JP7704419B2 - 安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス - Google Patents

Description

本発明は、安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス、及びその使用に関する。

遺伝子組換え技術の本格的な使用により、腫瘍選択性及び抗がん効力が増大した腫瘍溶解性ウイルスを用いる臨床研究が開始された。文献に報告された最初の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスであった。それ以来、他のウイルスを用いた腫瘍溶解の研究が活発に行われている。

ヘルペスウイルスをベースとしたＴ－Ｖｅｃ（タリモジェンラヘルパレプベク）が欧米で進行メラノーマの治療に商業化されたことから、近年、腫瘍溶解性ウイルスの有用性が注目されている。一方、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子欠損ワクシニアウイルスは臨床的有用性が高いものの、治療域が狭いため、臨床効果を最大限に発揮するには限界がある。ＴＫ欠損ワクシニアウイルスの場合、治療域が狭いことは、高用量のウイルスが大きな臨床的有効性を有するが、ウイルスの毒性のために臨床的リスクを伴うことを意味する。

実際に、原発肝がん患者３０例を対象としたＰｅｘａ－Ｖｅｃ（ＪＸ－５９４；ＳｉｌｌａＪｅｎ， Ｉｎｃ．）の第ＩＩ相臨床試験において、高用量群（１０^９ｐｆｕ）は低用量群（１０^８ｐｆｕ）と比較して生存率が高いことが示された。しかし、腫瘍内投与による第Ｉ相臨床試験での３×１０^９ｐｆｕで用量制限毒性（ＤＬＴ）が認められ、これが最大耐用量（ＭＴＤ）を１×１０^９ｐｆｕに制限した。薬剤との関連性はないとの報告がある。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスによる治療後の早期死亡が頻繁に報告されており、望ましくないウイルスの増殖が予測できない結果をもたらす可能性があることを示している。これらの用量依存性の効力の増加及び用量制限毒性は、より安全でより効果的なワクシニアウイルスを開発する必要があることを意味する。

一方、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルスに有効な抗ウイルス薬である。ＧＣＶが単純ヘルペスウイルスのＴＫに結合すると、その５’末端がリン酸化されてガンシクロビル－三リン酸（ＧＣＶ－ＴＰ）に変換される。ＧＣＶ－ＴＰはＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３’末端に結合してＤＮＡ伸長を終結させる。毒性の強い物質であるＧＣＶ－ＴＰは細胞内でもＤＮＡ合成を阻害し、それによって細胞毒性を示す。

最近、ＨＳＶ１－ＴＫを腫瘍溶解性ウイルスに挿入し、得られた腫瘍溶解性ウイルスをＧＣＶと共投与して腫瘍細胞死を誘導する抗がん研究が行われている。研究によると、まず、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞に感染し、直接的な抗がん効果を誘導する。ＨＳＶ１－ＴＫ（自殺遺伝子）によりリン酸化されたＧＣＶは、腫瘍細胞増殖を抑制することにより、さらなる抗がん効果を示す（Ｏｌｉｖｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．１６、１９９９）。ＨＳＶ１－ＴＫ／ＧＣＶシステムは主にアデノウイルスをベクターとする腫瘍溶解性ウイルス療法に用いられた。しかしながら、ＧＣＶの共投与によって予想されるさらなる細胞毒性効果については、依然として議論の余地がある。

具体的には、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を複製能を有するアデノウイルスに挿入して得られた腫瘍溶解性ウイルスをＧＣＶと共投与した場合、グリオーマ細胞において細胞毒性が有意に増強されることが観察された。一方、ＨＳＶ－ＴＫを複製能を有するアデノウイルスに挿入した他の多くの研究では、ＧＣＶの投与によって引き起こされるさらなる抗がん効果は一貫して示されていない（Ｌａｍｂｒｉｇｈｔ ＥＳｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、８：９４６ － ５３）。これは、ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶシステムが腫瘍細胞増殖の抑制のみならず、ウイルス増殖の抑制にも関与しており、これらの作用が逆で互いに相殺されているためと報告されている。

したがって、ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶシステムを腫瘍溶解性ウイルスに適用するに際して、安全性を確保しつつ、抗がん効果を増強することができる特定の方法について検討する必要がある。

［発明の開示］
［技術的課題］
そこで、本発明者らは、安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスの開発を検討した結果、チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を有さず、ＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することができる腫瘍溶解性ウイルスを開発し、この腫瘍溶解性ウイルスをＧＣＶと共投与した場合に優れた安全性及び抗がん効果を示すことを確認し、本発明を完成させた。

［課題を解決するための手段］
上記目的を達成するために、本発明の一態様では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来するエフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスであって、前記エフェクタードメインは、配列番号１によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。

本発明の別の態様では、腫瘍溶解性ウイルスを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、有効成分として、腫瘍溶解性ウイルス及びガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）を含む、医薬組成物が提供される。

本発明のさらに別の態様において、変異型ＨＳＶ－ＴＫをコードする遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造する方法であって、ｉ）ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を除去し、ワクシニアウイルスを野生型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子と組換えさせる工程；及びｉｉ）宿主細胞においてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下で組換えワクシニアウイルスの連続継代培養を行う工程を含む方法が提供される。

［発明の効果］
本発明に係る安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を有しないがＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することができる最小アミノ酸配列からなるエフェクタードメインを含むＨＳＶ－ＴＫ断片、又はＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化するためのそのバリアントを発現することができ、それにより、腫瘍溶解性ウイルスに感染したがん細胞及び隣接するがん細胞であっても殺傷することができる。さらに、ＧＣＶ又はＡＣＶはまた、ウイルス増殖の阻害に関与し、従って、ウイルスの高用量の投与に際してさえ、ウイルス誘導性副作用を制御し得る。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、ＧＣＶによって引き起こされるウイルス増殖の阻害によってウイルス粒子の数が減少しても、増大した抗がん効果を示す。従って、本発明に係る安全性及び抗がん効果が向上した腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に有効に用いることができる。

