JP7711049B2 - 初代ヒト細胞における、同族ｔ細胞及びエピトープ反応性をスクリーニングするハイスループット法 - Google Patents

初代ヒト細胞における、同族ｔ細胞及びエピトープ反応性をスクリーニングするハイスループット法

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）により、２０１９年１０月３日に出願された、米国特許仮出願番号第６２／９１０，３７９号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ＥＦＳ ＷＥＢによりテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル１０６６９＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載する配列表は５キロバイトであり、２０２０年１０月２日に作製され、参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト疾患における抗原特異的Ｔ細胞活性への関心に一層焦点が当てられるようになっているため、エピトープ特異的ＴＣＲ配列を、ＨＬＡの文脈で提示される同族エピトープと相関させることができることが必要とされている。しかし、どのエピトープが、生産的なＴ細胞の活性化、及び、応答するＴ細胞のＴＣＲ配列をもたらすかを識別することは、歴史的に、技術上問題のある課題となって現在まで続いている。
抗原特異的Ｔ細胞結合及び反応性を評価するために使用する従来の方法としては、Ｔ細胞が、サイトカインまたは細胞溶解応答により検出されるエピトープに再曝露される、多量体染色及び機能的Ｔ細胞アッセイ（例えばＥＬＩＳＰＯＴ、細胞殺傷アッセイ）が挙げられる。これらの方法は有用である一方で、ハイスループットで反応性の可能性を評価するために、高価な個別のＨＬＡハプロタイプ特異的試薬（多量体）及び多量の血液量を必要とする可能性がある。加えて、ＨＬＡクラスＩＩ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）多量体はほとんど存在しないため、多量体に基づく調査は、ＨＬＡクラスＩ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）反応性に焦点が当てられる。
したがって、とりわけ、ＴＣＲの同族ＴＣＲα及びβポリペプチドを、ＴＣＲにより認識されるエピトープと相関させる情報をもたらすことが可能なハイスループット法が必要とされている。
対象となる複数のＴ細胞エピトープに対するＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞が同時にアッセイ可能な、自己及び初代免疫細胞で使用可能な免疫細胞アッセイを本明細書に記載する。抗原の反応性は、ハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）追跡システムを用いて個別のＴ細胞と結びつけられ、この関連付けが、後で、シングルセル配列決定により逆畳み込みされ、（ａ）エピトープ特異性、（ｂ）シングルセルの対形成したアルファ／ベータ鎖ＴＣＲ配列、（ｃ）内因性シングルセルＲＮＡトランスクリプトーム情報、（ｄ）細胞表面タンパク質発現（例えば、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体を用いる）、（ｅ）多量体染色（多量体が含まれる場合）、及びこれらの任意の組み合わせなどのシングルセルレベルの情報を提供することができる。したがって、免疫細胞アッセイ法、そのための組成物及びキット、ならびに、例えば、ＴＣＲ治療薬を作製するための、その使用を本明細書で提供する。
一実施形態では、本明細書に記載する方法は、例えば、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の、活性化Ｔ細胞の発現に基づき、他の細胞、例えば自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む組成物から、活性化Ｔ細胞をソートすることであって、活性化Ｔ細胞がＨＴＯコンジュゲート分子で標識される、上記ソートすることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する（例えば、Ｔ細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の、ＴＣＲα鎖配列、及び／またはＴＣＲβ鎖配列を活性化可能な前記抗原を識別するための）方法は、
（Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、固有の生体サンプルが、（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、（ｂ）固有の抗原、（ｃ）固有の抗原を特異的に識別ために使用可能な（及び／または、特異的に識別する）固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地を含む、上記ソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識した分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯを識別することであって、固有のＨＴＯを識別することが、活性化Ｔ細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、（ｉ）活性化Ｔ細胞により発現する１つ以上の遺伝子、及び／または、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞により発現されるＴＣＲのＴＣＲα及び／またはβ鎖配列もまた識別する、上記識別することと、
を含む。
本明細書に記載するいくつかの方法は、ソート工程の前に、複数の生体サンプル、例えば固有の生体サンプルを作製し、ソートした組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むようにすることをさらに含む。いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、対象から単離したＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣ生存能、活性化及び／または活性を支持する培地及びサイトカインを含む、上記工程を含む。
いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な（及び／または、特異的に識別する）、複数の生体サンプル、単独の固有の抗原、及び／または単独の固有のＨＴＯのそれぞれを送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートし、複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まりを含み、固有の抗原及び／またはＴ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、（ａ）対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まり、（ｂ）固有の抗原、（ｃ）固有の抗原を特異的に識別し、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯ、ならびに任意選択的に、（ｄ）Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地を含む固有の生体サンプルになる、上記工程を含む。任意選択的に、複数の固有の生体サンプルは、本明細書に記載の方法でソートする前にプールし、（Ｉ）でソートされた組成物が複数の固有の生体サンプルを含むようにすることができる。本明細書のいくつかの方法の実施形態は、ソート工程の前に、複数の生体サンプルを作製し、（例えば、複数の生体サンプルから）複数の固有の生体サンプルを作製する工程と、任意選択的に、複数の固有の生体サンプルをプールして、本明細書に記載する方法に従いソート可能な組成物を作製する工程の両方を含む。
本明細書に記載するいくつかの方法では、ソートすることは、ＡＩＭの発現に基づく、活性化Ｔ細胞の蛍光活性化細胞ソーティングであって、蛍光活性化細胞ソーティングが、ＡＩＭを発現するＴ細胞を、ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体により検出することに基づく、上記ソートすることを含む。このような方法は、固有の生体サンプル（または、１つまたは複数の固有の生体サンプルを含む組成物）を、ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識リガンド（例えば、蛍光標識抗体）でインキュベートすることをさらに含んでよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、シングルセル配列決定により分析した活性化Ｔ細胞で、機能分析及び／または表現型分析を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の前に行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は、シングルセル配列決定分析と同時に行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の後で行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は、シングルセル配列決定分析の前に、シングルセル配列決定分析と同時に、及び／または、シングルセル配列決定分析の後で行われる。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析はフローサイトメトリー分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析はＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は多量体分析を含む。いくつかの実施形態では、機能分析及び／または表現型分析は、フローサイトメトリー分析、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析、及び多量体分析の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び／または表現型分析は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上の、タンパク質及び／またはＲＮＡの発現レベルを測定する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することであって、好ましくは、ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列が、それぞれ、ＴＣＲα鎖可変領域配列（Ｖα／Ｊα配列）及び／またはＴＣＲβ鎖可変領域配列（Ｖβ／Ｊβ配列）である、上記識別することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することを含み、方法は、治療薬、例えばヒト治療薬の作製において、ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を利用することをさらに含む。あるいは、方法は、ＴＣＲδ／ＴＣＲγ配列、例えば、ＴＣＲδ／ＴＣＲγ可変領域配列もまた含むことができる。
本明細書に記載の方法で使用可能な組成物もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、（ｂ）抗原、（ｃ）抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、上記ＨＴＯが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記ＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地を含む固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の生体サンプル、例えば第１及び第２の生体サンプルを含み、第１の生体サンプルは、（ａ）第１のＴ細胞及び第１の表面結合ＭＨＣであって、第１のＴ細胞が、第１の表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第１のＴ細胞及び第１の表面結合ＭＨＣ、（ｂ）第１の抗原、ならびに（ｃ）第１の抗原を特異的に識別するために使用可能であり、好ましくは第１の抗原を特異的に識別する、第１のＨＴＯを含み、第１のＨＴＯは、第１のＴ細胞を第１のＨＴＯで標識する第１の分子にコンジュゲートし、第２の生体サンプルは、（ａ）第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣであって、第２のＴ細胞が、第２の表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣ、（ｂ）第２の抗原、ならびに（ｃ）第２の抗原を特異的に識別する第２のＨＴＯを含み、第２のＨＴＯは、第２のＴ細胞を第２のＨＴＯで標識する第２の分子にコンジュゲートし、（ｉ）第１のＴ細胞及び第２のＴ細胞は同一の対象から単離され、（ｉｉ）第１の抗原及び第２の抗原は同一ではなく、（ｉｉｉ）第１のＴ細胞を第１のＨＴＯで標識する第１の分子、及び、第２のＴ細胞を第２のＨＴＯで標識する第２の分子は同一であり、第１のＨＴＯ及び第２のＨＴＯは同一ではなく、任意選択的に、第１及び第２の生体サンプルのいずれかまたは両方が、第１及び第２のＴ細胞の活性化を支持する培地をさらに含む。
キットもまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するキットは、複数の固有の抗原、及び、複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）を含み、複数の固有のＨＴＯのそれぞれは、複数の固有の抗原のうちの１つのみを特異的に識別するために使用可能であり、好ましくは、特異的に識別する。いくつかのキットの実施形態では、複数の固有のＨＴＯのそれぞれは、同一の分子にコンジュゲートし、キットが、固有のＨＴＯがコンジュゲートした複数の分子を含む。本明細書に記載するいくつかのキットの実施形態では、複数の固有の抗原のそれぞれは、単一のタンパク質、例えば、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む。
本明細書におけるいくつかの実施形態では、表面結合ＭＨＣは、細胞膜結合ＭＨＣであり、例えば、表面結合ＭＨＣは、細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現する。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＰＣは、単核細胞由来の樹状細胞である。いくつかの組成物、方法、キット、または使用の実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＰＣは単球である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＰＣはマクロファージである。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＰＣはＢ細胞である。いくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、表面結合ＭＨＣは、細胞の集団、例えばＡＰＣの集団の表面に発現し、例えば、ＡＰＣの集団は、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、及びこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＡＰＣ（複数可）は自己由来である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＡＰＣ（複数可）はそれぞれ、ヒトドナーから単離される。いくつかの実施形態では、（例えば、ヒトドナーから単離した）末梢血単核球細胞は、Ｔ細胞及び表面結合ＭＨＣ（例えば、ＡＰＣ（複数可）の表面に発現したＭＨＣ）を提供する。
本明細書に記載する方法、組成物、キット、及び使用は、体積の小さいサンプル、例えば体積の小さいヒトサンプルで有利に実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得るように、対象、例えばヒト対象から単離した、十分な数の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも２つの個別の生物学的サンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも３つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも５つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも１０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも２０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも３０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも５０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した十分な数のＡＰＣ及びＴ細胞を含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれが約１：１、約１：５、または約１：１０のＡＰＣ：Ｔ細胞の比でＡＰＣ及びＴ細胞（例えば、ＤＣ及びＴ細胞）を含む、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。例えば、各サンプルは、少なくとも約５×１０３、５×１０４、または５×１０５個のＤＣ、及び、約５×１０３、１×１０４、２．５×１０４、５×１０４、１×１０６、２．５×１０５、５×１０５、１×１０６、２．５×１０６、または５×１０６個のＴ細胞を含む。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。
本明細書に記載する方法で使用する、または、本明細書に記載する組成物もしくはキットの一部である抗原は、（Ｉ）（ｉ）細菌抗原もしくはその一部、（ｉｉ）ウイルス性抗原もしくはその一部、（ｉｉｉ）アレルゲンもしくはその一部、（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその一部、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される抗原であることができ、及び／または、（ＩＩ）（ｉ）アミノ酸配列、（ｉｉ）ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）溶解物、及び（ｉｖ）これらの組み合わせを含む。
本明細書に記載する方法、組成物、キット、及び使用はそれぞれ、分子にコンジュゲートしたハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）を含み、当該分子を使用して、細胞（例えばＴ細胞）をＨＴＯで標識することができる。いくつかの実施形態では、細胞をＨＴＯで標識するために使用した分子はリガンド、例えば抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＨＴＯコンジュゲートリガンド、例えばＨＴＯコンジュゲート抗体は、細胞表面分子に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、大部分の細胞により遍在的に発現される。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はβ２マイクログロブリンであるか、β２マイクログロブリンを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＣＤ２９８であるか、またはＣＤ２９８を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＴ細胞により選択的に発現されることができる。いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＴ細胞表面分子であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＣＤ２であるか、またはＣＤ２を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＣＤ３であるか、またはＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＣＤ４であるか、またはＣＤ４を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面分子はＣＤ８であるか、またはＣＤ８を含む。いくつかの実施形態では、細胞をＨＴＯで標識するために使用した分子は、例えば、好ましくは自身を細胞膜、例えば分裂細胞の細胞膜に組み込む脂質を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＨＴＯコンジュゲート分子は、ＨＴＯコンジュゲート脂質、例えば脂質修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞をＨＴＯで標識するために使用した分子はコレステロールであるか、またはコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＨＴＯコンジュゲート分子は、ＨＴＯコンジュゲートコレステロール、例えばコレステロール修飾オリゴヌクレオチドを含む。
