JP7685000B2 - フィコビリタンパク質の精製 - Google Patents

Description

本発明は、フィコビリタンパク質、特に酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を精製するための新規方法、得られたフィコビリタンパク質、およびその使用に関する。

ガルディエリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ Ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のフィコビリタンパク質、特にＣ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）の精製は、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（スピルリナ）または他のシアノバクテリアの精製よりもはるかに複雑である。この理由の一つにガルディエリア・スルフラリア細胞壁の組成があり、これを破砕するには機械的作用を必要とする（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。機械的な溶解の結果、ミセルが形成されるが、これは超遠心分離によって部分的にのみ除去される。これらのミセル中に、クロロフィルａと、溶解したカロテノイドが存在していると、２８０ｎｍでの吸光度値（タンパク質固有のＵＶ吸光度）が高まり、これによりスピルリナ粗抽出物と比較してＣ－ＰＣ粗抽出物の低純度レベルを説明することができる（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、ミセルとフィコビリタンパク質以外の可溶性タンパク質を除去することによって、粗抽出物の純度レベルを高めることができる。

シアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ）、シアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）、ガルディエリア・スルフラリアおよびスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）から抽出されたフィコビリタンパク質を硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる精製法が文献に記載されているが（ＷＯ２０１６０９９２６１；Ｅｉｓｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７５；２０１５；Ｃｒｕｚ ｄｅ Ｊｅｓｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、大量の硫酸アンモニウムを必要とし、この硫酸アンモニウムと上清の再処理という重大な問題を引き起こすことから工業規模での適用は非常に難い。

クロマトグラフ法のような純度レベルを得る他の公知の精製法は、実施に非常に費用がかかるものであった。

したがって、本発明は、フィコビリタンパク質産生微生物のバイオリアクター培養によって産生されたフィコビリタンパク質を精製する方法に関し、この方法は実施が容易であり、工業規模の実施に経済的に適している。

さらに、フィコビリタンパク質、特にフィコシアニンは、ｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンの混合物である。既知の精製方法では、工業的に制御してそれらを分離することはできない。硫酸アンモニウムを用いた沈殿による精製では、両方のタンパク質が制御されずに同伴されるため、安定した特性を有する色素を得ることは困難であり得る。この沈殿方法の結果、実質的な抽出収率の損失も生じる（Ｃｒｕｚ ｄｅ Ｊｅｓｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

したがって、本発明はまた、精製フィコビリタンパク質、特に本質的にｃ－フィコシアニンまたは本質的にアロフィコシアニンを含む精製フィコシアニン、特にフィコシアニンにおける制御された組成の酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質の調製、アスコルビン酸（ＷＯ２００５／０６５６９７）またはポリフェノール（ＷＯ２０１５／０９０６９７）などの安定剤の添加を必要としない酸ｐＨに対する耐性に関する。

したがって、本発明は、酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質の粗抽出物から酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を精製する方法に関し、この方法は、
ａ）酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質の粗抽出物のｐＨを６未満のｐＨに調整して、酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質以外の有機物を沈殿させる工程と、
ｂ）酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を含む上清を回収する工程と、
ｃ）上清から酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を分離する工程と
を含んでなることを特徴とする。

本発明はまた、この方法により得られた酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質、特にｃ－フィコシアニンとアロフィコシアニンの混合物を含む酸ｐＨ耐性フィコシアニン、より具体的にはｃ－フィコシアニン対アロフィコシアニンのモル比が少なくとも２であるものに関する。

新鮮な細胞のライセートからのｐＨの関数としての粗抽出物の純度指数の増加を示す図である。 異なるｐＨレベルで新鮮な細胞ライセートを遠心分離して得られた、異なる粗抽出物中のＣ－ＰＣおよびＡＰＣの濃度の測定を示す図である。ＡＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）は灰色で、Ｃ－ＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）は黒で示されている。 異なるｐＨレベルで新鮮な細胞ライセートを遠心分離して得られた、ペレット中のＣ－ＰＣおよびＡＰＣの濃度の測定を示す図である。ＡＰＣ濃度（ｍｇ／ｇ ＤＭ）は灰色で、Ｃ－ＰＣ濃度（ｍｇ／ｇ ＤＭ）は黒で示されている。 凍結乾燥および再水和された細胞のライセートからのｐＨの関数としての粗抽出物の純度指数の増加を示す図である。 異なるｐＨレベルで凍結乾燥および再水和された細胞のライセートを遠心分離して得られた、異なる粗抽出物中のＣ－ＰＣおよびＡＰＣの濃度の測定を示す図である。ＡＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）は灰色で、Ｃ－ＰＣ濃度（ｍｇ／ｍｌ）は黒で示されている。 タンジェンシャル濾過によるＣ－ＰＣの精製および濃縮を示す図である。酸ｐＨでの沈殿により前もって精製された粗抽出物は、中空糸膜系を使用して濾過される。 中空糸膜濾過中の保持液中のＣ－ＰＣ濃度の増加を示す図である

