JP7671284B2 - Ｆｃ変異および部位特異的コンジュゲーション特性を含む抗体組成物 - Google Patents

Ｆｃ変異および部位特異的コンジュゲーション特性を含む抗体組成物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／９７３，４７５号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
配列表提出
以下の紙コピーの提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。２０２０年１０月２日に記録された配列表の紙コピー。
連邦政府による資金提供を受けた研究の下でなされた発明に対する権利の声明
該当なし。
発明の分野
本明細書に記載の発明は、Ｆｃサイレンシングおよび部位特異的コンジュゲーションを含む複数の機能的特性を含むように操作された抗体、その抗原結合フラグメント、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、および抗体ホウ素コンジュゲート（ＡＢＣ）に関する。本発明はさらに、がんならびに免疫学的および神経学的障害の処置に有用な予後診断、予防および治療方法および組成物に関する。
発明の背景
がんは、世界中で冠動脈疾患に次いで２番目に多い死因である。数百万人もの人々が毎年がんにより死亡し、米国だけでも毎年５０万人をはるかに超える人々ががんにより死亡しており、２０１７年に１，６８８，７８０人の新たながん症例が診断された（米国がん協会）。心疾患による死亡は大幅に減少しているが、がんに起因する死亡は一般に増加している。２０４０年までに、世界中で毎年１６００万人を超えるがん死があり（ソース；国際がん研究機関、２０１８年）、したがって医学的発展が現在の傾向を変えない限り、主な死因として心疾患を上回ることが推定される。
いくつかのがんは、高い死亡率を有するとして際立っている。特に、肺の癌（すべてのがんによる死亡の１８．４％）、乳房の癌（すべてのがんによる死亡の６．６％）、結腸直腸の癌（すべてのがんによる死亡の９．２％）、肝臓の癌（すべてのがんによる死亡の８．２％）、および胃の癌（すべてのがんによる死亡の８．２％）は、世界中のすべての年齢の男女のがんによる死亡の主な原因を表す（ＧＬＯＢＯＣＡＮ ２０１８）。これらおよび実質的にすべての他の癌は、それらが原発腫瘍から離れた部位に転移するという共通の致死的特徴を共有し、例外はほとんどない。さらに、最初に自身の原発がんを生き延びたがん患者であっても、一般的な経験は、彼らの生活が劇的に変化することを示している。多くのがん患者は、再発または処置失敗の可能性を認識することによって陥る強い不安を経験する。多くのがん患者はまた、処置後に身体的衰弱を経験する。さらに、多くのがん患者は、自身の疾患の再発を経験する。
がん治療は過去数十年にわたって改善され、生存率は増加しているが、がんの不均一性は、複数の処置モダリティを利用する新しい治療戦略を依然として必要とする。これは、時として標準的な放射線療法および/または化学療法に限定される解剖学的に重要な部位での固形腫瘍（例えば、神経膠芽腫、頭頸部の扁平上皮癌および肺腺癌）の処置に特に当てはまる。それにもかかわらず、これらの療法の有害作用は、患者の生活の質を低下させる重度の副作用に加えて、局所領域再発、遠隔転移および第２の原発腫瘍を促進する化学耐性および放射線耐性である。
がんおよび他の医学的状態と戦う際に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｇ．ＫＯＨＬＥＲおよびＣ．ＭＩＬＳＴＥＩＮ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５））の治療的有用性が実現されつつある。ＭＡｂは、現在、移植、がん、感染症、心血管疾患および炎症における治療として承認されている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。このような機能の違いは、様々な免疫グロブリンアイソタイプについての異なる３次元構造に反映される（Ｐ．Ｍ．ＡＬＺＡＲＩら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５５５－５８０（１９８８））。
一般に、抗体は、いくつかの機構によって作用し、その大部分は、免疫系の他のアームに関与する。抗体は、単に分子の相互作用をブロックすることができるか、またはＣ１複合体上のＣ１ｑとクラスター化した抗体との相互作用によって古典的補体経路（補体依存性細胞傷害またはＣＤＣとして知られる）を活性化することができる。重要なことに、抗体はまた、Ｆｃ受容体の関与によって抗体媒介と細胞媒介の免疫応答との間の連結として作用する。
Ｆｃ操作アプローチは、ＦｃドメインとＦｃガンマ受容体およびＣ１ｑとの重要な相互作用部位を決定し、次いで、エフェクター機能をモジュレートすることおよび毒性の低減などのような治療特性を改善するために、これらの位置を変異させて結合を低減または消失させるために使用されてきた。ＨＥＺＡＲＥＨら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２４）：１２１６１－８（Ｄｅｃ．２００１）およびＯＧＡＮＥＳＹＡＮら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｄ．Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，６４：（Ｐｔ．６）：７００－４（Ｊｕｎ ２００８）を参照のこと。
さらに、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、従来の化学療法よりも改善された治療指数を有する新たなクラスの標的治療薬である。薬物およびリンカーは、（モノクローナル）抗体（ｍＡｂ）および標的選択に加えて、ＡＤＣ開発の焦点となっている。しかしながら、最近、コンジュゲート均一性の重要性が調査されている。抗体に操作された表面露出システイン残基を利用する部位特異的コンジュゲーション技術を適用することによって、ＡＤＣの薬理学的プロファイルを改善することができ、次いでリンカー薬物にコンジュゲートされ、その結果、定義された薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有する部位特異的コンジュゲートＡＤＣが得られることが報告されている。従来のリジンおよびシステインコンジュゲーション方法論を使用して作製された不均一混合物と比較して、部位特異的にコンジュゲートしたＡＤＣは、一般に、少なくとも同等のインビボ効力、ＰＫの改善、および治療域の拡大を示した。
先行技術は、部位特異的コンジュゲーションおよび結果として生じるＡＤＣを得るためのいくつかのアプローチを開示している。例えば、国際公開第２００６／０３４４８８号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＵＴＨＥＲＬＡＮＤら、Ｂｌｏｏｄ １２２（８）：１４５５－１４６３（２０１３）、国際公開第２０１４／１２４３１６号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、および米国特許出願公開第２０１７／００８０１０３号（Ｓｙｎｔｈｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などを参照されたい。
これまでに開示された先行技術の方法のすべてにおいて、リンカー薬物を、均一性および薬物動態特性を改善する目的で、表面/溶媒に曝露された位置、高いチオール反応性を示す位置、およびモノクローナル抗体の特異的定常領域の位置に、コンジュゲートする部位に重点が置かれた。
上記の従来のリジンおよびシステインコンジュゲーション方法は、ＦＤＡ承認された抗体－薬物コンジュゲートをもたらし、それらは、現在前臨床試験および臨床試験中の多数のＡＤＣの大部分を構築するために使用されているが、許容され得る抗原結合特性、インビボ有効性、治療指数および/または安定性を有するＡＤＣを得るために、ＡＤＣの物理化学的、薬物動態学的、薬理学的および/または毒性学的特性を（さらに）改善することを目的とする、新しいコンジュゲーション戦略が依然として必要である。
上記から、がんおよび免疫学的疾患の処置において新しい処置パラダイムが必要であることは、当業者には容易に明らかである。最新の抗体工学技術ならびに新しいコンジュゲーション方法論を使用することにより、より効果的な処置、副作用の低減、および生産コストの低減という全体的な目標を伴って、新しいクラスの抗体を達成することができる。
当技術分野で公知の現在の欠陥を考慮すると、抗体エフェクター機能を低下させ、部位特異的コンジュゲーションポイントを含む三重変異で操作された抗体を利用して、新規かつ改良された抗体および結合リガンド、ならびにがん（複数可）、免疫障害、および他の疾患を処置する方法を提供することが、本発明の目的である。
国際公開第２００６／０３４４８８号 国際公開第２０１４／１２４３１６号 米国特許出願公開第２０１７／００８０１０３号明細書
Ｇ．ＫＯＨＬＥＲおよびＣ．ＭＩＬＳＴＥＩＮ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５） Ｐ．Ｍ．ＡＬＺＡＲＩら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５５５－５８０（１９８８） ＨＥＺＡＲＥＨら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２４）：１２１６１－８（Ｄｅｃ．２００１） ＯＧＡＮＥＳＹＡＮら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｄ．Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，６４：（Ｐｔ．６）：７００－４（Ｊｕｎ ２００８） ＳＵＴＨＥＲＬＡＮＤら、Ｂｌｏｏｄ １２２（８）：１４５５－１４６３（２０１３）
本発明は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３を含むがこれらに限定されないタンパク質に結合する抗体、抗原結合フラグメント、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体免疫修飾コンジュゲート、および抗体ホウ素コンジュゲート（ＡＢＣ）、ならびにＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、およびを含むがこれらに限定されないタンパク質のポリペプチドフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療剤とコンジュゲートした完全ヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ボリル化化合物とコンジュゲートした完全ヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃサイレンシングによってエフェクター機能を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、抗体は、薬物部分にコンジュゲーションすることができる部位特異的変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃがサイレンシングされる三重変異を含み、薬物部分へのコンジュゲーションのために部位特異的変異が挿入される。さらなる実施形態では、三重変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃを含む。
本発明はさらに、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および、表ＩＶに列挙されるものなどの他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するがんを処置するための抗体、抗体薬物コンジュゲート、および戦略などの様々な免疫原性組成物または治療組成物を提供する。
別の実施形態では、本開示は、三重変異体抗体を合成する方法を教示する。
別の実施形態では、本開示は、三重変異体抗体を合成し、それに対する部位特異的位置で薬物部分をコンジュゲートする方法を教示する。
別の実施形態では、本開示は、単一変異体抗体を合成する方法を教示する。
別の実施形態では、本開示は、単一変異体抗体を合成し、それに対する部位特異的位置で薬物部分をコンジュゲートする方法を教示する。
別の実施形態では、本開示は、ヒトのがん（複数可）、免疫学的障害および他の疾患を処置する方法を教示する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
三重変異を含む抗体組成物であって、前記三重変異が、Ｌ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、前記三重変異が、Ｆｃγ受容体結合および抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物。
（項目２）
前記抗体が、ＥＧＦＲ抗体を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体が、Ｈｅｒ２抗体を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体が、ＣＤＨ３抗体を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記ＴＡＡが、表ＩＶに示される、項目６に記載の抗体。
（項目８）
抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
（ｉ）三重変異を含む抗体組成物であって、前記三重変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、かつ前記三重変異が抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物と、
（ｉｉ）リンカーと、
（ｉｉｉ）薬物単位であって、前記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）。
（項目８）
前記抗体組成物が、ＥＧＦＲ抗体を含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目９）
前記抗体組成物が、Ｈｅｒ２抗体を含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１０）
前記抗体組成物が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１１）
前記抗体が、ＣＤＨ３抗体を含む、項目８に記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体組成物が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１３）
前記ＴＡＡが、表ＩＶに示される、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
ストレッチャー単位をさらに含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１５）
スペーサー単位をさらに含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１６）
アミノ酸単位をさらに含む、項目８に記載のＡＤＣ。
（項目１７）
項目１に記載の抗体を含む、製造品。
（項目１８）
項目８に記載のＡＤＣを含む製造品。
（項目１９）
治療有効量の項目８に記載のＡＤＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
（項目２０）
治療有効量の項目１に記載の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
（項目２１）
抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）であって、
（ｉ）三重変異を含む抗体組成物であって、前記三重変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、前記三重変異が抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物と、
（ｉｉ）リンカーと、
（ｉｉｉ）薬物単位であって、前記薬物単位がボリル化組成物を含み、かつ前記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）。
（項目２２）
前記抗体組成物が、ＥＧＦＲ抗体を含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２３）
前記抗体組成物が、Ｈｅｒ２抗体を含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２４）
前記抗体組成物が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２５）
前記抗体組成物が、ＣＤＨ３抗体を含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２６）
前記抗体組成物が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２７）
前記ＴＡＡが、表ＩＶに示される、項目２６に記載の抗体。
（項目２８）
ストレッチャー単位をさらに含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目２９）
スペーサー単位をさらに含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目３０）
アミノ酸単位をさらに含む、項目２１に記載のＡＢＣ。
（項目３１）
治療有効量の項目２１に記載のＡＢＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
（項目３２）
個体におけるがんを処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の項目２１に記載のＡＢＣを前記個体に投与することを含み、前記がんが表Ｉに示される前記がんを発現する細胞を含む、方法。
抗Ｈｅｒ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．２およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．３およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗ＣＤＨ３ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントは、標的結合に影響を及ぼさない。
抗Ｈｅｒ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合の完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合の完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．２およびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合の完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．３およびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合のほぼ完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合の完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗ＣＤＨ３ ＭａｂおよびＦｃバリアント：ＦｃγＲＩ結合のほぼ完全な阻害が、三重変異体について観察される。
抗Ｈｅｒ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体についてＦｃγＲＩＩＡ結合の抑制が観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体についてＦｃγＲＩＩＡ結合の抑制が観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体についてＦｃγＲＩＩＡ結合の抑制が観察される。
抗ＣＤＨ３ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体についてＦｃγＲＩＩＡ結合の抑制が観察される。
抗Ｈｅｒ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．２およびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．３およびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗ＣＤＨ３ ＭａｂおよびＦｃバリアント：単一変異体および三重変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が観察される。
抗Ｈｅｒ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．２およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
抗ＥＧＦＲ Ｍａｂ Ｎｏ．３およびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
抗ＣＤＨ３ ＭａｂおよびＦｃバリアント：Ｆｃバリアントでは、ＦｃＲｎ結合の実質的な減少は観察されない。
ＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢおよびＦｃＲｎについての抗Ｈｅｒ２抗体およびＦｃバリアントの結合速度論分析。三重変異体は、すべてのＦｃγＲアイソフォームに対して実質的な結合阻害を示すが、ＦｃＲｎに対しては実質的な結合阻害を示さない。
ＦｃγＲＩについての抗Ｈｅｒ２抗体およびＦｃバリアントの結合速度論分析。野生型および単一変異と比較して、三重変異についての解離速度はより速い。
抗ＨＥＲ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＡＤＣＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：ＡＤＣＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＡＤＣＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＣＤＨ３ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＡＤＣＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＨＥＲ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＣＤＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：ＣＤＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＣＤＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＣＤＨ３ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：ＣＤＣの減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＨＥＲ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：Ｃ１ｑ結合の減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１およびＦｃバリアント：Ｃ１ｑ結合の減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗Ｔｒｏｐ２ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：Ｃ１ｑ結合の減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
抗ＣＤＨ３ ｍＡｂおよびＦｃバリアント：Ｃ１ｑ結合の減少は、Ｆｃバリアントで観察される。
独自のペイロード（ＬＯＬ１）とコンジュゲートした抗Ｈｅｒ２ Ｍａｂ三重変異体の逆相カラムクロマトグラフィープロファイル。非コンジュゲート三重変異体抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ（ピーク１）コンジュゲート三重変異体抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ（ピーク２）の重ね合わせたＵＶトレース。
ＬＯＬ１コンジュゲート三重変異体抗ＨＥＲ２ ｍＡｂのインタクト質量分析により、コンジュゲートが１００％部位特異的であることが確認された。（Ａ）．フルスペクトル、（Ｂ）．拡大ＬＣ領域、（Ｃ）．拡大ＨＣ領域。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ（Ａ）および抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（Ｂ）のＬ３２８Ｃバリアントについての逆相カラムクロマトグラフィープロファイル。単一ペイロード（Ｈ１）を有する重鎖は、コンジュゲーションが部位特異的であり、かつペイロードは、Ｃｙｓ３２８上に存在し、ヒンジ領域内には存在しないことを示唆する主要な種である。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＴＲＯＰ２ ｍＡｂのＬ３２８Ｃバリアントについての逆相カラムクロマトグラフィープロファイル。（Ａ）．軽鎖（ピーク１）、非コンジュゲート重鎖（ピーク２）、１つのペイロードを有するコンジュゲート重鎖（ピーク３）；２つおよび３つのペイロードを有するコンジュゲート重鎖（ピーク４～５）。（Ｂ）．重ね合わせたｍＡｂおよびＡＤＣのＵＶ２１４ｎｍトレース。抗ＴＲＯＰ２抗体の非コンジュゲートＬ３２８Ｃバリアント（黒色）；抗ＴＲＯＰ２抗体のｖｃＭＭＡＥコンジュゲートＬ３２８Ｃバリアント（赤色）。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした三重変異体抗ＴＲＯＰ２ ｍＡｂの逆相ＨＰＬＣ分析。（Ａ）．軽鎖（ピーク１）、非コンジュゲート重鎖（ピーク２）、１つのペイロードを有するコンジュゲート重鎖（ピーク３）；それぞれ、２つおよび３つのペイロードを有するコンジュゲート重鎖（ピーク４～５）。（Ｂ）．重ね合わせたｍＡｂおよびＡＤＣのＵＶ２１４ｎｍトレース。抗ＴＲＯＰ２抗体の非コンジュゲートＬ３２８Ｃバリアント（黒色）；抗ＴＲＯＰ２抗体のｖｃＭＭＡＥコンジュゲートＬ３２８Ｃバリアント（赤色）
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ ｍＡｂのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃバリアントについての逆相カラムクロマトグラフィープロファイル。（Ａ）．三重Ｆｃ変異を有する非コンジュゲート抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．３についてのプロファイル。（Ｂ）．三重Ｆｃ変異を有する非コンジュゲート抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１についてのプロファイル。（Ｃ）．三重Ｆｃ変異を有するｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．３についてのプロファイル。（Ｄ）．三重Ｆｃ変異を有するｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１についてのプロファイル
逆相カラムクロマトグラフィーデータ（図４８に提供）に基づくピーク割り当ておよびＤＡＲ計算の一例。非コンジュゲートｍＡｂ（対照）を使用して、重鎖および軽鎖の両方について保持時間およびＵＶ２５０／２８０比の両方を確認した。これらのパラメータは、正しいピーク割り当ておよびＤＡＲ決定に必要であった。
得られたＡＤＣの分析属性の要約：平均ＤＡＲ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるモノマーのパーセント、およびＤＡＲ１重鎖のパーセントを、単一または三重Ｆｃバリアントを有するｖｃＭＭＡＥまたはＬＯＬ１コンジュゲートｍＡｂについて示す。
ｖｃＭＭＡＥ－ペプチドのフラグメンテーション後の特徴的な娘イオン。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした三重変異体を有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１の配列包括度。（Ａ）．重鎖、（Ｂ）．軽鎖。
（Ａ）三重変異を有する非コンジュゲート抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１、（Ｂ）三重変異を有するｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１についてのトリプシンによる消化後のペプチドの代表的なＴＩＣクロマトグラム。
ＡＣＰＡＰＩＥＫ重鎖ペプチドのＭＳ／ＭＳにより、三重変異を有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１についてのコンジュゲーション部位が確認された。ＡＣＰＡＰＩＥＫ－カルバミドメチル（例えばアルキル化ｍＡｂ、Ａ、Ｂ）およびＡＣＰＡＰＩＥＫ－ｖｃＭＭＡＥ（Ｃ、Ｄ）ペプチドの完全ＭＳ（Ａ，Ｃ）およびＭＳ／ＭＳによるフラグメンテーション（Ｂ，Ｄ）を示す。ペプチドまたはｖｃＭＭＡＥを表すフラグメントは、それぞれ黒塗り矢印または白抜き矢印で示されている。
ＡＣＰＡＰＩＥＫ重鎖ペプチドのＭＳ／ＭＳによる、単一変異ＡＤＣを有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１におけるコンジュゲーションの部位の確認。ＡＣＰＡＰＩＥＫ－カルバミドメチル（例えばアルキル化ｍＡｂ、Ａ、Ｂ）およびＡＣＰＡＰＩＥＫ－ｖｃＭＭＡＥ（Ｃ、Ｄ）ペプチドの完全ＭＳ（Ａ，Ｃ）およびＭＳ／ＭＳによるフラグメンテーション（Ｂ，Ｄ）を示す。ペプチドまたはｖｃＭＭＡＥを表すフラグメントは、それぞれ黒塗り矢印または白抜き矢印で示されている。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＨＥＲ２抗体のＬ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＨＣＣ１９５４（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１のＬ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．３のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＥＧＦＲ陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗Ｔｒｏｐ２抗体のＬ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＳＫ ＢＲ３（ＴＲＯＰ２陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗Ｔｒｏｐ２抗体のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃバリアントによって媒介される細胞傷害。ＳＫ ＢＲ３（ＴＲＯＰ２陽性）細胞を７２～９６時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを用いて生存細胞の割合を測定した。
発明の詳細な説明
セクションの概要
Ｉ．）定義
ＩＩ．）抗体
ＩＩＩ．）エフェクター機能を改変するＦｃ変異
ＩＶ．）抗体－薬物－コンジュゲート
Ｖ．）ＡＤＣのための部位特異的コンジュゲーションフォーマット
ＶＩ．）リンカー単位
ＶＩＩ．）ストレッチャー単位
ＶＩＩＩ．）アミノ酸単位
ＩＸ．）スペーサー単位
Ｘ．）薬物単位
ＸＩ．）ＡＤＣの細胞傷害性効果を決定する方法
ＸＩＩ．）Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３およびＴＡＡを発現するがん（複数可）の処置
ＸＩＩＩ．）併用療法
ＸＩＶ．）キット/製造品
Ｉ．）定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記および他の科学用語または専門用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確性および/または容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般に理解されるものとの実質的な違いを表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書で商品名が使用される場合、商品名への言及は、文脈によって他に指示されない限り、商品名製品の製品製剤、ジェネリック医薬品、および医薬有効成分（複数可）も指す。
「進行がん」、「局所進行がん」、「進行疾患」および「局所進行疾患」という用語は、関連する組織カプセルを通って拡大したがんを意味し、米国泌尿器科学会（ＡＵＡ）システムの下でのステージＣ疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ－Ｊｅｗｅｔｔシステムの下でのステージＣ１～Ｃ２疾患、ならびにＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）システムの下でのステージＴ３～Ｔ４およびＮ＋疾患を含むことを意味する。一般に、局所進行疾患を有する患者には手術は推奨されず、これらの患者は、臨床的に限局性（臓器限局性）のがんを有する患者と比較して実質的に転帰があまり良好ではない。
「置換された」という用語は、特定の基または部分が１またはそれを超える置換基を有することを意味する。「非置換」という用語は、特定の基が置換基を有さないことを意味する。「必要に応じて置換されている」という用語は、特定の基が非置換であるか、または１またはそれを超える置換基によって置換されていることを意味する。「置換された」という用語は、構造系を説明するために使用される場合、置換は、系上の任意の原子価許容位置で起こることを意味する。
