JP7695246B2

JP7695246B2 - アルツハイマー病の治療のための化合物

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Publication number: JP7695246B2
Application number: JP2022535567A
Authority: JP
Inventors: ヘニング，ロベルト・ヘンク; ファン・デル・フラーフ，アドリアヌス・コルネリス; クレンニング，ヒード; スワルト，ダニエル・ヘンリ; デ・フェイ・メストダフ，クリスティナ・フランソワーズ; フォーゲラー，ピーテル・コルネリス
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Sulfateq BV
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Sulfateq BV
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2025-06-18
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: NL2024431B1; ZA202206837B; IL293758A; KR20220119032A; JP2023506480A; EP4072550A1; MX2022007227A; BR112022011344A2; GEAP202516676A; CL2022001520A1; PH12022551418A1; JOP20220140A1; AU2020400823A1; WO2021118359A1; CA3164071A1; US20230052152A1

Description

本発明は、アルツハイマー病の治療のための化合物に関する。本発明はさらに、記憶機能を改善するためのクロマノール化合物およびその誘導体に関する。

アルツハイマー病は、進行性の神経変性疾患であり、高齢者の認知症の主な原因である。

ＥＰ２９９４１６０Ｂ１は、中等度のアルツハイマー病を患っている、かつ／またはＡｐｏＥ４対立遺伝子を保有している患者において、プールされた免疫グロブリンＧの投与によるアルツハイマー病の治療のための方法を開示している。

ＥＰ２８９２５６３Ｂ１は、アセチルコリンエステラーゼ治療の補助療法としてのアルツハイマー病を治療する方法であって、有効１日用量のＮ－（２－（６－フルオロ－１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－３－（２，２，３，３－テトラフルオロプロプロポキシ）ベンジルアミンまたは薬学的に許容される塩を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含み、患者に投与される有効１日用量が約３０～約６０ｍｇである、方法を記載している。

ＥＰ２９３７０８５Ｂ１は、６－［４－（１－シクロヘキシル－１－Ｈ－テトラゾール－５５－イル）ブトキシ］－３，４－ジヒドロカルボスチリル（シロスタゾール）またはその塩、およびドネペジルまたはその塩の組み合わせを記載しており、アルツハイマー病を治療するための相乗作用を示している。

ＷＯ２００２／０４３６６６は、抗酸化剤の使用が精神的悪化を予防または低減できることを予言的に示唆している。抗酸化物質は、確かにミトコンドリアの酸化負荷を下げる可能性があるが、アルツハイマー病の治療における明確な効果は見出されない。

Ｃａｉｅｔａｌ．は、ＡＣＳＣｈｅｍｉｃａｌＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）８：２４９６－２５１１において、アルツハイマー病の治療に使用することを提案された、トロロクス部分で置換されたドネペジルに基づく薬剤について説明している。いくつかのインビトロ試験は、アルツハイマー病のいくつかのバイオマーカーのいくつかの活性を示唆している。

アミロイドベータ（ＡβまたはＡベータ）は、アルツハイマー病の人々の脳に見出されるアミロイド斑の主成分である３６～４３アミノ酸のペプチドを意味する。

ペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来し、ベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼによって切断されてＡβを生成する。Ａβ分子は凝集して、いくつかの形態で存在し得る柔軟な可溶性オリゴマーを形成することができる。現在、特定の誤って折りたたまれたオリゴマー（「シード」として知られている）は、他のＡβ分子も誤って折りたたまれたオリゴマー形態をとるように誘導し、連鎖反応を引き起こしてプラーク形成をもたらすと考えられている。可溶性オリゴマーは、神経細胞に対して毒性があり、プラークは、可溶性オリゴマーから形成される。

アルツハイマー病およびミトコンドリアの機能および健康の悪化に関係がある関連疾患の治療のための新たしい化合物、特にそのような化合物の投与範囲内で副作用が少ないか、または好ましくは全く副作用がない化合物の必要性が依然としてある。

本発明の目的は、アルツハイマー病の治療のための化合物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、記憶機能を改善するための化合物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病を経験している患者におけるベータプラーク負荷の発生を低減させるための化合物を提供することである。

欧州特許第２８９２５６３号明細書欧州特許第２９３７０８５号明細書国際公開第２００２／０４３６６６号

Ｃａｉｅｔａｌ．は、ＡＣＳＣｈｅｍｉｃａｌＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）８：２４９６－２５１１