図１は、変異ワクシニアウイルスの製造方法を示す模式図である。 図２は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ１～Ｃ５）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図３は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ６～Ｃ１０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図４は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ１１～Ｃ２０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図５は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ２１～Ｃ３０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図６は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ３１～Ｃ４０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図７は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ４１～Ｃ５０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図８は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ５１～Ｃ５５）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図９は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ５６～Ｃ６０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図１０は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ６１～Ｃ７０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図１１は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ７１～Ｃ８０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図１２は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ８１～Ｃ９０）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図１３は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ９１～Ｃ１００）がＨＳＶ１－ＴＫ断片を発現することを確認した結果を示す。 図１４は、変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ５２、Ｃ４０／４５、Ｃ５７、ＷＯＴＳ－４１８、及びＣ１９）によって発現されるＨＳＶ１－ＴＫ断片を示す模式図であり、これらの各々は変異ワクシニアウイルスの実施形態である。 図１５は、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｒｅｓｅｒｖｅ）株ワクシニアウイルスで処理されたＨｅＬａがん細胞株の培養液から分離された上清中のルシフェラーゼ活性を確認したグラフである。 図１６は、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスで処理されたＨｅＬａがん細胞株の培養液から分離されたペレット中のルシフェラーゼ活性を確認したグラフである。 図１７は、シャトルプラスミドベクター及びワイス（Ｗｙｅｔｈ）株ワクシニアウイルスで処理されたＨｅＬａがん細胞株の培養液から分離された上清中のルシフェラーゼ活性を確認したグラフである。 図１８は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２）及びＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への投与がウイルス増殖の減少を引き起こすことを確認した結果を示す。 図１９は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０又はＣ５７）及びＧＣＶのＨｅＬａがん細胞株への投与がウイルス増殖の減少を引き起こすことを確認した結果を示す。 図２０は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０又はＣ５７）及びＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への投与が、ウイルス増殖の減少を引き起こすことを確認した結果を示す。 図２１は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２）及びＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への投与が細胞毒性の増加を引き起こすことを確認した結果を示す。 図２２は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０又はＣ５７）とＧＣＶのＨｅＬａがん細胞株への共投与が細胞毒性の増加を引き起こすことを確認した結果を示している。 図２３は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０又はＣ５７）とＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への共投与が細胞毒性の増加を引き起こすことを確認した結果を示している。 図２４は、１０のがん細胞株を変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）で処理し、各がん細胞株の細胞生存率を観察したグラフである。 図２５は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）と、ＡＣＶ、ＧＣＶ、又はＢｒｄＵとのＡ５４９がん細胞株への共投与が、ウイルス増殖の減少を引き起こすことを確認した結果を示す。 図２６は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への共投与がウイルス増殖の減少を引き起こすことを確認した結果を示している。 図２７は、ＨＣＴ－１１６がん細胞株移植マウスモデルに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とＧＣＶを共投与し、マウスを犠牲にして、マウスの腫瘍組織で検出されたウイルス粒子数をカウントしたグラフである。 図２８は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への共投与が細胞毒性の増加を引き起こすことを確認した結果を示している。 図２９は、変異ワクシニアウイルスの実施形態である変異ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１８）とＧＣＶのＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株への共投与が細胞毒性の増加を引き起こすことを確認した結果を例示している。 図３０は、ヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＤ－２３１）を移植したマウスモデルを用いて、変異ワクシニアウイルスとヒドロキシ尿素の共投与により引き起こされる抗がん効果を確認するための実験スケジュールを示す模式図である。 図３１は、ヒト乳がん細胞株を移植したマウスに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とヒドロキシ尿素を個別投与又は共投与し、マウスの腫瘍体積を測定して得られた結果を示す。 図３２は、マウス腎がん細胞株（Ｒｅｎｃａ）を移植したマウスに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とヒドロキシ尿素を個別投与又は共投与し、マウスの腫瘍体積を測定して得られた結果を示す。 図３３は、ヒト大腸がん細胞株（ＣＴ－２６）を移植したマウスモデルを用いて、変異ワクシニアウイルスとヒドロキシ尿素の共投与により引き起こされる抗がん効果を確認するための実験スケジュールを示す模式図である。 図３４は、ヒト大腸がん細胞株（ＣＴ－２６）を移植したマウスに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とヒドロキシ尿素を個別投与又は共投与し、マウスの腫瘍体積を測定して得られた結果を示す。 図３５は、ヒト大腸がん細胞株（ＣＴ－２６）を移植したマウスに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とヒドロキシ尿素を個別投与又は共投与し、マウスからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞をがん細胞と共培養し、ＩＮＦ－γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を測定したグラフである。 図３６は、ヒト大腸がん細胞株（ＣＴ－２６）を移植したマウスに変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）とヒドロキシ尿素を個別投与又は共投与し、マウスからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞をがん細胞と共培養し、ＩＮＦ－γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞を染色した写真である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の態様において、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスであって、該エフェクタードメインが配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、腫瘍溶解性ウイルスが提供される。

本明細書において、「単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）」という用語は、単純ヘルペスウイルスにおけるＤＮＡ合成の間の初期リン酸化反応に関与する酵素を指す。また、ＨＳＶ－ＴＫは抗ウイルス薬であるガンシクロビル（ＧＣＶ）やアシクロビル（ＡＣＶ）のリン酸化にも関与している。特に、ＨＳＶ１－ＴＫは、ＧＣＶ又はＡＣＶに対して、他のウイルスに存在するＴＫの約１０倍の感度で反応する。ＨＳＶは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）又は単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）である。具体的には、ＨＳＶはＨＳＶ１であり得る。さらに、ＨＳＶ－ＴＫは、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）であり得る。

本明細書中で用いるように、用語「エフェクタードメイン」とは、配列番号１５で表され、３７６個のアミノ酸からなる、野生型ＨＳＶ－１ＴＫの１～１４５位の連続したアミノ酸からなるタンパク質ドメインを指す。エフェクタードメインは、野生型ＨＳＶ－１ＴＫと比較して、ＴＫ活性が低いか又は全くなく、従って、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスは、それ自体を増殖できない。しかし、エフェクタードメインはＡＴＰ結合部位を含み、ＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することができる。エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞を、ＧＣＶ又はＡＣＶで処理する場合、ＧＣＶ又はＡＣＶはリン酸化され得る。

エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのＣ末端に連結された０～２３１個のアミノ酸をさらに有し得る。ここで、該ポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－１ＴＫと比較して、ＴＫ活性が低いか又は全くなく、従って、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスは、それ自体を増殖できない。さらに、該ポリペプチドはＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することができる。該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞をＧＣＶ又はＡＣＶで処理する場合、ＧＣＶ又はＡＣＶはリン酸化され得る。

