JP7708373B2 - グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法 - Google Patents

グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法

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Description

本発明は、多能性幹細胞由来のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、及びその製造方法等に関する。
脊髄損傷を含む脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく疾患は、自然に治癒するケースは稀であり、ミエリンを形成するグリア細胞の脱落にとどまらず軸索変性及び細胞体変性を引き起こし深刻化するケースがほとんどである。特に脊髄損傷は、一部の患者においてリハビリテーションの効果が見られるものの、失われた神経軸索やグリア細胞を再生する根本的治療法は無く、アンメットメディカルニーズの高い疾患である。神経再生及び再髄鞘化による治療戦略として、移植による細胞補充が有望視されている。
神経前駆細胞を移植する治療を実現すべく多くの研究成果が報告されており、近年多能性幹細胞から神経前駆細胞を分化誘導する方法が知られている（例えば非特許文献１及び２）。また、神経系細胞の培養方法として、無血清培地中で胚様体を形成させ浮遊培養を行う方法も知られている（例えば非特許文献３）。
脊髄損傷においてはミエリンの脱落が顕著であることから、その治療にはグリア細胞の中でもオリゴデンドロサイトを多く含有する細胞を移植することが重要であると考えられてきたが（非特許文献４、６及び７）、どの細胞種がどの程度含まれていれば治療効果を示すかについては、これまで明らかにされていない。
また、細胞移植の実用化に向けては、移植後の細胞の腫瘍化を防ぐため未分化の多能性幹細胞が残存していないことが必須であり、また、感染性因子の混入を避けるため異種細胞由来成分が含まれないことが望ましい。しかしながら、これまで報告されているオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞凝集体（非特許文献４、５及び特許文献１）は、マウス細胞等のフィーダー細胞存在下で製造されているため、フィーダー細胞又はフィーダー細胞由来の異種細胞由来成分が含まれる可能性がある。そのため、より臨床応用に適した、異種細胞由来成分が含まれ得ない製造方法の確立が必要である。
特表２０１７－５２４３４０号公報
Fukusumi H et al., Stem Cells International, Volume 2016, Article ID 7235757 (2016) Sugai K et al., Molecular Brain、9:85 (2016) Eiraku M et al., Cell Stem Cell 3,519-532 (2008) Douvaras P et al., NatureProtocols 10, 1143-1154 (2015) Numasawa-Kuroiwa Y et al., StemCell Reports, 2: 648-661 (2014) Kawabata S et al., Stem CellReports, 6: 1-8 (2016) Yasuda A et al., Stem Cells 29, 1983-1994.(2011) Nori et al., Stem Cell Reports, 4: 360-73.(2015) Choi SS et al., PLoS ONE 9(4) (2014): e92325 Kunlin Jin et al., J Clin Invest. 2002;110(3):311-319 Thorsten R Doeppner et al., J Cereb Blood Flow Metab 2011; 31: 1251-1262 Shigeki Ohta et al., Journal of Cell Science 2012 125: 3210-3220 Vincent Pons et al., Front. Cell. Neurosci. 2018 12:499 Jeff A Stogsdill et al., Current Opinion in Neurobiology 2017, 42:1-8
本発明は、再生医療に有用な、異種細胞由来成分を含まない、グリア前駆細胞の含有率の高い細胞凝集体を提供すること、及び、異種細胞由来成分が混入する可能性のない、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、病巣におけるミエリン－神経細胞－アストロサイトの相互作用の低下に着目し、移植に用いる細胞には、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経前駆細胞、及びアストロサイト前駆細胞の全てが含まれることが重要であると考え、ｉＰＳ細胞からそのような細胞凝集体を分化誘導でき、かつ、より臨床応用に適した分化誘導方法を検討した。
本発明者らは、まず従来の分化誘導方法である非特許文献５に記載の方法について検討した。非特許文献５に記載の方法では、フィーダー細胞であるマウス細胞上でｉＰＳ細胞を維持培養している。すなわち、異種細胞由来成分を含有する培地を用いてｉＰＳ細胞を分化誘導しているため、得られたオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞凝集体は異種細胞由来成分を含有する可能性がある。一方、臨床応用には、異種細胞由来成分を可能な限り排除することが望まれていた。そこで、本発明者らは、フィーダー細胞非依存の、すなわち、フィーダーフリーｉＰＳ細胞から、異種細胞由来成分不含の培地を使用してオリゴデンドロサイト前駆細胞を含む細胞凝集体の分化誘導方法を開発すべく鋭意検討を行った。
本発明者らは、異種細胞由来成分を含まない未分化維持培地で、フィーダー細胞非存在下で培養されたフィーダーフリーｉＰＳ細胞を用い、非特許文献５に記載の方法を参照して分化誘導を試みた。その結果、ｉＰＳ細胞の細胞株によっては、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ；以下「ＥＢ」と略す場合がある）を形成できない場合があり、また、最終的にオリゴデンドロサイトへの分化能を有さない細胞凝集体へと誘導される確率が高いことが判明し、この分化誘導方法は不安定であることが示唆された。
そこで、ＥＢを形成する方法を検討した結果、培養方法を無血清凝集浮遊培養法（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｂｏｄｙ ｑｕｉｃｋ；以下「ＳＦＥＢｑ法」と略す場合がある）に変更するとともに、分化誘導の過程で、特定の培地と分化誘導剤との組合せを採用することにより、安定的にＥＢを形成できるとともに、オリゴデンドロサイトへの分化能を有する、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体（ニューロスフェア）を得ることができた。当該細胞凝集体は、障害モデル動物に移植された場合に治療効果を示すことも分かった。すなわち、本発明者らは、異種細胞由来成分を含まない、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が大量に製造可能な製造方法を確立することに初めて成功した。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法であって、以下の工程：
（１）１以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地中で、フィーダー細胞非存在下、多能性幹細胞を５日間～１０日間浮遊培養することにより、細胞凝集体を形成させる工程、
（２）（１）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含む胚様体形成培地中で、浮遊培養する工程、
（３）（２）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及び１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程、並びに
（４）（３）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含まず、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
を含み、更に以下の工程：
（５）（４）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤を共に含まない神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
を含んでいてもよい、製造方法。
［２］
（１）の工程において、多能性幹細胞を、複数の均一な形状の孔を有する培養容器を用いて培養する、［１］に記載の製造方法。
［３］
（１）の工程において、（１）の工程開始時に比べて、以下の条件：
１）ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＨＥＳ４及びＨＥＳ５のうち少なくとも１つのＲＮＡの発現量が１００倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、
２）ＯＣＴ３／４のＲＮＡの発現量が２００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること、並びに
３）ＮＡＮＯＧのＲＮＡの発現量が４００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまで、（１）の工程を持続してから、（２）の工程が開始される、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］
（２）の工程において、（２）の工程開始時に比べて、以下の条件：
１）ＡＳＣＬ１、ＤＣＸ、ＨＥＹ１、ＺＢＴＢ２０、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＥＬＡＶＬ３及びＳＬＩＴ１のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＢ８のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまで、（２）の工程を持続してから、（３）の工程が開始される、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
（２）の工程が４日間～１１日間行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］
（１）及び（２）の工程において、酸素濃度が３％～１０％である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
（３）の工程において、（３）の工程開始時に比べて、以下の条件：
１）ＨＥＹ２、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ２．２のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＯＬＩＧ１及び／又はＯＬＩＧ２のＲＮＡの発現量が１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまで、（３）の工程を持続してから、（４）の工程が開始される、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
（３）の工程が４日間～１１日間行われる、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
（４）の工程において、（４）の工程開始時に比べて、以下の条件：
１）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ及びＦＡＢＰ７のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＰＡＸ６のＲＮＡの発現量が５倍以下に低下した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまで、（４）の工程を持続してから、（５）の工程が開始される、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
（４）の工程が４日間以上行われる、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］
（４）の工程において、当該工程開始時に（３）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させる、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］
上記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、当該工程開始時に（４）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を５日間～１００日間浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させる、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］
上記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、Ｏ４抗原、ＮＧ２、ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰから選択される１以上のマーカーが発現するまで、（５）の工程を持続する、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］
上記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、細胞凝集体を培養する培地中において、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される１以上のタンパク質が検出されるまで（５）の工程を持続する、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］
ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＴＧＦβ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤の２種類である、［１］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］
ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、ＳＢ５２５３３４、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、及びＬｅｆｔｙ－１からなる群から選択される１以上である、［１５］に記載の製造方法。
［１７］
ＢＭＰ阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、Ｃｈｏｒｄｉｎ及びＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎからなる群から選択される１以上である、［１５］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］
Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔアゴニスト、Ｄｋｋ及びＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎからなる群から選択される１以上である、［１］～［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］
Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＳＢ２１６７６３及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群から選択される１以上である、［１］～［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］
ＳＨＨシグナル伝達活性化剤が、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧ、ＳＨＨタンパク質及びＳＨＨ断片からなる群から選択される１以上である、［１］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］
多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が、以下の特徴：
（ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
（ｂ）脊髄領域マーカーを発現していること、及び
（ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の成分を含まないこと
を有する、［１］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］
オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法であって、［１］～［２３］のいずれかに記載の製造方法により製造された、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を、成熟化培地を用いて５日間～６０日間培養する工程を含む、製造方法。
［２５］
オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団が、
（ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、
（ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、並びに
（ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞
を含む、［２４］に記載の製造方法。
［２６］
成熟化培地が、Ｔ３、ＮＴ－３及びＬＩＦのうち少なくとも１つを含む培地である、［２４］又は［２５］に記載の製造方法。
［２７］
成熟化培地が、さらにＣＮＴＦを含む、［２６］に記載の製造方法。
［２８］
［１］～［２３］のいずれかに記載の製造方法により得られた、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体。
［２９］
以下の特徴：
（ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
（ｂ）脊髄領域マーカーを発現する細胞を含むこと、
（ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の成分を含まないこと、及び
（ｄ）オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有すること
を有する、グリア細胞前駆細胞を含む細胞凝集体。
［３０］
脊髄領域マーカーがＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８からなる群より選択される１以上のマーカーである、［２９］に記載の細胞凝集体。
［３１］
さらに、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１及びＮＫＸ６．２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含む、［２９］又は［３０］に記載の細胞凝集体。
［３２］
以下の特徴：
（Ｉ）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
（ＩＩ）ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰからなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
（ＩＩＩ）ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＥＬＡＶＬ３、ＮＴＲＫ２、ＧＲＩＡ２、ＰＴＰＲＯ及びＥＰＨＡ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
（ＩＶ）ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＤＬＬ３及びＡＳＣＬ１からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
並びに、
（Ｖ）（ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、
（ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、及び
（ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞
を含む細胞集団へ分化する能力を有すること
を有する、［２９］～［３１］のいずれかに記載の細胞凝集体。
［３３］
さらに、（ＶＩ）Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含む、［２９］～［３２］のいずれかに記載の細胞凝集体。
［３４］
さらに、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群より選択される１以上のマーカーを発現又は分泌する細胞を含む、［２９］～［３３］のいずれかに記載の細胞凝集体。
［３５］
［２４］～［２７］のいずれかに記載の製造方法により得られた、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団。
［３６］
［２８］～［３４］のいずれかに記載の細胞凝集体、又は［３５］に記載の細胞集団を有効成分として含有する、医薬組成物。
［３７］
［２８］～［３４］のいずれかに記載の細胞凝集体、又は［３５］に記載の細胞集団の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患の治療方法。
［３８］
脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患が急性期、亜急性期又は慢性期の脊髄損傷である、［３７］に記載の治療方法。
［３９］
脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患の治療における使用のための、［２８］～［３４］のいずれかに記載の細胞凝集体、又は［３５］に記載の細胞集団。
［４０］
脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患が急性期、亜急性期又は慢性期の脊髄損傷である、［３９］に記載の細胞凝集体、又は細胞集団。
［４１］
被験物質の毒性又は薬効を評価するための方法であって、［２８］～［３４］のいずれかに記載の細胞凝集体、又は［３５］に記載の細胞集団に上記被験物質を接触させ、上記被検物質が上記細胞凝集体又は上記細胞集団に及ぼす影響を検出又は定量することを含む、評価方法。
［４２］
Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカーが発現しているか否かを指標として、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が移植に適していることを判別する方法。
［４３］
Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上の遺伝子、当該遺伝子によりコードされるタンパク質、及びこれらの断片を検出することを含む、グリア前駆細胞若しくはグリアへの分化指向性が高い神経幹細胞の同定方法。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法によれば、フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の異種細胞由来成分を含まない、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を製造することができる。このグリア前駆細胞を含む細胞凝集体をさらに培養すると、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団を製造することができる。本発明の製造方法によって得られた細胞凝集体又は細胞集団は、細胞治療用移植用材料として有用である。
１における、分化３５日目と４９日目のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の明視野像を示す画像である。 実施例１における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の終末分化１４日後の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法のプロトコールの一例を示す図である。 実施例２における分化誘導過程の遺伝子発現解析結果を示す図である。 実施例２における分化誘導過程の遺伝子発現解析結果を示す図である。 実施例２における分化誘導過程の遺伝子発現解析結果を示す図である。 実施例２における分化誘導過程の遺伝子発現解析結果を示す図である。 実施例３における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 実施例３における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を構成する全細胞数当たりのＯＬＩＧ２陽性細胞及びＮＦＩＡ陽性細胞の割合の解析結果を示す図である。 実施例４における、Ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣにおける各クラスターに属す細胞数の割合を示す図である。 実施例４における、Ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣにおける１細胞あたりの各遺伝子の発現量の分布を示す図である。 実施例４における、Ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣにおける１細胞あたりの各遺伝子の発現量の分布を示す図である。 実施例５における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の終末分化３１日後の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 実施例５における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の終末分化後３１日後におけるＯ４陽性細胞、ＧＦＡＰ陽性細胞及びＴｕｊ１陽性細胞の割合を示す図である。 実施例６における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の終末分化前後における各遺伝子発現量の相対値を示す図である。 実施例８における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後のＢＭＳスコアリングによる後肢運動機能評価結果を示す図である。 実施例９における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後のロータロッドテストによる協調運動評価の結果を示す図である。 実施例１０における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後の歩幅による歩様パターン評価の結果を示す図である。 実施例１０における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後の進行方向に対して肢をつく角度による歩様パターン評価の結果を示す図である。 実施例１１における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後のキネマティクス解析による関節の動きを評価した結果を示す図である。（Ａ）は、後肢が地面から離れてから接地するまでの軌跡の代表例を示す。（Ｂ）は歩行周期１周期における股関節、膝関節、足関節、足趾の関節角度変化を示す。 実施例１２における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を亜急性期脊髄損傷モデルマウスに移植した後の組織切片観察の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。（Ａ）はＳＴＥＭ１２１抗体を用いて蛍光免疫染色した矢状切片の結果であり、（Ｂ）はＨＥ染色した矢状切片の結果であり、（Ｃ）は抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色した（１）損傷中心部から頭側４ｍｍ、（２）損傷中心部、（３）損傷中心部から尾側４ｍｍの横断切片のそれぞれの結果である。 実施例１２における、ヒト特異的マーカーと各種マーカーとで蛍光免疫共染色した矢状切片の蛍光顕微鏡画像である。 実施例１２における、矢状切片におけるＨＮＡ陽性移植細胞中の各種陽性細胞率を示す図である。 実施例１２における、Ｔｕｊ１抗体、抗ＨＮＡ抗体と抗マウス特異的Ｂａｓｓｏｏｎ（Ｂｓｎ）及び抗ヒトＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（ｈＳｙｎ）抗体を用いて蛍光免疫染色した矢状切片の蛍光顕微鏡画像である。 実施例１２における、損傷中心部から頭側（Ｒｏｓｔｒａｌ）０．４８ｍｍ、損傷中心部（Ｅｐｉ－ｃｅｎｔｅｒ）及び損傷中心部から尾側（Ｃａｕｄａｌ）０．４８ｍｍのそれぞれのＬＦＢ染色画像ある。 実施例１２における、ＬＦＢ染色した横断切片における損傷中心部から頭尾側０．９６ｍｍまでの髄鞘組織のＬＦＢ陽性領域を定量した結果を示す図である。 実施例１２における、ＳＴＥＭ１２１抗体と抗ＭＢＰ抗体を用いて蛍光免疫染色した横断切片の蛍光顕微鏡画像である。 実施例１２における、免疫電子顕微鏡法によりＳＴＥＭ１２１抗体反応部位を検出した横断切片の電子顕微鏡画像である。金コロイド粒子を標識した二次抗体により検出した、ＳＴＥＭ１２１抗体反応部位（黒い点）を矢印で示す。（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれ異なる視野を撮像した画像である。 実施例１４における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を慢性期脊髄損傷モデルラットに移植した後のＢＢＢスコアリングによる後肢運動機能評価結果を示す図である。 実施例１５における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を慢性期脊髄損傷モデルラットに移植後１２週での歩様パターン評価の結果を示す図である。（Ａ）は歩幅を、（Ｂ）は進行方向に対して肢をつく角度を示す。 実施例１６における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を慢性期脊髄損傷モデルラットに移植した後の組織切片観察の結果を示す。（Ａ）はＨＥ染色した矢状切片の結果であり、（Ｂ）は抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色した矢状切片の結果である。 実施例１６における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を慢性期脊髄損傷モデルラットに移植した後の組織切片観察の結果を示す。（Ａ）は抗ＨＮＡ抗体と抗ＯＣＴ３／４抗体を用いて、（Ｂ）は抗ＨＮＡ抗体と抗Ｈｕ抗体を用いて、（Ｃ）は抗ＨＮＡ抗体と抗ＧＦＡＰ抗体を用いて、（Ｄ）は抗ＨＮＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体を用いて、それぞれ蛍光免疫染色した矢状切片の結果である。 実施例１７における、細胞播種後１日目、８日目と１４日目のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の明視野像を示す画像である。 実施例１７における、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の終末分化２８日後のＯ４抗体、抗ＧＦＡＰ抗体、Ｔｕｊ１抗体を用いて蛍光免疫染色した蛍光顕微鏡画像である。（Ａ）は培養８日後から終末分化を開始した細胞凝集体であり、（Ｂ）は培養１４日後から終末分化を開始した細胞凝集体である。