本明細書に記載の方法は、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞をソートすることを含む。したがって、本明細書に記載するいくつかの方法、組成物、キット、及び使用の実施形態は、このようなソート工程で有用な剤を含む。いくつかの実施形態では、剤は、ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識したリガンド、例えば、ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識した抗体を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、またはキットの実施形態では、ＡＩＭは、Ｔ細胞の活性化の際に、Ｔ細胞により上方制御される任意のマーカーであるか、またはこれを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＡＩＭであるか、またはこれを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢであるか、またはＣＤ１３７／４－１ＢＢを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ１０７であるか、またはＣＤ１０７を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＩＦＮγであるか、またはＩＦＮγを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＰＤ－１であるか、またはＰＤ－１を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ４０Ｌであるか、またはＣＤ４０Ｌを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＯＸ４０であるか、またはＯＸ４０を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ２５であるか、またはＣＤ２５を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ６９であるか、またはＣＤ６９を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＤ２８であるか、またはＣＤ２８を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＨＬＡ－ＤＲであるか、またはＨＬＡ－ＤＲを含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＣＸ３ＣＲ１であるか、またはＣＸ３ＣＲ１を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＴＩＭ３であるか、またはＴＩＭ３を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＬＡＧ３であるか、またはＬＡＧ３を含む。本明細書におけるいくつかの方法、組成物、キット、または使用の実施形態では、ＡＩＭは、ＴＩＧＩＴであるか、またはＴＩＧＩＴを含む。
本明細書に記載する方法は、シングルセル配列決定により分析した活性化Ｔ細胞で、機能分析及び／または表現型分析を行うことを含むことができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、キット、または使用は、追加の試薬、例えば抗体及び／またはＭＨＣ多量体を含むことができ、これらのいずれかまたは両方は、フローサイトメトリー分析、及び／またはＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析に有用であることができる。
本明細書に記載するいくつかの方法、組成物、キット、及び使用の実施形態は、存在するＴ細胞（及び任意選択的に、他の細胞、例えば、抗原提示細胞、例えば樹状細胞）の生存能、活性化、及び／または活性を支持する培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は１種以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－４を含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－７を含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、培地はＧＭ－ＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、培地はＦＬＴ３Ｌを含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＦＬＴ３Ｌの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、培地はＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを含む。
Ｔ細胞が媒介する、ワクチンに対する患者の免疫応答を分析するための、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットの使用もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットは、Ｔ細胞が媒介する、免疫療法に対する患者の免疫応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットは、患者の免疫療法の間に、患者における、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットは、自己抗原に対する患者のＴ細胞応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットは、移植抗原に対する患者のＴ細胞応答を分析するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法、組成物、及びキットを使用して、活性化Ｔ細胞の、１つ以上のＴＣＲ可変領域配列（例えば、ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３配列、及び／またはＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３配列）を識別することができる。いくつかの実施形態では、このように識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を使用して、ヒト治療薬、例えば、本明細書に記載する方法、組成物、及びキットを用いて識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を含むＴ細胞を作製することができる。
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｔ細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の、ＴＣＲα鎖配列、及び／またはＴＣＲβ鎖配列を活性化可能な前記抗原の識別方法であって、前記方法が、
（Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、前記固有の生体サンプルが、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、前記Ｔ細胞が、前記表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、前記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）固有の抗原、
（ｃ）前記固有の抗原を特異的に識別するために使用される固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、前記固有のＨＴＯが、前記Ｔ細胞を前記固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートする、前記ＨＴＯ、ならびに任意選択的に、
（ｄ）前記Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む、前記ソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした前記活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、前記活性化Ｔ細胞を前記固有のＨＴＯで標識した前記分子にコンジュゲートした前記固有のＨＴＯを識別することであって、前記固有のＨＴＯを識別することが、前記活性化Ｔ細胞を活性化可能な前記抗原を識別し、任意選択的に、前記シングルセル配列決定分析が、以下のうちの１つ以上：
（ｉ）前記活性化Ｔ細胞により発現した１つ以上の遺伝子、ならびに／または
（ｉｉ）前記活性化Ｔ細胞により発現したＴＣＲのＴＣＲα及び／もしくはβ鎖配列
もまた識別する、前記識別することと、を含む、前記方法。
（項目２）
ソートする前に、以下の工程（複数可）のうちの一方または両方：
対象から単離したＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣ生存能、活性化及び／または活性を支持する媒体及びサイトカインを含む、前記工程と、
前記固有の抗原を特異的に識別するために使用する固有の抗原及び／または固有のＨＴＯを、複数の生体サンプルのそれぞれに送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、前記固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を前記固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートされる、前記工程と、
を含み、
前記複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離されたＴ細胞及びＡＰＣを含み、任意選択的に、前記Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地を含む、細胞の集まりを含み、
前記固有の抗原及び／またはＴ細胞を前記固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした前記固有のＨＴＯの送達後、前記複数の生体サンプルのそれぞれが、
（ａ）対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まり、
（ｂ）固有の抗原、
（ｃ）前記固有の抗原を特異的に識別し、前記Ｔ細胞を前記ＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）前記Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地
を含む固有の生体サンプルになり、
（Ｉ）でソートされた前記組成物が複数の固有の生体サンプルを含む、
項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、またはこれらの組み合わせを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
ソートすることが、前記活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づく、活性化Ｔ細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記ＡＩＭが、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
蛍光活性化細胞ソーティングが、前記ＡＩＭに対する蛍光標識抗体を用いる検出に基づく、項目４または項目５に記載の方法。
（項目７）
ＩＩで分析した前記活性化Ｔ細胞にて、さらなる機能分析及び／または表現型分析を行うことを含み、任意選択的に、前記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、フローサイトメトリー分析、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、多量体分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上のタンパク質及び／またはＲＮＡ発現レベルを測定する、項目７に記載の方法。
（項目９）
末梢血単核球細胞が前記Ｔ細胞及び表面結合ＭＨＣをもたらす、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｔ細胞を前記固有のＨＴＯで標識する前記分子が、細胞表面分子に結合する抗体を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢであるか、またはこれを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記方法が、前記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することを含み、前記ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列がそれぞれ、ＴＣＲα鎖可変領域配列及び／またはＴＣＲβ鎖可変領域配列である、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記方法が、前記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することを含み、前記方法が、治療薬の作製において、前記ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を利用することをさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、前記Ｔ細胞が、前記表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、前記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）抗原、
（ｃ）前記抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、前記ＨＴＯが、前記Ｔ細胞を前記ＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、前記ＨＴＯ、
ならびに、任意選択的に、
（ｄ）前記Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む、組成物。
（項目１５）
（ａ）前記ＭＨＣが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現し、任意選択的に、
前記Ｔ細胞及びＡＰＣは自己由来であり、
前記Ｔ細胞及び前記ＡＰＣがそれぞれヒトドナーから単離され、ならびに／または、
前記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
（ｂ）前記抗原が、
（Ｉ）
（ｉ）細菌抗原もしくはその部分、
（ｉｉ）ウイルス性抗原もしくはその部分、
（ｉｉｉ）アレルゲンもしくはその部分、
（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
（ｖ）これらの組み合わせ
からなる群から選択され、ならびに／または、
（ＩＩ）
（ｉ）アミノ酸配列、
（ｉｉ）ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）細胞溶解物、及び
（ｉｖ）これらの組み合わせ
を含み、
（ｃ）前記ＨＴＯコンジュゲート分子が、細胞表面分子または脂質に結合する抗体を含み、ならびに／または
（ｄ）前記培地が、前記Ｔ細胞及び／またはＡＰＣの生存能を支持するサイトカインを含む、
項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記抗体が、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するか、または、
前記脂質が細胞膜に組み込まれる、
項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記Ｔ細胞及び／または前記ＡＰＣの生存能を支持する前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１５または項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
第２の生体サンプルをさらに含み、前記第２の生体サンプルが、
（ａ）第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣであって、前記第２のＴ細胞が、前記第２の表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、前記第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣ、
（ｂ）第２の抗原、
（ｃ）前記第２の抗原を特異的に識別する前記第２のＨＴＯであって、前記ＨＴＯが、前記第２のＴ細胞を前記第２のＨＴＯで標識する第２の分子にコンジュゲートする、前記第２のＨＴＯ、
ならびに、任意選択的に、
（ｄ）前記第２のＴ細胞の活性化を支持する培地
を含み、
（ｉ）前記Ｔ細胞及び第２のＴ細胞が同一の対象から単離され、
（ｉｉ）前記抗原及び前記第２の抗原が同一ではなく、
（ｉｉｉ）前記Ｔ細胞を前記ＨＴＯで標識する前記分子、及び、前記第２のＴ細胞を前記第２のＨＴＯで標識する前記第２の分子が同一であり、前記ＨＴＯ及び前記第２のＨＴＯが同一ではない、
項目１５～１７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１９）
前記組成物が、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞のソートを可能にする剤をさらに含む、項目１４～１８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２０）
ＡＩＭの発現に基づき活性化Ｔ細胞のソートを可能にする前記剤が、前記ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴからなる群から選択される、項目１９または項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記組成物が、前記組成物のフローサイトメトリー分析またはＣＩＴＥ－ｓｅｑに有用な抗体及び／またはＭＨＣ多量体を含む、項目１４～２１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２３）
複数の固有の抗原、及び、
複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、それぞれが、前記複数の固有の抗原のうちの１つのみを特異的に識別する、前記ＨＴＯ
を含むキット。
（項目２４）