具体的には、エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのＣ末端に連結された０～２３１、１０～２００、２０～１５０、又は４０～１００個のアミノ酸をさらに有していてもよい。好ましくは、エフェクタードメインを含むポリペプチドは、エフェクタードメインのＣ末端に連結された３６、８２、又は２３１個のアミノ酸をさらに有し得る。

該エフェクタードメインを含むポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３によって表されるアミノ酸配列からなるものであってよい。該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であってもよい。特に、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４によって表されるヌクレオチド配列であってもよい。

本発明者らは、安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルスを開発するために、野生型ＨＳＶ１－ＴＫ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを作製し、次いで、ＴＫの非存在下でウイルスを適応進化させた。適応進化したワクシニアウイルスをルシフェラーゼ活性、ゲノム解析、ＧＣＶに対する感受性の実験に供した。実験を通して、ＨＳＶ１－ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５２、及びＣ５７）を選択した。また、配列番号１５に示すアミノ酸配列の一部を変異させて得られたＨＳＶ－ＴＫバリアントをコードする遺伝子を含む変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８、ＯＴＳ－４１８）を作製した。変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５２、Ｃ５７、ＷＯＴＳ－４１８）のヌクレオチド配列を解析した。その結果、配列番号１５で示される野生型ＨＳＶ－１ＴＫの１４５位（基準点）までのアミノ酸配列は、ＴＫ活性を有さないものの、ＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することが確認された。

本明細書中で使用される用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、ウイルスががん細胞を破壊できるように、その遺伝子ががん細胞中で特異的に複製するように操作されている組換えウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス、ミキソーマウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来し得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスに由来し得る。

ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス株、すなわち、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ））、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ））、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、タシケント（ＴａｓｈＫｅｎｔ）、エヴァンス（Ｅｖａｎｓ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ（ＩＨＤ－Ｊ）、又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ（ＩＨＤ－Ｗ）であり得る。

本発明の別の態様では、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、該エフェクタードメインが、配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、医薬組成物が提供される。

医薬組成物中に有効成分として含まれる腫瘍溶解性ウイルスは、上記の通りである。

腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与期間に依存して変化し、当業者によって適切に選択され得る。用量は、患者が１×１０^３～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を受けるようなものであり得る。具体的には、患者に１×１０^３、２×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位、又はプラーク形成単位が投与される用量であればよく、これらの数値の間に種々の数値や範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは１×１０^３～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与することができる。

がんは、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであってもよい。

本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。

非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。

投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は、治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。

医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の用量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。

本発明のさらに別の態様では、腫瘍溶解性ウイルスとガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）とを有効成分として含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物であって、前記腫瘍溶解性ウイルスがエフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記エフェクタードメインが、配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、医薬組成物が提供される。

医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶは、同時に投与され得るか、又は逐次的にもしくは逆の順序で共投与され得る。具体的には、医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルスとＧＣＶ又はＡＣＶとを同時に投与することができる。さらに、医薬組成物の投与は、腫瘍溶解性ウイルスが最初に投与され、次いで、ＧＣＶ又はＡＣＶが投与され、これらの成分が医薬組成物に含まれるようなものであり得る。 さらに、医薬組成物の投与は、腫瘍溶解性ウイルスが最初に投与され、次いでＧＣＶ又はＡＣＶが投与され、次いで再び腫瘍溶解性ウイルスが投与され、ここで、これらの成分が医薬組成物に含まれるようなものであり得る。

医薬組成物中に有効成分として含まれる腫瘍溶解性ウイルスは、上記の通りである。

腫瘍溶解性ウイルスの用量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与期間に依存して変化し、当業者によって適切に選択され得る。用量は、患者が１×１０^３～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を受けるようなものであり得る。具体的には、患者に１×１０^３、２×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）が投与される用量であればよく、これらの数値の間に種々の数値や範囲が含まれていてもよい。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは１×１０^３～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与することができる。

本明細書で使用される用語「ＧＣＶ」は、ガンシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘・帯状疱疹ウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を指す。ＧＣＶはウイルスのＴＫによって５´末端がリン酸化され、ガンシクロビル三リン酸（ＧＣＶ－ＴＰ）に変換される。ＧＣＶ－ＴＰはウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３´末端に結合してＤＮＡ伸長を終結させる。さらに、リン酸化されたＧＣＶは細胞のＤＮＡ複製を停止させることができるので、細胞増殖を阻害する。ＧＣＶは式１で表される。

［式１］

本明細書で使用する「ＡＣＶ」という用語は、アシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、及びエプスタイン－バーウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を指す。ＡＣＶはウイルスのＴＫによってリン酸化され、アシクロビル三リン酸（ＡＣＶ－ＴＰ）に変換される。ＡＣＶ－ＴＰはウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３´末端に結合してＤＮＡ伸長を終結させる。ＡＣＶは式２で表される。

［式２］

さらに、ＧＣＶ又はＡＣＶを０．１μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。具体的には、ＧＣＶ又はＡＣＶを０．１μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、又は１０μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。

がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであることができる。

本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬的組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。

非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。

投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。

医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の用量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。

本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルスとガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）とを投与する工程を含み、該腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来するものである、がんを治療するための方法を提供する。

腫瘍溶解性ウイルス、ＧＣＶ及びＡＣＶは上記の通りである。

本明細書中で使用される場合、用語「個体」は、本発明の腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶを投与することによって軽減、阻害、又は治療することができる状態の疾患を有するか、又はそれに罹患している人を指す。

本発明のさらにもう１つの態様において、がんの治療のための腫瘍溶解性ウイルスの使用であって、該腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、使用が提供される。

本発明のさらに別の態様において、変異型ＨＳＶ－ＴＫをコードする遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造する方法であって、ｉ）ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を除去し、ワクシニアウイルスを野生型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子と組換えさせる工程及びｉｉ）宿主細胞においてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下で組換えワクシニアウイルスの連続継代培養を行う工程を含む方法が提供される。

野生型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子は、配列番号１６で表されるヌクレオチド配列であってもよい。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＴＫ活性が低いか又は全くなく、ＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化することができる。

継代培養は、少なくとも３回連続して行うことができ、好ましくは少なくとも１０回連続して行うことができる。

本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素を有効成分として含み、該腫瘍溶解性ウイルスが、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該エフェクタードメインは、配列番号１で表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、がんを予防又は治療するための医薬組成物を提供する。腫瘍溶解性ウイルスについては、上記の説明を参照のこと。