〔定義〕
本明細書において「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能（特に自己複製能）を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。
多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。
１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、胚盤胞期の内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＦＧＦ２を含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株（ＫｈＥＳ－１由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。
本明細書において「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。
人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１－１０６）。
人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ）、ＧＬＩＳ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣ又はＬ－ＭＹＣ）、（２）ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＬ－ＭＹＣ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。
人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。
本明細書において多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。
本明細書において多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。
ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。
本明細書において「グリア（Ｇｌｉａ）」は、「グリア細胞（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）」、「神経膠細胞」とも呼ばれ、神経系を構成する神経細胞ではない細胞の総称であり、ヒトの脳では細胞数で神経細胞の１０倍以上存在していると見積もられている。グリア細胞としては、アストロサイト（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、オリゴデンドロサイト（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）等が挙げられ、これらは神経組織において、神経細胞の周囲に存在しており、様々な機能を担っている。
本明細書において「マーカー」は、細胞に存在する物質であって、その存在や存在量に基づいて、当該細胞の種類若しくは性質等を同定若しくは判別することができる物質を意味する。マーカーとして、具体的には、ｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質及び糖鎖、並びにこれらの断片が挙げられる。
本明細書において「分化マーカー」は、特定の分化段階にある細胞の分化の程度（レベル）を検出するためのマーカーを意味する。
本明細書において「グリア前駆細胞」は、グリア細胞へ分化する能力を有する細胞を意味し、例えば、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞が挙げられる。
本明細書において「オリゴデンドロサイト」は、中枢神経系に存在するグリア細胞の一種であり、ニューロン（神経細胞）の軸索の周りに巻き付くように存在し、ミエリン（髄鞘）を形成することによって、神経細胞間のシグナル伝導速度を速める働きを担っている。オリゴデンドロサイトは、オリゴデンドロサイトに特異的に発現するマーカーによって同定することができ、当該マーカーとしては、例えばＰＬＰ、ＧａｌＣ、ＡＰＣ、ＭＢＰ、ＭＡＧ、ＭＯＧ、ＧＳＴ－π、ＳＯＸ１０、Ｏ４（オー４）抗原、ＮＧ２（ＣＳＰＧ４）及びＣＮＰ等が知られており、例えば遺伝子増幅法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、免疫組織学的手法、フローサイトメトリー解析等を用いて分析することによって、上記ｍＲＮＡ、糖鎖若しくはタンパク質のうち少なくとも１種類を発現する細胞をオリゴデンドロサイトとして判別することが可能である。尚、上記マーカーのうち、アストロサイトでも発現が認められるＮＧ２を指標とする場合には、別のマーカーと併せて同定することが望ましい。
本明細書において「オリゴデンドロサイト前駆細胞」は、オリゴデンドロサイトに分化する能力を有する細胞を意味する。オリゴデンドロサイト前駆細胞の存在は、オリゴデンドロサイト前駆細胞において、有意に発現が認められるマーカーによって特定することができる。オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーとしては、例えばＰＤＧＦＲα及びＯＬＩＧ２等が知られており、例えば遺伝子増幅法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、免疫組織染色法等を用いて分析することによって、上記ｍＲＮＡ若しくはタンパク質のうち少なくとも１種類のマーカーを発現する細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞として判別することが可能である。なお、ミエリンを形成していない未成熟なオリゴデンドロサイトも、オリゴデンドロサイト前駆細胞に含まれる。
本明細書において「アストロサイト」は、中枢神経系に存在するグリア細胞の一種であり、ニューロンを構造的に支える機能や、神経伝達物質やエネルギ―及び細胞外イオン濃度を調節することにより、神経伝達の活性化に寄与していると考えられている。また、上記オリゴデンドロサイトに対して、ミエリン形成を促進する物質を供給すると考えられており、神経組織において、ニューロン及びオリゴデンドロサイトとともに重要な機能を担う細胞である。アストロサイトに特異的に発現するマーカーによって同定することができ、当該マーカーとしては、例えばＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＮＧ２及びＳＬＣ１Ａ３（ＧＬＡＳＴ若しくはＥＡＡＴ１ともいう）等が知られており、例えば免疫組織学的手法を用いて分析することによって、上記ｍＲＮＡ、糖鎖若しくはタンパク質のうち少なくとも１種類を発現する細胞をアストロサイトとして判別することが可能である。尚、上記マーカーのうち、オリゴデンドロサイトでも発現が認められＮＧ２を指標とする場合には、別のマーカーと併せて同定することが望ましい。
本明細書において「アストロサイト前駆細胞」は、アストロサイトに分化する能力を有する細胞を意味する。アストロサイト前駆細胞の存在は、アストロサイト前駆細胞において、有意に発現が認められるマーカーによって特定することができる。アストロサイト前駆細胞のマーカーとしては、例えばＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７及びＺＢＴＢ２０等が挙げられる。
多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトへの分化の過程において、まず多能性幹細胞が神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に分化し、さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞、そしてオリゴデンドロサイトの順へと分化する。神経幹細胞は多分化能（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、神経前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞のいずれにも分化可能であるが、オリゴデンドロサイト前駆細胞に分化されると、オリゴデンドロサイトへ分化することが運命づけられる。また、神経前駆細胞へ分化されると、神経細胞へ分化することが運命づけられ、アストロサイト前駆細胞へ分化されると、アストロサイトへ分化することが運命づけられる。
ここでアストロサイトへ分化することが運命付けられたことは、以下の１以上のマーカー：ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３及びＳ１００Ｂのうちの少なくとも一つを発現しているか否か、好ましくはＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３及びＳ１００Ｂのうちの少なくとも一つを発現しているか否かで確認することができる。ここでＳ１００ＢはＳ１００βともいう。
本明細書において神経細胞とは、細胞体、樹状突起及び軸索から構成される神経単位のことを言い、ニューロンとも呼ばれる。神経細胞は、有意に発現するマーカーによって同定することができ、当該マーカーとしては、例えばβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３等が挙げられる。
神経細胞は、他の神経細胞又は刺激受容細胞からの刺激を別の神経細胞、筋又は腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより、セロトニン神経、運動神経等のように分類されるが、本明細書においては神経伝達物質の種類については特に限定しない。
本明細書において「神経前駆細胞」は、神経細胞への分化能を有し、神経細胞へ分化することが運命づけられた細胞のことをいい、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ポリシアリル化ＮＣＡＭ、神経マーカー（ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ等）等によって同定されうる。
本明細書において「神経幹細胞」は、神経前駆細胞への分化能、及びアストロサイト前駆細胞又はオリゴデンドロサイト前駆細胞を含むグリア前駆細胞への分化能を共に有する細胞のことをいい、中間体フィラメントタンパク質（ネスチン、ビメンチン等）、転写因子ＳＯＸ１，ＰＡＸ６等の原始的神経外胚葉及び神経幹細胞のマーカー等によって同定されうる。
本明細書において、「脊髄領域マーカー」とは、発生段階において、脊髄への分化に伴って発現するマーカーを意味し、具体的には、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８等の遺伝子又は当該遺伝子がコードするタンパク質等が挙げられる。
本明細書において、「腹側領域マーカー」とは、発生段階において、腹側への分化に伴って発現するマーカーを意味し、具体的には、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１及びＮＫＸ６．２等の遺伝子又は当該遺伝子がコードするタンパク質等が挙げられる。
本明細書において「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定されず、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞凝集体には、特定の組織を形成している場合も含まれる。胚様体もまた、細胞凝集体に包含される。本明細書において「細胞集団」は、細胞凝集体（スフェア状細胞集団）であってもよく、層状の細胞集団であってもよい。
本明細書において「培地」は、動物細胞の培養に通常用いられる培地であればよく、動物細胞が生命を維持することができれば特に限定されないが、好ましくは目的細胞に増殖可能な環境を提供するものである。培地は自ら調製してもよく市販培地を購入して用いてもよい。本明細書において「胚様体形成培地」、「神経・グリア増殖用培地」及び「成熟化培地」は、上記培地を基礎培地としているものであり、それぞれの目的に合った因子等を添加することによって調製することができる。
本発明で使用される培地は、移植に適した細胞凝集体を製造するために使用するという観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本明細書において、精製された血液由来成分、又は、動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地であっても、無調整又は未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
本発明で使用される培地には、血清代替物が含まれていてもよい。血清代替物として、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、或いはこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製；以下、ＫＳＲと記す場合がある。）、「ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ）」Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＩＴＳサプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が挙げられ、好ましくはＢ２７サプリメントが挙げられる。
本発明で使用される培地は、好ましくはゼノフリー培地である。ここで「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分（異種由来成分、Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒともいう）が排除された条件を意味する。無血清培地の一部は、ゼノフリー培地であり得る。
本明細書において、フィーダー細胞とは、多能性幹細胞等の幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞をいう。フィーダー細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（ＭＥＦ等）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞、ＳＴＯ細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理されたフィーダー細胞であってもよい。ここで、増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンＣ）処理又はガンマ線照射若しくはＵＶ照射等による処理が挙げられる。
本明細書においてフィーダー細胞由来の成分とは、当該幹細胞には含まれず、フィーダー細胞に含まれる若しくはフィーダー細胞が分泌する成分を意味する。
本明細書において、「異種細胞」は、培養対象の細胞とは異なる生物種由来の細胞を意味し、「異種動物細胞」と同義で用いられる。「異種細胞由来成分」は当該異種細胞由来の成分であって、培養対象の細胞には含まれない成分を意味する。
フィーダー細胞由来の異種細胞由来成分とは、フィーダー細胞が培養対象の細胞とは異なる生物種由来である場合において、当該フィーダー細胞由来の成分であって、培養対象の細胞には含まれない成分を意味する。
具体的な成分としては、少なくとも、塩基配列若しくはアミノ酸配列等が異なるたんぱく質成分、糖及び脂質等が挙げられる。
本発明において「浮遊培養」とは、細胞を培地中に浮遊させた状態で生存させることを意味する。本明細書中では、細胞は、単一細胞又は複数の細胞が集まった塊（細胞凝集体又は細胞集団）の状態で浮遊培養される。浮遊培養された細胞は、増殖及び／又は分化する。
〔グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法〕
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法の一態様としては、
（１）１以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地中で、フィーダー細胞非存在下、多能性幹細胞を５日間～１０日間浮遊培養することにより、細胞凝集体を形成させる工程、
（２）（１）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含む胚様体形成培地中で、浮遊培養する工程、
（３）（２）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及び１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程、並びに
（４）（３）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含まず、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
を含み、更に以下の工程：
（５）（４）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤を共に含まない神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
を含んでいてもよい、
製造方法が挙げられる。
＜（１）の工程＞
（１）の工程において、多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成させる。「胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ；ＥＢ）」とは、多能性幹細胞を浮遊培養することによって形成される三次元の細胞凝集体を意味する。多能性幹細胞を効率よく目的細胞に分化させるためには、分化の途中で形成される胚様体が、目的細胞が含まれる胚葉（外胚葉、中胚葉又は内胚葉）への分化能を有する細胞を多く含有することが好ましい。例えば、多能性幹細胞を神経細胞やグリア細胞に分化させたい場合、分化途中で形成される胚様体には、外胚葉への分化能を有する細胞が多く含まれることが好ましい。すなわち、本明細書において、胚様体は、好ましくは外胚葉への分化能を有する胚様体である。もっとも、胚様体形成の過程においても多能性幹細胞の分化は開始されており、胚様体は、外胚葉に分類される細胞を含んでいてもよい。
（１）の工程において、多能性幹細胞は、有効濃度の１以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤等の分化誘導因子を含む胚様体形成培地を用いて培養される。（１）の工程において使用される培地は、胚様体形成培地に有効濃度の上記所定の分化誘導因子を混合することによって調製することができる。
本明細書において、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＳＭＡＤにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、１以上のＳＭＡＤシグナル阻害剤を適宜組合せて使用してもよい。ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤としては、例えば、ＳＭＡＤシグナルの上流において、ＳＭＡＤのリン酸化を阻害することでＳＭＡＤシグナル伝達を阻害し得るＴＧＦβスーパーファミリーの阻害剤、具体的には、ＴＧＦβ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤が挙げられる。ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＴＧＦβ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤の２種類を用いることが好ましく、例えば、１以上のＴＧＦβ阻害剤、好ましくは１つのＴＧＦβ阻害剤と、１以上のＢＭＰ阻害剤、好ましくは１つのＢＭＰ阻害剤とを適宜組合せて使用してもよい。
本明細書において、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。ＴＧＦβ阻害剤として、例えばＴＧＦβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、ＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、ＴＧＦβ受容体の阻害剤等）を挙げることができる。ＴＧＦβ阻害剤として、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。
本明細書において、具体的なＴＧＦβ阻害剤としては、例えばＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ ２：２０（２００３））、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ２００９１４６４０８）、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、ＳＢ５２５３３４、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、Ｌｅｆｔｙ－２（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿１７７０９９、ヒト：ＮＭ＿００３２４０及びＮＭ＿００１１７２４２５が例示される）、及びこれらの誘導体等が挙げられ、少なくとも１つのＴＧＦβ阻害剤を使用することができる。ＴＧＦβ阻害剤として、好ましくは、ＴＧＦβ受容体（ＡＬＫ５）及びアクチビン受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤として知られている、ＳＢ４３１５４２及びＡ８３－０１からなる群から選択される１以上であることが好ましい。
培地中におけるＴＧＦβ阻害剤の濃度は、ＴＧＦβにより媒介されるシグナル伝達を抑制可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、ＳＢ４３１５４２の濃度は、ＡＬＫ５を阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは５００ｎＭ～３０μＭ、更に好ましくは１μＭ～２０μＭである。他のＴＧＦβ阻害剤の場合、前述の濃度のＳＢ４３１５４２に相当するＡＬＫ阻害活性若しくはＴＧＦβ阻害活性を示す濃度を、適宜設定することができる。
本明細書において、ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とＢＭＰ受容体（Ｉ型又はＩＩ型）との結合を介するＢＭＰシグナル伝達（ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の阻害に関与する阻害剤である限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。ＢＭＰ阻害剤としては、ＢＭＰに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰの結合を阻害することによって上記のＢＭＰシグナル伝達を阻害する生物活性を有する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、ＢＭＰ受容体の阻害剤等）や、ＢＭＰ Ｉ型受容体キナーゼ阻害剤等が含まれる。
ＢＭＰ受容体へのＢＭＰの結合を阻害することによって上記のＢＭＰシグナル伝達を阻害する生物活性を有するものの具体例には、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ及びこれらの誘導体が挙げられる。また、ＢＭＰ Ｉ型受容体キナーゼ阻害剤の具体例には、ＬＤＮ－１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）及びその誘導体（例えば、ＬＤＮ－２１２８５４）が挙げられる。その他ＢＭＰ阻害剤として、Ｋ０２２８８、Ｃｈｏｒｄｉｎ及びＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎが挙げられる。
ＢＭＰ阻害剤としては、好ましくはＮｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＫ０２２８８（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３； ８（４）： ｅ６２７２１．）からなる群から選択される１以上である。
培地中におけるＢＭＰ阻害剤の濃度は、例えばＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を抑制可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、ＬＤＮ－１９３１８９の濃度は、ＢＭＰ Ｉ型受容体キナーゼを阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～１０μＭ、好ましくは１０ｎＭ～５μＭ、更に好ましくは５０ｎＭ～３μＭ、更により好ましくは５０ｎＭ～１μＭである。他のＢＭＰ阻害剤の場合、前述の濃度のＬＤＮ－１９３１８９に相当するＢＭＰ Ｉ型受容体キナーゼ阻害活性若しくはＢＭＰ阻害活性を示す濃度を、適宜設定することができる。
本明細書において、Ｗｎｔシグナル活性化剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えばＷｎｔタンパク質（Ｗｎｔ３ａ等）、Ｗｎｔアゴニスト、Ｄｋｋ（Ｗｎｔシグナル伝達阻害タンパク質の阻害剤）、ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ ３β）阻害剤、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ等が挙げられる。
本明細書において、ＧＳＫ３β阻害剤は、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＧＳＫ）３βタンパク質のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、その具体例として、ＢＩＯ（別称：ＧＳＫ－３βインヒビターＩＸ；６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）等のインジルビン（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ）誘導体、ＳＢ２１６７６３等のマレイイミド誘導体、ＧＳＫ－３βインヒビターＶＩＩ等のα－ブロモメチルケトン化合物、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｌ８０３－ｍｔｓ等の細胞膜透過性リン酸化ペプチド、及びそれらの誘導体が挙げられる。
本明細書において、Ｗｎｔシグナル活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤であることが好ましく、また、ＧＳＫ３β阻害剤である、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＳＢ２１６７６３及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群から選択される１以上であることが好ましい。
