JP7657773B2 - 核酸送達のための脂質化カチオン性ペプチド－ｐｅｇ組成物 - Google Patents

核酸送達のための脂質化カチオン性ペプチド－ｐｅｇ組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年８月９日に出願された米国仮出願第６２／８８５，０２２号、および２０１９年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／９０７，４７０号の優先権および利益を主張し、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、核酸および他のポリアニオン性カーゴの送達のために、ＰＥＧ化脂質またはＰＥＧ化ジアシルグリセロール誘導体などの低質量パーセントのＰＥＧ化化合物と組み合わされたカチオン性化合物の複合体および組成物に関する。より具体的には、本開示は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化ペプトイド、ならびに核酸送達のために少量のＰＥＧ化脂質と組み合わされたそれらの複合体および組成物に関する。本開示はまた、１つ以上のカチオン性化合物および低質量パーセントのＰＥＧ化化合物を核酸などのポリアニオン性化合物とともに含む複合体およびその組成物を調製するための方法、ならびにポリアニオン性化合物を細胞に送達するための方法を提供する。
核酸を一貫して効果的に細胞に送達する能力は、臨床現場における遺伝子療法、ｓｉＲＮＡ－、ｍｉＲＮＡ－、アンチセンス－、またはｍＲＮＡ－ベース療法の実用的な実行のための重要な要件である。様々なカチオン性化合物が送達ビヒクルとして探究されており、それらはポリアニオン性核酸をカプセル化し、核酸をインビボでヌクレアーゼに対して安定化することができる。リピトイド１（図１に示される）は、単体のカチオン性送達ビヒクルとして広く評価されているカチオン性ペプトイド－リン脂質コンジュゲート構築物の例である。しかしながら、核酸とリピトイドの複合体は、例えば、粒子の不安定性および凝集を含む、インビボでのさらなる複雑さに依然として影響され得る。
脂質ナノ粒子製剤などの多成分脂質混合物は、製剤（粒子）の安定性の改善を含む、インビボでの核酸送達を支持するために必要な薬物動態特性を達成するための大きな焦点領域になっている。脂質ナノ粒子は、電荷絶縁を提供して、生理学的条件下で送達ビヒクル－核酸複合体に構造的および化学的安定性を付与する、多くの適合性脂質共成分（例えば、遮蔽脂質、構造脂質、およびリン脂質）とともに、カチオン性化合物を組み込む。
インビボ核酸移送に必要な特性を達成する脂質ナノ粒子製剤の有望性にもかかわらず、脂質製剤の最適化は、送達される核酸の適合性共成分を特定すること、および所望の薬物動態特性を達成する各成分の相対量を注意深く調整することを含む、多くの変数の相互作用のためにしばしば困難である。さらに、ほとんどの脂質ベース製剤は、通常、４つ以上の別個の成分を含み、既存の製剤の大部分は、核酸物質自体ではなく、主に送達成分からなる。結果として、活性治療剤は、重量で製剤全体のうちの少ない部分のみを構成する。
したがって、インビボ適用に必要とされる薬物動態特性を損なうことなく、より高い質量パーセントの活性核酸物質の効果的かつ効率的な送達を達成する遺伝子治療のための製剤が必要とされ続けている。
本開示は、ポリアニオン性化合物の送達システムとして、リピトイドまたは三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物などのカチオン性化合物を、ＰＥＧ脂質などのＰＥＧ化化合物と組み合わせて含む複合体ならびに組成物を提供する。本明細書に記載の複合体および組成物は、カチオン性化合物およびポリアニオン性化合物の含有量に対して重量ベースで最小量のＰＥＧ化合物を利用して、粒子凝集に対して安定させ、したがって、高い質量パーセントの活性ポリアニオン性物質を有する、容易に最適化可能で安定な製剤を提供する。
一態様において、本開示は、
（ｉ）１つ以上のポリアニオン性化合物と、
（ｉｉ）１つ以上のＰＥＧ化合物と、
（ｉｉｉ）１つ以上のカチオン性化合物と、の複合体を含む組成物であって、１つ以上のカチオン性化合物が、
（ａ）式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩であって、

式中、
ｍは、０であり、
ｎは、整数０～５であり、
ｓは、整数０～５であり、
ｔは、０であり、
ｎおよびｓのうちの少なくとも１つが、０以外であり、
ｒは、整数１～２０であり、
各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
各ｐは、独立して、整数１または２であり、
Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、
Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
各Ｒ２は、独立して、
式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｕが、独立して、整数１～２００であり、
各Ｒ３は、独立して脂質部分であり、
各Ｒ４は、独立して中性スペーサー部分または脂質部分であり、
各Ｒ５は、独立してカチオン性部分であり、
各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｖが、独立して、整数１～２００であり、
Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ １－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩、
（ｂ）式（ＩＩ）の１つ以上のリピトイドであって、

式中、
ｘは、整数１～１００であり、
各Ｒ９は、独立して、脂質部分であり、
各Ｒ１０は、独立して、カチオン性または中性のスペーサー部分である、式（ＩＩ）の１つ以上のリピトイド、
（ｃ）式（ＩＩＩ）の１つ以上の脂質様化合物であって、

式中、
各Ｒ１１は、独立して、置換または非置換アルキルであり、
各Ｒ１２は、独立して、置換または非置換アルキルであり、
各Ｒ１３は、独立して、水素、または置換もしくは非置換アルキルであり、
各ｙは、独立して整数１～８である、式（ＩＩＩ）の１つ以上の脂質様化合物、
あるいは
（ｄ）それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物とが、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する、組成物を含む。
この態様のいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。特定の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化アミノ酸残基のブロックを含み、ｎまたはｓのどちらかは、少なくとも２である。特定の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化アミノ酸残基のブロックを含み、ｎまたはｓのどちらかが、４である。本態様の他の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、Ｃ４－Ｃ２２－アルキルまたはＣ４－Ｃ２２－アルケニルであり、Ｃ４－Ｃ２２－アルケニルは、任意選択的にモノまたはポリ不飽和である。特定の実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、各Ｒ３は、独立してＣ８－Ｃ１２アルキルである。なおさらに他の実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、各Ｒ３は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、２つの異なる脂質部分Ｒ３ａおよびＲ３ｂのうちの１つを有する混合Ｎ－脂質化アミノ酸残基のセットを含む、Ｎ－脂質化アミノ酸残基のブロックを含む。さらに他の実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、少なくとも１つの脂質部分Ｒ３（またはＲ３ａもしくはＲ３ｂ）は、分岐脂肪族部分である。特定の実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、少なくとも１つの脂質部分Ｒ３（またはＲ３ａもしくはＲ３ｂ）は、２－エチルヘキサ－１－イルである。
本態様のいくつかの実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含む。他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、各Ｒ５は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ－ヘテロシクリルアルキル、またはＮ－ヘテロアリールである。特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、各Ｒ５は、独立して、

からなる群から選択される。他の実施形態において、各Ｒ５は、－（Ｃ１－Ｃ４アルキレン）－ＮＲ５ａＲ５ｂであり、Ｒ５ａおよびＲ５ｂが、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、もしくはＣ６－Ｃ１０アリールであるか、またはＲ５ａおよびＲ５ｂが、それらが結合する窒素原子と一緒になって４～７員Ｎ－ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｎ－ヘテロシクロアルキル環は、任意選択的に、ＮおよびＯからなる群から選択される１つの追加のヘテロ原子を含み得る。さらに他の実施形態において、各Ｒ５は、

である。いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、独立して

であり、Ｒ５ａおよびＲ５ｂが、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、もしくはＣ６－Ｃ１０アリールであるか、またはＲ５ａおよびＲ５ｂが、それらが結合する窒素原子と一緒になって４～７員Ｎ－ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｎ－ヘテロシクロアルキル環は、任意選択的に、ＮおよびＯからなる群から選択される１つの追加のヘテロ原子を含み得る。特定の実施形態において、各Ｒ５は、

である。
本態様のさらに他の実施形態において、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１－Ｃ４－アルキル、Ｃ１－Ｃ５直鎖アルキルであり、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルは、任意選択的に、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、もしくはアルコキシによって置換される。いくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、－ＣＨ３、

からなる群から選択される。特定の実施形態において、各中性スペーサー部分Ｒ４は、

である。
なおさらなる実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つのアミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含み、カチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基の各々は、中性スペーサーまたは脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つのアミノ酸残基によって分離される。本態様のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性を含み、Ｒカチオンが、カチオン性部分Ｒ５を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性が、中性スペーサー部分Ｒ４を含むアミノ酸残基である。本態様の他の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ脂質を含み、Ｒカチオンが、カチオン性部分Ｒ５を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性が、中性スペーサー部分Ｒ４を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ脂質が、脂質部分Ｒ４である。前述の実施形態のいずれかの特定の実施形態において、各カチオン性部分Ｒ５は、

であり、各中性スペーサー部分Ｒ４は、

である。
この態様の他の実施形態において、前述の実施形態のうちのいずれか１つ以上と組み合わされ得、ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈおよび－ＣＨ３からなる群から選択される。この態様の他の特定の実施形態において、前述の実施形態のうちのいずれか１つ以上と組み合わされ得、ＲａおよびＲｂは、－Ｈである。
さらに他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物は、９０：１０～９９：１のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する。本態様のなおさらなる実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物は、９５：５～９８：２のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する。本態様の特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のＰＥＧ化合物は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。この態様のなおさらに他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のＰＥＧ化合物は、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩を含み、