本明細書で使用する「ヒドロキシ尿素」という用語は、以下の式を有する化合物を指す。

［式３］

ヒドロキシ尿素はＤＮＡ合成を阻害する抗がん剤として知られている。しかしながら、その正確なメカニズムは解明されていない。また、ヒドロキシ尿素は、ヒドロキシ尿素を含有する商品化薬物として、医薬組成物中に含有させてもよい。ヒドロキシ尿素を含有する商品化薬物の例は、限定されるものではないが、Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ（登録商標）、Ｈｙｄｒｅａ（登録商標）、Ｄｒｏｘｉａ（商標）、Ｍｙｌｏｃｅｌ（商標）、Ｓｉｋｌｏｓ（登録商標）及びＨｙｄｒｉｎｅ（登録商標）キャップを含み得る。ヒドロキシ尿素は経口摂取が可能であり、非経口投与も可能である。

医薬組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素は、同時に投与され得るか、又は逐次的にもしくは逆の順序で共投与され得る。具体的には、腫瘍溶解性ウイルス及びヒドロキシ尿素を同時に投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与することができる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスを最初に投与し、次いでヒドロキシ尿素を投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に投与し、続いて腫瘍溶解性ウイルスを投与し、次いで再びヒドロキシ尿素を投与することができる。

さらに、ヒドロキシ尿素は、１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日から９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素を１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日～６５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。本発明の実施形態において、ヒドロキシ尿素は３０ｍｇ／ｋｇ／日又は６０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。用量に応じて、医薬組成物を１日に数回に分けて投与することができる。具体的には、医薬組成物は、１日１～４回又は１日１～２回などの分割用量で投与することができる。

がんは、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかであってよい。

本発明の医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製において一般的に使用される適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。また、医薬組成物は、常法に従って注射剤の形態で製剤化することができる。

非経口投与のための製剤として製剤化する場合、医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥製剤、坐剤などに製剤化することができる。非水溶液又は懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１、カカオバター、ラウリン脂肪、グリセロゼラチン等を用いることができる。

投与経路、用量及び投与回数に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無に依存して、種々の方法及び量で対象に投与することができる。また、その最適な投与経路、用量、投与回数は、当業者が適切な範囲で選択することができる。また、医薬組成物は、治療効果が既知である他の薬剤や生理活性物質と組み合わせて投与してもよいし、他の薬剤と組み合わせて製剤化してもよい。

医薬組成物は、非経口的に投与することができ、このような投与は、任意の適切な方法、例えば、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、リンパ節内、及び静脈内投与によって行うことができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与が好ましい。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、総用量、及び患者の健康状態に応じて決定することができる。

本発明のさらに別の態様において、腫瘍溶解性ウイルスを投与する工程を含む、がんを治療する方法が提供される。

本発明のさらに別の態様において、がんの治療のための腫瘍溶解性ウイルスの使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんを治療するための医薬の製造のための腫瘍溶解性ウイルスの使用が提供される。

本発明のさらに別の態様において、がんを予防又は治療するための医薬組成物を投与する工程を含む、がんを治療する方法が提供される。

本発明のさらに別の態様において、がんの治療のための、がんを予防又は治療するための医薬組成物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんを治療するための医薬の製造のための、がんを予防又は治療するための医薬組成物の使用が提供される。

［実施例］
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は例示のためだけであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。

実施例１．変異ワクシニアウイルスの作製
実施例１．１．シャトルプラスミドベクターの構築
シャトルプラスミドベクターは、１型ＨＳＶＴＫ遺伝子（ｐＳＥ／Ｌ プロモーター）及びホタルルシフェラーゼレポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子を合成し、これらの遺伝子をｐＵＣ５７ａｍｐ＋プラスミド（Ｇｅｎｅｗｉｚ、米国）に組み込んで作製したシャトルプラスミドベクターを用いた。

実施例１．２．変異ワクシニアウイルス（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５２、及びＣ５７）の構築
変異ワクシニアウイルスの製造方法を図１に示す。具体的には、まず、組換えウイルスを得るために、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートに４×１０^５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地を添加した。Ｗｙｅｔｈ株野生型ワクシニアウイルス（ＮＹＣ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｓｔｒａｉｎ，ＷＲ－１５３６，ＡＴＣＣ）による０．０５ＭＯＩでの処理を行った。２時間後、培地を、２％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地と交換し、Ｘｆｅｃｔ（商標）ポリマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ６３１３１７、米国）を使用して、実施例１．１で構築したシャトルプラスミドベクター４μｇを細胞に送達した。培養４時間後、培地を、２％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地で置換し、ＨｅＬａ細胞をさらに７２時間培養した。ＨＳＶ１－ＴＫ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性をチェックすることによって得た。

次いで、ＴＫ活性を欠くＨＳＶ１－ＴＫを引き起こす突然変異を、ＴＫ－骨肉腫（１４３Ｂ ＴＫ－）細胞株（ＡＴＣＣ）において、ＢｒｄＵ（チミジン類似体、１５μｇ／ｍｌ）の存在下でＴＫ機能を欠く細胞の選択を可能にする生化学環境（ＴＫ－選択圧）を適用した状態で、１０回連続継代培養を行うことによって誘導した。ルシフェラーゼ活性を有する変異ワクシニアウイルスクローンのライセートをプレート上に分注し、次いで、ルシフェラーゼ活性を有する１００個の単一プラークを単離した。次いで、単一プラークを増幅し、次いで、異なるタンパク質サイズのＨＳＶ－ＴＫ断片を発現するクローン（Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ１～Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ１００）をウェスタンブロッティングによって同定した。

具体的には、１００個のクローンをそれぞれ１５μｌで処理して、ＨｅＬａ細胞株に感染させた。次いで、２４時間後、細胞を回収し、溶解してタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を変性させ、各試料４０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷して電気泳動を行った。電気泳動後、試料をＰＶＤＦ膜に転写し、一次抗体である抗ＨＳＶ１－ＴＫ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ａ５０－１０１Ｐ）と反応させた。次いで、ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体であるＨＲＰ標識抗ヤギ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ｓｃ－２８０３７）と反応させた。試料を再びＰＢＳＴで洗浄し、化学発光試薬で処理し、化学発光画像システム（Ｄａｖｉｎｃｈ Ｋ）を用いてチェックした。その結果、ウイルスではＨＳＶ１－ＴＫ断片タンパク質が発現していることが確認された（図２～図１３）。