したがって、本発明は、酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質の粗抽出物から酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を精製する方法に関する。

フィコビリタンパク質の粗抽出物の取得は、一般的に、高容量バイオリアクターで工業的に成長させられた微生物の細胞から、好ましくは高密度のフィコビリタンパク質産生微生物を含む発酵マストが得られるように行われる（高密度は、一般的に、発酵マスト１リットルあたり５０ｇ超の乾燥物質（ＤＭ）、優先的には１００ｇ／Ｌ超として定義される）。これらの培養方法は、当業者に知られており、特にＷＯ２０１７／０５０９１７、ＷＯ２０１７／０５０９１８号および２０１６年１１月３０日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７９３２５出願に記載される独立栄養、従属栄養または混合栄養で行うことができる。培養微生物によって産生されたフィコビリタンパク質は、細胞溶解後に放出されなければならない。実際、微生物細胞には大量のフィコビリタンパク質が含まれている（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５， Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｒｉｋｓｅｎ ２００８）。したがって、本発明による方法の実施には、まず発酵マストからの水性抽出物の調製が必要である。

水性抽出物は、おそらく適切な量の水を添加して、発酵の終了時にリアクターから回収されるため、発酵マストから直接調製することができる。

抽出物は、当業者に周知の任意の分離方法によって、発酵マストから分離された新鮮な細胞から調製することができる。抽出物はまた、保存のために凍結乾燥または乾燥された細胞から調製することもできる。

本発明の好ましい実施形態によれば、水性抽出物は、培養後の発酵マストから分離された新鮮な細胞から調製される。

細胞溶解は、当業者に知られている細胞溶解の任意の手段によって行うことができる。細胞溶解は、細胞が水、発酵マストまたは再構成された懸濁液に懸濁されている間に行うことができる。

本発明の好ましい実施形態によれば、細胞溶解は、再懸濁される前に、発酵マストから分離された細胞で行われる。

好ましくは、水性抽出物は、細胞溶解、特に濾過の固体残渣を除去するための当業者に公知の任意の分離手段によって、固体を分離することにより、溶解細胞を含む懸濁液から得られる。

この結果、「フィコビリタンパク質の粗抽出物」または「粗抽出物」と呼ばれる水性抽出物が得られ、これには、所望のフィコビリタンパク質に加えて、特に酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質、ミセルなどの他の有機物質および他の水溶性タンパク質が含まれる。

フィコビリタンパク質の粗抽出物は、新鮮な溶解細胞（発酵マスト中で直接もしくは発酵マストの分離後）から、または凍結乾燥もしくは乾燥された細胞から調製することがで、ここで、凍結乾燥または乾燥の前後に細胞溶解が行われる。

本発明の好ましい実施形態によれば、粗抽出物は、新鮮な細胞から調製される。

本発明による精製方法は、フィコビリタンパク質、特に酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を、ミセルなどの他の有機物および他の水溶性タンパク質から分離することにある。

フィコビリタンパク質を産生するために培養された微生物は、当業者に周知であり、特に、アルスロスピラ・プラテンシス（スピルリナ）、スピルリナ・マキシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｘｉｍａ）、シネココッカス・エロンガトゥス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）などの藍藻類、またはガルディエリア・スルフラリア、シアニディウム・カルダリウム、シアニディオシゾン・メロラエなどのイデユコゴメ綱の群から選択される。

好ましくは、フィコビリタンパク質は、酸ｐＨ耐性フィコシアニンである。酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質または酸ｐＨ耐性フィコシアニンは、酸ｐＨで沈殿に耐えるフィコビリタンパク質として定義される。本発明によれば、酸ｐＨは、７未満、有利には６以下のｐＨを意味する。有利には、酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質は、６未満のｐＨレベルでは水溶液中に沈殿しない。このタンパク質は、酸ｐＨで耐性または安定であると言い表すこともできる。