前記キットが、活性化Ｔ細胞の、その活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づくソートを可能にする剤をさらに含み、任意選択的に、ＡＩＭの発現に基づき活性化Ｔ細胞のソートを可能にする前記剤が、前記ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体である、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
前記複数の固有のＨＴＯのそれぞれが、同一の分子にコンジュゲートし、前記キットが、固有のＨＴＯがコンジュゲートした複数の分子を含む、項目２３または２４に記載のキット。
（項目２６）
前記複数の固有の抗原のそれぞれが、単一のタンパク質からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む、項目２３～２５のいずれか１項に記載のキット。
（項目２７）
前記単一のタンパク質が、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からなる群から選択される、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
患者の、ワクチンに対する、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目２９）
患者の、免疫療法に対する、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目３０）
患者における、前記患者の免疫療法の間における、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目３１）
患者の、自己抗原に対するＴ細胞応答を分析するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目３２）
患者の、移植抗原に対するＴ細胞応答を分析するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目３３）
活性化Ｔ細胞の１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を識別するための、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
（項目３４）
前記１つ以上のＴＣＲ可変領域配列が、ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３配列、及び／または、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３配列を含む、項目３３に記載の使用。
（項目３５）
ヒト治療薬の作製における、項目３３または３４で識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列の使用。
（項目３６）
前記ヒト治療薬が、項目１～１３のいずれか１項に記載の方法、項目１４～２２のいずれか１項に記載の組成物、または、項目２３～２７のいずれか１項に記載のキットを使用して識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を含むＴ細胞を含む、項目３５に記載の使用。
本発明の非限定的な実施例の図解（縮尺通りでない）を示す。簡潔に述べると、それぞれが、細胞（例えば、全末梢血単核球細胞、自己抗原提示細胞、及びＴ細胞など）、固有の抗原、ならびに、固有の抗原を識別する固有のＨＴＯを含む、固有の生体サンプルをプールする。固有の生体サンプルのプールを活性化Ｔ細胞に対して濃縮し、当該活性化Ｔ細胞の機能的特徴及び表現型特徴を、次に分析することができる。方法の詳細な工程を、本明細書の以下に記載する。 （ａ）予増殖の後かつ再刺激の前、及び、（ｂ）同一抗原による２４時間の再刺激後に、ＤＭＳＯ、ＣＭＶ ｐｐ６５またはＭＡＲＴ１抗原でプライミングした後の、Ｔ細胞：樹状細胞共培養物の、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）ドットプロットを示す。ＣＤ１３７／４－１ＢＢまたは多量体染色により測定した、ＣＤ８及び機能的活性の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより、蛍光標識モノクローナル抗体（ＣＤ８及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、またはデキストラマー多量体を用いて評価した。 ＤＭＳＯまたはＣＭＶ ｐｐ６５でインキュベートし、陰性多量体、またはｐｐ６５標識多量体（上面）もしくは抗４－１ＢＢ抗体（下面）に結合した、４つの異なるドナー（ｘ軸）から単離した、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合（ｙ軸）を示す。＊陰性多量体＝無関係なペプチドを含む多量体；ＦＭＯ＝蛍光－１個の対照 １０日間の予増殖、及び、ＤＭＳＯ（ベースライン）またはＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ：配列番号１５）合成短鎖ペプチド（ＭＡＲＴ－１再曝露）のいずれかでの、２４時間の再刺激の後での、健常なＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋ヒトドナー（ＨＤ３及びＨＤ２７；ｘ軸）由来の、全末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の集団内での、機能的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合（ｙ軸）を示す。多量体を使用して、ベースライン集団を染色し、抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢ抗体を使用して、再刺激した集団を染色した。＊ＦＭＯ＝蛍光－１個の対照；陰性多量体＝無関係なペプチドを含む多量体。 ドナーＨＤ２７に由来し、ＣＤ１３７／４－１ＢＢまたは多量体染色（ｘ軸）により識別されたＭＡＲＴ１に対して特異的な、全ＴＣＲクローンの、Ｔ細胞の割合としてのクローン頻度（上面；ｙ軸）及びＴ細胞の数としてのクローンサイズ（下面；ｙ軸）を示す、ヴァイオリンプロットを示す。メジアン、上部四分位数、及び下部四分位数、ならびに四分位数間領域（上部四分位数と下部四分位数との距離）を示す、ボックスプロットが、ヴァイオリンプロットに埋め込まれている。 Ａ及びＢは、ｈＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドで予増殖及び再刺激し、以下の固有の抗原：ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭウイルスのうちの１つでインキュベートしたＴ細胞を含む固有の生体サンプルに由来するデータを示す。Ａは、ペプチド特異的Ｔ細胞の数が、これらの生体サンプルによるＩＦＮγ産生（ＳＦＣ／２×１０６；ｙ軸）を測定することにより列挙される、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイからのデータを示す。ＳＰＣ＝スポット形成コロニー。Ｂは、抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢ（ｙ軸）及び抗ＣＤ８（ｘ軸）抗体で染色したこれらの生体サンプルの、フローサイトメトリー分析によるドットプロットを示す。ＤＭＳＯでインキュベートしたＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋細胞の割合は０．２５％であり、ＥＢＶ ＹＶＬ－９ペプチドでインキュベートした細胞の割合は１．２７％であり、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドでインキュベートした細胞の割合は約２６．２％であり、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａペプチドでインキュベートした細胞の割合は３．２１％であり、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１ペプチドでインキュベートした細胞の割合は約９．６７％であり、または、インフルエンザウイルスペプチドでインキュベートした細胞の割合は約５．２％であった。 ＰＢＭＣ、固有の抗原ポリペプチド（例えば図４に記載している）、及び、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗ＣＤ２抗体（ＨＴＯ；１～６）を含む固有の生体サンプルが、プールされ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ及びＣＤ８を発現するこれらの細胞に対して濃縮され、シングルセル配列決定（５’ｓｃＳＥＱ）分析により分析される、本発明の非限定的な実施形態の非限定的な図解（縮尺通りでない）を示す。例えば、ＤＭＳＯ、ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ｈＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭウイルスで刺激した固有の生体サンプルのそれぞれに対する、６個の細かく分けたウェルを示すものの、ＤＭＳＯ集団は最終的に、シングルセル配列決定分析用の多くのＣＤ８＋ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞をもたらさなかった。 固有の抗原（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭ；ｙ軸）でそれぞれ刺激した固有の生体サンプルから濃縮した、個別のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞と関連する、ハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ－１、ＨＴＯ－２、ＨＴＯ－３、ＨＴＯ－４、ＨＴＯ－５）（ｙ軸）のレベル（０～２．５の縮尺）を示す。２つ以上のＨＴＯが配列決定された（ダブレット）か、またはＨＴＯが配列決定されなかった（ＨＴＯなし）、これらのＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた示す。 各固有の抗原、例えば、ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭのそれぞれが、その関連する固有の生体サンプルを等しく増殖した場合に、図６Ａがどのように見えるのかについての、概略（縮尺通りでない）例を示す。 ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の各集団に対する、ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、インフルエンザＭに対する反応性が識別され、それぞれ、ＨＴＯ－１、ＨＴＯ－２、ＨＴＯ－３、ＨＴＯ－４、及びＨＴＯ－５に対応する、図６Ａのソートプール（ｙ軸）からの、細かく分けた細胞の数を示す。２つ以上のＨＴＯが配列決定された（ダブレット）か、またはＨＴＯが配列決定されなかった（ＨＴＯなし）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数もまた示す。 上面は、様々なペプチド（ｘ軸）をロードしたデキストラマーで染色した後に、ＨＴＯ４０（ＨＴＯ－５などの、インフルエンザＭ抗原を識別するもの）、ＨＴＯ４７（ＨＴＯ－４などの、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１抗原を識別するもの）、または、ＨＴＯ－４８（ＨＴＯ－２などの、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原を識別するもの）で細分化した、濃縮ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞による、正規化したデキストラマー発現（係数；ｙ軸）を示すグラフを示す。下面は、ＨＴＯ－４０、ＨＴＯ－４７、及びＨＴＯ－４８で細分化し、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ発現（ｘ軸）のために濃縮した、Ｔ細胞クローンのクローンサイズ、ならびに、上面で示す実験で識別したこれらのクローンのクローンサイズを示す。固有のクローンの総数、例えば全クローンは、ＴＣにより示される。細分化した抗原に対応するデキストラマーの高発現を示すクローン、例えば重複クローンの数は、ＯＣにより示される。 固有の抗原（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭ；ｙ軸）でそれぞれ刺激した固有の生体サンプルから濃縮した個別のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＲＮＡトランスクリプトーム分析から解像した、７つの固有のクラスター（クラスター０～６）を示す。各点は、シングルセルを表す。 ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭに対する同族反応性、及び、各反応性に対する相対的なＴＣＲクローンサイズに対応する個別のＴ細胞を示す、ＴＣＲクロナリティーマップを示す。各点は、シングルセルを表す。 固有の抗原（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭ；ｙ軸）でそれぞれ刺激した固有の生体サンプルから濃縮した個別のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞による、表現型及び機能的Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２７４－ＰＤＬ１、ＣＤ２７９－ＰＤ１、ＣＤ１２７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８／ＩＣＯＳ、ＣＤ１９７／ＣＣＲ７）の、相対的タンパク質発現レベルを示し、個別細胞は点により表され、図７に示すＲＮＡトランスクリプトーム分析に従いクラスター化される。 固有の抗原（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭ；ｙ軸）でそれぞれ刺激した固有の生体サンプルから濃縮した個別のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞による、表現型及び機能的Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２７４－ＰＤＬ１、ＣＤ２７９－ＰＤ１、ＣＤ１２７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８／ＩＣＯＳ、ＣＤ１９７／ＣＣＲ７）の、相対的タンパク質発現レベルを示し、個別細胞は点により表され、図７に示すＲＮＡトランスクリプトーム分析に従いクラスター化される。 それぞれが点により表される、各細胞による、これらの同一の表現型及び機能的Ｔ細胞マーカーの、対応するＲＮＡｓｅｑ転写物発現レベルを示す。 それぞれが点により表される、各細胞による、これらの同一の表現型及び機能的Ｔ細胞マーカーの、対応するＲＮＡｓｅｑ転写物発現レベルを示す。 ＨＴＯ－１、ＨＴＯ－２、ＨＴＯ－３、ＨＴＯ－４、またはＨＴＯ－５により識別した固有のＨＰＶ抗原で刺激した固有の生体サンプルから濃縮した、個別のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞のＨＴＯ識別（１～５）に基づく、５つの固有のクラスターを示す。各クラスターを、数とグレースケールグラデーションの両方で識別する。クラスター「Ｍ」は、複数のＨＴＯで識別した個別の細胞である。各点は、個別の細胞を表す。 図９Ａのクラスターマップを複製し、ＨＴＯクラスターにまたがり共有されていないＴＣＲクローンを表す、例えば、ＨＴＯにより識別された固有の抗原に対して特異的なＴＣＲを発現する細胞を示す。同一クローンの細胞を、同じグレースケール着色で表す。 個別の細胞による、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３の相対的なＲＮＡ発現レベルを示す、図９Ａ～Ｂのクラスターマップの複製を示す。これらの細胞による、ＣＤ１３７／４－１ＢＢタンパク質発現（ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ）もまた示す。
従来のフローサイトメトリー分析をバイパスするための方法として、オリゴヌクレオチド（オリゴ）タグ抗体を開発した。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１８１４４８１３を参照されたい。このようなオリゴタグ抗体を、生きた細胞の表面でタンパク質を結合させるためのツールとして使用し、シングルセルＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ ＳＥＱ）実験に対するシングルセル追跡を補助することができる。Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ（２０１７） ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている（（２０１８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：２２４でもまた出版されている）方法は、全ての標的細胞で発現する単一タンパク質特異性、加えて、サンプル当たりで固有の配列を有する固有のオリゴヌクレオチドタグ（ハッシュタグオリゴヌクレオチドまたはＨＴＯとも呼ばれる）を有するオリゴタグ抗体を用い、配列決定ライブラリー調製のために最終的にプールした個別のサンプルを追跡する。本方法では、各細胞を、細胞が由来するサンプルを識別する独自のオリゴヌクレオチド配列でタグ付けすることができる。このオリゴヌクレオチド配列を検出し、配列決定ライブラリーに含めることで、サンプルの同一性を、得られる配列決定情報から測定することができる。従来、細分化抗体を使用して複数のサンプルを、１個のシングルセル配列決定（ｓｃＳＥＱ）ライブラリー調製にプールする、例えば、サンプルを多重化し、データを正規化して効率を改善する。
例えば、特性決定特異的なＴ細胞応答のために、機能アッセイでＨＴＯを用いることが以前に記載されており、ここでは、ＨＴＯが、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の多量体にコンジュゲートされる（例えば、Ｂｅｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：１０３７－４５を参照されたい）。ＭＨＣは抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、ペプチドを認識するＴ細胞に対してペプチドを提示する。独断的には、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＭＨＣ Ｉと対形成する一方で、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＭＨＣ ＩＩと対形成する。また、ＭＨＣの極度の多型により、どの対立遺伝子が、Ｔ細胞自身で認識されるのかを知るのに重要となり、これにより、あらゆる応答が、ペプチド自身の提示によるものであり、外来のＭＨＣの提示によるものではないと言うことができるようになる。したがって、抗原特異的Ｔ細胞を効果的に刺激し、ペプチド特異的なＴ細胞応答を特性決定することを可能にするために、ペプチドは、対応するＴ細胞に対して、クラス及びハプロタイプが一致するＭＨＣにおいて提示されなければならない。