培地中におけるＷｎｔシグナル活性化剤の濃度は、例えばＷｎｔ３ａにより媒介されるシグナル伝達を亢進可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、ＧＳＫ３βを阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは５００ｎＭ～３０μＭ、更に好ましくは１μＭ～１０μＭである。他のＷｎｔシグナル活性化剤の場合、前述の濃度のＣＨＩＲ９９０２１に相当するＧＳＫ３β阻害活性若しくはＷｎｔ３ａにより媒介されるシグナル伝達の亢進を示す濃度を、適宜設定することができる。
（１）の工程において、多能性幹細胞はフィーダー細胞非存在下で培養される。フィーダー細胞非存在下とは、フィーダーフリーともいい、培地中にフィーダー細胞が存在しない状態をいう。フィーダー細胞非存在下の培養条件としては、例えば、線維芽細胞、ＳＮＬ細胞、ＳＴＯ細胞等のフィーダー細胞を添加していない培養条件が挙げられる。
本明細書において「胚様体形成培地」とは、多能性幹細胞を浮遊培養することにより胚様体を作製する際に使用可能な培地であれば特に限定されない。胚様体形成培地としては、胚様体の形成に適し、かつ、多能性幹細胞のフィーダーフリー培養に適した、フィーダーフリー培地であってよい。胚様体形成培地は、例えば基礎培地に必要に応じて血清代替物及び栄養源等の添加因子を添加することにより調製することができる。
基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ （ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。これらの基礎培地には、糖質やアミノ酸等の炭素源やビタミン、無機塩類等が含まれる。
胚様体形成培地としては、例えば、多能性幹細胞を未分化のままに維持培養するための培地（未分化維持培地）から、未分化維持のために必要な因子（未分化維持因子）の一部又は全てを除いた培地、又は、後述のとおり一部若しくは全ての未分化維持因子の濃度を有効濃度以下に低下させた培地を使用することができる。このような培地は、例えば、当該培地と同等の成分を含むように配合することによって調製することができる。または、例えば、ＤＭＥＭ等の基礎培地に血清代替物やホルモン等の栄養因子を添加した培地を使用することもできる。或いは、未分化維持培地は複数の液体を適宜混合して使用できるようキットとして販売されている場合があり、その場合、未分化維持因子を含む液体を入れないで配合することで、胚様体形成培地を調製することも可能である。例えばＳｔｅｍ Ｆｉｔ ＡＫ０３Ｎ（味の素ヘルシーサプライ社製）の場合、Ａ液、Ｂ液及びＣ液に分かれているので、ＦＧＦ２を含むＣ液を除いてＡ液及びＢ液のみで胚様体形成培地を調製して使用することができる。
胚様体形成培地として未分化維持培地に基づく培地を用いる場合は、（１）の工程開始時に培地の基本組成を大幅に変えることなく、所望の添加因子を所望の濃度まで適宜変化させればよいという利点がある。これにより、細胞にとって培養環境が大きく変わらないという利点がある。
胚様体形成培地には、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達活性化剤等の分化誘導因子の作用を阻害又は拮抗する成分が、（１）の工程に影響を与えない程度、例えば作用しない程度の濃度で含まれるか、又は含まれないことが好ましい。
（１）の工程に用いられる培地の具体例としては、未分化維持培地である、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ培地（味の素ヘルシーサプライ社製）から、キット中でＣ液と呼ばれるＦＧＦ２を抜いた培地（ＡＫ０３Ｎ－Ｃ）を胚様体形成培地とし、５０ｎＭ～３μＭ、好ましくは１００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤）、１μＭ～２０μＭ、好ましくは３μＭのＳＢ４３１５４２（ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤）及び１μＭ～１０μＭ、好ましくは３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤）（全てステムジェン社製）を添加した培地が挙げられる。
（１）の工程において、多能性幹細胞は、胚様体形成培地中で５日間～１０日間浮遊培養される。一実施形態において、浮遊培養は、細胞が細胞凝集体（又は胚様体）を形成した状態で浮遊培養される。浮遊培養としては、いわゆるＳＦＥＢｑ法（非特許文献３）として知られている浮遊培養法が好ましい。ＳＦＥＢｑ法、複数の均一な形状の孔を有する培養容器を用いて、多能性幹細胞を浮遊培養することにより細胞凝集体を形成させる方法である。ＳＦＥＢｑ法においては、細胞は、（１）の工程開始時に分散された単一の細胞として培養容器（孔）内で浮遊培養され、やがて一つの孔の中で浮遊していた細胞同士が接着することにより、３次元構造を取り、各孔に一つずつ細胞凝集体を形成する。
ＳＦＥＢｑ法において使用される複数の均一な形状の孔を有する培養容器としては、一つの培養容器には、複数の、例えば６、１２、２４、９６又は３８４の、独立した、細胞を培養するための空間（孔）を有し、これらの孔は同じ形状及び大きさを有することが好ましい。培養容器の各孔は柱状であってよく、底面の形状は特に限定されないが、真円、正方形、長方形、多角形、楕円等であってよく、真円であること（すなわち、孔が円柱状であること）が好ましい。また、孔の底面が平底であってもよく、丸底（Ｕ底）又はＶ底又はＭ底であってもよく、好ましくはＵ底又はＶ底又はＭ底、より好ましくはＶ底又はＭ底、最も好ましくはＶ底である。底の形状が尖っていることにより、孔内に懸濁（浮遊）した細胞が集まりやすく、一定時間内に球状を形成しやすいからである。また、孔の底面に細胞非接着性素材又は細胞低接着性素材が用いられているものであることが好ましい。
培養容器における孔は、底面積が平底換算で０．１～２．０ｃｍ２、好ましくは０．５～１．２ｃｍ２、より好ましくは０．３５ｃｍ２程度であってよく、内径が０．３～１６．５ｍｍ、好ましくは３～１１ｍｍ、より好ましくは６～８ｍｍ程度であってよく、高さが０．１～２０ｍｍ、好ましくは０．３～１７ｍｍ、より好ましくは８～１２ｍｍであってよい。
培養容器として、通常市販で入手できる培養容器、例えば、６ウェルプレート（底面積が平底換算で９．５ｃｍ２程度、内径３５ｍｍ程度）、１２ウェルプレート（底面積が平底換算で３．８ｃｍ２程度、内径２３ｍｍ程度）２４ウェルプレート（底面積が平底換算で１．８８ｃｍ２程度、内径１６ｍｍ程度）、４８ウェルプレート（底面積が平底換算で１．０ｃｍ２程度、内径１１ｍｍ程度）、９６ウェルプレート（底面積が平底換算で０．３５ｃｍ２程度、内径６～８ｍｍ程度）、３８４ウェルプレート（底面積が平底換算で０．１ｃｍ２程度、内径３～４ｍｍ程度）が挙げられる。好ましくは、９６ウェルプレートであり、より好ましくはＶ底の９６ウェルプレートである。
９６ウェルプレートとしては、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖ、９６Ｍ、９６Ｕ、９６スリットウェルプレート（住友ベークライト社製）、Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ウェル丸型ボトム（コーニング社製）を使用することができる。また、培養容器は、均一な大きさの細胞凝集体を独立して形成可能な形状を有していれば、９６ウェルプレートのように各孔が明確に独立している必要はなく、例えばディッシュの底面に凹凸、又は、くぼみがあるものを使用することもできる。このような培養容器としてマルチディンプルが挙げられ、６０ｍｍ～１５０ｍｍのものが利用されているが、これに限定されない。
９６ウェルプレートの全ての孔に細胞懸濁液を分注した場合には、原理的には９６個の均一な細胞凝集体を得ることが可能となり、プレートの数を増やす、或いはマルチディンプルのようなウェル当たりの孔の数を増やすことによって、一度に大量の細胞凝集体を得ることが可能となる。市販のマルチディンプルとしては、例えばＥｌｐｌａｓｉａ（クラレ社製）やＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（旭テクノグラス社製）を使用することができるが、これらに限定されない。
ＳＦＥＢｑ法において、まず均一な細胞密度を有する細胞懸濁液を、培養容器の各孔に等量ずつ分注する。９６ウェルプレートの場合、細胞密度は３０００細胞／ウェル～２００００細胞／ウェルであってよく、好ましくは５０００細胞／ウェル～１００００細胞／ウェルであってよく、より好ましくは約９０００細胞／ウェルである。そして、培養開始から短時間で、例えば２４時間以内に、好ましくは１２時間以内、より好ましくは８時間以内に、各孔の中央部分に１つずつほぼ同じ大きさを有する細胞凝集体が形成される。また、分注する細胞懸濁液の量や細胞密度を調節することにより、細胞凝集体の径及び細胞数を制御することが可能である。さらに、ＳＦＥＢｑ法を用いることによって、得られた複数の細胞凝集体は球状となり、再現性高く細胞凝集体を形成させることができる。
（１）の工程における浮遊培養は、凡そ５日間～１０日間、好ましくは凡そ７日間～１０日間、より好ましくは凡そ７日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することができ、（１）の工程においては、例えば、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＨＥＳ４及びＨＥＳ５の発現量の上昇、ＯＣＴ３／４の発現量の低下、及びＮＡＮＯＧの発現量の低下によって培養期間を決めることができる。具体的には、（１）の工程開始時に比べ、以下の条件：
１）ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＨＥＳ４及びＨＥＳ５のうち少なくとも１つの発現量がＲＮＡレベルで１００倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、
２）ＯＣＴ３／４の発現量がＲＮＡレベルで２００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること、並びに
３）ＮＡＮＯＧの発現量がＲＮＡレベルで４００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまでの期間、（１）の工程を持続してから、（２）の工程を開始してもよい。
本明細書において、「ＲＮＡレベルでＸ倍多く発現する」こと、「発現量がＲＮＡレベルでＸ倍上昇した」こと、又は「ＲＮＡの発現量がＸ倍上昇した」こととは、工程中の２時点において浮遊細胞或いは細胞凝集体を構成する細胞を一つ又は複数取得し、細胞中のＲＮＡ発現量を絶対的又は相対的に定量できる手法を用いて、比較解析した結果、一方の時点より他方の時点のＲＮＡ発現量がＸ倍多い（Ｘ倍上昇した）ことを意味する。また、「ＲＮＡレベルでＸ倍少なく発現する」こと、「発現量がＲＮＡレベルでＸ倍低下した」こと、又は「ＲＮＡの発現量がＸ倍低下した」ことは、一方の時点より他方の時点のＲＮＡ発現量がＸ倍少ない（Ｘ倍低下した）ことを意味する。用いる手法はＲＮＡの定量が可能な限り特に限定されないが、ＲＮＡシーケンス、リアルタイムＰＣＲアッセイ、マイクロアレイ、ノザンブロット、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、等を用いた測定法が使用可能であり、好ましくは、ＲＮＡシーケンス、リアルタイムＰＣＲアッセイ、マイクロアレイを用いて比較計測される。
（１）の工程における浮遊培養の培養条件は特に限定されないが、例えば、３５℃～３７℃、好ましくは３７℃の温度、９０％～９５％、好ましくは９５％の湿度、３％～５％、好ましくは５％のＣＯ２濃度の条件であればよく、さらに低酸素培養条件であることが好ましい。「低酸素培養条件」とは、大気中の酸素濃度（約２１％）より低い酸素濃度において、細胞を培養する条件のことを意味する。ここで、酸素濃度とは、培養装置中、細胞を含む培地が接する空気中の酸素の濃度を意味する。酸素濃度は、２０％以下であれば特に限定されないが、好ましくは３％～１０％の範囲であり、より好ましくは４％～６％の範囲であり、最も好ましくは５％である。
なお、分化させる前に、すなわち、（１）の工程の前に、多能性幹細胞を未分化維持培地で維持培養してもよい。未分化維持培地は、未分化状態を維持するために必要な因子（未分化維持因子）を含み、多能性を維持できる培地である。未分化維持因子としては、線維芽細胞増殖因子、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβファミリー）因子、アクチビンＡ等が挙げられる。
本明細書における「線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、ＦＧＦ）」とは、線維芽細胞増殖因子受容体に作用してＦＧＦシグナルを活性化する因子を意味する。ＦＧＦとして、例えば、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦともいう）、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８が挙げられる。
本明細書における未分化維持培地は、フィーダーフリー条件で多能性幹細胞を維持培養可能な培地、すなわちフィーダーフリー培地である。使用可能なフィーダーフリー培地としては、様々な培地が開発、市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、添加剤としてＬ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム（６４ｍｇ／ｌ）、セレン化ナトリウム（１４μｇ／１）、インスリン（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ３（５４３ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（１０．７ｍｇ／ｌ）、ＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍｌ）、及び、ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍｌ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍｌ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８、ｐ４２４－４２９（２０１１））。
市販の未分化維持培地として、他に、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社社製）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｓｅｐ ９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＤＥＦ－ＣＳ ５００ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社製）又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素ヘルシーサプライ社製）が挙げられる。
上述の未分化維持培地の成分から、未分化維持因子の濃度を低下させて、未分化維持因子を除去した組成の培地を調製し、（１）の工程の胚様体形成培地として使用することができる。従って、（１）の工程で用いられる胚様体形成培地は、好ましくは、フィーダーフリー培地であり、かつ未分化維持因子の濃度を低下させた、又は未分化維持因子を除去した未分化維持培地である。具体的には、ＦＧＦ２等のＦＧＦを含まないフィーダーフリー培養用の未分化維持培地が挙げられる。また、後述の神経・グリア増殖用培地又はこれと類似の組成の培地と、未分化維持培地とを、１：１等の比率で混合した培地を、胚様体形成培地として用いることもできる。
＜（２）の工程＞
（２）の工程において、（１）の工程で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含む胚様体形成培地中で、浮遊培養する。胚様体形成培地及び浮遊培養は、上述のとおりである。（２）の工程で用いられる培地は、胚様体形成培地にレチノイン酸を混合することによって調製することができる。
（２）の工程で用いられる培地は、（１）の工程で用いられる培地とは、レチノイン酸を含むこと、１以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤を含まないことの２点を除き、同一組成を有する培地であってもよい。「レチノイン酸」としては、レチノイド類（例えば、レチノイン酸）を挙げることができる。（２）の工程で用いられる培地の具体例として、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ培地（味の素ヘルシーサプライ社製）から、キット中でＣ液と呼ばれるＦＧＦ２を抜いた培地（ＡＫ０３Ｎ－Ｃ）を胚様体形成培地とし、１μＭ レチノイン酸（シグマアルドリッチ社製）を添加した培地が挙げられる。
培地中におけるレチノイド類の濃度は、レチノイン酸により媒介されるシグナル伝達を亢進可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、レチノイン酸の濃度は、活性、すなわち領域特異性の後方化作用を示す限り限定はないが、例えば、１０ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ、更に好ましくは５００ｎＭ～５μＭである。他のレチノイド類の場合、前述の濃度のレチノイン酸に相当する活性を示す濃度を、適宜設定することができる。
（１）の工程の終了時に、（１）の工程で用いられる培地を培養容器から取り除き、（２）の工程で用いられる培地に培地交換することによって、（２）の工程を開始することができる。（２）の工程で、（１）と同じ培養容器を使用する場合には、細胞凝集体を保護する観点から、半量程度の培地を交換することが好ましいが、この作業を複数回繰り返すことによって、半量以上の培地を交換することができる。また、この時、必要に応じて、（２）の工程で用いられる培地以外の培地又はリン酸緩衝液等を用いて細胞凝集体を洗浄したのち、（２）の工程で用いられる培地での培養を開始することもできる。或いは、（１）の工程の終了時に、（１）で得られたすべての細胞凝集体を回収し、必要に応じて、細胞凝集体を洗浄したのち、（２）の工程で用いられる培地に懸濁することによって、（２）の工程を開始することもできる。（２）の工程において使用する培養容器は浮遊培養用の培養器材であれば特に限定されず、当業者に汎用されているディッシュ―やプレートを用いることができる。例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖ及びＵｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）等が挙げられる。
（２）の工程における浮遊培養は、凡そ３日間～２１日間、好ましくは凡そ４日間～１１日間、より好ましくは凡そ７日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することができ、例えば細胞を採取して発現する分化マーカーのｍＲＮＡ量若しくはタンパク質量を測定することができる。または、培養上清を採取し、細胞から培地中に分泌される分化マーカーのタンパク質量を測定してもよい。（２）の工程においては、例えば、ＡＳＣＬ１、ＤＣＸ、ＳＬＩＴ１、ＨＥＹ１、ＺＢＴＢ２０、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＥＬＡＶＬ３、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＢ８からなる群より選択される１以上のマーカーのＲＮＡ若しくはタンパク質の発現量によって培養期間を決めることができる。具体的には、（２）の工程開始時に比べ、
１）ＡＳＣＬ１、ＤＣＸ、ＨＥＹ１、ＺＢＴＢ２０、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＥＬＡＶＬ３及びＳＬＩＴ１のうち、少なくとも１つの発現量がＲＮＡレベルで５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＢ８のうち、少なくとも１つの発現量がＲＮＡレベルで５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまでの期間、（２）の工程を持続してから、（３）の工程を開始してもよい。
（２）の工程における浮遊培養の培養条件は（１）の工程と同様であってよく、さらに低酸素培養条件であることが好ましい。低酸素培養条件の酸素濃度としては、２０％以下であれば特に限定されないが、好ましくは３％～１０％の範囲であり、より好ましくは４％～６％の範囲であり、最も好ましくは５％である。
＜（３）の工程＞
（３）の工程において、（２）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及び１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する。胚様体形成培地は、上述のとおりである。（３）の工程で用いられる培地は、胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地にレチノイン酸及び１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を混合することによって調製することができる。胚様体形成培地を用いる場合、（２）の工程で用いられる培地に、さらに１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を混合することによって調製することもできる。
本明細書において「神経・グリア増殖用培地」とは、グリア前駆細胞、グリア細胞、神経前駆細胞及び神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ；ニューロン）の増殖培養に適した培地を意味し、これらの細胞の生存を維持し、かつ分化・増殖させることができる培地であれば特に限定はない。神経・グリア増殖用培地は、上記の基礎培地に適宜、グリア前駆細胞、グリア細胞、神経前駆細胞及び神経細胞の生存に適した栄養因子等を添加して作製することもできるが、特に神経系細胞の維持培養又は分化誘導に適した培地として市販されているものを適宜組み合わせるか又は組成を一部変更して使用することもできる。例えば、市販されているＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、又は市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２等の基礎培地等を選択した上で、これに適宜上記栄養因子等を添加して使用してもよい。
前述の「生存に適した栄養因子」は、神経系細胞を培養する際に添加される因子として当業者に周知のものを適宜組合せて用いることができるが、具体的には、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、トランスフェリン、プトレシン、成長因子、ビタミン、ｃＡＭＰ活性化剤、ホルモン、神経栄養因子等が挙げられ、これらから１以上の因子を選択して使用することができる。
本明細書における神経・グリア増殖用培地には、特にグリア前駆細胞、グリア細胞、神経前駆細胞及び神経細胞の全てを適切に分化・増殖させるべく１種類以上の成長因子が含まれていることが好ましく、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が含まれていることが好ましい。血小板由来成長因子としては、ＰＤＧＦ－ＡＡを用いることができる。本明細書における神経・グリア増殖用培地には、その他の成長因子として、ＦＧＦ（例えばＦＧＦ２）、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１又はＨＧＦ等も挙げられる。好ましい一態様として、神経・グリア増殖用培地には、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１及びＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）が含まれる。
神経栄養因子としては、ヒトＮＴ－３（組み換え体タンパク質ヒトニューロトロフィン３）、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ又はＣＮＴＦ等が挙げられる。ビタミンとしては、ビオチン又はアスコルビン酸等が挙げられる。ｃＡＭＰ活性化剤としては、ｃＡＭＰ、ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ又はフォルスコリン等が挙げられる。ホルモンとしては、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）又はＴ３等が挙げられる。好ましい一態様として、神経・グリア増殖用培地には前述の成長因子に加えて、Ｔ３等の甲状腺ホルモン、ＮＴ－３等の神経栄養因子が含まれる。
上述の栄養因子を適宜配合した混合物として、Ｎ１サプリメント（以下、Ｎ１と記す場合がある）、Ｎ２サプリメント（以下、Ｎ２と記す場合がある）、Ｂ２７サプリメント（ビタミンＡを除去したものも含む；以下、Ｂ２７と記す場合がある）等が市販されていることから、これを便宜的に用いて基礎培地に添加することができる。例えばＮ２には、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム及びプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）が含まれている。Ｎ２を使用する場合、更に、ヒトＮＴ－３、及び／又はＢ２７（ビタミンＡを除くことが好ましい）が含まれていることが好ましい。
神経・グリア増殖用培地として、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、Ｎ２、Ｂ２７（ビタミンＡを除いたものを用いてもよい）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｔ３、ＮＴ－３、ＰＤＧＦ－ＡＡ及びＩＧＦ－１を添加した培地が挙げられる。また、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、グルコース、Ｌ－グルタミン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、プトレシン、Ｂ２７、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｔ３、ＮＴ－３、ＰＤＧＦ－ＡＡ、及びＩＧＦ－１を添加した培地が挙げられる。また、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、β－メルカプトエタノール、Ｂ２７、Ｎ２、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｔ３、ＮＴ－３、ＰＤＧＦ－ＡＡ、及びＩＧＦ－１を添加した培地を挙げられる。さらに、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、Ｎ１、Ｂ２７、Ｔ３、ビオチン、ジブチリルｃＡＭＰ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＩＧＦ－１、及びＮＴ－３を添加した培地が挙げられる。
神経・グリア増殖用培地には、上述の神経系細胞の生存に適した栄養因子が１以上含まれているという観点から、当該成分の生物活性を阻害若しくは抑制する物質を含まないか、有効濃度に満たない濃度で含むことが好ましい。
神経・グリア増殖用培地の具体例として、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、１％Ｎ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ビタミンＡの濃度が５μｇ／ｍｌ％以下、好ましくはビタミンＡを含まないＢ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは６０ｎｇ／ｍｌのＴ３（シグマアルドリッチ社製）、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ（ぺプロテック社製）、１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ぺプロテック社製）、１０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子１（Ｒ＆Ｄ システムズ社製）、及び、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３）（Ｒ＆Ｄ システムズ社製）を添加した培地が挙げられる。