上記の目的のうちの１つ以上は、前述の処置のうちの１つ以上に特定のクロマノール、キノンまたはヒドロキノン化合物を提供することによって満たされる。

上記の目的は、アルツハイマー病の治療に使用するため、記憶機能を改善するため、かつ／またはアルツハイマー病患者におけるプラーク負荷を低減させるための式（Ｉ）、（ＩＩ）による化合物、式（ＩＩ）のヒドロキノン類似体、またはそれらの薬学的に許容される塩であって、

式中、Ｒ１は、水素または生体組織において除去され得るプロドラッグ部分を表し、
Ｒ２およびＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１～４個のＮ、Ｏ、もしくはＳ原子を有する、飽和もしくは不飽和の、非芳香族の、任意選択で置換された５～８員環を形成し、Ｒ２およびＲ３は一緒に、３～１２個の炭素原子を含むか、
またはＲ２は、水素原子、もしくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３は、窒素もしくは酸素で任意選択で置換されたアルキル基であり、アルキル基は、３～１２個の炭素原子を含み、Ｒ３におけるアルキル基は、１つ以上の非芳香族環状構造を含み、直鎖状および／もしくは分枝状基、ならびに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る、化合物、ヒドロキノン類似体、またはそれらの薬学的に許容される塩を提供することにより本明細書によって満たされる。

本発明の場合、式（ＩＩ）による化合物は、水素化キノン（すなわち、ヒドロキノン）類似体を含むが、安定性の観点からキノン誘導体が好ましい。

好ましい実施形態では、窒素は、アミン、四級アミン、グアニジンもしくはイミンであり得、酸素は、ヒドロキシル、カルボニルもしくはカルボン酸であり、かつ／または酸素および窒素が一緒になって、アミド、尿素、もしくはカルバメート基を形成し得る。

好ましい実施形態では、式（Ｉ）におけるＲ１は水素であるか、または６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成する。

式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるいずれかの化合物の好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、追加のＮ原子を組み入れた飽和環を形成し、この環は、非置換であるか、またはアルコール、もしくはエチロール（ｅｔｈｙｌｏｌ）などの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換されている。

別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、４～７個の炭素原子を有し、かつ、１個の窒素原子を有する飽和環状構造を含み、この環は、非置換であるか、またはアルコール、もしくはエチロールなどの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換されている。

さらに別の好ましい実施形態によれば、化合物は、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）、または（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）のいずれかである。

最も好ましい実施形態では、化合物は、ＳＵＬ－１０９のＳ－エナンチオマー、すなわち、Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１３８）である。

本発明による好ましい実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるかのいずれかの化合物は、５００Ｄａ未満の分子量を有する。

そのため、例えば、ＷＯ２０１４／０９８５８６、ＷＯ２０１４／０１１０４７、およびＷＯ２０１７／０６０４３２において、トロロクス誘導体が記載されている。しかしながら、記憶機能およびプラーク形成は、調査されておらず、アルツハイマー病の治療に直接関連する別の種類のインビボまたはインビトロ試験も行われていない。

ＷＯ２０１９／１０１８２６は、トロロクス部分を含むいくつかの化合物がＭＰＧＥＳ阻害剤として作用し得ることを示唆しており、これは炎症性疾患の治療に有利であることが示唆されている。ＷＯ２０１９／１０１８２６は、アルツハイマー病がＭＰＧＥＳを介して作用し得ることを示唆しているが、本発明者らの研究では、野生型マウス対ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて発現に差異は見出されず、ＭＰＧＥＳがアルツハイマー病に関連していないことを示している。

アミロイド－βの重合によって引き起こされる記憶機能およびプラーク形成は、アルツハイマー病の主な問題と考えられている。一部の抗酸化物質が、根底にある酸化メカニズムを低減させる可能性があるという事実にもかかわらず、実際に記憶機能を改善できるという証拠は提供されていない。現在の調査結果は、特定のトロロクス誘導体がアルツハイマー病を治療するための有用な新しい治療選択肢になり得ることを示している。

慢性的ＳＵＬ－１３８処置が、ＷＴマウスおよびＡＰＰマウスの記憶力（凍結％）をどのように増加させるかを示している。ＳＵＬ－１３８が、ＷＴマウスおよびＡＰＰマウスの両方でＬＴＰの維持をどのように増加させるかを示している。ＳＵＬ－１３８処置がＡＰＰ／ＰＳ１マウスのプラーク数およびサイズを低減させることを示している。