当然ながら、本発明による精製フィコビリタンパク質は、考慮された酸ｐＨに応じて多かれ少なかれ安定であろう。約６のｐＨ値範囲で安定するものもあれば、６を大きく下回るｐＨ値で安定するものもある。結果として、酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質は、フィコビリタンパク質の混合物としても定義され、その大部分は７未満、有利には６以下のｐＨで沈殿しない。

有利には、本発明は、ｐＨが５未満、優先的には４以下、より優先的には４～２の範囲、さらに優先的には３．５以下で安定なフィコビリタンパク質に関する。

そのような酸ｐＨ耐性フィコシアニンは、当業者に知られており、特にＷＯ２０１６／０９９２６１またはＷＯ２０１７／０５０９１８の出願に記載されている。特に、これらは、特にシアニディオシゾン・メロラエ １０Ｄ種、シアニディオシゾン・メロラエ ＤＢＶ２０１種、シアニジウム・カルダリウム種、シアニジウム・ダエダルム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｄａｅｄａｌｕｍ）種、シアニジウム・マキシマム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｍａｘｉｍｕｍ）種、シアニジウム・パルチツム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｐａｒｔｉｔｕｍ）種、シアニジウム・ルンペンス（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｒｕｍｐｅｎｓ）種、ガルディエリア・ダエダラ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｄａｅｄａｌａ）種、ガルディエリア・マキシマ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）種、ガルディエリア・パルチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）種、ガルディエリア・スルフラリア種から選択されるシアニディオシゾン属、シアニジウム属またはガルディエリア属の微細藻類株、特にガルディエリア・スルフラリア、シアニジウム・カルダリウムおよびシアニディオシゾン・メロラエの菌株によって産生されたフィコシアニンである。

これらのフィコシアニンは、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の混合物である。

有利には、Ｃ－ＰＣのアポタンパク質は、配列番号１または配列番号２のタンパク質またはその変異体を含む。特に、Ｃ－ＰＣのαサブユニットのアポタンパク質は、配列番号１のタンパク質を含み、Ｃ－ＰＣのβサブユニットのアポタンパク質は、配列番号２のタンパク質またはその変異体を含む：

有利にはまた、前記ＡＰＣのαサブユニットは、配列番号３またはその変異体を含み、前記ＡＰＣのβサブユニットのアポタンパク質は、配列番号４またはその変異体を含む：

同じフィコシアニン源からのＣ－ＰＣおよびＡＰＣのアポタンパク質は、一般的に、異なる等電点を有している。ｐＨを下げることによって、Ｃ－ＰＣをＡＰＣから少なくとも部分的に分離することが可能になる。

実際、本発明者らは、粗抽出物のｐＨをより低く調整するほど、得られたＣ－ＰＣがより純粋になることを見出した。

有利には、フィコビリタンパク質が酸ｐＨ耐性フィコシアニンである場合、ｐＨをＡＰＣの等電点よりも下げると、少なくとも５、優先的には少なくとも１０、より優先的には少なくとも１５のモル比を有するＣ－ＰＣ／ＡＰＣ混合物を含むフィコシアニンが生じる。

好ましくは、工程ａ）における粗抽出物のｐＨは、５未満のｐＨに調整される。したがって、５モル％未満、優先的には１モル％未満、より優先的には０．１モル％未満のＡＰＣを含む酸ｐＨ耐性フィコシアニンを得ることが可能であり、ここで、パーセンテージはＡＰＣとＣ－ＰＣの合計に対する割合を表す。

工程ａ）では、ｐＨ調整は、固体または溶液の形態の強いまたは弱い鉱酸または有機酸を添加することによって行われ、ここで、添加される酸の量は、処理すべき粗抽出物のｐＨおよび当業者が得ようと努めるｐＨ値によって決定される。当業者に周知の鉱酸の中でも、塩酸およびリン酸を特に挙げることができる。当業者に周知の有機酸の中でも、酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、好ましくはクエン酸を特に挙げることができる。また、ロスマリン酸、タンニン酸、二没食子酸、カシ属タンニン酸、ガロタンニン酸などの酸性ポリフェノール、ケルセチン、エラギタンニン、カスタラギン、カスタリン、カスアリクチン、グランジニン、プニカリギン、プニカリン、ロブリンＡ、テリマグランジンＩＩ、テルフラビンＢ、ベスカラギン、ペズンクラギン、カジュアリニン、カストリン、ベスカリンなどの酸性タンニン、好ましくはタンニン酸も挙げることができる。好ましくは、使用される酸は、食品での使用が認可されている酸、特にリン酸、クエン酸またはタンニン酸である。

酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を含む上清を回収する工程ｂ）については、特にセラミック膜またはポリエーテルスルホン中空糸膜などの有機膜でのタンジェンシャル濾過による、当業者に知られている任意の分離方法を使用することができる。これらのフィルターのカットオフは、標的フィコビリタンパク質よりも分子量の大きいまたは小さい分子を分離するために選択することができる。

本発明の特定の実施形態によれば、工程ｂ）における分離は、タンジェンシャル濾過によって行われる。この工程では、フィコビリタンパク質以外のタンパク質の一部が濃縮および除去され、ひいては最終産物の純度レベルが高められる。

上清から酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質を乾燥／脱水する工程ｃ）は、溶媒、この場合は水を除去する任意の方法によって、例えば大気圧または真空下での蒸発によって行われる。霧化、凍結乾燥、ゼオライトを用いた水和(zeodratation)、赤外線乾燥、または屈折窓乾燥を特に挙げることができる。

加熱による蒸発の場合、当業者は、フィコビリタンパク質の変性を引き起こす可能性がある過度に高い温度を使用しないように注意する必要がある。

工程ｂ）で上清を回収した後、沈殿物に含まれるフィコビリタンパク質を再利用することが可能である。これを行うために、残留フィコビリタンパク質を約６以下の酸ｐＨの水溶液に可溶化し、このｐＨでは、フィコビリタンパク質は可溶性でありながら不純物は不溶性のままである。

次いで、これらの残留フィコビリタンパク質は不純物から分離され、方法の工程ｂ）とｃ）を繰り返すことによって単離される。これは必要な回数だけ繰り返すことができる反復プロセスである。本発明による方法に使用される条件がＣ－ＰＣの優先的な精製を可能にする場合、残留フィコビリタンパク質は、ＡＰＣに富んだＣ－ＰＣ／ＡＰＣ混合物である。

沈殿物を再利用することによって、モル比が５未満、特に４未満、有利には３～０．１の範囲のＣ－ＰＣ／ＡＰＣ混合物を含むフィコビリタンパク質が得られる。

上記方法の工程ａ）～ｃ）を繰り返すことによって、反復プロセスにより、Ｃ－ＰＣの沈殿物を排出することが可能であり、この沈殿物を、前もって得られた画分に添加して、その内容物を富化し、ＡＰＣにおけるフィコビリタンパク質の残留混合物を、少なくとも５、優先的には少なくとも１０、より優先的には少なくとも１５のＡＰＣ／Ｃ－ＰＣ比で富化することもできる。

これにより、５モル％未満、好ましくは１モル％未満、より優先的には０．１モル％未満のＣＰＣを含むＡＰＣ混合物を得ることが可能であり、ここで、パーセンテージはＡＰＣとＣ－ＰＣの合計に対する割合を表す。

次いで、沈殿物から単離されたこれらのＡＰＣは、例えばこれらの蛍光特性のために医用イメージングの分野で使用することができるアロフィコシアニンの産生のために当業者に周知の分取クロマトグラフィー技法によってさらに精製することができる。

本発明はまた、精製プロセスによって得ることができる酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質、特にフィコシアニンに関する。

本発明はまた、モル比が少なくとも２であるＣ－ＰＣ／ＡＰＣ混合物を含む、精製された酸ｐＨ耐性フィコシアニンに関する。

特に、本発明は、少なくとも９５モル％のＣ－ＰＣと５モル％未満のＡＰＣ、優先的には少なくとも９９モル％のＣ－ＰＣと１モル％未満のＡＰＣを含む酸ｐＨ耐性フィコシアニンに関し、ここで、パーセンテージはＡＰＣとＣ－ＰＣの合計に対する割合を表す。

これらのＣ－ＰＣは当業者に知られており、特に上記で定義されており、特にＣ－ＰＣのαサブユニットが配列番号１のタンパク質を含み、Ｃ－ＰＣのβサブユニットのアポタンパク質が配列番号２のタンパク質またはその変異体を含むものである。

