JP7703541B2

JP7703541B2 - 血清アルブミン結合性フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインおよびその使用

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Publication number: JP7703541B2
Application number: JP2022537426A
Authority: JP
Inventors: カリン・オニール; ヤオ・シン; ラッセル・シー・アディス
Original assignee: アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2025-07-07
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: US20230039851A1; JP2023508885A; US12351619B2; CN115175691B; EP4076505A4; WO2021127353A1; AU2020405107A1; CN115175691A; EP4076505A1; CA3161723A1

Description

本実施形態は、血清アルブミンと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに関する。そのようなＦＮ３ドメインは、例えば、それにコンジュゲートした薬物またはタンパク質のｉｎｖｉｖｏ血清半減期を延長するために使用され得る。また、そのような分子の製造方法およびそれらを含む医薬組成物も提供される。

血流からの薬物またはバイオ治療分子の急速な除去は、これらの分子の臨床的有効性の制限に寄与し、または患者にとってより頻繁な投与をもたらし得る。一般的に生じる１つの除去方法は、糸球体濾過による腎クリアランスである。分子量が５０，０００ダルトンを超える分子では、腎臓の濾過速度が大幅に低下するため、この除去経路は、より小さなバイオ治療薬に最も関連する（非特許文献１）。いくつかの承認されたバイオ治療薬は、それ自体が濾過限界を下回り、したがって迅速に除去される活性部分を含んでいる。この制限を克服するために、治療用分子のサイズを効果的に大きくして、腎臓の濾過を減らすための多くの技術が導入されてきた。

Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１年

薬物または治療薬の半減期を延ばすための化合物または方法が依然として必要とされている。本実施形態は、これらのニーズならびに他のニーズを満たすものである。

本実施形態は、血清アルブミン結合性フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。また、提供されるＦＮ３ドメインをコードすることができる関連ポリヌクレオチド、提供されるＦＮ３ドメインを発現する細胞、ならびに関連するベクターも記載される。さらに、提供されるＦＮ３ドメインを使用する方法についても記載される。例えば、アルブミンの血清半減期が長いことを考えると、アルブミン結合性ペプチドは、血清半減期が長いか、または延長された治療用タンパク質または薬物を創製するための融合パートナーとして使用することができる。

アルブミン結合性ＦＮ３ドメインに加えて、記載のタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチド配列も提供される。本明細書のアルブミン結合性ＦＮ３ドメインを発現する細胞と同様に、記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。開示されたベクターを発現することができる細胞もまた記載される。これらの細胞は、哺乳動物細胞（２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞など）、昆虫細胞（Ｓｆ７細胞など）、酵母細胞、植物細胞、または細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）でありうる。記載のＦＮ３ドメイン（タンパク質）の製造方法もまた提供される。

本実施形態はまた、提供されるアルブミン結合性ＦＮ３ドメインを様々な分子に融合または他の方法で会合させて、そのような分子の半減期を延長する方法も提供する。このように、アルブミン結合性ＦＮ３ドメインは、例えば、治療薬の半減期を延長するために使用することができる。

いくつかの実施形態において、アルブミン結合性ＦＮ３ドメインを含む医薬組成物は、治療薬パートナーのｉｎｖｉｖｏ半減期を改善するために投与される。そのような半減期の延長は、例えば、アルブミン結合性ＦＮ３ドメインの薬物動態を監視することを含む、当技術分野で知られている様々な方法によってアッセイすることができる。これらの方法のためのそのようなアッセイの非限定的な例は、本明細書に提供される実施例において提供される。

提供されるアルブミン結合性ＦＮ３ドメインを含むキットもまた提供される。本キットは、本明細書で提供されるアルブミン結合性ＦＮ３ドメインを使用する方法、または当業者に知られている他の方法を実行するために使用することができる。いくつかの実施形態において、記載されるキットは、本明細書に記載のＦＮ３ドメインおよび生物学的試料中のヒト血清アルブミンの存在を検出する際に使用するための試薬を含んでいてもよい。記載されるキットは、本明細書に記載のように、本明細書に記載されるＦＮ３ドメインの１つまたはそれ以上、および使用されていないときにＦＮ３ドメインを収容するための容器、固体支持体に固定されたＦＮ３ドメインの使用説明書、および／または検出可能に標識された形態のＦＮ３ドメインを含んでいてもよい。

図１は、アルブミン結合性ＦＮ３ドメインを使用したカニクイザルおよびヒトの血清からの内在性アルブミンの間接的なプルダウンを示している。アルブミンのドメイン１に結合するＦＮ３ドメインは、点線で囲まれている；アルブミンのドメイン３に結合するＦＮ３ドメインは、実線で囲まれている。全てのコンストラクトは、１つのヌルＦＮ３ドメイン（ＴＣ２５）と１つのアルブミン結合性ＦＮ３ドメインを有する二重特異性遺伝子融合として調製される。^＊ＡＢＤはアルブミン結合性ドメインを意味する（参考文献：Ｊ．Ｔ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｒ．Ｐｅｈｒｓｏｎ、Ｖ．Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ、Ｍ．Ｂ．Ｄａｂａ、Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎ、Ｃ．Ｅｋｂｌａｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：５２３４～５２４１頁、２０１１年）。図２は、５ｍｇ／ｋｇ（Ｈ９）または５ｍｇ／ｋｇ（ＡＬＢ４０（Ｂ７））の単回ＩＶ投与後のカニクイザルにおけるアルブミン結合性ＦＮ３ドメインの薬物動態プロファイルを示している。

定義
記載される側面に関連する様々な用語が、明細書および特許請求の範囲全体を通して使用される。そのような用語は、他に指し示されない限り、当技術分野においてそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致する様式で解釈されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の参照対象を含んでいる。したがって、例えば、「１つの細胞」への言及は、２つまたはそれ以上の細胞の組み合わせなどを含む。

量、時間的持続時間などの測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定の値から最大±１０％のバリエーションを包含し、そのようなバリエーションが開示される方法を実行するのに適切であることが意味される。特に指し示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量、反応条件などの特性を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対に指し示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を規定する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の例において規定される数値は可能な限り正確に報告される。しかし、数値は、それぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を本質的に含む。

「単離された」とは、生物学的成分（核酸、ペプチドまたはタンパク質など）が、その成分が天然に存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離、離れて生成、または離れて精製されていることを意味する。したがって、「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、組成物の一部となることができ、そのような組成物が核酸、ペプチド、またはタンパク質の天然環境の一部でない場合には、なおも単離されたものであり得る。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現によって調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。本明細書で使用される「単離された」ＦＮ３ドメインは、異なる抗原特異性を有する他のＦＮ３ドメインが実質的に存在しないＦＮ３ドメインを指すことが意図される（例えば、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミン以外の抗原に特異的に結合するＦＮ３ドメインを実質的に含まない）。しかし、ヒト血清アルブミンのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、例えば、他の種（血清アルブミン種ホモログなど）からの他の関連する抗原に対して交差反応性を有していてもよい。

本明細書で使用される「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）という用語は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体および原核生物酵素を含むタンパク質に頻繁に生じるドメインを指す（ＢｏｒｋとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：８９９０～８９９４頁、１９９２年；Ｍｅｉｎｋｅら、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１７５：１９１０～１９１８頁、１９９３年；Ｗａｔａｎａｂｅら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６５：１５６５９～１５６６５頁、１９９０年）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、および例えば、米国特許第８２７８４１９号に記載されるような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、例えば、テネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）といった、ドメイン番号とタンパク質名により参照される。

本明細書で使用される「特異的に結合する」または「特異的な結合」という用語は、本発明のＦＮ３ドメインが、約１×１０^－６Ｍ以下、例えば約１×１０^－７Ｍ以下、約１×１０^－８Ｍ以下、約１×１０^－９Ｍ以下、約１×１０^－１０Ｍ以下、約１×１０^－１１Ｍ以下、約１×１０^－１２Ｍ以下、または約１×１０^－１３Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で所定の抗原に結合する能力を指す。典型的には、記載されたＦＮ３ドメインは、例えば、ＰｒｏｔｅｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた表面プラズモン共鳴によって測定される非特異的な抗原（例えば、カゼイン）に対するそのＫ_Ｄよりも少なくとも１０倍小さいＫ_Ｄで所定の抗原（すなわち、ヒト血清アルブミン）に結合する。しかし、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する記載のＦＮ３ドメインは、他の関連する抗原、例えば、マカカ・ファシクラリス（ＭａｃａｃａＦａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル、ｃｙｎｏ）またはパン・トログロダイト（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（チンパンジー）のような、他の種（ホモログ）からの同じ所定の抗原に対する交差反応性を有していてもよい。

本明細書で使用される「血清半減期」は、一般に、アミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドの血清濃度が、例えば、配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物の天然のメカニズムによるクリアランスもしくは隔離により、ｉｎｖｉｖｏで５０％減少するために要する時間として定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ半減期は、それ自体既知の任意の方法、例えば、薬物動態解析によって決定することができる。適切な技術は、当技術分野の当業者には明らかであり、例えば一般に、温血動物（すなわち、ヒト、またはマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、霊長類のような別の適切な哺乳動物、例えばマカカ属のサル（特に、カニクイザル（マカカ・ファシクラリス）など）および／またはアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ））およびヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Ｐａｐｉｏｕｒｓｉｎｕｓ）））に対して、適切な用量の本開示のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドを適切に投与する工程；前記動物から血液試料または他の試料を収集する工程；前記血液試料中の本発明のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドのレベルまたは濃度を決定する工程；ならびに、そのようにして得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドのレベルまたは濃度が、投与により初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含んでいてもよい。例えば、以下の実験パート、ならびにＫｅｎｎｅｔｈ，Ａら：ＣｈｅｍｉｃａｌＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ＡＨａｎｄｂｏｏｋｆｏｒＰｈａｒｍａｃｉｓｔｓおよびＰｅｔｅｒｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅａｎａｌｙｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９６年）のような標準的なハンドブックが参照される。また、「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」、ＭＧｉｂａｌｄｉとＤＰｅｒｒｏｎ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ発行、改訂第２版（１９８２年）も参照される。

また、当業者には明らかなように（例えば、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの第６および７頁、ならびにそこに引用されているさらなる文献を参照）、半減期は、ｔ１／２－アルファ、ｔ１／２－ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）のようなパラメータを用いて表現することができる。本明細書では、「半減期」は、これらのパラメータのいずれか２つ、または本質的にこれらのパラメータの３つ全てのような、これらのパラメータのいずれか１つにおける減少を指す。

「薬物動態」または「薬物動態学」という用語は、その技術的に認められた意味に従って使用され、体内における薬物の作用、例えば、薬物の作用の効果および持続時間、それらが体により吸収、分布、代謝、および除去される速度などの研究を意味する。