本明細書において、ＳＨＨシグナル伝達活性化剤とは、ＳＨＨ（Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ；ソニック・ヘッジホッグ）が受容体であるＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ１）に結合して引き起こされるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の脱抑制及びさらに続くＧｌｉ２の活性化を引き起こす物質として定義される。ＳＨＨシグナル伝達活性化剤として例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質、具体的にはＳＨＨ若しくはＩＨＨ（Ｉｎｄｉａｎ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ；インディアン・ヘッジホッグ）、又はＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ（Ｓｈｈ－Ｎ）、リコンビナントＨｕｍａｎ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｃ２４ＩＩ）Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕs（ＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩ）、及びリコンビナントＭｏｕｓｅ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｃ２５ＩＩ）Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎｕs（ＳＨＨ－Ｃ２５ＩＩ）等のＳＨＨ若しくはＩＨＨの部分ペプチド、ＳＨＨ受容体、ＳＨＨ受容体アゴニスト、Ｈｈ－Ａｇ１．５（Ｌｉ、Ｘ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３、２１５～２２１（２００５）．）、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ（ＳＡＧ）、［Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ；Ｎ－メチル－Ｎ’－（３－ピリジニルベンジル）－Ｎ’－（３－クロロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボニル）－１，４－ジアミノシクロヘキサン）］、２０ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（ＰＭＡ；９－シクロヘキシル－Ｎ－［４－（４－モルホリニル）フェニル］－２－（１－ナグタレニルオキシ）－９Ｈ－プリン－６－アミン）並びにこれらの誘導体等が例示される（Ｓｔａｎｔｏｎ ＢＺら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ．６：４４－５４、２０１０）。
（３）の工程におけるＳＨＨシグナル伝達活性化剤として、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧ、ＳＨＨタンパク質及びＳＨＨ断片（例えばＳＨＨ Ｃ２５ＩＩ又はＳＨＨ Ｃ２４ＩＩ）からなる群から選択される１以上であってよく、好ましくは、ＳＨＨタンパク質、ＳＨＨ断片、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧからなる群から選択される１以上である。
培地中におけるＳＨＨシグナル伝達活性化剤の濃度は、ＳＨＨにより媒介されるシグナル伝達を亢進可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅの濃度は、領域特異性の腹側化作用を示す限り限定はないが、例えば、１０ｎＭ～１０μＭ、好ましくは１００ｎＭ～１０μＭ、更に好ましくは５００ｎＭ～５μＭである。他のＳＨＨシグナル伝達活性化剤の場合、前述の濃度のＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅに相当する、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の脱抑制作用及びさらに続くＧｌｉ２の活性化作用を引き起こす、又は領域特異性の腹側化作用を示す濃度を、適宜設定することができる。
（３）の工程において使用される培地として具体的には、胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地に、１μＭ レチノイン酸（シグマアルドリッチ社製）及び１μＭ Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（ミリポア社製）を添加した培地を挙げられる。
（２）の工程の終了時に、（２）で得られたすべての細胞凝集体を回収し、必要に応じて、（３）の工程で用いられる培地、その他の培地（例えばＤＭＥＭ／Ｆ－１２が挙げられるがそれに限定されない）又はリン酸緩衝液等で回収した細胞凝集体を洗浄したのち、（３）の工程で用いられる培地に懸濁することによって、（３）の工程を開始することができる。或いは、細胞凝集体を保護する観点から、急激な培養環境の変化を避けて半量程度の培地を交換することもでき、この作業を複数回繰り返すことによって、半量以上の培地を交換することもできる。（３）の工程において使用する培養容器は浮遊培養用の培養器材であれば特に限定されず、当業者に汎用されているフラスコ、プレートを適宜用いることができる。例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖ、９６スリットウェルプレート及びＵｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）等が挙げられる。
（３）の工程における浮遊培養は、凡そ４日間～１１日間、好ましくは凡そ４日間～７日間、より好ましくは凡そ７日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。培養期間中、適宜数日に１回（例えば３日若しくは４日に１回）全量若しくは一部培地交換を行ってもよい。
細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することができ、例えば細胞を採取して発現する分化マーカーのｍＲＮＡ量若しくはタンパク質量を測定することができる。または、培養上清を採取し、細胞から培地中に分泌される分化マーカーのタンパク質量を測定してもよい。（３）の工程においては、例えば、ＨＥＹ２、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．２、ＯＬＩＧ１及びＯＬＩＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーのＲＮＡ若しくはタンパク質の発現量によって培養期間を決めることができる。具体的には、（３）の工程開始時に比べ、
１）ＨＥＹ２、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ２．２のうち、少なくとも１つの発現量がＲＮＡレベルで５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＯＬＩＧ１及び／又はＯＬＩＧ２の発現量がＲＮＡレベルで１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまでの期間、（３）の工程を持続してから、（４）の工程を開始してもよい。当該ＲＮＡの発現量の評価方法は、（１）の工程で述べたとおりである。
（３）の工程における浮遊培養の培養条件は特に限定されないが、例えば、３５℃～３７℃、好ましくは３７℃の温度、９０％～９５％、好ましくは９５％の湿度、３％～５％、好ましくは５％のＣＯ２濃度、１０％～２０％、好ましくは２０％のＯ２濃度の条件であればよい。
＜（４）の工程＞
（４）の工程において、（３）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含まず、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する。神経・グリア増殖用培地及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤は上述のとおりである。
（４）の工程において、（３）の工程の終了時に、（３）の工程で得られた細胞凝集体を（４）の工程の培地に培地交換して細胞凝集体のまま浮遊培養してもよいが、（４）の工程に使用する培地中で生存、増殖できない細胞を目的外細胞として取り除き、目的とするオリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞の含有率を向上させるため（３）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させてもよい。
「細胞凝集体を分散させる」とは、細胞凝集体を形成する細胞を一細胞単位（単一細胞）に解離させるか或いは、複数の細胞同士が接合したままの状態を維持しながら、もとの細胞凝集体の形状を崩壊させることを意味する。分散させる方法として、物理的な刺激手法、化合物を用いた手法が挙げられるが、いずれか又は両方の手法を組み合わせて用いることにより、細胞凝集体を崩壊させることができる。すなわち、元の細胞凝集体は約１０００個～１０万個、好ましくは約３０００個～５万個であり、より好ましくは約１０００個～５万個、更により好ましくは約３０００個～３万個の細胞を含んでいるが、細胞凝集体を分散させた後は、複数の細胞同士が接合して小さな細胞の塊を形成している状態であっても、当該塊に含まれる細胞数は１００個以下程度であるが、好ましくは、解離前の細胞凝集体に対して、９０％以上の細胞が単一の状態になるまで分散させることが更に好ましい。
具体的には、トリプシン様酵素（例えばトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標））、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）、又は金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等）を用いて、細胞同士の接着を解離させ、さらにピペットマンを用いて物理的刺激を与えることにより、効果的に細胞凝集体を分散させることができる。更に細胞を単一細胞にまで分散させるための方法として、セルストレーナーに通す、という手技を利用することができる。本発明の実施のために、分散させた細胞凝集体を集合させ、再度細胞凝集体を形成させるためには、浮遊培養条件下で細胞を一定期間培養することにより達成されるが、より均一な大きさの細胞凝集塊を得るために前述のＳＦＥＢｑ法を用いることができる。
（４）の工程における浮遊培養は、凡そ４日間以上、好ましくは凡そ１０日間以上、より好ましくは凡そ１４日間以上、特により好ましくは凡そ１４日間～２１日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。
細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することができ、例えば細胞を採取して発現する分化マーカーのｍＲＮＡ量若しくはタンパク質量を測定することができる。または、培養上清を採取し、細胞から培地中に分泌される分化マーカーのタンパク質量を測定してもよい。（４）の工程においては、例えば、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＦＡＢＰ７及びＰＡＸ６からなる群より選択される１以上のマーカーのＲＮＡ若しくはタンパク質の発現量によって培養期間を決めることができる。具体的には、（４）の工程開始時に比べて
１）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ及びＦＡＢＰ７のうち、少なくとも１つの発現量がＲＮＡレベルで１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
２）ＰＡＸ６の発現量がＲＮＡレベルで５倍以下に低下した細胞凝集体が得られること
の少なくとも１つが充足されるまでの期間、（４）の工程を持続してから、（５）の工程を開始してもよい。当該ＲＮＡの発現量の評価方法は、（１）の工程で述べたとおりである。
例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート９６Ｖ、９６スリットウェルプレート及びＵｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）等が挙げられる。
（４）の工程において使用する培養容器は細胞培養用の浮遊培養用の培養器材であれば特に限定されず、当業者に汎用されているフラスコ、プレート及びディッシュを適宜用いることができる。例えばＮｕｎｃ（商標）ＥａｓＹＦｌａｓｋ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ （サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｕｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）、ＳＦＥＢｑ法において使用される複数の均一な形状の孔を有する培養容器等が挙げられる。
（４）の工程における浮遊培養の培養条件は特に限定されないが、例えば、３５℃～３７℃、好ましくは３７℃の温度、９０％～９５％、好ましくは９５％の湿度、２％～５％、好ましくは５％のＣＯ２濃度、１０％～２０％、好ましくは２０％のＯ２濃度の条件であればよい。
培養期間中に、凡そ２～７日に１回培地交換、又は凡そ２日～５日に１回培地交換、又は凡そ３～４日に１回培地交換を行ってもよく、当該培地交換は、培地の全量を交換してもよいし、細胞の環境が大きく変わることを避けるために、例えば１／３若しくは１／２程度の培地を交換してもよい。培地交換以外のタイミングで、培地に含まれる成長因子若しくは神経栄養因子等の成分を適宜補ってもよい。例えば、（４）の工程においては、ＰＤＧＦ－ＡＡの濃度（例えば１０ｎｇ／ｍｌ）が維持されるように、例えば２～３日に１回ＰＤＧＦ－ＡＡを添加することが好ましい。
（４）の工程で用いられる神経・グリア増殖用培地は、（３）の工程で神経・グリア増殖用培地を用いる場合、（４）の工程でも同じ組成の培地を神経・グリア増殖用培地として用いてもよいし、適宜成分を変更してもよい。
（４）の工程で用いられる神経・グリア増殖用培地は、５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡを含んでいることが好ましい。
＜（５）の工程＞
（５）の工程において、（４）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤を共に含まない神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する。神経・グリア増殖用培地は上述のとおりである。
（５）の工程において、（４）の工程の終了時に、（４）の工程で得られた細胞凝集体を（５）の工程の培地に培地交換して細胞凝集体のまま浮遊培養してもよいが、（５）の工程に使用する培地中で生存、増殖できない細胞を目的外細胞として取り除き、目的とするオリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞の含有率を向上させるため（４）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させてもよい。具体的な方法は、工程（４）と同様である。
（５）の工程における浮遊培養は、分化が進み過ぎず、かつ細胞凝集体が大きくなり過ぎない条件で適宜培地交換及び継代を行いながら培養する限り、その期間に特に限定はなく培養を続けることができる。（５）の工程の培養は、凡そ５日間～１００日間、好ましくは凡そ５日間～２０日間又は７日間～５０日間、より好ましくは凡そ７日間～３５日間、更に好ましくは７日間～２８日間、最も好ましくは１４日間～２８日間行ってもよい。（５）の工程において、培養期間中、細胞数や培地量に合わせて、適宜数日に１回、例えば、７日以内に１回、凡そ２～７日に１回、又は凡そ２日～５日に１回、又は凡そ３～４日に１回培地交換を行ってもよく、当該培地交換は、培地の全量を交換してもよいし、細胞の環境が大きく変わることを避けるために、例えば１／３若しくは１／２程度の培地を交換してもよい。継代回数は制限されず、例えば０回～５回継代してもよい。例えば、（５）の工程を開始して、１４日間培養し、その時点で工程を終了することもできるが、さらに、１回継代を行い、その後、８日間又は１４日間培養を継続してから、工程を終了することもできる。
細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することができ、例えば細胞を採取して発現又は存在する分化マーカーの量を測定することができる。分化マーカーとしては、少なくとも、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質、糖、脂質等が挙げられる。または、培養上清を採取し、細胞から培地中に分泌される分化マーカーの量を測定してもよい。
（５）の工程においては、例えば、Ｏ４抗原、ＮＧ２、ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ａ２Ｂ５）抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰからなる群より選択される１以上のマーカーの発現量又は存在量によって培養期間を決めることができる。
（５）の工程で用いられる神経・グリア増殖用培地としては、レチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤を共に含まない限り、（４）の工程と同じ組成の培地を用いてもよいし、適宜成分を変更してもよい。
（５）の工程において使用する培養容器は細胞培養用の器材であれば特に限定されず、当業者に汎用されているフラスコ、プレートを適宜用いることができる。例えばＮｕｎｃ（商標）ＥａｓＹＦｌａｓｋ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ （サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｕｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）、９６穴ウェルプレート、９６穴スリットウェルプレート等が挙げられる。（５）の工程における浮遊培養の培養条件は特に限定されないが、例えば、３７℃の温度、９５％の湿度、５％のＣＯ２濃度、２０％のＯ２濃度の条件であればよい。培養期間中に、凡そ７日に１回培地交換、凡そ３～４日に１回ＰＤＧＦ－ＡＡ（例えば１０ｎｇ／ｍｌ）を添加することが好ましい。
（５）の工程後に得られるグリア前駆細胞を含む細胞凝集体（本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体）は、以下の特徴を有する：
（ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
（ｂ）脊髄領域マーカーを発現していること、及び
（ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の成分を含まないこと。
（５）の工程において、上記（ａ）の特徴を有する細胞が得られていることを確認する目的で、細胞凝集体が、Ｏ４抗原、ＮＧ２、ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰから選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを確認するまで（５）の工程を持続することができる。
さらに、（５）の工程において、上記（ｂ）の特徴を有する細胞が得られていることを確認する目的で、細胞凝集体が、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８からなる群より選択される１以上好ましくは２以上のマーカーを発現していることを確認するまで（５）の工程を持続することができる。
さらに、（５）の工程において、細胞凝集体を培養する培地中において、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される１以上のタンパク質が検出されるまで（５）の工程を持続することができる。
上記グリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、直径が約１００μｍ～８００μｍ、例えば、約１００μｍ～３００μｍ、約２００μｍ～４００μｍ、又は、約４００μｍ～６００μｍの球状である。該グリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、分化に適した培養を継続することにより、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞凝集体へと分化可能である。また、該グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を生体へ移植した場合には、生体内でオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へと分化可能である。
〔グリア前駆細胞を含む細胞凝集体〕
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の一態様としては、以下の特徴を有する：
（ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
（ｂ）脊髄領域マーカーを発現していること、
（ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の成分を含まないこと、及び
（ｄ）オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有すること。
（ａ）一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、細胞凝集体を構成する細胞として、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含む。
グリア前駆細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びアストロサイト前駆細胞を共に含む概念である。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｏ４抗原、ＮＧ２、ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰから選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを特徴とする。当該オリゴデンドロサイト前駆細胞は、好ましくは、少なくともＡ２Ｂ５抗原、Ｏ４抗原、ＯＬＩＧ２及びＦＡＭ１８１Ｂを発現している。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体におけるアストロサイト前駆細胞は、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４から選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを特徴とする。当該アストロサイト前駆細胞は、好ましくは、少なくともＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３及びＳＰＡＲＣＬ１を発現している。
上記アストロサイト前駆細胞において発現するマーカーのうち、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７及びＺＢＴＢ２０は、グリア前駆細胞に分類され、かつ完全なアストロ前駆細胞に分化していないもののアストロサイトへの分化誘導が運命付けられている、成熟度の浅いアストロサイト前駆細胞に発現するマーカーである。すなわち、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、当該成熟度の浅いアストロサイト前駆細胞を含むことを特徴とする。
従って、より好ましくは、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体においては、
１）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７及びＺＢＴＢ２０から選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを特徴とする成熟度の浅いアストロサイト前駆細胞、並びに
２）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４から選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを特徴とするアストロサイト前駆細胞が共に含まれる。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は神経前駆細胞とともに、更に比較的未熟な（分化度の低い）神経幹細胞を含む。当該神経幹細胞は、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＤＬＬ３及びＡＳＣＬ１から選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは４以上のマーカーを発現していることを特徴とする。当該神経幹細胞は、好ましくは、少なくともＳＯＸ１、ＡＳＣＬ１、ＮＥＳＴＩＮを発現している。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体における神経前駆細胞は、ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＥＬＡＶＬ３、ＮＴＲＫ２、ＧＲＩＡ２、ＰＴＰＲＯ及びＥＰＨＡ３からなる群より選択される１以上、好ましくは２以上、更に好ましくは５以上のマーカーを発現していることを特徴とする。当該神経前駆細胞は、好ましくは、少なくともＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ及びＥＬＡＶＬ３を発現している。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、細胞凝集体を構成する全細胞に対して、オリゴデンドロサイト前駆細胞を５％以上含み、好ましくは１０％～６０％、より好ましくは２０％～５０％、更に好ましくは２０％～４０％含むことが好ましい。また、アストロサイト前駆細胞を１０％以上含み、好ましくは１０％～８０％、より好ましくは１０％～５０％、更に好ましくは２０％～３０％含むことが好ましい。さらに、神経前駆細胞を１０％以上含み、好ましくは２０％～６０％、より好ましくは３０％～５０％含むことが好ましい。ここでオリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞は合計が１００％を超えることは無く、当該細胞凝集体に含まれる全細胞数の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上を占める。
ここでグリア前駆細胞を含む細胞凝集体におけるそれぞれの細胞種の割合は特に限定されないが、一態様として、アストロサイト前駆細胞又は神経前駆細胞の含有量が、オリゴデンドロサイト前駆細胞の含有量よりも大きい細胞凝集体が挙げられる。
細胞凝集体を構成する全細胞に対する各細胞の含有割合は、それぞれの細胞マーカーの発現によって特定することができる。例えば、ＦＡＣＳ、免疫染色、又はシングルセルＲＮＡ配列解析等、当業者に周知の手法により、一定範囲内に存在する全細胞に対する目的細胞の割合を、マーカーのｍＲＮＡ、タンパク質、又はそれらの断片を測定（検出若しくは定量）して算出した数値を用いて判断することが可能である。全細胞数は、例えば、核染色により計数することが可能であり、同じ範囲内に存在する目的細胞数は目的細胞特異的に発現するマーカーを発現する細胞数で計数することが可能となる。
（ｂ）一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、脊髄領域マーカーを発現しており、例えば、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８から選択される１以上、好ましくは２以上の脊髄領域マーカーをｍＲＮＡレベルで発現することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、腹側領域マーカーを発現しており、例えば、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１及びＮＫＸ６．２から選択される１以上、好ましくは２以上の腹側領域マーカーをｍＲＮＡレベルで発現することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８から選択される１以上、好ましくは２以上の脊髄領域マーカーをｍＲＮＡレベルで発現し、かつＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１及びＮＫＸ６．２から選択される１以上、好ましくは２以上の腹側領域マーカーを発現している細胞を含むことを特徴とする。
（ｃ）一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の成分を含まないこと、フィーダー細胞が異種動物由来の場合は異種細胞由来成分を含まないことを特徴とする。このような細胞凝集体は、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で培養することによって得ることができる。ここで、異種細胞由来成分は、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分を意味し、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体においては、ｉＰＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞以外の細胞、又はこれらの細胞特異的な成分が含まれない。尚、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体には、フィーダー細胞由来の成分、例えば異種のフィーダー細胞由来の成分のみならず、他の異種細胞由来の成分や異種由来成分（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）も含まない態様も含まれる。このような細胞凝集体は、上記フィーダー細胞非存在下条件に加えて、ゼノフリー培地を用いることによって得ることができる。