式中、
ｍは、整数０～１５であり、
ｎは、整数０～５であり、
ｓは、整数０～５であり、
ｔは、整数０～１５であり、
ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外であり、
ｒは、整数１～２０であり、
各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
各ｐは、独立して、整数１または２であり、
Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、
Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
各Ｒ２は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｕが、独立して、整数１～２００であり、
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり、
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分または脂質部分であり、
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり、
各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｖが、独立して、整数１～２００であり、
Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ １－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である。
１つ以上のＰＥＧ化合物が１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む本態様のさらに他の実施形態において、ｍが、整数０～３である場合、各ｕは、独立して整数３０～５０であり、ｍが、整数４～１５である場合、各ｕは、独立して整数１～１０である。１つ以上のＰＥＧ化合物が１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含むなおさらに他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、組成物は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含み、ｔが、整数０～３である場合、各ｖは、独立して整数３０～５０であり、ｔが、整数４～１５である場合、各ｖは、独立して整数１～１０である。特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、ｍが、１であり、ｕが、整数４０～４５であるか、またはｔが、１であり、ｖが、整数４０～４５である。
本態様のさらに他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸を含む。本態様のなおさらに別の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸を含み、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物の核酸に対する質量比は、０．５：１～２０：１である。本態様のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸を含み、核酸は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。本態様の特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸を含み、核酸は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。
本態様のなおさらなる実施形態において、前述の実施形態のいずれかのうちの１つ以上と組み合わされ得、複合体は、１つ以上の第２の薬剤をさらに含む。さらに他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、１つ以上の第２の薬剤は、ポリエチレングリコール、標的化要素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。なおさらに別の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、複合体は、１つ以上の小分子活性剤または原薬をさらに含む。
本開示のさらに別の態様において、本明細書ではポリアニオン性化合物を細胞に送達することが提供され、細胞を、その様々な実施形態のいずれかおよびすべてにおける、前述の態様の組成物と接触させることを含む。この態様の特定の実施形態において、接触させることは、エンドサイトーシスによるものである。この態様の他の実施形態において、前述の態様と組み合わされ得、細胞は、インビボまたはインビトロで接触させる。ポリペプチドをコードする核酸を含むこの態様の特定の実施形態において、前述の実施形態のどちらかまたは両方と組み合わされ得、細胞は、組成物と接触した後にポリペプチドを発現する。タンパク質をコードする核酸を含むなおさらなる実施形態において、前述の実施形態のうちの１つ以上と組み合わされ得、細胞は、組成物と接触した後にタンパク質を発現する。
本開示の追加の態様は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を、１つ以上のＰＥＧ化合物および１つ以上のポリアニオン性化合物と接触させることによって、組成物に関連する前述の態様ならびにその様々な実施形態のいずれかおよびすべての組成物を調製する方法を提供する。この態様の実施形態において、組成物は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物ならびに１つ以上のＰＥＧ化合物を含む溶液を、１つ以上のポリアニオン性化合物を含む溶液と接触させることによって形成される。
本開示のさらに別の態様において、本明細書ではポリアニオン化合物を対象の肺に送達する方法が提供され、対象に前述の態様の組成物を投与することを含み、１つ以上のカチオン性化合物は、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のポリアニオン性化合物に対する質量比は、１：１～１０：１である。本態様のいくつかの実施形態において、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、化合物８、化合物２４、化合物２８、化合物７３、化合物７９、化合物９３、化合物９８、もしくは化合物１１２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本態様のいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物は、９０：１０～９９：１のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する。他の実施形態において、前述の実施形態と組み合わされ得、投与は、静脈内（ＩＶ）（例えば、ボーラス注射または静脈内注入）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内、または腫瘍内注射である。他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、ポリアニオン性化合物は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞は、組成物と接触した後にポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、ポリアニオン性化合物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞は、組成物と接触した後にタンパク質を発現する。
本開示の別の態様において、本明細書ではポリアニオン化合物を対象の肺および／または脾臓に送達する方法が提供され、対象に請求項１の組成物を投与することを含み、１つ以上のカチオン性化合物は、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のポリアニオン性化合物に対する質量比は、１：１～１０：１である。本態様のいくつかの実施形態において、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、化合物８、化合物１９、化合物２４、化合物２８、化合物７３、化合物７９、化合物９３、化合物９８、もしくは化合物１１２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本態様のいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物は、９０：１０～９９：１のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する。他の実施形態において、前述の実施形態と組み合わされ得、投与は、静脈内（ＩＶ）（例えば、ボーラス注射または静脈内注入）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内、または腫瘍内注射である。他の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、ポリアニオン性化合物は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞は、組成物と接触した後にポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得、ポリアニオン性化合物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞は、組成物と接触した後にタンパク質を発現する。
特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面を伴うこの特許または特許出願公開の複写物は、要請および必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
図1は、例示的な二級アミンリン脂質化カチオン性ペプチド「リピトイド１」を示す。 図２Ａ～２Ｆは、三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイドを一般的に示す。図２Ａは、三級アミノ脂質化ペプトイドの一般化構造を示す。図２Ｂは、例示的な三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイドを示す。図２Ｃは、例示的な脂質モノマーを示す。図２Ｄは、例示的なカチオン性モノマーを示す。図２Ｅは、例示的なスペーサーモノマーおよびポリエチレングリコールモノマーを示す。図２Ｆは、例示的な三級アミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物８を示す。 図３Ａ～３Ｅは、固相におけるアミノ酸残基の連続的付加を介して三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製するための例示的なプロセスを示す。図３Ａは、樹脂結合した二級アミンのアシル化剤ブロモ酢酸との一般化されたアシル化反応を示す。図３Ｂは、得られたアシル化生成物と適切なアミンとの求核置換を介した反応を示し、対応するＮ－置換アミノ酸残基を生成する。図３Ｃおよび図３Ｄは、アシル化および求核置換反応の連続した繰り返しを示し、所望の樹脂結合したカチオン性ペプチド化合物を生成する。図３Ｅは、固体樹脂支持体からのカチオン性ペプチド化合物の切断を示し、遊離ペプチドを提供する。 図４Ａおよび４Ｂは、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡのみ（ＰＥＧ化合物なし）、または２％ｗ／ｗもしくは５％ｗ／ｗのいずれかのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００組み込みによって製剤化した例示的なアミノ脂質化ペプトイド化合物８の製剤における経時的な粒子サイズ安定性の変動およびトランスフェクション効率を示す。図４Ａは、配合直後（配合後３０分）および配合後８時間で３つの製剤の各々について観察された数平均粒子サイズのグラフを示す。図４Ｂは、３つの製剤で処理されたＨｅＬａ細胞について、処理の８時間後に記録された平均生物発光の棒グラフを示す。 図５Ａ～５Ｄは、注射前の４℃での保存期間の関数として、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡおよび２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイド化合物２８の製剤のインビボでの全身分布を示す。図５Ａ～５Ｃは、保存の１時間後（図５Ａ）、３日後（図５Ｂ）、および７日後（図５Ｃ）の全身発光を示す。図５Ｄは、各々の時点で観測された総光子束のプロットを示す。 図６Ａ～６Ｅは、ＰＥＧ組み込み（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）の有無におけるアミノ脂質化ペプトイドおよびＦｌｕｃ ｍＲＮＡの製剤による処理後２４時間にＨｅＬａ細胞で記録された生物発光（ＲＬＵ）を示す。図６Ａは、アミノ脂質化ペプトイド化合物（１～１８）およびＦｌｕｃ ｍＲＮＡのみ（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００なし）の製剤で処理された細胞において観察された生物発光を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、添加された２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイド化合物（１～３６）およびＦｌｕｃ ｍＲＮＡの製剤で処理された細胞において観察された生物発光を示す。図６Ｄおよび６Ｅは、添加された２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２およびＦｌｕｃ ｍＲＮＡのペプトイド：ｍＲＮＡ比が５：１の製剤で処理されたＨｅＬａ細胞において観察された平均生物発光を示す。 図７Ａ～７Ｃは、生物発光強度および総光子束によって表される、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡおよび２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイドの製剤のインビボでの全身分布および器官特異的分布を示す。図７Ａは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける製剤の全身分布を示す。図７Ｂは、製剤の対応する器官特異的生体内分布（肺、腎臓、肝臓、脾臓、鼠径リンパ節、および腸間膜リンパ節）を示す。図７Ｃは、製剤の器官特異的生体内分布を総光子束の関数として定量化する棒グラフを示す。 図８Ａ～８Ｃは、２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００およびをＦｌｕｃ ｍＲＮＡを有するアミノ脂質化ペプトイドの製剤の皮下および筋肉内注射で処理されたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて観察された総光子束を示す。図８Ａは、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかで投与された、２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００および異なるペプトイド：ｍＲＮＡ比（１：１、２：１、５：１、７．５：１および１０：１）のＦｌｕｃ ｍＲＮＡを有するアミノ脂質化ペプトイド化合物２８の製剤における総光子束のプロットを示す。図８Ｂおよび８Ｃは、２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００およびＦｌｕｃ ｍＲＮＡを有するアミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２のペプトイド：ｍＲＮＡが５：１の製剤で処理されたマウスにおいて観察された総光子束のプロットを示す。 図９Ａ～９Ｃは、市販のＰＥＧ脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、１８：０ ＰＥＧ１０００ＰＥ、１４：０ ＰＥＧ２０００ ＰＥ、１４：０ ＰＥＧ５０００ ＰＥ）と組み合わせたアミノ脂質化ペプトイド（化合物２４および７９）、線状アミノＰＥＧ化ペプトイド（化合物４８、５６、６４、および７２）、および分岐アミノＰＥＧ化ペプトイド（化合物１０６、１０７、１０８、および１０９）の異なる製剤で提供されるＦｌｕｃ ｍＲＮＡの、様々な細胞型（図９ＡにＨｅＬａ、図９ＢにＨｅｐＧ２、および図９ＣにＪＡＷＳＩＩ）におけるトランスフェクション効率のインビトロでの評価について基準化した総光子束を示す。
以下の説明は、例示的な方法、パラメータなどを示す。しかしながら、かかる説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。
本開示は、核酸および他のポリアニオン性カーゴの送達のために、低質量パーセントのＰＥＧ化脂質などのＰＥＧ化化合物を有する、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物などのカチオン性化合物の複合体および組成物に関する。より具体的には、本開示は、核酸送達のための、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化ペプトイド、ならびに低濃度のＰＥＧ化脂質を有するそれら複合体および組成物に関する。本開示はまた、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドと、低質量パーセントのＰＥＧ化化合物とを、核酸などのポリアニオン性化合物とともに含む複合体および組成物を調製するための方法、ならびにポリアニオン化合物を細胞に送達するための方法を提供する。一態様において、本明細書では１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のカチオン性化合物と、を含む複合体および組成物が提供される。
１つ以上のカチオン性化合物は、それらの好都合な電荷－電荷相互作用に起因して、組成物内の１つ以上のポリアニオン性化合物と複合体を形成し得ることを認識されたい。１つ以上のＰＥＧ化化合物が、カチオン性化合物－ポリアニオン性化合物の電荷複合体とさらに結合して、複合体を形成し得ることをさらに認識されたい。本明細書で提供される組成物は、カチオン性化合物およびポリアニオン性化合物と複合体を形成しない任意のさらなる成分に加えて、ポリアニオン性化合物をカチオン性化合物およびＰＥＧ化化合物とともに含む複合体に存在するすべての成分を含むと理解されたい。
驚くべきことに、カチオン性送達ビヒクル化合物およびポリアニオン性化合物を含む複合体および組成物へのＰＥＧ化化合物（ＰＥＧ脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００など）の添加は、標準的な脂質ナノ粒子製剤の共成分として使用される構造脂質およびリン脂質のさらなる組み込みを必要とせずに、経時的に改善された粒子安定性を提供できることが観察された。さらに、長期安定化効果は、複合体全体に対してわずかな質量パーセントのＰＥＧ化化合物のみを組み込むことによって達成できることも観察され、したがって、複合体中のはるかに大きい重量分率の活性ポリアニオン性物質の細胞への送達を支持することができる安定した、容易に最適化可能な製剤を提供する。わずかな質量パーセントのＰＥＧ化化合物を含む複合体、したがってまた複合体を含む組成物は、カチオン性化合物およびポリアニオン性化合物単独の複合体に匹敵するそれらのポリアニオン性カーゴのトランスフェクション効率を有するが、大幅に改善された製剤安定性を有することが示された。
本明細書で使用される「アルケニル」は、不飽和の直鎖または分岐一価炭化水素鎖またはそれらの組み合わせを指し、オレフィン性不飽和の少なくとも１つの部位を有し（すなわち、式Ｃ＝Ｃの少なくとも１つの部分を有する）、指定された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ２－Ｃ１０は、２～１０個の炭素原子を意味する）。アルケニル基は、「シス」もしくは「トランス」配置、または代わりに「Ｅ」もしくは「Ｚ」配置であり得る。特定のアルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ２０アルケニル」）、２～８個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ８アルケニル」）、２～６個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ６アルケニル」）、または２～４個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ４アルケニル」）である。アルケニルの例には、エテニル（またはビニル）、プロプ－１－エニル、プロプ－２－エニル（またはアリル）、２－メチルプロプ－１－エニル、ブト－１－エニル、ブト－２－エニル、ブト－３－エニル、ブタ－１，３－ジエニル、２－メチルブタ－１，３－ジエニル、それらの同族体および異性体などの基が含まれるが、これらに限定されない。
「アルキル」という用語は、飽和した直鎖および分岐一価炭化水素構造およびそれらの組み合わせを指し、指定された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ１－Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する）。特定のアルキル基は、１～２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ１－Ｃ２０アルキル」）である。より具体的なアルキル基は、１～８個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ８アルキル」）、３～８個の炭素原子（「Ｃ３－Ｃ８アルキル」）、１～６個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ６アルキル」）、１～５個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ５アルキル」）、または１～４個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ４アルキル」）を有するものである。アルキルの例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルの同族体および異性体などの基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「アルキレン」は、アルキルと同じ残基を指すが、二価性を有する。特定のアルキレン基は、１～６個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ６アルキレン」）、１～５個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ５アルキレン」）、１～４個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ４アルキレン」）または１～３個の炭素原子（「Ｃ１－Ｃ３アルキレン」）を有するものである。アルキレンの例には、メチレン（－ＣＨ２－）、エチレン（－ＣＨ２ＣＨ２－）、プロピレン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ブチレン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）などの基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「アルキニル」は、不飽和の直鎖もしくは分岐一価炭化水素鎖またはそれらの組み合わせを指し、アセチレン不飽和の少なくとも１つの部位を有し（すなわち、式Ｃ≡Ｃの少なくとも１つの部分を有する）、指定された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ２－Ｃ１０は、２～１０個の炭素原子を意味する）。特定のアルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ２０アルキニル」）、２～８個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ８アルキニル」）、２～６個の炭素原子を有するもの（「Ｃ２－Ｃ６アルキニル」）、または２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２－Ｃ４アルキニル」）である。アルキニルの例には、エチニル（またはアセチレニル）、プロプ－１－イニル、プロプ－２－イニル（またはプロパルギル）、ブト－１－イニル、ブト－２－イニル、ブト－３－イニル、それらの同族体および異性体などの基が含まれるが、これらに限定されない。
「アリール」という用語は、ポリ不飽和芳香族炭化水素基を指し、それらを含む。アリールは、追加の融合アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、および／またはヘテロシクリル環を含む、追加の融合環（例えば、１～３個の環）を含み得る。１つの変化では、アリール基は、６～１４個の環状炭素原子を含む。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、ビフェニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
「カルボニル」は、基Ｃ＝Ｏを指す。
本明細書で使用される「複合体」は、２つ以上の分子間の任意の化学的会合を含み、これは、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、金属－配位子配位、他の化学的力、および上記のうちの１つ以上の組み合わせによって媒介され得る。複合体は、例えば、ポリプレックス、コアセルベート複合体、ナノ複合体、ナノ粒子、およびマイクロ粒子を含む、高次構造を形成し得る。
「シクロアルキル」という用語は、環状一価炭化水素構造を指し、それらを含み、完全に飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和であり得るが、非芳香族であり、指定された炭素原子の数を有する（例えば、Ｃ１－Ｃ１０は、１～１０個の炭素を意味する）。シクロアルキルは、シクロヘキシルなどの１つの環、またはアダマンチルなどの複数の環で構成することができるが、アリール基は除外される。２つ以上の環を含むシクロアルキルは、融合、スピロ、もしくは架橋、またはそれらの組み合わせであり得る。好ましいシクロアルキルは、３～１３個の環状炭素原子を有する環状炭化水素である。より好ましいシクロアルキルは、３～８個の環状炭素原子を有する環状炭化水素（「Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル」）である。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル、ノルボルニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ハロ」または「ハロゲン」は、原子番号９～８５を有する第１７族の元素を指す。好ましいハロ基には、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれる。残基が２つ以上のハロゲンで置換される場合、それは、結合しているハロゲン部分の数に対応する接頭辞を使用することによって言及され得、例えば、ジハロアリール、ジハロアルキル、トリハロアリールなどは、２つ（「ジ」）または３つ（「トリ」）のハロ基で置換されたアリールおよびアルキルを指し、同じハロであり得るが、必ずしも同じではなく、そのため、４－クロロ－３－フルオロフェニルは、ジハロアリールの範囲内である。各水素がハロ基で置換されるアルキル基は、「ペルハロアルキル」と称される。好ましいペルハロアルキル基は、トリフルオロアルキル（－ＣＦ３）である。同様に、「ペルハロアルコキシ」は、ハロゲンがアルコキシ基のアルキル部分を構成する炭化水素中の各Ｈに代わるアルコキシ基を指す。ペルハロアルコキシ基の例は、トリフルオロメトキシ（－ＯＣＦ３）である。
「ヘテロアリール」という用語は、１～１０個の環状炭素原子、ならびに窒素、酸素、および硫黄などのヘテロ原子をこれらに限定されずに含む、少なくとも１つの環状ヘテロ原子を有する不飽和芳香族環状基を指し、窒素および硫黄原子は任意選択的に酸化され、窒素原子は任意選択的に四級化される。ヘテロアリール基は、環状炭素または環状ヘテロ原子で分子の残りの部分に結合することができる。ヘテロアリールは、追加の融合アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、および／またはヘテロシクリル環を含む、追加の融合環（例えば、１～３の環）を含み得る。ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ピリミジル、チオフェニル、フラニル、チアゾールなどが含まれるが、これらに限定されない。
「複素環」または「ヘテロシクリル」という用語は、１～１０個の環状炭素原子と、窒素、硫黄、もしくは酸素などの１～４個の環状ヘテロ原子と、を有する飽和または不飽和の非芳香族基を指し、窒素原子および硫黄原子は任意選択的に酸化され、窒素原子は任意選択的に四級化される。ヘテロシクリル基は、単一の環または複数の縮合した環を有し得るが、ヘテロアリール基を除外する。２つ以上の環を含む複素環は、融合、スピロ、もしくは架橋、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。融合環系では、融合環のうちの１つ以上は、アリールまたはヘテロアリールであることができる。ヘテロシクリル基の例には、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェニル、２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル、４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イルなどが含まれるが、これらに限定されない。
「オキソ」は部分＝Ｏを指す。
「チオカルボニル」は、基Ｃ＝Ｓを指す。
「任意選択的に置換された」とは、別段の指定がない限り、基が非置換であるか、または置換基が同じに異なり得るその基について列挙される置換基のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）によって置換され得ることを意味する。一実施形態において、任意選択的に置換された基は、１つの置換基を有する。別の実施形態において、任意選択的に置換された基は、２つの置換基を有する。別の実施形態において、任意選択的に置換された基は、３つの置換基を有する。別の実施形態において、任意選択的に置換された基は、４つの置換基を有する。いくつかの実施形態において、任意選択的に置換された基は、１～２、２～５、３～５、２～３、２～４、３～４、１～３、１～４、または１～５つの置換基を有する。
「置換された」という用語は、部分の１つ以上の水素原子の一価または二価ラジカルによる置換を指す。「任意選択的に置換された」は、その部分が置換または非置換であり得ることを示す。好適な置換基には、例えば、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ（例えば、－ＮＨ２またはジアルキルアミノ）、イミノ、シアノ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、ハロアルキル（－ＣＣ１３または－ＣＦ３など）、チオ、スルホニル、チオアミド、アミジノ、イミジノ、オキソ、オキサミジノ、メトキサミジノ、イミジノ、グアニジノ、スルホンアミド、カルボキシル、ホルミル、アルキル、アルコキシ、アルコキシ－アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ（－ＯＣＯＲ）、アミノカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、カルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロアラルキル－カルボニル、アルキルチオ、アミノアルキル、シアノアルキル、カルバモイル（－ＮＨＣＯＯＲ－または－ＯＣＯＮＨＲ－）、尿素（－ＮＨＣＯＮＨＲ－）、アリールなどが含まれ、Ｒは任意の好適な基、例えば、アルキルまたはアルキレンである。いくつかの実施形態において、任意選択的に置換された部分は、記載されるように、選択ラジカルによってのみ任意選択的に置換される。いくつかの実施形態において、上記の基（例えば、アルキル基）は、例えば、アルキル（例えば、メチルまたはエチル）、ハロアルキル（例えば、－ＣＣ１３、－ＣＨ２ＣＨＣｌ２、または－ＣＦ３）、シクロアルキル（例えば、－Ｃ３Ｈ５、－Ｃ４Ｈ７、－Ｃ５Ｈ９）、アミノ（例えば、－ＮＨ２またはジアルキルアミノ）、アルコキシ（例えば、メトキシ）、ヘテロシクロアルキル（例えば、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、アゼチジン）、ヒドロキシル、および／またはヘテロアリール（例えば、オキサゾリル）によって任意選択的に置換される。いくつかの実施形態において、置換基はそれ自体が任意選択的に置換される。いくつかの実施形態において、置換基はそれ自体が置換されない。置換基に置換される基は、例えば、カルボキシル、ハロ、ニトロ、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アミノカルボニル、－ＳＲ、チオアミド、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２Ｒ、またはシクロアルキルであることができ、Ｒは、任意の好適な基、例えば、水素またはアルキルである。
送達ビヒクルとしてのカチオン性化合物
上で詳述されるように、本明細書に提供される複合体および組成物は、１つ以上のポリアニオン性化合物、１つ以上のＰＥＧ化化合物、および１つ以上のカチオン性化合物を含む。それらの正電荷のおかげで、複合体および組成物中のカチオン性化合物は、ポリアニオン性カーゴの負電荷を相殺し、電荷中性の複合体（カチオン性化合物－ポリアニオン性化合物複合体とも呼ばれる）を形成し、したがって標的細胞への親油細胞膜を通るアニオン性物質の輸送を促進することができる。
本明細書に記載のカチオン性化合物は、正味のゼロ電荷または正味の正電荷を有する。複合体または組成物が１つ以上のカチオン性化合物を含むいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、独立して、正味のゼロ電荷または正味の正電荷を有する。特定の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、独立して、少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。他の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、独立して、少なくとも＋２の正味の正電荷を有する。さらに他の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、独立して、＋４以下または＋３以下の正味の正電荷を有する。１つ以上のカチオン性化合物に存在する正味電荷は、環境条件に応じて変化し得ることを認識されたい。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、独立して、生理学的に適切なｐＨ範囲で、安定した正味の正電荷を有する。例えば、生理学的ｐＨは、少なくとも約５．５、典型的には少なくとも約６．０である。より典型的には、生理学的ｐＨは、少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは、約８．５未満であり、通常は約８．０未満である。より典型的には、生理学的ｐＨは、約７．５未満である。
核酸の送達ビヒクルとして役立ち得て、本明細書に記載の複合体および組成物に好適な様々なカチオン性化合物があることを認識されたい。本明細書に記載の複合体および組成物中のカチオン性化合物は、別個の小分子ならびにより大きいポリマー構築物を含み得る。好適なカチオン性化合物には、カチオン性脂質、カチオン性脂質－ペプチドコンジュゲート（例えば、リピトイド）、カチオン性ペプチド、カチオン性ポリマー、および脂質様（親油性）カチオン性化合物が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の複合体および組成物は、１つ以上のカチオン性化合物を含み、１つ以上のカチオン性化合物は、カチオン性脂質、カチオン性脂質－ペプチドコンジュゲート（例えば、リピトイド）、カチオン性ペプチド、カチオン性ポリマー、および脂質様（親油性）カチオン性化合物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物
いくつかの実施形態において、本開示の複合体および組成物は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－置換アミノ酸残基を含むペプチド鎖である。本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、オリゴペプチド骨格を含み、オリゴペプチド骨格は、Ｎ－置換中性（「スペーサー」）および／または脂質アミノ酸残基と任意選択的に交互配置されたＮ－置換カチオン性アミノ酸残基の反復サブユニットを含む。オリゴペプチド骨格は、脂質部分でＮ－置換され（「Ｎ－脂質化」）、かつ／またはオリゴエチレングリコールおよび／もしくはポリエチレングリコールでＮ－置換される（「Ｎ－ＰＥＧ化」）アミノ酸残基によって、Ｎ－および／またはＣ－末端でさらにキャッピングされる。
一態様において、本明細書において、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩が提供される。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、ペプチド化合物に存在するアミノ酸残基の総数を特徴とし得、各アミノ酸残基は、一般構造－（ＮＲ－ＣＲａＲ）ｂ－Ｃ（Ｏ））－によって表される。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基の総数は、２～４０個のアミノ酸残基、２～３０個のアミノ酸残基、３～２５個のアミノ酸残基、５～２０個のアミノ酸残基、または７～１５個のアミノ酸残基である。特定の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、５～２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態において、アミノ酸残基の総数は、ｍ、ｎ、ｓ、ｔ、および［ｒ×（ｏ＋ｐ＋ｑ）］の合計である。
他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、正味のゼロ電荷または正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である特定の実施形態において、三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物は、少なくとも＋１の正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物または三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である他の実施形態において、カチオン性ペプチド化合物は正味のゼロ電荷（すなわち、電荷中性である）または正味の正電荷を有する。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物または三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であるいくつかの実施形態において、カチオン性ペプチド化合物は＋１の正味の正電荷を有する。特定の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、（ｒ×ｐ）＋の正味の正電荷を有する。
特定の実施形態において、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸または非天然に存在するアミノ酸のＮ－置換変異体であり、炭素側鎖は、ＲａおよびＲｂによって表される。アミノ酸残基は、Ｄ－またはＬ－配置のいずれかで存在し得る。さらに、アミノ酸残基のＮ－位置の置換がアミド結合の自由回転を制限し得ることを認識されたい。したがって、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、様々な回転異性体立体構造（回転異性体）で存在し得る。
いくつかの実施形態において、各Ｒａおよび各Ｒｂは、独立して、天然または非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である。本明細書で使用される場合、「天然に存在するアミノ酸」という用語は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＴｒｐを指す。「非天然に存在するアミノ酸」という用語は、通常、自然界には認められないアミノ酸を指し、例えば、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体、２－アミノアジピン酸、２－アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンが含まれる。特定の実施形態において、各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、－ＣＨ３、または