１００種類の異なるクローンは基本的にＴＫ活性をもたない。なぜなら、それらはＴＫ機能を欠く細胞を選択できる生化学的環境で培養されたからである。一方、ＧＣＶに対して感受性を有するクローンをスクリーニングするために、９６ウェルプレート中でＧＣＶの存在下で４日間の培養を行いながら、リアルタイムの細胞イメージング及び分析システムであるＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、リアルタイムイメージングによってアポトーシスが生じた１０個のクローンを最初に選択した。一般に、ウイルス誘導細胞毒性はプラーク形成後に徐々に増加する。しかし、ＧＣＶ誘導細胞毒性の場合、プラーク形成後１５時間以内に一度に全体的な細胞毒性が生じる。したがって、ＧＣＶ誘導細胞毒性を定性的にチェックした。

画像解析の結果、最初に選択されたコロニーについて、ＧＣＶ投与によるウイルス増殖及び細胞毒性の抑制を確認した。次いで、コロニーＳ３Ｃ４＃１＿Ｃ１、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ３、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ４０、Ｓ３Ｃ４＃１＿４５、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ５２、及びＳ３Ｃ４＃１＿Ｃ５７における変異ワクシニアウイルスを最終的に選択した。コロニーＳ３Ｃ４＃１＿Ｃ１、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ３、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ４０、Ｓ３Ｃ４＃１＿４５、Ｓ３Ｃ４＃１＿Ｃ５２及びＳ３Ｃ４＃１＿Ｃ５７における変異ワクシニアウイルスは、それぞれ「Ｃ１」、「Ｃ３」、「Ｃ４０」、「Ｃ４５」、「Ｃ５２」及び「Ｃ５７」と命名された。

Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４０、Ｃ４５、Ｃ５２及びＣ５７のアミノ酸配列決定は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（ソウル、韓国）に依頼した。その結果、Ｃ４０とＣ４５のアミノ酸配列は同一であることが確認された。また、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４０／Ｃ４５、Ｃ５２及びＣ５７は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３及び２５のアミノ酸配列を有することが確認された。特に、選択された変異ワクシニアウイルスのＨＳＶ１－ＴＫでは、変異がＮ末端の１４５番目のアミノ酸から開始することが確認された（図１４）。

実施例１．３．変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８／ＯＴＳ－４１８）の産生
ＨＳＶ－ＴＫにおける最も多く報告されている突然変異は、４３０～４３６位（７Ｇ）及び５４８～５５３位（６Ｃ）の塩基配列部位において生じる塩基の挿入又は欠失によって引き起こされるフレームシフト突然変異である。野生型ＨＳＶ－ＴＫをワクシニアウイルスに挿入した後、変異の９８％以上がこれらの部位で起こった。そこで、塩基配列部位にサイレント変異を起こさせるために、４３０～４３６位の塩基配列であるＧＧＧＧＧＧＧをＧＧＴＧＧＴＧに、５４８～５５３位の塩基配列であるＣＣＣＣＣＣをＣＣＣＣＴＣに変更した。また、シャトルプラスミドベクターは、配列番号１５のＨＳＶ－ＴＫの１６７位のアラニンをチロシンに置換したＨＳＶ－ＴＫバリアントをコードする遺伝子と、ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子を合成し、これらの遺伝子をｐＵＣ５７ａｍｐ＋プラスミド（Ｇｅｎｅｗｉｚ、米国）に組換えたものを用いた。次いで、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株（ＡＴＣＣ）又はワイス株ワクシニアウイルスを用いて、実施例１．２と同様にして変異ワクシニアウイルスを作製した。ウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「ＷＯＴＳ－４１８」、ワイス株ワクシニアウイルスを用いて作製した変異ワクシニアウイルスを「ＯＴＳ－４１８」とした。

その結果、シャトルプラスミドベクター及びウェスタンリザーブ株ワクシニアウイルスで処理したＨｅＬａがん細胞株の培養液から分離した上清及びペレットの両方において、ルシフェラーゼ活性が確認された（図１５及び１６）。また、シャトルプラスミドベクター及びワイス株ワクシニアウイルスで処理したＨｅＬａがん細胞株の培養液から分離した上清において、ルシフェラーゼ活性が確認された（図１７）。これらの結果から，ＨＳＶ－ＴＫバリアントをコードする遺伝子がウェスタンリザーブ株又はワイス株ワクシニアウイルスに導入されたことが確認された。

実施例２．ＧＣＶ投与後の変異ワクシニアウイルス（Ｃ１，Ｃ３，Ｃ４５，Ｃ５２）の増殖抑制の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１．２で製造したＣ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２のＧＣＶ投与による増殖能の抑制を確認した。ここで、コロニーＳ３Ｃ４＃１＿Ｃ１９中の変異ワクシニアウイルスを陰性対照として用い、これを「Ｃ１９」と命名した。Ｃ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２をＧＣＶ処理した後のウイルス粒子数の違いを確認するため、ワクシニアウイルスのみに特異的に発現するＥ９Ｌ遺伝子を用いて定量ＰＣＲ解析（ｑＰＣＲ）を行った。

具体的には、ＤＮＡの２つの相補鎖のうちの１つのみに結合しながらＥ９Ｌ遺伝子を認識するプローブ（配列番号１９及び２０）を調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに１回の発光を測定するものであった。ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、次いで、０．０１～１のＭＯＩでウイルスＣ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２に感染させた。２時間後、６０μＭの濃度のＧＣＶとの共処理を行った。培養を４８時間行った後、ウイルス抽出キット（ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ，ＱＩＡＧＥＮ，５７７０４）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡを１ｎｇ／５μｌの濃度に希釈し、ｑＰＣＲに供した。

その結果、Ｃ１９については、ＧＣＶ投与にもかかわらず、ウイルス増殖は抑制されなかった。一方、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２については、ＧＣＶ投与に続いてウイルス増殖が抑制された（図１８）。これらの結果から、ＧＣＶ投与によりＣ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２の増殖能が低下することが確認された。

実施例３．ＧＣＶ投与後の変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０、Ｃ５７）の増殖能低下の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１．２で製造したＣ４０及びＣ５７の増殖能を、ＧＣＶを投与して確認した。ＧＣＶで処理した場合のＣ４０又はＣ５７の増殖レベルの変化を調べるために、Ｅ９Ｌ遺伝子を用いて定量ＰＣＲ解析（ｑＰＣＲ）を行った。