本明細書で使用される「置換」または「置換された」または「変異」または「変異された」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列において１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを変更、欠失、または挿入し、その配列のバリアントを生成することを指す。

本明細書で使用される「ランダム化」または「ランダム化された」または「多様化」または「多様化された」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における少なくとも１つの置換、挿入または欠失を指す。

本明細書で使用される「バリアント」は、例えば、置換、挿入または欠失のような１つまたはそれ以上の修飾によって参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。

「ライブラリ」という用語は、バリアントの集合を指す。ライブラリは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのバリアントから構成される。

本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指し、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記載されている。

「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と同義に参照される「ポリヌクレオチド」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成分子を含むが、限定はされない。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を参照する。また、ポリヌクレオチドという用語は、安定性もしくは他の理由のために、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基および、イノシンのような通常は見られない塩基を含む。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われる；よって、「ポリヌクレオチド」は、天然に一般に見出されるような、化学的、酵素的、もしくは代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短い核酸の鎖も包含する。

「ベクター」は、セグメントの複製または発現をもたらすように別の核酸セグメントが作動可能に挿入されるプラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルスのようなレプリコンである。

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞であり得る。特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされた細胞、およびそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、例えば、後の世代で起こりうる変異もしくは環境的な影響、または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みために、核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一でなくともよい。「発現」および「産生」という用語は、本明細書では同義に用いられ、遺伝子産物の生合成を指す。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。これらの用語はまた、ＲＮＡの１つまたはそれ以上のポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに、全ての天然に存在する転写後および翻訳後修飾も包含する。抗体またはその抗原結合性フラグメントの発現または産生は、細胞の細胞質内、または細胞培養物の増殖培地のような細胞外環境内であってもよい。「実質的に同一」の意味は、その用語が使用される文脈に応じて異なり得る。重鎖および軽鎖ならびにそれらをコードする遺伝子の間に存在する可能性が高い天然の配列のバリエーションのために、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードするアミノ酸配列または遺伝子内に、固有の結合特性（例えば、特異性およびアフィニティー）にほとんど、またはまったく影響を与えない、ある程度のバリエーションが見出されることが予想される。そのような予想は、部分的には、遺伝暗号の縮重、ならびにコードされるタンパク質の性質を感知できるほどに変化させない保存的アミノ酸配列バリエーションの進化上の成功によるものである。

開示されるＦＮ３ドメインの概要
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣからの１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７頁、２０１２年；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的である７つのベータストランドをつなぐ６つの表面露出ループを示しており、ベータストランドはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ばれ、ループはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧループと呼ばれる（ＢｏｒｋとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ８９：８９９０～８９９２頁、１９９２年；米国特許第６６７３９０１号）。これらのループ、または各ループ内の選択された残基は、血清アルブミンに結合する新規分子を選択するために使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するためにランダム化してもよい。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の各ループとベータストランドの位置および配列を示している。

したがって、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されるライブラリは、以下に記載されるライブラリＴＣＬ１またはＴＣＬ２のような、ランダム化されたＦＧループ、またはランダム化されたＢＣおよびＦＧループを有していてもよい。ＴｅｎｃｏｎのＢＣループは７アミノ酸長であり、よって、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸は、ＢＣループで多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されるライブラリ内でランダム化される。ＴｅｎｃｏｎのＦＧループは７アミノ酸長であり、よって、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸は、ＦＧループで多様化され、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されるライブラリ内でランダム化される。Ｔｅｎｃｏｎライブラリのループにおけるさらなる多様性は、ループにおける残基の挿入および／または欠失によって達成してもよい。例えば、ＦＧおよび／またはＢＣループは、１～２２アミノ酸延長してもよく、または１～３アミノ酸減らしてもよい。ＴｅｎｃｏｎのＦＧループは７アミノ酸長であるが、抗体重鎖の対応するループは４～２８残基の範囲である。最大の多様性を提供するために、ＦＧループは、抗体のＣＤＲ３の長さの範囲である４～２８残基に対応するように、配列および長さが多様化される。例えば、ＦＧループは、追加の１、２、３、４または５アミノ酸によりループを延長することによって、長さがさらに多様化される。

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されるライブラリは、ＦＮ３ドメインの側面に形成され、２つまたはそれ以上のベータストランドと少なくとも１つのループを含むランダム化された代替的な表面も有しうる。そのような１つの代替的な表面は、ＣおよびＦベータストランドとＣＤおよびＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏｎ代替Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面に基づくライブラリ設計は、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されるライブラリは、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（配列番号１に対応する残基番号）に置換を有し、改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎバリアントのような、Ｔｅｎｃｏｎバリアントに基づいて設計されるライブラリも含む。例示的なＴｅｎｃｏｎのバリアントは、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較した場合、置換Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６ＶおよびＥ８６Ｉを有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号４）を含む。

Ｔｅｎｃｏｎおよび他のＦＮ３配列ベースのライブラリは、ランダムまたは定義されたアミノ酸のセットを使用して、選択された残基位置でランダム化される。例えば、ランダムな置換を有するライブラリ中のバリアントは、２０個全ての天然に存在するアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを使用して生成することができる。他の多様化スキームでは、ＤＶＫコドンを使用して、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコード化することができる。あるいは、ＮＮＳコドンを使用して、２０個全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に終止コドンの頻度を減らすことができる。多様化される位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）テクノロジー（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を使用して合成することができる。このテクノロジーは、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な普遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列の組み合わせを示す。コドン指定は、よく知られているＩＵＢコードによる。

本明細書に記載のヒト血清アルブミンに結合または特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ｃｉｓディスプレイを使用して、スカフォールドタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントに連結させ、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳後に形成される、各タンパク質がそれをコードするＤＮＡと安定して結合しているタンパク質－ＤＮＡ複合体のプールを生成して（米国特許第７８４２４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１、２８０６～２８１０頁、２００４年）、ＴｅｎｃｏｎライブラリのようなＦＮ３ライブラリを作成し、そして、当技術分野で知られており、実施例に記載されている任意の方法によって、ヒト血清アルブミンへの特異的結合についてライブラリをアッセイことにより、単離することができる。使用できる例示的なよく知られた方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに競合的および非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨークを参照）。ヒト血清アルブミンに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインは、所望の特性に従ってさらに特徴付けられる。

本明細書に記載のヒト血清アルブミンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリを生成するためのテンプレートとして任意のＦＮ３ドメインを使用し、提供される方法を使用してヒト血清アルブミンに特異的に結合する分子についてライブラリをスクリーニングすることで生成される。使用できる例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号８１）、フィブコン（配列番号８２）、およびフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号８３）である。Ｉｎｖｉｔｒｏでライブラリを発現または翻訳するために、ライブラリをベクターにクローニングするか、またはライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成するために、標準的なクローニングおよび発現技術が使用される。例えば、リボソームディスプレイ（ＨａｎｅｓとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、９４、４９３７～４９４２頁、１９９７年）、ｍＲＮＡディスプレイ（ＲｏｂｅｒｔｓとＳｚｏｓｔａｋ、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、９４、１２２９７～１２３０２頁、１９９７年）、または他の無細胞系（米国特許第５６４３７６８号）を使用することができる。ＦＮ３ドメインバリアントのライブラリは、例えば、任意の適切なバクテリオファージの表面に提示される融合タンパク質として発現される。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを提示するための方法は、よく知られている（米国公開特許第２０１１／０１１８１４４号；国際公開第２００９／０８５４６２号パンフレット；特許第６９６９１０８号；米国特許第６１７２１９７号；米国特許第５２２３４０９号；米国特許第６５８２９１５号；米国特許第６４７２１４７号）。

本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列または配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、場合により、配列番号１または配列番号４は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／または８６に置換を有する。

本開示のヒト血清アルブミンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性ならびに熱フォールディングおよびアンフォールディングの可逆性を改善するような、それらの特性を改善するように修飾される。タンパク質および酵素の見かけの熱安定性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋の安定化設計、アルファヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、およびコンセンサス配列の組成を含む、いくつかの方法が適用されている（ＬｅｈｍａｎｎとＷｙｓｓ、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２、３７１～３７５頁、２００１年）。高い熱安定性は、発現されたタンパク質の収量を増加させ、溶解性または活性を改善し、免疫原性を低下させ、そして製造におけるコールドチェーンの必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を改善するために置換することができる残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されている。これらの残基に対応する置換は、本発明の分子を含むＦＮ３ドメインに組み込むことができる。

タンパク質安定性およびタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同一または異なる側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線もしくは電離放射線、溶液中の場合には周囲の浸透圧モル濃度およびｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって与えられる機械的せん断力、紫外線放射、ガンマ線照射によるような電離放射線照射、化学的もしくは熱脱水、またはタンパク質構造の破壊を引き起こす可能性のあるその他の任意の作用もしくは力によって引き起こされる変性に対して感受性または「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を使用して決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分がアンフォールディングされるセ氏（℃）での温度である、熱融解（「Ｔ_ｍ」）温度を測定することによって決定できる。典型的には、Ｔ_ｍが高いほど、分子はより安定である。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。

一実施形態において、本開示のヒト血清アルブミンに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔ_ｍの増加によって測定される改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれ以上の増加した安定性を示す。

化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤は、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ベータ－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、および水素化ホウ素ナトリウムのような水素化物）、非イオン性およびイオン性界面活性剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、および標的化変性剤を含む。変性の程度の定量化は、標的分子を結合する能力のような機能的特性の喪失、あるいは凝集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、またはジスルフィド結合の破壊もしくは形成のような物理化学的特性に依拠し得る。

本開示のＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、よって、標的分子結合のアビディティーを増加させる手段として、または２つもしくはそれ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重もしくは多重特異性のスカフォールドを生成する手段として、単量体、二量体、または多量体として生成される。二量体および多量体は、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシンおよびセリン、またはアラニンおよびプロリンを含有するリンカーの含有によって、単一特異性、二重もしくは多特異性タンパク質スカフォールドを連結することによって生成される。例示的なリンカーは、（ＧＳ）_２（配列番号７１）、（ＧＧＧＳ）_２（配列番号７２）、（ＧＧＧＧＳ）_５（配列番号７３）、（ＡＰ）_２（配列番号７４）、（ＡＰ）_５（配列番号７５）、（ＡＰ）_１０（配列番号７６）、（ＡＰ）_２０（配列番号７７）およびＡ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番号７８）を含む。二量体および多量体は、ＮからＣの方向で互いに連結される。ポリペプチドを新規な連結融合ポリペプチドに接続するための天然に存在するペプチドリンカーおよび人工のペプチドリンカーの使用は、文献上よく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６４、５２６０～５２６８頁、１９８９年；Ａｌｆｔｈａｎら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．８、７２５～７３１頁、１９９５年；ＲｏｂｉｎｓｏｎとＳａｕｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５、１０９～１１６頁、１９９６年；米国特許第５８５６４５６号）。