有利には、本発明による変異体は、Ｃ－ＰＣのαサブユニットに対して少なくとも８３％とＣ－ＰＣのβサブユニットに対して少なくとも８２％の配列同一性を有している。

優先的には、本発明による変異体は、α（配列番号１）およびβ（配列番号２）サブユニットに対して少なくとも９０％の同一性を有している。

本発明はまた、本発明による方法によって得られるＡＰＣに富んだ精製フィコシアニンに関する。

特に、本発明は、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比が５未満、特に４、有利には３～０．１の範囲であるＡＰＣに富んだ混合物を含む精製フィコシアニンに関する。

本発明の特定の実施形態によれば、ＡＰＣに富んだ混合物は、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５のＡＰＣ／Ｃ－ＰＣ比を有している。

本発明のより具体的な実施形態によれば、フィコシアニンは本質的にＡＰＣからなり、少なくとも９５モル％のＡＰＣと５モル％未満のＣ－ＰＣ、好ましくは少なくとも９９モル％のＡＰＣと１モル％未満のＣ－ＰＣを含み、ここで、パーセンテージはＡＰＣとＣ－ＰＣの合計に対する割合を表す。

これらのＡＰＣは当業者に知られており、特に上記で定義されており、特に前記ＡＰＣのαサブユニットが配列番号３またはその変異体を含み、前記ＡＰＣのβサブユニットのアポタンパク質が配列番号４またはその変異体を含むものである。

有利には、本発明による変異体は、ＡＰＣのαサブユニットに対して少なくとも８３％とＡＰＣのβサブユニットに対して少なくとも８２％の配列同一性を有している。

当業者には、自由に使用することができる通常の方法、特にＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用してタンパク質配列の同一性を測定する方法は知られている。

同様に、当業者には、酸ｐＨでの単純な安定性試験により、前記配列の変異体を同定し、それらが同じ構造特性を保持していることを検証する方法は知られおり、例えばＷＯ２０１７／０５０９１８の出願の例３に示される試験などの試験を実施することによって行う。

ポリペプチドは、その機能を実質的に改変することなく、少なくとも１個のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失によって改変することができることは当業者には知られている。

例えば、所定の位置における化学的に等価な別のアミノ酸とのアミノ酸の置換は、タンパク質の特性に実質的に影響を与えない配列変異の既知の例である。

これらの「保存的」置換は、次のアミノ酸基の中での交換として定義することができる：
－ Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
－ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
－ Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
－ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓおよび
－ Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ

したがって、本発明によるフィコシアニンおよび／またはアロフィコシアニンのアポタンパク質の変異体は、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上述の相同性／同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、特にフィコシアニンのαおよび／またはβサブユニットに関して、対応するいわゆる参照配列と比較して数が異なる１～３０個のアミノ酸を含み得る。

より正確には、本発明によれば、
－ 置換、挿入および／または欠失から生じる、本発明による酸性組成物において使用可能なフィコシアニンのαサブユニットのアポタンパク質の変異体の場合、該変異体は、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上述の同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、対応するいわゆる参照配列とは異なる１～２７個のアミノ酸を含み得る；
－ 置換、挿入および／または欠失から生じる、本発明による酸性組成物において使用可能なフィコシアニンのβサブユニットのアポタンパク質の変異体の場合、該変異体は、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上述の同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、対応するいわゆる参照配列とは異なる１～３０個のアミノ酸を含み得る；
－ 置換、挿入および／または欠失から生じる、本発明による酸性組成物において使用可能なアロフィコシアニンのαサブユニットのアポタンパク質の変異体の場合、該変異体は、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上述の同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、対応するいわゆる参照配列とは異なる１～２４個のアミノ酸を含み得る；
－ 置換、挿入および／または欠失から生じる、本発明による酸性組成物において使用可能なアロフィコシアニンのβサブユニットのアポタンパク質の変異体の場合、該変異体は、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上述の同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、対応するいわゆる参照配列とは異なる１～２０個のアミノ酸を含み得る。

特に本発明によれば、および考慮された参照配列（フィコシアニンのαおよび／もしくはβサブユニットならびに／またはアロフィコシアニンのαおよび／もしくはβサブユニット）のいかんを問わず、前記サブユニットの変異体は、有利には、得られた変異体が参照タンパク質の特性および上記の同一性のパーセンテージを保持しているという条件で、対応するいわゆる参照配列と比較して１～１５個の異なるアミノ酸、好ましくは１～１０個の異なるアミノ酸、特に１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０個の異なるアミノ酸を含み得る。