具体的には、ＤＮＡの２つの相補鎖のうちの１つのみに結合しながら、Ｅ９Ｌ遺伝子を認識するプローブを調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに１回の発光を測定するものであった。ＨｅＬａがん細胞株を１×１０^４細胞／ウェルで播種し、又はＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を０．１のＭＯＩ（０．１ｐｆｕ／細胞）でウイルスＣ４０又はＣ５７に感染させた。２時間後、５０μＭの濃度のＧＣＶとの共処理を行った。４８時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを１ｎｇ／５μｌの濃度に希釈し、ｑＰＣＲに供した。

その結果、Ｃ４０及びＣ５７については、ＧＣＶ投与によりウイルス増殖が抑制されることが確認された（図１９及び２０）。これらの結果から、ＧＣＶ投与によりＣ４０及びＣ５７の増殖能が低下することが確認された。

実施例４．ＧＣＶ投与後の変異ワクシニアウイルス（Ｃ１，Ｃ３，Ｃ４５，Ｃ５２）の細胞毒性の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２が実施例２においてＧＣＶによる増殖阻害を示したが、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２がＧＣＶの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、細胞毒性の比較のためにＣ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２とＧＣＶとの共処理を行った。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、次いで０．０１～１のＭＯＩでＣ１、Ｃ３、Ｃ１９、Ｃ４５又はＣ５２に感染させた。２時間後、６０μＭの濃度のＧＣＶと共処理を行った。７２時間培養した後、ＣＣＫ８キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８、同仁堂、熊本、日本）を用いて細胞毒性を分析した。

その結果、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５又はＣ５２とＧＣＶとの共処理を行った場合、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５及びＣ５２におけるＧＣＶによるウイルス増殖抑制にもかかわらず、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株はさらに約２５％以上も多く殺傷された。一方、Ｃ１９とＧＣＶの共処理を行った場合には、Ｃ１９のみで処理した場合と同程度にＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株は殺傷された（図２１）。これらの結果から、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５又はＣ５２とＧＣＶを共投与した場合に、Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４５又はＣ５２の細胞毒性が増加することが確認された。

実施例５．ＧＣＶ投与後の変異ワクシニアウイルス（Ｃ４０，Ｃ５７）の細胞毒性の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
Ｃ４０及びＣ５７が実施例３においてＧＣＶによるウイルス増殖阻害を示したが、Ｃ４０及びＣ５７がＧＣＶの投与に際して細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、Ｃ４０又はＣ５７とＧＣＶとの共処理を行い、それらの細胞毒性を分析した。

具体的には、ＨｅＬａがん細胞株を１×１０^４細胞／ウェルで播種し、又はＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種した。次いで、０．１のＭＯＩ（０．１ｐｆｕ／細胞）でのＣ４０又はＣ５７と５０μＭの濃度でのＧＣＶとの共処理を、細胞に対して感染させるために２時間行った。４８時間培養後、ＣＣＫ８キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８）を用いて細胞毒性を分析した。

その結果、Ｃ４０又はＣ５７とＧＣＶとの共処理を行った場合には、Ｃ４０及びＣ５７においてＧＣＶによるウイルス増殖抑制が認められたにもかかわらず、ＨｅＬａがん細胞株及びＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株は、Ｃ４０又はＣ５７のみで処理した場合と同程度に殺傷された（図２２及び２３）。これらの結果から，Ｃ４０又はＣ５７とＧＣＶとを共投与した場合、Ｃ４０又はＣ５７の細胞毒性が増加することが確認された。

実施例６．変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の細胞毒性の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１．３で作製したＷＯＴＳ－４１８のがん細胞に対する細胞毒性を確認するために、９６ウェルプレートに、ヒト肺がん細胞株（Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ４６０）、ヒト腎がん細胞株（Ａ４９８、Ｃａｋｉ－１）、ヒト大腸がん細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ１１６）、ヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ）、マウス乳がん細胞株（４Ｔ１）、及びマウス腎がん細胞株（Ｒｅｎｃａ）の１０種のがん細胞株をそれぞれ３×１０^３細胞／ウェルで播種し、細胞を１ＭＯＩ（１ｐｆｕ／細胞）でＷＯＴＳ－４１８で処理した。７２時間培養後、ＣＣＫ８キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８）を用いて細胞毒性を分析した。ここで、ヒト肺がん細胞株（Ａ５４９）及びマウス乳がん細胞株（４Ｔ１）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。また、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）から、ヒト腎がん細胞株（Ａ４９８）、ヒト大腸がん細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６）、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０）、ヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ）及びマウス腎がん細胞株（Ｒｅｎｃａ）を入手した。

その結果、ヒト肺がん細胞株（Ａ５４９）、ヒト腎がん細胞株（Ａ４９８、Ｃａｋｉ－１）、ヒト大腸がん細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６）及びヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ）で６０％以上の細胞毒性が観察された（図２４）。

実施例７．ＡＣＶ、ＧＣＶ又はＢｒｄＵ投与後の変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の増殖能低下の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１．３で作製したＷＯＴＳ－４１８の増殖能を、ＧＣＶの投与に際して確認した。ＷＯＴＳ－４１８をＧＣＶ処理した後のウイルス粒子数の違いを調べるために、Ｅ９Ｌ遺伝子を用いて定量ＰＣＲ解析（ｑＰＣＲ）を行った。

具体的には、ＤＮＡの２つの相補鎖のうちの１つのみに結合しながら、Ｅ９Ｌ遺伝子を認識するプローブを調製した。調製したプローブは、ウイルス増殖が起こるたびに１回の発光を測定するものであった。Ａ５４９がん細胞株を１×１０^４細胞／ウェルで播種し、次いで０．１ＭＯＩ（０．１ｐｆｕ／細胞）でＷＯＴＳ－４１８に感染させた。２時間後、２００μＭ又は３００μＭの濃度のＡＣＶ、ＧＣＶ又はＢｒｄＵでの共処理を行った。４８時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを１ｎｇ／５μｌの濃度に希釈し、ｑＰＣＲに供した。

その結果、ＷＯＴＳ－４１８では、ＡＣＶ、ＧＣＶ又はＢｒｄＵの共投与後にウイルス増殖が著しく阻害されたことが確認された（図２５）。

さらに、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、次いで、０．１ＭＯＩ（０．１ｐｆｕ／細胞）でＷＯＴＳ－４１８に感染させた。２時間後、１００μＭの濃度のＧＣＶで共処理を行った。４８時間培養後、ウイルス抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを１ｎｇ／５μｌの濃度に希釈し、ｑＰＣＲに供した。