ヒト血清アルブミンバインダー
ＦＮ３ドメインは、約１０ｋＤａのその小さなサイズのために、腎濾過および分解によって循環から急速に除去される。特定の側面において、本開示は血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合して、ＦＮ３ドメインまたはアルブミン結合性ＦＮ３ドメインが会合もしくは連結される別の治療薬の半減期を延長するＦＮ３ドメインを提供する。

いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結された開始メチオニン（Ｍｅｔ）を含む。

いくつかの実施形態において、ヒト血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端またはＮ末端に連結されたシステイン（Ｃｙｓ）を含む。

Ｎ末端Ｍｅｔおよび／またはＣ末端Ｃｙｓの追加は、発現および／または、ＰＥＧ、Ｆｃ領域、別のＦＮ３ドメインなどのような、別の半減期延長分子であってもよい他の分子へのコンジュゲーションを促進しうる。

いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメイン（タンパク質）は単離されている。いくつかの実施形態では、ＦＮ３タンパク質は、配列番号５１と比較して、少なくとも１つの置換を有する配列番号５１を含む。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号５１の位置１０に対応する残基においてである。いくつかの実施形態では、置換（変異）はＡ１０Ｖである。いくつかの実施形態において、置換はＡ１０からＧ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、またはＳである。いくつかの実施形態において、位置１０における置換は、任意の天然に存在するアミノ酸である。

いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、もしくは６９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、タンパク質が配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、もしくは６９のアミノ酸配列の１０位に対応する置換を有するという条件で、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、もしくは６９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、置換はＡ１０Ｖである。いくつかの実施形態では、置換は、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｉ、Ａ１０Ｔ、またはＡ１０Ｓである。いくつかの実施形態において、位置１０における置換は、任意の天然に存在するアミノ酸である。

いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９のアミノ酸配列と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９の位置１０に対応する位置においてである。

いくつかの実施形態では、提供されるＦＮ３ドメインは、配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６１、８８、または位置６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、もしくは９３に対応する少なくとも１つの残基位置、またはＣ末端にシステイン残基を含む。一連の位置がリストされているが、各位置は個別に選択することもできる。いくつかの実施形態では、システインは、位置６、位置５３、または位置８８に相当する位置にある。

特定の実施形態では、本明細書に記載の単離されたＦＮ３ドメインは、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループが、記載されたアルブミン結合性ＦＮ３ドメイン配列（すなわち、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、もしくは６９）または４つのコアＦＮ３ドメイン配列のＣストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループ配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列のいずれかからのＣストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループのそれぞれのセットで置換されている、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、もしくは６９に記載の配列を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、単離されたアルブミン結合性ＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９に規定される配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、Ａ１０Ｖ、Ｎ３３Ａ、Ａ３５Ｓ、Ｗ３７Ａ、Ｐ３９Ａ、Ｇ４０Ａ、Ｉ４１Ａ、Ｇ４２Ａ、Ｗ４７Ａ、Ｒ４９Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｗ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ａ７９Ｓ、Ｓ８０Ａ、Ｐ８２Ａ、Ｉ８５Ａ、またはＲ８７Ａの置換を有する配列番号５１を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１０、３３、２５、３７、３９、４０、４１、４２、４７、４９、６９、７１、７３、７９、８０、８２、８５、または８７の位置に置換を有する配列番号５１を含む。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、１０の位置に置換を有する配列番号５１を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、１０の位置に置換を有し、Ａ１０Ｖ、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｉ、Ａ１０Ｔ、またはＡ１０Ｓの追加の置換を有する配列番号５１を含む。

いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して９０％同一であるか、または配列番号５１のアミノ酸配列と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の置換を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、置換はアラニン置換である。いくつかの実施形態において、置換は、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、またはＳである。いくつかの実施形態では、置換または変更は、任意の他の天然に存在するアミノ酸残基へのものである。「天然に存在するアミノ酸残基」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのような、２０個のアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、Ｗ３７またはＷ４７は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、またはメチオニンのような異なる疎水性残基で置換される。いくつかの実施形態では、Ｗ３７またはＷ４７は、フェニルアラニンまたはチロシンで置換される。

ヒト血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインの融合
いくつかの実施形態では、本開示は、血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインと少なくとも１つの追加の部分を含むコンジュゲートを提供する。追加の部分は、任意の診断、造影、または治療目的に有用でありうる。いくつかの実施形態において、追加の部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗体、別のＦＮ３ドメインなどである。他のＦＮ３ドメインの例は、米国特許第８２７８４１９号、米国特許第９２０００５９号、第１００４０８４２号、第８５６９２２７号、第９２３４０２９号、第９９８２２５３号、第９２００２７３号、第９８９７６１２号、第１０１９６４４６号、第８４１５２９１号、第８６１７８９４号、第９６９５２２８号、第９７２５４９７号、第９１５６８８７号、もしくは第１０２８０２００号において提供されるものを含むが、それらに限定はされず、その各々が参照により、その中に提供される特定のＦＮ３ドメインを含め、全体として組み込まれ、または米国特許出願第１５／６２９０９０号、第１６／２１８９９０号、第１５／６３７２７６号、第１５／１４８３１２号、第１５／６１１２９６号、第１５／８３９９１５号、第１５／８４０２８１号、第１５／８４０３０３号、第６２／９１４６４３号、第６２／９１４６５４号、もしくは第６２／９１４７２５号において提供されるものを含むが、それらに限定はされず、その各々が参照により、その中に提供される特定のＦＮ３ドメインを含め、全体として組み込まれる。

特定の実施形態において、記載のＦＮ３ドメインに融合された部分の血清半減期は、ＦＮ３ドメインにコンジュゲートされていない場合における部分の血清半減期と比較して増加する。特定の実施形態において、ＦＮ３ドメイン融合物の血清半減期は、記載のＦＮ３ドメインに融合していない場合における部分の血清半減期に比べて、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％長い。他の実施形態では、ＦＮ３ドメイン融合物の血清半減期は、記載のＦＮ３ドメインに融合していない場合における部分の血清半減期よりも、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメイン融合物の血清半減期は、カニクイザルにおいて、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、または４０時間である。

したがって、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン融合分子は、治療薬部分と記載のＦＮ３ドメインとの間に融合を生じさせることにより、治療薬部分の半減期を増加させるのに有用である。そのような融合分子は、融合物に含まれる治療薬部分の生物学的活性に応答する状態を治療するために使用することができる。本開示は、以下のタンパク質または分子のいずれかの調節不全によって引き起こされる疾患における記載のＦＮ３ドメイン融合分子の使用を想定している。

異種部分
いくつかの実施形態では、記載のＦＮ３ドメインは、小さな有機分子、核酸分子、またはタンパク質である第２の部分に融合される。いくつかの実施形態において、記載のＦＮ３ドメインは、受容体、受容体リガンド、ウイルスコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、または細胞シグナル伝達タンパク質を標的とする治療薬部分に融合される。融合物は、第２の部分を、記載のＦＮ３ドメインのいずれかの末端、すなわち、ＦＮ３ドメイン－治療用分子または治療用分子－ＦＮ３ドメインの配置で結合させることによって形成することができる。

他の例示的な実施形態では、記載のＦＮ３ドメインは、１つまたはそれ以上の追加のＦＮ３ドメインに融合される。例えば、記載のＦＮ３ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の追加のＦＮ３ドメインに融合される。追加のＦＮ３ドメインは、血清アルブミン以外の同一または異なる標的に結合してもよい。ＦＮ３ドメインの例は、本明細書に提供され、参照により組み込まれる。

いくつかの実施形態において、記載のＦＮ３ドメインは、別の分子に連結される。いくつかの実施形態では、別の分子は、薬物または治療薬、タンパク質、抗体、ポリマー、毒素である。いくつかの実施形態では、別の分子は、ヒトアルブミン以外の分子に結合するＦＮ３ドメインである。いくつかの実施形態では、他のＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に結合する。いくつかの実施形態では、記載のＦＮ３ドメインは、別の分子に直接連結される。いくつかの実施形態では、記載のＦＮ３ドメインは、リンカーを介して別の分子に連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）_２（配列番号７１）、（ＧＧＧＳ）_２（配列番号７２）、（ＧＧＧＳ）_５（配列番号７３）、（ＡＰ）_２（配列番号７４）、（ＡＰ）_５（配列番号７５）、（ＡＰ）_１０（配列番号７６）、（ＡＰ）_２０（配列番号７７）およびＡ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番号７８）の配列を含む。

特定の実施形態において、本出願は、式：ＦＮ３－Ｘ－ＹまたはＹ－ＸＦＮ３によって表されるＦＮ３－Ｙ融合物を提供し、ここで、ＦＮ３は本明細書に記載されるＦＮ３ドメイン（任意のＮ末端および／またはＣ末端の延長を含む）であり、Ｘはポリペプチドリンカー（適切なリンカーは、例えば、配列番号７１～７８のいずれか１つを含む）であり、Ｙは本明細書に記載の治療薬部分である。

特定の実施形態では、本出願は、式：ＦＮ３－Ｘｉ－Ｃｙｓ－Ｘ_２－ＹまたはＹ－Ｘｉ－Ｃｙｓ－Ｘ_２－ＦＮ３によって表されるＦＮ３－Ｙ融合物を提供し、ここで、ＦＮ３は本明細書に記載されるＦＮ３ドメイン（任意のＮ末端および／またはＣ末端の延長を含む）であり、Ｘｉは任意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーは、例えば、配列番号７１～７８のいずれか１つを含む）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ_２は化学的に誘導されたスペーサーであり、Ｙは本明細書に記載の治療薬部分である。例示的な実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーは、本明細書においてさらに説明されるように、マイケル付加によって、治療薬部分を記載のＦＮ３ドメインのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートするために、または記載のＦＮ３ドメインを治療薬部分のＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートするために使用可能なマレイミド部分を含む。他の側面において、記載のＦＮ３ドメインは、２つまたはそれ以上の治療薬部分に結合していてもよい。例えば、２つの部分は、例えば、Ｘ－Ｙ－ＦＮ３、Ｘ－ＦＮ３－Ｙ、またはＦＮ３－Ｘ－Ｙのように、融合配列のＮ末端からＣ末端に向けて、様々な配置で記載のＦＮ３ドメインに結合することができ、ここで、ＸおよびＹは２つの異なる治療薬部分を表す。２つの異なる治療薬部分は、本明細書に開示される部分のいずれかから選択される。