である。
他の実施形態において、各Ｒａおよび各Ｒｂは、独立して、－ＨまたはＣ１－Ｃ４－アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒａおよび各Ｒｂは、独立して、－ＨまたはＣＨ３である。他の実施形態において、ＲａおよびＲｂは、－Ｈである。ＲａおよびＲｂが－Ｈである実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、Ｎ－脂質化および／またはＰＥＧ化ポリグリシン化合物あるいはＮ－脂質化および／またはＰＥＧ化ペプトイド化合物と呼ばれ得る。特定の実施形態において、各Ｒａおよび各Ｒｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ１－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である。
オリゴペプチド骨格、または反復サブユニット、および構造モチーフ
本明細書に記載されるように、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、核酸などのポリアニオン性化合物との複合体形成、およびかかるポリアニオン性化合物の細胞への送達のために有用であり得る。本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｎ－置換中性スペーサーアミノ酸残基および／またはＮ－脂質化アミノ酸残基で任意選択的に交互配置されるＮ－置換カチオン性アミノ酸残基の反復サブユニットのオリゴペプチド骨格を含む。
オリゴペプチド骨格の反復サブユニット中のカチオン性アミノ酸残基は、本開示の化合物に正電荷を付与し、核酸のようなポリアニオン種との好都合な静電相互作用およびその電荷中和を可能にする。カチオン性残基間における中性または脂質化アミノ酸残基の交互配置は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の全体を通して正電荷の空間分布にわたってより優れた制御を可能にし、特定の長さ、電荷分布、および／または立体構造を有するポリアニオン種とのカチオン性化合物の改善された複合体形成を可能にする。
オリゴペプチド骨格において、ｒは、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物におけるカチオン性および中性ならびに／または脂質化アミノ酸残基の反復サブユニットの数を表す。いくつかの実施形態において、ｒは、整数１～２５である。特定の実施形態において、ｒは、整数１～２０である。他の実施形態において、ｒは、整数１～１５である。いくつかの実施形態において、ｒは、整数１～５である。特定の実施形態において、ｒは、整数２～４である。
各サブユニットｒは、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物全体内の他のサブユニットと厳密に同一であり得るか、またはあり得ないことを認識されたい。例えば、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物内で、各サブユニットｒは、カチオン性アミノ酸残基、ならびに任意選択的に中性および／または脂質化アミノ酸残基も含み、独立して、他のサブユニットに存在するカチオン性および中性ならびに／または脂質化アミノ酸残基に関連して選択される。
カチオン性部分
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各反復サブユニットは、少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基を含む。カチオン性アミノ酸残基は、核酸またはポリアニオン性化合物の負電荷との相互作用によって、本明細書に記載のペプチド化合物が、核酸または他のポリアニオン性化合物と静電複合体を形成することを可能にする正電荷を提供する。核酸の複合体形成は、核酸の負電荷を部分的または完全に遮蔽し、細胞の脂質膜を通って細胞内部への輸送を促進する。
各サブユニットｒ内で、ｐはそのサブユニットに存在するカチオン性アミノ酸残基の数を表す。いくつかの実施形態において、各ｐは、独立して、整数１または２である。特定の実施形態において、ｐは、１である。
各カチオン性アミノ酸残基は、Ｎ－位置にカチオン性部分Ｒ５を含む。各カチオン性部分Ｒ５は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の反復サブユニット内で選択されるだけでなく、オリゴペプチド骨格全体にわたって選択され得ることを認識されたい。
本明細書に記載のカチオン性部分は、生理学的に適切なｐＨ範囲で安定した正味の正電荷を有する置換基であり得る。例えば、生理学的ｐＨは、少なくとも約５．５、典型的には少なくとも約６．０である。より典型的には、生理学的ｐＨは、少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは、約８．５未満であり、典型的には約８．０未満である。より典型的には、生理学的ｐＨは、約７．５未満である。カチオン性部分は、例えば、生理学的ｐＨで正電荷を生成するのに十分である部分に存在する官能基における閾値ｐＫａ値を特徴とし得る。特定の実施形態において、カチオン性部分は、少なくとも７．５のｐＫａ値を有する。他の実施形態において、カチオン性部分は、生理学的ｐＨと、より酸性のｐＨ、例えば、ｐＨ４．５～５．５との間のｐＫａを有する。追加の実施形態において、複数の独立したｐＫａ値を有する置換基が使用される。
本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、オリゴペプチド骨格に沿って互いに近接して複数のカチオン性部分を含み得ることを認識されたい。複数のカチオン性部分がオリゴペプチド骨格に沿って存在する場合、特定のカチオン性部分のプロトン化または脱プロトン化状態は、近接している他のカチオン性部分のｐＫａ値に影響を及ぼし得る。このメカニズムによって、本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物中の特定のカチオン性部分のｐＫａは、単離されて測定されるそのｐＫａ値に関して変化され得る。例えば、ｐＫａ約８を有するオリゴペプチド骨格中の１つのアミンのプロトン化は、近くのカチオン性部分のｐＫａ値を、約７．５の通常の値からｐＫａ約５～６に低下させ得る。
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、互いに様々な近接で複数のカチオン性部分を収容する能力は、これらのカチオン性ペプチド化合物、およびそれらの任意の複合体が、生理学的ｐＨの変動に高い感受性で応答することを可能にする。生理学的ｐＨの変化に対するこれらの化合物およびそれらの複合体の感受性は、エンドソーム輸送（エンドソームコンパートメントｐＨ～４．５～５．５）後のサイトゾルへの核酸の送達および放出を促進するために重要であり得る。
カチオン性、または正に帯電した部分は、例えば、アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、およびアミジノである官能基を含むものなど、窒素ベースの置換基を含み得る。これらの官能基は、芳香族、飽和環状、または脂肪族のいずれかであることができる。いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ－ヘテロシクリルアルキル、またはＮ－ヘテロアリールである。他の実施形態において、各Ｒ５は、独立して、

である。
特定の実施形態において、各Ｒ５は、独立して、

からなる群から選択される。さらに他の実施形態において、各Ｒ５は、

である。
特定の実施形態において、各Ｒ５は、－（Ｃ１－Ｃ４アルキレン）－ＮＲ５ａＲ５ｂであり、Ｒ５ａおよびＲ５ｂが、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、もしくはＣ６－Ｃ１０アリールであるか、またはＲ５ａおよびＲ５ｂが、それらが結合する窒素原子と一緒になって４～７員Ｎ－ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｎ－ヘテロシクロアルキル環は、任意選択的に、ＮおよびＯからなる群から選択される１つの追加のヘテロ原子を含み得る。特定の実施形態において、各Ｒ５は、

である。いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、独立して

であり、Ｒ５ａおよびＲ５ｂが、独立してＨ、Ｃ１－Ｃ３アルキル、もしくはＣ６－Ｃ１０アリールであるか、またはＲ５ａおよびＲ５ｂが、それらが結合する窒素原子と一緒になって４～７員Ｎ－ヘテロシクロアルキル環を形成し、Ｎ－ヘテロシクロアルキル環は、任意選択的に、ＮおよびＯからなる群から選択される１つの追加のヘテロ原子を含み得る。特定の実施形態において、各Ｒ５は、独立して、

からなる群から選択される。さらに特定の他の実施形態において、各Ｒ５は、

である。
カチオン性残基がペプチド化合物全体の末端残基であるなおさらなる実施形態において、合成または脱保護条件（酸に不安定なリンカーなど）と適合しないか、または適切な保護基戦略が利用可能ではない（例えば、ポリアミン）、追加のカチオン性部分Ｒ５が、利用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、ポリアミンである。末端残基のＲ５がポリアミンであるいくつかの実施形態において、ポリアミンは、

である。特定の実施形態において、ポリアミンは、

からなる群から選択される。
他の実施形態において、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシエーテル、アルコキシアルキル、またはヒドロキシルヘテロアルキルである。特定の実施形態において、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、

である。
なおさらなる実施形態において、末端カチオン性残基のカチオン性部分Ｒ５は、

である。
ペプチド鎖中の非置換窒素原子は、すなわち、Ｒ５が水素である場合、生理学的条件下でイオン化可能なカチオン性部分としても機能し得ることをさらに認識されたい。いくつかの実施形態において、カチオン性部分Ｒ５は、水素原子である。
中性スペーサー部分
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内で、カチオン性アミノ酸残基は、Ｎ－位置に中性スペーサー部分を有する中性スペーサーアミノ酸残基と任意選択的に交互配置され得る。中性アミノ酸残基は、カチオン性ペプチド化合物と複合体を形成するポリアニオン化合物（ポリヌクレオチドを含む）との改善された静電相互作用のために、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するのに有用であり得る。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各反復サブユニットにおいて、中性アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸残基のＮ末端またはＣ末端のいずれかに１つ以上のＲ４基として存在し得る。サブユニットｒが中性スペーサー部分Ｒ４を含むいくつかの実施形態において、存在する各中性スペーサー部分に対応するｏおよび／またはｑは、サブユニットｒ内のカチオン性アミノ残基のＮ末端およびＣ末端に結合した中性スペーサー残基のそれぞれの数を表す。いくつかの実施形態において、各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４である。他の実施形態において、各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４である。
各中性スペーサーアミノ酸残基は、Ｎ－位置に中性スペーサー部分Ｒ４を含む。本明細書に記載のカチオン性部分と同様に、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の反復サブユニット内、ならびにオリゴペプチド骨格の反復サブユニットｒの中から選択されることを認識されたい。
中性スペーサー部分は、生理学的に適切なｐＨ範囲で中性であるか、またはゼロの正味電荷を有する任意の置換基を含み得ることも認識されたい。いくつかの実施形態において、各中性部分Ｒ４は、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１－Ｃ４－アルキル、Ｃ１－Ｃ５直鎖アルキルであり、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルは、任意選択的に、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、もしくはアルコキシで置換される。さらにいくつかの実施形態において、各中性スペーサー部分Ｒ４は、独立して、－ＣＨ３、

からなる群から選択される。特定の実施形態において、各中性スペーサー部分Ｒ４は、

である。
さらに他の実施形態において、中性スペーサー部分は、生理学的に適切なｐＨ範囲でアニオン性（すなわち、負電荷を有する）になり得る置換基を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、スペーサー部分Ｒ４は、

である。
脂質部分
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のオリゴペプチド骨格内における中性アミノ酸残基のカチオン性アミノ酸残基との任意選択的な交互配置に加えて、Ｎ－位置に脂質部分を有するＮ－脂質化アミノ酸残基もまた、任意選択的に、カチオン性（および任意選択的な中性スペーサー）アミノ酸残基と交互配置され得る。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ－脂質化アミノ酸残基を含むいくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化される。中性アミノ酸残基と同様に、オリゴペプチド骨格内のＮ－脂質化アミノ酸残基は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物における正電荷の空間分布を調節するために、ならびにポリアニオン性物質の改善されたカプセル化および細胞内送達のためにそれらの親油性を増加させるために、有用であり得る。ペプトイド骨格に沿った脂質の間隔も、細胞の取り込みおよびエンドソーム放出に影響を与えることが知られている脂質の流動性／結晶化度に影響を及ぼし得る。
中性スペーサー残基と同様に、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各反復サブユニットにおいて、Ｎ－脂質化アミノ酸残基は、カチオン性アミノ酸のＮ末端もしくはＣ末端のどちらかまたは両端に、１つ以上のＲ４基として存在し得る。サブユニットｒが脂質部分Ｒ４を含むいくつかの実施形態において、存在する各脂質部分に対応するｏおよび／またはｑはまた、ユニットｒ内のカチオン性アミノ酸残基のＮ末端およびＣ末端に結合した脂質化残基のそれぞれの数を表し得る。いくつかの実施形態において、各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４である。他の実施形態において、各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４である。
各Ｎ－脂質化アミノ酸残基は、Ｎ－位置に脂質部分Ｒ４を含む。本明細書に記載のカチオン性および中性部分と同様に、各脂質部分Ｒ４は、独立して、カチオン性ペプチド化合物の反復サブユニット内、ならびにオリゴペプチド骨格の反復サブユニットｒの中から選択されることを認識されたい。
好適な脂質部分には、例えば、任意選択的に置換された分岐もしくは直鎖脂肪族部分、または脂肪酸、ステロール、およびイソプレノイドを含む天然脂質化合物に由来する任意選択的に置換された部分が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、脂質部分は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に、１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に、１つ以上の二重または三重結合（すなわち、飽和またはモノもしくはポリ不飽和）を含む、分岐または直鎖脂肪族部分を含み得る。特定の実施形態において、脂質部分は、任意選択的に置換された脂肪族、直鎖または分岐部分を含み得、各疎水性テールは、独立して、約８～約３０個の炭素原子または約６～約３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態において、脂質部分は、例えば、脂肪酸および脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、Ｃ８－Ｃ２４－アルキルまたはＣ８－Ｃ２４－アルケニルであり、Ｃ８－Ｃ２４－アルケニルが、任意選択的にモノまたはポリ不飽和である。いくつかの実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはＣ６－Ｃ１８アルケニルである。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはＣ６－Ｃ１８アルケニルであり、Ｃ６－Ｃ１８アルケニルが、モノ不飽和である。特定の他の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ６－Ｃ１７アルキルまたはＣ６－Ｃ１７アルケニルである。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、Ｃ８－Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、ｎ－デシルなどのＣ１０－アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ４は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプリリル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。他の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。
さらに他の実施形態のいずれかと組み合わされ得るさらに他の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、

である。前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得るなおさらに他の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、式

であり、Ｒ８は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に１つ以上の二重結合または三重結合を含む、分岐または直鎖脂肪族部分である。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ４は、独立して、

である。
本発明の実施において使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質、グリセリド（ジグリセリドまたはトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、ならびに飽和および不飽和ステロール、イソプレノイド、および他の同様の天然脂質に由来することができる。
他の好適な脂質部分は、例えば、ナフタレニルもしくはエチルベンジルを含む、任意選択的に置換されたアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはアリールアルキル部分などの親油性炭素環式または芳香族基、あるいは例えばステロールエステルおよびワックスエステルを含むエステル官能基を含む脂質を含み得る。さらに他の実施形態において、脂質部分Ｒ４は、

である。
構造モチーフ
いくつかの実施形態において、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、カチオン性、中性スペーサー、および脂質化アミノ酸残基の互いに対する特定の配列または配置を含み得、これは、線状共重合体の様々な分類（ランダム、ブロック、交互、周期的、ステレオブロックなど）と同様に記載することができる。
例えば、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性化合物が一般的な部分Ｒカチオン、Ｒ中性、およびＲ脂質を含むいくつかの実施形態において、アミノ酸残基は、ランダム配列、交互配列、またはブロック配列で配置され得る。ＲカチオンおよびＲ中性の表現は、それぞれ、カチオン部分Ｒ５および中性部分Ｒ４を含むアミノ酸残基と同等であることを理解されたい。一般的な部分Ｒ脂質は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物中のＮ－脂質化残基の位置に応じて、脂質部分Ｒ４および脂質部分Ｒ３を有する両方のアミノ酸残基を含むと理解され得る。
カチオン性および中性スペーサーアミノ酸残基の交互配列の一例は、Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒカチオン－Ｒ中性、またはＲ中性－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒカチオンによって表され得る。カチオン性および脂質化アミノ酸残基の交互配列の別の例は、Ｒカチオン－Ｒ脂質－Ｒカチオン－Ｒ脂質、またはＲ中性－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒカチオンによって表され得る。ブロック配列のいくつかの例は、Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性－Ｒ中性、Ｒ中性－Ｒ中性－Ｒ中性－Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒカチオン、Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒ脂質－Ｒ脂質－Ｒ脂質、またはＲ脂質－Ｒ脂質－Ｒ脂質－Ｒカチオン－Ｒカチオン－Ｒカチオンによって表され得る。さらにいくつかの実施形態において、カチオン性部分、中性スペーサー部分、および脂質化部分は、オリゴペプチド化合物全体内の異なる反復サブユニットセグメントにおいてブロック配列および交互配列で配置され得る。例えば、いくつかの実施形態において、カチオン性ペプチド化合物内に、Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性などのより大きなオリゴマーユニットの反復モチーフがあり得る。他の実施形態において、カチオン性ペプチド化合物は、交互のカチオン性および中性残基のブロックと組み合わされるＮ－脂質化残基のブロックを含み得る。
本明細書に記載されるように、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも１つのカチオン性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の骨格は、「カチオン性ドメイン」または「カチオン性ブロック」を含む。カチオン性ドメインは、複数のカチオン性部分Ｒ５、例えば、少なくとも２つのカチオン性残基を有するオリゴペプチド鎖内の連続するアミノ酸残基のセグメントとして広く理解され得る。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、カチオン性ドメインを含み、カチオン性ドメインは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つのカチオン性アミノ酸残基を含む。
カチオン性ドメインは、例えば、連続する線状配列に複数のＲ５カチオン性部分を有するアミノ酸残基のブロック（例えば、Ｒ５Ｒ５Ｒ５、またはＲカチオンＲカチオンＲカチオン）を含み得る。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、「カチオン性ドメイン」を含み、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つの連続するアミノ酸残基を含む。
他の実施形態において、「カチオン性ドメイン」は、隣接するアミノ酸残基のブロックを含み得、複数のカチオン性残基は、２つのカチオン性残基の間に配置される追加の非カチオン性（すなわち、中性または脂質化）残基を特徴とし、そのためブロック内のカチオン性残基は、別のカチオン性残基に直接結合されない。例えば、いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、「カチオン性ドメイン」を含み、カチオン性ドメインは、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含み、カチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基の各々は、中性スペーサーまたは脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つまたは少なくとも２つのアミノ酸残基によって分離される。いくつかの実施形態において、非カチオン性残基は、カチオン性ドメイン内の２つのカチオン性残基の間に規則的に離された間隔で交互配置される。カチオン性ドメインがカチオン性残基の間に交互配置される非カチオン性残基を含むいくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、反復（二量体、三量体、四量体など）サブユニットを含むドメインとして説明され得る。これらのサブユニットには、－ＲカチオンＲ中性－、－ＲカチオンＲ中性Ｒ中性－、－ＲカチオンＲ脂質－、－ＲカチオンＲ脂質Ｒ脂質－、－Ｒ脂質ＲカチオンＲ脂質－、－Ｒ脂質Ｒ脂質Ｒカチオン－、－ＲカチオンＲ中性Ｒ脂質－、または－ＲカチオンＲ脂質Ｒ中性－が含まれ得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、非カチオン性残基は、カチオン性ドメイン内の２つのカチオン性残基の間に散在され、非カチオン性残基の数は、各対のカチオン性残基の間で変化する。カチオン性ドメインがカチオン性残基の間に散在する非カチオン性残基を含む特定の実施形態において、各対のカチオン性残基は、独立して、少なくとも１つの非カチオン性残基によって分離される。いくつかの実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性を含む。他の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ脂質を含む。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がカチオン性ドメインを含むいくつかの実施形態において、各Ｒ５は、