以前は、ペプチド特異的なＴ細胞応答は、増殖アッセイ、クロムベースの細胞毒性アッセイ、Ｃａ２＋フラックスアッセイなどの機能アッセイ、ならびに、より一般的には、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカインフローサイトメトリー染色などのサイトカイン検出アッセイにより特性決定されていた。このようなアッセイの多重化については、Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４１５６１で記載されている。しかし、これらの機能アッセイは、抗原特異性を詳述することができるわけでも、シングルセルレベルで応答を特性決定することができるわけでもないという点で制限されていた。これらの制限のいくつかは、フローサイトメトリーＭＨＣ四量体染色により克服された。フローサイトメトリーＭＨＣ四量体染色を用いると、特異的Ｔ細胞応答を、対象となるペプチドでロードした、フルオロフォアコンジュゲートＭＨＣ多量体で評価することができる。対象となるペプチドでロードしたＭＨＣ多量体に、特異的に結合し、これによって活性化される可能性が高い、Ｔ細胞の識別は、蛍光性ＭＨＣ多量体、及び場合によっては他の抗体に結合した、これらの細胞をソートすることにより実現した。蛍光標識ＭＨＣ多量体から、ＨＴＯコンジュゲートＭＨＣ多量体への遷移により、活性化Ｔ細胞を特性決定するのに利用可能な、少数の蛍光タグの限定因子が取り除かれる。加えて、細分化抗体と同様に、細分化ＭＨＣ多量体は、配列分析のためにプールした個別のサンプルを追跡するのに有用であり、これにより、ＨＴＯ配列が検出されて配列決定ライブラリーに含まれ、分析されているＴ細胞に結合したＭＨＣ／ペプチドの組み合わせが識別される。しかし、上述した、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ（２０１７） ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている（（２０１８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：２２４でもまた出版されている）方法とは異なり、ＨＴＯコンジュゲートＭＨＣ多量体を用いることにより、このような使用が、機能分析、例えば、特異的Ｔ細胞に結合可能なＭＨＣ／ペプチドの組み合わせの識別もまたもたらすという点で、サンプルの追跡を超えるものがもたらされる。
シングルセルレベルで抗原特異的Ｔ細胞応答を追跡するための機能アッセイを、本明細書で記載するが、当該機能アッセイは、ＭＨＣ多量体の使用を必要としない（ただし、その使用を禁止するものでもない）。一般に、本明細書に記載の方法は、細分化分子を用いて、個別のアッセイウェルから、活性化Ｔ細胞を追跡する。全てのウェルの細胞が、例えば、それぞれ、細胞膜（例えば、１つ以上のオリゴタグ脂質）に組み込まれ得る、及び／または、１つ以上の遍在する細胞表面マーカー（例えば、１つ以上のオリゴタグ抗原結合タンパク質）に結合する、１つ以上のオリゴタグ分子で標識された後にのみ、異なる固有の培養液がプールされる。細胞がハッシュタグ化されると、その源及び同族抗原を決定することができ、サンプルを別個のまま維持する必要はない。プールした後、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）に対するフローサイトメトリー分析の機能アッセイを用いて、活性化されていないプールにおいて、これらの細胞から活性化された細胞をソートすることができる。
本明細書に記載する方法の、非限定的な例示的図解を、図１に図示する。この非限定的実施例に示すように、工程（１）において、固有の抗原、例えば固有のＴ細胞エピトープ（例えば、「１」、「２」、「３」）（タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、細胞、細胞溶解物などであってよい）、及び／または、単独の刺激、または刺激のプールを、複数の生体サンプルのうちの１個を含む個別ウェルのそれぞれに添加し、ここで、複数の生体サンプルのそれぞれは、Ｔ細胞、及び、当該Ｔ細胞により認識されるＭＨＣを含み、例えば、複数のサンプルのそれぞれは、自己由来の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含む。生体サンプルを、活性化Ｔ細胞により、活性化誘発マーカーを上方制御するのに十分な時間（例えば、６～７２時間）、固有の抗原で培養する。いくつかの非限定的な例示的実施形態では、抗原による、生体サンプルの一晩のみの培養（例えば、約１８～２４時間）が、例えば、活性化Ｔ細胞の再刺激の間に、活性化Ｔ細胞によるＡＩＭの上方制御のために必要である。いくつかの非限定的実施形態では、生体サンプルをまず、例えば約１または２週間、例えば、約７～１４日間、抗原でプライミングして、一晩の再刺激培養の前に、反応性Ｔ細胞の予増殖を可能にする。再刺激に続き、工程（２）では、各個別の細胞を、細胞膜に組み込まれ、及び／または、活性化状態に関係なく、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカー（例えば、β２マイクログロブリン、ＣＤ２、ＣＤ２９８、ＣＤ３、ＣＤ４、及び／またはＣＤ８など）に特異的に結合する分子（例えば脂質、抗体など）にコンジュゲートした、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）でインキュベートし、ここで、各固有のＨＴＯ（例えば、「１」、「２」、「３」は、各個別のウェルで固有の抗原を識別する。工程（３）では、固有の生体サンプル全てを多重化、例えばプールし、プールした後で、工程（４）では、固有の生体サンプルのプールを含む組成物を、活性化Ｔ細胞（例えばＣＤ１３７／４－１ＢＢ）、ならびに、所望により、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体、蛍光タグ抗体、及びオリゴヌクレオチドタグ多量体を含むがこれらに限定されない、他のシングルセル配列決定及びフローサイトメトリー試薬により発現される、活性化誘発マーカーを検出するのに有用な剤でインキュベートした。図１で示す非限定的実施形態は、プールした後に、これらの追加の試薬を添加することを示すが、他の非限定的実施形態では、これらの追加の試薬は、プールする前に添加してよい。工程（５）では、活性化誘発マーカーを検出するのに有用な剤で標識した細胞、例えば、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識抗体、及び、別のＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞）が、ＡＩＭ蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により機能的に濃縮される。工程（６）では、濃縮細胞のそれぞれのトランスクリプトームを次に分析し、例えば、ソートした細胞の集団を、１０Ｘゲノム解析シングルセルＧｅｌ Ｂｅａｄ－Ｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ（ＧＥＭＳ）に封入して、細胞をシングルセルに分画し、ＲＮＡ配列決定を各細胞で行う。図１に示す非限定的実施形態では、ＨＴＯ用の５’配列決定ライブラリー、トランスクリプトーム（５’ｍＲＮＡ）、ＴＣＲ－ｓｅｑ、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、及び／またはオリゴ多量体を、工程（６）でのハイスループットシングルセル配列決定のために生成する。工程（７）では、個別のＨＴＯクラスターを、生命情報科学的に逆多重化し、どの抗原に、個別の細胞が曝露されたのかを明らかにした。
記載した機能アッセイは、多くのベネフィットをもたらす。例えば、本明細書に記載の方法は、例えば、自己由来のＴ細胞及びＭＨＣを用いることにより、完全にパーソナライズすることができる。加えて、本明細書に記載の方法により、試験される生体サンプルが制限される場合であっても、多くの反応性の同時調査が可能となる。同族抗原／Ｔ細胞反応性は、シングルセルに対して、または、プールした細胞レベルで識別することができる。ＭＨＣ特異的でない試薬を用いることにより、患者サンプルにまたがる方法の柔軟な適用が可能になり、加えて、ＭＨＣ非限定的方法における情報、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞情報の両方の補足能力を、同時に捕捉することが可能となり、機能的表現型（例えば、活性化誘発マーカー）を用いることにより、活性化Ｔ細胞のみを識別し評価するのに役立つ。加えて、本明細書に記載の方法は、パーソナライズした治療法の開発及び／または決定を知らせ得る、迅速かつコストパフォーマンスの高い方法で、活性化Ｔ細胞の表現型及びトランスクリプトームを評価する、次の開発段階にある方法と適合性がある。この方法では、治療法（ワクチン、免疫療法など）に対する免疫応答、例えば、ワクチンコード抗原、ウイルス性抗原、及び／または腫瘍抗原に対するＴ細胞反応性を評価することができる。同様に、自己免疫反応性、例えば、自己抗原に対するＴ細胞反応性の免疫監視もまた、アッセイすることができる。本明細書に記載の方法は、例えば、対象となる多数の抗原にまたがる対象となるＴＣＲ、及び／または、ＴＣＲ：エピトープの結合発見及びアルゴリズム生成をスクリーニングするための、ＴＣＲの発見、及び治療法の開発のために、有用であることができる。例えば、本明細書に記載の方法により提供される、エピトープ：ＴＣＲ配列データの複雑性は、特異的ＨＬＡ－ペプチド結合と関連する、ＴＣＲ配列（複数可）及び／または構造的特徴に関する、ハプロタイプ特異的な規則を発見するのに有用であり得る。
したがって、以下の工程の１つ以上：
Ｔ細胞及びＭＨＣを含む生体サンプルを細分化すること、例えば、生体サンプルを固有の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）及び固有のバーコード（例えば、ハッシュタグオリゴヌクレオチド）でインキュベートして、固有の生体サンプルを形成する工程と、
複数の固有の生体サンプルをプールする工程と、
機能アッセイに基づき、活性化Ｔ細胞のために濃縮する工程（例えば、蛍光標識抗体で、活性化誘発マーカー、例えば、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴに対して、ＡＩＭをソートすること）と、
配列決定方法、ならびに任意選択的に、他の周知の方法（例えば、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析、フローサイトメトリー分析、及び／または多量体染色）を、活性化細胞、例えばシングルセルベースで行い、（ａ）活性化Ｔ細胞の固有のバーコード、及び故に、Ｔ細胞を活性化した抗原、ならびに、任意選択的に、（ｂ）例えば、治療開発のための、例えば、活性化Ｔ細胞のＴＣＲα及びβ配列を識別するのに有用であり得る、他の配列を識別する工程と、
を含む方法を本明細書で記載する。
定義
別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
文脈で明確に別様が示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数形を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、及び／または本明細書に記載する種類の工程を含み、及び／または、本開示を読解するにあたり、当業者に明らかとなろう。
用語「約」または「およそ」は、ある値の有意義な範囲内にあることを含む。用語「約」または「およそ」により包含される、許容可能なバリエーションは、研究されている特定のシステムに応じて変化し、当業者により速やかに理解されることができる。
Ｔ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連する抗原提示細胞の表面の小抗原決定基でエピトープに結合する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の表面で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を通してこれらのエピトープに結合する。Ｔ細胞受容体は、２種類の鎖：α（アルファ）及びβ（ベータ）鎖、またはγ（ガンマ）及びδ（デルタ）で構成されるヘテロ二量体構造である。α鎖は、ヒト染色体１４のα座位内に位置する核酸配列によりコードされ、当該染色体は、全δ座位もまた含み、β鎖は、ヒト染色体７のβ座位内に位置する核酸配列によりコードされる。大多数のＴ細胞は、αβＴＣＲを有する一方で、少数のＴ細胞は、γδＴＣＲを有する。α及びβ鎖は共通して本明細書で言及されるものの、本明細書に記載する方法、組成物、及び／またはキットは、γδＴＣＲ鎖にも同様に適用され得る。
Ｔ細胞受容体α及びβポリペプチド（ならびに、同様にγ及びδポリペプチド）は、ジスルフィド結合を介して互いに結合する。ＴＣＲを作製する２つのポリペプチドはそれぞれ、定常領域及び可変領域を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに、細胞質テールを含有する（膜貫通ドメイン及び細胞質テールは、定常領域の一部でもある）。ＴＣＲの可変領域は、その抗原特異性を決定し、免疫グロブリンと同様に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。また、免疫グロブリン遺伝子と同様に、Ｔ細胞受容体可変遺伝子座位（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβ座位）は、多数の非再配列Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント（可変（Ｖ）、結合（Ｊ）、ならびに、ＴＣＲβ及びδ、多様性（Ｄ）セグメント）を含有する。胸腺でのＴ細胞成長の間に、ＴＣＲα可変遺伝子座位は、得られるＴＣＲα可変ドメインが、ＶＪセグメントの特定の組み合わせ（Ｖα／Ｊα配列）によりコードされるように転位を受け、ＴＣＲβ可変遺伝子座位は、得られるＴＣＲβ可変ドメインが、ＶＤＪセグメントの特定の組み合わせ（Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列）によりコードされるように転位を受ける。ＴＣＲα及びβ可変ドメイン、特に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、より具体的にはＣＤＲ３は、ＴＣＲがＭＨＣに結合する特異性をもたらす。
用語「主要組織適合性複合体」及び「ＭＨＣ」は、用語「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」（一般に、後者２つが、ヒトＭＨＣに対して保存される）、自然に存在するＭＨＣ、ＭＨＣの個別鎖（例えば、ＭＨＣクラスＩα（重）鎖、β２マイクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩ α鎖、及びＭＨＣクラスＩＩ β鎖）、ＭＨＣのこのような鎖の個別のサブユニット（例えば、ＭＨＣクラスＩ α差のα１、α２、及び／またはα３サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩ α鎖のα１～α２サブユニット、ＭＨＣクラスＩＩ β鎖のβ１～β２サブユニット）、加えて、部分（例えば、ペプチド結合部分、例えばペプチド結合溝）、これらの変異体及び様々な誘導体（融合タンパク質を含む）を包含し、このような部分、変異体、及び誘導体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば抗原特異的ＴＣＲによる認識に対して、抗原ペプチドを提示する能力を保持する。ＭＨＣ Ｉは、約８～１０個のアミノ酸のペプチドを収容可能なα重鎖の、α１及びα２ドメインにより形成されるペプチド結合溝を含む。両方のクラスのＭＨＣが、ペプチド内の約９個のアミノ酸（例えば、約５～１７個のアミノ酸）のコアに結合するという事実にもかかわらず、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝（クラスＩＩ ＭＨＣβポリペプチドのβ１ドメインと関連した、クラスＩＩ ＭＨＣαポリペプチドのα１ドメイン）のオープンエンドの性質により、広範囲のペプチド長が可能になる。１３～１７アミノ酸長で、ペプチド結合ＭＨＣクラスＩＩは通常変化するものの、より短い、または長い長さは、珍しいわけではない。結果的に、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝内で移動し得、任意の所与の時間において、溝内で９量体が直接存在する場所が変化する。
用語「抗原」は、導入されたときに、免疫応答性宿主が宿主の免疫系により認識され、宿主により免疫応答が誘発される、任意の剤（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、ヌクレオチド、これらの一部、またはこれらの組み合わせ）を包含する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、免疫シナプスの一部として、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の文脈で提示されるペプチドを認識する。ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体は、相互作用の特異性を伴う、ペプチド（抗原決定基）及びＴＣＲイディオタイプにより、ＴＣＲにより認識される。したがって、用語「抗原」は、ＭＨＣ、例えばペプチド－ＭＨＣ複合体、例えばｐＭＨＣ複合体の文脈で提示されるペプチドを包含する。ＭＨＣに提示されるペプチドは、「エピトープ」、または「抗原決定基」ともまた呼ばれることができる。用語「ペプチド」、「抗原決定基」、「エピトープ」などが包含するのは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により自然に提示されるものだけではなく、Ｔ細胞に適切に提示されるときに、Ｔ細胞により認識されるのであれば、任意の所望のペプチドであってよい。例えば、人工的に調製したアミノ酸配列を有するペプチドもまた、エピトープとして使用してよい。
同族ｐＭＨＣとのＴＣＲエンゲージメントは一般に、期間が短いが、この相互作用は、単一の骨格、例えば表面で、複数のｐＭＨＣを組み込むこと、例えば、多量体、例えば四量体、デキストラマーなどを用いることにより得られる「結合活性効果」により安定され得る。様々なｐＭＨＣ多量体化プラットホームが利用されてきており、これらの多くは市販されている。例えば、Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１４７－６４を参照されたい。このような結合活性効果に適応するために、いくつかの実施形態では、本明細書のＭＨＣは、好ましくは、表面に結合し、これにより、ＭＨＣの適切な密度が実現され得る。
ＭＨＣが、本明細書にて開示した非限定的な実施形態で結合し得る、非限定的な例示的表面としては、
ａ 例えば、ＭＨＣが抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単核細胞、マクロファージ、及びＢ細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）の表面、リポソームの表面、ウイルスベクターのエンベロープ膜などで発現する、細胞膜、
ｂ ビーズ、
ｃ 細胞培養皿、例えばマルチウェルプレートのウェル、ならびに、
ｄ 多量体、例えば四量体、デキストラマーなど
が挙げられる。
抗原は、合成ペプチド、タンパク質、ｍＲＮＡ、ウイルス、ウイルスベクター、ＤＮＡ、生細胞、細胞溶解物などを含み得る。いくつかの非限定的実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原であり、そのペプチド部分を含む。このような実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ－由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、トンプソン－ヌーベル抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、ＷＴ１からなる群から選択することができる。
別の実施形態では、抗原は、感染症と関連し得る。このような実施形態では、例えば、生体サンプルは、病原菌、またはこれに由来するエピトープを添加することで、固有の生体サンプルになることができる。このような一実施形態では、感染症関連抗原はウイルス性抗原であり得、ウイルス性抗原は、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、エボラウイルス、及び、アルボウイルス脳炎ウイルス抗原からなる群から選択される。このような別の実施形態では、感染症と関連する抗原は、細菌抗原であり得、細菌抗原は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及び、ライム病細菌抗原からなる群から選択される。
本明細書に記載の方法で使用する用語「生体サンプル」とは、生物学的に活性な細胞、生物学的に活性な細胞の活性化因子、ならびに任意選択的に、細胞の生存能、及び／または生物学的活性化、例えば細胞の活性を支持する培地を含む培養物を意味する。生物学的に活性な細胞は、細胞、例えば、特定の種類の単離細胞（例えばＴ細胞）の均質な集団、または、異なる細胞型の混合物（例えば、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞の共培養物、樹状細胞（ＤＣ）とＴ細胞の共培養物など）であってよく、これらは、対象、例えばヒトまたは哺乳類または他の種の対象から単離した、生物学的流体または組織から単離することができるか、または、これを含むことができる。生物学的流体または組織としては、非限定例として、血清、血漿、全血、末梢血、唾液、尿、膣もしくは頸部分泌液、羊水、胎盤液、脳脊髄液、漿液流体、または粘膜分泌物（例えば頬、膣、もしくは直腸）を挙げることができる。さらに他のサンプルとしては、血液由来または生検由来の生体サンプルまたは組織、例えば、腫瘍浸潤リンパ球を含む組織（例えば腫瘍）、硬結などが挙げられる。