特定の実施形態では、二重特異性ＦＮ３分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインを含み、第１のＦＮ３ドメインは、本明細書に記載の血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインを含み、第２のＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミン以外の標的タンパク質に結合する。

結合性ポリペプチドの脱免疫化
血清アルブミンバインダーおよびそれらの融合物のアミノ酸配列は、１つまたはそれ以上のＢ細胞またはＴ細胞エピトープを除去するように変更することができる。本明細書に記載のＦＮ３ドメイン融合物を含むタンパク質は、所定の種に対して非免疫原性、または免疫原性が低いものにするために、脱免疫化することができる。脱免疫化は、タンパク質の構造変化によって達成できる。当業者に知られている任意の脱免疫化技術を使用することができるが、例えば、その開示の全体が本明細書に組み込まれる国際公開第００／３４３１７号パンフレットを参照されたい。

一実施形態では、血清アルブミンバインダーおよびそれらの融合物の配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析することができる。例えば、ワールドワイドウェブのｓｉｔｅｗｅｈｉｌ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕで「モチーフ」データベースを検索するなどして、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースと比較を行うことができる。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、Ａｌｔｕｖｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９２４４～２５０頁（１９９５年））によって考案されたもののような計算的なスレッディング法を用いて同定してもよく、それにより、ポリペプチドからの連続的な重複するペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対するそれらの結合エネルギーについて試験される。計算による結合予測アルゴリズムは、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）、およびＭＨＣｐｒｅｄを含む。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を支援するために、両親媒性モチーフおよびロスバードモチーフのような上手く提示されるペプチドに関連する関連配列の特徴、ならびにカテプシンＢおよびその他のプロセッシング酵素の切断部位を検索することができる。

潜在的な（例えば、ヒト）Ｔ細胞エピトープを同定した後、これらのエピトープは、Ｔ細胞エピトープを除去するために必要とされる１つまたはそれ以上のアミノ酸の変更によって除去される。通常、これはＴ細胞エピトープ自体の中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の変更を伴う。これは、タンパク質の一次構造の点でエピトープに隣接するアミノ酸、または一次構造では隣接していないが分子の二次構造では隣接しているアミノ酸を変更することを伴い得る。想定される通常の変更は、アミノ酸の置換であるが、特定の状況では、アミノ酸の追加または欠失が適切となる可能性がある。最終的な分子を組換え宿主からの発現によって、例えば、十分に確立された方法によって調製できるように、全ての変更を組換えＤＮＡ技術によって達成することができるが、タンパク質化学の使用、または分子改変の他の手段もまた使用することができる。

同定されたＴ細胞エピトープを除去した後、脱免疫化された配列を再度分析して、新たなＴ細胞エピトープが生じていないことを確認し、もし生じている場合には、そのエピトープを削除することができる。

計算により同定された全てのＴ細胞エピトープを除去する必要があるわけではない。当業者は、特定のエピトープの「強さ」またはむしろ潜在的な免疫原性の重要性を理解するであろう。様々な計算方法により、潜在的なエピトープのスコアが生成される。当業者は、高いスコアのエピトープのみが除去される必要がありうることを認識するであろう。当業者はまた、潜在的なエピトープを除去することと、タンパク質の結合アフィニティーまたは他の生物学的活性を維持することとの間にバランスがあることも認識するであろう。したがって、１つの戦略は、記載のＦＮ３ドメインまたはＦＮ３ドメイン融合タンパク質に置換を順次導入し、次に標的結合または他の生物学的活性および免疫原性を試験することである。

追加の修飾
特定の実施形態において、血清アルブミンバインダーおよびそれらの融合物は、翻訳後修飾をさらに含んでいてもよい。例示的な翻訳後タンパク質修飾は、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の追加を含む。結果として、修飾された血清アルブミンバインダーおよびそれらの融合物は、脂質、多糖または単糖、およびリン酸塩のような非アミノ酸要素を含んでいてもよい。グリコシル化の好ましい形態は、１つまたはそれ以上のシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートするシアル化である。シアル酸部分は、溶解性と血清半減期を改善すると同時に、タンパク質の免疫原性の可能性を低減する。例えば、Ｒａｊｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年７月３１日；４０（３０）：８８６８～７６頁を参照。血清アルブミンバインダーまたはその融合物の機能性に対するそのような非アミノ酸要素の効果は、特定の血清アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＲｈＳＡ）に結合するそれらの能力および／または融合物の文脈における特定の非ＦＮ３部分によって付与される機能的役割（例えば、グルコース取り込みに対するＦＧＦ２１の効果）について試験される。

ベクター＆ポリヌクレオチドの実施形態
本開示には、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸配列もまた含まれる。当業者に理解されるように、ほとんど全てのアミノ酸は、３番目の塩基の縮重のために、コード性ヌクレオチド配列において、２つ以上のトリプレットコドンによって表すことができる。さらに、マイナーな塩基対の変化は、コードされるアミノ酸配列の保存的置換をもたらしうるが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変えるとは予想されない。したがって、本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸配列は、配列がわずかに改変されていても、なおもそれぞれの遺伝子産物をコードすることができる。

本明細書に開示される様々なタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。細胞内における発現を改善するために、コドン使用頻度を選択してもよい。そのようなコドン使用頻度は、選択された細胞のタイプに依存するであろう。大腸菌およびその他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば、以下を参照されたい：Ｍａｙｆｉｅｌｄら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００３年、１００（２）：４３８～４２頁；Ｓｉｎｃｌａｉｒら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ．２００２年（１）：９６～１０５頁；ＣｏｎｎｅｌｌＮＤ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１年（５）：４４６～９頁；Ｍａｋｒｉｄｅｓら、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ．１９９６年、６０（３）：５１２～３８頁；およびＳｈａｒｐら、Ｙｅａｓｔ．１９９１年、７（７）：６５７～７８頁。

核酸操作のための一般的な技術は、当業者の認識の範囲内であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第１～３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、第２版、１９８９年、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：ニューヨーク、１９８７年）および定期的な改訂版にも記載されている。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択的なオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。通常は複製起点によって付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が付加的に組み込まれる。適切な調節エレメントは、当技術分野でよく知られている。

本明細書に記載のタンパク質および融合タンパク質は、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として産生することができ、異種ポリペプチドは好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブのシグナル配列を認識およびプロセッシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌の場合、ネイティブのシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）アルファ因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号パンフレットに記載されているシグナルによって置換することができる。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動のシグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡに読み枠を合わせて連結される。

真核生物の宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含んでいるであろう。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、ときとして３’の非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含んでいる。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットおよびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。

組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用でありうる任意のタイプのタンパク質タグ配列も含むことができる。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグを含むが、これらに限定はされない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８５年）に見出すことができ、その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。

当業者には明らかであるように、発現コンストラクトは、宿主細胞に適切な方法を使用して宿主細胞中に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性因子である場合）を含むが、これらに限定されない、宿主細胞に核酸を導入するための様々な方法が当技術分野で知られている。

適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞を含む。適切な細菌は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．）を含む。酵母、好ましくはＳ．セレビシエのようなサッカロミセス種の酵母もまた、ポリペプチドの産生に使用することができる。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系を使用することもできる。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７、１９８８年）によってレビューされている。グリコシル化などのために脊椎動物細胞でタンパク質を産生することが望まれる場合もあり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が日常的な手順となっている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株を含む。多くの用途で、本明細書に記載されるタンパク質多量体の小さなサイズは、大腸菌を発現のための好ましい方法とするであろう。

タンパク質の産生
宿主細胞は、タンパク質生産のために本明細書に記載の発現またはクローニングベクターによって形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養される。

本発明のタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養される。宿主細胞の培養には、Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地が適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｓ．Ａ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０年）、米国特許第４７６７７０４号；第４６５７８６６号；第４９２７７６２号；第４５６０６５５号；もしくは第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；または米国再発行特許第３０９８５号に記載された培地のいずれかを宿主細胞に対する培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン、チミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通常、マイクロモル領域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を補充することができる。他の必要なサプリメントもまた、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

本明細書に開示されるタンパク質はまた、細胞翻訳系を用いて産生させることもできる。そのような目的のためには、タンパク質をコードする核酸は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写がｍＲＮＡを生成することを可能にし、利用される特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように改変されなければならない。例示的な真核生物の無細胞翻訳系は、例えば、哺乳動物または酵母の無細胞翻訳系を含み、例示的な原核生物の無細胞翻訳系は、例えば、細菌の無細胞翻訳系を含む。

本明細書に開示されるタンパク質はまた、化学合成によって（例えば、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４年、ＴｈｅＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、イリノイ州ロックフォードに記載の方法によって）生成することもできる。タンパク質への修飾は、化学合成によっても生成できる。

本明細書に開示されるタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に知られているタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分布、またはこれらの任意の組み合わせを含む。精製後、タンパク質は、濾過および透析を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている様々な方法のいずれかによって、異なるバッファー中に交換および／または濃縮することができる。

精製されたタンパク質は、好ましくは少なくとも８５％の純度であり、より好ましくは少なくとも９５％の純度であり、そして最も好ましくは少なくとも９８％の純度である。純度の正確な数値に関係なく、タンパク質は医薬品として使用するのに十分な純度である。

造影、診断および他の用途
本明細書で提供されるＦＮ３ドメイン融合物は、記載のＦＮ３ドメインに融合された異種分子のアイデンティティに基づいて、様々な疾患および障害を治療するために使用することができる。ＦＮ３ドメイン融合物の用途は、当技術分野の知識および本明細書に提供される情報に基づいて当業者によって決定される。様々なＦＮ３ドメイン融合タンパク質の使用が、本明細書に詳細に記載されている。ＦＮ３ドメイン融合物は、ヒトおよび非ヒト生物の両方を含む、任意の哺乳動物の対象または患者に投与することができる。

本明細書に記載の血清アルブミンバインダーおよび融合分子は、検出可能に標識され、例えば、造影または診断用途のために、融合分子によって結合されるタンパク質を発現する細胞に接触させるために使用される。タンパク質を検出可能な部位にコンジュゲートさせるためには、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ１４４：９４５（１９６２年）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：１０１４（１９７４年）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１年）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２年）を含む、当技術分野で公知の任意の方法を採用することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載される血清アルブミンバインダーおよび融合分子は、検出の可能な標識にさらに結合される（標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子である）。標識は、鉄キレートの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムのポジトロンエミッター、^４３Ｋ、^５２Ｆｅ、^５７Ｃｏ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３Ｔ、^１３２Ｉ、または^９９Ｔｃのような放射性物質であってもよい。そのような部分に結合した血清アルブミンバインダーまたは融合分子は、造影剤として使用することができ、ヒトのような哺乳動物における診断的使用に有効な量で投与され、その後、造影剤の局在化および蓄積が検出される。造影剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法または陽電子放出断層撮影法によって検出することができる。当業者には明らかなように、投与される放射性同位元素の量は、放射性同位元素に依存的である。当業者は、活性部分として使用される所与の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される造影剤の量を容易に処方することができる。