「抗体」という用語は、他に明記しない限り、最も広い意味で使用される。したがって、「抗体」は、天然に存在するか、または従来のハイブリドーマまたはトランスジェニックマウス技術によって産生されるモノクローナル抗体などの人工のものであり得る。Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/またはＴＡＡ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインならびに/または１もしくはそれを超える相補性決定領域を含むフラグメントを含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/または任意のＴＡＡに特異的に結合し、かつ/または所望の生物学的活性を示し、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３に特異的に結合し、および/または所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを特異的に包含する任意の形態の抗体またはそのフラグメントを指す。任意の特異的抗体が、本明細書中に提供される方法および組成物において使用され得る。したがって、一実施形態では、「抗体」という用語は、組み合わせて標的抗原に対する特異的結合部位を形成する、軽鎖免疫グロブリン分子からの少なくとも１つの可変領域および重鎖分子からの少なくとも１つの可変領域を含む分子を包含する。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。例えば、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。本方法および組成物において有用な抗体は、細胞培養において、ファージにおいて、酵母において、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーおよび類人猿を含むがこれらに限定されない様々な動物において生成され得る。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は哺乳動物抗体である。ファージ技術を使用して、初期抗体を単離するか、または特異性もしくはアビディティ特性が変化したバリアントを生成することができる。そのような技術は日常的であり、当技術分野で周知である。一実施形態では、抗体は、当技術分野で公知の組換え手段によって産生される。例えば、組換え抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生することができる。１またはそれを超えるベクターを使用して、宿主細胞において少なくとも１つのＶＬおよび少なくとも１つのＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列をトランスフェクトすることができる。抗体の生成および産生の組換え手段の例示的な記載には、Ｄｅｌｖｅｓ、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；ＳＨＥＰＡＲＤら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；ＧＯＤＩＮＧ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，最新版）が挙げられる。本発明の抗体は、所望の機能を媒介する際の抗体の有効性を高めるために組換え手段によって修飾することができる。したがって、抗体を、組換え手段を用いた置換によって修飾することができることは、本発明の範囲内である。典型的には、置換は、保存的置換である。例えば、抗体の定常領域中の少なくとも１つのアミノ酸を異なる残基で置き換えることができる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第６，１９４，５５１号、出願番号国際公開第９９５８５７２号、およびＡＮＧＡＬら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５－０８（１９９３）を参照されたい。アミノ酸の修飾には、アミノ酸の欠失、付加および置換が含まれる。場合によっては、そのような変更は、望ましくない活性、例えば補体依存性細胞傷害を減少させるために行われる。しばしば、抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合でまたは非共有結合で接続することによって標識される。多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献の両方で広く報告されている。これらの抗体は、正常または欠損ＦＬＴ３への結合についてスクリーニングすることができる。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６年）を参照されたい。所望の生物学的活性を有する適切な抗体は、限定されないが、増殖、遊走、接着、軟寒天成長、血管新生、細胞間コミュニケーション、アポトーシス、輸送、シグナル伝達を含む以下のインビトロアッセイ、および腫瘍成長の阻害などの以下のインビボアッセイを使用して同定することができる。本明細書中に提供される抗体はまた、診断用途において有用であり得る。捕捉抗体または非中和抗体として、抗原の受容体結合または生物学的活性を阻害することなく、特異的抗原に結合する能力についてスクリーニングすることができる。中和抗体として、抗体は競合結合アッセイにおいて有用であり得る。それらはまた、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２および/またはＣＤＨ３またはその受容体を定量するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」または「抗体フラグメント」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および/またはバリアント）に特異的に結合する能力を保持するＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/またはＴＡＡ抗体の１またはそれを超えるフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって行うことができることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（ＷＡＲＤら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって、連結することができる。例えば、ＢＩＲＤら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨＵＳＴＯＮら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３）を参照されたい。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語内に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される「Ｆｃ」という用語は、ヒンジ領域、ＣＨ２および/またはＣＨ３ドメインを含む領域を指す。
本明細書で使用される場合、「抗原」の任意の形態を使用して、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/または本発明の任意のＴＡＡに特異的な抗体を生成することができる。したがって、誘発抗原は、単一のエピトープ、複数のエピトープ、または単独もしくは当技術分野で公知の１またはそれを超える免疫原性増強剤と組み合わせたタンパク質全体であってもよい。誘発抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部でトランスフェクトされた細胞で免疫すること）、または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみでの免疫すること）であり得る。抗原は、遺伝子修飾された細胞で産生され得る。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムまたは非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってよく、細胞外ドメインの少なくとも一部をコードする。本明細書で使用される場合、抗原の文脈における「部分」という用語は、適宜、目的の抗原の免疫原性エピトープを構成するための最小数のアミノ酸または核酸を指す。限定されないが、アデノウイルスベクター、プラスミド、および非ウイルスベクター、例えばカチオン性脂質を含む、目的の細胞の形質転換に適した任意の遺伝子ベクターを使用することができる。一実施形態では、本明細書の方法および組成物の抗体は、目的の標的の細胞外ドメインの少なくとも一部に特異的に結合する。
本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントは、「生物活性剤」を構成するか、またはその一部であり得る。本明細書で使用される場合、「生物活性剤」という用語は、抗原に結合し、および/または細胞殺滅毒素を増強するために所望の生物学的効果を増強または媒介する任意の合成または天然に存在する化合物を指す。一実施形態では、本発明において有用な結合フラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という用語は、所望の抗原エピトープに結合し、生物学的効果を直接的または間接的に発揮することができる抗体または抗体フラグメントを指す。直接的な効果には、成長シグナルのモジュレーション、刺激および/または阻害、抗アポトーシスシグナルのモジュレーション、刺激および/または阻害、アポトーシスシグナルまたは壊死シグナルのモジュレーション、刺激および/または阻害、ＡＤＣＣカスケードのモジュレーション、刺激および/または阻害、ならびにＣＤＣカスケードおよび/またはＦｃサイレンシングのモジュレーション、刺激および/または阻害が含まれるが、これらに限定されない。
抗原結合に関して本明細書で使用される場合、タンパク質に「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質が、標的ならびに標的内の別個のドメインまたは別個のアミノ酸配列に結合するが、他の（例えば、無関係である）タンパク質には結合しないか、またはわずかばかり結合することを意味する。しかしながら、この用語は、抗体またはその結合フラグメントが密接に関連する分子と交差反応性であってもよいという事実を排除しない。本明細書に記載の抗体およびそのフラグメント、ならびにこれらを含む抗体薬物コンジュゲートは、密接に関連する分子に結合するよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００、または１０００倍高い親和性で、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/または本明細書に開示されるＴＡＡに特異的に結合し得る。
「二重特異性」抗体もまた、本方法および本組成物において有用である。本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対する結合特異性を有する抗体、典型的にはモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、エピトープは、同じ抗原に由来する。別の実施形態では、エピトープは、２つの異なる抗原に由来する。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現を使用して組換えで産生することができる。例えば、ＭＩＬＳＴＥＩＮら、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－３９（１９８３）を参照されたい。あるいは、化学結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。例えば、ＢＲＥＮＮＡＮら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照されたい。二重特異性抗体には、二重特異性抗体フラグメントが含まれる。例えば、ＨＯＬＬＩＮＧＥＲら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－４８（１９９３）、ＧＲＵＢＥＲら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含み、一方、鎖（複数可）の残りの部分は、それらが標的抗原に特異的に結合しかつ/または所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるかまたは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭＯＲＲＩＳＯＮら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１－６８５５（１９８４））。
本明細書で使用される場合、「がん」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は互換的に使用され、単数形または複数形のいずれかで、宿主生物に対して病的になる悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発がん細胞（すなわち、悪性形質転換の部位の近くから得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非がん性細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用されるがん細胞の定義は、原発がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来する任意の細胞を含む。これには、転移したがん細胞、ならびにがん細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として現れるがんのタイプに言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍質量に基づいて検出可能なものである。例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診などの手順によって、および/または患者から得られる試料中の１またはそれを超えるがん特異的抗原の発現のために検出可能である。腫瘍は、造血性腫瘍、例えば、血液細胞の腫瘍などであってよく、液体腫瘍を意味する。このような腫瘍に基づく臨床状態の具体例としては、慢性骨髄球性白血病、急性骨髄球性白血病、多発性骨髄腫などの骨髄腫、リンパ腫などが挙げられる。
「治療剤」という用語は、治療上の利益を提供し、および/または本明細書で定義される治療上有効なすべての薬剤を指す。治療剤は、例えば、疾患、障害、もしくは状態を逆転させるか、寛解するか、緩和するか、阻害するか、もしくはその進行を制限するか、もしくはその重症度を低下させるか、またはがんなどの疾患の１またはそれを超える症状に影響を及ぼすか、改善するか、もしくは寛解させることができる。そのような薬剤は、細胞傷害性または細胞増殖抑制性であり得る。この用語には、本明細書で定義される化学療法剤、抗新生物剤および「薬物単位」剤が含まれるが、これらに限定されない。
「抗新生物剤」という用語は、新生物またはがんの処置において、本明細書で定義されるように、治療上の利益を提供するおよび/または治療上有効である全ての薬剤を指す。
「化学療法剤」という用語は、腫瘍成長を阻害するのに有効なすべての化学化合物を指す。化学療法剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物およびアルキルスルホネート；代謝拮抗剤、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジン拮抗剤；有糸分裂阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド、アウリスタチンおよびポドフィロトキシンの誘導体などの抗チューブリン剤；細胞傷害性抗生物質；ＤＮＡの発現または複製を損傷または妨害する化合物、例えばＤＮＡ副溝結合剤；および成長因子受容体アンタゴニストが挙げられる。さらに、化学療法剤には、細胞傷害剤（本明細書で定義される）、抗体、生物学的分子および小分子が含まれる。
「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の不連続配列を指すことが当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）および各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）が存在する。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら、（１９９１），‘‘Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，’’５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、ＡＬ－ＬＡＺＩＫＡＮＩら、（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、ＭＡＣＣＡＬＬＵＭら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），‘‘Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，’’Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５．‘‘（Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）、ＬＥＦＲＡＮＣ Ｍ．Ｐ．ら、’’ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，’’Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、およびＨＯＮＥＧＧＥＲ Ａ．ａｎｄ ＰＬＩＣＫＴＨＵＮ Ａ．，‘‘Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，’’Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ．８；３０９（３）：６５７－７０（ＡＨｏナンバリングスキーム）に記載されているものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
所与のＣＤＲの境界は、識別に使用されるスキームに応じて異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方に対するナンバリングは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入は、挿入文字、例えば「３０ａ」によって提供され、欠失は、いくつかの抗体において現れる。２つのスキームは、異なる位置に特定の挿入および欠失（「インデル」）を配置し、異なるナンバリングをもたらす。接触スキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに類似している。
したがって、別段特定されない限り、所与の抗体またはその領域、例えば可変領域の「ＣＤＲ」および「相補性決定領域」という用語、ならびに抗体またはその領域の個々のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、上記の本明細書に記載の公知のスキームのいずれかによって定義されるような相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。場合によっては、特定の１つまたは複数のＣＤＲ、例えばＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲの同定のためのスキームが指定される。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく行われ得るアミノ酸および/またはアミノ酸配列の置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、ＷＡＴＳＯＮら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＧＥＮＥ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７）を参照されたい）。そのような例示的な置換は、好ましくは、表ＩＩおよび表ＩＩＩに示されるものに従って行われる。例えば、そのような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）のいずれかで、これらの疎水性アミノ酸のいずれか他のものを、置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）でグルタミン酸（Ｅ）を置換することおよびその逆；グルタミン（Ｑ）でアスパラギン（Ｎ）を置換することおよびその逆；ならびにセリン（Ｓ）でトレオニン（Ｔ）を置換することおよびその逆が含まれる。特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に応じて、他の置換も保存的であると考えることができる。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）と同様に、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）はしばしば交換可能であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンと交換されることが多く、バリンと交換されることもある。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要特徴がその電荷であり、これらの２つのアミノ酸残基の異なるｐＫは、重要ではない位置において頻繁に交換可能である。さらに他の変化は、特定の環境において「保存的」であると考えることができる（例えば、本明細書の表ＩＩＩ；ｐａｇｅｓ １３－１５‘‘Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’’２ｎｄ ＥＤ．Ｌｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＥＮＩＫＯＦＦら、ＰＮＡＳ １９９２ Ｖｏｌ ８９ １０９１５－１０９１９；ＬＥＩら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５ Ｍａｙ １９；２７０（２０）：１１８８２－６）を参照のこと。）他の置換も許容され、経験的にまたは公知の保存的置換に従って決定され得る。
「細胞傷害剤」という用語は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害または防止し、および/または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、ならびに細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素（そのフラグメントおよび/またはバリアントを含む）を含むことを意図している。細胞傷害剤の例としては、アウリスタチン、アウロマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリケアマイシン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤およびグルココルチコイドならびに他の化学療法剤ならびにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２などの放射性同位体、およびＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体を含む抗体はまた、上記の細胞傷害剤のいずれかに、また、プロドラッグをその活性な形態に変換することができる抗がんプロドラッグ活性化酵素にもコンジュゲートされる場合がある。
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を作り出すことを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号；およびＨＯＬＬＩＮＧＥＲら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～４８（１９９３）により十分に記載されている。
「相同体」という用語は、例えば、対応する位置で同じまたは類似する化学残基の配列を有することによって、別の分子と相同性を示す分子を指す。
「同一の」または「配列同一性」という用語は、最適にアラインメントされ、適切な挿入または欠失と比較した場合の２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
２つの配列間の「パーセント同一性」は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数/位置の総数×１００）の関数である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮＥＥＤＬＥＭＡＮら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、決定することができる。
例として、ポリヌクレオチド配列は、参照配列と１００％同一である参照ポリヌクレオチド配列と同一であってもよく、または、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一など、参照配列と比較して最大で特定の整数のヌクレオチド変化を含んでもよい。そのような変化は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、置換（遷移およびトランスバージョンを含む）、または挿入から選択され、上記変化は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、またはそれらの末端位置の間の任意の場所で起こってよく、参照配列中のヌクレオチドの間に個別に、または参照配列内の１またはそれを超える連続する基に散在し得る。ヌクレオチド変化の数は、本明細書中に記載されるような参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数にそれぞれのパーセント同一性の数値パーセント（１００で割ったもの）を掛け、その積を参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの上記総数から減算することによって、または、ｎｎ≦ｘｎ－（ｘｎｙ）によって決定され、式中、ｎｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘｎは本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数であり（例示的な参照ポリヌクレオチド配列については「配列表」の核酸配列を参照されたい）、ｙは、５０％については０．５０、６０％については０．６０、７０％については０．７０、７５％については０．７５、８０％については０．８０、８５％については０．８５、９０％については０．９０、９５％については０．９５、９８％については０．９８、９９％については０．９９、または１００％については１．００であり、乗算演算子の記号であり、ｘｎおよびｙとの任意の非整数積は、ｘｎからそれを減算する前に最も近い整数に切り捨てる。同様に、ポリペプチド配列は、本明細書に記載のポリペプチド参照配列と同一であってもよく、すなわち１００％同一であるか、または％同一性が１００％未満、例えば少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一であるように、参照配列と比較してある特定の整数までのアミノ酸変化を含んでもよい。そのような変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入からなる群から選択され、上記変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置の間の任意の場所で起こってよく、参照配列中のアミノ酸の間に個別にまたは参照配列内の１またはそれを超える連続する基のいずれかに散在し得る。所与の％同一性に対するアミノ酸変化の数は、ポリペプチド参照配列によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数に、それぞれのパーセント同一性の数値パーセント（１００で割ったもの）を掛け、次いでその積を本明細書に記載のポリペプチド参照配列中のアミノ酸の上記総数から減算することまたは：ｎａ≦ｘａ－（ｘａｙ）によって決定され、式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは参照ポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％については０．５０、６０％については０．６０、７０％については０．７０、７５％については０．７５、８０％については０．８０、８５％については０．８５、９０％については０．９０、９５％については０．９５、９８％については０．９８、９９％については０．９９、または１００％については１．００であり、乗算演算子の記号であり、式中、ｘａとｙとの任意の非整数積は、ｘａからそれを減算する前に最も近い整数に切り捨てる。パーセント同一性は、配列の長さにわたって決定され得る。本明細書で定義されるように、「７５％を超えて同一」という用語は、７５％、８０％、８５％、９５％および９９％を超える同一性、ならびにこの範囲内のすべての離散値および離散部分範囲を含む。
一実施形態では、本明細書に提供される抗体は「ヒト抗体」である。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖および重鎖配列の本質的に全配列がヒト遺伝子に由来する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞技術（例えば、（ＫＯＺＢＯＲら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３），ＥＢＶ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅを参照されたい（例えば、ＣＯＬＥら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ７７－９６（１９８５）を参照されたい）によって、またはファージディスプレイ（例えば、ＭＡＲＫＳら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）を参照されたい）を使用して、調製される。具体的な実施形態では、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて生成される。そのような部分的から完全なヒト抗体を作製するための技術は、当技術分野で公知であり、任意のそのような技術を使用することができる。特に好ましい一実施形態によれば、完全ヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。出願番号国際公開第０２／４３４７８号および米国特許第６，６５７，１０３（Ａｂｇｅｎｉｘ）およびその子孫に見られるヒト抗体を作製するトランスジェニックマウスを調製することの例示的な説明。次いで、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合して、抗体の連続産生のためのハイブリドーマ細胞株を作製することができる。例えば、米国特許第５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，６６１，０１６号、および同５，５４５，８０６号、ならびにＪＡＫＯＢＯＶＩＴＳ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３１：３３－４２（１９９８）、ＧＲＥＥＮら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－９５（１９９８）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）抗体およびヒト抗体からの配列を含む抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）のそれを含む。例えば、ＣＡＢＩＬＬＹ、米国特許第４，８１６，５６７号、ＱＵＥＥＮら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３、およびＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を参照されたい。
本明細書で使用される「阻害する」または「の阻害」という用語は、測定可能な量だけ減少させること、または完全に予防することを意味する。
「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む、哺乳動物として分類される任意の生物を指す。本発明の一実施形態では、哺乳動物は、マウスである。本発明の別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
「転移がん」および「転移疾患」という用語は、領域性リンパ節または遠隔部位に転移したがんを意味し、ＡＵＡ系下のステージＤ疾患およびＴＮＭ系下のステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むことを意味する。
本明細書で使用される「修飾された」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドへの変化の存在を指す。そのような変化または修飾は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチドもしくは非天然アミノ酸ポリペプチドの合成後修飾によって、または共翻訳によって、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチドもしくは非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾によって得ることができる。
「分子認識」は、宿主分子が第２の分子（すなわち、ゲスト）と複合体を形成することができる化学的事象を意味する。このプロセスは、水素結合、疎水性相互作用、イオン性相互作用を含むがこれらに限定されない非共有結合性化学結合によって起こる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原エピトープに対するものである。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対する（または異なるエピトープに特異的な）多数の抗体を含む。一実施形態では、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピトープを含む単一の抗原内に異なるエピトープ特異性、親和性、またはアビディティを有する複数のモノクローナル抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫＯＨＬＥＲら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、ＣＬＡＣＫＳＯＮら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭＡＲＫＳら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、ＥＬＩＳＡによって決定される、少なくとも約１μＭ、より一般的には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭまたはそれよりよいＫｄで結合する。
「非天然アミノ酸」またはそうでなければ「ｎｎＡＡ」と記載されるものは、２０（２０）個の一般的なアミノ酸またはピロリジンまたはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。ｎｎＡＡという用語と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然にコードされたアミノ酸」、「不自然なアミノ酸」、「非天然で生じるアミノ酸」である。さらに、ｎｎＡＡという用語は、天然には生じず、合成的に得られ得るか、または非天然アミノ酸の修飾によって得られ得るアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
「医薬賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤、防腐剤などの材料を含む。
「薬学的に許容され得る」は、非毒性、不活性および/またはヒトまたは他の哺乳動物と生理学的に適合性である組成を指す。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも約４、５、６、７、または８個のアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸の標準的な３文字（表ＩＩを参照されたい。）または１文字表記が使用される。当技術分野では、この用語は「ペプチド」または「タンパク質」と互換的にしばしば使用される。
本明細書で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」または「一本鎖」抗体という用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説については、ＰＬＵＣＫＴＨＵＮ，ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」および「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、標的抗原エピトープへの抗体の選択的結合を指す。抗体は、所与の一連の条件下で、適切な抗原への結合を無関係な抗原または抗原混合物への結合と比較することによって、結合の特異性について試験することができる。抗体が、無関係な抗原または抗原混合物よりも少なくとも２、５、７、好ましくは１０倍多く適切な抗原に結合する場合、それは特異的であると考えられる。一実施形態では、特異的抗体は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原にのみ結合するが、無関係な抗原には結合しない抗体である。別の実施形態では、特異的抗体は、ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３－４抗原に結合するが、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるアミノ酸相同性を有する非ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原には結合しない抗体である。別の実施形態では、特異的抗体は、ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合するが、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原のアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるパーセント同一性を有する非ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合しない抗体である。別の実施形態では、特異的抗体は、ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合し、マウスＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合するが、ヒト抗原への結合度がより高い抗体である。別の実施形態では、特異的抗体は、ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合し、霊長類Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合するが、ヒト抗原への結合度がより高い抗体である。別の実施形態では、特異的抗体は、ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原および任意の非ヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３抗原に結合するが、ヒト抗原またはそれらの任意の組み合わせとの結合度がより高い。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「治療的」および文法的に関連する用語は、生存期間の延長、罹患率の低下、および/または代替治療法の副産物である副作用の軽減など、疾患の任意の結果の任意の改善を指す。当技術分野で容易に理解されるように、疾患の完全な根絶は、好ましいが、処置行為についての要件ではない。
用語「バリアント」は、具体的に記載されたタンパク質（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３タンパク質）の対応する位置に１またはそれを超える異なるアミノ酸残基を有するタンパク質など、記載されたタイプまたは基準からの変異を示す分子を指す。類似体は、バリアントタンパク質の例である。スプライスアイソフォームおよび一塩基多型（ＳＮＰ）は、バリアントのさらなる例である。
ＩＩ．）抗体
本発明の別の態様は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および本明細書に開示される他のＴＡＡに結合する抗体を提供する。一実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ関連タンパク質に結合する抗体。
当技術分野で知られているように、本発明のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ抗体は、がん（例えば、表Ｉを参照されたい）において、予後アッセイ、イメージング、診断および治療方法論のために特に有用である。一実施形態では、がんの検出に使用するための、例えばイムノアッセイにおける、本明細書に開示のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ結合アッセイである。同様に、そのような抗体は、（例えば、治療剤と組み合わせた場合、ＡＤＣにおいて、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および/または他のＴＡＡがこれらの他のがんでも発現または過剰発現される程度の、がん（例えば、表Ｉに示されるがん）の処置および/または予後において有用である。さらに、細胞内発現抗体（例えば、一本鎖抗体）は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他の標的の発現が関与するがんの処置に治療的に有用である。
抗体、具体的にはモノクローナル抗体の調製のための様々な方法が、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを使用して、単離された形態または免疫コンジュゲートされた形態（抗体：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｓ．，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））で適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調製することができる。さらに、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３の融合タンパク質、およびＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３ ＧＳＴ融合タンパク質など他のＴＡＡの融合タンパク質も使用することができる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３のアミノ酸配列の全部または大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が産生され、次いで、適切な抗体を生成するための免疫原として使用される。別の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ関連タンパク質が合成され、免疫原として使用される。
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術を使用して（精製されたＨｅｒ２、ＥＧＦＲおよび他のＴＡＡ関連タンパク質またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ発現細胞の有無にかかわらず）、コードされた免疫原に対する免疫応答を生じる（総説については、ＤＯＮＮＥＬＬＹら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７－６４８を参照されたい）。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ抗体の生成のための好ましい方法は、本明細書で提供される例によってさらに説明される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。ＢＳＡ、ＫＬＨまたは別の担体タンパク質などの担体とのタンパク質の免疫原性コンジュゲートを調製するための方法も当技術分野で周知である。いくつかの状況では、例えばカルボジイミド試薬を使用する直接コンジュゲーションが使用される。他の例では、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，によって供給されるものなどの連結試薬が有効である。Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ免疫原の投与は、当技術分野で理解されているように、適切な期間にわたって適切なアジュバントを使用して注射によって行われることが多い。免疫スケジュール中に、抗体の力価を取得して、抗体形成の妥当性を決定することができる。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手段によって産生することができる。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般に知られているように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術または抗体産生Ｂ細胞を不死化する修飾を用いて調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ関連タンパク質であるイムノアッセイによってスクリーニングされる。適切な不死化細胞培養物が同定されると、細胞を拡大することができ、抗体はインビトロ培養物または腹水のいずれかから産生される。
本発明の抗体またはフラグメントは、組換え手段によっても産生され得る。Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡタンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体に関連して産生され得る。ヒト化またはヒトＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ抗体も産生することができ、治療状況での使用のために好ましい。対応するヒト抗体配列の代わりに１またはそれを超える非ヒト抗体ＣＤＲを置換することによる、マウスおよび他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、ＪＯＮＥＳら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；ＲＩＥＣＨＭＡＮＮら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；ＶＥＲＨＯＥＹＥＮら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６を参照されたい）。ＣＡＲＴＥＲら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５およびＳＩＭＳら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６も参照されたい。
一実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメント）および/またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座に内因性マウス可変セグメントを有するゲノム配列が、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ）および/またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座の再編成されていない生殖系列可変セグメントを有するヒトゲノム配列（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）で全体的または部分的に置き換えられているＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウスを使用して調製することができる。例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、同第６，５２８，３１３号、同第６，６３８，７６８号、および同第６，５２８，３１４号を参照されたい。
さらに、本発明のヒト抗体は、再編成されていないヒト重鎖免疫グロブリン配列（ミューおよびガンマ）およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内因性ミューおよびカッパ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異（例えば、ＬＯＮＢＥＲＧら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６－８５９参照のこと）と共に含むＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）を用いて生成することができる。
別の実施形態では、本発明の完全ヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスなど、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを使用して産生され得る。本明細書で「ＫＭマウス」と呼ばれるそのようなマウス、そのようなマウスは、ＴＯＭＩＺＵＫＡら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２－７２７およびＴＯＭＩＺＵＫＡらへのＰＣＴ公報国際公開第０２／４３４７８号に記載されている。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、ＬＡＤＮＥＲらへの米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、および米国特許第５，５７１，６９８号、ＤＯＷＥＲらへの米国特許第５，４２７，９０８号、第５，５８０，７１７号、ＭＣＣＡＦＦＥＲＴＹらへの米国特許第５，９６９，１０８号および第６，１７２，１９７号、ならびにＧＲＩＦＦＩＴＨＳらへの米国特許第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号および第６，５９３，０８１号に記載されている。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫の際にヒト抗体応答が生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して調製され得る。そのようなマウスは、例えば、ＷＩＬＳＯＮらへの米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７号に記載されている。
さらに、本発明のヒト抗体は、抗体産生のために不活性化され、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｍｇｅｎ Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｉｎｃ．、旧Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれるヒト重鎖および軽鎖遺伝子座で操作された、トランスジェニックマウスを使用する技術を用いて製造することができる。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスを調製する例示的な記載は、米国特許第６，６５７，１０３号に見出すことができる。また、米国特許第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号および第５，５４５，８０６明細書、ならびにＭＥＮＤＥＺら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６（１９９８）；ＫＥＬＬＥＲＭＡＮ，Ｓ．Ａ．およびＧＲＥＥＮ，Ｌ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３、５９３～５９７（２００２）も参照されたい。
上記の産生方法のいずれも、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡに結合する一定の能力を有する抗体、またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡに対して８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９、９８もしくは９９％の配列同一性を有する相同体もしくはフラグメントもしくはポリペプチド配列をもたらす。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡに対する抗体、その結合フラグメント、およびそれらを含む抗体薬物コンジュゲートの結合親和性（ＫＤ）は、１ｍＭまたはそれ未満、１００ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、２ｎＭまたはそれ未満、または１ｎＭまたはそれ未満であり得る。あるいは、ＫＤは、５～１０ｎＭ、または１～２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１マイクロモル濃度～５００マイクロモル濃度または５００マイクロモル濃度～１ｎＭであり得る。
抗原結合タンパク質の結合親和性は、会合定数（Ｋａ）および解離定数（Ｋｄ）によって決定される（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥによって、例えば、プロテインＡでコーティングされたセンサー表面上に試験抗体を捕捉し、この表面上にＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡを流すことによって測定され得る。あるいは、結合親和性は、例えば、プロテインＡでコーティングされた針上に試験抗体受容体を捕捉し、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡをこの表面上に流す、ＦＯＲＴＥＢＩＯによって、測定することができる。当業者は、結合親和性を測定するための当技術分野で公知の他の適切なアッセイを同定することができる。
本発明の操作された抗体には、ＶＨおよび/またはＶＬ内のフレームワーク残基に対して修飾が行われたものが含まれる（例えば、抗体の特性を改善するため）。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１またはそれを超えるフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰変異させる」ことである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞変異は、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発（例えば、ロイシンからメチオニンへの「復帰変異」）によって生殖系列配列に「復帰変異」され得る。そのような「復帰変異」抗体もまた、本発明に包含されることが意図される。
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、またはさらには１またはそれを超えるＣＤＲ領域内の１またはそれを超える残基を変異させることを含む。このアプローチは、「脱免疫」とも呼ばれ、ＣＡＲＲらによる米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはその代わりに、本発明の抗体は、典型的には抗体の１またはそれを超える機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および/または抗原依存性細胞傷害を変化させるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ ＭＡｂは、化学的に修飾されてもよく（例えば、１つまたはそれを超える化学部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を変化させるように修飾されてもよく、ここでもＭＡｂの１またはそれを超える機能的特性を変化させるように修飾されてもよい。これらの実施形態の各々を以下でさらに詳細に説明する。一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更される、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、ＢＯＤＭＥＲらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の構築を容易にするために、またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ ＭＡｂの安定性を増加または減少させるために変更される。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ ＭＡｂの生物学的半減期を減少させるように変異させる。より具体的には、抗体が、天然のＦｃ－ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較してブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を損なわせるように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン界面領域に、１またはそれを超えるアミノ酸変異が導入される。このアプローチは、ＷＡＲＤらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ ＭＡｂは、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄへの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、変異を導入することができる。あるいは、ＰＲＥＳＴＡらによる米国特許第５，８６９，０４６号および米国特許第６，１２１，０２２号に記載されるように、生物学的半減期を増加させるために、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させて、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有させることができる。
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡ ＭＡｂのエフェクター機能（複数可）を変更することによって変更される。例えば、アミノ酸特異的残基から選択される１またはそれを超えるアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。親和性が変化するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
好ましい実施形態では、Ｔｒｏｐ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
好ましい実施形態では、ＣＤＨ３ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
別の好ましい実施形態では、ＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換を含む。
別の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、Ｈｅｒ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、Ｔｒｏｐ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、ＣＤＨ３ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、本開示のＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ３２８Ｃに単一置換を含む。
別の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
別の実施形態では、Ｈｅｒ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
別の実施形態では、ＥＧＦＲ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
別の実施形態では、Ｔｒｏｐ２ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
別の実施形態では、ＣＤＨ３ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
別の実施形態では、本開示のＴＡＡ Ｍａｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに二重置換を含む。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ抗体の反応性は、適宜、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ関連タンパク質、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ発現細胞またはそれらの抽出物を使用するウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析を含む多くの周知の手段によって確立することができる。Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ抗体またはそれらのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識するか、または第２の分子にコンジュゲートすることができる。適切な検出可能なマーカーには、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．）エフェクター機能を改変するＦｃ変異
抗体のＦｃ領域（すなわち、ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の一部にまたがる抗体の重鎖の末端）は可変性が制限されており、抗体が果たす生理学的役割を果たすことに関与している。抗体のＦｃ領域に起因するエフェクター機能は、抗体のクラスおよびサブクラスによって異なり、細胞上のＦｃ領域を介した特異的Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）への抗体の結合を含み、これが様々な生物学的応答を引き起こす。
これらの受容体は、典型的には、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内の一部のシグナル伝達事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を含む様々な免疫細胞で発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を、結合した抗原の部位に動員し、典型的には細胞内のシグナル伝達事象、および炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃などの重要なその後の免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する潜在的な機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞は、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（ＲＡＶＥＴＣＨら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（２００１）２７５－２９０を参照されたい）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後、標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。さらに、分子のＦｃ領域上の重複部位はまた、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）としても知られる補体によって媒介される細胞非依存性細胞傷害性機能の活性化を制御する。
さらに、補体炎症カスケードは、自然免疫応答の一部であり、個体が感染を防ぐ能力にとって重要である。別の重要なＦｃリガンドは、補体タンパク質Ｃ１ｑである。Ｃ１ｑへのＦｃ結合は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と呼ばれるプロセスを媒介する。Ｃ１ｑは、６つの抗体に結合することができるが、２つのＩｇＧへの結合は補体カスケードを活性化するのに十分である。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓセリンプロテアーゼと複合体を形成して、補体経路のＣ１複合体を形成する。
多くの状況において、免疫グロブリンのＦｃ領域によって媒介されるエフェクター機能の結合および刺激は、非常に有益である。しかしながら、特定の例では、エフェクター機能を減少させるか、または排除することがより有利であり得る。これは、Ｆｃ／ＦｃγＲが媒介するエフェクター機能が健康な免疫細胞を致命的なペイロードの近くに運び、標的細胞と共に正常なリンパ組織の枯渇をもたらす標的細胞に薬物（例えば、毒素および同位体）を送達するように設計された抗体に特に当てはまる（ＨＵＴＣＨＩＮＳら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２（１９９５）１１９８０－１１９８４を参照されたい。これらの場合、補体細胞またはエフェクター細胞をほとんど動員しない抗体の使用は、非常に有益であろう（米国特許第６，１９４，５５１号、米国特許第５，８８５，５７３号およびＰＣＴ公報国際公開第０４／０２９２０７号も参照されたい）。
他の例では、例えば、広く発現される受容体とその同族リガンドとの相互作用をブロックすることが目的である場合、望ましくない毒性を低減するためにすべての抗体エフェクター機能を減少または排除することが有利であろう。さらに、治療用抗体が多数のヒト組織にわたって無差別結合を示した場合、エフェクター機能の標的化を組織の多様なセットに制限して毒性を制限することは賢明であろう。最後に、特にＦｃγＲＩＩ受容体に対する抗体の親和性の低下は、ＦｃγＲＩＩ受容体結合を介して血小板の活性化および凝集を誘導する抗体にとって有利であり、これはそのような抗体の重大な副作用であろう。ＴＡＭら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ６：１２（２０１７）を参照されたい。ＷＥＢＥＲら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３５：１６９（２０１８）も参照されたい。
特異的エフェクター機能を欠くヒト免疫グロブリンの特定のサブクラスが存在するが、全てのエフェクター機能を欠く天然に生じる公知の免疫グロブリンは存在しない。別のアプローチは、エフェクター機能を担うＦｃ領域中の重要な残基を操作または変異させることであろう。ＳＣＨＬＯＴＨＡＵＥＲら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２９，ｎｏ．１０ ｐｐ４５７－４６６（２０１６）およびＷＡＮＧら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，９（１）ｐｐ６３－７３（２０１８）を参照されたい。実際、いくつかの研究団体がそのような試みを試してきた。例えば、ＰＣＴ公報国際公開第２００９／１００３０９号（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、国際公開第２００６／０７６５９４号（Ｘｅｎｃｏｒ）、国際公開第１９９９／５８５７２号（Ｕｎｉｖ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、国際公開第２００６／０４７３５０号（Ｘｅｎｃｏｒ）、国際公開第２００６／０５３３０１号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許第６，７３７，０５６号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、米国特許出願公開第５，６２４，８２１号（Ｓｃｏｔｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、米国特許出願公開第２０１０／０１６６７４０号（Ｒｏｃｈｅ）、および米国特許第８，９６９，５２６号（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ）を参照されたい。