好ましくは、本発明は、サブユニットαタンパク質が配列番号１のタンパク質からなり、βサブユニットタンパク質が配列番号２のタンパク質からなるＣ－ＰＣに関する。

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、サブユニットαタンパク質が配列番号３のタンパク質からなり、サブユニットβタンパク質が配列番号４のタンパク質からなるＡＰＣに関する。

フィコビリタンパク質は、主に食品の着色に使用される天然色素である。

本発明はまた、本発明による方法によって得られた酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質、特に食品中の色素として上で定義された酸ｐＨ耐性フィコシアニンの使用に関する。

本発明はまた、本発明による方法によって得られた酸ｐＨ耐性フィコビリタンパク質、特に上で定義された酸ｐＨ耐性フィコシアニンを含む組成物、特に食品組成物に関する。

そのような使用およびそのような組成物は、当業者に知られている。

優先的には、ＷＯ２０１７／０５０９１８の出願に定義されるように、食品または食品組成物は酸性組成物である。

本発明によれば、酸性組成物は、鉱酸または有機酸とフィコシアニンを含む任意の組成物として定義される。この組成物は、酸ｐＨを有する液体、流体または粘性、ペースト状または固体であってよく、その中に酸ｐＨ耐性フィコシアニンが組み込まれている。

水性液体組成物の場合、ｐＨは通常どおり測定される。非水性液体組成物またはペースト状または固体組成物の場合、無機酸または有機酸とフィコシアニンを含む可溶性化合物を溶解するのに十分な量の水に該組成物を溶解した後にｐＨが測定される。

有利には、本発明による組成物は、任意にゲルの形態の水性液体組成物、または水溶液もしくは水を含む固体またはペースト状組成物に溶解することを意図したペースト状または固体組成物である。本発明の別の有利な実施形態によれば、酸性組成物は、湿潤環境で使用および／または保存されることを意図したペースト状または固体組成物である。

本発明による組成物中に使用することができる鉱酸または有機酸は、当業者に周知である。鉱酸の中でも、炭酸、リン酸、塩酸、硫酸、過塩素酸、スルホン酸および硝酸を特に挙げることができる。有機酸の中でも、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、特にクエン酸を特に挙げることができる。

本発明によれば、酸性食品組成物とは、上記の定義に含まれる、ヒトまたは動物による摂取を意図した任意の組成物を意味する。栄養補助食品の酸性組成物は、本発明の意味における酸性食品組成物の定義に含まれるものとみなされなければならない。

本発明による酸性食品組成物は、当業者に周知である。この組成物は、その栄養素の寄与またはヒトもしくは動物の健康に有益な特性のために特定された活性化合物に関連する構造成分を含み得る賦形剤を含み得る。本発明による酸性食品組成物は、食品改良剤(texturizing agents)、香味剤、防腐剤などの食品添加剤も含んでいてよく、これらの添加剤はすべて当業者に周知である。賦形剤は、水および／またはタンパク質および／または脂肪および／または繊維および／または糖を含み得る。賦形剤の成分は構造的な特性しか有しないが、それらは一般的に栄養素を寄与することで知られている。

本発明による酸性食品組成物は、すぐに使用できるか、または摂取可能な食品を調製するために固体、ペースト状または液体調製物に添加される食品添加剤の形態であってもよい。

食品組成物の場合、酸は、承認された食物酸性化剤、特に炭酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸および乳酸、より具体的にはクエン酸のリストから選択されることが好ましい。

本発明による食品組成物以外の酸性組成物に関して、それらは、とりわけ、医薬品、動物用医薬品または化粧品用であってよく、このタイプの組成物において既知で使用される任意の添加剤および／または活性薬剤をさらに含み得る。

本発明による固体、液体またはペースト状の酸性組成物において、フィコシアニンは、例えば、粉末形態で組み込まれ得る。前記酸性組成物、特に前記酸性食品組成物は、クリーム、ゲル、フォーム、ペーストなどの任意の既知の通常の形態であり得る。特に固体食品組成物の場合、ケーキまたはビスケット、乾燥調理食品、希釈される粉末、固体または「ゼリー」ゼラチン様組成物、フォームなどを特に挙げることができる。

本発明によれば、前記液体酸性組成物は、フィコシアニンが溶解されている水性組成物であってもよい。この組成物は、すぐに使用できる組成物の形態、または特に摂取のために希釈される液体濃縮物もしくはその調製もしくは摂取のために固体食品に添加される液体濃縮物、例えば液体コーティング濃縮物もしくはケーキの上に置かれて着色を付与する「トッピング」組成物であってもよい。これらの濃縮組成物の中でも、任意にアルコールを含むシロップを挙げることができる。