血清アルブミンバインダーおよび融合分子はまた、アフィニティー精製剤としても有用である。このプロセスにおいて、タンパク質は、当技術分野で公知の方法を使用して、セファデックス樹脂または濾紙などの適切な支持体上に固定化される。タンパク質は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイのような既知のアッセイ方法において使用できる（Ｚｏｌａ、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１４７～１５８頁（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年））。典型例

治療用製剤および投与様式
本発明は、記載のＦＮ３ドメインに融合された治療薬部分を投与するための方法を提供し、ここで、治療薬部分の半減期は、記載のＦＮ３ドメインに融合された場合に延長される。融合コンストラクトの投与のための技術および投薬量は、記載のＦＮ３ドメインに融合された治療薬部分のタイプおよび治療される特定の状態に応じて変化するが、当業者は容易に決定することができる。一般に、規制当局は、治療薬として使用されるタンパク質試薬が、許容可能に低いレベルの発熱物質を含むように製剤化されることを要求する。したがって、治療用製剤は、実質的にパイロジェンを含まないか、または少なくとも適切な規制当局（例えば、ＦＤＡ）によって決定された許容可能なレベル以下のパイロジェンを含むという点で、一般に他の製剤と区別されるであろう。特定の実施形態において、記載のＦＮ３ドメインおよびそれらの融合分子の医薬製剤は、例えば、ｐＨ４．０～７．０で１～２０ｍＭのコハク酸、２～１０％のソルビトール、および１～１０％のグリシンを含む。例示的な実施形態では、記載のＦＮ３ドメインおよびそれらの融合分子の医薬製剤は、例えば、ｐＨ６．０で１０ｍＭのコハク酸、８％のソルビトール、および５％のグリシンを含む。

いくつかの実施形態において、記載のＦＮ３ドメインおよびそれらの融合物は、哺乳動物、特にヒトにとって薬学的に許容可能である。「薬学的に許容される」ポリペプチドは、有意な医学的悪影響なしに動物に投与されるポリペプチドを指す。本明細書に開示される薬学的に許容されるＦＮ３ドメインおよびその融合物の例は、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠いたＦＮ３ドメイン、および本質的にエンドトキシンを含まない、またはエンドトキシンレベルが非常に低い組成物を含む。

治療用組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とともに、単位剤形で投与することができる。非限定的な例として、投与は非経口（例えば、静脈内、皮下）、経口、または局所でありうる。組成物は、経口投与用のピル、錠剤、カプセル、液体、もしくは徐放性錠剤の形態；静脈内、皮下もしくは非経口投与用の液体；または、局所投与用のゲル、ローション、軟膏、クリーム、もしくはポリマーもしくは他の徐放性ビヒクルであってもよい。

製剤を製造するための当技術分野でよく知られている方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ」（第２０版、Ａ．Ｒ．ＧｅｎｎａｒｏＡＲ．編、２０００年、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）に見出される。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来の油、または硬化ナフタレンを含んでいてもよい。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、化合物の放出を制御することができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用して、化合物の生体内分布を制御してもよい。他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系、およびリポソームを含む。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の投与量および投与経路を含む数多くの要因に応じて変化する。

ポリペプチドは、場合により、製薬業界で一般的に使用されている非毒性の酸付加塩または金属錯体のような薬学的に許容される塩として投与してもよい。酸付加塩の例は、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリック酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのような高分子酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸リン酸などのような無機酸を含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一例では、ポリペプチドは、熱安定性を高めるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。

経口使用のための製剤は、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含有する錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）でありうる。

経口使用のための製剤はまた、チュアブル錠として、または有効成分が不活性固体希釈剤と混合されるハードゼラチンカプセルとして、または有効成分が水もしくは油性媒体と混合されるソフトゼラチンカプセルとしても提供されうる。

治療上有効な用量とは、治療効果を生じる、それが投与される用量を指す。正確な用量は、治療される障害に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認される。一般に、ＦＮ３ドメイン融合物は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回、もしくは４回）または、より少ない頻度（例えば、１日おきに１回、週に１回もしくは２回、または毎月）で与えられる。さらに、当技術分野で知られているように、年齢ならびに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重症度についての調整が必要な場合があるが、当業者によるルーチン的な実験によって確かめられるであろう。

ヒト血清アルブミンを検出するためのキット
本明細書で提供されるのは、生物学的試料中のヒト血清アルブミンを検出するためのキットである。これらのキットは、１つまたはそれ以上の本明細書に記載の血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメイン、およびキットの使用説明書を含む。

提供される血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインは、溶液中にあるか；凍結乾燥されているか；基質、担体、もしくはプレートに固定されているか；または検出可能に標識されたものであってもよい。

記載のキットはまた、本明細書に記載された方法を実行するために有用な追加の構成要素を含んでいてもよい。例として、キットは、対象から試料を取得するための手段、対照もしくは参照試料、例えば、ゆっくりと進行する癌を有する対象および／または癌を有さない対象からの試料、１つまたはそれ以上の試料コンパートメント、および／または本発明の方法および組織特異的な対照もしくは標準の性能を説明する教材を含んでいてもよい。

血清アルブミンのレベルを決定するための手段は、例えば、血清アルブミンのレベルを決定するためのアッセイで使用するためのバッファーまたは他の試薬をさらに含むことができる。説明書は、例えば、アッセイを実行するための印刷された説明書および／または血清アルブミンのレベルを評価するための説明書であり得る。

記載のキットは、対象から試料を単離するための手段も含みうる。これらの手段は、対象から流体または組織を取得するために使用することができる機器または試薬の１つまたはそれ以上のアイテムを含むことができる。対象から試料を取得するための手段はまた、血液試料から血清のような血液成分を単離するための手段を含んでいてもよい。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用するように設計されている。

本明細書に記載の実施形態は、生物学的試料中のヒト血清アルブミンの存在を検出する方法であって、生物学的試料を本明細書に記載のアルブミン結合性ＦＮ３ドメインと接触させること、およびタンパク質に対する生物学的試料の結合を評価することを含む方法に向けられている。

本明細書に記載の実施形態は、ヒト対象における標的分子の半減期を延長する方法であって、本明細書に記載の血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインを標的分子に結合させることを含み、それによりヒト対象における標的分子の半減期を延長する方法に向けられている。いくつかの実施形態では、本方法は、コンジュゲートされた分子をヒトに投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、薬物、抗体、ヒト血清アルブミン以外の分子に結合するＦＮ３ドメイン、または毒素である。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＳ）_２（配列番号７１）、（ＧＧＧＳ）_２（配列番号７２）、（ＧＧＧＳ）_５（配列番号７３）、（ＡＰ）_２（配列番号７４）、（ＡＰ）_５（配列番号７５）、（ＡＰ）_１０（配列番号７６）、（ＡＰ）_２０（配列番号７７）およびＡ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番号７８）の配列を含む。

以下の実施例は、以前の開示を補足し、本明細書に記載されている主題のより良い理解を提供するために提供されている。これらの実施例は、説明されている主題を制限するものと見なされるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らした様々な修正または変更が当業者には明らかであって、本発明の真の範囲内に含まれるものであり、それから逸脱することなく行うことができることが理解される。

ランダム化されたループを使用したＴＥＮＣＯＮライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣからの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様スカフォールド、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７頁、２０１２年；米国特許第８２７８４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータストランドを接続する６つの表面露出ループを示す。これらのループ、または各ループ内の選択された残基は、特異的な標的に結合する新規分子を選択するために使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するためにランダム化してもよい。

Ｔｅｎｃｏｎ：

Ｔｅｎｃｏｎスカフォールドと様々な設計戦略を使用して、様々なライブラリを生成した。一般に、ライブラリＴＣＬ１とＴＣＬ２が優れたバインダーを生成した。ＴＣＬ１、ＴＣＬ２ライブラリの作製については、国際公開第２０１４０８１９４４号パンフレットに詳しく記載されている。

ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループ、ＴＣＬ１のみをランダム化するように設計されたライブラリは、ｃｉｓディスプレイ系で使用するために構築した（Ｊａｃｏｂｓら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７～１１７頁、２０１２年）。この系では、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント、およびｏｒｉエレメントの配列を組み込んだ二本鎖ＤＮＡが生成される。Ｉｎｖｉｔｒｏの転写／翻訳系で発現させると、Ｔｅｎｃｏｎ－ＲｅｐＡ融合タンパク質とそれをコードするＤＮＡがｃｉｓに結合した複合体が生成される。次に、標的分子に結合する複合体は、以下に説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離および増幅される。

Ｃｉｓディスプレイで使用するためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウンドによって達成され、２つの半分に分かれた最終的な直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子を生成した；５’フラグメントはプロモーターおよびＴｅｎｃｏｎ配列を含み、３’フラグメントはｒｅｐＡ遺伝子ならびにｃｉｓおよびｏｒｉエレメントを含む。これらの２つの半分は、全体のコンストラクトを生成するために、制限消化によって組み合わされる。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号３２）にのみランダムなアミノ酸を組み込むように設計した。このライブラリの構築にはＮＮＳコドンが使用され、その結果、２０のアミノ酸全てと１つの停止コドンがＦＧループに組み込まれる可能性がある。ＴＣＬ１ライブラリは、多様性をさらに高めるために、それぞれが７～１２残基の異なるランダム化ＦＧループ長を持つ、６つの別個のサブライブラリを含んでいる。

ＴＣＬ１ライブラリ（配列番号２）

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は、任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１およびＸ_１２は、任意のアミノ酸であるか、または削除されている

ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣループとＦＧループの両方がランダム化され、各位置におけるアミノ酸の分布が厳密に制御されているＴＣＬ２ライブラリを構築した。表２は、ＴＣＬ２ライブラリ中の所望のループ位置におけるアミノ酸分布を示している。設計されたアミノ酸分布には２つの目的があった。第１に、ライブラリは、Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造の分析に基づいて、および／またはホモロジーモデリングから、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディングと安定性に構造的に重要であると予測された残基への偏りを有していた。例えば、位置２９は、この残基がＴｅｎｃｏｎの折り畳みの疎水性コアに埋め込まれているため、疎水性アミノ酸のサブセットのみに固定した。設計の第２の層は、アフィニティーの高いバインダーを効率的に生成するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に見られる残基に向けてアミノ酸分布に偏りを持たせることを含んでいた（Ｂｉｒｔａｌａｎら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ３７７：１５１８～２８頁、２００８年；Ｏｌｓｏｎら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１６：４７６～８４頁、２００７年）。この目標に向け、表２の「設計された分布」は、以下の分布を指している：６％のアラニン、６％のアルギニン、３．９％のアスパラギン、７．５％のアスパラギン酸、２．５％のグルタミン酸、１．５％のグルタミン、１５％のグリシン、２．３％のヒスチジン、２．５％のイソロイシン、５％のロイシン、１．５％のリジン、２．５％のフェニルアラニン、４％のプロリン、１０％のセリン、４．５％のスレオニン、４％のトリプトファン、１７．３％のチロシン、および４％のバリン。この分布には、メチオニン、システイン、および終止コドンは含まれていない。