ＩｇＧの、活性化および阻害性Ｆｃγ受容体または補体（Ｃ１ｑ）の第１の成分への結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑの結合に重要であり、ユニークな配列を有する。位置２３３～２３６でのヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２残基ならびに位置３２７、３３０および３３１でのＩｇＧ４残基の置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを大幅に減少させた（ＡＲＭＯＵＲら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）（１９９９）２６１３－２６２４；ＳＨＩＥＬＤＳら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）（２００１）６５９１－６６０４）を参照されたい）。
さらに、ＩＤＵＳＯＧＩＥら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（２０００）２５７１－２５７５は、ＲＩＴＵＸＡＮのＣ１ｑ結合部位をマッピングし、Ｐｒｏ３２９Ａｌａが、Ｃ１ｑに結合して補体を活性化するリツキシマブの能力を低下させることを示した。さらに、Ｐｒｏ３２９のＡｌａでの置換は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への減少した結合につながることが報告されている（ＳＨＩＥＬＤＳら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）（２００１）６５９１－６６０４を参照されたい）。しかしながら、この変異はまた、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩへの野生型様結合およびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への結合のごくわずかな減少を示すと記載されている（欧州特許第１，０６８，２４１号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。
さらに、ＯＧＡＮＥＳＹＡＮら、Ａｃｔａ Ｃｒｉｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６４（２００８）７００－７０４は、三重変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓを、下部ヒンジおよびＣ２Ｈドメインに導入し、ヒトＣ１ｑ受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡに対するヒトＩｇＧ１分子への結合活性の低下を示した。
前記の背景に対して、本明細書の発明は、Ｆｃがサイレンシングおよび/または阻害されるＦｃバリアントを含むポリペプチドの製造方法に関する。「親」、「開始」、「非バリアント」または「野生型」ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むポリペプチドまたは抗体を生成するための当技術分野で利用可能な技術を使用して調製される。本発明の好ましい実施形態では、親ポリペプチドは抗体であり、抗体を生成するための例示的な方法は、本開示においてより詳細に記載されている。さらに好ましい実施形態では、野生型ポリペプチドは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および/または本開示の任意のＴＡＡ（表ＩＶを参照されたい）に結合する抗体である。
本発明の一実施形態は、少なくとも１つのＦｃ受容体に対する親和性の低下または除去をもたらす、少なくとも１つのアミノ酸残基のＦｃ領域への付加、置換または欠失を含む、抗体のＦｃ領域を含むポリペプチドを包含する。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ）、補体タンパク質Ｃ１ｑ、ならびにプロテインＡおよびＧなどの他の分子を含むがこれらに限定されないいくつかの受容体またはリガンドと相互作用する。本開示で述べるように、これらの相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むが、これらに限定されない様々なエフェクター機能および下流のシグナル伝達事象に不可欠である。
したがって、特定の実施形態では、本発明のバリアントは、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、Ｆｃ領域への少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、置換および欠失を含まないポリペプチド（本明細書では「野生型ポリペプチドとも称される）と比較して、エフェクター機能を担うＦｃ受容体に対する親和性が低下または除去されている。特定の実施形態では、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドは、以下の特性：低下もしくは除去されたエフェクター（ＡＤＣＣおよび/またはＣＤＣおよび/またはＡＤＣＰ）機能、低下もしくは除去されたＦｃ受容体への結合、低下もしくは除去されたＣ１ｑへの結合、または低下もしくは除去された毒性、のうちの少なくとも１またはそれより多くを含む。より具体的には、本発明の実施形態は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）ならびに/または補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低下した抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ｔｒｏｐ２、抗ＣＤＨ３および抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原（表ＩＶ））抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、三重変異を含む、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、およびＴＡＡ ＭＡｂを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、位置３２８におけるアミノ酸残基の少なくとも１つの付加、置換または欠失を含むＦｃ領域を含み、定常領域のナンバリングシステムは、ＫＡＢＡＴら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１（１９９１）３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．に示されるようなＥＵインデックスのナンバリングシステムである。
一実施形態では、本発明の抗体は、位置２３４におけるアミノ酸残基の少なくとも１つの付加、置換または欠失を含むＦｃ領域を含み、定常領域のナンバリングシステムは、ＫＡＢＡＴら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１（１９９１）３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．に示されるようなＥＵインデックスのナンバリングシステムである。
一実施形態では、本発明の抗体は、位置２３５におけるアミノ酸残基の少なくとも１つの付加、置換または欠失を含むＦｃ領域を含み、定常領域のナンバリングシステムは、ＫＡＢＡＴら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１（１９９１）３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．に示されるようなＥＵインデックスのナンバリングシステムである。
本発明のある特定の態様では、Ｆｃバリアントを含むポリペプチドは、抗体を含む。本発明のさらに別の態様では、Ｆｃバリアントを含むポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。本発明のなおさらなる態様では、バリアントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。
さらなる具体的な実施形態では、上述のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１領域を含む。
具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃバリアントを含み、上記バリアントは、位置Ｌ３２８Ｃにアミノ酸置換を含み、ＩｇＧ Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔの場合のようなＥＵインデックスのナンバリングである。さらに別の実施形態では、上記バリアントは、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、上記バリアントは、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、上記バリアントは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む。
具体的な実施形態では、本発明の抗Ｈｅｒ２ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む野生型ヒトＦｃ Ｈｅｒ２ ＭａｂのＦｃバリアントを含む。
具体的な実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む野生型ヒトＦｃ ＥＧＦＲ ＭａｂのＦｃバリアントを含む。
具体的な実施形態では、本発明の抗Ｔｒｏｐ２ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む野生型ヒトＦｃ Ｔｒｏｐ２ ＭａｂのＦｃバリアントを含む。
具体的な実施形態では、本発明の抗ＣＤＨ３ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む野生型ヒトＦｃ ＣＤＨ３ ＭａｂのＦｃバリアントを含む。
具体的な実施形態では、本発明のＴＡＡ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに３つの（３）アミノ酸置換を含む野生型ヒトＦｃ ＴＡＡ ＭａｂのＦｃバリアントを含む。
一態様では、Ｆｃバリアントを含むポリペプチドは、未修飾抗体と比較して標的結合に影響を及ぼさない。
一態様では、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドは、未修飾抗体と比較してＦｃγＲＩ結合の阻害を示す。
一態様では、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドは、未修飾抗体と比較してＦｃγＲＩＩ結合の阻害を示す。
一態様では、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドは、未修飾抗体と比較してＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害を示す。
一態様では、本発明のＦｃバリアントを含むポリペプチドは、未修飾抗体と比較してＦｃＲｎ結合に実質的に影響を及ぼさない。
当業者が理解するように、本発明によって発見された驚くべき認識は、三重変異の必要性、具体的にはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａにおけるアミノ酸置換（複数可）の付加が以下の観察（複数可）に起因することを見出した。第１に、Ｌ３２８Ｃはそれ自体でＦｃエフェクター機能の部分的な低下のみを示す。さらなる変異を組み合わせることによって、より大きな程度のＦｃサイレンシングを達成することができる。Ｌ２３４およびＬ２３５は、これらの残基がヒンジエリアの近くに位置し、アラニンに変異した場合にＦｃγＲ結合を部分的に減少させることができるので選択された。Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡとＬ３２８Ｃとの組み合わせは、試験したすべてのアイソフォームについてＦｃγＲ相互作用のほぼ完全な阻害を示した。
観察されたように、ＦｃγＲ結合の完全な抑止にもかかわらず、野生型対応物と比較した場合に同等の結合活性が観察されたので、三重変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａと組み合わせたＬ３２８Ｃ）は標的抗原結合に影響を及ぼさなかった。抗体の安定性および発現もまた、野生型抗体と同等のままであった。したがって、三重変異は、標的特異性、抗体の質および収量を損なうことなくＦｃエフェクター機能の完全な阻害を可能にする。
さらに、後述するように、特異的三重変異は、効率的な部位特異的コンジュゲーションを促進することができる。
ＩＶ．）抗体薬物コンジュゲート
別の態様では、本発明は、治療剤にコンジュゲートさせた抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。治療剤は、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）であり得る。別の態様では、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。一態様では、ＡＤＣは、細胞傷害剤または検出可能な作用物質に、共有結合的に付着またはオキシム結合を介して結合した上記Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ ＭＡｂのいずれかを含む。
さらなる実施形態では、ＡＤＣは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換をさらに含むＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ Ｍａｂを含む。
好ましい実施形態では、ＡＤＣは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃに三重置換をさらに含み、Ｌ３２８Ｃに部位特異的コンジュゲーションをさらに含むＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、および他のＴＡＡ Ｍａｂを含む。
背景には、がんの処置において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち腫瘍細胞を死滅させるまたは阻害する薬物の局所送達のために抗体－薬物コンジュゲートを使用すると（Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５－６１４；ＮＩＣＵＬＥＳＣＵ－ＤＵＶＡＺ ａｎｄ ＳＰＲＩＮＧＥＲ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１－１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）、腫瘍への薬物部分の標的化送達およびその細胞内蓄積が可能になり、これらの非コンジュゲート薬物剤の全身投与は、除去しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対しても許容できないレベルの毒性をもたらし得る（ＢＡＬＤＷＩＮら、（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３－０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）‘‘Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，’’ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．ＰＩＮＣＨＥＲＡら（ｅｄ．）、ｐｐ．４７５－５０６）。それにより、最小の毒性で最大の有効性が求められる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３－８７）。これらの方法で使用される薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンデシン（ＲＯＷＬＡＮＤら、（１９８６）上記）が含まれる。抗体－毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（ＭＡＮＤＬＥＲら、（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３－１５８１；ＭＡＮＤＬＥＲら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５－１０２８；ＭＡＮＤＬＥＲら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６－７９１）、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；ＬＩＵら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８－８６２３），およびカリケアマイシン（ＬＯＤＥら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；ＨＩＮＭＡＮら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、それらの細胞傷害性効果および細胞増殖抑制効果に影響を及ぼし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされた場合、不活性であるかまたはあまり活性でない傾向がある。
抗体薬物コンジュゲートの例は、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（ブレンツキシマブベドチン、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＥＳＰＯＮＳＡ（登録商標）（イノツズマブオゾガマイシン、ファイザー／Ｗｙｅｔｈ）、ＰＯＬＩＶＹ（ポラツズマブベドチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＭＬＮ－２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）である。
さらに、限定されないが、ＡＤＣの生成に有用な化学療法剤を含む治療剤が本明細書に記載される。使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号を参照されたい。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の産生のために利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８に記載されているように調製することができる。炭素－１４で標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号）。本発明の抗体にコンジュゲートさせることができる他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５－フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載されているＬＬ－Ｅ３３２８８複合体として集合的に知られている薬剤のファミリー、ならびにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
使用することができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号（１９９３年１０月２８日公開）を参照されたい。
本発明はさらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間に形成されるＡＤＣを企図する。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高放射性原子を含み得る。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲート抗体の作製のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ８８、Ｓｍ５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。コンジュゲートが検出のために使用される場合、コンジュゲートは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴画像法としても知られている、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えばヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含み得る。
放射性標識または他の標識は、公知の方法でコンジュゲートに組み込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成されてもよく、または水素の代わりに例えばフッ素－１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用した化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム－９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（ＦＲＡＫＥＲら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９－５７を使用してヨウ素－１２３を組み込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（ＣＨＡＴＡＬ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、他の方法を詳細に記載している。
本発明は、とりわけ、治療剤の標的化送達のための抗体－薬物コンジュゲート化合物を提供する。本発明者らは、抗体－薬物コンジュゲート化合物が、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３および他のＴＡＡを発現する細胞に対して強力な細胞傷害活性および/または細胞増殖抑制活性を有することを発見した。
抗体－薬物コンジュゲート化合物は、少なくとも１つの薬物単位に共有結合した抗体単位を含む。薬物単位は、抗体単位に直接またはリンカー単位（－ＬＵ－）を介して共有結合され得る。さらに、薬物単位は、Ｌ３２８Ｃの部位特異的位置でコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する：
Ｌ－（ＬＵ－Ｄ）ｐ（Ｉ）
またはその薬学的に許容され得る塩もしくは溶媒和物；式中、
・Ｌは、抗体単位、例えば本発明のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または別のＴＡＡ ＭＡｂであり、ＭＡｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに三重変異を含み、
・（ＬＵ－Ｄ）は、リンカー単位－薬物単位部分であり、式中、
・ＬＵ－は、リンカー単位であり、
・－Ｄは、標的細胞に対して細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物単位であり、
・ｐは、１～２０または代替的に１～５０の範囲である。
さらに、薬物単位部分は、Ｌ３２８ＣでＭＡｂ上の部位特異的位置でコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、抗体薬物コンジュゲート化合物は、以下の式を有する：
Ｌ－（Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－Ｄ）ｐ（ＩＩ）
またはその薬学的に許容され得る塩もしくは溶媒和物；式中
・Ｌは、抗体単位、例えばＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または別のＴＡＡ ＭＡｂであり、ＭＡｂは、以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃに三重変異を含み、
・－Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－は、リンカー単位（ＬＵ）であり、式中、
・－Ａ－は、ストレッチャー単位であり、
・ａは、０または１または２または３であり、
・各－Ｗ－は、独立してアミノ酸単位であり、
・ｗは、０～１２の範囲の整数であり、
・－Ｙ－は、自己犠牲型スペーサー単位であり、
・ｙは、０、１または２であり、
・－Ｄは、標的細胞に対する細胞増殖抑制活性または細胞傷害活性を有する薬物単位であり、
・ｐは、１～２０の整数、または代替的に１～５０の整数である。
さらに、薬物単位部分は、Ｌ３２８ＣでＭＡｂ上の部位特異的位置でコンジュゲートされる。
複数の抗体を含む組成物の場合、薬物負荷は、抗体あたりの薬物分子の平均数であるｐによって表される。薬物負荷は、抗体あたり１～２０の薬物（Ｄ）の範囲であり得る。コンジュゲーション反応物の調製における抗体あたりの薬物の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。ｐに関する抗体－薬物－コンジュゲートの定量的分布もまた決定され得る。いくつかの例では、ｐが他の薬物負荷を有する抗体－薬物－コンジュゲートからの特定の値である均一な抗体－薬物－コンジュゲートの分離、精製および特徴付けは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成され得る。例示的な実施形態では、ｐは２～８である。
抗体－薬物コンジュゲート化合物の生成は、当業者に公知の任意の技術によって達成することができる。簡潔には、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、抗体単位として以下の位置：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｃに三重変異を含む、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または別のＴＡＡ ＭＡｂと、薬物と、必要に応じて薬物と結合剤とを結合するリンカーと、を含む。好ましい実施形態では、薬物単位は、Ｌ３２８Ｃの部位特異的位置でコンジュゲートされる。
薬物および/またはリンカーを結合剤に共有結合させるために、いくつかの異なる反応が利用可能である。これは、結合剤、例えば、リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部分を含む抗体分子のアミノ酸残基の反応によってしばしば達成される。共有結合の最も一般的に使用される非特異的な方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に連結するカルボジイミド反応である。さらに、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に連結するために、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性剤が使用されている。結合剤への薬物の結合にも利用可能なのは、シッフ塩基反応である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸酸化を含み、したがってアルデヒドを形成し、次いで、これを結合剤と反応させる。結合は、結合剤のアミノ基とのシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートは、薬物を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤としても使用することができる。他の技術は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
特定の実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を適切な条件下で薬物と反応させる。特定の実施形態では、反応基は、薬物および/または中間体において使用される。薬物と中間体または誘導体化薬物との間の反応の生成物は、その後、適切な条件下でＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＭＡｂと反応する。
Ｖ．）ＡＤＣのための部位特異的コンジュゲーションフォーマット
当業者には理解されるように、ＡＤＣの文脈においてペイロード配置およびコンジュゲート組成を最適化できることは、有益な取り組みである。ＡＢＨＩＪＩＩＴら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．，Ｍａｂ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（Ｏｃｔ ２０１４）を参照されたい。
一般的に言えば、バイオコンジュゲーション戦略は、タンパク質またはペプチド（生物製剤）を、小分子、炭水化物、オリゴヌクレオチド、合成ポリマー、または別のタンパク質/ペプチドと共有結合的に連結させることを含む。このアプローチは、非常に競争の激しい生物製剤市場において差別化を生み出し、製品開発を推進するために極めて重要であり得る。これらの戦略は、Ｐｒｅｖｎａｒ １３、Ｍｅｎａｃｔｒａ、Ｍｅｎｏｍｕｎｅ、およびＨｉｂＴＩＴＥＲなどの非常に成功したコンジュゲートワクチンの開発の基礎であった。それらの４つ（４）は、細菌多糖類を免疫原性担体タンパク質にコンジュゲートすることによって作り出された。同様に、半減期延長ポリマー担体（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）へのバイオコンジュゲーションを適用して、現在市販されている薬物（例えば、セルトジルマブ（Ｃｉｍｚｉａ）、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ）およびペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ））であって、それらの非コンジュゲート化対応物および患者のコンプライアンスを促進する投与レジメンよりも長い作用持続時間を有する薬物を作り出す。
当技術分野で知られているように、第１世代ＡＤＣを作製するためのリンカーおよびコンジュゲーション化学の選択は、タンパク質を用いる作業の制限によって決定された。したがって、リンカーは、システイン（チオール）またはリジン（アミン）などの天然アミノ酸に属する表面にアクセス可能な求核性アミノ酸側鎖と特異的に反応するように設計された反応基で官能化された。
しかしながら、抗体をジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で処理すると、それらのジスルフィド結合を切断して遊離チオールを露出させることができ、遊離チオールはその後、マレイミド含有リンカーと容易にコンジュゲートさせることができる。最大４つの鎖間ジスルフィド結合を還元して、それにより、コンジュゲーションのために最大８つの反応性チオール基を露出させることができる。チオール化学的コンジュゲーションのために開発された条件は、ジスルフィド結合の完全な還元または部分的な還元のいずれかをもたらし、この方法を使用して作製されたコンジュゲートは、抗体分子あたり０、２、４、６、または８つの薬物のいずれかを含有することができる。
抗体分子あたりの薬物の数を超えて、別のレベルの不均一性がコンジュゲーション部位に起こることに留意することが重要である。したがって、システインコンジュゲーションによって生成される特異的な薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣは、依然として、コンジュゲーションの異なる部位を有するコンジュゲートの不均一な混合物である。しかしながら、システインコンジュゲーションに利用可能な部位は８つのみであるため（リジンを対象とした化学反応（lysine-directed chemistry）に利用可能な最大８０と比較して）、システインコンジュゲーション手法は、コンジュゲーション部位に対するより大きな制御を提供し、より良好な特徴付けを促進すると言っても過言ではない。制御された還元－アルキル化戦略は、臨床試験を現在受けているいくつかの他のＡＤＣと共に、承認されたＡＤＣＥＴＲＩＳ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）製品を製造するために首尾よく使用されている。
研究者らは、抗体分子あたり２、４、および８つのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）毒素で、ＣＤ３０＋腫瘍細胞を標的とするＡＤＣのインビボ効果を研究し、薬物負荷の化学量論が薬物の薬物動態（ＰＫ）、有効性、および毒性に有意に影響を及ぼすことを実証した。ＨＡＭＢＬＥＴＴらは、それらの系において、抗体あたり４つの薬物を有するＡＤＣが、２つの薬物を有するＡＤＣよりも強力であったが、８つの薬物/抗体を有するＡＤＣと同等の有効性およびそれよりも良好な耐容性を有したことを見出した。結果は、一般に、より高い薬物負荷を有するＡＤＣは、より大きなクリアランス、より高い有効性、および増加した毒性を有することを示した。これは、各ＡＤＣが、有効性および毒性の正しいバランスを有する最適な薬物負荷を有することを暗示した。
その独創性に富んだ研究により、ＤＡＲが、ＡＤＣの重要な設計パラメータであるという概念が確立された。天然のシステインまたはリジン残基への化学的コンジュゲーションは、それらが不均一なＡＤＣ混合物を産生するので最適ではないことが明らかになった。不均一性は、ＤＡＲおよびコンジュゲーション部位の違いに由来し、効力が低く、毒性が高く、異なる配置およびＰＫ特性を有し得るＡＤＣ亜集団をもたらす。さらに、そのような非選択的コンジュゲーション方法では、製造中のバッチ間変動の分析的特徴付けおよび制御は、大きな課題のままである。これらの制限を克服するために、部位特異的コンジュゲーションの概念は進化しており、それは、最初に均一なＡＤＣを産生し、ＤＡＲおよびコンジュゲーション部位を制御することを目的としている。
様々な技術（例えば、ＴｈｉｏＭａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＡｍｂｒｘ，Ｉｎｃ．を参照されたい）を使用してペイロード配置を最適化するいくつかの部位特異的コンジュゲーション技術が実証された。
報告されたＴｈｉｏＭａｂに関する研究は、別の基本的な概念を明らかにした。ＡＤＣの均一性は、生物物理学的特性および治療特性の改善の鍵であるだけでなく、抗体骨格上のコンジュゲーションの実際の部位もまた、ＡＤＣ分子のインビボ挙動に大きな影響を有する。ＳＨＥＮらは、ＭＭＡＥペイロードを使用してＨＥＲ２標的化抗体との複数の均一なＴＤＣコンジュゲートを作製し、ここで、コンジュゲーションのための操作されたシステインは、抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）またはＦｃ領域のいずれかに位置した。全てのコンジュゲートは、同等のインビトロ効力を示したが、著者らは、それらのインビボ有効性およびＰＫ特性における有意差を報告している。