その結果、ＷＯＴＳ－４１８について、ＷＯＴＳ－４１８とＧＣＶとの共投与後にウイルス増殖が顕著に抑制されることが確認された（図２６）。これらの結果から、ＷＯＴＳ－４１８はＡＣＶ、ＧＣＶ及びＢｒｄＵに対して感受性を有し、ＡＣＶ、ＧＣＶ又はＢｒｄＵの投与により増殖能の低下を示すことが確認された。

実施例８．ＧＣＶ投与後の変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の増殖能低下の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＷＯＴＳ－４１８の増殖能を、ヒト大腸がん細胞株（ＨＣＴ－１１６、５×１０^６細胞／ｍｌ）を移植したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）モデルにおけるｑＰＣＲ解析によって確認した。

具体的には、ＫＯＡＴＥＣＨ（韓国）から購入したマウス（ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）を１週間の馴化期間に供した後、ヒト大腸がん細胞株であるＨＣＴ－１１６がん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６個の細胞で異種移植した。腫よう体積を１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３になるまで観察し、次いで、ＷＯＴＳ－４１８とＧＣＶを腫瘍内に共投与した。ここで、ＷＯＴＳ－４１８（１×１０^６ｐｆｕ）を腹腔内投与した。４日後から、ＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間投与した（Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７）。５日目から、各群３匹のマウスを屠殺し、腫瘍を分離した。分離した腫瘍を、サンプル均質化システム（ＯＭＮＩ Ｂｅａｄ Ｒｕｐｔｏｒ２４）を用いてホモジナイズし、次いで、ｑＰＣＲによってウイルス粒子の数を定量した。

その結果、ＧＣＶ処理によるウイルス増殖抑制は、３日目から起こることが確認された（図２７）。

実施例９．変異ワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の細胞毒性の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＷＯＴＳ－４１８が実施例７及び８においてＧＣＶによる増殖抑制を示したが、このウイルスがＧＣＶの投与により細胞毒性を維持するかどうかを確認するために、ＷＯＴＳ－４１８及びＧＣＶの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を１．５×１０^４細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を０．０２ＭＯＩ（０．０２ｐｆｕ／細胞）でＷＯＴＳ－４１８に感染させた。２時間後、６０μＭ又は１００μＭの濃度のＧＣＶで共処理を行った。７２時間培養後、ＣＣＫ８キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８）を用いて細胞毒性を分析した。

その結果、ＷＯＴＳ－４１８とＧＣＶとを共処理した場合、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株は、ＧＣＶによるＷＯＴＳ－４１８でのウイルス増殖抑制にもかかわらず、さらに約３０％以上も多く殺傷された（図２８）。これらの結果から，ＷＯＴＳ－４１８とＧＣＶとを共投与した場合、ＷＯＴＳ－４１８の細胞毒性が増加することが確認された。

実施例１０．変異ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１８）の細胞毒性の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＧＣＶ投与時のＯＴＳ－４１８の細胞毒性を確認するために、ＯＴＳ－４１８とＧＣＶの共処理を行い、細胞毒性を比較した。具体的には、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株を３×１０^３細胞／ウェルで播種した。次いで、０．０２ＭＯＩ（０．０２ｐｆｕ／細胞）で細胞をＯＴＳ－４１８に感染させた。２時間後、６μＭ又は６０μＭの濃度のＧＣＶとの共処理を行った。７２時間培養後、ＣＣＫ８キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８）を用いて細胞毒性を分析した。

その結果、ＯＴＳ－４１８とＧＣＶとを共処理した場合、ＧＣＶによりＯＴＳ－４１８の細胞毒性が増大することが確認された。特に、ＯＴＳ－４１８と６０μＭの濃度のＧＣＶとを共処理した場合には、ＮＣＩ－Ｈ４６０がん細胞株はさらに約２０％以上も多く殺傷された（図２９）。これらの結果から，ＯＴＳ－４１８とＧＣＶとを共投与した場合に細胞毒性が増加することが確認された。

実施例１１．ヒト乳がん細胞株移植マウス：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、韓国）から購入したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（雌、８週齢）を１週間の順化馴化期間に供した後、ヒト乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を５×１０^６細胞で異種移植した。腫瘍体積が５０ｍｍ^３になるまで観察し、薬剤投与を開始した。３１日後、腫瘍体積を測定した。

作製したヒト乳がん細胞株移植マウスを４群（ｎ＝５）に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし，ヒドロキシ尿素（ＨＵ、３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した群、ＷＯＴＳ－４１８（１×１０^７ｐｆｕ）を投与した群、及び、ＷＯＴＳ－４１８とＨＵの両方を投与した群を実験群とした。ＷＯＴＳ－４１８を計２回、０日目に腹腔内投与し、１０日目に腫瘍内投与した（Ｄ０，Ｄ１０）。ヒドロキシ尿素を１日２回毎日（６回／週）腹腔内投与した（図３０）。

腫瘍体積を３１日間測定した。その結果、対照群では、腫瘍体積がゆっくりと増加し、１７日目以降に劇的に増加し、３１日目の腫瘍体積が最初の腫瘍体積より６倍以上大きくなった。また、ＨＵ投与群のマウスでは腫瘍体積が徐々に増加し、３１日目の腫瘍体積が最初の腫瘍体積の５倍以上に増加した。

一方、ＷＯＴＳ－４１８を投与した実験群のマウスの腫瘍体積については、１４日目から腫瘍の成長が抑制され、３１日目まで腫瘍は変化しなかった。また、ＷＯＴＳ－４１８及びヒドロキシ尿素を投与した実験群のマウスにおける腫瘍体積について、１７日目から腫瘍の成長が抑制され、腫瘍体積の減少傾向が認められた（図３１）。

これらの結果から、ＷＯＴＳ－４１８は腫瘍成長を抑制する効果があることが見出され、ヒドロキシ尿素単独で処理した場合には腫瘍成長は抑制されなかったが、ＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素を共投与した場合には、ＷＯＴＳ－４１８又はヒドロキシ尿素単独で処理した場合と比較して、抗がん効果が向上することが確認された。

実施例１２．マウス腎がん細胞株移植マウス：Ｒｅｎｃａにおける組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、韓国）から購入したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（雌、８週齢）を１週間の馴化期間に供した後、マウス腎がん細胞株（Ｒｅｎｃａ、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）と同種移植した。腫瘍体積が１００ｍｍ^３になるまで観察し、薬剤投与を開始した。２８日後、腫瘍体積を測定した。