上記の目的のうちの１つ以上は、アルツハイマー病の治療に使用するため、もしくは記憶機能を改善するため、かつ／もしくはアルツハイマー病を経験している患者においてプラーク負荷を低減させるための、上に示す式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）による化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供することによって本発明によって満たされる。

好ましくは、記憶機能が改善される一方で、プラーク形成も低減し、それにより、アルツハイマー病の治療のさらなる改善が可能になる。

記憶機能の改善が医療とみなされない限り、本発明はまた、哺乳動物における記憶機能の改善のために定義された化合物の使用を提供する。哺乳動物は、好ましくはヒトである。

Ｒ１は、人体で容易に除去される置換基であり得、したがって化合物はプロドラッグである。Ｒ１は、例えば、アミノ酸誘導体またはエステル誘導体であり得、一般に、１００ダルトン未満の分子量を有する。

好ましい実施形態では、式（Ｉ）のＲ１は水素であるか、または６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成する。エステルは、１つ以上のエーテルまたはアルコール基を含むことができる。適切なエステルは、酢酸エステル、酪酸エステル、３－ヒドロキシ酪酸エステルなどである。

式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるいずれかの化合物の好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、３～６個の炭素原子を有し、１つの追加のＮ原子を組み入れた飽和環を形成し、これは、酸素、カルボン酸またはアミン基を含み得る１～４個の炭素原子で置換され得る。

より好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を形成し、この環は、メチル、エチル、またはアルコール置換メチルもしくはエチルで任意選択で置換される。

別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、３～６個の炭素原子を有し１個の窒素原子を有する環状構造を含む。

より好ましくは、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を含み、この環は、アミド窒素に結合し、メチル、エチル、またはアルコール置換メチルもしくはエチルで任意選択で置換される。

いずれの場合も、環（Ｒ２およびＲ３、またはＲ３のみで形成される環状構造）は、非置換であり得、または１～４個の炭素原子を有するアルキル、アルコール、もしくはエチロールなどの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換され得る。

特定のクロマノール化合物は、ＷＯ２０１４／０９８５８６に記載されている。詳細に説明されている化合物には、ＳＵＬ－ＸＸＸ（ＸＸＸは２桁または３桁の数字）を指す略語がある。これらの化合物の多くは、ラセミ混合物であるが、一部のエナンチオマーも試験されている。本発明によるクロマノール化合物を調製するための適切な方法は、ＷＯ２０１４／０９８５８６またはＷＯ２０１４／０１１０４７に記載されている。

ＷＯ２０１７０６０４３２Ａ１は、２－ヒドロキシ－２－メチル－４－（３，５，６－トリメチル－１，４－ベンゾキノン－２－イル）－ブタン酸のアミド誘導体およびそのような化合物を作製する方法を開示している。

水素化キノン誘導体は、キノン構造の水素化によって容易に調製することができる。

さらに別の好ましい実施形態によれば、化合物は、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）、または（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）のいずれかである。

薬学的に許容される塩中の対イオンは、当技術分野で知られている対イオンであり得る。好ましくは、化合物は、プロトン化することができる少なくとも１つの塩基性窒素、アミンを有する。対イオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩などのハロゲン、最も好ましくは塩化物である。

これらの化合物は、ラセミ混合物として、または実質的に純粋なエナンチオマー形態で有効である。化合物は、１つ以上のキラル中心、一般的に１つまたは２つを有する。

好ましくは、化合物は、実質的に鏡像異性的に純粋な化合物である。実質的に鏡像異性的に純粋なものは、約９５％以上の鏡像体過剰率、より好ましくは約９８％の鏡像体過剰率、最も好ましくは約９９％以上の鏡像体過剰率である。また、化合物に複数のキラル中心が含まれている場合は、これらの量が適用される。

化合物は、記憶機能の改善を達成するため、かつ／またはアルツハイマー病の治療を達成するために、有効量で使用されることが好ましい。

「治療」という用語は、疾患の進行の低減および／または疾患の症状の改善を包含する。

効果は、一般的に体液中の約１μＭの量で観察されるが、より多くの量が使用されることが好ましい。好ましい量は、約１０μＭ以上、より好ましくは約２０μＭ以上のインビボまたはインビトロの濃度である。一般的に、ヒトにおける濃度は、約２００μＭ以下で十分かつ安全である。