である。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドがカチオン性ドメインを含む他の実施形態において、各カチオン性部分Ｒ５は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドが、１つ以上の二量体または三量体サブユニットを含むカチオン性ドメインを含む特定の実施形態において、各カチオン性部分Ｒ５は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。さらに他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、１つ以上の三量体サブユニット－ＲカチオンＲ中性Ｒ中性－を含むカチオン性ドメインを含み、各カチオン性部分Ｒ５は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。さらに他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、少なくとも１つの三量体サブユニット－ＲカチオンＲ中性Ｒ脂質－を含み、各カチオン性部分Ｒ５は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。
本明細書に記載されるように、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、１つ以上の異なるカチオン性部分（Ｒカチオン１、Ｒカチオン２、Ｒカチオン３など）、１つ以上の異なる中性スペーサー部分（Ｒ中性１、Ｒ中性２、Ｒ中性３など）、および／または１つ以上の異なる脂質部分（Ｒ脂質１、Ｒ脂質２、Ｒ脂質３など）を含み得る。一般的なカチオン性および中性スペーサーアミノ酸残基の配列または配置の上記の例は、本開示のペプチド化合物に限定することは意図されないことを認識されたい。カチオン性、中性スペーサー、および脂質部分は、一般的に前述されるようにランダム、交互、またはブロック配列で存在し得、より大きなブロックまたは交互する構造的モチーフ内における個別のカチオン性部分、中性部分、および脂質部分の特定の配列で存在し得る。例えば、残基のいくつかの例示的な配置には、Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１、Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒ脂質１、
Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒカチオン１Ｒ中性１－Ｒ脂質２Ｒカチオン２Ｒ中性２Ｒ脂質２Ｒカチオン２Ｒ中性２、Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質３Ｒ脂質４Ｒ中性１Ｒ中性２Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ中性２Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質３Ｒ脂質４、またはＲ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒカチオン１Ｒ中性１Ｒ脂質１Ｒ脂質２Ｒ脂質１Ｒ脂質２が含まれ得るが、これらに限定されない。
側鎖官能化およびペプチドコンジュゲート化合物
上記のように、オリゴペプチド骨格は、主に、Ｎ－位置にカチオン性、中性スペーサー、もしくは脂質部分を有する天然または非天然アミノ酸（ＲａおよびＲｂ）に認められる側鎖部分を有するアミノ酸残基を含む（Ｒ４およびＲ５）。
一態様において、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＲａ、Ｒｂ、Ｒ４、およびＲ５基は、小分子または抗体などの治療剤および／または標的化要素に共有結合するために使用することができる反応性リンカー基をさらに含み得る。これらの追加の官能性は、合成もしくは脱保護条件と適合しない（酸に不安定なリンカーなど）か、または適切な保護基戦略が利用できない（例、ポリアミン）、カチオン性基も含み得る。反応性基は、例えば、既存の側鎖Ｒａおよび／もしくはＲｂ、またはＲ５のカチオン性部分、Ｎ－位置のＲ４の中性スペーサーもしくは脂質部分に、当技術分野で知られている化学的方法によって付加することができる。あるいは、所望の反応性部分を有するＲａ、Ｒｂ、Ｒ４、またはＲ５基が、対応する遊離アミンとして商業的に入手可能である場合、対応する遊離アミンは、ペプチド鎖の一般的な合成中（例えば、サブモノマー合成中）に組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、反応性基またはリンカー基を含む１つ以上のアミノ酸残基を含む。好適な反応性基には、エステル、アミド、イソシアネート、チオール、または「クリック」ケミストリー適合性部分（例えば、アジド、アルキニル）が含まれ得るが、これらに限定されない。
別の態様において、本開示はさらに、カチオン性化合物として、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物をさらに提供し、ペプチド化合物が治療剤および／または標的化要素に共有結合またはコンジュゲートされる。特定の実施形態において、治療剤および／または標的化要素は、小分子、ペプチド配列、抗体もしくは抗体フラグメント、アプタマー、モノもしくはオリゴサッカライド（例えば、ガラクトース）、またはグリカンである。
特定の生理学的条件環境下で感受性もしくは不安定なリンカー基または結合は、特定の器官または細胞への標的化送達、それに続く細胞内または細胞への治療剤および／またはポリアニオン性物質の選択的放出を可能にするために有用であり得る。さらに、不安定な結合はまた、ポリアニオン性物質の送達後の細胞（または器官、もしくは全身）からの三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性化合物の排除および消失を促進し得る。特定の実施形態において、リンカー基は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と治療剤または標的化要素との間の共有結合が、加水分解的に不安定、化学的に不安定、ｐＨに不安定、光に不安定、熱に不安定、または酵素的に切断可能であるように選択される。
末端（キャッピング）残基および末端基の保護
本明細書に記載されるように、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、脂質部分でＮ－置換され（「Ｎ－脂質化」）、かつ／またはオリゴエチレングリコールおよび／もしくはポリエチレングリコールでＮ－置換（「Ｎ－ＰＥＧ化」）されるアミノ酸残基によって、そのＮ末端および／またはＣ末端がキャップされるオリゴペプチド骨格を含む。カチオン性ペプチド化合物のＮ－脂質化は、化合物、ならびに化合物とポリアニオン種との間に形成される任意の複合体に、好都合な親油性を付与する。Ｎ－ＰＥＧ化は、インビボでの粒子形成および凝集におけるより優れた制御を提供する。Ｎ末端およびＣ末端の末端アミノ酸およびカルボン酸部分は、保護末端基でさらにキャッピングされ得る。
本明細書に記載されるように、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化および／またはＮ－ＰＥＧ化されるアミノ酸残基を含み得る。本明細書に提供されるカチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化またはＮ－ＰＥＧ化される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物である。他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。なおさらに他の実施形態において、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化およびＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基の両方を含む。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。
脂質部分
上記のように、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端および／またはＣ末端にアミノ酸残基を含み得、アミノ酸残基は、脂質部分でＮ－置換されるか、または「Ｎ－脂質化」される。本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物のＮ末端および／またはＣ末端でのＮ－脂質化アミノ酸残基の組み込みは、化合物の親油性を増加させる。カチオン性ペプチド化合物の親油性の増加は、細胞膜の脂質二重層などの疎水性環境に対するそれらの親和性を高め、したがって、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、およびポリアニオン性化合物とのそれらの複合体の細胞に輸送される性質を増加させる。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化される。いくつかの実施形態において、本開示の三級アミン脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端にＮ－脂質化アミノ酸残基を含む。他の実施形態において、本開示の三級アミン脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｃ末端にＮ－脂質化アミノ酸残基を含む。特定の実施形態において、本開示の三級アミン脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端およびＣ末端にＮ－脂質化アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるカチオン性ペプチド化合物のＮ末端におけるＮ－脂質化アミノ酸残基の数は、ｎによって表される。他の実施形態において、本明細書に記載されるカチオン性ペプチド化合物のＮ末端におけるＮ－脂質化アミノ酸残基の数は、ｓによって表される。
いくつかの実施形態において、ｎは、整数０～８である。特定の実施形態において、ｎは、整数０～５である。他の実施形態において、ｎは、整数０、１、２、３、４、５、６、または７である。いくつかの実施形態において、ｎは、整数４以下である。さらに他の実施形態において、ｎは、整数１、２、３、または４である。特定の実施形態において、ｎは、４である。いくつかの実施形態において、ｓは、整数０～８である。特定の実施形態において、ｓは、整数０～５である。他の実施形態において、ｓは、整数０、１、２、３、４、５、６、または７である。いくつかの実施形態において、ｓは、整数４以下である。さらに他の実施形態において、ｓは、整数１、２、３、または４である。特定の実施形態において、ｓは、４である。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ－脂質化されるいくつかの実施形態において、ｎまたはｓのうちの少なくとも１つは、０以外である。いくつかの実施形態において、ｎは、０以外である。特定の実施形態において、ｎは、０以外であり、ｓは、０である。他の実施形態において、ｓは、０以外である。特定の実施形態において、ｓは、０以外であり、ｎは、０である。特定の実施形態において、ｎおよびｓの両方が、０以外である。
いくつかの実施形態において、ｎとｓの合計は、整数１～８、２～７、または４～６である。他の実施形態において、ｎとｓの合計は、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４である。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化残基のブロック、または「Ｎ－脂質ブロック」を含み、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、互いに隣接する少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＮ－脂質化残基を含む（例えば、Ｒ脂質Ｒ脂質Ｒ脂質）。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化残基のブロックを含み、ｎは、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４である。他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化残基のブロックを含み、ｓは、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４である。
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド中のＮ－脂質化アミノ酸残基は、脂質部分Ｒ３によってＮ－置換される。本開示の脂質部分は、中性である（すなわち、電荷を有さないか、または正味の電荷がゼロである）疎水性または親油性部分を含み得る。本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性化合物の脂質部分は、天然または合成のいずれかに由来し得る。各Ｒ３は、独立して脂質部分であり、同じかまたは異なり得る。いくつかの実施形態において、各Ｒ３は、同じである。他の実施形態において、各Ｒ３は、異なる。ｎとｓの合計が少なくとも２（つまり、ｎ＋ｓ≧２））であるさらに他の実施形態において、脂質部分Ｒ３のうちの少なくとも２つは、互いに異なる。
Ｎ－脂質化アミノ酸残基の特定の配列または配置は、核酸との複合体形成および核酸の送達を改善するために特に有用であり得ることを認識されたい。例えば、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性化合物が、２つの異なる脂質部分Ｒ３ａおよびＲ３ｂのうちの１つを有する混合Ｎ－脂質化アミノ酸残基のセットを含むいくつかの実施形態において、Ｎ－脂質化アミノ酸残基は、交互またはブロック配列でＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置され得る。Ｎ－脂質化アミノ酸残基の交互配列の一例は、Ｒ３ａ－Ｒ３ｂ－Ｒ３ａ－Ｒ３ｂまたはＲ３ｂ－Ｒ３ａ－Ｒ３ｂ－Ｒ３ａによって表され得る。ブロック配列の例は、Ｒ３ａ－Ｒ３ａ－Ｒ３ｂ－Ｒ３ｂまたはＲ３ｂ－Ｒ３ｂ－Ｒ３ａ－Ｒ３ａで表され得る。他の実施形態において、Ｎ－脂質化アミノ酸残基の配列は、ランダムに順序付けられ得る。２つのＮ－脂質化アミノ酸残基の配列または配置の上記の例は、限定することが意図されていないことを認識されたい。さらに、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｒ３の２つ以上の異なる脂質部分を含み得、これは、一般に上記のように、ランダム、交互、またはブロック配列で存在し得る。
好適な脂質部分には、例えば、任意選択的に置換された分岐もしくは直鎖脂肪族部分、または任意選択的に、脂肪酸、ステロール、およびイソプレノイドを含む天然脂質化合物に由来する任意選択的に置換された部分が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、脂質部分は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に１つ以上の二重または三重結合（すなわち、飽和またはモノもしくはポリ不飽和）を含む、分岐または直鎖脂肪族部分を含み得る。特定の実施形態において、脂質部分は、任意選択的に置換された脂肪族、直鎖または分岐部分を含み得、各疎水性テールは、独立して、約８～約３０個の炭素原子または約６～約３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態において、脂質部分は、例えば、脂肪酸および脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、各Ｒ３は、独立して、Ｃ８－Ｃ２４－アルキルまたはＣ８－Ｃ２４－アルケニルであり、Ｃ８－Ｃ２４－アルケニルが、任意選択的にモノまたはポリ不飽和である。いくつかの実施形態において、各Ｒ３は、Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはＣ６－Ｃ１８アルケニルである。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ３は、Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはＣ６－Ｃ１８アルケニルであり、Ｃ６－Ｃ１８アルケニルが、モノ不飽和である。特定の他の実施形態において、各脂質部分Ｒ３は、Ｃ６－Ｃ１７アルキルまたはＣ６－Ｃ１７アルケニルである。特定の実施形態において、各Ｒ３は、Ｃ８－Ｃ１２アルキルである。さらに他の実施形態において、各Ｒ３は、ｎ－デシルなどのＣ１０－アルキルである。いくつかの実施形態において、各Ｒ３は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプリリル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。他の実施形態において、各脂質部分Ｒ３は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。特定の実施形態において、各脂質部分Ｒ３は、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。他の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。
さらに他の実施形態のいずれかと組み合わされ得るさらに他の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、

である。
いくつかの実施形態において、各Ｒ３は、独立して、約６～５０個の炭素原子を有する分岐または直鎖脂肪族部分である。特定の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、直鎖脂肪族部分である。特定の他の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、分岐脂肪族部分である。ｎとｓの合計が少なくとも２（つまり、ｎ＋ｓ≧２）であるなおさらに他の実施形態において、各Ｒ３は独立して分岐または直鎖脂肪族部分であり、脂質部分Ｒ３の少なくとも２つは互いに異なる（Ｒ３ａおよびＲ３ｂ）。いくつかの実施形態において、脂質部分Ｒ３は、２つの異なる脂質部分Ｒ３ａおよびＲ３ｂのうちの１つである。ｎとｓの合計が少なくとも２（つまり、ｎ＋ｓ≧２）である他の実施形態において、少なくとも１つのＲ３は、分岐脂肪族部分であるか、またはそれを含み、少なくとも１つのＲ３は、直鎖脂肪族部分であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの脂質部分Ｒ３（またはＲ３ａもしくはＲ３ｂ）は、分岐脂肪族部分である。前述の実施形態のいずれかと組み合わされ得る特定の実施形態において、少なくとも１つの脂質部分Ｒ３（またはＲ３ａもしくはＲ３ｂ）は、２－エチルヘキサ－１－イルである。
なおさらに他の実施形態のいずれかと組み合わされ得るなおさらに他の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、式

であり、Ｒ８は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に１つ以上の二重結合または三重結合を含む、分岐または直鎖脂肪族部分である。特定の実施形態において、各Ｒ３は、独立して、

である。
本発明の実施において使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質、グリセリド（ジグリセリドまたはトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、ならびに飽和および不飽和ステロール、イソプレノイド、および他の同様の天然脂質に由来することができる。
他の好適な脂質部分は、例えば、ナフタレニルもしくはエチルベンジルを含む、任意選択的に置換されたアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはアリールアルキル部分などの親油性炭素環または芳香族基、あるいは例えばステロールエステルおよびワックスエステルを含むエステル官能基を含む脂質を含み得る。さらに他の実施形態において、脂質部分Ｒ４は、

である。
エチレングリコール部分
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、エチレングリコールのオリゴマーまたはポリマーによってＮ－置換される、すなわち、オリゴエチレングリコールおよび／またはポリエチレングリコールでＮ－置換されるＮ末端および／またはＣ末端にキャッピングアミノ酸残基を含み得る。本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物へのオリゴエチレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール部分の組み込みは、核酸と形成される複合体の粒子安定性を促進し得、インビボでの粒子凝集を防止し得る。
「ＰＥＧ化」という用語は、本明細書では、オリゴエチレングリコール、もしくはポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせでＮ－置換され得る末端アミノ酸残基を含むカチオン性ペプチド化合物を説明するために使用されることを認識されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－ＰＥＧ化されている。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｎ末端にＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ末端にＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む特定の実施形態において、ｍは、Ｎ末端におけるＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基の数を表し、各Ｒ２は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＲ２ａのエチレングリコール部分であり、Ｒ２ａは、－ＨまたはＣ１－Ｃ４－アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２ａは、－Ｈ、－ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施形態において、Ｒ２ａは、－Ｈである。他の実施形態において、Ｒ２ａは、－ＣＨ３である。なおさらに他の実施形態において、Ｒ２ａは、－ＣＨ２ＣＨ３である。
いくつかの実施形態において、ｍは、整数０～１５、整数０～１０、整数０～３、整数４～１０、または整数４～１５である。いくつかの実施形態において、各ｕは、独立して、整数１～２００、整数２～２００、整数２～１００、整数２～５０、整数５０～２００、整数５０～１００、整数１００～２００、または整数１５０～２００である。
特定の実施形態において、ｍは、整数０～３であり、各ｕは、整数２０～２００、または任意選択的に３０～５０である。特定の実施形態において、ｍは、整数０～３であり、ｕは、整数４０～４５である。なおさらに他の実施形態において、ｍは、１であり、ｕは、整数４０～４５である。他の実施形態において、ｍは、整数４～１０であり、各ｕは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｍは、整数４～１０であり、ｕは、整数２～５である。なおさらに他の実施形態において、ｍは、整数７～１０であり、ｕは、３である。他の実施形態において、ｍは、整数４～１５であり、各ｕは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｍは、整数４～１５であり、ｕは、整数２～５である。いくつかの実施形態において、ｍは、整数１０～１５であり、ｕは、整数１～１０である。特定の実施形態において、ｍは、整数１０～１５であり、ｕは、整数１～５である。他の実施形態において、ｍは、整数１０～１５であり、ｕは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｍは、整数１０～１５であり、ｕは、整数２～５である。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、以下の式（Ｉ）の断片に示されるように、Ｃ末端にＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＣ末端にＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基を含む特定の実施形態において、ｔは、Ｎ末端におけるＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基の数を表し、各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＲ６ａのエチレングリコール部分であり、Ｒ６ａは、－ＨまたはＣ１－Ｃ４－アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ６ａは、－Ｈ、－ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３である。特定の実施形態において、Ｒ６ａは、－Ｈである。他の実施形態において、Ｒ６ａは、－ＣＨ３である。なおさらに他の実施形態において、Ｒ６ａは、－ＣＨ２ＣＨ３である。
いくつかの実施形態において、ｔは、整数０～１５、整数０～１０、整数０～３、整数４～１０、または整数４～１５である。いくつかの実施形態において、各ｖは、独立して、整数１～２００、整数２～２００、整数２～１００、整数２～５０、整数５０～２００、整数５０～１００、整数１００～２００、または整数１５０～２００である。
いくつかの実施形態において、ｔは、整数０～３であり、各ｖは、整数３０～５０である。特定の実施形態において、ｔは、整数０～３であり、ｖは、整数４０～４５である。なおさらに他の実施形態において、ｔは、１であり、ｖは、整数４０～４５である。他の実施形態において、ｔは、整数４～１０であり、各ｖは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｔは、整数４～１０であり、ｖは、整数２～５である。なおさらに他の実施形態において、ｔは、整数７～１０であり、ｖは、３である。他の実施形態において、ｔは、整数４～１５であり、各ｖは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｔは、整数４～１５であり、ｖは、整数２～５である。いくつかの実施形態において、ｔは、整数１０～１５であり、ｖは、整数１～１０である。特定の実施形態において、ｔは、整数１０～１５であり、ｖは、整数１～５である。他の実施形態において、ｔは、整数１０～１５であり、ｖは、整数２～１０である。特定の実施形態において、ｔは、整数１０～１５であり、ｖは、整数２～５である。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物がＮ－ＰＥＧ化されるいくつかの実施形態において、ｍまたはｔのうちの少なくとも１つは、０以外である。いくつかの実施形態において、ｍは、０以外である。他の実施形態において、ｔは、０以外である。特定の実施形態において、ｍおよびｔの両方が、０以外である。
Ｎ－脂質化および／またはＮ－ＰＥＧ化
本明細書に記載されるように、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化および／またはＮ－ＰＥＧ化されるアミノ酸残基を含み得る。本明細書で提供されるカチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化またはＮ－ＰＥＧ化される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のいくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、ｓ、またはｔのうちの少なくとも１つは、０以外である。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物であり、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは、０以外である。特定の実施形態において、ｎおよびｓの両方が、０以外である。さらに特定の実施形態において、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉａ）の三級アミノ脂質化カチオン性ペプチド化合物であって、

式中、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは０以外であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、式（Ｉ）について定義されるとおりである。式（Ｉａ）の化合物の特定の実施形態において、ｎおよびｓの両方が、０以外である。
他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外である。特定の実施形態において、ｍおよびｔの両方が、０以外である。特定の実施形態において、ｍおよびｔの両方が、０以外である。他の実施形態において、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉｂ）の三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であって、

式中、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは０以外であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、式（Ｉ）について定義されるとおりである。式（Ｉｂ）の化合物の特定の実施形態において、ｍおよびｔの両方が、０以外である。
なおさらに他の実施形態において、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ－脂質化およびＮ－ＰＥＧ化アミノ酸残基の両方を含む。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である特定の実施形態において、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外であり、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは、０以外である。
なおさらなる実施形態において、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式（Ｉｃ）の三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であって、

式中、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外であり、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは、０以外であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒａ、Ｒｂ、ｏ、ｐ、ｑ、およびｒは、式（Ｉ）について定義されたとおりである。
他の実施形態において、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物はまた、Ｎ－ＰＥＧ化残基と同様な遮蔽効果を提供するＮ末端またはＣ末端に他の中性遮蔽ポリマーまたは部分を有するＮ－置換アミノ酸残基を含み得る。これらには、ヒドロキシルアルキル、ヒアルロン酸、ポリサッカライド、ポリリン酸およびポリホスホエステル、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリオール、親水性ポリペプチド、または他の合成親水性ポリマーのような例が含まれ得る。
Ｎ－およびＣ－末端基
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端およびＣ末端で、それぞれそれらの遊離アミンおよび遊離酸の形態で、または保護された形態で提供され得る。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端および／またはＣ末端残基にさらに保護基または末端キャッピング基を含む。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｎ末端残基に保護基または末端キャッピング基Ｒ１を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、－ＣＨ２－ＣＯＲ１ａ、カチオン性部分、脂質部分、またはオリゴエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール部分であり、Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルキルアリール、または脂質部分である。特定の実施形態において、Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールである。Ｒ１が脂質部分である特定の実施形態において、脂質部分は、リン脂質ではない。Ｒ１がアルキルまたは－ＣＯＲ１ａであり、Ｒ１ａがアルキルであるさらに他の実施形態において、アルキルは、任意選択的に、－ＯＨまたはハロで置換される。
他の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、Ｃ末端残基に保護基または末端キャッピング基Ｒ７を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、カチオン性部分、脂質部分、またはオリゴエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分である。Ｒ７が脂質部分である特定の実施形態において、脂質部分は、リン脂質ではない。
なおさらなる実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＮ末端およびＣ末端は、Ｒ１およびＲ７が反応性リンカー基などの追加の官能基を有するように選択またはさらに修飾され得る。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドのＲ１および／またはＲ７は、独立して、１つ以上の反応性リンカー基を含む。好適な反応性基には、エステル、アミド、イソシアネート、チオール、または「クリック」ケミストリー適合性部分（例えば、アジド、アルキニル）が含まれ得るが、これらに限定されない。
次に、反応性リンカー基を使用して、標的化要素または治療剤を含む他の有用な化合物を、ペプチド化合物に共有結合し得る。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、治療剤および／または標的化要素に共有結合またはコンジュゲートされる。特定の実施形態において、治療剤および／または標的化要素は、小分子、抗体、または抗体フラグメントである。
さらに、Ｒ１およびＲ７における追加の官能基はまた、合成もしくは脱保護条件と適合しない（酸に不安定なリンカーなど）か、または適切な保護基戦略が利用できない（例えば、ポリアミン）、カチオン性基を含み得る。なおさらなる実施形態において、Ｒ１は、ポリアミンである。Ｒ１がポリアミンであるいくつかの実施形態において、ポリアミンは、