本発明による液体酸性組成物は、可変粘度であってもよく、増粘剤、ゲル化剤、および当業者に既知で液体食品組成物の調製に慣用の他の構造化添加剤などの添加剤を含んでも含んでいなくてもよい。

本発明の特定の実施形態によれば、液体食品組成物は、任意に炭酸化された酸性飲料であってもよい。これらには、ソーダ、ジュース、スポーツ飲料、スポーツ飲料、フィットネス飲料、回復飲料などが含まれ得る。これらの飲料の組成は、当業者に周知であり、特に、糖、ミネラル塩、食品添加剤、溶存ガスなどを含み得る。本発明による飲料は、通常使用される色素の全体または一部が、本発明による酸ｐＨ耐性フィコシアニンで置き換えられている通常の酸性飲料である。

本発明によれば、本発明による組成物中のフィコシアニン含有量は、当業者の慣行に従ったものとすることができる。

例えば、フィコシアニンが酸性組成物を着色するために使用される場合、前記組成物中のフィコシアニン含有量は、着色に関する当業者の慣行に従ったものとすることができる。

本発明において定義される液体酸組成物において、フィコシアニン含有量は、２．５ｍｇ／Ｌから２５００ｍｇ／Ｌの間、優先的には２５ｍｇ／Ｌから３００ｍｇ／Ｌの間であり得る。

すぐに使用することができる液体飲料組成物において、フィコシアニン含有量は、一般的に２５ｍｇ／Ｌから３００ｍｇ／Ｌの間、好ましくは５０ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌの間であり得る。

シロップなどの使用のために希釈される濃縮液体組成物において、フィコシアニン含有量は、一般的２５０ｍｇ／ｌから２５００ｍｇ／ｌの間、優先的には５００ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌの間であり得る。

固体組成物において、フィコシアニン含有量は、一般的に０．０１ｍｇ／ｇから１０ｍｇ／ｇの間、優先的には０．１ｍｇ／ｇから５．０ｍｇ／ｇの間、非常に優先的には０．２５ｍｇ／ｇから２．５ｍｇ／ｇの間であり得る。

実施例１．新鮮な細胞での酸性沈殿による精製
遠心分離し、等量の水ですすいだガルディエリア・スルフラリア細胞の発酵マストを、ｐＨ６の水相でフィコビリタンパク質を放出するために機械的に粉砕する。粉砕した材料を、クエン酸の添加によって０．５ｐＨ単位の刻みで酸性化する。各レベルで、混合物のサンプルを採取し、次いで１１，０００ｇで１０分間遠心分離する。フィコビリタンパク質を含む上清を収集し、分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｌｔｒａ Ｓｐｅｃ ２１００ Ｐｒｏ）を使用して６１８ｎｍの吸光度対２８０ｎｍの吸光度の比を測定することによって純度指数を測定する。

ｐＨが低いほど、純度指数が高くなることは明らかである（図１）。純度指数のこの増加は、上清中の混在タンパク質の減少を反映しているが、Ｃ－ＰＣは主に上清中に残留している。酸ｐＨに対する耐性により、上清中のＣ－ＰＣ含有量の実質的な損失はない（図２）。驚くべきことに、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）は５未満のｐＨ値で上清から完全に消失し、他の沈殿したタンパク質と細胞片を含むペレットになる（図３）。このペレットにはＣ－ＰＣとＡＰＣも含まれており、ＡＰＣの含有量が高い（図３）。

酸性化の結果、液相と固相の分離が改善され、細胞片とタンパク質のペレットがより緻密化され、水相から分離しやすくなる。

実施例２．凍結乾燥および再水和された細胞での酸性沈殿による精製
遠心分離し、等量の水ですすいだガルディエリア・スルフラリア細胞の発酵マストを、ｐＨ６の水相でフィコビリタンパク質を放出するために機械的に粉砕する。粉砕した材料を、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥した乾燥物質を、マストの初期体積に相当する量の水に懸濁し、クエン酸の添加によって０．５ｐＨ単位の刻みで酸性化する。各レベルで、混合物のサンプルを採取し、次いで１１，０００ｇで１０分間遠心分離する。フィコビリタンパク質を含む上清を収集し、分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕｌｔｒａ Ｓｐｅｃ ２１００ Ｐｒｏ）を使用して６１８ｎｍの吸光度対２８０ｎｍの吸光度の比を測定することによって純度指数を測定する。