ヒトが使用する場合、これは、３０Ｌの分布容積、１００％の有効性、および約１μＭの濃度を想定すると、約１０ｍｇ以上の投与量を意味する。好ましい量は、約１０μＭの濃度をもたらし、そのためには、約１００ｍｇ以上の投与量が適切であろう。したがって、好ましくは、約２０ｍｇ以上、好ましくは５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上の剤形が適切である。一般的に、固形、経口剤形は、賦形剤を可能にするために、最大で約５００ｍｇの化合物、好ましくは約４５０ｍｇ以下を含む。静注、他の液体投与形態によって、より多くの量を投与することができる。

使用できる投与量の例は、有効量の本発明の化合物の０．２ｍｇ／ｋｇ以上の投与量であり、例えば、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、または約２ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、または約３ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、または約４ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。本発明の化合物は、１日１回の用量で投与することができ、または総１日投与量は、１日２、３または４回の分割投与で投与することができる。

本明細書に記載の化合物は、薬学的または生理学的に許容される賦形剤担体、およびビヒクルなどの添加剤を配合することにより、医薬組成物として調製することができる。

適切な薬学的または生理学的に許容される賦形剤、担体およびビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、デキストロース、ヒドロキシプロピル－Ｐ－シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスなど、ならびにそれらの任意の２つ以上の組み合わせなどの処理剤、薬物送達調節剤および増強剤が挙げられる。他の適切な薬学的に許容される賦形剤は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。

医薬組成物は、好ましくは、単位用量製剤を含み、単位用量は、治療効果を有するのに十分な用量である。単位用量は、障害の治療または抑制の過程で定期的に投与される用量であり得る。

さらに、単位用量は、記憶に関連する本来の認知機能を改善するために、治療の過程で定期的に投与される用量であり得る。

本発明の化合物は、必要に応じて、従来の無毒の薬学的または生理学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位製剤において、経腸的、経口的、非経口的、舌下的、吸入（例えば、ミストまたはスプレーとして）によって、直腸に、または局所的に投与され得る。本明細書で使用される非経口的という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、足根内注射、または注入手法を含む。化合物は、所望の投与経路に適した薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルと混合される。

経口投与は、好ましい投与経路であり、経口投与に適した製剤が好ましい製剤である。

本明細書で使用するために記載された化合物は、固体形態、液体形態、エアロゾル形態、または錠剤、丸剤、散剤混合物、カプセル剤、顆粒剤、注射液、クリーム、液剤、坐剤、浣腸、結腸洗浄、乳剤、分散液、食品プレミックスの形態、およびその他の適切な形態で投与することができる。化合物はまた、リポソーム製剤で投与することができる。

注射用製剤、例えば、無菌の注射用水性または油性の懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って調製され得る。無菌の注射用製剤はまた、例えば、プロピレングリコール中の液剤として、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用液剤または懸濁剤であり得る。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、従来は、溶媒または懸濁媒として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用されている。

薬物の直腸投与用の坐剤は、薬物を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸で溶融して薬物を放出する、ココアバターおよびポリエチレングリコールなどの適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。

経口投与用の固形剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれ得る。そのような固体剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。そのような剤形はまた、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含み得る。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含み得る。錠剤および丸剤は、腸溶性コーティングでさらに調製することができる。

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、および水などの当技術分野で一般的に使用されている不活性希釈剤を含むエリキシル剤が含まれ得る。そのような組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、シクロデキストリン、甘味料、香料、および芳香剤などのアジュバントを含み得る。

単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、有効成分が投与される宿主および特定の投与様式に応じて変化するであろう。選択された単位投与量は、通常、血液、組織、臓器、または体の他の標的領域における薬物の定義された最終濃度を提供するために製造および投与される。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医または当業者の技能および判断の範囲内である。

本発明を以下の実施例を使用してさらに説明する。実施例では、図を参照している。

実施例１
アルツハイマー病の治療のための本発明による化合物の有効性を、１つは記憶を反映すること、１つはシナプス結合を示すことによる、２つの独立した試験によって試験した。