である。特定の実施形態において、ポリアミンは、

からなる群から選択される。
上記のように、特定の生理学的条件環境下で感受性もしくは不安定であるリンカー基または結合は、特定の細胞への標的化送達ポリアニオン性物質を促進し、排除などの特定の薬物動態特性を改善し得る。特定の実施形態において、リンカー基は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と治療剤または標的化要素との間の共有結合が、加水分解的に不安定、化学的に不安定、ｐＨに不安定、光に不安定、熱に不安定、または酵素的に切断可能であるように選択される。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の組み合わせ
本開示の複合体および組成物は、１つ以上のカチオン性化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体は、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含み得る。本開示の複数のカチオン性ペプチド化合物の混合物および組み合わせの単一複合体での使用は、特定の薬物動態学的および薬力学的特性に合わせた製剤の調製を可能にし得る。関連の薬物動態および薬力学の特性には、生体内分布、免疫原性、製剤安定性、カプセル化割合、トランスフェクション効率、血漿半減期などが含まれ得るが、これらに限定されない。これらの特性の異なる組み合わせが、異なる適用のために必要とされ得る。
例えば、特定の実施形態において、複合体または組成物は、高度に脂質化され、かつ／あるいは少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を有するカチオンが豊富である１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の組み合わせを含み得る。理論的に、かかる組み合わせは、より高い親油性遮蔽（脂質化ペプチド化合物による）とともにより大きな電荷安定化（カチオンに富むペプチド化合物を介した）を提供することによって、ポリアニオン化合物の改善された送達を付与することができる。個々の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の各々の量は、所望の特性を達成するために調整され得ることをさらに認識されたい。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の合成
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製する方法が提供される。
本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、脂質部分をオリゴペプチドコアにコンジュゲートする追加のリンカー種を必要とせずに合成され得る。本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物では、脂質およびエチレングリコール部分は、ペプチドそれ自体内の窒素原子と、すなわち、アミノ酸残基中のアミド窒素またはＮ－位置で共有結合および直接結合される。したがって、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドは、ペプチド鎖にＮ－置換残基を生成するための当技術分野で知られている方法によって完全に合成され得る。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、残基がＮ－位置にカチオン性、中性、脂質、またはオリゴ／ポリエチレングリコール部分を有するかに関係なく、添加される各アミノ酸残基の一連のアシル化（アミド化）および求核性置換（アミノ化）反応によって調製され得る。本明細書に記載のカチオン性ペプチド化合物は、ペプチド鎖への個々の残基の連続的な付加によって合成される。残基の連続的な付加は、アミノ酸の所望の配列および長さが達成されるまで繰り返して実行され得る。
本発明の化合物は、固相法および液相法の両方によって合成することができる。本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含むＮ－置換ペプチドを調製するための例示的な方法は、固相合成によって以下で考察され、図３Ａ～３Ｅに示される。
図３Ａに示されるように、末端二級アミンを有する固体樹脂支持体は、合成の開始時に提供される。アシル化剤は、好適なペプチドカップリング試薬および溶媒とともに末端二級アミンに添加されて、末端二級アミンとアシル化剤との間にアミド結合を形成する。アシル化剤は、好ましくはアセチル化剤である。アシル化剤は、α炭素でのアミド化およびそれに続くアミノ化を促進する、少なくとも２つの好適な脱離基を含む。特定の実施形態において、アシル化剤は、ハロ酢酸である。他の実施形態において、アシル化剤は、ブロモ酢酸である。
図３Ｂにおいて、図３Ａで生成されるアシル化生成物は、所望の置換された一級または二級アミンと反応して、対応するＮ－置換された末端アミノ酸残基を提供する。選択される一級または二級アミンは、α炭素上でブロモ酢酸における臭素などの脱離基を置換して、対応するアミノ化生成物を生成する。いくつかの実施形態において、一級または二級アミンは、ＮＨＲｐＲ２、ＮＨＲｐＲ３、ＮＨＲｐＲ４、ＮＨＲｐＲ５、およびＮＨＲｐＲ６からなる群から選択されるアミンであり、Ｒｐは、－Ｈまたは保護基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、本明細書に記載の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物について定義されるとおりである。
アミド化およびアミノ化反応は、所望のペプチド配列が達成されるまで（図３Ｄ）、連続して繰り返される（図３Ｃ）。本明細書に記載される三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製する方法は、連続的なアミド化／アミノ化反応の過程でペプチド鎖の反応性部分とのいかなる望ましくない反応も防止する保護および脱保護ステップをさらに含み得ることを認識されたい。例えば、保護基Ｒｐは、合成中に本明細書に記載のペプチド化合物に沿った任意の場所で、α炭素および／またはＮ－置換基で側鎖に付加され得る。好適な保護基Ｒｐは、当技術分野で知られている任意の保護基、特に、Ｂｏｃ／ＢｚｌまたはＦｍｏｃ／ｔＢｕなどのオルソゴナル保護スキームにおけるペプチド合成に適しているものを含み得る。
Ｎ末端およびＣ末端（Ｒ１およびＲ７）での末端基の取り込み、ならびにオリゴペプチド骨格に沿ったアミノ酸残基の末端基および／または側鎖（Ｒａ、Ｒｂ、Ｒ４、Ｒ５）の官能化は、当技術分野で知られている方法によって実行することができる。当業者は、好適な方法の選択および全体的な固相合成に対する追加の官能化ステップのタイミングが、追加される末端基および／またはリンカー基、ならびにペプチド化合物に存在する他の部分および／または保護基との当該方法の適合性に依存することを認識するであろう。
所望のペプチド化合物は、上記の合成で利用される任意の保護スキームに応じて、塩酸、臭化水素酸、またはトリフルオロ酢酸を含む、酸性条件などの好適な反応条件下で固体樹脂支持体から切断される（図３Ｅ）。固体樹脂支持体からの三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の切断は、対応する遊離カチオン性ペプチド化合物を溶液中に生成する。
さらなるステップを実施して、カチオン性ペプチド化合物を溶液から単離および精製し得、例えば、固体樹脂支持体からのペプチド含有溶液の濾過および固体生成物を提供するための単離された濾液の凍結乾燥が含まれる。
樹脂切断に効果を与えるために用いられる酸性条件によって、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が対応する酸性塩の形態で存在し得ることを認識されたい。例えば、いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、その塩形態である。特定の実施形態において、塩形態は、酸付加塩である。いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、塩酸塩（塩酸付加塩）、臭化水素酸塩（臭化水素酸付加塩、またはトリフルオロ酢酸塩（トリフルオロ酢酸付加塩）である。特定の実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のトリフルオロ酢酸付加塩、またはトリフルオロ酢酸塩である。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の酸付加塩形態は、１つ以上の薬学的に許容される塩形態を得るために、当技術分野の方法（例えば、イオン交換）を介してさらに修飾され得る。「薬学的に許容される」という句は、物質または組成物が、化学的および／または毒物学的に、製剤を構成する他の成分、および／または製剤が投与される対象と適合性でなければならないことを示す。「薬学的に許容される酸付加塩」という用語は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸、などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、安息香酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸「メシレート」、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、およびサリチル酸などの有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、複素環式、カルボン酸、およびスルホン酸のクラスから選択される有機酸で形成される薬学的に許容される塩を含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の塩は、薬学的に許容される塩である。特定の実施形態において、塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、またはサリチル酸塩である。
リピトイド
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体および組成物の１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上のカチオン性ペプトイド－リン脂質コンジュゲート構築物を含み、リピトイドとしても知られる。リピトイドは、ペプトイド骨格に沿ったグリシン残基のＮ－位置にカチオン性および／または中性側鎖の組み合わせを有するＮ－置換ポリグリシン化合物（「ペプトイド」としても知られる）であり、ペプトイド鎖の単一末端リン脂質基にさらにコンジュゲートされる。リピトイドおよびそれらの合成は、一般に、Ｓｉｍｏｎ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，９３６７－９３７１（１９９２）、Ｌｏｂｏ，Ｂ．Ａ．；Ｖｅｔｒｏ，Ｊ．Ａ．；Ｓｕｉｃｈ，Ｄ．Ｍ．；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．；Ｍｉｄｄａｕｇｈ，Ｃ．Ｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｏｉｄ／Ｌｉｐｉｔｏｉｄ：ＤＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００３，９２（９），１９０５－１９１８、およびＵｔｋｕ，Ｙ．；Ｄｅｈａｎ，Ｅ．；Ｏｕｅｒｆｅｌｌｉ，Ｏ．；Ｐｉａｎｏ，Ｆ．；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．；Ｐａｇａｎｏ，Ｍ．；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｋ．Ａ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ＳｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ２００６，２（６－７），３１２に記載される。例示的なリピトイドは、図１に示されるような九量体「リピトイド１」である。リピトイド化合物の一般的な構造を以下の式（ＩＩ）に示し、式中、ｘは、整数１～１００であり、各Ｒ９は、独立して脂質部分であり、各Ｒ１０は、独立して、カチオン性部分または中性部分である。
上記の式（ＩＩ）において、ｘは、整数１～１００である。特定の数の残基は、本明細書に記載の複合体および組成物における使用のために特に好適であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｘは、整数１～５０、２～２５、または３～１５である。
上記の式（ＩＩ）に示されるように、Ｒ９は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有する分岐または直鎖脂肪族部分を含むがこれらに限定されない脂質部分を表し、任意選択的に、１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に、１つ以上の二重結合または三重結合（すなわち、飽和またはモノもしくはポリ不飽和）を含む。特定の実施形態において、脂質部分Ｒ９は、任意選択的に置換された脂肪族、直鎖部分、または分枝部分を含み得、各疎水性テールは、独立して、約８～約３０個の炭素原子または約６～約３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態において、脂質部分は、例えば、脂肪酸および脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、各脂質部分Ｒ９は、独立して、Ｃ８－Ｃ２４－アルキルまたはＣ８－Ｃ２４－アルケニルであり、Ｃ８－Ｃ２４－アルケニルが、任意選択的にモノまたはポリ不飽和である。他の実施形態において、各脂質部分Ｒ９は、独立して、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される。さらに他の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るさらに他の実施形態において、各脂質部分Ｒ９は、独立して、

である。
アミノグリシン残基のＮ－位置の基Ｒ１０は、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物について上に記載のものと同様のカチオン性および中性部分を含む。
カチオン性、または正電荷の部分は、例えば、アミノ、グアニジノ、ヒドラジド、およびアミジノである官能基を含むものなど、窒素ベースの置換基を含み得る。これらの官能基は、芳香族、飽和環状、または脂肪族のいずれかであることができる。リピトイドのいくつかの実施形態において、各カチオン性部分は、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、またはＮ－ヘテロシクリルアルキルである。他の実施形態において、各カチオン性部分は、独立して、

である。特定の実施形態において、各カチオン性部分は、独立して、

からなる群から選択される。さらに他の実施形態において、各カチオン性部分は、

である。
中性部分は、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１－Ｃ４－アルキルであり得るが、これらに限定されず、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルは、任意選択的に、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、もしくはアルコキシによって置換される。リピトイドのいくつかの実施形態において、各中性部分は、

からなる群から選択される。特定の実施形態において、各中性スペーサー部分は、

である。さらに他の実施形態において、各中性スペーサー部分は、

である。
さらに他の実施形態において、各カチオン性部分は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。なおさらなる実施形態において、１つ以上のリピトイドは、リピトイド１を含む。
上記の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と同様に、本明細書に記載のリピトイドは、ランダム配列、または交互配列もしくはブロック配列における反復モチーフで配置され得るアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のリピトイドは、ｘ残基の鎖内に反復（二量体、三量体、四量体など）サブユニットを含み得る。これらのサブユニットには、－ＲカチオンＲ中性－または－ＲカチオンＲ中性Ｒ中性－が含まれ得るが、これらに限定されず、Ｒカチオンは、カチオン性部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基である。他の実施形態において、式（ＩＩ）のリピトイドは、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性を含み、Ｒカチオンは、カチオン性部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基である。
式（ＩＩ）のリピトイドがカチオン性ドメインを含むいくつかの実施形態において、各カチオン性部分Ｒ１０は、

である。前述の実施形態の他の実施形態において、各カチオン性部分Ｒ１０は、

であり、各中性スペーサー部分Ｒ１０は、

である。特定の実施形態において、式（ＩＩ）のリピトイドは、１つ以上の二量体または三量体サブユニットを含み、各カチオン性部分は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。さらに他の実施形態において、式（ＩＩ）のリピトイドは、１つ以上の三量体サブユニット－ＲカチオンＲ中性Ｒ中性－を含むカチオン性ドメインを含み、Ｒカチオンは、カチオン性部分を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分を含むアミノ酸残基であり、各カチオン性部分は、

であり、各中性スペーサー部分は、

である。
三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と同様に、本明細書に記載の複合体および組成物は、１つ以上のリピトイドを含み得る。特定の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上のリピトイドを含む。さらに他の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、リピトイド１を含む。
脂質様カチオン性化合物
さらに他の実施形態において、本明細書に記載の複合体および組成物の１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上の脂質様カチオン性化合物を含み得る。
脂質様カチオン性化合物は、１つ以上のイオン化可能な（カチオン性）窒素含有部分および１つ以上の親油性テールを含む両親媒性化合物である。脂質様カチオン性化合物は、あるいは、「カチオン性脂質」または「イオン化可能な脂質」と呼ばれる。脂質様カチオン性化合物におけるイオン化可能な（カチオン性）部分は、好適な生理学的ｐＨレベルで正電荷部分にイオン化される中性三級アミンを含み得る。あるいは、イオン化可能な（カチオン性）原子は、好適な対イオンを有する正電荷基として提供される四級アンモニウム基であり得る。親油性テールは、例えば、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に１つ以上の二重または三重結合（すなわち、飽和またはモノもしくはポリ不飽和）を含む、分岐または直鎖脂肪族部分を含み得る。
脂質様カチオン性化合物の例は、米国特許公開第２０１８／０１４７１６６Ａ１号に記載されており、以下の式（ＩＩＩ）として示される。
いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、式（ＩＩＩ）の１つ以上の脂質様カチオン性化合物を含み、