（ｄ）一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有する。本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体が当該能力を有することは、後述の成熟化培地中で後述の培養方法で５日間～６０日間、より具体的には１０日間培養したのち、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へ分化したかどうかを確認することができる。すなわち、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団への分化は、後述するマーカーの発現を検出することにより、同定することができる。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（Ｉ）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４から選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは５以上のマーカーを、好ましくはｍＲＮＡレベルで発現する細胞を含むことを特徴とする。
好ましくは、実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２及びＺＢＴＢ２０から選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは５以上のマーカーをｍＲＮＡレベルで発現することを特徴とし、かつＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４から選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは５以上のマーカーをｍＲＮＡレベルで発現する細胞を含むことを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＩＩ）ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰから選択される１以上、好ましくは２以上、さらに好ましくは５以上のマーカーを、好ましくはｍＲＮＡレベルで発現する細胞を含むことを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＩＩＩ）ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＥＬＡＶＬ３、ＮＴＲＫ２、ＧＲＩＡ２、ＰＴＰＲＯ及びＥＰＨＡ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むことを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＩＶ）ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＤＬＬ３及びＡＳＣＬ１からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むことを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（Ｖ）
（ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞；
（ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、並びに
（ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞
を含む細胞集団へ分化する能力を有する。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記培養を経て、少なくとも５％以上、好ましくは約５％～２０％のＯ４陽性細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記培養を経て、少なくとも１０％以上、好ましくは約１０％～５０％のＡＰＣ陽性細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記培養を経て、少なくとも１０％以上、好ましくは約１０％～４０％のＧＦＡＰ陽性細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記培養を経て、少なくとも１５％以上、好ましくは約１５％～５０％のβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ陽性細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記培養を経て、少なくとも１０％以上、好ましくは約１０％～３０％のＨｕ陽性細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＶＩ）Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２から選択される１以上のマーカーをｍＲＮＡレベルで発現することを特徴とする。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＶＩＩ）さらに、以下の（Ａ）～（Ｃ）の少なくとも１つの特徴を有する：
（Ａ）細胞凝集体を構成する全細胞に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは７０％～９０％、更により好ましくは７５％～８５％の細胞が、ＮＦＩＡを発現すること、
（Ｂ）細胞凝集体を構成する全細胞に対して１０％以上の、好ましくは２０％以上、更に好ましくは２０％～５０％、更により好ましくは２０％～４０％の細胞が、ＯＬＩＧ２を発現すること、並びに、
（Ｃ）細胞凝集体を構成する全細胞に対して２０％以上の、好ましくは３０％以上、更に好ましくは３０％～６０％、更により好ましくは３０％～５０％の細胞がＨＥＹ２、Ｃ１ＯＲＦ６１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＩＴＭ２Ｂ、ＬＨＦＰＬ３及びＭＬＣ１から選択される１以上のマーカーを発現すること。
ここで各マーカー陽性細胞の比率は、免疫染色により染色された細胞数の計測や、シングルセルレベルでの遺伝子発現解析により算出することができる。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＶＩＩＩ）多能性幹細胞を包含しない。多能性幹細胞を包含しないことは、ＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧのいずれもｍＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルで発現しないこと、又は発現量が低下していることを指標として確認することができる。具体的には、例えばＯＣＴ３／４の発現量がｉＰＳ細胞と比較して２００分の１以下に低下していること、及び／又はＮＡＮＯＧの発現量がｉＰＳ細胞と比較して４００分の１以下に低下していることを指標とすることができる。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（ＩＸ）ＰＡＸ６を発現しない程度まで分化していることを特徴とする。ここでＰＡＸ６がｍＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベルで発現しないこと、又は発現量が低下していることを指標として確認することができる。具体的には、例えばＰＡＸ６の発現量が工程（３）を開始するタイミング（例えば本願実施例における分化１４日目）に比べて工程（４）又は（５）を実施し移植用の細胞凝集体を回収するタイミング（例えば本願実施例における分化４９日目）で１０分の１以下に低下していることを指標とすることができる。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、（Ｘ）直径が約１００μｍ～８００μｍの球状の細胞凝集体であってよく、例えば、約１００μｍ～３００μｍ、約２００μｍ～４００μｍ、又は、約４００μｍ～６００μｍであってよい。細胞凝集体当たりの細胞数は、約１０００～１０００００個であってよく、好ましくは約３０００～５００００個であり、より好ましくは約３０００～３００００個である。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、上記（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）（ＩＸ）及び（Ｘ）の少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８又は全ての特徴を有する。
一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群より選択される１以上のマーカーを発現又は分泌する細胞、又は当該細胞凝集体の培養上清中に上記マーカーが検出される細胞を含む。一実施形態のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、及びＧＲＯ－αからなる群より選択される１以上のマーカーを発現又は分泌する細胞、又は当該細胞凝集体の培養上清中に上記マーカーが検出される細胞を含むことが好ましく、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ及びＨＧＦからなる群より選択される１以上のマーカーを発現又は分泌する細胞、又は当該細胞凝集体の培養上清中に上記マーカーが検出される細胞を含むことがより好ましい。
一実施態様において、ＳＰＡＲＣＬ１は、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．１ｎｇ以上、好ましくは１ｎｇ以上、より好ましくは１０ｎｇ以上検出される。一実施態様において、ＳＰＡＲＣＬ１は、細胞１０００個あたり０．１ｎｇ～１０００ｎｇ、好ましくは１ｎｇ～１０００ｎｇ、より好ましくは１０ｎｇ～６０ｎｇ検出される。
一実際態様において、ＭＩＦは、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．１ｐｇ以上、好ましくは０．２ｐｇ以上、より好ましくは０．５ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．１ｐｇ～１００ｐｇ、好ましくは０．１ｐｇ～１０ｐｇ、より好ましくは０．５ｐｇ～５ｐｇ検出される。
一実際態様において、ＭＣＰ－１は、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．１ｐｇ以上、好ましくは０．２ｐｇ以上、より好ましくは０．５ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．１ｐｇ～１００ｐｇ、好ましくは０．１ｐｇ～１０ｐｇ、より好ましくは０．５ｐｇ～８ｐｇ検出される。
一実際態様において、ＳＣＦは、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．００１ｐｇ以上、好ましくは０．０１ｐｇ以上、より好ましくは０．０２ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．００１ｐｇ～１０ｐｇ、好ましくは０．０１ｐｇ～１ｐｇ、より好ましくは０．０２ｐｇ～０．２ｐｇ検出される。
一実際態様において、Ｍ－ＣＳＦは、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．００１ｐｇ以上、好ましくは０．００５ｐｇ以上、より好ましくは０．０１ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．０００１ｐｇ～１０ｐｇ、好ましくは０．００１ｐｇ～１ｐｇ、より好ましくは０．００５ｐｇ～０．１ｐｇ検出される。
一実際態様において、ＨＧＦは、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．０００１ｐｇ以上、好ましくは０．００１ｐｇ以上、より好ましくは０．０１ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．０００１ｐｇ～１０ｐｇ、好ましくは０．００１ｐｇ～１ｐｇ、より好ましくは０．００５ｐｇ～０．５ｐｇ検出される。
一実際態様において、ＬＩＦは、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清に検出される場合は、例えば、４８時間培養した場合、細胞１０００個あたり０．０００１ｐｇ以上、好ましくは０．００１ｐｇ以上、より好ましくは０．０１ｐｇ以上検出される。一実施態様において、細胞１０００個あたり０．０００１ｐｇ～１０ｐｇ、好ましくは０．００１ｐｇ～１ｐｇ、より好ましくは０．００５ｐｇ～０．５ｐｇ検出される。
〔オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法〕
本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法の一態様としては、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を、成熟化培地を用いて５日間～６０日間培養することによって行われる。
「成熟化培地」とは、グリア細胞及び神経細胞が成熟化するための培地をいい、グリア細胞及び神経細胞の成熟化に必要な因子を含有する培地である。基礎となる培地（基礎培地）となるものは、神経系細胞が生存可能な培地であれば特に限定はなく、上述の神経・グリア増殖用培地と共通であってよい。基礎培地として、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２等の基礎培地にＮ２及び／又はＢ２７等の神経系細胞培養用のサプリメントを添加した培地が挙げられる。但し、神経・グリア増殖用培地に含まれる、主に細胞の増殖に寄与する増殖因子類：ＦＧＦ（例えばＦＧＦ２）、ＥＧＦ及びＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ－ＡＡ）は含まれないことが望ましい。
一方、成熟化培地は、グリア細胞への分化に寄与する、神経栄養因子、甲状腺ホルモン及び／又はサイトカインを含む。神経栄養因子としては、ＮＴ－３が挙げられる。甲状腺ホルモンとしては、Ｔ３が挙げられる。当該サイトカインとしてはＬＩＦが挙げられる。
成熟化培地として、例えば、Ｔ３、ＮＴ－３及びＬＩＦのうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、更に好ましくは全てを含む培地が使用できる。また、アストロサイトへの分化のために用いられる成熟化培地として、さらにＣＮＴＦを含む培地が使用できる。培地にこれらの因子を添加して使用してもよく、これらの因子が配合された培地を使用してもよい。成熟化培地中におけるＴ３の濃度は、５ｎｇ／ｍｌ以上であればよく、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。また、成熟化培地中におけるＮＴ－３の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ以上であればよく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌである。また、成熟化培地中におけるＬＩＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ以上であればよく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌである。さらに、成熟化培地中におけるＣＮＴＦの濃度は、５ｎｇ／ｍｌ以上であればよく、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌである。
オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法によって得られた、「オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団」（本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団）とは、細胞集団を構成する細胞にオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞の３種類の細胞を検出可能なレベルで含んでいる細胞集団であれば、それぞれの細胞種の含有割合は特に限定されない。上記細胞集団は、立体構造（スフェア状）を有する細胞凝集体であっても、二次の層状構造を有する細胞集団であってもよい。層状の細胞集団は、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を、マトリゲル等の細胞接着因子の存在下で接着培養することにより製造することができる。
各々の細胞を検出するためには、例えば、免疫組織学的手法及び（ＲＴ－ｑＰＣＲ及びＲＮＡシーケンス等の）遺伝子解析を用いることができる。遺伝子解析を用いる場合、本明細書実施例２に記載の方法に準じて、細胞凝集体に含まれるｍＲＮＡ及びその発現レベルを同定することができる。
得られた本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団は、出発細胞であるオリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含んでもよい。当該細胞集団は、好ましくは、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を全細胞数の５０％以上、更に好ましくは７０％以上含む。当該細胞集団は、オリゴデンドロサイトを２％以上含み、好ましくは５％～５０％、より好ましくは１０％～４０％含む。また、アストロサイトを１０％以上含み、好ましくは１０％～７０％、より好ましくは１０％～５０％含む。さらに、神経細胞を１０％以上含み、好ましくは２０％～６０％、より好ましくは３０％～５０％含む。ここでオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞は合計が１００％を超えることは無く、当該細胞凝集体に含まれる全細胞数の５０％以上、好ましくは７０％以上を占める。
本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団は、
（ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカー、好ましくは３以上のマーカー、更に好ましくは５以上のマーカー、更により好ましくは全てのマーカーを発現する細胞、
（ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカー、好ましくは２以上のマーカー、更に好ましくは全てのマーカーを発現する細胞、並びに
（ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカー、好ましくは２以上のマーカー、更に好ましくは３以上のマーカー、更により好ましくは全てのマーカーを発現する細胞を含む。
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養は、浮遊培養であってもよい。培養条件は特に限定されないが、例えば、３５℃～３７℃、好ましくは３７℃の温度、９０％～９５％、好ましくは９５％の湿度、３％～５％、好ましくは５％のＣＯ２濃度、１０％～２０％、好ましくは２０％のＯ２濃度の条件であればよい。培養容器は細胞培養用器材であれば特に限定されず、当業者に汎用されているフラスコやディッシュを用いることができる。例えばＮｕｎｃ（商標）ＥａｓＹＦｌａｓｋ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ （サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｕｌｔｒａ―Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋｓ（コーニング社製）等が挙げられる。
〔医薬組成物〕
本発明の一態様として、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、又は本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団、或いは当該細胞凝集体又は細胞集団由来の細胞を含む移植用細胞集団を有効成分とする、医薬組成物が挙げられる。本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法によって製造される。本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団は、本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法によって製造される。
当該有効成分の有効量は、投与目的、投与方法、及び投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば、細胞数として、１×１０４個～１×１０８個、１×１０５個～３×１０５個、１×１０６個～３×１０６個、又は１×１０７～３×１０７個とすることができる。
一実施形態の医薬組成物は、上記有効成分の有効量のほか、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。医薬組成物は、必要に応じて移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を含んでもよい。
移植用細胞凝集体又は移植用細胞集団を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して上記移植用細胞集団を凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いてもよい。
本発明の移植用細胞集団は、細胞凝集体を懸濁させた懸濁液であってもよいし、当該細胞凝集体を、細胞凝集体から細胞を分散させたりした懸濁液、シート剤であってもよい。
また、本発明の製造方法で得られた移植用細胞集団は、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法における（４）の工程を実施した後に、スキャフォールド上で培養を行うことによって、立体状に成型し、三次元組織である細胞組織構造体とすることもできる。
下記に記載するように、本発明の細胞を含む医薬組成物は、無血清で取得できることから、血清由来成分など治療上に問題となる成分を含むことなく、脊髄損傷モデル動物（例えばマウス）への投与において、損傷部位における損傷神経系の修復そして運動機能の回復という顕著な効果をもたらすものである。したがって、本発明の医薬組成物は、これまで有効な治療手段のなかった脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患、更に急性期、亜急性期又は慢性期脊髄損傷等の、急性期、亜急性期又は慢性期のグリア細胞の障害に基づく又は伴う疾患の治療薬として有用である。
しかも本明細書に記載するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体からなる移植用細胞集団は、株化された多能性幹細胞から製造され、マーカー等により特定され品質管理されることにより、安定した品質の移植用細胞集団を大量に製造し、移植に用いることができる。また、移植用細胞集団を保存することができるため、患者の移植の時期にあわせて移植用細胞集団を準備することができる。
「脱髄疾患」は、神経細胞の軸索の周囲に髄鞘を形成するミエリンの炎症や退縮を含む障害であれば特に限定されない。脱髄疾患としては、例えば、脊髄損傷や多発性硬化症、副腎白質ジストロフィー、白質消失疾患、ペリツェウス・メルツバッハー病（広義には先天性大脳白質形成不全症）及び白質ジストロフィーが挙げられる。上記脊髄損傷として、急性期骨髄損傷、亜急性期脊髄損傷又は慢性期の脊髄損傷が挙げられる。
「グリア細胞の障害を伴う疾患」（「グリア細胞に基づく疾患」ともいう）とは、グリア細胞すなわちアストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞及びミクログリアからなる群から選択される一又は複数の細胞種の障害を伴う疾患であれば特に限定されない。グリア細胞の障害を伴う疾患としては、具体的には、脊髄損傷、脳梗塞、統合失調症などの精神神経疾患、脱髄疾患、神経変性疾患が挙げられる。より具体的には、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｔｉｃａ）や筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アレキサンダー病、先天性大脳白質形成不全症、ハンチントン病、アルツハイマー病及び統合失調症、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、ウォラー変性、副腎白質ジストロフィー、黄斑円孔、脊髄小脳変性症、多系統萎縮症等の他の多数の神経障害及び神経変性状態等が挙げられる。これらの疾患のうち発症から一定期間が経過したものを、慢性期の脱髄疾患又は慢性期のグリア細胞の障害を伴う疾患と呼ぶ。例えば、脊髄損傷については、損傷後３か月から６か月経過すると損傷部には非常に固い瘢痕組織が形成され病態が固定化するケースが多く認められており、この病態を慢性期の脊髄損傷と呼ぶ。
グリア細胞の障害を伴う疾患において、グリア細胞を含む膜組織の損傷状態としては、例えは、オリゴデンドロサイト若しくはアストロサイト等のグリア細胞が変性死している状態等が挙げられる。
〔治療方法・治療薬〕
本発明の一態様として、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、又は本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団、或いは当該細胞凝集体又は当該細胞集団由来の細胞を含む移植用細胞集団の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく又は伴う疾患の治療方法が挙げられる。ここで、脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく又は伴う疾患が、慢性期の脱髄疾患及び慢性期のグリア細胞の障害に基づく又は伴う疾患であってもよい。なお、障害又は疾患の発症から一定期間が経過したもの、例えば慢性期脊髄損傷の場合損傷後３か月から６か月以上経過したものが慢性期と判定される。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、脱髄疾患、及びグリア細胞の障害を伴う疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の細胞凝集体、又は当該細胞凝集体から得られる細胞を含む移植用細胞集団を含む、脱髄疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患の治療薬を提供する。
また、本発明は当該治療薬を、細胞凝集体若しくはその懸濁液、分散された細胞の懸濁液や、フィブリン、ハイドロジェル等の生分解性バイオマテリアルとの懸濁液、及びそれらをスキャフォールドとして培養した細胞組織構造体の形態で患者に投与（移植）することを含む治療方法も提供する。脱髄疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患の治療薬として、又は、当該グリア細胞を含む組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の細胞凝集体（細胞集団）又は当該細胞凝集体（細胞集団）から得られる細胞を含む移植用細胞集団を用いることができる。
移植を必要とする、脱髄疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患、又はグリア細胞を含む組織の損傷状態の患者に、本発明の細胞凝集体又は当該細胞凝集体から得られる細胞を含む移植用細胞集団を移植し、又は、障害を受けたグリア細胞を含む組織自体を補充することによって、脱髄疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患、又はグリア細胞を含む組織の損傷状態を治療することができる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶反応がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。すなわち、本発明の好ましい一態様において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることによって、当該レシピエントについて免疫学的自己の細胞凝集体（細胞集団）を製造し、当該細胞凝集体（細胞集団）又は当該細胞凝集体（細胞集団）から得られる細胞を含む移植用細胞集団が当該レシピエントに移植される。
また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、ＨＬＡ型又はＭＨＣ型が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロ（他家）の細胞凝集体（細胞集団）を製造し、当該細胞凝集体（細胞集団）又は当該細胞凝集体（細胞集団）から得られる細胞を含む移植用細胞集団を当該レシピエントに移植してもよい。
また、組織適合性抗原（例えば、ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ、ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩを構成する抗原タンパク質）又は当該抗原の発現に必要な因子の発現が抑制されたｉＰＳ細胞を用いて本発明の細胞凝集体（細胞集団）を製造することによって、他家の細胞移植であっても拒絶反応を回避することができる。
本発明の治療方法において患者若しくはレシピエントに投与若しくは移植される治療薬として、前述の医薬組成物を使用することができる。