実施例１で前述したように、ｐＨの低下と相関する純度指数の増加を確認することができる（図４）。この場合も、酸性化の結果、液相と固相の分離が改善され、細胞片とタンパク質のペレットがより緻密化され、水相から分離しやすくなる。実施例１で観察されたものと同様に、５未満のｐＨ値の場合、ＡＰＣは水相にではなくペレット中に見出される（図５）。ｐＨ値が６から５の間の場合、ｐＨが低下すると、上清のＡＰＣの量が減少する。

実施例３．タンジェンシャル濾過によるＣ－ＰＣの精製および濃縮
酸性沈殿および遠心分離後の粗抽出物を、中空糸膜タンジェンシャル濾過モジュールで濾過する。このメッシュを介した濾過はＣ－ＰＣ以外のタンパク質の一部を除去し、ひいては純度指数を増加させる（図６）。この方法によって達成することができる純度指数は、二相抽出、または硫酸アンモニウムによる沈殿、またはさらにクロマトグラフィー法を含む、はるかに複雑な方法によって通常得られる値に近似する（Ｓｏｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｒｕｚ ｄｅ Ｊｅｓｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。精製プロセスと並行して、この濾過工程はＣ－ＰＣ抽出物から水を除去し（図７）、その後の生成物の乾燥を促進する。

参考文献

－ ＷＯ２００５／０６５６９７、ＷＯ２０１５／０９０６９７、ＷＯ２０１６／０９９２６１、ＷＯ２０１７／０５０９１７、ＷＯ２０１７／０５０９１８および２０１６年１１月３０日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７９３２５

Claims (12)

1. シアニディオスキゾン、シアニジウムまたはガルディエリア属のフィコシアニン産生微生物の細胞からの酸ｐＨ耐性フィコシアニンの粗抽出物から、酸ｐＨ耐性フィコシアニンを精製する方法であって、
   前記酸ｐＨ耐性フィコシアニンが、４～２の範囲のｐＨで安定であり、
   前記酸ｐＨ耐性フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は少なくとも５であり、
   当該方法が、
   ａ）前記酸ｐＨ耐性フィコシアニンの粗抽出物のｐＨを５未満のｐＨに調整して、前記酸ｐＨ耐性フィコシアニン以外の有機物を沈殿させ、上清およびペレットを得る工程と、
   ｂ）工程ａ）で得られた、酸ｐＨ耐性フィコシアニンを含む上清を回収する工程と、
   ｃ）前記上清から酸ｐＨ耐性フィコシアニンを分離する工程と
   を含んでなることを特徴とする、方法。
2. 工程ａ）において、前記酸ｐＨ耐性フィコシアニンの粗抽出物のｐＨを、４未満のｐＨに調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）において、前記酸ｐＨ耐性フィコシアニンの粗抽出物のｐＨを、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）の等電点未満に調整することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程ｃ）により分離された酸ｐＨ耐性フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の混合物を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は少なくとも１０である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ｃ）により分離された酸ｐＨ耐性フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の混合物を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は少なくとも１５である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程ｃ）により分離された酸ｐＨ耐性フィコシアニンが、９５％超の酸ｐＨ耐性Ｃ－ＰＣと５％未満のＡＰＣを含み、ここで、パーセンテージはＡＰＣとＣ－ＰＣの合計に対する割合を表す、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記フィコシアニン産生微生物が、ガルディエリア・スルフラリアの菌株である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ペレットに含まれる残留酸ｐＨ耐性フィコシアニンを酸ｐＨの水溶液に可溶化し、不純物から分離し、工程ｂ）とｃ）を繰り返すことによって単離する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、前記残留酸ｐＨ耐性フィコシアニンが４～２の範囲のｐＨで安定である、方法。
9. 前記水溶液のｐＨが６以下である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ペレットに含まれる前記フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は５未満である、請求項８または９に記載の方法。
11. 前記ペレットに含まれる前記フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は４未満である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ペレットに含まれる前記フィコシアニンが、ｃ－フィコシアニン（Ｃ－ＰＣ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含み、ここで、Ｃ－ＰＣ／ＡＰＣモル比は３～０．１である、請求項１１に記載の方法。

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