式中、各Ｒ１１は、独立して、置換または非置換アルキルであり、各Ｒ１２は、独立して、置換または非置換アルキルであり、各Ｒ１３は、独立して、水素または置換もしくは非置換のアルキルであり、各ｙは、独立して、整数１～８である。
ＰＥＧ化化合物
本明細書に記載されるように、本開示の複合体および組成物は、ＰＥＧ化脂質またはＰＥＧ（および任意選択的に同様に脂質）官能性を有する化合物などの１つ以上のＰＥＧ化化合物を含む。本明細書に記載のＰＥＧ化化合物は、あるいは、「ＰＥＧ化合物」と呼ばれ得る。１つ以上のカチオン性化合物および１つ以上のポリアニオン性カーゴを含む複合体へのＰＥＧ化化合物の組み込みは、粒子の凝集を阻止し、粒子の表面電荷を遮蔽し、例えばヌクレアーゼによる攻撃を含む内因性分解経路に対する保護を提供することによって、カチオン性化合物－カーゴの細胞内取り込みを促進する。
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体および組成物は、１つ以上のＰＥＧ化化合物を含み、１つ以上のＰＥＧ化化合物は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。「ＰＥＧ化脂質」という用語は、「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ修飾脂質」と互換的に呼ばれ得ることを認識されたい。本明細書に記載されるように、ＰＥＧ化脂質は、ポリエチレングリコール部分に共有結合された任意の脂質または脂質様化合物を含むと理解され得る。
ＰＥＧ化脂質のために好適な脂質部分には、例えば、任意選択的に置換された分岐もしくは直鎖脂肪族部分、または脂肪酸、ステロール、およびイソプレノイドを含む天然脂質化合物に由来する任意選択的に置換された部分が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、脂質部分は、約６～約５０個の炭素原子または約１０～約５０個の炭素原子を有し、任意選択的に１つ以上のヘテロ原子を含み、任意選択的に１つ以上の二重または三重結合（すなわち、飽和またはモノもしくはポリ不飽和）を含む、分岐または直鎖脂肪族部分を含み得る。特定の実施形態において、脂質部分は、任意選択的に置換された脂肪族、直鎖または分岐部分を含み得、各疎水性テールは、独立して、約８～約３０個の炭素原子または約６～約３０個の炭素原子を有する。特定の実施形態において、脂質部分は、例えば、脂肪酸および脂肪アルコールに由来する脂肪族炭素鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、各脂質部分は、独立して、Ｃ８－Ｃ２４－アルキルまたはＣ８－Ｃ２４－アルケニルであり、Ｃ８－Ｃ２４－アルケニルが、任意選択的に、モノまたはポリ不飽和である。
本発明の実施において使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質、グリセリド（ジグリセリドまたはトリグリセリドなど）、グリコシルグリセリド、スフィンゴ脂質、セラミド、ならびに飽和および不飽和ステロール、イソプレノイド、および他の同様の天然脂質に由来することができる。
他の好適な脂質部分は、例えば、ナフタレニルもしくはエチルベンジルを含む、任意選択的に置換されたアリールまたはアリールアルキル部分などの親油性芳香族基、あるいは例えばステロールエステルおよびワックスエステルを含むエステル官能基を含む脂質を含み得る。
他の実施形態において、１つ以上のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ステロールを含む。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾コレステロールを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾セラミドである。特定の実施形態において、ＰＥＧ修飾セラミンは、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］｝およびＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］｝、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾リン脂質のリン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ １６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。特定の実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ＤＭＰＥ（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ修飾ＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ）、およびＰＥＧ修飾ＤＯＰＥ（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ）からなる群から選択されるＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールである。
特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、ジステアロイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、ジパルミトイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＰＧ－ＰＥＧ）、およびジオレオイルグリセロール－ポリエチレングリコール（ＤＯＧ－ＰＥＧ）からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧである。
前述のＰＥＧ脂質におけるＰＥＧ鎖の特定の分子量が、本開示の複合体への組み込みに特に有利であり得ることをさらに認識されたい。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＧ鎖は、３５０～６，０００ｇ／ｍｏｌ、１，０００～５，０００ｇ／ｍｏｌ、または２０００～５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、３，０００ｇ／ｍｏｌ、５，０００ｇ／ｍｏｌ、または１０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の他の実施形態において、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、または５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。例えば、特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質は、ジミリストイルグリセロール－ポリエチレングリコール２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）である。
三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド
なおさらなる実施形態において、１つ以上のＰＥＧ化化合物は、少なくとも１つのオリゴまたはポリエチレングリコール部分を含む式（Ｉ）の三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。ペプチド鎖の骨格に沿って脂質部分およびＰＥＧ部分の両方を収容するそれらのフレキシビリティのおかげで、かつそれらの特定の置換基の性質に応じて、本開示の式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、カチオン性送達ビヒクルとしてだけでなく、カチオン性化合物－ポリアニオン性化合物複合体を安定化する好適なＰＥＧ化化合物としても機能する。式（Ｉ）の三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、リピトイドまたは脂質様化合物などの他のクラスのカチオン性化合物、ならびに式（Ｉ）の他の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と組み合わされ得ることを認識されたい。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化化合物は、本明細書に記載の式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外である（すなわち、Ｎ－ＰＥＧ化）。なおさらなる実施形態において、ＰＥＧ化化合物は、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ｍおよびｔは、独立して、整数０～１５であり、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化化合物は、式（Ｉｂ）の三級アミノＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である。さらに他の実施形態において、ＰＥＧ化化合物は、式（Ｉｃ）の三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性化合物である。
上記のＰＥＧ化脂質と同様に、前述の三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物におけるＰＥＧ鎖の特定の分子量が、本開示の複合体への組み込みのために特に有利であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＥＧ鎖は、３５０～６，０００ｇ／ｍｏｌ、１，０００～５，０００ｇ／ｍｏｌ、または２０００～５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実施形態において、三級アミノ脂質化およびＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のＰＥＧ鎖は、約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、３，０００ｇ／ｍｏｌ、または５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の他の実施形態において、ＰＥＧ脂質のＰＥＧ鎖は、約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、または５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
しかしながら、式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、いくつかの短いオリゴエチレングリコール部分を、より少なくより長いポリエチレングリコール部分の代わりに含み得、複合体に同様な粒子安定化を提供し得ることを認識されたい。ＰＥＧ化化合物が式（Ｉ）のＮ－ＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であるいくつかの実施形態において、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物は、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＲ２ａの少なくとも１つのエチレングリコール部分Ｒ２を含み、式中、各Ｒ２ａは、独立して、－ＨまたはＣ１－Ｃ４－アルキルである。他の実施形態において、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＲ６の少なくとも１つのエチレングリコール部分Ｒ６ａであり、式中、各Ｒ６ａは、独立して、－ＨまたはＣ１－Ｃ４－アルキルである。ｍが０以外である前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るいくつかの実施形態において、ｍは、整数０～１５であり、各ｕは、独立して、整数１～２００である。ｔが０以外である前述の実施形態のうちのいずれかと組み合わされ得るなおさらなる実施形態において、ｔは、整数０～１５であり、各ｖは、独立して、整数１～２００である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化化合物は、本明細書に記載される式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物であり、ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外であり、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは、０以外である（すなわち、Ｎ－脂質化）。式（Ｉ）のＮ－ＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物もＮ－脂質化される特定の実施形態において、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つは、０以外である。いくつかの実施形態において、ｎとｓの合計は、少なくとも１、２、３、または４である。特定の実施形態において、ｓは、４である。なおさらに別の実施形態において、ｎは、４である。
ポリアニオン性化合物および他の送達カーゴ
本明細書に記載されるように、本開示の複合体および組成物は、カチオン性化合物と複合体化された、核酸などの１つ以上のポリアニオン性化合物を含み得る。三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物などの１つ以上のカチオン性化合物ならびに１つ以上のＰＥＧ化脂質を、ポリアニオン性化合物とともに含む本開示の複合体および組成物を使用して、核酸などのポリアニオン性化合物を細胞内部に送達し得る。ポリアニオン性カーゴに加えて、本明細書に提供される複合体および組成物はまた、広範囲の非アニオン性カーゴの細胞内送達のために利用され得る。細胞に送達されるポリアニオン性および非アニオン性化合物またはカーゴに応じて、本明細書に提供される複合体および組成物は、例えばワクチン接種および遺伝子治療を含む多くの異なる適用において有用であり得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸を含む。本明細書で使用される核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはそれらのハイブリッドなどの天然に存在する核酸、ならびにホスホロチオエート、非天然および修飾塩基、ならびに非天然および修飾末端などの非天然骨格および修飾骨格結合を有する非天然に存在する変種が含まれる。例示的な核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡが含まれる。
核酸は、組換えによって生成されるか、または化学的に合成される分子であり得る。核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、および四本鎖、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含む、より複雑な三次元形態であり得る。
核酸の種類に応じて、核酸の長さ（必要に応じてヌクレオチド単位または塩基対（ｂｐ）で定義される）が異なり得る。核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、１００～１０，０００ヌクレオチド単位、または１，０００～３，０００ヌクレオチド単位を有し得る。核酸がＤＮＡである他の実施形態において、ＤＮＡは、５，０００ｂｐ～２０，０００ｂｐ、または約１０，０００ｂｐを有し得る。
核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡである。核酸がｍＲＮＡであるいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、オリゴペプチドまたはポリペプチドを含むペプチドをコードするｍＲＮＡである。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。なおさらなる実施形態において、ｍＲＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。他の実施形態において、ｍＲＮＡは、ペプチドをコードするｍＲＮＡである。上記のように、ｍＲＮＡは天然に存在し得るか（例えば、単離された腫瘍ＲＮＡ）、または合成的であり得る（例えば、インビトロ転写によって生成される）。合成または非天然に存在するｍＲＮＡの変種では、ｍＲＮＡは、ホスホロチオエート、非天然および修飾塩基、ならびに／または非天然および修飾末端などの修飾骨格結合を有する非天然骨格を含み得る。核酸がｍＲＮＡである特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、自己増幅配列または内部リボソーム侵入部位などの特別な配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、２つ以上の特定の核酸の組み合わせた送達は、治療適用のために特に有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、ＣＲＩＳＰＲ配列としてのｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）と、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡとの組み合わせを含む。なおさらなる実施形態において、核酸はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体などのタンパク質と複合体化され得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、核酸ではないアニオン性またはポリアニオン性化合物を含み得る。好適なアニオン性化合物には、タンパク質、ポリリン酸、またはヘパリンが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、１つ以上のタンパク質を含む。一実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。他の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、ポリリン酸を含む。さらに他の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物は、ヘパリンまたは他のグリコサミノグリカン誘導体を含む。
ポリアニオン性カーゴを細胞に送達する本明細書に提供される複合体および組成物の適合性に加えて、本明細書に記載の複合体および組成物は、他の非アニオン性薬剤またはカーゴ（疎水性化合物を含む）を細胞に送達するためにも利用され得ることが認められるべきである。これらの他のカーゴには、例えば、小分子活性剤（独立した治療剤として、または核酸などの別の薬剤と組み合わせて）および／または免疫学的アジュバントが含まれ得るが、これらに限定されない。これらの他のカーゴ分子は、複合体形成のために本明細書に記載されるポリアニオン性化合物のいずれかと組み合わされても組み合わされなくてもよいことをさらに認識されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体は、エンドソーム脱出調節剤、ＴＬＲアゴニスト、および化学療法剤を含む。他の実施形態において、本開示の複合体は、アジュバントまたは免疫共刺激剤を含む。例えば、いくつかの実施形態において、複合体または組成物は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される免疫学的アジュバントを含む。
追加成分
本開示の複合体および組成物は、ポリエチレングリコールおよび／または標的化剤を含む１つ以上の追加成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、複合体および組成物は、１つ以上の追加成分を含み、１つ以上の追加成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ポリエチレングリコールの特定の分子量が、本開示の複合体および組成物への組み込みに特に好適であり得ることをさらに認識されたい。例えば、いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、３５０～６，０００ｇ／ｍｏｌ、１，０００～５，０００ｇ／ｍｏｌ、または２０００～５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の実施形態において、ポリエチレングリコールは、約３５０ｇ／ｍｏｌ、５００ｇ／ｍｏｌ、６００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、３，０００ｇ／ｍｏｌ、５，０００ｇ／ｍｏｌ、または１０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。特定の他の実施形態において、ポリエチレングリコールは、約５００ｇ／ｍｏｌ、７５０ｇ／ｍｏｌ、１，０００ｇ／ｍｏｌ、２，０００ｇ／ｍｏｌ、または５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。組成物が追加成分としてポリエチレングリコールを含むいくつかの実施形態において、異なる分子量の１つ以上のポリエチレングリコールポリマーが、複合体および組成物に含まれ得ることを認識されたい。
他の実施形態において、複合体または組成物は、１つ以上の追加成分を含み、１つ以上の追加成分は、標的化剤を含む。特定の実施形態において、標的化剤は、小分子、抗体、または抗体フラグメントである。
本明細書に記載される組成物は、投与のための製剤として調製され得ることを認識されたい。いくつかの実施形態において、製剤は、溶液、懸濁液、コロイド懸濁液、スプレー、またはエアロゾルである。他の実施形態において、製剤は、脂質複合体製剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、経腸製剤、非経口製剤、または局所製剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、静脈内製剤、皮下製剤、筋肉内製剤、皮内製剤、眼内製剤、髄腔内製剤、または腫瘍内製剤などの注射可能な製剤である。他の実施形態において、製剤は、経口製剤である。さらに他の実施形態において、製剤は、例えば、鼻腔製剤、肛門内製剤、口腔内製剤、または膣内製剤などを含む、粘膜製剤である。
本開示の複合体および製剤を調製する際に使用される成分、ならびに当該複合体または製剤を作成するためのプロセスパラメータは、複合体および／または製剤が即時使用（「ジャストインタイム」）が意図されるか、または将来の使用のために保存場所に置かれるかに応じて適応され得ることを認識されたい。特に、保存に関する考慮事項には、複合体および／または製剤が維持される温度（例えば、室温、４℃、－２０℃、－７８℃）および保存期間が含まれ得る。
したがって、好適な賦形剤には、投与を容易にするか、または保存安定性を改善するもの（例えば、凍結防止剤）が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、上記の成分に加えて、本明細書に記載の製剤は、担体、溶媒、分散剤、希釈剤、充填剤、安定剤、防腐剤などの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。さらに他の実施形態において、組成物は、例えば、溶媒、希釈剤、緩衝液、および粘度調節剤を含む、薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。
しかしながら、標準的な脂質ナノ粒子製剤とは対照的に、本開示の複合体および組成物は、上記のようにポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ修飾）にコンジュゲートされない限り、単体の構造脂質（コレステロールまたは関連するステロールなど）または単体のリン脂質（例えば、ＤＯＰＥ）を含まない。
複合体および組成物の特性
本明細書に記載されるように、本開示の複合体および組成物は、主に、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、細胞内送達のための核酸などの１つ以上のポリアニオン性化合物と、からなる。標準的な脂質ナノ粒子製剤などの多くの他の既存の脂質ベースの製剤とは対照的に、本開示の複合体および組成物は、構造脂質（コレステロールなど）またはリン脂質（ＤＯＰＥなど）を含まない。これらの追加の共成分は、通常、構造安定性および細胞膜透過性の改善を提供するために使用され、製剤全体のかなりの割合を構成する。従来の脂質ナノ粒子製剤は、大量の不活性成分を含み、したがって、特定量の核酸を送達するため、例えば、所望の治療的または予防的効果を引き出すために、より大量の投与される製剤を必要とする。対照的に、電荷を中和するためにポリアニオン性カーゴと複合体化したカチオン性化合物のみを含む製剤は、重量で大きな割合のポリアニオン性物質を含むが、これらのカチオン性化合物－ポリアニオン性化合物複合体は、任意の追加の共成分の利益を伴わず、粒子の不安定性および凝集に悩まされる。
本開示の複合体および組成物は、カチオン性化合物およびポリアニオン性化合物を少ない割合のＰＥＧ化脂質と組み合わせることによって、従来の脂質製剤の欠点を克服し、それによって、複合体、そのため組成物全体における活性ポリアニオン性物質の重量比率を有害に低下させることなく、カチオン性化合物－ポリアニオン性化合物複合体を安定化させ、インビボ分解から保護し、エンドサイトーシスを促進する。
一態様において、本開示の複合体および組成物は、複合体に存在する個々の成分の各々の質量パーセント（または重量パーセント）を特徴とし得る。あるいは、複合体および組成物は、複合体の総質量に対する２つ以上の成分の合計質量パーセントを特徴とし得る。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のカチオン性化合物とは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも９９％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。特定の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のカチオン性化合物とは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。複合体が１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩を含む実施形態において、１つ以上の１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩とは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも９９％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。特定の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩とは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。複合体が１つ以上のリピトイドを含む複合体を含む他の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のリピトイドとは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも９９％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。特定の実施形態において、１つ以上のポリアニオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のリピトイドとは、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する。
複合体または組成物がポリエチレングリコールポリマーまたは標的化剤などの１つ以上の追加成分を含むいくつかの実施形態において、１つ以上の追加成分は、複合体の１０％以下の質量パーセントで存在する。
別の態様において、本開示の複合体および組成物は、個々の成分の相互の質量比を特徴とすることができる。例えば、本明細書に記載のように、本開示の複合体は、カチオン性送達ビヒクルの質量パーセントと比較して、低い質量パーセントのＰＥＧ化化合物を含む。複合体または組成物が１つ以上のカチオン性化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物を含むいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物と１つ以上のＰＥＧ化合物とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、または９５：５～９８：２の質量比で存在する。複合体または組成物が１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む特定の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、もしくは９５：５～９８：２の質量比で存在する。複合体または組成物が１つ以上のリピトイドを含むさらに他の実施形態において、１つ以上のリピトイドと１つ以上のＰＥＧ化合物とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、または９５：５から９８：２の質量比で存在する。
複合体または組成物が１つ以上のカチオン性化合物および１つ以上のＰＥＧ脂質を含むいくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物と１つ以上のＰＥＧ脂質とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、または９５：５～９８：２の質量比で存在する。複合体または組成物が１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む特定の実施形態において、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ脂質とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、もしくは９５：５～９８：２の質量比で存在する。複合体または組成物が１つ以上のリピトイドを含むさらに他の実施形態において、１つ以上のリピトイドと１つ以上のＰＥＧ脂質とは、９０：１０～９９：１、９２：８～９８：２、９５：５～９９：１、または９５：５～９８：２の質量比で存在する。
本明細書に記載される複合体および複合体を含む組成物は、１つ以上のカチオン性化合物における総カチオン電荷、例えば、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドのカチオン性基の数の、核酸におけるアニオン性リン酸基の数に対する比を特徴とし得る。いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と１つ以上のポリアニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、または２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチドと、核酸などの１つ以上のポリアニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、もしくは２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。特定の他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上のポリアニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、または２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。
他の実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と１つ以上の核酸とを、２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上の核酸とを、２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。さらに他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上の核酸とを、２：１～５：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と１つ以上の核酸とを、３：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。他の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上の核酸とを、３：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。さらに他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上の核酸とを、３：１のカチオン：アニオン電荷比で含む。
あるいは、複合体および組成物は、ポリアニオン性化合物および／または複合体中の他のカーゴに対するカチオン性化合物の相対質量比を特徴とし得る。複合体における成分の質量比は、複合体を調製する際に使用される各成分のストック溶液の既知の濃度および体積に基づいて容易に計算することができる。さらに、非アニオン性カーゴが複合体に存在する場合、質量比は、非アニオン性物質を考慮しないカチオン：アニオン電荷比よりも、カーゴ全体に対するカチオン性化合物の相対量のより正確な表示を提供し得る。
いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、もしくは２：１～５：１の質量比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、もしくは２：１～５：１の質量比で含む。他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、もしくは２：１～５：１の質量比で含む。
他の実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、２：１～５：１の質量比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、２：１～５：１の質量比で含む。いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、２：１～５：１の質量比で含む。なおさらに他の実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、３：１の質量比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、３：１の質量比で含む。なおさらなる実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと、１つ以上のポリアニオン性化合物および／または非アニオン性化合物とを、３：１の質量比で含む。
複合体が１つ以上の核酸を１つ以上のポリアニオン性化合物の一部として含む特定の実施形態において、複合体は、１つ以上のカチオン性化合物と１つ以上の核酸とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、または２：１～５：１の質量比で含む。いくつかの実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上の核酸とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、もしくは２：１～５：１の質量比で含む。他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上の核酸とを、０．５：１～５０：１、０．５：１～２０：１、０．５：１～１０：１、０．５：１～５：１、１：１～２０：１、１：１～１０：１、１：１～５：１、２：１～２０：１、２：１～１０：１、または２：１～５：１の質量比で含む。いくつかの実施形態において、複合体は、１つまたは複数のカチオン性化合物と１つ以上の核酸とを、２：１～５：１の質量比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上の核酸とを、２：１～５：１の質量比で含む。特定の他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上の核酸とを、２：１～５：１の質量比で含む。なおさらに他の実施形態において、複合体は、１つまたは複数のカチオン性化合物と、１つ以上の核酸とを、３：１の質量比で含む。特定の実施形態において、複合体は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上の核酸とを、３：１の質量比で含む。特定の他の実施形態において、複合体は、１つ以上のリピトイドと１つ以上の核酸とを、３：１の質量比で含む。
複合体および組成物を調製する方法
カチオン性化合物とポリアニオン性化合物との複合体およびそれらの組成物は、様々な物理的および／または化学的方法によって調製して、それらの物理的、化学的、および生物学的特性を調節することができる。これらには通常、水中または水混和性有機溶媒中のカチオン性化合物（例えば、三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド）と、水中または水性緩衝溶液中の所望のポリアニオン性化合物（例えば、オリゴヌクレオチド）との迅速な混合が含まれる。これらの方法には、ピペッティングによる成分の単純な混合、またはＴミキサー、ボルテックスミキサー、もしくはその他のカオス混合構造を含むものなどのマイクロ流体混合プロセスが含まれる。本開示の組成物は、同様の方法で調製され得る。
一態様において、本開示は、本明細書に記載される複合体および組成物を調製する方法を提供し、この方法は、１つ以上のカチオン性化合物を、１つ以上のポリアニオン性化合物と、ＰＥＧ脂質などの１つ以上のＰＥＧ化合物と、接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を、１つ以上のポリアニオン性化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物と接触させることを含む、組成物を調製する方法が提供される。他の実施形態において、本明細書では、１つ以上のリピトイドを、１つ以上のポリアニオン性化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物と接触させることを含む、組成物を調製する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物とを含む複合体、またはその組成物を調製する方法は、１つ以上のカチオン性化合物を含む溶液を、１つ以上のポリアニオン性化合物を含む溶液および１つ以上のＰＥＧ化合物を含む溶液と接触させることを含む。特定の実施形態において、ポリアニオン性化合物は、核酸を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を含む。他の実施形態において、１つ以上のカチオン性化合物は、１つ以上のリピトイドを含む。
ポリエチレングリコールおよび／もしくは標的化剤または賦形剤の追加成分などの複合体および組成物中の追加成分は、カチオン性化合物と、ポリアニオン性化合物と、ＰＥＧ化合物と、の主成分が混合される前か、混合中か、または混合された後に、組成物と混ぜるかまたは混合され得る。
本明細書に記載の複合体および組成物を調製するための特定のプロセス条件は、組成物の所望の物理的特性を提供するために、それに応じて調整または選択され得る。例えば、最終組成物に影響を及ぼし得る組成物の成分を混合するためのパラメータには、混合する順序、混合する温度、混合する速度／率、流速、ストック溶液の濃度、成分の質量比（例：ペプチド：カーゴ）、および溶媒が含まれ得るが、これらに限定されない。
複合体およびその組成物を使用する方法
上述されるように、本明細書に記載の組成物は、細胞、特に細胞内環境へのポリアニオン性化合物の送達を促進する。そのため、組成物は、多くの臨床適用ならびに研究応用における使用を認め得る。細胞へのポリアニオン性化合物の送達は、予防的、診断的、および／または治療的方法に関連するものなどの臨床適用のために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、好適な臨床適用には、ワクチン接種、癌免疫療法、タンパク質補充療法、および／またはインビボ遺伝子編集、エクスビボ細胞療法トランスフェクション、エクスビボ幹細胞誘導が含まれ得る。ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、生物学的アッセイおよび試薬のためを含む、研究または非臨床適用のためにも有用であり得る。
別の態様において、本明細書では、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体と接触させることを含む。他の実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体と接触させることを含む。前述の方法のいくつかの実施形態において、接触させることは、エンドサイトーシスによるものである。さらに他の実施形態において、本明細書では、細胞を、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体を含む組成物と接触させることを含む、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法が提供される。他の実施形態において、本明細書では、細胞を、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体を含む組成物と接触させることを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体と接触させることを含み、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる。特定の実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体と接触させることを含み、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる。他の実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体を含む組成物と接触させることを含み、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる。特定の実施形態において、ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法は、細胞を、１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物と、１つ以上のＰＥＧ化化合物と、ポリアニオン性化合物と、を含む複合体を含む組成物と接触させることを含み、細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる。
細胞をインビトロで接触させるいくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、またはＪＡＷＳＩＩ細胞である。細胞をインビボで接触させる他の実施形態において、本開示の複合体、またはその組成物、またはその製剤は、哺乳動物対象に投与される。哺乳動物の対象には、ヒトまたはマウス対象が含まれ得るが、これらに限定されない。細胞をエクスビボで接触させるさらに他の実施形態において、細胞は、ヒトまたはマウス対象から得られる。
細胞をインビボで接触させる前述の方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される複合体および組成物は、注射によって投与され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される複合体およびその組成物は、注射（静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内、または腫瘍内）によって投与され得る。いくつかの実施形態において、複合体および組成物は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、髄腔内、または腫瘍内注射によって投与される。他の実施形態において、本明細書に記載される複合体および組成物は、ボーラス注射または静脈内注入によって投与される。細胞をインビボで接触させる他の実施形態において、本開示の複合体および組成物は、鼻腔または経口吸入によって投与される。細胞をインビボで接触させるいくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体および組成物は、経口投与される。細胞をインビボで接触させるさらに他の実施形態において、複合体および組成物は、粘膜への吸収を介して投与される（局所、肛門内、頬側、膣内などを含む）。
別の態様において、本明細書では、ポリアニオン性化合物を対象の１つ以上の標的器官（例えば、肺、脾臓、肝臓、腎臓、鼠径部リンパ節、および／または腸間膜リンパ節）に送達する方法が提供される。器官特異性（例えば、肺を標的とする）は、１つ以上のカチオン性化合物（例えば、少なくとも２＋電荷を有する、特定の範囲内のｐＫａを有するなどの式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化化合物）の選択、またはカチオン性化合物のそれらのカーゴに対する質量比（例えば、より高いペプトイド：カーゴ比）によって影響され得る。
上記で開示される診断、予防、および治療の例などの臨床適用は、使用される特定の複合体および組成物、投与経路、複合体および組成物が投与される対象、ならびに／または所望の生理学的効果に応じて変更され得る投与レジメン（例えば、投与量レベルおよび投与の時間経過）を含み得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の方法は、複合体または組成物を、０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することを含む。
実施形態の列挙
以下の列挙される実施形態は、本発明のいくつかの態様を代表する。
１．
（ｉ）１つ以上のポリアニオン性化合物と、
（ｉｉ）１つ以上のＰＥＧ化合物と、
（ｉｉｉ）１つ以上のカチオン性化合物と、の複合体を含む組成物であって、１つ以上のカチオン性化合物が、
（ａ）式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物、またはその塩であって、