本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、Ｔ細胞、及び、抗原を提示する表面結合ＭＨＣ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み、例えば、生物学的に活性な細胞はＴ細胞であり、活性化因子は、抗原を提示する表面結合ＭＨＣ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）である。本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、Ｔ細胞、抗原を提示する表面結合ＭＨＣ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）、ならびに、Ｔ細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持する１種以上のサイトカインを含み、例えば、生物学的に活性な細胞はＴ細胞であり、活性化因子は、抗原を提示する表面結合ＭＨＣ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）であり、培地は、Ｔ細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持する１種以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持するサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるインターロイキンを含む。本明細書で開示するいくつかの非限定的生体サンプルは、Ｔ細胞、及び、抗原を提示する表面結合ＭＨＣを含み、ＭＨＣは、抗原提示細胞、例えば体細胞の表面で発現し、抗原提示細胞は任意選択的に、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、及びＢ細胞からなる群から選択されるプロフェッショナル抗原提示細胞であってよい。Ｔ細胞、及び、抗原を提示する表面結合ＭＨＣを含み、ＭＨＣが抗原提示細胞の表面で発現する、これらの非限定的な生体サンプルは、任意選択的に、Ｔ細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持するサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１）、及び／または、抗原提示細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持するサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及び／またはＩＬ－４）をさらに含むことができる。Ｔ細胞及び／または抗原提示細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持するのに有用な、さらなるサイトカイン、またはサイトカインの組み合わせ（ならびに、Ｔ細胞及び／または抗原提示細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持するための、当該細胞の量）は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣを活性化するさらなる因子、例えば、ＩＦＮα、ＬＰＳ、ポリ－ＩＣ、ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＰＧＥ２などが、細胞の生存能を支持する培地に含まれる。
生体サンプルは多くの場合、特定の源、対象、または患者から入手されるか、またはこれらに由来する。
「個体」または「対象」または「動物」とは、ヒト、獣医学動物（例えばネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）、及び、疾患の実験動物モデル（例えばマウス、ラット）を意味する。一実施形態では、対象はヒトである。
本明細書の非限定的な実施形態では、生体サンプルは、対象に由来する末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含む。本明細書に記載する生体サンプルは、新規に単離したＰＢＭＣ、凍結保存した、新しく解凍したＰＢＭＣ、または、抗原の存在下で約１週間プライミング、例えば培養し、記憶反応性が拡大し、アッセイシグナルが増加したＰＢＭＣを含むことができる。
一般に、本明細書に記載する生体サンプル（例えば、固有の生体サンプル）は、抗原に応答して、Ｔ細胞の活性化を支持するのに十分な数のＴ細胞及び表面結合ＭＨＣ、例えば、少なくとも１×１０５、５×１０５、１×１０６個、またはそれ以上の全末梢血単核球細胞を含む。１ｍＬの全（ヒト）血液が、どの箇所においても、５×１０５～３×１０６個の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含み得、及び／または、どの箇所においても５×１０３～５×１０５個のＡＰＣ（例えば樹状細胞）、及び、どの箇所においても５×１０３～５×１０６個のＴ細胞を単離するために使用され得るため、細分化と多重化の組み合わせにより、少ない血液量サンプル、例えば、少量のヒト血液サンプルで実施される、本明細書に記載の方法が有利にもたらされる。非限定的実施例として、対象から単離した１０ｍＬの全血に由来する細胞の集まりは、どの箇所においても、５×１０６～３×１０７個のＰＢＭＣを含み得、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプル、例えば、それぞれが、約１×１０５～１×１０６個のＰＢＭＣ、及び／または、１×１０５～５×１０５個のＤＣ、及び１×１０５～５×１０６個のＴ細胞などを含む、少なくとも２０個の生体サンプルに等しく分配され得、これを次に（それぞれに、固有の抗原及び／または固有のＨＴＯを添加した後で）プールし、本明細書に記載する方法に従ってアッセイすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含み、細胞の集まりが複数の生体サンプルに等しく分配され得るいくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも２つの個別の生物学的サンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも３つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも５つの個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも１０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも２０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも３０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＰＢＭＣを含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれ、少なくとも約１×１０５個のＰＢＭＣ、少なくとも約５×１０５個のＰＢＭＣ、または少なくとも約１×１０６個のＰＢＭＣを含む、少なくとも５０個の個別のサンプルに等しく分配されることができる。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約１ｍＬ、約３ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、十分な数のＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を含み、これにより、細胞の集まりが、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。いくつかの実施形態では、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した十分な数のＡＰＣ及びＴ細胞を含み、これにより、細胞の集まりが、それぞれが約１：１、約１：５、または約１：１０のＡＰＣ：Ｔ細胞の比でＡＰＣ及びＴ細胞（例えば、ＤＣ及びＴ細胞）を含む、複数の個別の生体サンプルに等しく分配され得る。例えば、各サンプルは、少なくとも約５×１０３、５×１０４、または５×１０５個のＤＣ、及び、約５×１０３、１×１０４、２．５×１０４、５×１０４、１×１０６、２．５×１０５、５×１０５、１×１０６、２．５×１０６、または５×１０６個のＴ細胞を含む。例えば、細胞の集まりは、対象、例えばヒト対象から単離した、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、または約５０ｍＬの全血に由来することができる。
対象から単離した生体サンプルを、生理食塩水、緩衝液、または、生理学的に許容できる希釈剤でさらに希釈してよい。あるいは、対象由来の生体サンプルを、従来の方法により濃縮することができる。対象から単離した生体サンプルは、２つ以上のアリコートに分割して、「複数の生体サンプル」を形成することもまた可能であり、複数の生体サンプルのそれぞれは、およそ同じ数の、生物学的に活性な細胞（例えばＴ細胞）、及び、およそ同じ量の支持試薬を含む。したがって、別途記載のない限り本明細書で使用する場合、「複数の生体サンプル」とは、生物学的に活性な細胞の複数の異なる集団を意味し、生物学的に活性な細胞の各集団は、同一の対象から単離され、およそ同じ数の生物学的に活性な細胞を含み、類似する培養条件、例えば、生物学的に活性な細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持する支持試薬と共に、維持される。
本発明のいくつかの実施形態では、生体サンプルは、約１週間（例えば、約７～１０日）、抗原でインキュベーションすることにより、エクスビボでプライミング、例えば予増殖され、その後、約１～３日（例えば、６～７２時間、例えば１８～２４時間）、抗原でインビトロにて再刺激された後、固有の生体サンプルの細分化、濃縮、及び／または分析が行われる。本発明のいくつかの実施形態では、生体サンプルは、抗原でのインビトロ再刺激の前に、エクスビボでプライミングされず、その後、生体サンプルの細分化、固有の生体サンプルの濃縮、及び／または分析が行われる。エクスビボでのプライミングは一般に、インビボでの間に抗原に出くわし得ない生体サンプルには必要ない。生体サンプルに対するタイミング（例えば、プライミングは７～１０日間、及び、再刺激は６～７２時間、例えば１８～２４時間）、Ｔ細胞を含む生体サンプルに対するタイミングを含む、プライミング及び再刺激手順は、当該技術分野において周知である。
いくつかの非限定的実施形態では、自身の固有の刺激、もしくは固有の刺激の組み合わせ（例えば、抗原、もしくは抗原のプール（例えばＴ細胞エピトープ））、及び／または、多重化、及び任意選択的な多重化のための、自身の固有のバーコード、例えば（ハッシュタグオリゴヌクレオチド）でインキュベートされることにより、複数の生体サンプルのそれぞれが、固有の生体サンプルとなる。
本明細書で使用する場合、「ハッシュタグ化」、「細分化」、「タグ化」などは、固有の生体サンプルの生物学的に活性な細胞を、固有のバーコードにコンジュゲートした分子、例えば固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）と接触させることを含み、固有のバーコードが、固有の生体サンプル、例えば固有の抗原（例えば、固有のＴ細胞エピトープ）の固有の特徴、または固有の抗原の欠落を識別し、生物学的に活性な細胞の活性化状態に関係なく、分子が、生物学的に活性な細胞により発現した細胞表面マーカーの細胞膜に組み込まれ、及び／または、当該細胞表面マーカーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＨＴＯ分子は、あらゆる細胞、例えば、あらゆる分裂細胞に組み込まれ得、及び／または、大部分、もしくはあらゆる細胞により発現される細胞表面マーカー（例えば、βマイクログロブリン、ＣＤ２９８）に結合する。いくつかの実施形態では、選択される細胞マーカーは、活性化状態に関係なく、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、及び／またはＣＤ８など）により発現される。細胞をＨＴＯで、２つ以上の異なる方法で標識する２つ以上の分子（例えば、一方の分子は、自身を細胞膜に組み込み得る一方で、他方はマーカーに結合し、２つ以上の分子が２つ以上の異なるマーカーに結合し得る）が、それぞれＨＴＯにコンジュゲートされ、それぞれがハッシュタグ化法で用いられ、同一の固有の生体サンプルをタグ化する、いくつかの実施形態では、２つ以上の分子は、同一のバーコードを含み得る。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルをハッシュタグ化するために使用する２つ以上のマーカーは、同一の、または異なるマーカーであってよい。いくつかの実施形態では、第１の固有の生体マーカーを、第１の固有のバーコード（例えば第１のＨＴＯ）にコンジュゲートした第１の分子でタグ化してよく、第２の固有の生体サンプルを、第２の固有のバーコード（例えば第２のＨＴＯ）でコンジュゲートした第２の分子でタグ化し、第３の生体サンプルを、第３のバーコード（例えば第３のバーコード）にコンジュゲートした第３の分子でタグ化し、第１、第２、及び第３の分子はそれぞれ同一であり、例えば、それぞれが自身を細胞膜に組み込むか、または、それぞれが同一のマーカーに特異的に結合するものの、第１、第２、及び第３の分子のそれぞれは、第１、第２、及び第３の分子のそれぞれが区別され得るほど十分に異なる固有のバーコードを含む。ハッシュタグ化により、同一のサンプルに由来するサンプル及び試薬のそれぞれの、後での検出、追跡、及び／または定量化が可能となるため、未結合の分子を洗浄した後、固有に細分化した固有の生体サンプルをプールし、抗原特異的活性化Ｔ細胞のさらなる機能及び表現型分析（例えば、フローサイトメトリー分析、及び／または、蛍光細胞活性化ソーティング、シングルセル配列分析など）のために、任意選択的に、さらなる試薬でインキュベートしてよい。
いくつかの非限定的な実施形態はさらに、本明細書に記載する方法の感度及び／またはロバスト性を向上させることができる。例えば、いくつかの非限定的な実施形態では、ｓｃＳＥＱサンプル当たりで、２０個の潜在的な反応性オリゴ細分化アッセイサンプルをプールすることにより、典型的には十分な濃縮が得られる。いくつかの実施形態では、コンビナトリアル細分化アプローチを用いることで、アッセイの感度が増加し得る。例えば、細胞をその反応性ＨＴＯで、２つ以上の異なる方法でそれぞれ標識する２つ以上の分子（例えば、一方の分子は、自身を細胞膜に組み込み得る一方で、他方はマーカーに結合し、２つ以上の分子が２つ以上の異なるマーカー（例えば、β２マイクログロブリン及びＣＤ２）に結合し得る）が、それぞれ同一のバーコード、例えば、同一の配列を含むＨＴＯにコンジュゲートされ、それぞれがハッシュタグ化法で用いられ、同一の固有の生体サンプルをタグ化する。
例えば、活性化誘発マーカーに、任意選択的に、及び、いくつかの非限定的な実施形態では好ましくは、結合する分子（例えば、抗体または他の巨大分子、例えば脂質）への、ハッシュタグオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションを含む、「ハッシュタグオリゴヌクレオチド」、「ＨＴＯ」などの生成及び使用は、周知である。例えば、それぞれの参考文献が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１８１４４８１３；Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９：２２４；ｖａｎ Ｂｕｇｇｅｎｕｍ ＪＡＧＬ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。一般に、ＨＴＯは、固有のバーコード、例えば、標準的なポリメラーゼ連鎖反応、例えば、細胞トランスクリプトームを配列決定するシングルセルＲＮＡ配列決定手順（例えば、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄ ９：２５７９－１０を参照されたい。）によって測定可能な固有の配列を含む核酸を含み、当該固有の配列は、本明細書に記載する実施形態では、例えば、生体サンプルに、活性化誘発マーカーを発現させる、単独の刺激、または刺激の組み合わせを識別する。生体サンプルを活性化するコンジュゲーションケミストリー、例えば、ｉＥＤＤＡクリックケミストリーを使用して、ハッシュタグオリゴヌクレオチドを分子、例えば、細胞表面マーカー（例えば、構造的に発現した細胞表面マーカー）に結合する配位子にコンジュゲートさせる、例えば共有的に付着させることができる。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、Ｔ細胞（例えば、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８）を含む、大部分の、またはあらゆる細胞により発現される。いくつかの実施形態では、選択される細胞マーカーは、活性化状態に関係なく、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、及び／またはＣＤ８など）により発現される。オリゴタグ抗体は本明細書に記載するものの、特に、シングルセル配列決定分析に基づくさらなる機能的及び／または表現型特性決定のために、脂質及び細胞透過核酸を組み込む、オリゴタグ細胞膜などの、抗体以外の他のオリゴタグ追跡分子を使用することができる。
これらの組成物及び方法で用いるハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）を、あらゆる自然に存在する、または合成生体または化学分子にコンジュゲートすることができ、これを用いて、細胞、例えば、細胞膜に組み込まれる脂質、及び／または、識別された単独のマーカーに特異的に結合するリガンドを標識することができる。結合は共有または非共有であってよい、即ち、コンジュゲートされるか、または、リガンド、及びその対応する標的の性質を考慮に入れ、任意の既知の手段によるものであってよい。用語「第１のＨＴＯ－コンジュゲート分子」、及び「さらなるＨＴＯ－コンジュゲート分子」、または「第２のＨＴＯ－コンジュゲート分子」などは、異なる方法で細胞を標識するＨＴＯ－コンジュゲート分子を意味し、例えば、ある分子は、自身を細胞膜に組み込むことができる一方で、第２の分子はマーカーに結合し、２つ以上の分子は、異なる標的、または標的の異なる部分に結合することができる。例えば、複数の「第１のＨＴＯ－コンジュゲート分子」は、同一部位で、細胞膜に組み込まれるか、または同一のマーカーに結合する。複数のさらなるＨＴＯ－コンジュゲート分子は、第１のＨＴＯ－コンジュゲート分子とは異なり、あらゆるさらなるＨＴＯ－コンジュゲート分子とは異なるマーカーに結合する。ＨＴＯ－コンジュゲート分子（例えば、第１のＨＴＯ－コンジュゲート分子、ならびに、さらなるＨＴＯ－コンジュゲート分子、例えば、第２、第３、第４、及び第５のＨＴＯ－コンジュゲート分子など）は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくは抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部）、抗体模倣物、アフィボディ、リボもしくはデオキシリボ核酸配列、アプタマー、脂質、コレステロール、多糖類、レクチン、または、複数の同一の、もしくは異なる分子で形成されるキメラ分子から独立して選択することができる。ＨＴＯ－コンジュゲート分子のさらなる非限定例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄａｂ）、シンボディ、ナノボディ、ＢｉＴＥ、ＳＭＩＰ、ＤＡＲＰｉｎ、ＤＮＬ、ドゥオカリン、アドネクチン、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚ Ｄｏｍａｉｎｓ Ａｌｂｕ－ｄａｂｓ、ＤＡＲＴｓ、ＤＶＤ－ＩＧ、Ｃｏｖｘボディ、ペプチボディ、ｓｃＦｖ－Ｉｇ、ＳＶＤ－Ｉｇ、ｄＡｂ－Ｉｇ、ノブ－イン－ホール、トリオームＡｂなど、またはこれらの組み合わせを含むものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＴＯにコンジュゲートした分子は、組み換え、または自然に存在するタンパク質である。特定の実施形態では、ＨＴＯにコンジュゲートした分子は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはその断片である。一実施形態では、ＨＴＯがコンジュゲートする分子は、自身が、周知の方法に従い、バーコード（例えばＨＴＯ）を測定または検出する方法とは無関係な方法で測定可能なフルオロフォアなどの１つ以上の検出可能な標識で直接標識されることもまた可能である。