本発明の一態様として、脱髄疾患並びに、グリア細胞の障害に基づく疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患の治療における使用のための、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、又は本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の使用が挙げられる。
〔毒性・薬効評価方法〕
本発明の一態様として、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、又は本発明のオリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団に被験物質を接触させ、被検物質が該細胞凝集体又は該細胞集団に及ぼす影響を検出又は定量することを含む、被験物質の毒性又は薬効を評価するための方法が挙げられる。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、並びに、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団は、疾患のモデル細胞として、脱髄疾患並びに、グリア細胞の障害に基づく疾患及びグリア細胞の障害を伴う疾患（併せてグリア疾患ともいう）の治療薬、又はその予防薬のスクリーニング、薬効評価に利用することができる。
また、本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、並びに、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団は、健常のモデル細胞として、化学物質等の安全性試験、ストレス試験、毒性試験、副作用試験、感染又は混入試験に利用することができる。また、本発明の細胞凝集体又は細胞集団は、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞等のグリア前駆細胞、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト等を含むため、これらの細胞を含む神経組織（中枢神経系、脊髄、神経筋接合部）の機能試験、具体的には、セロトニン作動性神経や運動神経等の機能評価や、グリア及び神経前駆細胞の増殖能や分化能評価に利用することも可能である。
その評価方法としては、アポトーシス評価等の刺激・毒性試験のほか、化学物質が、グリア前駆細胞からグリア細胞への正常分化に及ぼす影響を評価する試験（各種遺伝子マーカーのＲＴ－ＰＣＲ、サイトカインのＥＬＩＳＡ等による発現タンパク質解析、貪食能試験）等が挙げられる。例えば、オリゴデンドロサイトへの分化能を促進する化合物の探索や、脱髄疾患やグリア疾患等の患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた細胞について、疾患特異的な表現型をレスキューさせるような化合物、タンパク質等の探索等に使用できる。
また、これらの試験の為の細胞材料としては、例えば、本発明の細胞凝集体の細胞を分散し、播種接着したプレート、細胞懸濁液、そのシート又は成形体を提供することができる。
本発明のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体、並びに、オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団、或いはこれらから分散される細胞は、ヒト及び動物試験の外挿試験として用いることができる。
〔グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を評価・判別するための新規マーカー〕
本発明の一態様として、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカーが発現しているか否かを指標として、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が移植に適していることを判別する方法が挙げられる。
本発明の判別方法は、Ｃ１ＯＲＦ６１又はＳＥＲＰＩＮＥ２の発現の有無は、これらのマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はこれらの断片を検出することにより実施することができる。すなわち、一態様として、本発明の判別方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞凝集体サンプルに発現する、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカー由来のタンパク質又はその断片を検出する工程；
（２）上記マーカー由来のタンパク質又はその断片の発現量が、基準値よりも大きい場合に、当該細胞凝集体サンプルが、移植に適するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体であると決定する工程。
また、一態様として、本発明の判別方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞凝集体サンプルに発現する、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカー由来のｍＲＮＡ又はその断片を検出する工程；
（２）上記マーカー由来のｍＲＮＡ又はその断片の発現量が、基準値よりも大きい場合に、当該細胞凝集体サンプルが、移植に適するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体であると決定する工程。
本発明の一態様として、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上の遺伝子、当該遺伝子によりコードされるタンパク質、及びこれらの断片を検出することを含む、グリア前駆細胞若しくはグリアへの分化指向性が高い神経幹細胞の同定方法が挙げられる。ここで「グリアへの分化指向性が高い」とは、成熟化培地にて終末分化を誘導すると、グリアに分化する割合が高い（例えば３０％以上）神経幹細胞の性質を表す。
本発明の同定方法は、Ｃ１ＯＲＦ６１又はＳＥＲＰＩＮＥ２の発現の有無は、これらのマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、又はこれらの断片を検出することにより実施することができる。すなわち、一態様として、本発明の同定方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞集団サンプルに発現する、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカー由来のタンパク質又はその断片を検出する工程；
（２）上記マーカー由来のタンパク質又断片の発現量が、基準値よりも大きい場合に、当該細胞集団サンプルが、グリアへの分化指向性が高いグリア前駆細胞若しくは神経幹細胞であると同定する工程。
また、一態様として、本発明の同定方法は、以下の工程を含む：
（１）細胞集団サンプルに発現する、Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１以上のマーカー由来のｍＲＮＡ又はその断片を検出する工程；
（２）上記マーカー由来のｍＲＮＡ又はその断片の発現量が、基準値よりも大きい場合に、当該細胞集団サンプルが、グリアへの分化指向性が高いグリア前駆細胞若しくは神経幹細胞であると決定する工程。
下記の表１は、本明細書に記載の遺伝子及びそのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を示す。


以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
＜実施例１ 細胞凝集体の製造＞
ｉＰＳ細胞株として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所にて樹立された臨床グレード末梢血由来フィーダーフリーｉＰＳ細胞株であるＱＨＪＩ０１ｓ０４株を用いた。分化前に、ラミニン５１１Ｅ８断片（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１Ｅ８；ニッピ社製）（０．５ｍｇ／ｍｌ）が添加されたＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素社製）中で維持培養された。
ｉＰＳ細胞を神経前駆細胞に分化誘導するため、胚様体形成に無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）を使用した。具体的に、維持培養されたＱＨＪＩ０１ｓ０４株を、０．５×ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）／０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）／ＰＢＳ（リン酸生理食塩水、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で単一細胞に分離し、９６ウェル低接着性プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ、住友ベークライト社製）上に、９０００細胞／ウェルで播種し、播種日を分化０日として５％ＣＯ２／５％Ｏ２下に３７℃で誘導を開始した。表２に示す各因子を添加した胚様体形成培地（ＡＫ０３Ｎ－Ｃ培地）を用い、毎日半量培地交換を行った。
分化１４日目に胚様体を９６ウェルプレートから回収し、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（商品名：Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２、富士フィルム和光純薬社製）にて１度洗浄した。その後、分化１４日目から２１日目までに表３に示す１、２、３及び４の条件にて、低接着性フラスコ（商品名：Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ７５ｃｍ２ Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ Ｃａｎｔｅｄ Ｎｅｃｋ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋ ｗｉｔｈ Ｖｅｎｔ Ｃａｐ 、コーニング社製）にて、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２下に３７℃で、３日に１回培地交換を行い７日間培養した。
表３中の神経・グリア増殖用培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（３．１５１ｇ／Ｌ グルコース、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム含有、富士フィルム和光純薬社製）に、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、６０ｎｇ／ｍｌ Ｔ３（３，３’，５－トリヨード－Ｌ－チロニン ナトリウム塩、シグマアルドリッチ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ、ぺプロテック社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－１ （Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ－３ （Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３、ぺプロテック社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ぺプロテック社製）、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２ （Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２、ぺプロテック社製）を添加した培地を用いた。
分化２１日目に胚様体を回収し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞へ分散させた後に１μＭＰＭを含む神経・グリア増殖用培地で組織培養用フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて７日に１回培地交換を行い、浮遊培養を行った（継代数１）。１４日後、分化３５日目の時点で再び単一細胞へ分散させた後に神経・グリア増殖用培地で浮遊培養を行った（継代数２）。分化３５日目と４９日目での明視野像を図１Ａに示す。
また、分化４９日目で得られた細胞凝集体について終末分化能を確認するため、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２にて希釈した１％マトリゲル基底膜マトリックス グロースファクター リデュースト（コーニング社製）処理をした８ウェルチャンバースライドガラス（イワキ社製）に細胞凝集体の状態で播種し、マトリゲル上に接着させて、成熟化培地にて１４日間培養し、終末分化させた。成熟化培地として、ＫＢＭ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（コージンバイオ社製）に、Ｂ２７サプリメント、１％非必須アミノ酸（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、６０ｎｇ／ｍｌ Ｔ３、１０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ－３、２５ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦを添加した培地を用いた。
終末分化１４日目（分化６３日目）の細胞を用いて、各マーカーに対して蛍光免疫染色を行った。蛍光免疫染色は、６種類の１次抗体及びそれらに対応する蛍光標識された２次抗体を使用した。１次抗体は表４に示すように３種類ずつ混合して、ブロッキング液で希釈して２種類の１次抗体液（１次抗体液１及び１次抗体液２）を調製した。２次抗体も同様に表４に示すように３種類ずつ混合して、さらに核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（希釈倍率１：１０００、同仁化学社製）も加えて、ブロッキング液で希釈して２種類の２次抗体液（２次抗体液１及び２次抗体液２）を調製した。
蛍光免疫染色は、終末分化１４日目（分化６３日目）に、条件１、２、３及び４で得られたそれぞれの細胞を４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ、富士フィルム和光純薬社製）にて室温で２５分間固定し、ＰＢＳで３度洗浄した後に、１０％ヤギ血清（富士フィルム和光純薬社製）／ＰＢＳをブロッキング液として室温で１時間インキュベートした。その後、上記表４に示す１次抗体液（１次抗体液１又は１次抗体液２）を添加し、４℃で１晩インキュベートし、共染色を行った。その後、ＰＢＳで３度洗浄し、更に１次抗体液に対応した２次抗体液（２次抗体液１又は２次抗体液２）を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３度洗浄し、４℃で保存した。
顕微鏡観察及び画像取得は、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）を用いて行われた。蛍光免疫染像を図１Ｂに示す。なお、Ｍｅｒｇｅは３種類の蛍光を重ねた画像である。条件１、２、３及び４のいずれの条件でもニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトが検出されたが、条件１では終末分化１４日目の時点でＯ４陽性細胞の形態が未熟であること、ＧａｌＣ陽性細胞が検出されなかったことから成熟が遅いこと、条件２ではＧＦＡＰ非陽性細胞集団が検出されたことから、条件３又は４が最も良い条件であることが明らかとなった。
以上の検討から、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法を確立した（図２）。なお、図２中、胚様体形成培地はＡＫ０３Ｎ－Ｃ培地であり、神経・グリア増殖用培地は上記の神経・グリア増殖用培地であり、化合物のＳはＳＢ４３１５４２を、ＬはＬＤＮ１９３１８９を、ＣはＣＨＩＲ９９０２１を、ＹはＹ－２７６３２を、ＲＡはレチノイン酸を、ＰＭはパルモルファミンをそれぞれ表す。
＜実施例２ 細胞凝集体の特性評価１（分化誘導過程での遺伝子発現変化）＞
分化誘導過程での遺伝子発現変化を検討するため、分化誘導の中間産物についてＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによる遺伝子発現解析を実施した。ＱＨＪＩ０１ｓ０４株を用いて実施例１の条件３の方法で分化誘導を開始し、分化前（ｉＰＳ細胞株）、分化７日目、１４日目、２１日目、３５日目の細胞からＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてライブラリーを作成し、ＨｉＳｅｑ ２５００を用いて８０サイクルのシーケンスを行った。１細胞あたり３０００万リード以上のデータにて遺伝子発現解析を行った（図３Ａ～３Ｄ）。
分化誘導前（ｉＰＳ細胞）と分化７日目の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、分化７日目の時点で多能性マーカーであるＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）の発現量は顕著に低下しており、また、分化７日目では神経幹細胞マーカーであるＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＨＥＳ４及びＨＥＳ５の発現量は顕著に上昇した（図３Ａ）。分化７日目と分化１４日目の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、分化１４日目で分化７日目に比較して遺伝子発現が上昇する遺伝子として、ＡＳＣＬ１、ＨＥＹ１、ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ（ＴＵＢＢ３）、ＥＬＡＶＬ３、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＩＴ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ８等が挙げられた（図３Ｂ）。また、分化１４日目と分化２１日目の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、分化２１日目の時点で分化１４日目に比較して遺伝子発現が上昇する遺伝子としてＨＥＹ２、ＮＫＸ６．２、ＮＫＸ２．２、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２等が挙げられた（図３Ｃ）。分化２１日目と分化３５日目の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、分化３５日目の時点で分化２１日目に比較して発現量が上昇する遺伝子として、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＦＡＢＰ７が挙げられた（図３Ｄ）。また、ＰＡＸ６の発現量が顕著に低下した（図３Ａ）。
＜実施例３ 細胞凝集体の特性評価２（細胞凝集体の蛍光免疫染色）＞
ｉＰＳ細胞株として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所にて樹立された臍帯血由来フィーダーフリーｉＰＳ細胞株であるＦｆ－ＷＪ１４ｓ０１株を用いて、実施例１の条件３の方法でグリア前駆細胞を含む細胞凝集体を作製し、各分化マーカーに対する蛍光免疫染色を実施した。蛍光免疫染色は、８種類の１次抗体及びそれらに対応する蛍光標識された２次抗体を使用した。１次抗体は表５に示すように２又は３種類ずつ混合して、ブロッキング液で希釈して３種類の１次抗体液（１次抗体液１、１次抗体液２、１次抗体液３）を調製した。２次抗体も同様に表５に示すように２又は３種類ずつ混合して、さらに核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（希釈倍率１：１０００、同仁化学社製）も加えて、ブロッキング液で希釈して３種類の２次抗体液（２次抗体液１、２次抗体液２、２次抗体液３）を調製した。
分化７７日目の時点で細胞凝集体を４％ＰＦＡにて室温で２０分間固定し、ＰＢＳで３度洗浄した。固定後の細胞をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン社製）を用いてドライアイス上で凍結包埋を行い、１０μｍ厚の凍結切片を作製し、－８０℃にて保管した。凍結切片を１度ＰＢＳで洗浄後、１０％ヤギ血清（富士フィルム和光純薬社製）／ＰＢＳをブロッキング液として室温で１時間インキュベートした。その後、上記表５に示す１次抗体液（１次抗体液１、１次抗体液２又は１次抗体液３）を添加し、４℃で１晩インキュベートし、共染色を行った。その後、ＰＢＳで３度洗浄し、更に１次抗体液に対応した２次抗体液（２次抗体液１又は２次抗体液２又は２次抗体液３）を添加し、室温で１時間インキュベートした。マウント剤パーマフロー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でマウント後に４℃で保存した。
顕微鏡観察及び画像取得は、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）を用いて行われた。蛍光免疫染色像を図４Ａに示す。ＧＦＡＰ陽性細胞、ＮＥＳＴＩＮ陽性細胞、Ｔｕｊ１陽性細胞、ＯＬＩＧ２陽性細胞、ＥＬＡＶＬ３陽性細胞、ＭＡＰ２陽性細胞、ＮＦＩＡ陽性細胞が認められた。また、１スフェア（細胞凝集体）を構成する全細胞数当たりのＯＬＩＧ２陽性細胞及びＮＦＩＡ陽性細胞の割合をＢＺ－Ｘ７１０付属の解析ソフト（ＢＺ－Ｈ３Ｃ）にて定量し、６スフェアの平均を算出した。その結果、ＯＬＩＧ２陽性細胞が３０．９±６．６％、ＮＦＩＡ陽性細胞が８７．６±１．８％の割合で存在した（図４Ｂ）。
＜実施例４ 細胞凝集体の特性評価３（シングルセル遺伝子発現解析）＞
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体に特徴的な遺伝子を探索した。実施例１の条件３の方法でＦｆ－ＷＪ１４ｓ０１株から作製したグリア前駆細胞を含む細胞凝集体（Ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ）と、非特許文献２の方法でＦｆ－ＷＪ１４ｓ０１株から作製した神経への分化指向性が高い細胞を多く含む細胞凝集体（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ）について「Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ｖｏｌｕｍｅ ９， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ６１９ （２０１８）」に記載の方法でシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲａｍＤＡ－ｓｅｑ）を行った。ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ ２５００を用いて、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｅｎｄモードにて５０サイクルのシーケンスを行った。品質評価をクリアしたＧｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ：１５０個、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ：９１個（計２４１個）について遺伝子発現解析を行った。
遺伝子発現プロファイルから、２４１個の細胞は３つのクラスター（Ｃ１～Ｃ３）に分類された。解析されたＮｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ全細胞数の９１．２％はＣ１に、８．８％はＣ３に分類され、Ｃ２には分類されなかった。一方、解析されたＧｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣ全細胞数の５．３％はＣ１に、５８．０％はＣ２に、３６．７％はＣ３に分類された（図５）。よって、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣとＧｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣでは遺伝子発現プロファイルが大きく異なることが示唆された。
各クラスターにおいて特徴的に発現する遺伝子（上位１０個）を表６に示す。Ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣのみが分類されたＣ２に属する細胞で高発現する遺伝子として、ＨＥＹ２、Ｃ１ＯＲＦ６１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＮＦＩＢ、ＩＴＭ２Ｂ、ＮＦＩＡ、ＬＨＦＰＬ３、ＭＬＣ１が見出された（表６、図６Ａ、図６Ｂ）。また、その他、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣに比べてＧｌｉｏｇｅｎｉｃ ＮＰＣにて発現が高い遺伝子として、ＡＳＣＬ１、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＤＬＬ３、ＨＥＹ１、ＺＢＴＢ２０、ＳＯＸ９、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＳＬＩＴ１、ＳＰＡＲＣＬ１、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４、ＳＰＯＮ１、ＫＬＦ９、ＧＲＩＫ３、ＳＯＸ６、ＥＰＨＡ３、ＮＴＲＫ２、ＧＲＩＡ２、ＰＴＰＲＯ、ＫＣＮＤ３、ＳＥＲＰＩＮＥ２が見出された（図６Ａ、図６Ｂ）。なお、表６に記載の遺伝子の一部のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、表１に示す。また、ＬＯＣ５４１４７１は、Oncol Lett. 2019 Feb; 17(2): 2457-2464に記載されている。
＜実施例５ 細胞凝集体の特性評価４（終末分化能評価）＞
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体について、終末分化後にニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの３系統に分化するかを蛍光免疫染色により検討した。実施例１の条件３の方法で作製したＦｆ－ＷＪ１４ｓ０１株由来のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体（分化７７日目）について、実施例１に記載の方法で成熟化培地を用いて終末分化誘導を行った。終末分化３１日後（分化１０８日目）に細胞を実施例１に記載の方法で４％ＰＦＡにて室温で２５分間固定し、ＰＢＳで３度洗浄した後に蛍光免疫染色を行った。顕微鏡観察及び画像取得は、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）、及び共焦点蛍光顕微鏡ＬＳＭ８８０（ツァイス社製）を用いて行われた。その結果、Ｔｕｊ１及びＭＡＰ２陽性ニューロン、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト、Ｏ４陽性、ＧａｌＣ陽性及びＭＢＰ陽性オリゴデンドロサイトが検出された。よって、３系統への分化能が確認された（図７Ａ）。また、各陽性細胞率を、Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒの解析ソフトＤｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて定量した。その結果、陽性細胞率はＯ４陽性細胞が１０％程度、ＧＦＡＰ陽性細胞が３０％程度、Ｔｕｊ１陽性細胞が３０％程度であった（図７Ｂ）。
＜実施例６ 細胞凝集体の特性評価５（終末分化前後の遺伝子発現変化＞
グリア前駆細胞を含む細胞凝集体について、終末分化前後での各分化細胞マーカーの遺伝子発現レベルを解析した。実施例１の条件３の方法でＱＨＪＩ０１ｓ０４株から作製したグリア前駆細胞を含む細胞凝集体（分化４８日目）について、実施例１に記載の方法で成熟化培地を用いて終末分化誘導を行った。終末分化前（分化４８日目）と終末分化３４日後（分化８２日目）の細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡについて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。その後、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲ法でＧＦＡＰ、ＣＳＰＧ４（ＮＧ２）、ＯＬＩＧ２、ＰＬＰ１（ＰＬＰ）、ＰＤＧＦＲＡ（ＰＤＧＦＲα）、ＳＯＸ１０、ＣＮＰ、ＭＢＰ、ＴＵＢＢ３（βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）、ＭＡＰ２の発現量をＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定した。なお、内在性コントロールとしてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。