ＴＣＬ２ライブラリ（配列番号３）

式中、
Ｘ_１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＴｙｒであり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＴｈｒであり；
Ｘ_９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；そして
Ｘ_１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである。

その後、これらのライブラリは、野生型Ｔｅｎｃｏｎと比較した置換Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２７；配列番号４）を組み込んだ安定化Ｔｅｎｃｏｎフレームワーク（米国特許第８５６９２２７号）上でのライブラリの構築、ならびにＢＣおよびＦＧループにおけるランダム化位置の変更を含む、種々の方法により改良された。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際公開第２０１３０４９２７５号パンフレットに記載されている。これから、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループのみ（ライブラリＴＣＬ９）、またはＢＣループとＦＧループの組み合わせ（ライブラリＴＣＬ７）をランダム化するように設計された新しいライブラリを生成した。これらのライブラリは、ｃｉｓディスプレイ系で使用するために構築した（Ｏｄｅｇｒｉｐら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１：２８０６～２８１０頁、２００４年）。この設計の詳細を以下に示す：

安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号４）

ＴＣＬ７（ランダム化されたＦＧおよびＢＣループ）（配列番号５）

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５およびＸ_１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹ；であり、そして
Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１７、Ｘ_１８およびＸ_１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか、または削除されている。

ＴＣＬ９（ランダム化されたＦＧループ）（配列番号６）

Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６およびＸ_７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１およびＸ_１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか、または削除されている。

ライブラリ構築では、ライブラリのアミノ酸分布を制御し、終止コドンを排除するために、ランダム化されたＢＣループ（長さ６～９の位置）またはＦＧループ（長さ７～１２の位置）をコードするＤＮＡフラグメントをＳｌｏｎｏｍｉｃｓテクノロジー（ＳｌｏｎｉｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｍｂＨ）を使用して合成した。ＢＣループまたはＦＧループのいずれかをランダム化する２つの異なるＤＮＡ分子セットを個別に合成し、後にＰＣＲを用いて組み合わせて完全なライブラリ産物を生成した。

ＦＧループライブラリの構築（ＴＣＬ９）
５’Ｔａｃプロモーターとそれに続く、ＦＧループ内のランダム化されたコドンを除いてＴｅｎｃｏｎの完全な遺伝子配列からなる合成ＤＮＡ分子のセットを生成した（配列番号２６～３１）。ＦＧループのランダム化では、システインとメチオニンを除く全てのアミノ酸を同じ割合でコード化した。多様化させた部分の長さは、それらがＦＧループ内において７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸をコードするようなものである。各長さのバリエーションのサブライブラリを２μｇのスケールで個別に合成し、その後、オリゴＳｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ（配列番号９）およびＳｌｏｎｉｎｇ－Ｒｅｖ（配列番号１０）を使用したＰＣＲによって増幅した。

ライブラリの３’フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、ならびにｃｉｓおよびｏｒｉエレメントを含む、提示のための要素を含む一定のＤＮＡ配列である。このフラグメントを増幅するために、プラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとしてＭ１３ＦｏｒｗａｒｄおよびＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを使用してＰＣＲ反応を実行した。得られたＰＣＲ産物をＰｓｐＯＭＩで一晩消化し、ゲルで精製した。ライブラリＤＮＡの５’部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む３’ＤＮＡに連結するために、ＮｏｔＩおよびＰｓｐＯＭＩ酵素とＴ４リガーゼの存在下、３７℃で一晩、２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇから５６０ｎｇ）の５’ＤＮＡを等モル（約１．２５μｇ）の３’ｒｅｐＡＤＮＡに連結させた。連結されたライブラリ産物をオリゴＰＯＰ２２５０（配列番号１１）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号１２）を用いた１２サイクルのＰＣＲを使用して増幅した。各サブライブラリについて、１２回のＰＣＲ反応から得られたＤＮＡを組み合わせて、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムで精製した。ＴＣＬ９の各サブライブラリの収量は３２～３４μｇの範囲であった。

ＦＧ／ＢＣループライブラリ（ＴＣＬ７）の構築
ＴＣＬ７ライブラリは、ランダム化されたＴｅｎｃｏｎＢＣおよびＦＧループを備えたライブラリを提供する。このライブラリでは、長さが６～９アミノ酸のＢＣループが、長さが７～１２アミノ酸のランダム化されたＦＧループと組み合わせ的に混合された。合成ＴｅｎｃｏｎフラグメントＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、およびＢＣ９（配列番号１３～１６）は、ＢＣループが６、７、８、または９個のランダム化されたアミノ酸で置換されるように、残基ＶＸを含むそこまでのタンパク質のＮ末端部分をコードするＴｅｎｃｏｎ遺伝子を含むように作成した。これらのフラグメントは、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８３Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）が発見される前に合成されたが、これらの変異は、以下に記載する分子生物学工程において導入された。このフラグメントをランダム化されたＦＧループをコードするフラグメントと組み合わせるために、以下の工程を実行した。

まず、Ｔａｃプロモーターおよびアミノ酸Ａ１７（１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ、配列番号１７）をコードするヌクレオチドまでのＴｅｎｃｏｎの５’配列をコードするＤＮＡフラグメントをオリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号１８）およびＬＳ１１１４（配列番号１９）を使用したＰＣＲによって生成した。これは、ライブラリ（ＣＥＮ５２４３）中にＬ１７Ａ変異を含めるために行った。次に、ランダム化されたＢＣループを含むＴｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８～Ｖ７５をコードするＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、またはＢＣ９を使用し、オリゴＬＳ１１１５（配列番号２０）およびＬＳ１１１７（配列番号２１）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ工程は、３’末端にＢｓａＩサイトを導入した。続いて、プライマーとしてオリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔとＬＳ１１１７を使用したオーバーラップＰＣＲによって、これらのＤＮＡフラグメントを結合した。その結果生じる２４０ｂｐのＰＣＲ産物をプールし、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットにより精製した。精製したＤＮＡをＢｓａＩ－ＨＦで消化し、ゲルで精製した。

ＢｓａＩ制限部位とＮ４６ＶおよびＥ８６Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）を組み込むために、ＦＧ７（配列番号３１）、ＦＧ８（配列番号３０）、ＦＧ９（配列番号２９）、ＦＧ１０（配列番号２８）、ＦＧ１１（配列番号２７）、およびＦＧ１２（配列番号２６）をテンプレートとして用いて、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号２２）およびＳＤＧ２４（配列番号２３）によって、ＰＣＲによりＦＧループをコードするフラグメントを増幅した。

消化されたＢＣフラグメントとＦＧフラグメントは、３方向連結を使用して１つの工程で一緒に連結させた。各連結反応が２つのＢＣループ長と２つのＦＧループ長を組み合わせる、１６の可能な組み合わせで４つの連結反応を設定した。各連結は、約３００ｎｇの総ＢＣフラグメントと３００ｎｇのＦＧフラグメントを含んでいた。次に、これら４つの連結プールを、オリゴＰＯＰ２２２２（配列番号２４）およびＳＤＧ２８（配列番号２５）を用いたＰＣＲによって増幅した。次に、７．５μｇの各反応生成物をＮｏｔ１で消化し、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製カラムで浄化した。このＤＮＡの５．２μｇをＰｓｐＯＭＩで消化した等モル量のＲｅｐＡＤＮＡフラグメント（約１４μｇ）に連結し、オリゴＰＯＰ２２２２を使用したＰＣＲによって生成物を増幅した。

代替的な結合表面を有するＴＥＮＣＯＮライブラリの生成
特定のライブラリ設計においてランダム化される残基の選択は、生成される相互作用表面の全体的な形状を決定する。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループがランダム化されたライブラリからマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するために選択されたスカフォールドタンパク質を含むＦＮ３ドメインのＸ線結晶構造解析は、ＭＢＰの活性部位にフィットする大きく湾曲した界面を有することが示された（Ｋｏｉｄｅら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０４：６６３２～６６３７頁、２００７年）。対照的に、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリンリピートスカフォールドタンパク質は、はるかに平面的な相互作用表面を有し、活性部位から離れたＭＢＰの外表面に結合することが見出された（Ｂｉｎｚら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２２：５７５～５８２頁、２００４年）。これらの結果は、スカフォールド分子の結合表面の形状（湾曲対平坦）が、どのような標的タンパク質またはそれらの標的タンパク質上の特定のエピトープがスカフォールドによって効果的に結合できるかを決定しうることを示唆している。タンパク質結合のためにＦＮ３ドメインを含むタンパク質スカフォールドを改変することに関する公表された取り組みは、標的結合のために隣接するループを改変することに依存しており、したがって湾曲した結合表面を生成する。このアプローチは、そのようなスカフォールドによってアクセス可能な標的およびエピトープの数を制限しうる。

Ｔｅｎｃｏｎおよび他のＦＮ３ドメインは、分子の反対側の面に位置する２セットのＣＤＲ様ループを含んでおり、第１のセットは、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループによって形成され、第２のセットはＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループによって形成される。２セットのループは、ＦＮ３構造の中心を形成するベータストランドによって分離されている。Ｔｅｎｃｏｎの画像を９０度回転させると、他方の表面を視覚化できる。このわずかに凹状の表面は、ＣＤおよびＦＧループと２つの逆平行ベータストランド、ＣおよびＦベータストランドによって形成され、ここではＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面と呼ばれる。Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面は、表面を形成する残基のサブセットをランダム化することにより、タンパク質スカフォールド相互作用表面のライブラリを設計するためのテンプレートとして使用できる。ベータストランドは、残基の側鎖が１つおきにタンパク質の表面に露出する繰り返し構造を有している。したがって、ベータストランドの表面に露出した残基の一部または全てをランダム化することによって、ライブラリを作成できる。ベータストランドの適切な残基を選択することにより、Ｔｅｎｃｏｎスカフォールドの固有の安定性の損失が最小限に抑えられ、他のタンパク質との相互作用のための独特なスカフォールド表面が提供されるべきである。

ライブラリＴＣＬ１４（配列番号７）は、Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号４）中に設計された。