方法および実験の詳細
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルは、アルツハイマー病（ＡＤ）に広く使用されているＡベータ病理学（ＡＤの２つの主要な神経病理学的特徴の１つ）モデルである。これらのマウスには、ＡＰＰ（スウェーデン変異）およびＰＳＥＮ１（Ｌ１６６Ｐ変異）のヒト導入遺伝子が含まれており、これにより、約３か月齢（３ｍｏａ）から開始する脳における病的なアミロイド沈着ならびに海馬依存性記憶および長期増強（ＬＴＰ）の障害につながる。

ＡＰＰ／ＰＳ１モデルにおいてＳＵＬ－１３８（（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン）の一般的な病状の緩和／予防における有効性を試験した。記憶への影響を海馬依存性コンテキストテスト（恐怖条件付け（ＦＣ））で試験し、シナプス接続を電気生理学的ＬＴＰ（長期増強）測定によって試験した。このマウスモデルでは、基本条件下で両方が損なわれている。さらに、Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｒ（Ｓｙｌｉｃｓ）を使用して、ＳＵＬ－１３８が慢性的経口処置後に非定型行動を誘発することを除外した。

野生型（ＷＴ）およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、それぞれ２つの群に分け、ビヒクルまたはＳＵＬ－１３８のいずれかをそれらの飼料を介して与えた。群サイズは、１２匹であった。マウスの体重が約３０ｇ、飼料摂取量が約５ｇ／日、望ましい経口摂取量が３０ｍｇ／日／ｋｇであることに基づいて、飼料ペレットに、５ｋｇの飼料中１ｇのＳＵＬ－１３８で０．０１４５％エタノールを含む水に溶解したＳＵＬ－１３８を噴霧した。ビヒクル飼料は、同量の０．０１４５％エタノール含有水を噴霧することによって調製した。

試験前に、マウスを２．５ｍｏａ（前病理学／記憶障害）～６ｍｏａ（明らかな神経病理学および記憶障害が発生する月齢）で慢性的に処置した。

ＦＣ：マウスを２分間コンテキストにさらした後、０．７ｍＡのフットショックを与えた。フットショックから３０秒後、マウスをホームケージに戻した。２４時間後、マウスを同じコンテキストに置き、凍結レベルを２分間測定した。

ＬＴＰ：急性冠状海馬切片を人工ＣＳＦに保持し、３×１００Ｈｚ刺激後にＬＴＰを測定した。

Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｒ（Ｓｙｌｉｃｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから提供される）：マウスをＰｈｅｎｏｔｙｐｅｒに３日間収容し、その間に自発的行動：活動、暗／明、習慣、運動学、明暗相転移パターン、および退避を測定した。

結果
全体的な福祉は、監視され、ビヒクル処置動物とＳＵＬ－１３８処置動物との間の差異を示さず、すべての群で同様の体重増加を示した。

コンテキスト取得後の凍結を測定することにより、記憶を６ｍｏａで評価した。

図１は、慢性的ＳＵＬ－１３８処置がＷＴマウスおよびＡＰＰマウスの記憶（凍結％）をどのように増加させるかを示している。ＳＵＬ－１３８処置は、ＷＴマウスおよびＡＰＰマウスの両方において凍結レベル（記憶）を増加させた。スチューデントのｔ検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。

対照飼料で処置した場合、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、ＷＴマウスと比較して予想通りの凍結減少を示した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける慢性的ＳＵＬ－１３８処置後の記憶は、ＷＴレベルまで回復した。これは、ＳＵＬ－１３８がアルツハイマー病および／もしくはその症状の予防または改善に効果的であることを示している。

興味深いことに、ＳＵＬ－１３８を投与されたＷＴマウスは、記憶課題でも優れたパフォーマンスを示した。これは、ＳＵＬ－１３８が健康な哺乳動物の記憶機能の改善にも有効であることを示している。

図２は、ＳＵＬ－１３８がＷＴマウスおよびＡＰＰマウスの両方においてＬＴＰ維持をどのように増加させるかを示している。群当たり８～１４の海馬切片（２Ａ：ＷＴ対照、ＷＴＳＵＬ－１３８、２Ｂ：ＡＰＰ対照、ＡＰＰＳＵＬ－１３８）に、２０秒間隔で１秒の３×１００Ｈｚ刺激（強縮）によって惹起されるＬＴＰを与えた。勾配を６０分間測定した。ＬＴＰは、ベースラインのパーセンテージとして表した。すべてのＬＴＰデータ分析は、ブラインドで行った。ＬＴＰの維持（３０～６０分）は、ＳＵＬ－１３８動物（ＷＴおよびＡＰＰの両方）において有意に（ｐ＜０．０５）高かった。スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；２Ｃ。