ＬＣコンジュゲートは、ＨＣコンジュゲートが中程度であり、Ｆｃコンジュゲートがほとんどまたは全く活性を有さないマウス異種移植モデルで研究した場合に、最大の有効性を示した。マウスＰＫ研究は、ＬＣコンジュゲートが最大の安定性および最低のクリアランスを示し、次いでＨＣコンジュゲートが続くという同様の傾向がみられ、ＦｃコンジュゲートＡＤＣは最も早く除去され、最も低いＡＤＣ曝露を提供した。これらの結果は、局所的な微小環境および溶媒への接近可能性の違いが、異なる部位におけるリンカー系の異なる安定性に寄与することに起因していた。
第一世代のリジンおよびシステインコンジュゲーションと比較して均一なＡＤＣを送達することを目的としたいくつかの追加の部位特異的生体コンジュゲーション方法が報告されているが、これらの技術のサブセットのみが、所与の抗体－ペイロードの組み合わせのための最適なコンジュゲーション部位を見出すことにおいて、より大きな汎用性を提供する。それらには、遺伝子コード修飾によって導入された非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）によるコンジュゲーションが含まれる（Ａｍｂｒｘ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；Ｓｕｔｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡに買収されたＡｌｌｏｚｙｎｅ）。また、操作されたグルタミンタグへのトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）媒介コンジュゲーション（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。また、共発現ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって生成されたアルデヒドタグ付き抗体とのコンジュゲーション（Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡに買収されたＲｅｄｗｏｏｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
上記に基づいて、柔軟な部位特異的コンジュゲーションの選択肢を提供する技術を用いた研究は、コンジュゲーションの部位がＡＤＣの薬理学的特性に有意に影響を及ぼすことをしっかりと確立している。したがって、それは製品設計における重要なパラメータと見なされるべきであり、特定のペイロード－抗体の組み合わせに最適な部位を見つける能力は、製品または製品（複数）の開発の成功にとって重要であり得る。ＳＣＨＵＭＡＣＨＥＲら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３６（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１００－Ｓ１０７（２０１６）；ＤＥＯＮＡＲＡＩＮら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１０（５）（２０１５）；ＺＨＯＵ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，５：６４（２０１７）；ＰＡＮＯＷＳＫＩら、ｍＡｂｓ ６：１ ｐｐ ３４－４５（Ｊａｎ／Ｆｅｂ ２０１４）；ＰＣＴ特許公報国際公開第２０１８／２００８１号および米国特許公報第２０１７／００８０１０３号を参照されたい。
一実施形態では、モノクローナル抗体のＦｃドメイン中のＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示されている。
さらなる実施形態では、Ｈｅｒ２抗体のＦｃドメイン中のＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示されている。
さらなる実施形態では、ＥＧＦＲ抗体のＦｃドメイン中のＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示されている。
さらなる実施形態では、Ｔｒｏｐ２抗体のＦｃドメインにおけるＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も。Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示され得る。
さらなる実施形態では、ＣＤＨ３抗体のＦｃドメイン中のＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示されている。
さらなる実施形態では、ＴＡＡ抗体（表ＩＶに記載のＴＡＡなど）のＦｃドメイン中のＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換による部位特異的コンジュゲーション手法は、標的結合に影響を及ぼすことなく制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれないことが示されている。
Ｌ３２８Ｃによって媒介される部位特異的コンジュゲーション手法は、より均一な薬物生成物および改善されたコンジュゲーション効率を可能にするように選択された。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む様々な治療様式は、インビボ有効性および治療指数に負の影響を有し得る不均一な混合物の形成を防止することができので、部位特異的コンジュゲーションから利益を得ることができる。同様に、抗体分子の特異的に定義された部位へのホウ素含有実体の結合は、がんを処置するための非侵襲的治療様式であるホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）の有効性を改善することができる。
モノクローナル抗体のＦｃドメインにおけるＬｅｕ－３２８のＣｙｓへの変換は、標的結合に影響を与えることなく、制御されたコンジュゲーションを可能にする。さらに、抗体の発現レベルも安定性も、Ｌ３２８Ｃの導入によって損なわれない。サイズ排除クロマトグラフィーによる品質評価は、野生型対応物に匹敵する９９％を超える主ピークを示す。したがって、対合していないシステインの導入に関連することが多い凝集傾向は、Ｌ３２８Ｃについては観察されない。Ｌ３２８Ｃによって媒介される１００％のコンジュゲーション効率を有する均一な生成物形成は、非特異的にコンジュゲートされた対応物に必要とされる複雑で非効率的な産生プロセスと比較して、より単純な製造プロセスを暗示する。Ｌ３２８Ｃコンジュゲーションによって媒介される定義された均一な組成物は、治療上の負担がはるかに少なく、製造プロセスがより簡単であり、ＢＮＣＴの適用のためのＡＤＣおよび抗体ホウ素コンジュゲートの迅速な発見および開発を可能にする。
さらに、Ｌ３２８Ｃはまた、Ｆｃエフェクター機能を低下させるというさらなる利点を示す。治療用モノクローナル抗体およびＦｃγＲとのそれらの相互作用によって引き起こされる注入反応に関連する安全性の責任（safety liability）が報告されている。抗体安定性を損なうことなくＦｃエフェクター機能を部分的にサイレンシングする能力は、Ｌ３２８Ｃの魅力的な特徴である。改善された臨床安全性プロファイルのための潜在的な緩和戦略は、Ｌ３２８Ｃ媒介コンジュゲーションのために、またはネイキッド抗体として、Ｆｃエフェクター機能を減少させることが以前に示された他の変数（variance）との可能な組み合わせでさらに開発することができる。
ＶＩ．）リンカー単位
典型的には、抗体－薬物コンジュゲート化合物は、薬物単位と抗体単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカーの切断が細胞内環境で抗体から薬物単位を放出するように、細胞内条件下で切断可能である。さらに他の実施形態では、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は、例えば抗体分解によって放出される。
好ましい実施形態では、リンカーは、部位特異的位置Ｌ３２８Ｃでコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。リンカーはまた、細胞外環境に（例えば、細胞膜または組織空間の近傍に）存在する切断因子によって切断され得る。リンカーは、例えば、細胞外ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（カテプシンファミリー酵素またはマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれるが、これらに限定されない）によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。
他の実施形態では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性であり、すなわち特定のｐＨ値で加水分解に感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、同第５，８２４，８０５号、同第５，６２２，９２９号、ＤＵＢＯＷＣＨＩＫ ＡＮＤ ＷＡＬＫＥＲ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３；ＮＥＶＩＬＬＥら、１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３－１４６６１を参照されたい。）
さらに他の実施形態では、リンカーは、当技術分野で公知の還元条件下で切断可能である。（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４－５９３１；ＷＡＷＲＺＹＮＣＺＡＫら、Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．ＶＯＧＥＬ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７、米国特許第４，８８０，９３５号を参照されたい。）リンカーはまた、細胞内（または細胞外）に見出される還元条件下で切断され得る。例えば、好ましい実施形態では、特異的リンカーＮ－Ｏ結合は、正式に還元および切断されて、リンカーの切断をもたらし得る。
さらに他の実施形態では、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体分解によって放出される。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公報国際出願第２０１２／１６６５６０号（Ａｍｂｒｘ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。）
他の相互に排他的でない実施形態では、リンカーは、当技術分野で知られているように細胞内在化を促進する。
本発明の組成物および方法と共に使用することができる様々な例示的なリンカーは、国際公開第２００４／０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されている（それぞれが、その全体においてあらゆる目的のために本明細書に参照として組み込まれる）。
ＶＩＩ．）ストレッチャー単位
ストレッチャー単位（Ａ）は、存在する場合、抗体単位をアミノ酸単位（－Ｗ－）に、存在する場合、スペーサー単位（－Ｙ－）に、存在する場合、または薬物単位（－Ｄ）に連結することができる。天然にまたは化学的操作を介してＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＭＡｂ上に存在することができる有用な官能基には、ケト、アルデヒド、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれるが、これらに限定されない。適切な官能基は、ケト、アルデヒド、スルフヒドリル、およびアミノである。一例において、ケト基は、本発明のＭａｂに組み込まれる非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）上にある。さらなる例では、アルデヒド基は、本発明のＭａｂに組み込まれたｎｎＡＡ上にある。別の例では、スルフヒドリル基は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂの分子内ジスルフィド結合の還元によって生成され得る。別の実施形態では、スルフヒドリル基は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂのリジン部分のアミノ基と、２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬との反応によって生成することができる。特定の実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂは組換え抗体であり、１またはそれを超えるリジンを担持するように操作される。特定の他の実施形態では、組換えＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂは、追加のスルフヒドリル基、例えば追加のシステインを有するように操作される。
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡにＦｃ修飾を含み、Ｌ３２８Ｃに別の修飾をさらに含み、Ｌ３２８Ｃに部位特異的コンジュゲーションをさらに含む。
好ましい実施形態では、ストレッチャー単位は、Ｌ３２８Ｃに位置する。
ＶＩＩＩ．）アミノ酸単位
アミノ酸単位（－Ｗ－）は、存在する場合、スペーサー単位が存在する場合ストレッチャー単位をスペーサー単位に連結し、スペーサー単位が存在しない場合ストレッチャー単位を薬物部分に連結し、ストレッチャー単位およびスペーサー単位が存在しない場合抗体単位を薬物単位に連結する。
特定の実施形態では、アミノ酸単位は、天然アミノ酸を含むことができる。他の実施形態では、アミノ酸単位は、非天然アミノ酸を含むことができる。
いくつかの実施形態では、アミノ酸単位は、がんまたは腫瘍関連プロテアーゼを含む１またはそれを超える酵素によって酵素的に切断されて薬物単位（－Ｄ）を遊離させることができ、一実施形態では、放出の際にインビボでプロトン化されて薬物（Ｄ）を提供する。
好ましい実施形態では、アミノ酸単位はＬ３２８Ｃに位置する。
ＩＸ．）スペーサー単位
スペーサー単位（－Ｙ－）は、存在する場合、アミノ酸単位が存在する場合、アミノ酸単位を薬物単位に連結する。あるいは、スペーサー単位は、アミノ酸単位が存在しない場合、ストレッチャー単位を薬物単位に連結する。スペーサー単位はまた、アミノ酸単位およびストレッチャー単位の両方が存在しない場合、薬物単位を抗体単位に連結する。スペーサー単位は、２つの一般的なタイプ：非自己犠牲型または自己犠牲型である。本発明の可能なスペーサーの例は、当技術分野で公知である。ＴＯＫＩら、２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６－１８７２およびＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８－７８４）を参照されたい。
自己犠牲型スペーサーの他の例には、２－アミノイミダゾール－５－メタノール誘導体（ＨＡＹら、１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびオルトまたはパラ－アミノベンジルアセタールなどのＰＡＢ基に電子的に類似している芳香族化合物が含まれるが、これらに限定されない。置換および非置換４－アミノ酪酸アミド（ＲＯＤＲＩＧＵＥＳら、１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（ＳＴＯＲＭら、１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）および２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（ＡＭＳＢＥＲＲＹら、１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）など、アミド結合加水分解の際に環化を受けるスペーサーを使用することができる。グリシンのａ位置で置換されたアミン含有薬物（ＫＩＮＧＳＢＵＲＹら、１９８４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）の排除もまた、自己犠牲型スペーサーの例である。
好ましい実施形態では、アミノ酸単位はＬ３２８Ｃに位置する。
Ｘ．）薬物単位
薬物単位（Ｄ）は、任意の治療剤であり得る。例えば、薬物単位は、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤または免疫調節（例えば、免疫抑制）剤または化学療法剤である部分であり得る。Ｄは、スペーサー単位（存在する場合）と、アミノ酸単位（存在する場合）と、ストレッチャー単位（存在する場合）と、または抗体単位と結合を形成することができる原子を有する薬物単位（部分）である。いくつかの実施形態において、薬物単位Ｄは、（使用される場合）スペーサー単位と結合を形成することができる窒素原子を有する。本明細書で使用される場合、「薬物単位」および「薬物部分」という用語は同義であり、互換的に使用される。
ＸＩ．）ＡＤＣの細胞傷害性効果を決定する方法
薬物または抗体－薬物コンジュゲートが細胞に対して細胞増殖抑制作用および/または細胞傷害作用を及ぼすかどうかを決定する方法は公知である。一般に、抗体薬物コンジュゲートの標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞を細胞培養培地中で曝露すること、細胞を約６時間～約５日間培養すること、および細胞生存率を測定することによって、ＡＤＣの細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性を測定することができる。細胞に基づくインビトロアッセイを使用して、生存率（増殖）、細胞傷害および抗体薬物コンジュゲートのアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定することができる。
ＡＤＣが細胞増殖抑制効果を発揮するかどうかを判定するために、チミジン取り込みアッセイを使用することができる。例えば、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５，０００個の細胞の密度で、標的抗原を発現するがん細胞を７２時間培養し、７２時間のうちの最後の８時間に０．５μＣｉの３Ｈ－チミジンに曝露することができる。培養物の細胞への３Ｈ－チミジンの取り込みを、ＡＤＣの存在下および非存在下で測定する。
細胞傷害を決定するために、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定することができる。壊死は、典型的には、原形質膜の透過性の増加、細胞の膨潤、および原形質膜の破裂を伴う。アポトーシスは、典型的には、膜ブレブ形成、細胞質の凝縮、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化を特徴とする。がん細胞に対するこれらの効果のいずれかの決定は、ＡＤＣががんの処置に有用であることを示す。
細胞生存率は、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルー（例えば、ＰＡＧＥら、１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ３：４７３－４７６）などの色素の取り込みを細胞において決定することによって測定することができる。そのようなアッセイでは、細胞は色素を含有する培地中でインキュベートされ、細胞は洗浄され、色素の細胞取り込みを反映する残りの色素を分光光度的に測定する。タンパク質結合色素スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を使用して、細胞傷害性を測定することもできる（ＳＫＥＨＡＮら、１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７－１２）。
あるいは、生きている細胞を検出するが死んだ細胞を検出しないことによる哺乳動物細胞の生存および増殖についての定量的比色アッセイにおいて、ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩が使用される（例えば、ＭＯＳＭＡＮＮ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５～６３）。
アポトーシスは、例えばＤＮＡフラグメンテーションを測定することによって定量することができる。
ＤＮＡフラグメンテーションの定量的インビトロ決定のための市販の測光法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（フラグメント化されたＤＮＡ中の標識ヌクレオチドの取り込みを検出する）およびＥＬＩＳＡベースのアッセイを含むそのようなアッセイの例は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，ｎｏ．２，ｐｐ．３４－３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
アポトーシスは、細胞の形態学的変化を測定することによっても決定することができる。例えば、壊死と同様に、原形質膜の完全性の喪失は、特定の色素（例えば、蛍光色素、例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウム）の取り込みを測定することによって決定することができる。アポトーシス細胞数を測定する方法は、Ｄｕｋｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＯＬＩＧＡＮら、ｅｄｓ．，１９９２，ｐｐ．３．１７．１－３．１７．１６）に記載されている。細胞はまた、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウム）で標識することができ、細胞は、核内膜に沿ったクロマチン凝縮および辺縁化について観察される。アポトーシスを決定するために測定することができる他の形態学的変化には、例えば、細胞質凝縮、膜ブレブ形成の増加、および細胞収縮が含まれる。
アポトーシス細胞の存在は、培養物の付着区画と「浮遊」区画の両方で測定することができる。例えば、両方の区画は、上清を除去し、付着した細胞をトリプシン処理し、遠心分離洗浄工程（例えば、２０００ｒｐｍで１０分間）後に調製物を合わせ、アポトーシスを検出する（例えば、ＤＮＡフラグメンテーションを測定することによって）ことによって、収集することができる。（例えば、ＰＩＡＺＺＡら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：３１１０－１６を参照のこと。）
インビボでは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂ治療組成物の効果を適切な動物モデルで評価することができる。例えば、がん外植片または継代した異種移植片組織を免疫が損なわれた動物、例えばヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスに導入する異種（xenogeneic）がんモデルを使用することができる（ＫＬＥＩＮら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２－４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開第９８／１６６２８号および米国特許第６，１０７，５４０号は、原発腫瘍の発生、微小転移、および後期疾患に特徴的な骨芽細胞転移の形成を反復することができるヒト前立腺がんの様々な異種移植モデルを記載している。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮または転移などを測定するアッセイを用いて予測することができる。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイは、治療用組成物の評価に有用である。一実施形態では、治療用組成物により処置される腫瘍を有するマウスからの異種移植片が、アポトーシス病巣の存在について調べられてよく、未処置の対照異種移植片を有するマウスと比較され得る。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、組成物の治療有効性の指標を提供する。
前記の方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物へと製剤化することができる。適切な担体には、治療用組成物と組み合わせたときに治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、一般に患者の免疫系と非反応性である任意の材料が含まれる。例としては、限定されないが、滅菌リン酸緩衝食塩溶液、静菌水などのような多数の標準的な医薬担体のいずれかが挙げられる（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．、Ｅｄ．，１９８０を参照されたい）。
治療用製剤を可溶化し、治療用組成物を腫瘍部位に送達することができる任意の経路を介して投与することができる。潜在的に有効な投与経路には、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、同所性などが含まれるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい製剤は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中に治療組成物を含み、および/または０．９％滅菌注射用塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有するポリ塩化ビニルまたはポリエチレンバッグ中で希釈される。治療タンパク質調製物を凍結乾燥し、滅菌粉末として、好ましくは真空下で保存し、次いで注射前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含有する）または滅菌水で再構成することができる。
前記の方法を使用してがんを処置するための投与量および投与プロトコルは、方法および標的がんによって異なり、一般に、当技術分野で理解されている多くの他の因子に依存する。
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂの修飾による、本発明のＡＤＣの２種以上を含み得る。例えば、本発明は、本発明のＡＤＣを含む医薬組成物を含み、ここで、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＭＡｂは、Ｃ末端リジンが部分的に除去されたかもしくは完全に除去された抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を有する抗体、重鎖Ｃ末端リジンを欠き、Ｎ末端翻訳後修飾を有する抗体、および/または重鎖Ｃ末端リジンを有し、Ｎ末端翻訳後修飾を有さない抗体である。
好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭＡｂは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｃにおける三重変異であり、ここで、Ｌ３２８Ｃは、部位特異的コンジュゲーションのための位置である。
ＸＩＩ．）Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３およびＴＡＡを発現するがん（複数可）の処置
通常は限られた組の組織または細胞で発現されるが、表Ｉに列挙されるようながんなどのがんでも発現されるタンパク質（複数可）としての、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡの同定は、そのようながんの処置に対する多数の治療アプローチを開く。
注目すべきことに、標的化された抗腫瘍治療は、標的化されたタンパク質が正常な組織または細胞、さらには生命維持に必要な正常な臓器組織で発現される場合でさえ、有用であった。生命維持に必要な器官は、心臓または結腸など、生命を維持するために必要な器官である。生命維持に必要でない器官は、除去することができ、その結果、個体は依然として生存することができる器官である。生命維持に必要でない器官の例は、卵巣、乳房、および前立腺である。
正常組織（さらに、生命維持に必要な正常組織）における標的タンパク質の発現は、該タンパク質がまた過剰発現される特定の腫瘍に対する治療薬としての、該タンパク質に対する標的化剤の有用性を失わない。例えば、生命維持に必要な器官における発現は、それ自体有害ではない。さらに、前立腺および卵巣など、必須ではないと見なされる器官は、死亡率に影響を及ぼすことなく除去することができる。最後に、いくつかの生命維持に必要な器官は、免疫特権のために正常な器官発現の影響を受けない。免疫特権臓器は、血液臓器関門によって血液から保護され、したがって免疫療法にアクセスできない臓器である。免疫特権臓器の例は、脳および精巣である。
したがって、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡタンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡを発現するがん（例えば、表Ｉに示されるがんなど）に罹患している患者にとって有用である。これらの治療アプローチは、一般に３つのクラスに分類される。第１のクラスは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ機能が腫瘍細胞成長に関する場合、それをモジュレートし、腫瘍細胞成長の阻害もしくは遅延をもたらす、またはその殺滅を誘導する。第２のクラスは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡタンパク質とその結合パートナーとの、または他のタンパク質との結合または会合を阻害するための様々な方法を含む。第３のクラスは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３もしくは他のＴＡＡ遺伝子の転写またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３もしくは他のＴＡＡ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための様々な方法を含む。
したがって、がん患者は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ発現の存在およびレベルについて、好ましくは腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡイメージング、またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ発現の存在および程度を確実に示す他の技術を使用して、評価することができる。適用可能であれば、腫瘍生検または外科標本の免疫組織化学的分析がこの目的のために好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当技術分野で周知である。
ＸＩＩＩ．）併用療法
一実施形態では、ヒト腫瘍を含む腫瘍が、化学療法剤もしくは放射線またはそれらの組み合わせと併せてＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣで処置される場合、相乗効果がある。換言すれば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＡＤＣによる腫瘍成長の阻害は、化学療法剤または放射線またはそれらの組み合わせと組み合わせた場合、予想されるよりも増強される。相乗効果は、例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣのみの処置、またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣおよび化学療法剤または放射線による処置の相加効果から予想されるよりも、併用処置による腫瘍成長のより大きな阻害によって示され得る。好ましくは、相乗効果は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣからの処置、またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣと化学療法剤もしくは放射線との相加的組み合わせを用いた処置のいずれかからの寛解が予想されないがんの寛解によって実証される。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣ、および化学療法もしくは放射線の組み合わせ、またはそれらの両方を使用して腫瘍細胞の成長を阻害する方法は、化学療法もしくは放射線療法の開始前、開始中、または開始後、ならびにそれらの任意の組み合わせ（すなわち、化学療法および/もしくは放射線療法の開始前ならびに開始中、開始前ならびに開始後、開始中ならびに開始後、または開始前、開始中ならびに開始後）に、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣを投与することを含む。例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣは、典型的には、放射線療法および/または化学療法を開始する前の１～６０日間、好ましくは３～４０日間、より好ましくは５～１２日間投与される。しかしながら、処置プロトコルおよび具体的な患者のニーズに応じて、本方法は、最も効果的な処置を提供し、最終的に患者の寿命を延ばすように実施される。
化学療法剤の投与は、非経口および経腸経路による全身を含む様々な方法で達成することができる。一実施形態では、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣおよび化学療法剤は、別個の分子として投与される。化学療法剤または化学療法の特定の例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ゲムシタビン、クロラムブシル、タキソールおよびそれらの組合せが挙げられる。
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣと組み合わせて使用される放射線源は、処置されている患者の外部または内部のいずれかであり得る。放射線源が患者に対して外部にある場合、治療は外部照射放射線治療（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者に対して内部にある場合、処置は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。一実施形態では、放射線療法はホウ素中性子捕捉療法である。一実施形態では、放射線はプロトンホウ素融合療法である。
上記の治療レジメンは、追加のがん処置剤および/またはレジメン、例えば追加の化学療法、がんワクチン、シグナル伝達阻害剤、異常な細胞成長またはがんの処置に有用な薬剤、抗体（例えば、国際公開第２００５／０９２３８０号（Ｐｆｉｚｅｒ）に記載される抗ＣＴＬＡ－４抗体）またはＩＧＦ－１Ｒに結合することによって腫瘍成長を阻害する他のリガンド、およびサイトカインとさらに組み合わせることができる。