いくつかの実施形態では、ＨＴＯ－コンジュゲート分子は、自身が細胞膜に組み込まれる脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＯ－コンジュゲート分子は、自身が細胞膜に組み込まれるコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＯ－コンジュゲート分子は、脂質及びコレステロール修飾オリゴヌクレオチド（ＬＭＯ及びＣＭＯ）を含む。例えば、その全体が参照により組み込まれているＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：６１９－２６を参照されたい。
抗原特異的活性化Ｔ細胞集団をさらに機能及び表現型分析するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、蛍光標識結合タンパク質（例えば抗体）またはＭＨＣ多量体を用いる蛍光細胞活性化ソーティング、及び／またはフローサイトメトリー分析、シングルセルＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、及び／または、配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞指数（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ）分析などが挙げられるが、これらに限定されない。「フローサイトメトリー」とは、流体に細胞または粒子を懸濁し、懸濁液をフローサイトメーターに注入することを含む方法包含し、これにより、サンプルを、レーザービームを通して一度に１個の細胞に理想的に流し、光散乱が、細胞及びその構成成分の特徴となる。蛍光標識で標識した細胞は、レーザー光線を吸収し、細胞を区別するために使用可能な波長のバンドで放出される。好ましい実施形態では、細分化及びプールの後、固有の生体サンプルを活性化Ｔ細胞に対して濃縮する、例えば、活性化誘発マーカーを発現する細胞に対してソートする。一実施形態では、細胞のあらゆるさらなる機能及び表現型分析の前に、または、これらと同時に、例えば、あらゆるさらなるフローサイトメトリー分析及び／またはシングルセル配列分析（ソートの前後に生体サンプルに添加された、あらゆるＣＩＴＥ－ｓｅｑ試薬のＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析を含み得る。）の前に、またはこれらと同時に、活性化誘発マーカーに対する蛍光標識抗体、及び、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞を活性化Ｔ細胞に対して濃縮する、例えばソートする。「ＣＩＴＥ－ｓｅｑ」とは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００１７） Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：８６５－８６８に記載されているように、例えば、シングルセル配列決定アプローチの間に、オリゴヌクレオチド標識分子、例えばオリゴヌクレオチド標識分子を用いて、サンプルのタンパク質発現レベルを測定する方法を包含する。いくつかの非限定的実施形態では、細胞のさらなる機能及び表現型分析は、細胞表面マーカー、例えば、活性化マーカー、または細胞内タンパク質、例えば細胞内サイトカインのタンパク質発現レベルを指示する、蛍光標識抗体によるフローサイトメトリー分析を含む。いくつかの非限定的実施形態では、細胞のさらなる機能及び表現型分析は、各活性化細胞の、シングルセルＲＮＡ配列決定を含む。シングルセルＲＮＡ配列決定のための、非限定的な例示的プラットホームとしては、プレートベースのアプローチ、またはマイクロフルイディクス／ナノウェルアプローチ、例えば、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ（Ｍａｃｏｓｋｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：１２０２－１４）、ＩｎＤｒｏｐ（Ｋｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１１８７－１２０１）、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１－１２）、及び、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）／ＢＩＯ－ＲＡＤシングルセル配列決定ソリューションなど（ただし、これらに限定されない）の、ドロップレットベースのマイクロフルイディクスアプローチが挙げられるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡの発現レベルは、細胞内でのタンパク質発現レベルと十分に相関しない場合があるため、いくつかの非限定的実施形態では、シングルセルＲＮＡ配列決定は、例えば、オリゴヌクレオチドタグ抗体、ＭＨＣ多量体などを用いて、ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ分析と組み合わせて行う（例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれているＷＯ２０１８１４４８１３を参照されたい）。
「活性化誘発マーカー」（ＡＩＭ）は、Ｔ細胞の活性化の後で、発現するマーカー、または、発現が上方制御されるマーカーである。Ｔ細胞用の周知の活性化誘発マーカーとしては、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化マーカー、例えば活性化誘発マーカーは、ＣＤ４０Ｌを含む。ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ１５４とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化マーカー、例えば活性化誘発マーカーは、ＣＤ１３７を含む。ＣＤ１３７は、本明細書では４－１ＢＢとも呼ばれる。したがって、ＣＤ１３７／４－１ＢＢは、ＣＤ１３７、４－１ＢＢなどの、当該技術分野において公知の分子を指し、語句「ＣＤ１３７」、「４－１ＢＢ」、及び「ＣＤ１３７／４－１ＢＢ」は、同じ意味で用いることができる。ＣＤ１３７／４－１ＢＢは、抗原特異的ＴＣＲエンゲージメントの際に速やかに上方制御される、一過性のＴ細胞活性化マーカーであり、およそ７２時間、細胞で発現したままとなる。本明細書に記載する方法では、抗原への曝露後、２０～３６時間が、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ発現及び検出の機能的濃縮の、最適な時点のようである。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＣＤ１０７を含む。ＣＤ１０７は、ＣＤ１０７ａまたはＬＡＭＰ１とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を含み、これは、ガンマインターフェロン、ＩＦＮＧ、ＩＦＧなどともまた呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーはＰＤ－１を含み、これは、プログラム細胞死１、ＣＤ２７９、及びＨＰＤ－１とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４を含み、これは、ＯＸ４０及び／またはＣＤ１３４ともまた呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、インターロイキン－２受容体αを含み、これは、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－２Ｒα、及び／またはＣＤ２５とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＣＤ６９を含み、これは、白血球表面抗原Ｌｅｕ－２３及び／またはＭＬＲ３とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＣＤ２８を含み、これは、Ｔｐ４４及び／またはＴ細胞特異的表面糖タンパク質とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、主要組織適合性複合体クラスＩＩ ＤＲを含み、これは、ＨＬＡ－ＤＲとも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＣＸＣモチーフケモカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１）を含み、これは、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－８Ｒα、及び／またはＣＤｗ１２８ａとも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＴＩＭ３を含み、これは、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２、Ｔ細胞膜タンパク質３、及び／またはＣＤ３６６とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）を含み、これは、ＣＤ２２３とも呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）を含み、これは、Ｖ－ｓｅｔ及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質９（ＶＳＩＧ９）、及び／または、Ｖ－ｓｅｔ及び／または膜貫通ドメイン含有３（ＶＳＴＭ３）とも呼ぶことができる。
用語「免疫グロブリン」、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、「結合タンパク質」などは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、イントラボディ、ミニボディ、ダイアボディ及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗原特異的ＴＣＲに対する、抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに、上述のいずれかのエピトープ結合断片を意味する。用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２００７０００４９０９号に開示されているものなどの共有ダイアボディ、及び、その全体が本明細書に参照により組み込まれている同第２００９００６０９１０号に開示されているものなどのＩｇ－ＤＡＲＴＳもまた意味する。
本明細書で使用する場合、用語「検出可能な標識」とは、用いるアッセイフォーマットに応じて、検出可能なシグナルを提供可能な試薬、部分、または化合物を意味する。標識は、分子のみと、及び／または、固有のバーコード（例えば固有のＨＴＯ）、もしくはその機能的部分と関連し得る。あるいは、異なる標識を、ＨＴＯコンジュゲート分子の各構成成分に対して使用することができる。このような標識は、単独で、または、他の組成物もしくは化合物と組み合わせて、検出可能なシグナルを提供することができる。一実施形態では、標識は相互作用的し、検出可能なシグナルを提供することができる。特定の一実施形態では、標識は目視により、例えば、比色分析により検出可能である。様々な酵素系が、アッセイで比色分析シグナルを明らかにするために作動する。例えば、（グルコースを基質として用いる）グルコースオキシダーゼが、ペルオキシドを、ペルオキシダーゼ、及び、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの水素ドナーの存在下で、青色に見える酸化ＴＭＢを産生する生成物として放出する。他の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ならびに、ＡＴＰ、グルコース、及びＮＡＤ＋と相互作用し、他の生成物の中でもとりわけ、３４０ｎｍの波長で吸光度が増加して検出されるＮＡＤＨを得る、グルコース－６リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせたヘキソキナーゼを含む。記載した方法及び分子で利用可能な、さらに他の標識系は、他の手段により検出可能である。例えば、染料が埋め込まれる有色ラテックス微小粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を酵素の代わりに使用し、適用可能なアッセイにて、標識した分子の存在を示す視覚シグナルをもたらすことができる。さらに他の標識としては、蛍光性化合物、フルオロフォア、放射性化合物または元素が挙げられる。一実施形態では、蛍光検出可能な蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィリコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン－０（ＣＰＯ）またはタンデム染料、ＰＥ－シアニン－５または７（ＰＣ５またはＰＣ７）、ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＥＣＤ）、ＰＥ－シアニン－５．５、ローダミン、ＰｅｒＣＰ、及びＡｌｅｘａ染料。とりわけ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄとローダミン、ＦＩＴＣ＋ＰＥ、ＦＩＴＣ＋ＰＥＣｙ５、及びＰＥ＋ＰＥＣｙ７などの、このような標識の組み合わせを、アッセイ法に応じて使用することができる。分子、及び／またはポリマー分子の任意の構成成分を標識するのに用いるための好適な標識の選択及び／または生成は、本明細書を考慮すると、当該技術分野の範囲内である。
用語「に特異的に結合する」、「特異的な様式で結合する」などは、特異的結合に関与する分子が、（１）生理的条件下で、安定的に結合する、例えば会合する、例えば分子間非共有結合を形成可能であり、かつ、（２）生理的条件下で、特定の結合ペア以外の他の分子に結合不可能であることを示す。
用語「タンパク質」とは、糖タンパク質、加えて、あらゆる他の種類の修飾タンパク質（例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ＰＥＧ化、ビオチン化などにより得られるタンパク質）を含むがこれらに限定されない、あらゆる長さのタンパク質断片、融合タンパク質、及び修飾タンパク質を含む、全ての種類の自然に存在する、及び合成タンパク質を包含する。
用語「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「ヌクレオチド」は、特に明記しない限り、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方、修飾塩基、またはこれらの塩基の組み合わせを包含する。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドは、３～１００、３～５０、３～３０、５～３０、１０～２０、５～２０、または５～１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、８０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個、または最大１００個のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、ハッシュタグオリゴヌクレオチドはポリＡ配列を含み、当該配列は、１０個以上（例えば１０～４０、１０～３０、または１０～２０個）の連続したアデノシンヌクレオチド、アデノシンヌクレオチドの誘導体またはバリアントを含むことができる。
用語「自己」とは、同一の源から単離した生物学的構成成分を意味し、同一の源から単離されてはいないが、生体構成成分が同一の源から単離されているかのような物理的（例えばアミノ酸配列）、及び機能的特徴を有する生体構成成分を含む。対照的に、「異種」とは、異なる源からの剤または構成要素を意味する。
本明細書における開示に従うと、当該技術範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術を用いてよい。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、出版物のそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（本明細書では“Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９”）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照されたい。これらの技術は部分特異的突然変異誘発を含む。例えば、出版物のそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２： ４８８－４９２（１９８５）、米国特許第５，０７１，７４３号、Ｆｕｋｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３：３５７－３６０（１９９９）；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｍａａｓ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２８：１９６－１９８（２０００）；Ｐａｒｉｋｈ ａｎｄ Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２４：４ ２８－４３１（１９９８）；Ｒａｙ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，ＢｉｏＴｅｃｈ．１３：３４２－３４６（１９９２）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．１９：５５６－５５９（１９９５）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｃｏｌｍ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６： ６８０－６８２（１９９９）；Ｘｕ ａｎｄ Ｇｏｎｇ，ＢｉｏＴｅｃｈ．２６：６３９－６４１（１９９９）、米国特許第５，７８９，１６６号及び同第５，９３２，４１９号、Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ １４．３：７４－７５（２００１）、米国特許第５，７０２，９３１号、同第５，７８０，２７０号、及び同第６，２４２，２２２号、Ａｎｇａｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０：４８６－４８８（２００１）、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：９７６－９７８（２０００）、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４４－４６（１９９６）、Ｏｇｅｌ ａｎｄ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．５：４６７－４６８（１９９２）、Ｋｉｒｓｃｈ ａｎｄ Ｊｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１８４８－１８５０（１９９８）、Ｒｈｅｍ ａｎｄ Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３３４６－３，３４９（１９９６）、Ｂｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｏｇｓａ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１９７－１９８（１９９５）、Ｂａｒｒｅｎｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：５４１－５４２（１９９３）、Ｔｅｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５７：２２９－２３７、及びＰｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．６７：２０９－２１８を参照されたい。