式中、
ｍは、０であり、
ｎは、整数０～５であり、
ｓは、整数０～５であり、
ｔは、０であり、
ｎおよびｓのうちの少なくとも１つが、０以外であり、
ｒは、整数１～２０であり、
各ｏは、独立して、整数０、１、または２であり、
各ｑは、独立して、整数０、１、または２であり、
各ｐは、独立して、整数１または２であり、
Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、
Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
各Ｒ２は、独立して、
式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｕが、独立して、整数２～２００であり、
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり、
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分または脂質部分であり、
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり、
各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｖが、独立して、整数２～２００であり、
Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ １－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩、
（ｂ）式（ＩＩ）の１つ以上のリピトイドであって、

式中、
ｘは、整数１～１００であり、
各Ｒ９は、独立して、脂質部分であり、
各Ｒ１０は、独立して、カチオン性または中性のスペーサー部分である、式（ＩＩ）の１つ以上のリピトイド、
（ｃ）式（ＩＩＩ）の１つ以上の脂質様化合物であって、

式中、
各Ｒ１１は、独立して、置換または非置換アルキルであり、
各Ｒ１２は、独立して、置換または非置換アルキルであり、
各Ｒ１３は、独立して、水素、または置換もしくは非置換アルキルであり、
各ｙは、独立して整数１～８である、式（ＩＩＩ）の１つ以上の脂質様化合物、
ならびに
（ｄ）それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
１つ以上のカチオン性化合物と、１つ以上のＰＥＧ化合物と、１つ以上のポリアニオン性化合物とが、複合体の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを有する、組成物。
２．１つ以上のカチオン性化合物が、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物である、実施形態１の組成物。
３．１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物が、Ｎ－脂質化アミノ酸残基のブロックを含み、ｎまたはｓのどちらかが、少なくとも２である、実施形態１または実施形態２の組成物。
４．各Ｒ３が、独立して、Ｃ４－Ｃ２２－アルキルまたはＣ４－Ｃ２２－アルケニルであり、Ｃ４－Ｃ２２－アルケニルは、任意選択的にモノまたはポリ不飽和である、実施形態１～３のいずれか１つの組成物。
５．各Ｒ３が、独立して、Ｃ８－Ｃ１２アルキルである、実施形態１～４のいずれか１つの組成物。
６．各Ｒ３が、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される、実施形態１～４のいずれか１つの組成物。
７．１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つが、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含む、実施形態１～６のいずれか１つの組成物。
８．各Ｒ５が、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ－ヘテロシクリルアルキル、またはＮ－ヘテロアリールである、実施形態１～７のいずれか１つの組成物。
９．各Ｒ５が、独立して、

からなる群から選択される、実施形態１～８のいずれか１つの組成物。
１０．各Ｒ５が、

である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の組成物。
１１．各中性スペーサー部分Ｒ４が、独立して、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１－Ｃ４－アルキルであり、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルは、任意選択的に、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、もしくはアルコキシによって置換される、実施形態１～１０のいずれか１つの組成物。
１２．各中性スペーサー部分Ｒ４が、独立して、

からなる群から選択される、実施形態１～１１のいずれか１つの組成物。
１３．各中性スペーサー部分Ｒ４が、

である、実施形態１～１２のいずれか１つの組成物。
１４．１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つが、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つのアミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含み、カチオン性ドメイン内の少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基の各々は、中性スペーサーまたは脂質部分Ｒ４を有する少なくとも１つのアミノ酸残基によって分離される、実施形態１～１３のいずれか１つの組成物。
１５．１つ以上の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの三量体サブユニット－Ｒカチオン－Ｒ中性－Ｒ中性を含み、Ｒカチオンは、カチオン性部分Ｒ５を含むアミノ酸残基であり、各Ｒ中性は、中性スペーサー部分Ｒ４を含むアミノ酸残基である、実施形態１～１４のいずれか１つの組成物。
１６．各カチオン性部分Ｒ５が、

であり、各中性スペーサー部分Ｒ４が、

である、実施形態１～１５のいずれか１つの組成物。
１７．ＲａおよびＲｂが、独立して、－Ｈおよび－ＣＨ３からなる群から選択される、実施形態１～１６のいずれか１つの組成物。
１８．ＲａおよびＲｂが、－Ｈである、実施形態１～１７のいずれか１つの組成物。
１９．１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物が、９０：１０～９９：１のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する、実施形態１～１８のいずれか１つの組成物。
２０．１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物が、９５：５～９８：２のペプチド化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する、実施形態１～１９のいずれか１つの組成物。
２１．１つ以上のＰＥＧ化合物が、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの組成物。
２２．１つ以上のＰＥＧ化合物が、式（Ｉ）の１つ以上の三級アミノ脂質化および／もしくはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物またはその塩を含み、