慢性的ＳＵＬ－１３８処置は、自発的行動の差異を誘発せず、活動、暗／明、慣れ、運動学、明暗相転移パターンおよび退避を測定した。

結論
実施例は、ＳＵＬ－１３８がＷＴマウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの両方において記憶およびＬＴＰを増加させ、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて記憶およびＬＴＰを対照レベルまで効果的に回復させることを示している。

これらのパラメーター両方における増加は、ＳＵＬ－１３８を使用して刺激される一般的な可塑性の増加／ＬＴＰ促進プロセスを反映している。この発見は、ＳＵＬ－１３８を使用して、シナプス強度または可塑性の低減を示す神経疾患の症状を緩和できることを意味する。

ＳＵＬ－１３８の効果は、３ｍ間の慢性的処置後、処置によってマウスに非定型行動が導入されなかったため、記憶の改善に特異的であるように思われる。さらに、ＳＵＬ－１３８処置飼料に対する嫌悪または中毒性の行動、または主要な生理学的機能の変化を示し得る３ｍ間の慢性的経口処置中に体重の差異は測定されなかった。

最後に、動物福祉の問題および群間の差異は、実験全体を通して発生しなかった。

実施例２
ＳＵＬ－１３８による介入後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるプラーク負荷の低減
ＡＰＰ／ＰＳ１（ｎ＝１０）およびＷＴマウス（ＷＴ、ｎ＝１０）マウスを、ビヒクルまたはＳＵＬ－１３８のいずれかで処置した。マウスは、３か月齢から開始して３か月間、ＳＵＬ－１３８またはビヒクル処置飼料ペレットのいずれかで処置した。（とりわけ）海馬依存性記憶障害および明らかなプラーク負荷が予想される月齢である６か月齢でマウスを犠牲にした。

ショ糖に保存された４％ＰＦＡ灌流脳は、クリオスタット（－２０℃、Ｌｅｉｃａ）を使用して３５μＭでライスした。海馬切片（ｎ＝２／動物、５匹／群）を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄した後、ブロッキング溶液（１０ｍＬの１×ＰＢＳ＋５００μＬの通常のヤギ血清＋０．２５０ｇのウシ血清アルブミン＋２０μＬのＴｒｉｔｏｎ－１００）で１時間ブロックした。切片を抗アミロイドベータ（６Ｅ１０）（ＩＴＫＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１：４００）とともに一晩インキュベートし、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄した後、二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ蛍光４８８抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２５０）とともに２時間インキュベートした。次に、切片を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、スライドにマウントした。

ＬＳＭ９００共焦点ヘッドを備えたＺｅｉｓｓＣｅｌｌＤｉｓｃｏｖｅｒ７ハイコンテンツ顕微鏡を使用して切片を画像化した。Ｆｉｊｉを使用して、群当たり５匹の動物について両海馬を別々に選択し（図３Ａの黄色の線）、プラークの数およびサイズを測定した（図３Ｂ、Ｃ）。スチューデントの片側ｔ－検定を使用したＧｒａｐｈＰａｄ８の統計分析には、動物当たりの平均プラーク数およびプラークサイズを使用した。

３か月の経口ＳＵＬ－１３８は、ビヒクル処置マウスと比較して、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのプラーク数（図３Ｂ、ｐ＝０．０１３８）およびプラークサイズ（図３Ｃ、ｐ＝０．００２１）の両方を低減させた。ＳＵＬ－１３８およびビヒクル処置ＷＴ動物は、プラークを示さなかった。

これらのデータは、ＳＵＬ－１３８が実施例１により観察されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける記憶を救済しシナプス伝達を増加させること（長期増強）とともに、ＳＵＬ－１３８がアルツハイマー病に対する有望な治療選択肢であることを示している。

ＳＵＬ－１３８脳のバイオアベイラビリティは、高度であるように見え、それによって他のミトコンドリア標的化合物の問題を克服し、将来の臨床応用のためのより適切な治療選択肢になる。

実施例３
本発明による化合物が活性であることを示すインビトロアッセイ。

興奮毒性は、それ以外の場合は必要で安全な神経伝達物質のレベルが病理学的に高くなり、受容体の過剰な刺激をもたらすときに、神経細胞が損傷を受けるかまたは死に至るプロセスである。興奮毒性は、アルツハイマー病などの中枢神経系の神経変性疾患に関与している可能性がある。