作製したマウス腎がん細胞株移植マウスを３群（ｎ＝７）に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし、ＷＯＴＳ－４１８及びヒドロキシ尿素（１×１０^６ｐｆｕ、３０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与した群と、ＷＯＴＳ－４１８及びヒドロキシ尿素（１×１０^６／１×１０^７ｐｆｕ、３０ｍｇ／ｋｇ）を反復投与した群を実験群とした。ＷＯＴＳ－４１８を０日目及び１４日目に腹腔内投与し、ヒドロキシ尿素を１日２回毎日（６回／週）腹腔内投与した。

その結果、ＷＯＴＳ－４１８及びヒドロキシ尿素を投与された実験群のマウスでは、対照群と比較して腫瘍体積が顕著に抑制されることが確認され、単回投与群と比較して、反復投与された群では腫瘍体積がさらに抑制されることが確認された。また、反復投与された群において、ＷＯＴＳ－４１８の２回目投与時の濃度が高いほど、抗がん効果が増強されることが確認された（図３２）。

実施例１３．マウス大腸がん細胞株移植マウス：ＣＴ－２６における組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素の抗がん効果の確認
実施例１３．１．マウス大腸がん細胞移植マウスの作製と薬剤投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、韓国）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）を１週間の馴化期間に供した後、マウス大腸がん細胞株（ＣＴ－２６、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）で同種移植した。腫瘍体積が１００ｍｍ^３になるまで観察し、薬剤投与を開始した。

作製したマウス大腸がん細胞移植マウスを４群（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３：ｎ＝１５、及び、Ｇ４：ｎ＝１４）に分けた。生理食塩水を腹腔内投与した群を対照群とし、ヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）のみを腹腔内投与した群、ＷＯＴＳ－４１８のみを、２回腹腔内投与した群（１×１０^８ｐｆｕ、腹腔内（ｉ．ｐ．）、Ｄ０、Ｄ３）及び２回腫瘍内投与した群（１×１０^７ｐｆｕ、腫瘍内（ｉ．ｔ．）、Ｄ１４、Ｄ２１）、ならびにＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素を同じ用量及びレジメンで共投与した群を実験群とした。ＷＯＴＳ－４１８を０日目及び３日目に腹腔内投与した後、１４日目及び２１日目に腫瘍内投与し、ヒドロキシ尿素をウイルス投与直前から２６日目まで１日１回毎日（週６回／週）腹腔内投与した（図３３）。

２５日目に腫瘍体積を測定し、マウスを屠殺した。次いで、免疫細胞をそれから単離し、インターフェロン－γアッセイに供した。

実施例１３．２ 腫瘍体積の変化の確認
実施例１３．１において各群のマウスに薬剤投与を行い、２５日目に腫瘍体積を測定した。その結果、ＷＯＴＳ－４１８のみを投与された実験群、ヒドロキシ尿素のみを投与された実験群、及びＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素を共投与された実験群のマウスは、対照群と比較して腫瘍体積が抑制されたことが確認された。特に、ＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素を共投与した実験群のマウスで腫瘍体積が顕著に抑制されたことが確認された（図３４）。

実施例１３．３ インターフェロンγアッセイ
実施例１３．１の各群のマウスに薬剤投与を行った。次いで、免疫細胞をそれから単離し、インターフェロン－γアッセイに供した。

特に、各群のマウスの脾臓内のＣＤ８＋Ｔ細胞を（Ｌｙ－２）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓキット及び磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて単離し、次いでＣＴ－２６細胞株（１×１０^４細胞）と共培養した。ＩＦＮ－γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞をＥＬＩＳＰＯＴ（ＭＡＢＴＥＣＨ、スウエーデン）実験に供し、スポットをスキャンし、ＬＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｅｏｕｌ、韓国）により計数した。

その結果、対照マウスの脾臓から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＷＯＴＳ－４１８のみを投与された実験群、ヒドロキシ尿素のみを投与された実験群及びＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素を共投与された実験群のマウスの脾臓から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＩＦＮ－γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞が豊富であることが確認された。特に、ＷＯＴＳ－４１８とヒドロキシ尿素とを共投与した実験群のマウスでは、腫瘍体積が顕著に抑制されることが確認された（図３５及び３６）。

Claims (16)

1. エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、腫瘍溶解性ウイルスであって、
   前記ポリペプチドが、配列番号３、５、７、９、１１又は１３によって表されるアミノ酸配列からなり、前記配列番号１３によって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、５５１～５５３位でのＣＣＣからＣＴＣへのヌクレオチド置換を含み、
   前記エフェクタードメインは、配列番号１によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来し、
   前記腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルスに由来する、腫瘍溶解性ウイルス。
2. 前記ＨＳＶが単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
3. 前記ポリペプチドが、前記エフェクタードメインのＣ末端に連結された３６、８２、又は２３１アミノ酸の配列をさらに有する、請求項１又は２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
4. 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４、６、８、１０、１２、又は１４によって表されるヌクレオチド配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
5. 有効成分として請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、
   がんを予防又は治療するための医薬組成物。
6. 前記がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかである、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス；ならびに
   ガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）を、有効成分として含む、
   がんを予防又は治療するための医薬組成物。
8. 前記医薬組成物に含まれる前記腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶが、同時に又は逐次的に投与される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. ＧＣＶ又はＡＣＶが０．１μｇ／ｋｇ／日～５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
10. 前記がんが、肺がん、大腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織がん、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかである、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 腫瘍溶解性ウイルスを製造する方法であって、
    ｉ）ウイルスからＴＫ遺伝子を除去し、前記ウイルスを野生型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子と組換えさせる工程；及び
    ｉｉ）宿主細胞においてブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下で前記組換えウイルスの連続継代培養を行う工程、を含み、
    前記ウイルスが、エフェクタードメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドが、配列番号３、５、７、９、又は１１によって表されるアミノ酸配列からなり、及び、
    前記エフェクタードメインは、配列番号１によって表され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）に由来する、方法。
12. 前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記野生型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子が、配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列である、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記腫瘍溶解性ウイルスがＴＫ活性を有さず、ＧＣＶ又はＡＣＶをリン酸化する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. がんを治療するための医薬の製造のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
16. がんを治療するための医薬の製造のための、請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。

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