標的遺伝子の増幅反応に使用したプライマーのセットを表７に示す。結果を図８に示す。終末分化後の発現量が終末分化前の発現量（１とする）に対する相対発現量になるように示した。終末分化後の細胞ではアストロサイトマーカー及びオリゴデンドロサイトマーカーの発現量が上昇したことから、成熟化培地による終末分化誘導により、成熟したアストロサイト及びオリゴデンドロサイトへ分化したことが示唆された。神経マーカーであるβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎとＭＡＰ２の遺伝子発現量は終末分化前後でほとんど変わらなかったが、実施例３にて検討した細胞凝集体の蛍光免疫染色の結果からも、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体は、終末分化前の細胞凝集体の時点からβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ及びＭＡＰ２を発現しており、終末分化後も発現が維持されると考えられた。
＜実施例７ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の移植実験＞
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ・Ｊ）マウス（チャールズ リバー ラボラトリーズ社）は慶應義塾大学及びＮＩＨの動物実験ガイドラインに従って取り扱われた。動物実験計画は、慶應義塾大学内の動物実験委員会にて承認された。８週齢のメスＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与により麻酔をかけた。「Ｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ２０， １７９－１９３（２００３）」に記載の方法で、第１０胸椎レベルにＩＨ ｉｍｐａｃｔｏｒ（６０－７０ｋｄｙｎ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社製）で圧挫損傷を加え、直後にアンピシリン（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射した。損傷を加えて７日後に、「Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ， ２３： ６３５－５９（２００６）」に記載の方法でＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）を用いて後肢運動機能を評価した。損傷後７日の時点でＢＭＳが２．５以上に自然回復している個体は、細胞移植効果が測定できないことから除外し、２群（対照群１２匹と細胞移植群１４匹）に分け、各群のＢＭＳ平均が同じになるように群分けをした。
損傷後９日目（亜急性期）に、定位固定インジェクションシステム（室町機械社製）を用いて、２８Ｇのメタルニードルにて細胞移植群には細胞懸濁液を、対照群にはＰＢＳを２μｌ損傷中心部に移植した。細胞はＦｆ－ＷＪ１４ｓ０１株由来のグリア前駆細胞を含む細胞凝集体（５．０×１０５細胞）を２μｌのＰＢＳ中に集めた状態で移植に用いた。移植後１２週間まで各種運動機能評価を実施した。また、移植後１２週間の時点で深麻酔の下、４％ＰＦＡを心臓内に灌流することによって脊髄を固定し、４℃保管を行った。その後、固定した脊髄を３０％スクロース／ＰＢＳ中で４℃保管した後にＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドを用いて凍結包埋を行い、矢状（１４μｍ厚）及び横断（１６μｍ厚）切片を作製し、－８０℃にて保管した。組織染色は、組織像観察のためにヘマトキシリンーエオシン（ＨＥ）染色、及び髄鞘組織染色のためにルクソールファストブルー（ＬＦＢ）染色を行った。
また、より詳細な組織評価のために蛍光免疫染色を行った。ＰＢＳで３度洗浄した後に０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有するブロッキングワン（ナカライテスク社製）をブロッキング液として室温で１時間インキュベートした。その後、１次抗体をブロッキング液で希釈した１次抗体液を調製し、４℃で１晩インキュベートした。本実施例で使用した１次抗体は、ヒト抗Ｈｕ抗体（希釈倍率：１：１０００、ロックフェラー大 Ｄｒ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｄａｒｎｅｌｌより提供）、マウス抗ＧＦＡＰ抗体（希釈倍率１：５０００、アブカム社製）、マウス抗ＡＰＣ抗体（希釈倍率１：３００、アブカム社製）、ラビット抗ヒト特異的ＮＥＳＴＩＮ抗体（希釈倍率１：２００、ＩＢＬ社製）、ラビット抗Ｋｉ６７抗体（希釈倍率１：１０００、ライカバイオシステムズ社製）、マウス抗ＯＣＴ３／４抗体（希釈倍率１：１００、サンタクルズ社製）、マウス抗ヒト特異的核抗体（ＨＮＡ）（希釈倍率１：１００、ミリポア社製）、マウス抗ヒト特異的細胞質抗体（ＳＴＥＭ１２１）（希釈倍率１：１００、ミリポア社製）、マウス抗ヒトＴａｕ抗体（希釈倍率１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、マウス抗Ｂａｓｓｏｏｎ抗体（希釈倍率１：２００、ジーンテックス社製）、マウス抗ヒトＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体（希釈倍率１：２００、ミリポア社製）であった。その後、ＰＢＳで３度洗浄した後、更に１次抗体に対応したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識２次抗体と核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（希釈倍率１：１０００、同仁化学社製）をそれぞれブロッキング液で希釈した２次抗体液を調製し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３度洗浄後、マウント剤パーマフロー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてマウント後に４℃で保存した。サンプルは蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）及び共焦点蛍光顕微鏡ＬＳＭ７００（ツァイス社製）を用いて観察及び画像取得を行った。
＜実施例８ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価＞（ＢＭＳスコアリング）
実施例７に記載した実験において、移植細胞の有効性評価を検討するため、ＢＭＳスコアリングによる後肢運動機能評価を移植後１２週間まで７日に１回実施した。細胞移植群では、損傷後１４日目（移植後５日目）の時点から損傷後９１日目（移植後８２日目）の評価最終日まで対照群に比べてＢＭＳスコアが有意に（＊：ｐ＜０．０５）増加した（図９）。
＜実施例９ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価（ロータロッドテスト）＞
移植後１２週間の時点で協調運動評価（ロータロッドテスト）を実施した。１分間当たり２０回転しているロータロッド（室町機械社製）上で歩行可能な時間を測定した。細胞移植群では、対照群に比べて有意に（＊：ｐ＜０．０５）長い時間ロータロッド上で歩行可能であった（図１０）。
＜実施例１０ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価（歩様パターン評価）＞
移植後１２週間の時点で歩様パターン評価を、ＤｉｇｉＧａｉｔシステム（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ社製）を用いて実施した。トレッドミル（７ｃｍ／秒）上で歩行させ、歩幅と歩行角度を計測した。細胞移植群では対照群に比べて有意に（＊＊：ｐ＜０．０１）歩幅が長かった（図１１Ａ）。また、細胞移植群では進行方向に対して肢をつく角度が対照群に比べて有意に（＊：ｐ＜０．０５）小さいことから、両肢を平行に接地させ、より正常に近い歩行パターンであることが示唆された（図１１Ｂ）。
＜実施例１１ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価（キネマティクス解析）＞
移植後１２週間の時点で、関節の動きを評価するため、三次元動作解析ソフトＫｉｎｅｍａＴｒａｃｅｒ（キッセイコムテック社製）を用いて解析を実施した。肩関節、股関節、膝関節、足関節、足趾にマーカーラベルしたマウスをトレッドミル上で歩行させ、両側面前後４方向から高速度デジタルカメラ（ＧｏＰｒｏ社製）にて動画撮影し、各マーカーの軌跡を三次元的に可視化させた。図１２の（Ａ）に後肢が地面から離れてから接地するまでの軌跡の代表例を示す。細胞移植群では、対照群に比べてより肢が地面から離れており、よりスムーズな軌跡を示した。また、図１２の（Ｂ）に歩行周期１周期における股関節、膝関節、足関節、足趾の関節角度変化を示す。６個体に対して５ステップずつ解析を行い、各図は細い線は１個体分の５ステップの平均の関節角度変化を示しており、太い線は６個体の平均を示す。細胞移植群では、対照群に比べて歩行ごとの関節の動きにばらつきが小さいことが示唆された。
＜実施例１２ 亜急性期脊髄損傷モデルマウスの脊髄の組織評価＞
移植後１２週間の時点で、移植細胞を検出するため、矢状切片についてＳＴＥＭ１２１抗体を用いて蛍光免疫染色を行った（図１３の（Ａ））。移植細胞は、損傷中心部から離れた部位にも広範囲にわたって検出され、移植細胞の生着が確認された。また、隣接する切片についてＨＥ染色を実施し、頭側から尾側まで広範囲の組織像を観察した結果、腫瘍様構造は認められなかった（図１３の（Ｂ））。また、損傷中心部（２）、損傷中心部から頭側４ｍｍ（１）、損傷中心部から尾側４ｍｍ（３）の横断切片について抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を行った（図１３の（Ｃ））。移植部位である損傷中心部及び頭側４ｍｍ、尾側４ｍｍの切片においてＨＮＡ陽性細胞が検出されたことから、移植細胞が広範囲に遊走していることが示唆された。
より詳細な移植細胞の特性解析のため、矢状切片についてヒト特異的マーカーと各種マーカーとの蛍光免疫共染色を実施した。まず、ｉＰＳ細胞由来神経前駆細胞が腫瘍化するとＯＣＴ３／４陽性になるとの報告（非特許文献８）から、抗ＯＣＴ３／４抗体及び抗Ｋｉ６７（増殖性マーカー）抗体と抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。また、移植細胞の特性解析のため、抗ＮＥＳＴＩＮ（神経幹細胞マーカー）抗体、抗Ｈｕ（神経マーカー）抗体、抗ＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）抗体、抗ＡＰＣ（オリゴデンドロサイトマーカー）抗体、抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、陽性細胞を定量した。
その結果、ＨＮＡ＋／ＯＣＴ３／４＋共陽性細胞は検出されなかったことから、移植細胞は腫瘍化していないことが示唆された（図１４Ａ）。ＨＮＡ＋／Ｋｉ６７＋共陽性細胞は４．７１±０．２０％であり、移植細胞中に増殖性細胞が存在することが示唆された。また、ＨＮＡ＋／ＮＥＳＴＩＮ＋共陽性神経前駆細胞は１７．０２±３．１０％、ＨＮＡ＋／Ｈｕ＋共陽性の神経細胞は１８．１２±１．２２％、ＨＮＡ＋／ＧＦＡＰ＋共陽性アストロサイトは２７．２３±１．９２％、ＨＮＡ＋／ＡＰＣ＋共陽性オリゴデンドロサイトは３６．５６±２．８２％であった（図１４Ｂ）。よって、移植後９１日の時点で、一部未熟な神経前駆細胞及びグリア前駆細胞が存在するものの、移植細胞の大半がニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの３系統に分化することが示唆された。
次に、移植細胞由来のニューロンがホストのマウスニューロンと神経回路を形成しているかを検討するため、矢状切片について、Ｔｕｊ１抗体、抗ＨＮＡ抗体と抗マウス特異的Ｂａｓｓｏｏｎ（前シナプスマーカー）及び抗ヒトＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（シナプス小胞タンパク質）抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その結果、ＨＮＡ＋／Ｔｕｊ１＋共陽性の移植細胞由来ニューロンがマウス特異的Ｂａｓｓｏｏｎと共局在した（図１５の（Ａ））。また、ＨＮＡ－／Ｔｕｊ１＋のホストニューロンがヒト特異的Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎと共局在した（図１５の（Ｂ））。これらの結果から、ホストのマウスニューロンと移植細胞由来ニューロンが神経回路を形成していることが示唆された。
次に、細胞移植による再髄鞘化効果を検討した。図１６Ａに、頭側（Ｒｏｓｔｒａｌ）０．４８ｍｍ、損傷中心部（Ｅｐｉ－ｃｅｎｔｅｒ）及び尾側（Ｃａｕｄｕｌ）０．４８ｍｍのそれぞれのＬＦＢ染色画像を示す。損傷中心部から頭尾側０．９６ｍｍまでの横断切片についてＬＦＢ染色により髄鞘組織を観察し、ＬＦＢ陽性領域を定量した。その結果、細胞移植群では、観察した全ての切片においてＬＦＢ陽性面積が対照群に比べて有意に（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）増大した（図１６Ａ、図１６Ｂ）。また、横断切片について成熟オリゴデンドロサイトマーカーＭＢＰとＳＴＥＭ１２１の蛍光免疫染色を行った。その結果、ＳＴＥＭ１２１＋／ＭＢＰ＋共陽性領域が検出された（図１７）。さらに、より詳細な観察のため、「Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ，．２０１９；１３：２９．」に記載の方法で、横断切片についてＳＴＥＭ１２１抗体を用いた免疫電子顕微鏡法を行い、ＳＴＥＭ１２１抗体反応部位を、金コロイド粒子を標識した二次抗体により検出した。電子顕微鏡下で髄鞘を観察した結果、金コロイド粒子が髄鞘に検出された（図１８矢印）。これらの結果から、移植細胞由来の成熟オリゴデンドロサイトが神経軸索を再髄鞘化していることが示唆された。
＜実施例１３ 慢性期脊髄損傷モデルラットに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の移植実験＞
Ｎｕｄｅ（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ）ラット（日本クレア社）は慶應義塾大学及びＮＩＨの動物実験ガイドラインに従って取り扱われた。動物実験計画は、慶應義塾大学内の動物実験委員会にて承認された。８週齢のメスＮｕｄｅラットに三種混合麻酔（メデトミジン：０．３７５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム：２ｍｇ／ｋｇ、ブトルファノール：２．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与により麻酔をかけた。「Ｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ２０， １７９－１９３（２００３）」に記載の方法で、第１０胸椎レベルにＩＨ ｉｍｐａｃｔｏｒ（２２０ｋｄｙｎ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社製）で圧挫損傷を加え、オルビフロキサシン（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した後、ミデトミジン拮抗薬（アチパメゾール：０．７５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により覚醒を促した。損傷を加えた翌日及び損傷後１週毎に、「Ｂａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ， １２： １－２１（１９９５）」に記載の方法でＢａｓｓｏ Ｂｅａｔｔｉｅ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）を用いて後肢運動機能を評価した。損傷後４１日の時点でＢＢＢが９以上に自然回復している個体は、細胞移植効果が測定できないことから除外し、２群（対照群１３匹と細胞移植群１８匹）に分け、各群のＢＢＢ平均が同じになるように群分けをした。
損傷後４２日目（慢性期）に、定位固定インジェクションシステム（室町機械社製）を用いて、２７Ｇのメタルニードルにて細胞移植群には細胞懸濁液を、対照群にはＰＢＳを、損傷中心部の頭尾側２ヶ所に２μｌずつ移植した。細胞懸濁液は、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株由来グリア前駆細胞を含む細胞凝集体（５．０×１０５細胞／２μｌ）をＰＢＳ中に集めた状態で移植に用いた。移植後１２週間まで後肢運動機能評価を実施した。また、移植後１２週間の時点で歩様パターン評価を実施した後、深麻酔の下、４％ＰＦＡを心臓より全身に灌流することによって脊髄を固定・採取し、４％ＰＦＡ浸漬下で４℃保管を行った。その後、固定した脊髄を３０％スクロース／ＰＢＳ中で４℃保管した後にＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドを用いて凍結包埋を行い、矢状（１４μｍ厚）及び横断（２０μｍ厚）切片を作製し、－８０℃にて保管した。組織染色は、組織像観察のためにヘマトキシリンーエオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色、及び蛍光免疫染色を行った。
＜実施例１４ 慢性期脊髄損傷モデルラットに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価＞（ＢＢＢスコアリング）
実施例１３に記載した実験において、移植細胞の有効性評価を検討するため、ＢＢＢスコアリングによる後肢運動機能評価を移植後１２週間まで７～１４日に１回実施した。細胞移植群では、損傷後６３日目（移植後２１日目）の時点から損傷後１２６日目（移植後８４日目）の評価最終日まで対照群に比べてＢＢＢスコアが有意に（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）増加した（図１９）。
＜実施例１５ 慢性期脊髄損傷モデルラットに対するグリア前駆細胞を含む細胞凝集体の有効性評価（歩様パターン評価）＞
移植後１２週間の時点で歩様パターン評価を、ＤｉｇｉＧａｉｔシステム（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ社製）を用いて実施した。トレッドミル（１０ｃｍ／秒）上で歩行させ、歩幅と歩行角度を計測した。細胞移植群では対照群に比べて有意に（＊＊：ｐ＜０．０１）歩幅が長かった（図２０の（Ａ））。また、細胞移植群では進行方向に対して肢をつく角度が対照群に比べて有意に（＊＊：ｐ＜０．０１）小さいことから、両肢を平行に接地させ、より正常に近い歩行パターンであることが示唆された（図２０の（Ｂ））。
＜実施例１６ 慢性期脊髄損傷モデルラットの脊髄の組織評価＞
実施例１３に記載の方法で作製した矢状切片についてＨＥ染色を実施した結果、腫瘍様構造は認められなかった（図２１の（Ａ））。また、隣接する切片について抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を実施した。その結果、ＨＮＡ陽性細胞が広範囲で検出されたことから、移植細胞の生着が確認された（図２１の（Ｂ））。
より詳細な移植細胞の特性解析のため、実施例１２に記載の方法で、矢状切片についてヒト特異的マーカーと各種マーカーとの蛍光免疫共染色を実施した。造腫瘍性を評価するため、抗ＯＣＴ３／４抗体と抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その結果、ＨＮＡ＋／ＯＣＴ３／４＋共陽性細胞は検出されなかったことから、移植細胞は腫瘍化していないことが示唆された（図２２の（Ａ））。また、移植細胞の終末分化能を検討するため、抗Ｈｕ（神経マーカー）抗体、抗ＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）抗体及び抗ＡＰＣ（オリゴデンドロサイトマーカー）抗体と抗ＨＮＡ抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。その結果、ＨＮＡ＋／Ｈｕ＋共陽性細胞（図２２の（Ｂ））、ＨＮＡ＋／ＧＦＡＰ＋共陽性細胞（図２２の（Ｃ））、ＨＮＡ＋／ＡＰＣ＋共陽性細胞が検出された（図２２の（Ｄ））。よって、移植細胞がラット脊髄内でニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することが示唆された。
＜実施例１７ 均一サイズの細胞凝集体の作製＞
実施例１の条件３の方法でＱＨＪＩ０１ｓ０４株から作製したグリア前駆細胞を含む細胞凝集体を分化４９日の時点でＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞へ分散させた後に、９６ウェル低接着性プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６スリットウェルプレート、住友ベークライト社製）に、１００００細胞及び２００００細胞／ウェル播種し、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２下に３７℃で神経・グリア増殖培地中で培養した。その結果、播種翌日から細胞凝集体の形成が確認された。３日に１回半量培地交換を行い、８日間及び１４日間培養した（図２３）。培養８日及び１４日（分化５７日及び６３日）の時点で細胞凝集体１個をＤＭＥＭ／Ｆ－１２にて希釈した１％マトリゲル基底膜マトリックス グロースファクター リデュースト（コーニング社製）処理をした９６ウェルプレート（コーニング社製）１ウェルに移し、成熟化培地にて２８日間培養し、終末分化誘導を行った。
終末分化２８日（分化８５日及び９１日）の時点で４％ＰＦＡにて室温で２５分間固定し、ＰＢＳで３度洗浄した後に、１０％ヤギ血清（富士フィルム和光純薬社製）／ＰＢＳをブロッキング液として室温で１時間インキュベートした。その後、上記表４に示す１次抗体液３を添加し、４℃で１晩インキュベートし、共染色を行った。その後、ＰＢＳで３度洗浄し、更に１次抗体液３に対応した２次抗体液３を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３度洗浄し、４℃で保存した。
顕微鏡観察及び画像取得は、蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社製）を用いて行われた。蛍光免疫染像を図２４に示す。検討した全ての条件（播種細胞数（１００００細胞及び２００００細胞）と培養日数（８日間（Ａ）及び１４日間（Ｂ））で、Ｏ４陽性オリゴデンドロサイト、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト、ＭＡＰ２陽性ニューロンが検出された。
＜実施例１８ グリア前駆細胞を含む細胞凝集体由来分泌因子の検出＞
実施例１の条件３の方法でＱＨＪＩ０１ｓ０４株からグリア前駆細胞を含む細胞凝集体を作製した。分化４５日の時点で神経・グリア増殖培地に培地交換を行い、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２下に３７℃で培養した。４８時間後に培養液を回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により培養上清を回収した。残りの細胞ペレットをＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞へ分散させ、総細胞数を計測した。また、神経・グリア増殖培地に含まれるサイトカイン濃度を測定するため、神経・グリア増殖培地のみを同一条件（５％ＣＯ２／２０％Ｏ２／３７℃）で４８時間処理した後に回収した。
培養上清中の分泌因子を２つの方法で検出した。第１の方法として、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏ（登録商標）ヒトサイトカインスクリーニング４８－Ｐｌｅｘパネル（バイオ・ラッド社製）を用いて製造業者の説明書に従い、４８種類のサイトカイン（ＦＧＦ ｂａｓｉｃ、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－３、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１６、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＧＲＯ－α、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２、ＬＩＦ、ＭＣＰ－３、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）、ＭＩＧ、β－ＮＧＦ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ－β、ＳＤＦ－１α、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、ＣＴＡＣＫ、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、及びＴＮＦ－β）濃度を測定した。
まず、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓを９６ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、キット付属のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。なお、洗浄工程については自動化された磁気洗浄システム（Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ＰｒｏＩＩ Ｗａｓｈ Ｓｔａｔｉｏｎ、バイオ・ラッド社製）を用いて実施した。次に、各ウェルにキット付属のＳｔａｎｄａｒｄを用いて作製した８段階の４倍希釈系列（ｎ＝２）とサンプル（培養上清と培地のみ、ｎ＝３）を５０μｌずつ添加し、８５０ｒｐｍで振とうさせながら室温で３０分間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを２５μｌずつ添加し、８５０ｒｐｍで振とうさせながら室温で３０分間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを５０μｌずつ添加し、８５０ｒｐｍで振とうさせながら室温で１０分間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。各ウェルにキット付属のＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを１２５μｌずつ添加し、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００システム（バイオ・ラッド社製）を用いて蛍光値を測定した。
各サイトカインのＳｔａｎｄａｒｄ希釈系列の測定データから、標準曲線を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ソフトウェア ｖｅｒ ６．１（バイオ・ラッド社）を用いて５パラメーターロジスティック曲線回帰により作成し、各サンプル中のサイトカイン濃度を定量した。その後、培養上清の測定データから、培地のみの測定データをバックグラウンドとして差引くことにより、培養上清中に分泌されたサイトカイン濃度を算出した。培養上清中に検出されたサイトカインの上位１０個の濃度及び細胞あたりの分泌量を表８に示す。
ＭＩＦ、ＭＣＰ―１、ＩＬ－８、及びＧＲＯ－αはアストロサイト由来の分泌因子として報告があり（非特許文献９）、また、ＳＣＦ、ＨＧＦ、及びＭＩＦは神経前駆細胞の増殖・分化を促進すること（非特許文献１０～１２）、並びに、Ｍ－ＣＳＦはオリゴデンドロサイト前駆細胞の生存・分化に重要な役割を果たすこと（非特許文献１３）から、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体から神経新生に寄与するサイトカインが分泌されていることがわかった。
また第２の方法として、Ｈｕｍａｎ ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ １／ＳＰＡＲＣＬ１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）とＤｕｏＳｅｔ Ａｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ２（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて培養上清中のＳＰＡＲＣＬ１の濃度を測定した。
まず、製造業者の説明書に従い、Ｈｕｍａｎ ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ １ Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙを９６ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温で一晩吸着させた。その後、キット付属のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＲｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔを３００μｌずつ添加し、室温で８０分間反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＳｔａｎｄａｒｄを用いて作製した１１段階の２倍希釈系列（ｎ＝２）とサンプル（培養上清と培地のみ、ｎ＝３）を１００μｌずつ添加し、室温で２時間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＨｕｍａｎ ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ １ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙを１００μｌずつ添加し、室温で２時間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにキット付属のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを１００μｌずつ添加し、室温で２０分間、遮光下で反応させた。その後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。次に、各ウェルにＳｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（キット付属のＣｏｌｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔ ＡとＣｏｌｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂを１：１で混合したもの）を１００μｌずつ添加し、室温で２０分間、遮光下で反応させた。続いて、各ウェルにキット付属のＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μｌずつ添加し反応を停止させ、すぐにプレートリーダーＥｎｓｐｉｒｅ（パーキンエルマー社製）を用いて吸光度を測定し、４５０ｎｍでの吸光度から５４０ｎｍでの吸光度を差し引いた値を算出した。