式中、
ｍは、整数０～１０であり、
ｎは、整数０～５であり、
ｓは、整数０～５であり、
ｔは、整数０～１０であり、
ｍおよびｔのうちの少なくとも１つが、０以外であり、
ｒは、整数１～２０であり、
各ｏは、独立して、整数０、１、または２であり、
各ｑは、独立して、整数０、１、または２であり、
各ｐは、独立して、整数１または２であり、
Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、
Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
各Ｒ２は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｕが、独立して、整数２～２００であり、
各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり、
各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分または脂質部分であり、
各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり、
各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｖが、独立して、整数２～２００であり、
Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ １－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である、実施形態１～２１のいずれか１つの組成物。
２３．
ｍが、整数０～３である場合、各ｕは、独立して、整数２０～２００、任意選択的に３０～５０であり、
ｍが、整数４～１０である場合、各ｕは、独立して、整数２～１０である、実施形態２２の組成物。
２４．
ｔが、整数０～３である場合、各ｖは、独立して、整数３０～５０であり、
ｔが、整数４～１０である場合、各ｖは、独立して、整数２～１０である、実施形態２２または実施形態２３の組成物。
２５．
ｍが、１であり、ｕが、整数４０～４５であるか、または
ｔが１であり、ｖが、整数４０～４５である、実施形態２２～２４のいずれか１つの組成物。
２６．１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含む、実施形態１～２５のいずれか１つの組成物。
２７．１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、１つ以上のカチオン性ペプチド化合物の核酸に対する質量比が、０．５：１～２０：１である、実施形態１～２６のいずれか１つの組成物。
２８．１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、核酸が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、実施形態１～２７のいずれか１つの組成物。
２９．１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、核酸が、タンパク質をコードするｍＲＮＡである、実施形態１～２８のいずれか１つの組成物。
３０．複合体が、１つ以上の第２の薬剤をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つの組成物。
３１．１つ以上の第２の薬剤が、ポリエチレングリコール、標的化要素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１～３０のいずれか１つの組成物。
３２．複合体が、１つ以上の小分子活性剤または原薬をさらに含む、実施形態１～３１のいずれか１つの組成物。
３３．複合体が、水性溶液中に懸濁される、実施形態１～３１のいずれか１つの組成物。
３４．ポリアニオン性化合物を細胞に送達する方法であって、細胞を実施形態１～３３のいずれか１つの組成物と接触させることを含む、方法。
３５．接触させることが、エンドサイトーシスによるものである、実施形態３４の方法。
３６．細胞を、インビボまたはインビトロで接触させる、実施形態３４または３５の方法。
３７．ポリアニオン性化合物が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞が、組成物と接触した後にポリペプチドを発現する、実施形態３５～３６のいずれか１つの方法。
３８．ポリアニオン性化合物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡである核酸を含み、細胞が、組成物と接触した後にタンパク質を発現する、実施形態３４～３７のいずれか１つの方法。
３９．１つ以上のカチオン性ペプチド化合物を、１つ以上のＰＥＧ化合物および１つ以上のポリアニオン性化合物と接触させることを含む、実施形態１～３３のいずれ１つの組成物を調製する方法。
４０．１つ以上のカチオン性ペプチド化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物を含む溶液を、１つ以上のポリアニオン性化合物を含む溶液と接触させることを含む、実施形態３９の方法。
本開示は、以下の実施例においてさらに詳細に説明されるが、それらは請求される開示の範囲を限定することを決して意図するものではない。添付の図は、本開示の詳細および説明の不可欠な部分とみなされることが意図される。以下の例は、説明のために提供されるが、請求される開示を限定するものではない。
実施例１－核酸送達のための例示的な三級アミノ脂質化カチオン性ペプチドの合成
以下の実施例は、本明細書に記載される式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の合成のための一般的なプロトコルを説明する。
以下に提供される説明では、ＲａおよびＲｂは、すべて－Ｈである。すべてのポリマーは、ブロモ酢酸および一級アミンを使用して合成される。図２Ｂ～２Ｅは、本開示の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物を調製する、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の一級アミンの例示的な置換基のいくつかを提供する。
Ｆｍｏｃ－Ｒｉｎｋアミド樹脂が、固体支持体として使用される。樹脂のＦｍｏｃ基は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）によって脱保護される。次に、アミノ樹脂をブロモ酢酸でアミド化する。これに、一級アミンによる臭化物の求核置換によるα炭素のアミノ化が続く。２つのステップが連続して繰り返されて、所望のカチオン性ペプチド配列を生成する。
特に記載がない限り、すべての反応および洗浄は室温で行われる。樹脂の洗浄は、樹脂に洗浄溶媒（通常はＤＭＦまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を添加し、均一なスラリーが得られるように樹脂を撹拌し、続いて樹脂から溶媒を完全に排出することを指す。溶媒は、反応容器のフリット底を通した真空濾過によって、樹脂が乾燥しているように見えるまで除去する。すべての合成において、樹脂スラリーは、フリット容器の底からアルゴンをバブリングすることによって撹拌する。
最初の樹脂脱保護。フリット反応容器にＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋアミド樹脂を加える。ＤＭＦを樹脂に添加し、この溶液を撹拌して樹脂を膨潤させる。その後、ＤＭＦを排出させる。Ｆｍｏｃ基は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加し、樹脂を撹拌し、樹脂を排出することによって除去される。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加し、１５分間撹拌してから、排出させる。次に、樹脂をＤＭＦで６回洗浄する。
アシル化／アミド化。次に、脱ブロックしたアミンを、樹脂にＤＭＦ中のブロモ酢酸、続いてＤＭＦ中のＮ，Ｎ－ジイソプロプリカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加することによってアシル化する（図３Ａ）。この溶液を室温で３０分間撹拌し、次いで排出させる。このステップを２回繰り返す。次に、樹脂をＤＭＦで２回、ＤＭＳＯで１回洗浄する。これが１回の完結した反応サイクルである。
求核置換／アミノ化。アシル化樹脂を所望の一級または二級アミンで処理して、α炭素の臭素脱離基で求核置換を行う（図３Ｂ）。このアシル化／置換サイクルは、所望のペプチド配列が得られるまで（図３Ｄ）、繰り返される（図３Ｃ）。
樹脂からのペプチド切断。乾燥した樹脂をテフロン（登録商標）コーティングされたマイクロ撹拌バーを含むガラスシンチレーションバイアルに入れ、水中の９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加する。溶液を２０分間撹拌し、次にポリエチレンフリットを取り付けた固相抽出（ＳＰＥ）カラムに通してポリプロピレンコニカル遠心分離管に濾過する。
樹脂を１ｍＬの９５％ＴＦＡで洗浄する。次に、合わせた濾液を１：１のアセトニトリル：水から３回凍結乾燥する。凍結乾燥したペプチド（図３Ｅ）を、無水エタノールに５ｍｇ／ｍＬの濃度で再溶解するか、またはＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再溶解する。
精製および特性評価。再溶解した粗ペプチドを、分取ＨＰＬＣによって精製する。精製したペプチドは、ＬＣ－ＭＳ分析によって特徴付けられる。
実施例２－代表的なアミノ脂質化ペプトイドの合成および特性評価
アミノ脂質化ペプトイドは、ブロモ酢酸およびＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いて、実施例１で上述されるサブモノマー法によって合成した。ポリスチレン支持ＭＢＨＡ Ｆｍｏｃ保護Ｒｉｎｋアミド（代表スケール２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ／ｇ添加、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）樹脂を固体支持体として使用した。ブロモアセチル化では、樹脂を２Ｍブロモ酢酸および２Ｍ Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の１：１混合物と５分間混合した。アミン置換は、ＤＭＦ中のアミンの１Ｍ溶液を使用して１時間実行した。合成後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：水：トリイソプロピルシランが９５：２．５：２．５の混合物５ｍＬを使用して、粗ペプトイドを樹脂から室温で４０分間切断した。樹脂を濾過によって除去し、濾液をＢｉｏｔａｇｅ Ｖ１０エバポレーターを使用して濃縮した。粗ペプトイドを、ＭｅＣＮの２５％水溶液から凍結乾燥によってさらに濃縮した。純度および同一性は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ ＵＶ検出器およびＷａｔｅｒｓ ＳＱＤ２質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラムで５～９５％の勾配にわたって分析した。選択した粗ペプトイドは、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ／可視検出器を備えた分取Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ １５０ＬＣシステムによって、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００ Ｐｒｅｐ Ｃ４カラムで０．１％ＴＦＡ添加した水中の５～４０％アセトニトリル勾配を使用して３０分間にわたって精製した。
表１Ａは、実施例２に記載の方法によって調製された代表的なアミノ脂質化ペプトイドを示す。表１Ｂは、表１Ａで調製したアミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２に関する特性データを提供し、予測分子量、リテンションタイム（分単位、λ＝２１８ｎｍでのＵＰＬＣ－ＵＶ測定によって決定された）、および一次観測された質量電荷比（ｍ／ｚ、ＭＨ＋、エレクトロスプレーイオン化－質量分析による）が含まれる。アミノ脂質化およびＰＥＧ化ペプトイド化合物４８、５６、６４、および７２の各々について、質量スペクトルには、ペプトイドに結合したＰＥＧ部分（平均分子量２０００ｇ／ｍｏｌ）の多分散性に起因するピークのいくつかの分布が含まれた。これらのアミノ脂質化およびＰＥＧ化ペプトイド化合物について報告された質量電荷比ピークは、ピークのＭＨ２ ２＋分布の中心値であり、効果的なモノマー分離δ約２２ｍ／ｚ（－ＯＣＨ２ＣＨ２－、エチレングリコール分子量４４ｇ／ｍｏｌ）を有する。
実施例３－ナノ粒子組成物を形成する、オリゴヌクレオチドを有する代表的なアミノ脂質化ペプトイドの製剤
以下の実施例は、オリゴヌクレオチドを有する本明細書に記載される式（Ｉ）の三級アミノ脂質化および／またはＰＥＧ化カチオン性ペプチド化合物の製剤のための一般的なプロトコルを記載する。
標準的な製剤では、アミノ脂質化ペプトイドを、無水エタノールに０．５ｍｇ／ｍＬ（インビトロ実験の場合）または５ｍｇ／ｍＬ（インビボ実験の場合）の濃度で溶解する。得られる溶液は、室温で安定であるが、－２０℃で保存すべきである。核酸カーゴは、ＤＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅを含まない水に０．２ｍｇ／ｍＬ（インビトロ実験の場合）または１ｍｇ／ｍＬ（インビボ実験の場合）の最終濃度で溶解する。これらの溶液は、さらに長い期間では、－２０℃または－７８℃で保存すべきである。
ナノ粒子製剤を調製するために、アミノ脂質化ペプトイドを、核酸と約１：１（ペプトイド：カーゴ）～２０：１の質量比でピペッティングによって混合する。製剤化前に、アミノ脂質化ペプトイドおよび核酸カーゴをそれぞれエタノールおよび酸性緩衝液（０．１Ｍ ＨＣｌでｐＨ５．５に調整したＰＢＳ）で１：３の体積比に希釈し、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～０．２ｍｇ／ｍＬの最終カーゴ濃度を目標とした。
実施例４－代表的なｍＲＮＡ／ペプトイド製剤の物理的特性の調製および特性評価
実施例２に記載の例示的なアミノ脂質化カチオン性ペプトイドを、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）ｍＲＮＡと組み合わせてナノ粒子組成物を形成させ、インビトロまたはインビボでの治療的および／または予防的目的について評価した。製剤は、実施例３のプロトコルに従って調製し、単純なピペッティングによって混合した。
ペプトイド：カーゴの質量比が５：１のｍＲＮＡ／ペプトイド製剤を、動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価し、製剤内におけるｍＲＮＡ／ペプトイド複合体の体積平均粒子サイズ／直径（ｎｍ）およびサイズ多分散性指数（ＰＤＩ）を決定した。例示的な化合物の各製剤におけるｍＲＮＡカプセル化のパーセントは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による粒子の溶解の前後におけるＱｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）色素の蛍光によって決定した。結果を以下の表２に示す。
実施例５－製剤の安定性およびトランスフェクション効率におけるＰＥＧの効果
ペプトイド製剤の製剤安定性（すなわち、粒子サイズ）およびトランスフェクション効率における可変量のＰＥＧ取り込みの効果を評価するために、化合物８を単独で、またはＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と２％ｗ／ｗもしくは５％ｗ／ｗで組み合わせて使用して、３つの製剤を調製した。粒子は、５μｇのｍＲＮＡを０．２μｇ／μＬの濃度で使用して製剤化した。製剤化の直後に、粒子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に加えた。
３つの製剤の体積平均粒子サイズ（ｎｍ）を、製剤化の直後と、ＰＢＳ緩衝液への添加後（０．５時間）と、製剤化の８時間後（８時間）と、にわたって上記の実施例４と同じ方法によって評価した。測定された数平均粒子サイズが、図４Ａに示される。
トランスフェクション効率も、化合物８の単独、２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００添加、または５％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００添加の３つの製剤について評価した。図４Ｂは、製剤化後約３０分の１００ｎｇ ｍＲＮＡ／ウェルによって処理した８時間後に観察されたＨｅＬａ細胞の平均生物発光（ＲＬＵ）を示す。未処理のＨｅＬａ細胞を、生物発光測定のためのコントロールとして使用した。
実施例６－保存安定性
２％ｗ／ｗ ＰＥＧ組み込みを有するアミノ脂質化ペプトイド化合物を含有する製剤の保存安定性を評価するために、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡおよび２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイド化合物２８の製剤を、注射の７日前、３日前、または１時間前に調製した。その間は、製剤を４℃で保存した。これらの３つの製剤を、各々３匹のマウスに尾静脈注射を介して注射した。
製剤の保存安定性は、注射の８時間後に全身分布の発光（または光子束）を記録することによって評価した。図５Ａ～５Ｃは、保存の１時間後（図５Ａ）、３日後（図５Ｂ）、および７日後（図５Ｃ）での全身発光を示す。図５Ｄは、各時点で観測された総光子束のプロットを示す。
実施例７－代表的なＦｌｕｃ ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤の単独（ＰＥＧなし）または２％（ｗ／ｗ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（２％ＰＥＧ）含有による処理後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のインビトロ発現
ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤の有効性は、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子を培養細胞に送達するそれらの能力に基づいてインビトロで評価した。アミノ脂質化ペプトイドをＦｌｕｃ ｍＲＮＡと５：１ｗ／ｗ比で組み合わせ、得られた粒子を培養ＨｅＬａ細胞に１００ｎｇ／ウェル（全体積１００μＬ中）の用量で添加した。得られたルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）は、発光プレートリーダーによって、処理の６時間後および２４時間後に測定した。以下の表３は、２つの時点で観察されたｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤のルシフェラーゼ発現を示す。
ｍＲＮＡカーゴとアミノ脂質化ペプトイド単独との間に形成されたナノ粒子複合体を評価することに加えて、少量のＰＥＧ－脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する多成分製剤もインビトロでのＦｌｕｃ ｍＲＮＡ送達について試験した。これらの製剤では、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００は、全体で２％の取り込み（ｗ／ｗ）で候補ペプトイドと前混合し、その間、先に使用したペプトイド：ｍＲＮＡと同じ５：１質量比を維持した。以下の表４は、２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００組み込みを有するｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤について、２つの時点（処理後６時間および２４時間）で観察されたルシフェラーゼ発現を示す。
実施例８－代表的なＦｌｕｃ ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００無含有または２％（ｗ／ｗ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００含有による可変的なペプトイド：カーゴ質量比で処理後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のインビトロ発現
アミノ脂質化ペプトイド送達ビヒクルの電荷比依存性を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡと送達ビヒクルとの間の様々な質量比で粒子を製剤化することによって評価した。製剤は、ペプトイド：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）比を２：１～７．５：１で変化させた（２：１、３．５：１、５：１、７．５：１）。さらに、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００の役割も、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を除外するか、またはＤＭＧ－ＰＥＧ２０００をアミノ脂質化ペプトイドに対して２％（ｗ／ｗ）で組み込むことによって探究した。これらの製剤からのＦｌｕｃ発現は、２４時間の処理後にＨｅＬａ細胞で測定した。
図６Ａは、ＰＥＧ組み込みを有さない実施例２からの例示的なアミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物１～１８について実行されたインビトロルシフェラーゼ発現測定の結果を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、すべて２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００とともに製剤化された例示的なアミノ脂質化カチオン性ペプトイド化合物１～３６の製剤で処理されたＨｅＬａ細胞における平均生物発光（ＲＬＵ）のプロットを示す。表５は、２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する製剤によって処理されたＨｅＬａ細胞について観察されたＦｌｕｃ発現を示す。
２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有するアミノ脂質化ペプトイド化合物３７～７２の製剤も、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達するそれらの能力について評価した。図６Ｄおよび６Ｅは、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／ウェル、ペプトイド：ｍＲＮＡ比が５：１）および２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と組み合わせたアミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２の様々な製剤で処理したＨｅＬａ細胞について観察された平均生物発光（ＲＬＵ）のプロットを示す。
実施例９－代表的なＦｌｕｃ ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤の単独（ＰＥＧなし）または２％（ｗ／ｗ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（２％ＰＥＧ）含有による処理後のインビトロ細胞生存率
細胞生存率は、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤による処理後に従来のＭＴＴ生存率アッセイによって測定した。すべてのペプトイド／ｍＲＮＡ製剤は、５：１の質量比で、２％（ｗ／ｗ）ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を加えて調製した。このアッセイでは、細胞は、最初にペプトイド製剤によって１００ｎｇ／ウェルの最終ｍＲＮＡ濃度で８時間処理した。次に細胞を４８時間増殖させた後、１．５ｍｇ／ｍＬの３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）に２時間曝露し、次いで酸性イソプロパノール（０．１Ｎ ＨＣｌ）中の１０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００の可溶化溶液を使用して溶解した。還元されたホルマザンに対応するシグナルを未処理細胞に対して基準化して、各処理条件の相対的な生存率を得た。
生存率のわずかな変化のみが、ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤で処理したＨｅＬａ細胞で観察された。一般に、化合物５、３４、および３５の製剤のみを除いて、ほぼすべての条件で少なくとも８０％の生存率が維持された。平均して、２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する製剤はわずかに高い値を示した（ＰＥＧ不存在製剤の８９％に対して平均９７％の生存率）。表６は、ＰＥＧ不存在および２％－ＰＥＧ製剤で処理された細胞の相対的な生存率を示す。
実施例１０－代表的なＦｌｕｃ ｍＲＮＡ／アミノ脂質化ペプトイド製剤のＩＶ投与後のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のインビトロ全身発現。
アミノ脂質化ペプトイド送達ビヒクルは、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡのＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）へのインビボ投与に複数の投与経路を介して効果的である。簡単に説明すると、代表的なアミノ脂質化ペプトイド／Ｆｌｕｃ製剤（特に記載がない限り、アミノ脂質化ペプトイド：ｍＲＮＡの質量比５：１で、２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有して調製される）を０．５ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈注射を介して投与し、得られる生物発光を８時間後に定量化した。図７Ａは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける製剤の全身分布を示す。表７は、総束として定量化された試験マウスにおけるＦｌｕｃのインビボ全身発現を示す。
器官特異的生物発光は、処理した動物を犠牲にし、目的の器官を取り出し、得られた生物発光を別々に定量することによって定量化した。最も高い実行性アミノ脂質化ペプトイドの各々の相対的発現は有意に変化した。例えば、化合物８は全体的に最も高い発現を示したが、その発現のほぼすべてが肺に局在した。しかし、他の化合物は、化合物２８の場合は脾臓、化合物２４の場合は肝臓、脾臓、および肺の混合など、他の器官における優先的な局在を示した。
図７Ｂは、製剤の対応する器官特異的生体内分布（肺、腎臓、肝臓、脾臓、鼠径リンパ節、および腸間膜リンパ節）を示す。図７Ｃは、製剤の器官特異的生体内分布を総光子束の関数として定量化する棒グラフを示す。表８は、処理したマウスから得られた肝臓、肺、および脾臓の試料について測定された総束を示す。
ＩＶ投与に加えて、アミノ脂質化ペプトイドは、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）の投与経路を介したｍＲＮＡの局所投与においても効果的である。表９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下または筋肉内で投与した選択されたアミノ脂質化ペプトイド製剤で観察された総束を示す。
これらの例では、ｍＲＮＡは、皮下では０．１ミリグラム／キログラム（ｍｐｋ）、筋肉内では０．０５ｍｐｋの用量で投与された。これらの場合、全体的な発現は筋肉内注射後に高かった。最高の発現は化合物８でＩＶ投与について観察されたが、化合物２４および２８はＩＭ投与でその例を上回り、異なる投与経路に合わせてこれらの構造を調整する必要があることが示唆される。
追加の実験を実行して、生体内分布の任意の変動性を、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡに対するアミノ脂質化ペプトイドの負荷質量比の関数として評価した。図８Ａは、２％ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００および異なるペプトイド：ｍＲＮＡ比（１：１、２：１、５：１、７．５：１および１０：１）のＦｌｕｃ ｍＲＮＡを有するアミノ脂質化ペプトイド化合物２８の製剤における総光子束のプロットを示す。図８Ａに示されるように、化合物２８の製剤における最大総光子束は、皮下注射では５：１、筋肉内注射では７．５：１で観察された。
皮下投与における生体内分布プロファイルの評価を、アミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２に拡張した。２％ｗ／ｗ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００およびペプトイド：ｍＲＮＡ比が５：１のＦｌｕｃ ｍＲＮＡを含むアミノ脂質化ペプトイド化合物１～７２の製剤を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下投与した。製剤の各々について観察された総光子束の測定値は、図８Ｂおよび８Ｃに示される。
実施例１１－ＰＥＧを有するアミノ脂質化ペプトイド製剤におけるホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）のインビトロ細胞型トランスフェクション効率
細胞培養：ＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する１００μＬのＤＭＥＭ中で１０，０００ウェルに、処理の１８時間前に播種し、付着させた。トランスフェクション直前に、培地を１００μＬの新鮮な血清含有ＤＭＥＭと交換した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。それらは、処理の１８時間前に細胞１０，０００個／ウェルで播種し、付着させた。ＪＡＷＳＩＩ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ－ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地中で培養した。
ｍＲＮＡ調製：トランスフェクション実験のためのＦｌｕｃ ｍＲＮＡは、標準的なインビトロ転写（ＩＶＴ）法を使用して、施設内で調製した。
ｍＲＮＡ製剤：化合物２４および７９における代表的なアミノ脂質化ペプトイド／Ｆｌｕｃ製剤（特に記載がない限り、アミノ脂質化ペプトイド：ｍＲＮＡの質量比が５：１で調製された）。アミノ脂質化ペプトイド：ｍＲＮＡ混合物を、市販のＰＥＧ脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、１８：０ ＰＥＧ１０００ＰＥ、１４：０ ＰＥＧ２０００ ＰＥ、１４：０ ＰＥＧ５０００ ＰＥ）、線状アミノＰＥＧ化ペプトイド（化合物４８、５６、６４、および７２）、または分岐アミノＰＥＧ化ペプトイド（化合物１０６、１０７、１０８、および１０９）と、ＰＥＧ化化合物の０．０１％、０．０２％、０．０５％、および０．１％の重量パーセントで組み合わせた。
これらの製剤からのＦｌｕｃ発現は、観察された生物発光（総光子束）に基づいて、２４時間の処理後に細胞で測定した。比較を容易にするために、観察された総光子束は、標準条件としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する製剤に基準化した。
図９Ａ～９Ｃは、様々な細胞型（図９にＨｅＬａ、図９ＢにＨｅｐＧ２、および図９ＣにＪＡＷＳＩＩ）におけるＦｌｕｃ ｍＲＮＡのトランスフェクション効率のインビトロ評価で基準化した総光子束（ｃｐｓ）を示す。
線状ＰＥＧ化ペプトイドは、より低い重量パーセントの取り込みで高いトランスフェクション効率を示すことが観察された。分岐ＰＥＧ化ペプトイドは、低い重量パーセントよりも高い重量パーセントで組み込まれた場合に、より優れたトランスフェクションを示した。

Claims (27)

  1. （ｉ）１つ以上のポリアニオン性化合物と、
    （ｉｉ）１つ以上のＰＥＧ化合物と、
    （ｉｉｉ）１つ以上のカチオン性化合物と、を含む組成物であって、前記１つ以上のカチオン性化合物が、
    式（Ｉａ）またはその塩の構造を有し、
    式中、
    ｎは、整数０～５であり、
    ｓは、整数０～５であり、
    なお、ｎおよびｓのうちの少なくとも１つが、０以外であり、
    ｒは、整数１～２０であり、
    各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
    各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
    各ｐは、独立して、整数１または２であり、
    Ｒ １ は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ １ａ 、または脂質部分であり、なお、Ｒ １ａ が、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
    各Ｒ ３ は、独立して、脂質部分であり、
    各Ｒ ４ は、独立して、中性スペーサー部分または脂質部分であり、
    各Ｒ ５ は、独立して、カチオン性部分であり、
    Ｒ ７ は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ ７ａ 、－ＮＨ ２ 、－ＮＨＲ ７ａ 、または脂質部分であり、なお、Ｒ ７ａ が、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
    各Ｒ ａ およびＲ ｂ は、独立して、－Ｈ、Ｃ １ －Ｃ ４ －アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分であり、
    前記１つ以上のカチオン性化合物と、前記１つ以上のＰＥＧ化合物と、前記１つ以上のポリアニオン性化合物とが、前記組成物の少なくとも９０％ｗ／ｗの合計質量パーセントを占める、組成物。
  2. ｎまたはｓのどちらかが、少なくとも２である、請求項１に記載の組成物。
  3. 各Ｒ３が、独立して、Ｃ４－Ｃ２２－アルキルまたはＣ４－Ｃ２２－アルケニルであり、なお、前記Ｃ４－Ｃ２２－アルケニルは、任意選択的に、モノまたはポリ不飽和である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 各Ｒ３が、独立して、Ｃ８－Ｃ１２アルキルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 各Ｒ３が、独立して、２－エチルヘキサ－１－イル、カプロイル、オレイル、ステアリル、リノレイル、ミリスチル、およびラウリルからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記カチオン性化合物が、カチオン性部分Ｒ５を有する少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 各Ｒ５が、独立して、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、アミノアルキルアミノアルキル、グアニジノアルキル、Ｎ－ヘテロシクリルアルキル、またはＮ－ヘテロアリールである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 各Ｒ５が、独立して、
    からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. Ｒ４が、各中性スペーサー部分であり、独立して、Ｃ１－Ｃ５直鎖アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、およびヒドロキシアルキルによって置換されたＣ１－Ｃ４－アルキルからなる群から選ばれ、各シクロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、またはヒドロキシアルキルが、任意選択的に、１つ以上の置換基－ＯＨ、ハロ、もしくはアルコキシによって置換される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 各中性スペーサー部分Ｒ４が、独立して、
    からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 各中性スペーサー部分Ｒ４が、
    である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記カチオン性化合物のうちの少なくとも１つが、Ｒ５カチオン性部分を有する少なくとも２つのアミノ酸残基を含むカチオン性ドメインを含み、前記カチオン性ドメイン内の前記少なくとも２つのカチオン性アミノ酸残基の各々が、一つのＲ４を有する少なくとも１つのアミノ酸残基によって分離される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. ＲａおよびＲｂが、－Ｈである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記１つ以上のカチオン性化合物および１つ以上のＰＥＧ化合物が、９０：１０～９９：１のカチオン性化合物のＰＥＧ化合物に対する質量比で存在する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記１つ以上のＰＥＧ化合物が、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記１つ以上のＰＥＧ化合物が、式（Ｉ）の１つ以上の化合物またはその塩を含み、
    式中、
    ｍは、整数０～１５であり、
    ｎは、整数０～５であり、
    ｓは、整数０～５であり、
    ｔは、整数０～１５であり、
    ｍおよびｔのうちの少なくとも１つは、０以外であり、
    ｒは、整数１～２０であり、
    各ｏは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
    各ｑは、独立して、整数０、１、２、３、または４であり、
    各ｐは、独立して、整数１または２であり、
    Ｒ１は、－Ｈ、アルキル、アルキルアリール、－ＣＯＲ１ａ、または脂質部分であり、
    Ｒ１ａが、－Ｈ、－ＯＨ、アルキル、アリール、アルキルアリール、－Ｏ－アルキル、または－Ｏ－アルキルアリールであり、
    各Ｒ２は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｕＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｕが、独立して、整数１～２００であり、
    各Ｒ３は、独立して、脂質部分であり、
    各Ｒ４は、独立して、中性スペーサー部分または脂質部分であり、
    各Ｒ５は、独立して、カチオン性部分であり、
    各Ｒ６は、独立して、式－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｖＣＨ３のエチレングリコール部分であり、各ｖが、独立して、整数１～２００であり、
    Ｒ７は、－Ｈ、アルキル、アシル、－ＯＨ、－ＯＲ７ａ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ７ａ、または脂質部分であり、Ｒ７ａが、アルキル、アシル、または脂質部分であり、
    各ＲａおよびＲｂは、独立して、－Ｈ、Ｃ１－Ｃ４－アルキル、または天然もしくは非天然に存在するアミノ酸に認められる側鎖部分である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. ｍが、整数０～３である場合、各ｕは、独立して、整数３０～５０であるか、またはｍが、整数４～１５である場合、各ｕは、独立して、整数１～１０である、請求項１６に記載の組成物。
  18. ｔが、整数０～３である場合、各ｖは、独立して、整数３０～５０であるか、またはｔが、整数４～１５である場合、各ｖは、独立して、整数１～１０である、請求項１６または１７に記載の組成物。
  19. ｍが、１であり、ｕが、整数４０～４５であるか、またはｔが１であり、ｖが、整数４０～４５である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、前記１つ以上のカチオン性化合物の前記核酸に対する質量比が、０．５：１～２０：１である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、前記核酸が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記１つ以上のポリアニオン性化合物が、核酸を含み、前記核酸が、タンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、１つ以上の第２の薬剤をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記１つ以上の第２の薬剤が、ポリエチレングリコール、標的化要素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記組成物が、１つ以上の小分子活性剤または原薬をさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 請求項１～２６のいずれか一項に記載の組成物を含む、ポリアニオン性化合物を必要とする対象に送達するための医薬組成物。
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