このライブラリを構築するために使用された方法の完全な記載は、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。

ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号７）：

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２およびＸ_１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、またはＭである。

Ｔｅｎｃｏｎ２７のＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面を形成する２つのベータストランドは、ランダム化され得る合計９つの表面露出残基、Ｃストランド：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６；Ｆストランド：Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、およびＶ７４を有しており、一方、ＣＤループには６つの潜在的な残基：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、およびＥ４３があり、そしてＦＧループには７つの潜在的な残基：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、およびＮ８１がある。２２残基全てがランダム化された場合、ライブラリの理論上のサイズが大きくなるため、ＴＣＬ１４の設計に含めるために、選抜された残基を選択した。

Ｔｅｎｃｏｎ中の１３の位置をランダム化のために選択した：ＣストランドのＬ３２、Ｑ３４およびＱ３６、ＣＤループのＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０およびＶ４１、ＦストランドのＴ６８、Ｓ７０およびＹ７２、ＦＧループのＨ７８、Ｒ７９、およびＮ８１。ＣおよびＦストランドにおいて、Ｓ３０およびＥ６６は、ＣＤおよびＦＧループのすぐ先にあり、明らかにＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の一部ではないように見えるため、ランダム化しなかった。ＣＤループでは、グリシンは柔軟性を提供し、ループ領域において役立つことができ、また、Ｅ４３は表面の接合部にあることから、Ｇ４２とＥ４３はランダム化しなかった。ＦＧループでは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、およびＳ８０が除外された。グリシンは上記の理由で除外されたが、結晶構造を注意深く検討したところ、Ｓ８０がコアと重要な接触を形成し、安定なＦＧループを形成するのを助けることが明らかになった。Ｋ７５は、Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の表面とは反対側を向いており、ランダム化の候補としてはあまり魅力的でなかった。上記の残基は元のＴＣＬ１４設計ではランダム化されていなかったが、それらを後続のライブラリ設計に含めて、ｄｅｎｏｖｏセレクション、または例えば、選択したＴＣＬ１４標的に固有のヒットに対するアフィニティー成熟ライブラリのための追加の多様性を提供することができる。

ＴＣＬ１４の生成に続いて、同様の設計の３つの追加のＴｅｎｃｏｎライブラリを生成した。これらの２つのライブラリ、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同じ位置でランダム化されているが（上記を参照）、これらの位置において生じるアミノ酸の分布は変更されている（表３）。ＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１は、システインとメチオニンのみを除く１８個の天然アミノ酸が全ての位置に均等に分布するように設計されている（それぞれ５．５５％）。ＴＣＬ２３は、表２に記載されているように、各ランダム化位置が機能的抗体のＨＣＤＲ３ループにおいて見られるアミノ酸分布に近似するように設計した（Ｂｉｒｔａｌａｎら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ３７７：１５１８～１５２８頁、２００８年）。ＴＣＬ２１ライブラリと同様に、システインとメチオニンは除外した。

他のライブラリの潜在的な標的結合表面を拡大するために、第３の追加のライブラリを構築した。このライブラリ、ＴＣＬ２４では、ライブラリＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３と比較して、４つの追加のＴｅｎｃｏｎ位置をランダム化した。これらの位置は、ＤストランドからのＮ４６とＴ４８、およびＧストランドからのＳ８４とＩ８６を含む。位置４６、４８、８４、および８６は、これらの残基の側鎖がベータストランドＤおよびＧから表面に露出し、ＣおよびＦストランドのランダム化された部分に構造的に隣接しており、標的タンパク質への結合のためにアクセス可能な表面積が増加するため、特に選択した。ＴＣＬ２４の各位置で使用されるアミノ酸分布は、表３でＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１について説明されているものと同じである。

ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号８）

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２およびＸ_１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷである。

ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４ライブラリの生成
ＴＣＬ２１ライブラリは、アミノ酸分布を制御するためにＣｏｌｉｂｒａライブラリテクノロジー（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を用いて作成した。ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４遺伝子フラグメントは、アミノ酸分布を制御するためにＳｌｏｎｏｍｉｃｓテクノロジー（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して作成した。ループライブラリについて上述したように、ＣＩＳディスプレイ系（Ｏｄｅｇｒｉｐら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１：２８０６～２８１０頁、２００４年）を用いたセレクションに使用するために、最初の合成に続いてＰＣＲを用いて各ライブラリを増幅し、その後、ＲｅｐＡ用遺伝子への連結を行った。

ヒト血清アルブミンと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのセレクション
ライブラリスクリーニング
ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４ライブラリからヒト血清アルブミン結合性ドメインを選択するためにｃｉｓディスプレイを使用した。組換えヒトおよびカニクイザル血清アルブミンおよびヒトアルブミンドメインＩＩ（ＡｌｂｕｍｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準的な方法を使用してビオチン化し、パニングに使用した。Ｉｎｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＴＴ）のために、総容量５０μＬの０．１ｍＭ完全アミノ酸、１×Ｓ３０プレミックス成分、および１５μＬのＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに３μｇのライブラリＤＮＡを３０℃でインキュベートした。１時間後、３７５μＬのブロッキング溶液（０．１％カゼイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、イリノイ州ロックフォード）、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）、１ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス））を加え、反応物を氷上で１５分間インキュベートした。セレクションのために、ビオチン化した抗原を４００ｎＭ（ラウンド１）、２００ｎＭ（ラウンド２および３）および１００ｎＭ（ラウンド４および５）の濃度で添加した。ニュートラアビジン磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、イリノイ州ロックフォード）（ラウンド１、３、および５）またはストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）（ラウンド２および４）を用いて結合したライブラリメンバーを回収し、未結合のライブラリメンバーは、５００μＬのＰＢＳＴで５～１４回、その後５００μＬのＰＢＳで２回ビーズを洗浄して除去した。アフィニティーが改善されたＦＮ３ドメイン分子を同定するために、追加のセレクションラウンドを行った。簡単に説明すると、ラウンド５からの出力を上記のようにして準備し、以下の変更を有する追加のセレクション反復ラウンドにかけた：ビオチン化抗原とのインキュベーションを１時間から１５分に短縮し、ビーズの捕捉を２０分から１５分に短縮し、ｂｔ－ＨＳＡは２５ｎＭ（ラウンド６および７）または２．５ｎＭ（ラウンド８および９）に減らし、過剰の非ビオチン化標的タンパク質の存在下でさらに１時間の洗浄を行った。これらの変更の目的は、実質的に低いＫ_Ｄをもたらす潜在的により速いオンレートとより遅いオフレートを有するバインダーを同時に選択することであった。

パンニングの後、選択されたＦＮ３ドメインをオリゴＴｃｏｎ６（配列番号３３）およびＴｃｏｎ５ｓｈｏｒｔＥ８６Ｉ（配列番号３４）を用いてＰＣＲにより増幅し、アニーリングによりｐＥＴ１５－ＬＩＣ中にサブクローニングし、標準的な分子生物学技術を用いて大腸菌内で可溶発現させるためにＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ）を形質転換した。単一のクローンを選び取り、３７℃の９６ディープウェルプレート中、アンピシリンを含む１ｍＬのＬＢで飽和状態まで増殖させた。翌日、２５μＬを９６ディープウェルプレート中の新鮮な１ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地に移し、３７℃で２時間培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、タンパク質発現を３０℃で１６時間誘導した。遠心分離によって細胞を回収した後、０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度でニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を添加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ニュージャージー州ギブズタウン）により溶解した。細菌溶解物を遠心分離によって清澄化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡによって標的タンパク質への結合について試験した。

ヒト血清アルブミンと結合するＦＮ３ドメインのセレクション
ヒト血清アルブミンバインダーを同定するために、選択されたパンニング出力からの個々のクローンに対して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、イリノイ州ロチェスター）を５μｇのＨＳＡ、カニクイザルＳＡまたは５μｇ／ｍｌのＦｃで一晩コーティングし（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋＴ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、イリノイ州ロックフォード）を使用してブロッキングした。清澄化された細菌溶解物（上記）を、コーティングされたＨＳＡ、ｃＳＡおよびＦｃプレートのウェルにアプライした。プレートを１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＭ５プレートリーダーを使用して、結合したセンチリンを抗Ｖ５タグ抗体およびＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）で検出した。ヒットは、Ｆｃの結合シグナルに対して＞１０のヒトおよびカニクイザル血清アルブミンの結合シグナルとして定義した。

１つのＦＮ３ドメイン、Ｂ７は、以下の表４に示されるように、ヒトおよびカニクイザルアルブミンに対して、ならびにヒトアルブミンのドメインＩＩに対して有意な結合を示した。ヒトＳＡへの結合に重要な残基を、推定上の結合部位の各残基が個別にアラニンに変異しているバリアントを調製することによってさらに特徴付けた。表５は、ドメインＩＩに結合するＦＮ３ドメインおよびアラニンバリアントの完全なアミノ配列を示している。配列番号５１をＨ９の配列（配列番号７０）と比較したところ、カニクイザルにおける半減期が有意に増加していることが見出された。これは予想外であった。

小スケールでの発現と精製はヒト血清アルブミンと結合するＦＮ３ドメインを同定した
選抜ＦＮ３ドメインのクローンを選び取り、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１ｍＬルリアブロス（ＬＢ）（ＬＢ－Ａｍｐ培地）中、９６ディープウェルプレートにおいて３７℃で飽和まで増殖させた。翌日、２５μＬを２４ディープウェルプレート中の新鮮な５ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地に移し、３７℃で２時間培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、タンパク質発現を３０℃で１６時間誘導した。細胞を遠心分離により回収し、０．２ｍｇ／ｍＬ最終濃度でニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を添加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ニュージャージー州ギブズタウン）により溶解した。細菌溶解物を遠心分離によって清澄化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移した。Ｈｉｓタグを付けたＦＮ３ドメインは、９６ウェルＮｉ－ＮＴＡマルチトラッププレートを使用して、メーカーの推奨（ＧＥＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に従って精製した。

サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ヒト血清アルブミンと結合するＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインの一定分量（１０μＬ）を、ＰＢＳｐＨ７．４の移動相中、流速０．３ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５５／１５０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムからの溶出は、２８０ｎｍにおける吸光度によってモニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集を示したＦＮ３ドメインは、さらなる分析から除外した。

ヒト血清アルブミン結合性ＦＮ３ドメインの特徴付け
ヒト血清アルブミン－ＦＮ３ドメイン複合体の免疫沈降
バインダーの機能性を評価するために、正常な血清中の内在性アルブミンと複合体化する能力について、選択したＦＮ３ドメインを試験した。これを決定する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／６１１２９６号中に提供されている。ほとんどの配列は、置換を有するものでさえ、アルブミンと結合してプルダウンすることが見出された。特定の位置は、アラニン置換を許容しない場合があるが、これらの位置における他の置換は、アルブミン相互作用を排除することなく行われうる。結果を表６に示す。