哺乳動物がさらなる化学療法に供される場合、上記の化学療法剤が使用され得る。さらに、成長因子阻害剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン治療、選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）、血管新生阻害剤、および抗アンドロゲン剤を使用することができる。例えば、抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤、例えば、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェン）または抗アンドロゲン剤、例えば、Ｃａｓｏｄｅｘ（４’－シアノ－３－（４－フルオロフェニルスルホニル）－２－ヒドロキシ－２－メチル－３－’－（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド）を使用することができる。
上記の治療アプローチは、多種多様な外科的、化学療法または放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わせることができる。本発明の治療アプローチは、低投与量の化学療法（または他の療法）および/または低頻度の投与の使用を可能にすることができ、全ての患者、特に化学療法剤の毒性に十分に忍容しない患者にとって好都合である。
ＸＩＶ．）キット/製造品
本明細書に記載の実験室、予後、予防、診断および治療用途での使用のために、キットは本発明の範囲内である。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１またはそれを超える容器を受け入れるように区画化された搬送容器、パッケージ、または容器を含むことができ、容器（複数可）のそれぞれは、本明細書に記載の使用などの使用のための指示を含むラベルまたはインサートと共に、本方法で使用される別個の要素のうちの１つを含む。例えば、容器（複数可）は、本開示のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３もしくは他のＴＡＡ ＭａｂまたはいくつかのＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３もしくは他のＴＡＡ ＭＡｂを含むことができる。キットは、薬物単位を含む容器を含むことができる。キットは、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣの全部または一部、ならびに/またはがんおよび/もしくは他の免疫学的障害を検出するための診断アッセイを含むことができる。
本発明のキットは、典型的には、上記の容器、ならびにバッファー、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ；内容物ならびに/または使用のための指示を列挙する搬送容器、パッケージ、容器、バイアルおよび/もしくはチューブラベル、ならびに使用のための指示を含む添付文書を含み、商業的および使用者の観点から望ましい材料を含む、それに関連する１またはそれを超える他の容器を含む。
ラベルは、組成物が特定の治療または非治療的用途、例えば予後、予防、診断または実験室用途のために使用されることを示すために容器上または容器と共に存在することができ、また、本明細書に記載のものなどのインビボまたはインビトロのいずれかでの使用のための指示を示すこともできる。指示およびまたは他の情報は、キット上にまたはキットと共に含まれるインサート（複数可）またはラベル（複数可）に含めることもできる。ラベルは、容器上にあってもよく、または容器に関連付けられていてもよい。ラベルは、ラベルを形成する文字、数字または他の文字が容器自体に成形されるかまたはエッチングされる場合、容器上にあってよく、ラベルは、容器を保持する入れ物または搬送容器内に存在する場合、例えば、添付文書として容器に関連付けられ得る。ラベルは、組成物が、がんまたは他の免疫学的障害などの状態を診断、処置、予防または予後診断するために使用されることを示すことができる。
「キット」および「製造品」という用語は、同義語として使用することができる。
本発明の別の実施形態では、本開示のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣなどの組成物を含有する製造品（複数可）。製造品は、典型的には、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、１つまたはいくつかのＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣ、および/またはＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、もしくは他のＴＡＡ ＡＤＣの１またはそれを超える治療用量を保持することができる。
容器は、状態の処置、診断、予後診断または予防に有効な組成物を代替的に保持することができ、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、本開示のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＭａｂもしくはＡＤＣであり得る。
製造品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液および/またはデキストロース溶液などの薬学的に許容され得る緩衝液を含む第２の容器をさらに含むことができる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、撹拌器、針、シリンジ、ならびに適応症および/または使用のための指示を伴う添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
例示的な実施形態
提供される実施形態の中には、以下のものがある：
１）三重変異を含む抗体組成物であって、上記三重変異が、Ｌ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、上記三重変異が、Ｆｃγ受容体結合および抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物。
２）上記抗体が、ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
３）上記抗体が、Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
４）上記抗体が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
５）上記抗体が、ＣＤＨ３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
６）上記抗体が、ＧＰＮＭＢ抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
７）上記抗体が、ＤＬＬ３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
８）上記抗体が、ＥＮＰＰ３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
９）上記抗体が、ＳＬＩＴＲＫ６抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１０）上記抗体が、ＣＡ９抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１１）上記抗体が、ＰＳＭＡ抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１２）上記抗体が、ＣＤＨ６抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１３）上記抗体が、グリピカン３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１４）上記抗体が、ＥＤＮＲＢ抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１５）上記抗体が、ネクチン－４抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１６）上記抗体が、ＳＬＣ３４Ａ２抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１７）上記抗体が、Ｈｅｒ３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１８）上記抗体が、ＮＲＰ１抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
１９）上記抗体が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
２０）配列番号２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項３に記載のＨｅｒ２抗体。
２１）配列番号３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項３に記載のＨｅｒ２抗体。
２２）配列番号４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項３に記載のＨｅｒ２抗体。
２３）配列番号７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２４）配列番号８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２５）配列番号９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２６）配列番号１２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２７）配列番号１３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２８）配列番号１４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
２９）配列番号１７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
３０）配列番号１８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
３１）配列番号１９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項２に記載のＥＧＦＲ抗体。
３２）配列番号２２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項４に記載のＴｒｏｐ２抗体。
３３）配列番号２３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項４に記載のＴｒｏｐ２抗体。
３４）配列番号２４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項４に記載のＴｒｏｐ２抗体。
３５）配列番号２７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５に記載のＣＤＨ３抗体。
３６）配列番号２８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５に記載のＣＤＨ３抗体。
３７）配列番号２９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５に記載のＣＤＨ３抗体。
３８）抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
（ｉ）三重変異を含む抗体組成物であって、上記三重変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、かつ上記三重変異が抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物と、
（ｉｉ）リンカーと、
（ｉｉｉ）薬物単位であって、上記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）。
３９）上記抗体組成物が、ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４０）上記抗体組成物が、Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４１）上記抗体組成物が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４２）上記抗体が、ＣＤＨ３抗体を含む、請求項３８に記載の抗体。
４３）上記抗体組成物が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４４）上記ＴＡＡ抗体が、表ＩＶに示される、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４５）ストレッチャー単位をさらに含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４６）スペーサー単位をさらに含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４７）アミノ酸単位をさらに含む、請求項３８に記載のＡＤＣ。
４８）請求項１に記載の抗体を含む、製造品。
４９）請求項３８に記載のＡＤＣを含む製造品。
５０）治療有効量の請求項３８に記載のＡＤＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
５１）治療有効量の請求項１に記載の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
５２）個体におけるがんを処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の請求項３８に記載のＡＤＣを上記個体に投与することを含み、がんが表Ｉに示されるがんを発現する細胞を含む、方法。
５３）個体におけるがんを処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の請求項１に記載の抗体を上記個体に投与することを含み、がんが表Ｉに示されるがんを発現する細胞を含む、方法。
５４）個体における疾患を処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の請求項３８に記載のＡＤＣを上記個体に投与することを含み、疾患が表Ｖに示されるがんを発現する細胞を含む、方法。
５５）個体における疾患を処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の請求項１に記載の抗体を上記個体に投与することを含み、疾患が表Ｖに示されるがんを発現する細胞を含む、方法。
５６）抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）であって、
（ｉ）三重変異を含む抗体組成物であって、上記三重変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、上記三重変異が抗体エフェクター機能を修飾する、抗体組成物と、
（ｉｉ）リンカーと、
（ｉｉｉ）薬物単位であって、上記薬物単位がボリル化組成物を含み、かつ上記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）。
５７）上記抗体組成物が、ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
５８）上記抗体組成物が、Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
５９）上記抗体組成物が、Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
６０）上記抗体組成物が、ＣＤＨ３抗体を含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
６１）上記抗体が、ＧＰＮＭＢ抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６２）上記抗体が、ＤＬＬ３抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６３）上記抗体が、ＥＮＰＰ３抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６４）上記抗体が、ＳＬＩＴＲＫ６抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６５）上記抗体が、ＣＡ９抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６６）上記抗体が、ＰＳＭＡ抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６７）上記抗体が、ＣＤＨ６抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６８）上記抗体が、グリピカン３抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
６９）上記抗体が、ＥＤＮＲＢ抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
７０）上記抗体が、ネクチン－４抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
７１）上記抗体が、ＳＬＣ３４Ａ２抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
７２）上記抗体が、Ｈｅｒ３抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
７３）上記抗体が、ＮＲＰ１抗体を含む、請求項５６に記載の抗体。
７４）上記抗体組成物が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体を含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
７５）配列番号２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
７６）配列番号３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
７７）配列番号４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
７８）配列番号７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
７９）配列番号８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８０）配列番号９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８１）配列番号１２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８２）配列番号１３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８３）配列番号１４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８４）配列番号１７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８５）配列番号１８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８６）配列番号１９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８７）配列番号２２を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８８）配列番号２３を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
８９）配列番号２４を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９０）配列番号２７を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９１）配列番号２８を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９２）配列番号２９を含む抗体重鎖をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９３）ストレッチャー単位をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９４）スペーサー単位をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９５）アミノ酸単位をさらに含む、請求項５６に記載のＡＢＣ。
９６）治療有効量の請求項５６に記載のＡＢＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
９７）個体におけるがんを処置する方法であって、
（ｉ）治療有効量の請求項５６に記載のＡＢＣを上記個体に投与することを含み、上記がんが表Ｉに示される上記がんを発現する細胞を含む、方法。
本発明の様々な態様は、以下のいくつかの実施例によってさらに説明および例示され、そのいずれも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：抗体を生成する方法。
抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲ、抗Ｔｒｏｐ２および抗ＣＤＨ３ ＭＡｂを、アミノ酸配列を得て、対応するヌクレオチド配列についてコドン最適化を行うことによって生成した。（表ＶＩ－抗体配列１～３０を参照されたい）。遺伝子フラグメントを合成し、安定した発現のために二重ＨＣおよびＬＣ発現ベクターカセットの制限酵素部位にクローニングした。一過性構築物については、ＨＣおよびＬＣのための別々の発現ベクターを生成し、１対３のＨＣ対ＬＣ比で共トランスフェクトした。Ｆｃバリアントは、部位特異的変異誘発または部分的遺伝子フラグメント合成のいずれかとそれに続く当技術分野で公知の技術を用いたサブクローニングによって構築した。安定な発現ベクターまたは一過性の発現ベクターを構築し、トランスフェクションの前にエンドトキシンを含まないＤＮＡ精製キットで精製した。安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換え抗体およびＦｃバリアントを発現する安定なプールの生成のための選択および回収プロセスを受けた。抗体生成のために、８～１２日間の典型的な培養期間を有するフェドバッチ産生プロセスを、安定にトランスフェクトされたプールのために使用し、一過性発現のために、トランスフェクトされた細胞をトランスフェクション後６～８日間培養してから回収した。続いて、回収した細胞培養流体に対してプロテインＡ親和性精製を行い、精製した材料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。組換え抗体の品質は、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび当技術分野で公知の他の方法によって評価することができる。
実施例２：単一および/または三重変異体ＭＡｂは標的結合に影響を及ぼさない。
標的抗原結合を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。簡単に記載すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、０．０５～０．０７５ｕｇのＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２もしくはＥＧＦＲもしくはＴｒｏｐ２の組換えヒト可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）または０．０７５ｕｇの組換えヒトＣＤＨ３完全長（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｗａｎ）で、コーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液でブロッキングした。次いで、プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１×ＰＢＳ中で３倍に段階希釈した、抗ＨＥＲ２および抗ＥＧＦＲ ｍＡｂについては０．０００１～６．６６７ｎＭ、抗ＴＲＯＰ２および抗ＣＤＨ３ ｍＡｂについては０．０００３～２０ｎＭの濃度範囲の、試験試料（すなわち、抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＴＲＯＰ２および抗ＣＤＨ３ ｍＡｂの野生型またはＦｃ変異体）と共に、室温で２（２）時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、結合抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。洗浄して未結合検出抗体を除去した後、ウェルに、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の遅い速度論的基質溶液を添加した。そのウェルでは、試験試料の量に比例して発色する。色の光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定し、標的抗原に結合した試験試料の量の決定に使用した。試験濃度の範囲にわたる抗体の検出可能な結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた一部位結合非線形回帰分析を用いて分析した。
結果は、野生型と比較した場合、単一変異Ｌ３２８Ｃ、二重変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、ならびに三重変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＬ３２８Ｃを有するｍＡｂは、標的に結合し、三重変異は、単一および二重変異の場合と同様に、標的結合に影響を及ぼさない（図１、２、３、４、５および６）ことを示す。
実施例３：ＦｃγＲＩ結合の阻害が、三重変異体ＭＡｂについて観察される。
ＦｃγＲＩ結合を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）コーティング緩衝液中のＣＤ６４／ＦＣＧＲＩＡの組換えヒト可溶性ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）で、コーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液でブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１×ＰＢＳ中で４倍に段階希釈した、０．００５～８０ｕｇ／ｍｌ（または０．００２～３０ｕｇ／ｍｌ）の濃度範囲の試験試料（すなわち、トラスツズマブ、パニツムマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、サシツズマブ、または抗ＣＤＨ３（５８３６）の野生型またはＦｃバリアント）と共に、室温で２（２）時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、結合抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。洗浄して未結合検出抗体を除去した後、ウェルに、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の遅い速度論的基質溶液を添加した。そのウェルでは、試験試料の量に比例して発色する。色の光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定し、ＦｃγＲＩに結合した試験試料の量の決定に使用した。試験濃度の範囲にわたる抗体の検出可能な結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた一部位結合非線形回帰分析を用いて分析した。
結果は、野生型、単一変異体Ｌ３２８Ｃおよび二重変異体Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａと比較して、三重変異体についてＦｃγＲＩ結合の実質的な阻害が観察されたことを示す（図７、８、９、１０、１１および１２）。
実施例４：ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）結合の抑制が、三重変異体ＭＡｂについて観察される。
低親和性ＦｃｙＲＩＩＡ受容体への抗体の結合を、改変サンドイッチフォーマットＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔には、マイクロタイタープレートを、４ｕｇ／ｍｌの抗ｈｉｓタグ抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢＰ１－２５９３９ ｌｏｔ＃Ａ４）１００ｕｌ／ウェルでコーティングした。その後、ウェルをＢＳＡを含有するＰＢＳによりブロッキングした。次いで、異なる比（ＣＤ３２）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，ｃａｔ＃１０３７４－Ｈ０８Ｈ）でＦｃγＲＩＩａと混合したＦｃバリアントの段階希釈物を添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃ、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：３，０００希釈物を添加して、Ｈｉｓタグ捕捉ＦｃｙＲＩＩＡおよびＭａｂ複合体を検出した。結果をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加によって可視化し、６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。Ｆｃバリアント試験濃度の範囲にわたってＦｃｙＲＩＩＡに対する抗体の検出可能な結合を表し、抗ｈｉｓタグＡｂによって捕捉されたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した一部位結合非線形回帰分析によって分析した。
結果は、試験した全ての抗体について野生型および二重変異体Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａと比較して、三重変異体および単一変異体Ｌ３２８ＣについてＦｃγＲＩＩＡ結合の抑制が観察されることを示す（図１３、１４、１５、および１６）。
実施例５：ＦｃγＲＩＩＩａ結合の阻害が、三重変異体ＭＡｂについて観察される。
ＦｃγＲＩＩＩａ結合を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価した。簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）コーティング緩衝液中のｈＣＤ１６ａ／ＦＣＧＲＩＩＩＡの組換えヒト可溶性ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）でコーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液でブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１×ＰＢＳ中で４倍に連続希釈した、０．００５～８０ｕｇ／ｍｌの濃度範囲の試験試料（すなわち、トラスツズマブ、パニツムマブ、セツキシマブまたはニモツズマブの野生型またはＦｃバリアント）と共に、室温で２（２）時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、結合抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。洗浄して未結合検出抗体を除去した後、ウェルに、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の遅い速度論的基質溶液を添加した。そのウェルでは、試験試料の量に比例して発色する。色の光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定し、ＦｃγＲＩＩａに結合した試験試料の量の決定に使用した。試験濃度の範囲にわたる抗体の検出可能な結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた一部位結合非線形回帰分析を用いて分析した。
結果は、試験した全ての抗体について野生型および二重変異体Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａと比較して、三重変異体および単一変異体Ｌ３２８ＣについてＦｃγＲＩＩＩａ結合の実質的な阻害が観察されたことを示す（図１７、１８、１９、２０、２１、および２２）。
実施例６：ＦｃＲｎ結合の阻害は、Ｆｃバリアントおよび/または三重変異体ＭＡｂによって実質的に影響されない。
ＦｃＲｎ結合を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳ（ｐＨ６．０）コーティング緩衝液中の組換えヒトＦｃＲｎ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）でコーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液でブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１×ＰＢＳ（ｐＨ６．０）で３倍に段階希釈した、０．０４～９０ｕｇ／ｍｌ（または０．０４～３０ｕｇ／ｍｌ）の濃度範囲の試験試料（すなわち、トラスツズマブ、パニツムマブ、セツキシマブまたはニモツズマブ、サシツズマブ、または抗ＣＤＨ３（５８３６）の野生型またはＦｃバリアント）と共に、室温で２時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、結合抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。洗浄して未結合検出抗体を除去した後、ウェルに、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の遅い速度論的基質溶液を添加した。そのウェルでは、試験試料の量に比例して発色する。色の光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定し、ＦｃＲｎに結合した試験試料の量の決定に使用した。試験濃度の範囲にわたる抗体の検出可能な結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた一部位結合非線形回帰分析を用いて分析した。