Ｓｔａｎｄａｒｄ希釈系列の測定データからエクセル（マイクロソフト社製）を用いて、両対数スケールでのプロットから検量線を作成し、各サンプル中のＳＰＡＲＣＬ１濃度を定量した。培養上清の測定データから、培地のみの測定データをバックグラウンドとして差引くことにより、培養上清中に分泌されたＳＰＡＲＣＬ１濃度を算出した。また、細胞あたりのＳＰＡＲＣＬ１分泌量を算出した（表９）。
解析の結果、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の培養上清中には、高濃度のＳＰＡＲＣＬ１が存在することが明らかとなった。ＳＰＡＲＣＬ１はアストロサイト由来の分泌因子であり、シナプス形成を制御することが知られている（非特許文献１４）ことから、ＳＰＡＲＣＬ１はグリア前駆細胞の培養上清中に検出されるマーカーとして妥当性を有すると考えられる。したがって、ＳＰＡＲＣＬ１は、単独又は他のマーカーと組み合わせて用いることによって、製造工程において、目的細胞が取得できていることを確認するためのマーカーとして有用である。

Claims (37)

  1. グリア前駆細胞を含む細胞凝集体の製造方法であって、以下の工程：
    （１）複数の均一な形状の孔を有する培養容器を用いて、１以上のＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤及び１以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地中で、フィーダー細胞非存在下、多能性幹細胞を５日間～１０日間浮遊培養することにより、細胞凝集体を形成させる工程、
    （２）（１）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含む胚様体形成培地中で、４日間～１１日間浮遊培養する工程、
    （３）（２）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及び１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む胚様体形成培地又は神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程、並びに
    （４）（３）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸を含まず、１以上のＳＨＨシグナル伝達活性化剤を含む神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
    を含み、更に以下の工程：
    （５）（４）で得られた細胞凝集体を、レチノイン酸及びＳＨＨシグナル伝達活性化剤を共に含まない神経・グリア増殖用培地中で、浮遊培養する工程
    を含んでいてもよい、製造方法。
  2. （１）の工程において、（１）の工程開始時に比べて、以下の条件：
    １）ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＨＥＳ４及びＨＥＳ５のうち少なくとも１つのＲＮＡの発現量が１００倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、
    ２）ＯＣＴ３／４のＲＮＡの発現量が２００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること、並びに
    ３）ＮＡＮＯＧのＲＮＡの発現量が４００分の１以下に低下した細胞凝集体が得られること
    の少なくとも１つが充足されるまで、（１）の工程を持続してから、（２）の工程が開始される、請求項１に記載の製造方法。
  3. （２）の工程において、（２）の工程開始時に比べて、以下の条件：
    １）ＡＳＣＬ１、ＤＣＸ、ＨＥＹ１、ＺＢＴＢ２０、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＥＬＡＶＬ３及びＳＬＩＴ１のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
    ２）ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＢ８のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
    の少なくとも１つが充足されるまで、（２）の工程を持続してから、（３）の工程が開始される、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. （１）及び（２）の工程において、酸素濃度が３％～１０％である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. （３）の工程において、（３）の工程開始時に比べて、以下の条件：
    １）ＨＥＹ２、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ２．２のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が５倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
    ２）ＯＬＩＧ１及び／又はＯＬＩＧ２のＲＮＡの発現量が１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること
    の少なくとも１つが充足されるまで、（３）の工程を持続してから、（４）の工程が開始される、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. （３）の工程が４日間～１１日間行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. （４）の工程において、（４）の工程開始時に比べて、以下の条件：
    １）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ及びＦＡＢＰ７のうち、少なくとも１つのＲＮＡの発現量が１０倍以上上昇した細胞凝集体が得られること、並びに
    ２）ＰＡＸ６のＲＮＡの発現量が５倍以下に低下した細胞凝集体が得られること
    の少なくとも１つが充足されるまで、（４）の工程を持続してから、（５）の工程が開始される、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. （４）の工程が４日間以上行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. （４）の工程において、当該工程開始時に（３）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 前記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、当該工程開始時に（４）の工程で得られた細胞凝集体を分散させてから、分散された細胞を５日間～１００日間浮遊培養することにより再度細胞凝集体を形成させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 前記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、Ｏ４抗原、ＮＧ２、ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰから選択される１以上のマーカーが発現するまで、（５）の工程を持続する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 前記方法が（５）の工程を含み、（５）の工程において、細胞凝集体を培養する培地中において、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される１以上のタンパク質が検出されるまで（５）の工程を持続する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤が、ＴＧＦβ阻害剤及びＢＭＰ阻害剤である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ５０５１２４、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、ＳＢ５２５３３４、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、及びＬｅｆｔｙ－１からなる群から選択される１以上である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. ＢＭＰ阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、Ｃｈｏｒｄｉｎ及びＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎからなる群から選択される１以上である、請求項１３又は１４に記載の製造方法。
  16. Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔアゴニスト、Ｄｋｋ及びＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎからなる群から選択される１以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＳＢ２１６７６３及びＬ８０３－ｍｔｓからなる群から選択される１以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. ＳＨＨシグナル伝達活性化剤が、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＳＡＧ、ＳＨＨタンパク質及びＳＨＨ断片からなる群から選択される１以上である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の製造方法。
  19. 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  20. 多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が、以下の特徴：
    （ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
    （ｂ）脊髄領域マーカーを発現していること、及び
    （ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の異種細胞由来成分を含まないこと
    を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の製造方法。
  22. オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団の製造方法であって、請求項１～２１のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体を、成熟化培地を用いて５日間～６０日間培養する工程を含む、製造方法。
  23. オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団が、
    （ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、
    （ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、並びに
    （ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞
    を含む、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 成熟化培地が、Ｔ３、ＮＴ－３及びＬＩＦのうち少なくとも１つを含む培地である、請求項２２又は２３に記載の製造方法。
  25. 成熟化培地が、さらにＣＮＴＦを含む、請求項２４に記載の製造方法。
  26. 以下の特徴：
    （ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞及び神経前駆細胞を含むこと、
    （ｂ）脊髄領域マーカーを発現する細胞を含むこと、
    （ｃ）フィーダー細胞及びフィーダー細胞由来の異種細胞由来成分を含まないこと、及び
    （ｄ）オリゴデンドロサイト、アストロサイト及び神経細胞を含む細胞集団へ分化する能力を有すること
    を有し、さらに、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１及びＮＫＸ６．２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含む、グリア細胞前駆細胞を含む細胞凝集体。
  27. 脊髄領域マーカーがＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６及びＨＯＸＤ８からなる群より選択される１以上のマーカーである、請求項２６に記載の細胞凝集体。
  28. 以下の特徴：
    （Ｉ）ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＳＯＸ９、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＦＡＢＰ７、ＺＢＴＢ２０、ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＭＬＣ１、ＳＬＩＴ１、ＴＩＭＰ３、ＳＰＡＲＣＬ１、ＧＦＡＰ及びＡＱＰ４からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
    （ＩＩ）ＯＬＩＧ２、ＰＤＧＦＲα、ＳＯＸ１０、ＳＰＯＮ１、ＦＡＭ１８１Ｂ、ＴＩＭＰ４、ＳＯＸ６、ＧＲＩＫ３、ＬＨＦＰＬ３、ＫＬＦ９、Ａ２Ｂ５抗原、ＣＮＰ及びＰＬＰからなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
    （ＩＩＩ）ＤＣＸ、βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＥＬＡＶＬ３、ＮＴＲＫ２、ＧＲＩＡ２、ＰＴＰＲＯ及びＥＰＨＡ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
    （ＩＶ）ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＤＬＬ３及びＡＳＣＬ１からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞を含むこと；
    並びに、
    （Ｖ）（ｉ）Ｏ４抗原、ＧａｌＣ、ＭＢＰ、ＡＰＣ、ＧＳＴπ、ＣＮＰ、ＰＬＰ、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＰＤＧＦＲα及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、
    （ｉｉ）βＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２及びＥＬＡＶＬ３からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞、及び
    （ｉｉｉ）ＳＬＣ１Ａ３、Ｓ１００Ｂ、ＡＱＰ４、ＧＦＡＰ及びＮＧ２からなる群より選択される１以上のマーカーを発現する細胞
    を含む細胞集団へ分化する能力を有すること
    を有する、請求項２６又は２７に記載の細胞凝集体。
  29. さらに、（ＶＩ）Ｃ１ＯＲＦ６１及びＳＥＲＰＩＮＥ２からなる群より選択される１又は複数のマーカーを発現する細胞を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の細胞凝集体。
  30. さらに、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＦ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＧＲＯ－α、ＬＩＦ、ＩＦＮ－γ及びＴＲＡＩＬからなる群より選択される１以上のマーカーを発現又は分泌する細胞を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の細胞凝集体。
  31. 請求項２６～３０のいずれか一項に記載の細胞凝集体を有効成分として含有する、医薬組成物。
  32. 脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患の治療のための、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患が急性期、亜急性期又は慢性期の脊髄損傷である、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 脱髄疾患及びグリア細胞の障害に基づく若しくはグリア細胞の障害を伴う疾患の治療のための、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の細胞凝集体。
  35. 被験物質の毒性又は薬効を評価するための方法であって、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の細胞凝集体に前記被験物質を接触させ、前記被験物質が前記細胞凝集体に及ぼす影響を検出又は定量することを含む、評価方法。
  36. Ｃ１ＯＲＦ６１が発現しているか否かを指標として、グリア前駆細胞を含む細胞凝集体が移植に適していることを判別する方法。
  37. Ｃ１ＯＲＦ６１のｍＲＮＡ、Ｃ１ＯＲＦ６１遺伝子によりコードされるタンパク質、及びこれらの断片を検出することを含む、グリア前駆細胞若しくはグリアへの分化指向性が高い神経幹細胞の同定方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240162494A (ko) 2022-03-11 2024-11-15 각고호우징 게이오기주크 척수 손상 치료제
CN116478923B (zh) * 2022-04-26 2024-01-02 浙江霍德生物工程有限公司 一种星形胶质细胞的制备方法
EP4532686A1 (en) * 2022-05-24 2025-04-09 Bluerock Therapeutics LP Methods of making oligodendrocyte progenitor cells
EP4585225A1 (en) 2022-09-08 2025-07-16 Keio University Spinal cord injury therapeutic targeting from acute phase to subacute phase
AU2023352265A1 (en) 2022-09-30 2025-04-17 Fujifilm Corporation Human astrocyte cell mass, cell mass culture, method for producing human astrocyte cell mass, and method for evaluating test substance
US20250304916A1 (en) * 2024-03-11 2025-10-02 Trailhead Biosystems Inc. Methods and compositions for generating vascular leptomeningeal cells

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005523328A (ja) 2002-04-19 2005-08-04 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション 胎盤由来の幹細胞及びその使用
WO2005123902A1 (ja) 2004-06-18 2005-12-29 Riken 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
JP2010162024A (ja) 2003-08-29 2010-07-29 Wisconsin Alumni Res Found 霊長類胚幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びドーパミンニューロンのインビトロでの分化の方法
WO2010140698A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法
JP2011121949A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Kyoto Univ 筋萎縮性側索硬化症の予防および治療用医薬組成物
WO2013187416A1 (ja) 2012-06-12 2013-12-19 学校法人 慶應義塾 神経系分化に適したiPS細胞の増幅方法、及び神経幹細胞の誘導方法
WO2017141900A1 (ja) 2016-02-16 2017-08-24 学校法人慶應義塾 多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地及びその使用
WO2018199142A1 (ja) 2017-04-27 2018-11-01 国立大学法人京都大学 神経堤細胞および交感神経細胞の製造方法
WO2018208836A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Regents Of The University Of Minnesota Acceleration of stem cell differentiation

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
CA2277278A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
WO2002101057A1 (fr) 2001-06-08 2002-12-19 Dnavec Research Inc. Transfert genique dans des cellules souches embryonnaires de primate a l'aide d'un virus de l'immunodeficience simienne de pseudo type vsv-g utilise comme vecteur
US20100087486A1 (en) 2008-05-30 2010-04-08 Hiroshi Nakamura Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
AU2009319772A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Centocor Research & Development, Inc. Compositions and methods for regulating collagen and smooth muscle actin expression by SERPINE2
CN101798600B (zh) * 2010-04-02 2012-05-23 上海生物芯片有限公司 Serpine2基因的用途
US20160138113A1 (en) * 2013-06-19 2016-05-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of brain metastasis
PL3145517T3 (pl) 2014-05-22 2021-04-06 New York Stem Cell Foundation, Inc. Funkcjonalne oligodendrocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz sposoby ich otrzymywania i stosowania
WO2016201299A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Indiana University Research & Technology Corporation Predicting suicidality using a combined genomic and clinical risk assessment
US20190322981A1 (en) * 2016-07-05 2019-10-24 Westfaelische Wilhelms-Universitaet Muenster Means and methods for the generation of oligodendrocytes
IL268417B2 (en) * 2017-02-10 2025-05-01 Univ Rockefeller Methods for cell-type specific profiling to identify drug targets
US20180284108A1 (en) * 2017-04-01 2018-10-04 Michael Joseph Pugia Method for complete and fragmented markers
WO2019094955A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in h3k27m gliomas
US12365872B2 (en) * 2018-09-19 2025-07-22 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Methods for differentiating pluripotent stem cells in dynamic suspension culture

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005523328A (ja) 2002-04-19 2005-08-04 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション 胎盤由来の幹細胞及びその使用
JP2010162024A (ja) 2003-08-29 2010-07-29 Wisconsin Alumni Res Found 霊長類胚幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びドーパミンニューロンのインビトロでの分化の方法
WO2005123902A1 (ja) 2004-06-18 2005-12-29 Riken 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
WO2010140698A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 国立大学法人東北大学 多能性幹細胞からの神経堤細胞群の分化誘導方法
JP2011121949A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Kyoto Univ 筋萎縮性側索硬化症の予防および治療用医薬組成物
WO2013187416A1 (ja) 2012-06-12 2013-12-19 学校法人 慶應義塾 神経系分化に適したiPS細胞の増幅方法、及び神経幹細胞の誘導方法
WO2017141900A1 (ja) 2016-02-16 2017-08-24 学校法人慶應義塾 多能性幹細胞の神経幹細胞への分化用培地及びその使用
WO2018199142A1 (ja) 2017-04-27 2018-11-01 国立大学法人京都大学 神経堤細胞および交感神経細胞の製造方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NUMASAWA-KUROIWA, Y. et al.，Involvement of ER stress in Dysmyelination of Pelizaeus-Merzbacher Disease with PLP1 Missense Mutations Shown by iPSC-Derived Oligodendrocytes，Stem Cell Reports，2014年，vol.2, p.648-661
STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE，Vol.4，2015年，pp.755-763
ヒトの脊髄神経幹細胞の作製および損傷した脊髄における動態，オンライン，URL: https://first.lifesciencedb.jp/archives/18552，DOI: 10.7875/first.author.2018.084

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