方法及び組成物
本明細書に記載する組成物及び方法は、（ａ）対象、例えばヒト対象から単離した生体サンプル、例えば細胞の機能的活性化の有無を検出し、及び／または、（ｂ）刺激、及び任意選択的に固有の同族ＴＣＲ配列を識別するのに有用である。
一実施形態では、Ｔ細胞を活性化可能な抗原、例えばＴ細胞エピトープ、ならびに任意選択的に、本明細書に記載する抗原、例えばＴ細胞に特異的に結合するＴＣＲの、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列の識別方法は、
（Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）固有の抗原、
（ｃ）固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な、好ましくは特異的に識別する固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識した分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯを識別することであって、固有のＨＴＯを識別することが、活性化Ｔ細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの１つ以上：
（ｉ）活性化Ｔ細胞により発現した１つ以上の遺伝子、及び／または
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞により発現したＴＣＲのＴＣＲα及び／またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、
（Ｉ）固有の生体サンプルのプールを含む組成物から、１つ以上の活性化Ｔ細胞（複数可）をソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化Ｔ細胞が反応性である抗原を識別することと、
を含む。
いくつかの実施形態では、（Ｉ）でソートされた固有の生体サンプルのそれぞれは、
（ａ）Ｔ細胞、及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能であり、各固有の生体サンプルの各Ｔ細胞が同一の対象から単離され、各固有の生体サンプルの各ＭＨＣが同一のハプロタイプを有し（任意選択的に、各固有の生体サンプルの各ＭＨＣが同一のサンプルに由来し、同一表面（例えば、抗原提示細胞の細胞膜）に結合するなど）、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）固有の抗原、例えばＴ細胞エピトープ、
（ｃ）固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートし、固有のＨＴＯが、固有の抗原、例えば、（ｂ）のＴ細胞エピトープを特異的に識別する独自のヌクレオチド配列を含む、上記ＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含み、
（ＩＩ）のシングルセル配列決定分析が、構成要素にコンジュゲートした固有のＨＴＯを識別し、固有のＨＴＯの独自のヌクレオチド配列が、活性化Ｔ細胞を活性化可能な抗原、例えばＴ細胞エピトープを識別するようにいくつかの実施形態では、ＨＴＯ－コンジュゲート分子は、自身を細胞膜に組み込む脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＯ－コンジュゲート分子は、Ｔ細胞により発現する細胞表面マーカーに特異的に結合したリガンドを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーは、多くの細胞により遍在的に発現される。例えば、細胞表面マーカーはβ２マイクログロブリンであってよい。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、活性化状態に関係なく、全てのＴ細胞により選択的に発現されることができる。いくつかの実施形態では、細胞マーカーは、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、シングルセル配列決定分析は、活性化Ｔ細胞により発現した１つ以上の遺伝子、及び／または、活性化Ｔ細胞により発現したＴＣＲのＴＣＲα及び／またはβ鎖配列もまた識別する。
いくつかの実施形態では、方法は、固有の生体サンプルのプールを形成することをさらに含む。固有の生体サンプルのプールを形成することは、例えば、対象から単離し、少なくともＴ細胞、ならびに好ましくはＭＨＣ（例えば末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、及びＡＰＣなど）を含む生体サンプルを個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製することと、生体サンプルを、Ｔ細胞の生存能、活性化、及び／または活性を支持する条件で維持することとを含むことができる（例えば、各生体サンプルは培地、ならびに、ＰＢＭＣ、例えばＴ細胞及びＡＰＣ、生存能、及び活性を支持するサイトカインを含む）。本明細書に記載するように、本明細書に記載の方法で使用するＴ細胞及びＭＨＣは、任意の源に由来することができる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣは抗原提示細胞で発現する。例えば、生体サンプルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現するＴ細胞及びＭＨＣを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＡＰＣは自己由来である。ＡＰＣの非限定的かつ例示的な源としては、全末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、単球由来の樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ、正常組織または腫瘍細胞、ＡＰＣ細胞などが挙げられる。Ｔ細胞は、ＡＰＣのＴ細胞との同時培養を用いて刺激することができる。いくつかの実施形態では、全ＰＢＭＣは、ＡＰＣとＴ細胞の両方をもたらす。
いくつかのこれらの、及び他の実施形態では、方法は、（ｉ）固有の抗原、例えば固有のＴ細胞エピトープを、対象から単離し、少なくともＴ細胞、及び好ましくはＭＨＣもまた含む生体サンプルに送達することで、及び／または、（ｉｉ）Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯに送達することで、固有の生体サンプルを作製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルを、抗原と同時に再刺激する前に約７～１０日間、固有の抗原でプライミングし、再刺激の後、サンプルを固有のＨＴＯで細分化する。いくつかの実施形態では、固有の生体サンプルは、抗原で同時に再刺激されるにエクスビボでプライミングされず、固有のＨＴＯで細分化される（例えば、サンプルはインビボでプライミングされている）。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも６時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも１６時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に少なくとも約１８～２４時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に約４８時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に約７２時間、再刺激される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細分化される前に９６時間以下で再刺激される。いくつかの実施形態では、方法は、固有の生体サンプルをプールして、固有の生体サンプルを含む組成物を作製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化Ｔ細胞（複数可）をソートすることは、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）アッセイを含む。いくつかの実施形態では、ＡＩＭアッセイは、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識リガンドに結合した活性化Ｔ細胞の、蛍光活性化細胞ソーティングを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、固有の生体サンプルのプールを含む組成物から活性化Ｔ細胞をソートする前に、固有の生体サンプルを、活性化誘発マーカーに特異的に結合する蛍光標識リガンドでインキュベートすることを含む。インキュベーション工程は、任意の細分化工程と同時に、及び／または、固有の生体サンプルのプール工程の後で生じることができる。
いくつかの実施形態では、蛍光標識リガンドは蛍光標識抗体であり、及び／または、活性化誘発マーカーは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化誘発マーカーは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、活性化Ｔ細胞のさらなる機能分析及び／または表現型分析を行うことを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び／または表現型分析は、フローサイトメトリー分析、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析、多量体分析、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、さらなる機能分析及び／または表現型分析は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上のタンパク質及び／または発現レベルを測定する。
例えば、細胞が検出可能な機能を示す、生物学的に活性な細分化サンプルもまた本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）抗原、例えばＴ細胞エピトープ、
（ｃ）ハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、ＨＴＯが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートし、ＨＴＯが、抗原、例えば、（ｂ）のＴ細胞エピトープを特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記ＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子は脂質である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子は、細胞マーカーに結合する抗体である。
本明細書に記載の方法で使用可能な組成物もまた、本明細書で記載する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）抗原、
（ｃ）抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、上記ＨＴＯが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記ＨＴＯ、
ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、少なくとも２つの）固有の生体サンプルのプール、例えば、第１及び第２の生体サンプル（ならびに、いくつかの実施形態では、さらなる生体サンプル）を含む組成物を含み、第１及び第２の生体サンプルのそれぞれは、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）抗原、例えばＴ細胞エピトープ、
（ｃ）ハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、ＨＴＯが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートし、ＨＴＯが、（ｂ）の抗原を特異的に識別するために使用可能な、及び好ましくは特異的に識別するヌクレオチド配列を含む、上記ＨＴＯ、ならびに任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む。
いくつかの実施形態では、第２の生体サンプルは、
（ａ）第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣであって、第２のＴ細胞が、第２の表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣ、
（ｂ）第２の抗原、例えば、第２のＴ細胞エピトープ、
（ｃ）第２のＨＴＯであって、ハッシュタグオリゴヌクレオチドが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する第２の分子にコンジュゲートし、第２のＨＴＯが、第２の抗原、例えば、（ｂ）の第２のＴ細胞エピトープを特異的に識別する第２の配列を含む、上記第２のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）第２のＴ細胞の活性化を支持する第２の培地、を含み、
（ｉ）第１のサンプルのＴ細胞、及び第２のＴ細胞は同一の対象から単離され、第１のサンプルのＭＨＣ、及び第２のＭＨＣは同一表面に結合し、好ましくは同一のハプロタイプを有し（例えば、同一の源から単離され）、（ｉｉ）第１のサンプルの抗原、例えば、第１のＴ細胞エピトープ、及び第２の抗原、例えば第２のＴ細胞エピトープは同一ではなく、（ｉｉｉ）第１の分子及び第２の分子は同一であり、第１のＨＴＯの第１のヌクレオチド配列、及び第２のＨＴＯの第２のヌクレオチド配列は同一ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも２つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも３つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも４つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも５つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも６つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも７つの固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも８個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも９個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１０個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１１個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１２個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１３個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１４個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１５個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１７個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１８個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１９個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも２０個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも３０個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも５０個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも８０個の固有の生体サンプルを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は少なくとも１００個の固有の生体サンプルを含む。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、ＭＨＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞の表面で発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞及びＡＰＣは自己由来であり、Ｔ細胞及びＡＰＣはそれぞれ、ヒトドナーから単離され、及び／または、ＡＰＣは樹状細胞である。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、抗原、例えばＴ細胞エピトープは、（ｉ）細菌抗原またはその一部、（ｉｉ）ウイルス性抗原またはその一部、（ｉｉｉ）アレルゲンまたはその一部、（ｉｖ）腫瘍関連抗原またはその一部、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群からなる群から選択される。本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、抗原、例えばＴ細胞エピトープは、（ｉ）アミノ酸配列、（ｉｉ）ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）細胞溶解物、及び（ｉｖ）これらの組み合わせを含む。
本明細書に記載するいくつかの組成物の実施形態では、ＨＴＯは、抗体である分子にコンジュゲートし、及び／または、分子は、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、及び／またはＣＤ８からなる群から選択される細胞表面マーカーに結合する。
いくつかの実施形態では、培地は、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣの生存能を支持するサイトカインを含み、任意選択的に、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＦＬＴ３Ｌ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、培地は、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣの生存能を支持するサイトカイン（複数可）の代わりに、またはこれに加えて、抗ＣＤ２８及び／または抗ＣＤ３抗体を含む。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、対象から単離した末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは新しく単離したＰＢＭＣである。他の実施形態では、ＰＢＭＣは、凍結保存された、新しく解凍したＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、樹状細胞とＴ細胞、例えば、自己由来の樹状細胞とＴ細胞の、共培養物を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、Ｔ細胞活性化マーカーに特異的に結合する蛍光標識抗体をさらに含み、任意選択的に、Ｔ細胞活性化マーカーは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物は、フローサイトメトリー分析もしくは分析に有用なさらなる抗体、及び／またはＭＨＣ多量体（例えば、蛍光標識多量体及び／またはオリゴタグ多量体）をさらに含む。
キット