結果は、ＦｃＲｎ結合の阻害が、野生型抗体と比較して、三重変異体抗体を含むがこれに限定されないＦｃバリアントによって実質的に影響されなかったことを示す（図２３、２４、２５、２６、２７、および２８）。
実施例７：Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸシステムを使用したＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃＲｎについての速度論的および親和性分析
Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を２５℃で使用して、抗Ｈｅｒ２抗体およびＦｃバリアントに対する異なるＦｃ受容体の結合親和性を測定した。簡潔には、ヒトＦｃＲ Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質パネル（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ、ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃＲｎ）を抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ（Ｈ１Ｓ１Ｋ）バイオセンサーにロードした。ロードしたセンサーを、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳまたはＦｃＲｎ分析のためにｐＨ６．０で構成される緩衝液中のＭａｂ試験試料の段階希釈物（３００ｎＭ開始、１：２希釈、７点）に浸漬した。速度定数は、一価（１：１）結合モデルを用いて計算した。ＦｃＲパネルに結合することが知られている抗体を陽性対照として使用した。ｋｄｉｓ／ｋｏｎの比として定義される平衡解離定数（ＫＤ）は、いくつかの異なる濃度で得られたセンソグラム曲線を分析することによって決定した。
結果は、図２９に要約されるように、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＢ、ＦｃｙＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８およびＶ１５８バリアント）およびＦｃｙＲＩＩＩＢへの結合に対するＦｃドメインへの単一または三重変異を導入することの効果、ならびにＦｃＲｎ結合に対する効果を示す。ＦｃγＲＩ結合について、三重変異体について観察されたＫＤ値の実質的な減少は、主に抗体解離速度（ｋｄ）の増加に起因する（図２９）。三重変異体に対するその抗原からの迅速な解離はまた、クロマトグラムに示されている（図３０）。野生型または単一変異体抗体と比較して、三重変異体では会合速度（ｋｏｎ）のわずかな減少のみが観察された。三重変異体の検出不能な結合のために、他のＦｃγ受容体についてはＫｄ値を決定することができなかった（図２９）。対照的に、ＦｃＲｎについて観察されたＫＤ値は、三重変異体について損なわれず、三重変異体に対する結合親和性の低下がＦｃガンマ受容体アイソフォームに特異的であることを暗示している。
実施例８：Ｏｃｔｅｔを使用したＦｃγＲＩ（解離速度）についての結合速度論的分析。
さらなる結合実験をＯｃｔｅｔ ＨＴＸに対して２５℃で行った。簡潔には、ヒトＦｃＲ Ｈｉｓタグ化組換えタンパク質パネル（ＦｃＲＩ）を、抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ（Ｈ１Ｓ１Ｋ）バイオセンサーにロードした。ロードしたセンサーを、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳまたはＦｃＲｎ分析のためにｐＨ６．０で構成される緩衝液中のＭａｂ試験試料の段階希釈物（３００ｎＭ開始、１：２希釈、７点）に浸漬した。速度定数は、一価（１：１）結合モデルを用いて計算した。ＦｃＲパネルに結合することが知られている抗体を陽性対照として使用した。
結果は、野生型および単一変異体と比較した場合、三重変異体解離速度は、ＦｃγＲＩについてより速いことを示す（図３０）。
実施例９：フローサイトメトリーを用いたＦｃバリアントのＡＤＣＣ分析。
Ｆｃバリアント媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を評価するために、フローサイトメトリーＡＤＣＣ評価を使用した。簡潔には、ヒトがん細胞を標的細胞として使用し、凍結ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。ヒトがん細胞を、８ｕＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，ｃａｔ＃Ｓ８２６９ ｌｏｔ＃Ｓ８２６９０１）で３０分間標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、Ｕ底９６プレートに添加し、適切な濃度のＦｃバリアントを添加した。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを添加することによってＡＤＣＣを開始した（エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比として４～８：１）。プレートをさらに、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を２回洗浄し、死細胞を染色するＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ＦＶＤ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）の１：５００希釈液で染色した。３０分間インキュベートした後、細胞を２％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、次いでＡｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてフローサイトメトリー分析に供した。各実験について、測定を３連で行った。総標的細胞（ＣＦＳＥ陽性）中の死んだ標的細胞（ＣＦＳＥ陽性およびＦＶＤ陽性）のパーセンテージを使用して、％細胞傷害を決定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して％細胞傷害棒グラフとして示す。
結果は、野生型と比較して各ｍＡｂについて三重変異体が著しく減少したＦｃバリアントでＡＤＣＣの減少が観察されたことを示す（図３１、図３２、図３３、および図３４）。
実施例１０：フローサイトメトリーを用いたＦｃバリアントのＣＤＣ分析。
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、補体源として仔ウサギ血清を使用し、標的細胞としてヒトがん細胞を使用する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによって決定した。簡潔には、標的細胞（ウェルあたり２０×１０ｅ３個）を９６ウェルＵ底プレートに分配し、Ｆｃバリアントと共に氷上で３０分間プレインキュベートした。次いで、希釈した補体を添加し、さらに３７℃（５％ＣＯ２、加湿雰囲気）で４時間インキュベートした。アッセイは、抗体の有無にかかわらず３連で実施した。最大放出は、溶解溶液で溶解した標的細胞を用いて調製した。上清のＬＤＨ活性を、非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｇ１７８１）を用いて測定した。細胞死を示す放出されたＬＤＨ活性を、分光光度計（Ｃｙｔａｔｉｏｎ１ Ｂｉｏｔｅｋ）を用いた（suing）４９０ｎｍでの光学密度読み取りによって決定した。細胞傷害（％）＝１００×（実験的放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）の式に従って、パーセンテージ細胞傷害を計算した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作成された％細胞傷害棒グラフとして示される。
結果は、ＣＤＣの減少が、各ＭＡｂについて三重変異体が著しく減少したＦｃバリアントで観察されたことを示す（図３５、図３６、図３７、および図３８）。
実施例１１：ＥＬＩＳＡを使用したＦｃバリアントのＣ１ｑ結合。
Ｃ１ｑ結合を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）コーティング緩衝液中の１ｕｇ／ｍｌ試験試料（すなわち、トラスツズマブ、パニツムマブ、サシツズマブおよび抗ＣＤＨ３－５８３６の野生型またはＦｃバリアント）、６０ｕｌ／ウェルでコーティングした。その後、プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）でブロッキングした。プレートを、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有する１×ＰＢＳ中で２倍に連続希釈した、０．６２５～４０ｕｇ／ｍｌの濃度範囲の、希釈したヒトＣ１ｑ（ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｃ１７４０ ｌｏｔ＃ＳＣＣ６４６２）と共に、室温で２（２）時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ－Ｔ）中５ｕｇ／ｍｌのウサギ抗ｈ Ｃ１ｑ（Ｄａｋｏ Ａ０１３６ ｌｏｔ＃２００４７６４０）、６０ ｕｌ／ウェルを添加し、室温で１．０時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、結合抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ウサギＨＲＰ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ｃａｔ＃１１１－０３６－０４６ Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の遅い速度論的基質溶液を添加し、色の光学密度（ＯＤ）を６５０ｎｍで測定した。試験濃度の範囲にわたる抗体の検出可能な結合を表すデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する１部位結合非線形回帰分析によって分析した。
結果は、Ｃ１ｑ結合の減少が、Ｆｃバリアントで観察され、各ＭＡｂについて三重変異体が著しく減少したことを示す（図３９、図４０、図４１、および図４２）。
実施例１２：部位特異的ＡＤＣの生成および特性評価
部位特異的チオールの生成
Ｆｃバリアントのヒンジジスルフィドを、ＰＢＳ中のＤＴＴにより室温で１５（１５）分間還元し、ＰＤ－１０カラムを用いてｐＨ６．５緩衝液中に脱塩することにより、過剰の還元剤から抗体を精製した。予測される遊離チオールは、Ｅｌｌｍａｎの試験によって確認された。次いで、抗体濃度に対して３５倍過剰のデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡ）を使用して、ヒンジジスルフィドを再形成した。再酸化の進行は、Ｅｌｌｍａｎの試験によって監視される。チオール対抗体比が約２．０に達するとき、マレイミド－ペイロードを添加する。
コンジュゲートの調製
本発明の部位特異的ＡＤＣを生成するために、活性化された部位特異的抗体にマレイミド－リンカーを加えることによって、ＬＯＬ１と示される独自のリンカー（複数可）を使用する抗体コンジュゲートを調製した。活性化のプロセス（すなわち、遊離チオールの遊離）は、上記で記載される（部位特異的チオールの生成）。ＤＭＳＯ中のリンカー溶液を、１．２モル当量のリンカーでチオールへ添加する 反応物を室温で４５～６０分間撹拌する。得られたコンジュゲートを、ＰＤ－１０または同様の脱塩カラムを使用してヒスチジン製剤緩衝液（ｐＨ６）に精製し、分析する。
コンジュゲート評価
単一変異体（すなわち、Ｌ３２８Ｃ）抗体または三重変異体（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ）抗体のいずれかを使用して、部位特異的ＡＤＣを産生する能力を検証するために、３つの技術：（ｉ）インタクト質量分析、（ｉｉ）ペプチドマッピングおよび（ｉｉｉ）逆相ＨＰＬＣを使用した。逆相ＨＰＬＣは、システインに基づくコンジュゲートを切る離すための主要な方法であり、ペイロードが、主にまたは単独で重鎖にコンジュゲートされ、重鎖内の単一の位置でのみコンジュゲートされ、したがって生成物が部位特異的であることを確認するために使用された。質量分析によるインタクト分析を使用して、コンジュゲートされた重鎖が、正確な予想される質量（すなわち、ＨＣ＋ペイロード）を有することを確認した。一方でペプチドマッピングにより、ペイロードが重鎖内の特定の位置に繋ぎ止められていることを確認する。ここでは、インタクト質量分析を利用して、三重変異を有するＬＯＬ－１コンジュゲート抗ＨＥＲ２ ｍＡｂが単一コンジュゲート重鎖および非コンジュゲート軽鎖から構成されることを証明した（図４４）。単一または三重変異のいずれかを有する単一変異体および三重変異体ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ Ｎｏ．１の両方のペプチドマッピングは、重鎖内のＡＣＰＡＰＩＥＫペプチドは、Ｌ３２８Ｃ変異の部位およびコンジュゲーションの部位の両方であることを明らかにした（図５４、図５５）。
質量分析は、低スループット技術であるが、逆相ＨＰＬＣは、ＡＤＣの相対組成を示すハイスループット技術である。モノクローナル抗体では、野生型ヒトＩｇＧ１に存在するコンジュゲーションに利用可能なシステインが８つ（８）しかないので、システイン側鎖を介してコンジュゲートされたＡＤＣおよびコンジュゲートに特に有用である。
一般に、各ＣｙｓベースのＡＤＣは、公知である必要がある有限数のペイロードを搬送する。ペイロードとしてｖｃＭＭＡＥを利用するＡＤＣは、腫瘍殺滅において効率的であるために、２（２）～４（４）ペイロードをどこでも運ぶべきであることが一般的に受け入れられている。さらに、それらの構成は、０（非コンジュゲート）～８（完全コンジュゲート）の範囲のペイロードの分布である。ペイロード（すなわち、分布および高いペイロード対ｍＡｂ種を欠く部位特異的ＡＤＣ）の規定された数（典型的にはｍＡｂあたり２つ）を運ぶように操作された抗体は、臨床的有効性、安全性または安定性において有利であることが示されている。
したがって、本発明者らは、ｖｃＭＭＡＥのコンジュゲーションから生じるＡＤＣの構成を切り離すために、逆相クロマトグラフィーアッセイが主要な技術である分析方法を使用する。各種（すなわち、重鎖、軽鎖、およびコンジュゲート種）は、保持時間およびＵＶ２５０／２８０比の両方に基づいて同定され、ＤＡＲ（薬物対ｍＡｂ比）が計算される。さらに、本発明者らは、ペイロードが主にまたは完全に重鎖に繋ぎ止められ、単一のペイロードを有する重鎖が主要な種であり、部位特異的コンジュゲーションの主要な属性であることを示した。
分析の材料および方法を以下のように行った。
インタクト質量分析
簡潔には、１／２０の体積の２００ｍＭ ＤＴＴを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって試料を調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計を使用して試料を分析した。液体クロマトグラフィーカラムは、１０μｍ ＰＬＲＰＳポリスチレン逆相充填物を充填したＩＤ ２ｍｍ×長さ１０ｃｍのカラムであった。溶媒は、水中０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｂ）であった。勾配は、１％Ｂの１分間の保持、７０％Ｂへの１４分間の傾斜、９０％Ｂへの１分間の傾斜、９０％Ｂでの１分間の保持、および１％Ｂに戻る１分間の傾斜であった。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアを使用して取得し、ＢｉｏｃｏｎｆｉｒｍによるＡｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して分析した。逆重畳は、最大エントロピーモデルを使用した。
結果は、三重変異を有するＬＯＬ１－コンジュゲート抗ＨＥＲ２抗体が明確な保持シフトをもたらしたことを示しており、これは、ただ１つの位置異性体が形成されたことを示唆しており、部位特異的コンジュゲーションを非常に示している（図４３）。インタクト質量分析によるさらなる確認は、上記のＬＯＬ１コンジュゲート三重変異体抗ＨＥＲ２抗体が、部位特異的であることを示した（図４４）。２３４４０ダルトン（Ｄａ）の平均質量を有する非コンジュゲート軽鎖（ＬＣ）のみが検出された（図４４）。２３４６２Ｄａのピークは、ＬＣ－ＭＳシステムで通常形成されるナトリウム付加物を表す。重鎖（ＨＣ）については、４９４８７Ｄａの平均質量（抗体産生に利用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養系で典型的に観察されるｃ末端リジン欠失（－Ｋ）を反映する）および４９６１３Ｄａの産物（インタクトな未処理ｃ末端リジン（＋Ｋ）を有するＨＣを反映する）を有するコンジュゲート種が見出される。非コンジュゲートＨＣ種も第２のコンジュゲーション部位を有するＨＣも見出されていない（図４４）。まとめると、インタクト質量分析により、（ｉ）単一のＬＯＬ１ペイロードのみが重鎖にコンジュゲートしている、（ｉｉ）軽鎖へのコンジュゲーションが検出されない、かつ（ｉｉｉ）そのようなコンジュゲートは、操作されたＣｙｓ－３２８とのみ形成することができ、ヒンジ領域システインのいずれとも形成することができないことが確認された。
図４３および図４４の結果は、独自のペイロードＬＯＬ－１とコンジュゲートしたＡＤＣが、三重ＦｃバリアントについてＬ３２８Ｃで１００％部位特異的であることを確認する。
逆相クロマトグラフィー分析
さらに、抗体および/または抗体薬物コンジュゲートを、以下のプロトコルを使用して逆相クロマトグラフィーによって分析した。簡潔には、ＡＤＣまたはｍＡｂをＤＴＴで還元し、Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムを使用してＡｃｑｕｉｔｙ Ｃ４ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅカラム（１００×２．１ｍｍ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して分析した。カラムを８０℃に維持した。ｍＡｂ軽鎖および重鎖をアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）勾配で分離した。
図４５の結果は、単一ペイロードを有する重鎖（Ｈ１）が、コンジュゲーションが部位特異的であり、かつペイロードがＣｙｓ３２８上に存在し、ヒンジ領域内には存在しないことを示唆する主要な種であることを示す。さらに、図４６は、ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂのＬ３２８Ｃバリアントについての逆相カラムクロマトグラフィープロファイルを示す。８０％を超える部位特異的コンジュゲーションがＣｙｓ３２８重鎖上で起こることが示されている。
図４７は、ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗Ｔｒｏｐ２ ＭａｂのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ三重変異体の逆相カラムクロマトグラフィープロファイルを示す。７０％を超える部位特異的コンジュゲーションがＣｙｓ３２８重鎖上で起こることが示されている。図４８は、ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ ＭａｂのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃバリアントについての逆相カラムクロマトグラフィープロファイルを示す。ＤＡＲ１が、Ｃｙｓ３２８重鎖上に生じる部位特異的コンジュゲーションの８０％～９０％を超える優勢な種であることが示される。
図４９は、図４９に提供されるＲＰ－ＨＰＬＣデータに基づくピーク割り当ておよびＤＡＲ計算を示す。非コンジュゲートＭａｂ（対照）を使用して、重鎖および軽鎖の両方について保持時間およびＵＶ２５０／２８０比の両方を同定した。これらのパラメータは、ピーク割り当ておよびＤＡＲ決定の両方に必要であることに留意されたい。ＤＡＲは、以下のように計算した。
Figure 0007671284000001
 ここで、
ＬＣ０、ＬＣ１は、それぞれＬＣ非コンジュゲートおよびｖｃＭＭＡＥ－コンジュゲートのＡＵＣである。
ＨＣｎは各重鎖種のＡＵＣであり、ｎはｖｃＭＭＡＥペイロードの倍数である。
図５０は、単一または三重Ｆｃバリアントを有するｖｃＭＭＡＥまたはＬＯＬ１コンジュゲートｍＡｂについての平均ＤＡＲ、ＳＥＣによって決定されるパーセントモノマーピークおよびＤＡＲ１種のパーセントを含む分析的属性の要約を示す。
ペプチドマッピング
ペイロードが重鎖内の特定の位置に繋ぎ止められていることを確認するために、以下のプロトコルを使用してペプチドマッピング分析を行った。
（ｉ）試料調製：
当該分野で公知の公開された手順に従って、Ｍａｂ（複数可）およびＡＤＣ（複数可）をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドを使用して遊離チオールをアルキル化した。トリプシン消化ペプチドマップを得るために、上記抗体を以下のように消化した：５Ｍ グアニジンを使用して部分変性条件下でＤＴＴにより抗体を還元した。ヨードアセトアミドをＤＴＴの２倍の濃度で添加した。アルキル化ｍＡｂを、Ｚｅｂａ－Ｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）カラムを使用して１００ｍＭリン酸緩衝液に脱塩すること（desalinating）によって精製した。トリプシンを各試料に添加し、試料を３７℃で一晩インキュベートし、蒸発乾固し、ペレットを１００μＬの５％ＡＣＮ、９５％水、０．１％ギ酸に再懸濁した。
（ｉｉ）ＬＣ－ＭＳ：
試料を調製した後、５．０μＬの試料を、Ｃ１８の３μｍバルク樹脂（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が充填された７５μｍ×２ｃｍトラップカラムおよびＣ１８の２μｍ樹脂（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む７５μｍ×１５ｃｍ分析カラムを備えた最終的な３０００ナノＬＣに注入した。ｎａｎｏＬＣ勾配は、４０分かけて３～３５％の溶媒Ｂ（Ａ＝０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ、Ｂ＝０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）、５分で３５％～８５％の溶媒Ｂであり、流速３００ｎＬ／分であった。ｎａｎｎｏＬＣを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓオービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と組み合わせた。ＥＳＩ電圧を、１．９ｋＶに設定し、キャピラリ温度を２７５℃に設定した。３×１０６の自動化利得制御（ＡＧＣ）標的を用いて、ｍ／ｚ２００で分解能７０，０００のプロファイルモードで全スペクトル（ｍ／ｚ ３５０～２０００）を取得した。最大存在度の１５個のイオンは、２５の正規化された衝突エネルギーを有する高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）によるフラグメンテーションに供された。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ ２００で分解能１７，５００の質量中心モードで取得した。フラグメントイオンのＡＧＣ標的は、５０ｍｓの最大注入時間で２×１０４に設定される。電荷状態１、７、８、および割り当てられていないものをタンデムＭＳ実験から除外した。動的排除を４５．０秒に設定した。
図５１の結果は、ｖｃＭＭＡＥ－ペプチドのフラグメンテーション後の特徴的な娘イオンを示す。さらに、図５２は、ｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートした三重変異を有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ １の配列包括度を示す。図５３は、代表的なＴＩＣクロマトグラムを示す。違いを円で示す。図５４は、三重変異を有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ １についてのコンジュゲーション部位を含むペプチドの電荷状態を示す。非コンジュゲート対照ｍＡｂは、重鎖由来のＡＣＰＡＰＩＥＫペプチドと一致する８８６のＭ／ｚを有する［Ｍ＋１］イオンを有する（Ａ）。その＋２イオンが、挿入図に示されている。Ｍ／ｚが、４８６および６５４の２つの顕著な娘イオンを（Ｂ）に示す。ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートでは、このペプチドは、システインへのコンジュゲーションに起因して異なる場所で逆相カラムから溶出される（前図を参照されたい）。得られた生成物をＣで同定する（＋２および＋３の電荷状態を示す）。フラグメントは、上記と同じイオン（Ｄ、黒塗り矢印）を含有し、このことから、これが同じＡＣＰＡＰＩＥＫペプチドであることが確認される。Ｍ／ｚが６８６，５０６および３２１のさらなるフラグメント（Ｄ、白抜き矢印）は、ＶＣＭＭＡＥに属し、図５２のものに相当する。最後に、図５５は、単一変異（Ｌ３２８Ｃ）を有する抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１のコンジュゲーション部位がまた重鎖のＡＣＰＡＰＩＥＫペプチド上に確認されたことを示す。
ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１の単一変異体についての抗体フラグメントおよびペプチドマップの信頼スコアのリストを表ＶＩＩに示す。ｖｃＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥＧＦＲ抗体Ｎｏ．１の三重変異体についての抗体フラグメントおよびペプチドマップの信頼スコアのリストを表ＶＩＩＩに示す。
実施例１３：ｖｃＭＭＡＥのＦｃ単一変異体および/または三重変異体コンジュゲートの細胞傷害
腫瘍細胞株に対するｖｃＭＭＡＥとコンジュゲートしたＦｃ単一変異体または三重変異体抗体の細胞傷害性効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧＬｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ＃Ｇ７５７１）を用いて測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイは、代謝的に活性な細胞の存在をシグナル伝達する、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養中の生細胞の数を決定するための均一な方法である。簡潔には、不透明壁のマルチウェルプレート中のヒト腫瘍細胞（１００μｌ細胞培養培地中の６０００個/ウェルのヒトがん細胞）を、Ｆｃ単一変異体または三重変異体抗体ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの段階希釈物と共に３７℃（５％ＣＯ２、加湿雰囲気）で３～４日間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）基質をウェルに添加した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ１（Ｂｉｏｔｅｋ）プレートリーダーを用いて１０分後に発光を記録した。パーセント生存率を、式：生存率（％）＝１００×（実験的ＲＬＵ－培地のみのＲＬＵ）／（細胞のみのＲＬＵ－培地のみのＲＬＵ）に従って計算し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰ｌｏｇ（阻害剤） 対 応答（３つのパラメータ）曲線当てはめによって分析した。細胞傷害アッセイで試験された細胞株は、アッセイで使用されるｍＡｂのそれぞれの標的に対して陽性の表面発現を有する。具体的には、ＨＣＣ１９５４細胞株を、単一変異体（Ｌ３２８Ｃ）を有する抗ＨＥＲ２ ｍＡｂについて試験した。単一変異体または三重変異体のいずれかを有する抗ＥＧＦＲ ｍＡｂについて、ＭＤＡ ＭＢ４６８細胞株を試験した。単一変異体または三重変異体のいずれかを有する抗ＴＲＯＰ２抗体について、ＳＫ ＢＲ３細胞株を評価した。
図５６、図５７、図５８、図５９、図６０および図６１の結果は、単一または三重Ｆｃ変異体を有する抗体のインビトロ細胞傷害が、内在化後のリソソームカテプシンＢによる標的細胞内での効率的かつ選択的な薬物切断を促進する切断可能なジペプチドバリン－シトルリン（ｖｃ）リンカーを有するＭＭＡＥ誘導体であるｖｃＭＭＡＥとのそれらのコンジュゲーションによって増強されたことを示す。結果はさらに、ｖｃＭＭＡＥを有する部位特異的コンジュゲート化ｍＡｂが、用量依存的様式で抗原陽性腫瘍細胞株に対して強力かつ選択的な細胞傷害活性を示すことを示した。対照的に、単一変異体または三重変異体を有する非コンジュゲートｍＡｂは、細胞傷害性効果が実質的に少ないかまたは全く示さなかった。まとめると、これらの結果は、細胞による結合および内在化の際に細胞傷害性薬物の放出を可能にする細胞毒素に部位特異的様式で共有結合的に連結したモノクローナル抗体から構成されるＡＤＣのインビトロ有効性を実証する。
実施例１４：Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ三重変異体ＭＡｂおよび部位特異的コンジュゲートＡＤＣの使用によるヒト癌の処置のためのヒト臨床試験
Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣは、本発明に従って合成され、腫瘍細胞に特異的に蓄積し、特定の腫瘍ならびに他の免疫学的障害および/または他の疾患（表Ｉおよび表Ｖを参照されたい）の処置に使用される。これらの適応症のそれぞれに関連して、２つの臨床アプローチが首尾よく追求されている。
Ｉ．）補助療法：補助療法では、患者は、化学療法剤もしくは医薬品もしくはバイオ医薬品またはそれらの組み合わせと組み合わせてＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣで処置される。原発がん標的を、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣの添加によって標準プロトコル下で処置する。プロトコル設計は、限定するものではないが、原発性または転移病変の腫瘍量の減少、無増悪生存期間の延長、全生存期間、患者の健康の改善、疾患安定化、ならびに標準化学療法および他の生物学的薬剤の通常用量を低減できることを含む、以下の実施例によって評価されるような有効性に対処する。これらの投与量減少は、化学療法剤または生物学的薬剤の用量関連毒性を減少させることによって、追加のおよび/または長期の治療を可能にする。
ＩＩ．）単独療法：腫瘍の単独療法におけるＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣの使用に関連して、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣは、化学療法剤や医薬品や生物学的薬剤なしで患者に投与される。一実施形態では、単独療法は、広範囲の転移疾患を有する末期がん患者において臨床的に実施される。プロトコル設計は、限定するものではないが、原発性または転移病変の腫瘍量の減少、無増悪生存期間の延長、全生存期間、患者の健康の改善、疾患安定化、ならびに標準化学療法および他の生物学的薬剤の通常用量を低減できることを含む、以下の実施例によって評価されるような有効性に対処する。
投与量
投薬計画は、最適な所望の応答を提供するように調整され得る。例えば、単回のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣ注射を投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少または増加させてもよい。本明細書で使用される「単位剤形」は、処置される哺乳動物対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要とされる医薬担体に伴って所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３または他のＴＡＡ ＡＤＣの固有の特徴、照射機構（反応器）の個々の機構および達成される特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における過敏症（sensitivity）の処置のためにそのような化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
臨床開発計画（ＣＤＰ）
ＣＤＰは、本開示のＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣを使用して、がん（複数可）および/または免疫障害（表Ｉおよび表Ｖを参照されたい）の処置に続いて進展させる。試験は、最初に安全性を実証し、その後、反復投与における有効性を確認する。試験は、標準的な化学療法と、標準的な治療に加えたＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣとを比較する非盲検である。理解されるように、患者の登録に関連して利用することができる１つの非限定的な基準は、当技術分野で公知の標準的な検出方法によって決定される腫瘍でのＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ３、または他のＴＡＡ ＡＤＣの濃度である。
本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示として意図された本明細書に開示された実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価なものはいずれも本発明の範囲内である。本明細書に記載されたものに加えて、本発明のモデル、方法、およびライフサイクル方法論に対する様々な変更は、前記の説明および教示から当業者に明らかになり、同様に本発明の範囲内に入ることが意図される。そのような変更または他の実施形態は、本発明の真の範囲および主旨から逸脱することなく実施することができる。
Figure 0007671284000002
Figure 0007671284000005
Figure 0007671284000006
表ＶＩ 抗体配列
抗ＨＥＲ２ Ａｂ重鎖野生型
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１）