興奮毒性を調べるためのインビトロアッセイは、神経細胞死の特徴がはっきりした誘発物質（例えば、グルタミン酸、ドーパミン、またはＮＤＭＡ）および刺激された神経様細胞の細胞生存率の定量化を利用する。ヒト神経芽細胞腫由来のＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株は、インビトロで分化させて、形態学的および生化学的に成熟ニューロンに類似させることができる。さらに、分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙニューロン様細胞は、とりわけグルタミン酸およびドーパミンによって誘発される興奮毒性に感受性がある。

この現在の試験では、ＳＵＬ－１１、ＳＵＬ－１２７、ＳＵＬ－１３、ＳＵＬ－１３８（およびその一次代謝産物ＳＵＬ－１３８Ｍ２）、ＳＵＬ－１５０およびＳＵＬ－１５１のヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙニューロン様細胞のグルタミン酸およびドーパミン誘発性興奮毒性を阻害する有効性を調べた。ＳＵＬ－１１は、トロロクスであり、ＳＵＬ－１２７はトロロクスのメチルエステルである。これらの２つの化合物を参照として使用した。

この試験で使用した化合物を以下の表１に示す。

ヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２２６６）は、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（＃Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＤＭＥＭ培地で維持し、培養物が７０％コンフルエンシーに達するまで継代した。実験の前に、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を血清低減（１％まで）および１０μＭレチノイン酸（＃Ｒ７８８２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による７２時間の刺激によって分化させた。分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をすべての実験で０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種した。

分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＵＬ化合物（用量範囲８×１０^－４～１×１０^－８Ｍ）とともに標準培養条件下で３０分間プレインキュベートし、次に、１－グルタミン酸（６０ｍＭ、＃１２８４３－０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはドーパミン（１００μＭ、＃Ｈ８５０２、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のいずれかでさらに２４時間刺激した。ニュートラルレッドアッセイ溶液（＃Ｎ２８８９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、培養の最後の４時間に１０％（ｖ／ｖ）濃度で培養物に添加した。細胞を温かいＰＢＳおよび酸性エタノール（５０％ＥｔＯＨ中の１％酢酸）に可溶化したニュートラルレッドで洗浄した。ＣＬＡＲＩＯＳｔａｒＰｌｕｓプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、５４０ｎｍで吸光度を記録した。細胞生存率は、未処置の培養物の吸光度測定値（１００％生存率）および細胞を含まないサンプルの吸光度測定値（０％生存率）に対して正規化した。

すべての実験は、条件ごとに３連で行い、平均化した。２つの個別の実験から得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ、Ｃａ）での評価に使用した。４パラメーターの非線形回帰を使用して、１－グルタミン酸またはドーパミンのいずれかによって誘発される興奮毒性を低減させるＳＵＬ化合物の有効性および効力を決定した。興奮毒性を阻害するＳＵＬ化合物の有効性を次のように計算した：Ｅ_ｍａｘ＝１００＊Ｖ_{（処置済み）}－Ｖ_{（ビヒクル）}）／１００％－Ｖ_{（ビヒクル）}）、式中、Ｖは、観察された生存率であり、Ｅ_ｍａｘは、ＳＵＬ化合物処置によって引き起こされる最大の効果である。

下の表に示すモル範囲のＳＵＬ－化合物を使用した場合、細胞毒性は、生存率の低下として観察されなかった。

ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を確立されたプロトコルに従ってニューロン様細胞に分化させ、興奮毒性を誘発するために６０ｍＭグルタミン酸で刺激した。グルタミン酸は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存率をビヒクル処置対照細胞の１００±１．６３％からグルタミン酸に２４時間曝露したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の５５．４±１．７％に減少させた（ｐ＜０．０００１）。分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＵＬ化合物（１０^－３～１０^－８Ｍ）とともにプレインキュベーションすると、レベルは異なるが、グルタミン酸でチャレンジしたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率が用量依存的に増加した。以下の表２に示すように、トロロクスおよびトロロクスのメチルエステルは、他のＳＵＬ化合物よりも明らかに効果が低かった。