ＦＮ３タンパク質はまた、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、固定化されたヒトまたはカニクイザルのアルブミンに結合するそれらの能力を決定するために試験された。６６７ｎＭのＢ７およびＢ７バリアントのヒトまたはカニクイザルのアルブミンへの結合を表７に示す。陰性対照は野生型Ｔｅｎｃｏｎである。

カニクイザルにおけるアルブミン結合性ＦＮ３ドメインの薬物動態：
Ｂ７およびＨ９を用いてｉｎｖｉｖｏ試験を実施した。静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって５ｍｇ／ｋｇの用量のＢ７またはＨ９のいずれかをカニクイザルに投与した。投与の方法およびタンパク質の濃度を決定するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／６１１２９６号に記載の方法に従って決定した。図１および２は、Ｂ７またはＡＬＢ４０と呼ばれるアルブミンＦＮ３ドメインの半減期の増加を含む薬物動態を示している。

配列情報

配列番号１＝元のＴｅｎｃｏｎ配列

配列番号２＝ＴＣＬ１ライブラリ

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は、任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１およびＸ_１２は、任意のアミノ酸であるか、または削除されている。

配列番号３＝ＴＣＬ２ライブラリ

配列番号４＝安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）

配列番号５＝ＴＣＬ７（ＦＧおよびＢＣループ）

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５およびＸ_１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；そして
Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１７、Ｘ_１８およびＸ_１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか、または削除されている。

配列番号６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６およびＸ_７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹであり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１およびＸ_１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか、または削除されている。

配列番号７＝ＴＣＬ１４ライブラリ

配列番号８＝ＴＣＬ２４ライブラリ

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷである。

配列番号９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ

配列番号１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＲＥＶ

配列番号１１＝ＰＯＰ２２５０

配列番号１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ

配列番号１３＝ＢＣ９

配列番号１４＝ＢＣ８

配列番号１５＝ＢＣ７

配列番号１６＝ＢＣ６

配列番号１７＝１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ

配列番号１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ

配列番号１９＝ＬＳ１１１４

配列番号２０＝ＬＳ１１１５

配列番号２１＝ＬＳ１１１７

配列番号２２＝ＳＤＧ１０

配列番号２３＝ＳＤＧ２４

配列番号２４＝ＰＯＰ２２２２

配列番号２５＝ＳＤＧ２８

配列番号２６＝ＦＧ１２

配列番号２７＝ＦＧ１１

配列番号２８＝ＦＧ１０

配列番号２９＝ＦＧ９

配列番号３０＝ＦＧ８

配列番号３１＝ＦＧ７

配列番号３２ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ

配列番号３３＝Ｔｃｏｎ６

配列番号３４＝Ｔｃｏｎ５Ｅ８６Ｉｓｈｏｒｔ

配列番号３５元のＴｅｎｃｏｎのＣストランド

配列番号３６ＡＬＢ－Ｅ０５のＣストランド

配列番号３７ＡＬＢ－Ｅ０７のＣストランド

配列番号３８ＡＬＢ－Ｈ９のＣストランド

配列番号３９元のＴｅｎｃｏｎのＣＤループ

配列番号４０ＡＬＢ－Ｅ０５のＣＤループ

配列番号４１ＡＬＢ－Ｅ０７のＣＤループ

配列番号４２ＡＬＢ－Ｈ９のＣＤループ

配列番号４３元のＴｅｎｃｏｎのＦストランド

配列番号４４ＡＬＢ－Ｅ０５のＦストランド

配列番号４５ＡＬＢ－Ｅ０７のＦストランド

配列番号４６ＡＬＢ－Ｈ９のＦストランド

配列番号４７元のＴｅｎｃｏｎのＦＧループ

配列番号４８ＡＬＢ－Ｅ０５のＦＧループ

配列番号４９ＡＬＢ－Ｅ０７のＦＧループ

配列番号５０ＡＬＢ－Ｈ９のＦＧループ

Ｂ７－配列番号５１

Ａ１０Ｖ配列番号５２

Ａ１０Ｖ、Ｎ３３Ａ配列番号５３

Ａ１０Ｖ、Ａ３５Ｓ配列番号５４

Ａ１０Ｖ、Ｗ３７Ａ配列番号５５

Ａ１０Ｖ、Ｐ３９Ａ配列番号５６

Ａ１０Ｖ、Ｇ４０Ａ配列番号５７

Ａ１０Ｖ、Ｉ４１Ａ配列番号５８

Ａ１０Ｖ、Ｇ４２Ａ配列番号５９

Ａ１０Ｖ、Ｗ４７Ａ配列番号６０

Ａ１０Ｖ、Ｒ４９Ａ配列番号６１

Ａ１０Ｖ、Ｋ６９Ａ配列番号６２

Ａ１０Ｖ、Ｗ７１Ａ配列番号６３

Ａ１０Ｖ、Ｈ７３Ａ配列番号６４

Ａ１０Ｖ、Ａ７９Ｓ配列番号６５

Ａ１０Ｖ、Ｓ８０Ａ配列番号６６

Ａ１０Ｖ、Ｐ８２Ａ配列番号６７

Ａ１０Ｖ、Ｉ８５Ａ配列番号６８

Ａ１０Ｖ、Ｒ８７Ａ配列番号６９

配列番号７０ＡＬＢ－Ｈ９

配列番号７１（ＧＳ）_２

配列番号７２（ＧＧＧＳ）_２

配列番号７３（ＧＧＧＧＳ）_２

配列番号７４（ＡＰ）_２

配列番号７５（ＡＰ）_５

配列番号７６（ＡＰ）_１０

配列番号７７（ＡＰ）_２０

配列番号７８Ａ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ

配列番号７９ヒト血清アルブミン

配列番号８０カニクイザル血清アルブミン

配列番号８１テネイシンＣ（ＴＮ３）

配列番号８２Ｆｉｂｃｏｎ

配列番号８３ＦＮ１０

Claims

ヒト血清アルブミンに結合するＦＮ３ドメインタンパク質であって、配列番号５１、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６６、６７、または６９のアミノ酸配列を含む前記ＦＮ３ドメインタンパク質、またはヒト血清アルブミンに結合するＦＮ３ドメインタンパク質であって、配列番号５１、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６６、６７、または６９のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む前記ＦＮ３ドメインタンパク質。
配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６１、または８８に対応する少なくとも１つの残基位置にシステイン残基を含む、請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
ＦＮ３ドメインタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にシステインをさらに含む、請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
配列番号５１の位置１０に対応する位置に置換を含む、請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
ＦＮ３ドメインタンパク質は、Ａ１０Ｖ、Ｎ３３Ａ、Ａ３５Ｓ、Ｗ３７Ａ、Ｐ３９Ａ、Ｇ４０Ａ、Ｉ４１Ａ、Ｇ４２Ａ、Ｗ４７Ａ、Ｒ４９Ａ、Ｋ６９Ａ、Ｗ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ａ７９Ｓ、Ｓ８０Ａ、Ｐ８２Ａ、Ｉ８５Ａ、またはＲ８７Ａの置換を含み、位置は、配列番号５１中の位置に対応する、請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
配列番号５１の１０、３３、２５、３７、３９、４０、４１、４２、４７、４９、６９、７１、７３、７９、８０、８２、８５、または８７の位置に対応する位置に置換を含む、請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
置換は、Ａ１０Ｖ、Ａ１０Ｇ、Ａ１０Ｌ、Ａ１０Ｉ、Ａ１０Ｔ、またはＡ１０Ｓである、請求項４に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
請求項１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質であって、ＦＮ３ドメインタンパク質が、配列番号５１のアミノ酸配列に対して９０％同一であるか、または配列番号５１のアミノ酸配列と比較した場合に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の置換を有する、アミノ酸配列を含む、前記ＦＮ３ドメインタンパク質。
別の分子に連結されている、請求項１～８のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
別の分子は、薬物または治療薬、タンパク質、抗体、ポリマー、毒素である、請求項９に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
別の分子は、ヒトアルブミン以外の分子に結合するＦＮ３ドメインである、請求項９に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に結合する、請求項１１に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
別の分子に直接連結されている、請求項９～１２のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
リンカーを介して別の分子に連結されている、請求項９～１２のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項１４に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
ペプチドリンカーは、（ＧＳ）₂（配列番号７１）、（ＧＧＧＳ）₂（配列番号７２）、（ＧＧＧＧＳ）₅（配列番号７３）、（ＡＰ）₂（配列番号７４）、（ＡＰ）₅（配列番号７５）、（ＡＰ）₁₀（配列番号７６）、（ＡＰ）₂₀（配列番号７７）またはＡ（ＥＡＡＡＫ）₅ＡＡＡ（配列番号７８）の配列を含む、請求項１５に記載のＦＮ３ドメインタンパク質。
請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１８に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
ＦＮ３ドメインタンパク質を製造する方法であって、ＦＮ３ドメインタンパク質が発現されるような条件下で請求項１９に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
ＦＮ３ドメインタンパク質を精製することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質と、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
生物学的試料中のヒト血清アルブミンの存在を検出する方法であって、生物学的試料を
請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質と接触させること、およびＦＮ３ドメインタンパク質に対する生物学的試料の結合を評価することを含む、前記方法。
請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質を含むキット。
第１のＦＮ３ドメインおよび第２のＦＮ３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３分子であって、第１のＦＮ３ドメインは、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質を含み、第２のＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミン以外の標的タンパク質に結合する、前記二重特異性ＦＮ３分子。
請求項２５に記載の二重特異性分子を含む医薬組成物。
ヒト対象における標的分子の半減期を延長する方法であって、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＦＮ３ドメインタンパク質を標的分子にコンジュゲートすることを含み、それによりヒト対象における標的分子の半減期を延長する、前記方法。
標的分子は、薬物、抗体、ヒト血清アルブミン以外の分子に結合するＦＮ３ドメイン、または毒素である、請求項２７に記載の方法。
コンジュゲーションは、ペプチドリンカーである、請求項２７または２８に記載の方法。
ペプチドリンカーは、（ＧＳ）₂（配列番号７１）、（ＧＧＧＳ）₂（配列番号７２）、（ＧＧＧＧＳ）₅（配列番号７３）、（ＡＰ）₂（配列番号７４）、（ＡＰ）₅（配列番号７５）、（ＡＰ）₁₀（配列番号７６）、（ＡＰ）₂₀（配列番号７７）またはＡ（ＥＡＡＡＫ）₅ＡＡＡ（配列番号７８）の配列を含む、請求項２９に記載の方法。