抗ＨＥＲ２ Ａｂ重鎖Ｌ３２８Ｃ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２）

抗ＨＥＲ２ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号３）

抗ＨＥＲ２ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号４）

抗ＨＥＲ２ Ａｂ軽鎖野生型
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号５）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．１重鎖野生型
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号6）
抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．１重鎖Ｌ３２８Ｃ
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号７）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．１重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号８）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．１重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号９）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．１軽鎖野生型
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１０）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．２重鎖野生型
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１１）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．２重鎖Ｌ３２８Ｃ
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１２）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．２重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号13）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．２重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１４）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．２軽鎖野生型
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１５）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．３重鎖野生型
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１６）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．３重鎖Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１７）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．３重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１８）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．３重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１９）

抗ＥＧＦＲ Ａｂ Ｎｏ．３軽鎖野生型
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITREVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２０）

抗Ｔｒｏｐ２ Ａｂ重鎖野生型
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２１）

抗Ｔｒｏｐ２ Ａｂ重鎖Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２２）

抗Ｔｒｏｐ２ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２３）

抗Ｔｒｏｐ２ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２４）

抗Ｔｒｏｐ２ Ａｂ軽鎖野生型
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号２５）

抗ＣＤＨ３ Ａｂ重鎖野生型
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSQSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRIYYRSKWYNDYALSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGEGYGREGFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２６）

抗ＣＤＨ３ Ａｂ重鎖Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSQSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRIYYRSKWYNDYALSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGEGYGREGFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２７）

抗ＣＤＨ３ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSQSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRIYYRSKWYNDYALSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGEGYGREGFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２８）

抗ＣＤＨ３ Ａｂ重鎖Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ３２８Ｃ
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSQSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRIYYRSKWYNDYALSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGEGYGREGFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKACPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２９）

抗ＣＤＨ３ Ａｂ軽鎖野生型
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNTLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLSWFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号３０）
Figure 0007671284000007
Figure 0007671284000008
Figure 0007671284000009
Figure 0007671284000010
Figure 0007671284000011
Figure 0007671284000012

Claims (33)

  1. 三重アミノ酸変異を含む抗体であって、前記三重アミノ酸変異が、Ｌ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、ここで、前記アミノ酸変異の位置ナンバリングは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスにしたがうものであり、前記三重アミノ酸変異が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を抑制して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少し、前記三重アミノ酸変異が、Ｃ１ｑ結合をさらに減少して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少する、抗体。
  2. 前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、抗Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、抗Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、抗ＣＤＨ３抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、抗腫瘍関連抗原（抗ＴＡＡ）抗体を含む、請求項１に記載の抗体。
  7. 前記ＴＡＡが、ＧＰＮＭＢ、ＤＬＬ３、ＥＮＰＰ３、ＳＬＩＴＲＫ６、ＣＡ９、ＰＳＭＡ、ＣＤＨ６、グリピカン３、ＥＤＮＲＢ、ネクチン－４、ＳＬＣ３４Ａ２、Ｈｅｒ３およびＮＲＰ－１からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
  8. 抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
    （ｉ）三重アミノ酸変異を含む抗体であって、前記三重アミノ酸変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、ここで、前記アミノ酸変異の位置ナンバリングは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスにしたがうものであり、かつ前記三重アミノ酸変異がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を抑制して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少し、前記三重アミノ酸変異が、Ｃ１ｑ結合をさらに減少して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少する、抗体と、
    （ｉｉ）リンカーと、
    （ｉｉｉ）薬物単位であって、前記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）。
  9. 前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  10. 前記抗体が、抗Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  11. 前記抗体が、抗Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  12. 前記抗体が、抗ＣＤＨ３抗体を含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  13. 前記抗体が、抗腫瘍関連抗原（抗ＴＡＡ）抗体を含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  14. 前記ＴＡＡが、ＧＰＮＭＢ、ＤＬＬ３、ＥＮＰＰ３、ＳＬＩＴＲＫ６、ＣＡ９、ＰＳＭＡ、ＣＤＨ６、グリピカン３、ＥＤＮＲＢ、ネクチン－４、ＳＬＣ３４Ａ２、Ｈｅｒ３およびＮＲＰ－１からなる群から選択される、請求項１３に記載のＡＤＣ。
  15. ストレッチャー単位をさらに含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  16. スペーサー単位をさらに含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  17. アミノ酸単位をさらに含む、請求項８に記載のＡＤＣ。
  18. 請求項１に記載の抗体を含む、製造品。
  19. 請求項８に記載のＡＤＣを含む製造品。
  20. 治療有効量の請求項８に記載のＡＤＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
  21. 治療有効量の請求項１に記載の抗体と、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
  22. 抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）であって、
    （ｉ）三重アミノ酸変異を含む抗体であって、前記三重アミノ酸変異がＬ２３４Ａ修飾、Ｌ２３５Ａ修飾およびＬ３２８Ｃ修飾を含み、ここで、前記アミノ酸変異の位置ナンバリングは、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスにしたがうものであり、前記三重アミノ酸変異がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を抑制して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少し、前記三重アミノ酸変異が、Ｃ１ｑ結合をさらに減少して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少する、抗体と、
    （ｉｉ）リンカーと、
    （ｉｉｉ）薬物単位であって、前記薬物単位がボリル化組成物を含み、かつ前記薬物単位が部位Ｌ３２８Ｃで特異的にコンジュゲートされている、薬物単位と、を含む抗体－ホウ素－コンジュゲート（ＡＢＣ）。
  23. 前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  24. 前記抗体が、抗Ｈｅｒ２抗体を含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  25. 前記抗体が、抗Ｔｒｏｐ２抗体を含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  26. 前記抗体が、抗ＣＤＨ３抗体を含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  27. 前記抗体が、抗腫瘍関連抗原（抗ＴＡＡ）抗体を含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  28. 前記ＴＡＡが、ＧＰＮＭＢ、ＤＬＬ３、ＥＮＰＰ３、ＳＬＩＴＲＫ６、ＣＡ９、ＰＳＭＡ、ＣＤＨ６、グリピカン３、ＥＤＮＲＢ、ネクチン－４、ＳＬＣ３４Ａ２、Ｈｅｒ３およびＮＲＰ－１からなる群から選択される、請求項２７に記載のＡＢＣ。
  29. ストレッチャー単位をさらに含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  30. スペーサー単位をさらに含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  31. アミノ酸単位をさらに含む、請求項２２に記載のＡＢＣ。
  32. 治療有効量の請求項２２に記載のＡＢＣと、薬学的に許容され得る賦形剤と、を含む医薬組成物。
  33. 個体におけるがんを処置するための組成物であって、前記組成物は、請求項２２に記載のＡＢＣを含み、前記がんが、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫、Ｂ細胞ホジキンリンパ腫、膀胱癌、乳癌、淡明細胞型腎細胞癌腫、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、生殖器癌、子宮頸癌、食道癌および神経膠腫からなる群から選択される、組成物。
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