分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１５０μＭのドーパミンで刺激して興奮毒性を誘発した。ドーパミンは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の生存率をビヒクル処置対照細胞における１００±０．８％からドーパミンに２４時間曝露したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における５０．５±１．０％に減少させた（ｐ＜０．０００１）。分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＵＬ化合物（１０^－３～１０^－８Ｍ）とともにプレインキュベーションすると、以下の表２に示すように、有効性は異なるが、ドーパミンチャレンジＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率が用量依存的に増加した。このモデルでは、すべての化合物が１０^－３Ｍの用量レベルで細胞生存率を低下させた。

表の結果は、本発明によるＳＵＬ化合物が、改善されたＥＣ５０（すなわち、より低い濃度で活性）および／または改善されたＥｍａｘ（すなわち、毒性の回復がより高いレベルで達成される）のいずれかを示すことを示している。それにより、この実施例は、ＳＵＬ－１３８の次に、主張されている他のＳＵＬ化合物も、記憶機能の改善および／またはプラーク形成の低減、すなわち、一般的にアルツハイマー病の治療に有利である、の利点を示す可能性が高いことを示した。

参照実験Ａ
ＷＴおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬組織を、プロスタグランジン合成酵素およびトロンボキサン合成酵素Ａのタンパク質発現について調べた。プロスタグランジン合成酵素ＰＴＧＳ１、ＰＴＧＥＳ２、ＰＴＧＥＳ３、およびＰＴＧＦＳに類似しているペプチドが、ＷＴマウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの両方の海馬組織において見出された（表４）。ＰＴＧＳ２、ＰＴＧＤＳ、ＰＴＧＥＳ１、ＰＴＧＩＳ、およびＴＸＡのタンパク質フラグメントは、見出されなかった。ＷＴまたはＡＰＰ／ＰＳ１マウスのいずれかのＳＵＬ－１３８処置は、プロスタグランジン合成酵素のタンパク質発現を変化させなかった。

Claims

アルツハイマー病を治療するため、記憶機能を改善するため、かつ／またはアルツハイマー病患者におけるプラーク負荷を低減させるための、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）による化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、組成物であって、

式中、Ｒ１が、水素であるか、または６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成し、
Ｒ２およびＲ３が、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１～４個のＮ、Ｏ、もしくはＳ原子を有する、飽和もしくは不飽和の、非芳香族の、任意選択で置換された５～８員環を形成し、Ｒ２およびＲ３が一緒に、３～１２個の炭素原子を含むか、
またはＲ２が、水素原子、もしくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３が、窒素もしくは酸素で任意選択で置換されたアルキル基であり、前記アルキル基が、３～１２個の炭素原子を含み、Ｒ３における前記アルキル基が、１つ以上の非芳香族環状構造を含み、直鎖状および／もしくは分枝状基、ならびに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る、組成物。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるいずれかの化合物において、Ｒ２およびＲ３が、それらが結合している前記Ｎ原子と一緒に、追加のＮ原子を組み入れた飽和環を形成し、この環が、非置換であるか、またはアルコール、もしくは１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
前記化合物が、式Ｉによる化合物である、請求項２に記載の組成物。
Ｒ２およびＲ３が、それらが結合している前記Ｎ原子と一緒に、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を形成し、この環が、メチル、エチル、またはアルコール置換メチルもしくはエチルで任意選択で置換されている、請求項３に記載の組成物。
Ｒ２が、水素原子であり、Ｒ３が、４～７個の炭素原子を有し、かつ、１個の窒素原子を有する飽和環状構造を含み、この環が、アルキル基、アルコール基、または酸素、カルボン酸もしくはアミン基を含み得る１～４個の炭素原子を有する基で置換され得る、請求項１に記載の組成物。
前記化合物が、式ＩＩによる化合物であり、式中、Ｒ２が、水素原子であり、Ｒ３が、４～６個の炭素原子を有し、かつ、１個の窒素原子を有する環状構造を含み、この環が、メチル、エチル、またはアルコール置換メチルもしくはエチルで任意選択で置換されている、請求項５に記載の組成物。
前記化合物が、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）または（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）である、請求項１に記載の組成物。
前記化合物が、ＳＵＬ－１０９のＳ－エナンチオマー：Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１３８）である、請求項７に記載の組成物。
式（Ｉ）または式（ＩＩ）による前記化合物が、５００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
アルツハイマー病を治療するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
記憶機能を改善するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
アルツハイマー病患者におけるプラーク負荷を低減させるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
哺乳動物における記憶機能を改善するための、請求項１１に記載の組成物。
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１３に記載の組成物。