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答のハイスループット評価で有用であり得る。本明細書において提供する方法は、ＭＨＣハプロタイプに関係なく患者サンプルで用いられ得るため、このようなＴ細胞応答のシェルフ分析のためのキットもまた、本明細書で提供する。
いくつかの実施形態では、キットは、複数の固有の抗原、例えば、複数の固有のＴ細胞エピトープ、及び、複数の固有のＨＴＯ－コンジュゲート分子を含み、複数の固有のＨＴＯ－コンジュゲート分子のそれぞれは、固有のＨＴＯ配列及び同一の分子を含む固有のＨＴＯを含み、複数の固有のＨＴＯ配列のそれぞれは、複数の固有の抗原のうちの１つ（例えば、複数の固有のＴ細胞エピトープのうちの１つ）のみに割り当てられ、これにより、固有のＨＴＯ配列が、割り当てられた固有の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を識別することができる。いくつかの実施形態では、複数の抗原のそれぞれは、同一の源に由来する。例えば、複数の抗原は、例えば、エピトープマッピングを補助するための、単一の抗原に由来する、重なり合うペプチドのパネルを含む。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、病原性抗原、例えば細菌性またはウイルス性抗原であることができる。非限定的な実施形態では、このようなキットは、病原性抗原に由来する複数の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み、これは、ワクチン開発、または、確立したワクチンに対する患者の免疫応答の監視に有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、腫瘍関連抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、腫瘍関連抗原抗原に由来する複数の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み、これは、免疫療法開発、例えば、腫瘍細胞に対する、Ｔ細胞が媒介する細胞毒性と関連する、ＴＣＲ可変（例えば、ＣＤＲ３）配列の識別において有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、自己抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、自己抗原に由来する複数の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み、これは、患者の自動免疫応答の監視に有用であり得る。いくつかの実施形態では、単一の抗原は、移植抗原であってよい。非限定的な実施形態では、このようなキットは、移植抗原に由来する複数の抗原（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含み、これは、対象により拒絶される可能性が低いドナー器官の識別、及び／または、移植片対宿主病の確立において有用であり得る。いくつかのキットの実施形態は、追加の成分、例えば、陰性及び／または陽性対照抗原、緩衝液、バイアル瓶、使用のための取扱説明書、マルチウェル培養皿などをさらに含むことができる。
このようなキットは、例えば、（１）ワクチン、免疫療法などの、可能性のある、もしくは進行中の治療法に対する、（２）自己免疫疾患もしくは移植拒絶反応の間の、（３）ＴＣＲベースの治療薬の開発のための、及び／または、（４）ＴＣＲ：エピトープ結合アルゴリズムのための、Ｔ細胞応答のハイスループット分析において有用であり得る。したがって、免疫応答を評価する、及び／または、免疫応答に関与する活性化Ｔ細胞と関連する、ＴＣＲ配列（例えば、ＴＣＲ可変配列、例えば、ＴＣＲα及び／またはβ可変配列、例えば、ＴＣＲα及び／またはβ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列）を識別するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び／またはキットの使用方法もまた本明細書で提供する。
使用
本明細書で提供する方法及び組成物は、免疫応答の評価に有用であり得る。したがって、Ｔ細胞の活性化、免疫寛容などの文脈で免疫応答を研究するための、ハイスループットスクリーニング方法、関連する組成物、及び／または関連するキットの使用方法もまた本明細書に記載する。
本明細書に記載する方法は、単離時から、あらゆる事前刺激または再刺激培養を通して、細胞ソーティングの時間まで、サンプル（例えば、末梢血単核球細胞（ＰＭＢＣ）、吸引物）の、異なる細胞画分、特に、抗原特異的Ｔ細胞の画分の相対的な画分に影響を及ぼさないようである。したがって、サンプル内での、抗原特異的Ｔ細胞の相対的な集団サイズを評価するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び／またはキットの使用方法を提供する。
ワクチン候補を試験するための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び／またはキットの使用方法もまた提供する。一実施形態では、ワクチンが、対象において免疫応答（例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン放出など）を活性化し、エフェクター、加えてメモリーＴ細胞（例えば、中枢及びエフェクターメモリーＴ細胞）の生成をもたらすか否かの評価方法、及び／または、活性化された免疫学的免疫応答の分子表現型の識別方法を本明細書において提供する。
本発明は、養子Ｔ細胞療法のための、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、関連する組成物、及び／またはキットの使用方法もまた提供する。したがって、対象（例えば哺乳動物対象、例えばヒト対象）において、疾患または病状（例えばがん）の治療または緩和方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがんである。その他の実施形態では、疾患または病状は、ウイルスまたは細菌により引き起こされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する養子Ｔ細胞療法は、本明細書に記載するハイスループットスクリーニング法、組成物、及び／またはキットを用いて、ＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインをコードする核酸配列、例えば、抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の配列（または、他の実施形態では、ＴＣＲγ及び／またはδ可変ドメインをコードする核酸配列）、ならびに同族抗原を識別することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインをコードする核酸配列、例えば、識別した、ＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の配列（または、他の実施形態では、ＴＣＲγ及び／またはδ可変ドメインをコードする核酸配列）を、ヒト治療薬の創薬で用いる。
一実施形態では、ヒト治療薬は、Ｔ細胞が、対象となる抗原に対する親和性を有するＴＣＲを発現するように、対象となる核酸配列を有する（例えば、トランスフェクションした、もしくは形質導入した、または、別の場合においては対象となる核酸が導入された）Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ヒト対象由来のＴ細胞）である。一態様では、治療薬が用いられる対象は、特定の疾患または病状に対する治療法が必要であり、抗原は疾患または病状と関連している。一態様では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞であり、抗原は腫瘍関連抗原であり、疾患または病状はがんである。一態様では、Ｔ細胞は対象に由来する。したがって、核酸及び同族抗原の識別の際に、本明細書に記載する方法養子Ｔ細胞療法は、本明細書に記載する方法により識別したＴ細胞受容体の核酸配列またはその一部（例えば、ＴＣＲ可変ドメインの核酸配列）を、発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）にクローニングすることと、ベクターを、対象に由来するＴ細胞に導入し、Ｔ細胞が抗原特異的Ｔ細胞を発現することと、Ｔ細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。
本明細書に記載する養子Ｔ細胞療法の他の実施形態では、ＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインをコードする核酸配列（複数可）、例えば、抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲα及び／またはβ可変ドメインの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３の配列（または、他の実施形態では、ＴＣＲγ及び／またはδ可変ドメインをコードする核酸配列）を、ヒトＴ細胞受容体治療薬の作製において用いる。一実施形態では、治療薬受容体は、可溶性Ｔ細胞受容体である。多くの努力が広がり、治療剤で用いるための、可溶性Ｔ細胞受容体またはＴＣＲ可変領域が生成されてきた。可溶性Ｔ細胞受容体の生成は、再配列したＴＣＲ可変領域を入手することに左右される。１つのアプローチは、ＴＣＲα及びＴＣＲβを含む一本鎖ＴＣＲを設計し、同様にｓｃＦｖ免疫グロブリンフォーマットも設計し、これらをリンカーを介して互いに融合することである（例えば、国際出願第２０１１／０４４１８６号を参照されたい）。得られるｓｃＴｖは、ｓｃＦｖに類似する場合、熱的に安定な、可溶性形態のＴＣＲα／β結合タンパク質を提供する。代替のアプローチは、ＴＣＲβ定常ドメインを有する可溶性ＴＣＲを設計すること（例えば、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅｅ－ｄｏｍａｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：１２６５４－５８を参照されたい）；加えて、非自然のジスルフィド結合を組み換えて、ＴＣＲ定常ドメイン間の界面に導入すること（Ｂｏｕｌｔｅｒ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｓｅｎ（２００５）Ｓｔａｂｌｅ，ｓｏｌｕｂｌｅ，ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２：４５４－６０で確認される；米国特許第７，５６９，６６４号も参照されたい）を含んだ。可溶性Ｔ細胞受容体の他のフォーマットは説明されている。本明細書に記載の方法を用いて、対象となる抗原に、高親和性を有して結合するＴ細胞受容体の配列を測定し、その後、配列に基づき可溶性Ｔ細胞受容体を設計することができる。
本明細書に記載するハイスループット法、組成物、及び／またはキットに従い識別した配列を含む可溶性Ｔ細胞受容体を用いて、対象となるタンパク質、例えば、ウイルス性、細菌性、または腫瘍関連タンパク質の機能を遮断することができる。あるいは、可溶性Ｔ細胞受容体は、感染細胞またはがん細胞を殺傷可能な部分、例えば細胞傷害性分子（例えば、化学治療薬）、毒素、放射性核種、プロドラッグ、抗体などに融合することができる。可溶性Ｔ細胞受容体はまた、免疫賦活性分子、例えばサイトカイン、ケモカインなどに融合することができる。可溶性Ｔ細胞受容体はまた、免疫阻害性分子、例えば、Ｔ細胞により認識される抗原を有する他の細胞を、Ｔ細胞が殺傷することを妨げる分子に融合することができる。免疫阻害性分子に融合した、このような可溶性Ｔ細胞受容体を、例えば自己免疫の遮断において用いることができる。可溶性Ｔ細胞受容体に融合可能な、様々な例示的な免疫阻害性分子は、参照により本明細書に組み込まれているＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ（２０００）Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８４－８９で確認されている。
非限定的かつ例示的な実施形態を以下に示す。
実施形態１。Ｔ細胞のプールから、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体で標識したＴ細胞をソートすることを含む、対象となるエピトープを認識するＴＣＲのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α及び／またはβ鎖配列を識別する方法であって、オリゴヌクレオチドタグが、固有のエピトープ、抗原、または抗原プールと関連する配列を含む、上記方法。
実施形態２。ソート後に、上記オリゴヌクレオチドタグの配列を測定することで、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体で標識したＴ細胞を活性化したエピトープ、抗原、または抗原プールを測定する工程を含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３。上記ソート工程の前に、以下の工程のうちの１つ以上：
例えば、マルチウェル培養プレートにて、複数の培養液から末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを作製することであって、各培養液が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞機能及び増殖を支持する培地及びサイトカインを含む、上記作製する工程と、
複数の培養液のそれぞれ１つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原（または抗原プール）を、複数の培養液、例えば、培養プレートの１個のウェルに添加することであって、各培養液（ウェル）が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製する工程と、
固有の培養液に、当該固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグを添加する工程と、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばＣＩＴＥ－ｓｅｑ及びオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加する工程と、
上記培養液をプールする工程と、
を含む、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態４。例えば、マルチウェル培養プレートにて、複数の培養液から末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを作製することであって、各培養液が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞機能及び増殖を支持する培地及びサイトカインを含む、上記作製することと、
複数の培養液のそれぞれ１つを、対象となる固有の抗原または抗原プールに送達することにより固有の培養液を作製すること、例えば、対象となる単一の抗原（または抗原プール）を、複数の培養液、例えば、培養プレートの１個のウェルに添加することであって、各培養液（ウェル）が、固有の抗原または抗原プールを含む、上記作製することと、
固有の培養液に、Ｔ細胞活性化マーカーに結合する抗体を、各ウェルに存在する細胞全てを標識するのに十分な量で、及び、上記固有の培養液と関連する固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化した分子を添加することと、
任意選択的に、オリゴマータグ、例えばＣＩＴＥ－ｓｅｑオリゴデキストラマー試薬もまた含み得る、他の表面染色抗体及び多量体を添加することと、
上記培養液をプールすることと、
Ｔ細胞活性化マーカーに結合し、固有のオリゴヌクレオチドタグでタグ化される抗体で標識したこれらのＴ細胞をソートすることと、
上記固有のオリゴヌクレオチドタグの上記核酸配列を含む、工程（５）でソートしたＴ細胞から核酸配列を測定することと、
を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５。上記Ｔ細胞活性化マーカーがＣＤ１３７／４－１ＢＢを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６。Ｔ細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の、ＴＣＲα鎖配列、及び／またはＴＣＲβ鎖配列を活性化可能な前記抗原の識別方法であって、上記方法が、
（Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、当該固有の生体サンプルが、
（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）固有の抗原、
（ｃ）例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のＨＴＯを特異的に識別可能である、及び／または識別するために使用される固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、上記固有のＨＴＯが、上記Ｔ細胞を上記固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートする、上記ＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む、上記ソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識した分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯを識別することであって、固有のＨＴＯを識別することが、活性化Ｔ細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、以下のうちの１つ以上：
（ｉ）活性化Ｔ細胞により発現した１つ以上の遺伝子、及び／または
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞により発現したＴＣＲのＴＣＲα及び／またはβ鎖配列
もまた識別する、上記識別することと、
を含む、上記方法。
実施形態７。ソートする前に、以下の工程（複数可）のうちの一方または両方：
対象から単離したＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣ生存能、活性化及び／または活性を支持する媒体及びサイトカインを含む、上記工程と、
固有の抗原、及び／または、例えば、上記固有の抗原を特異的に識別する固有のＨＴＯを特異的に識別することができる、及び／または特異的に識別するために使用される、固有のＨＴＯを、複数の生体サンプルのそれぞれに送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、上記固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を上記固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートする工程、ならびに、任意選択的に、上記複数の固有の生体サンプルを、（Ｉ）でソートした上記組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むように組み合わせる工程と、
を含み、
上記複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離されたＴ細胞及びＡＰＣを含み、任意選択的に、上記Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地を含む、細胞の集まりを含み、
Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有の抗原及び／または固有のＨＴＯの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、
（ａ）対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まり、
（ｂ）固有の抗原、
（ｃ）固有の抗原を特異的に識別し、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地
を含む固有の生体サンプルになる、実施形態６に記載の方法。
実施形態８。上記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態７に記載の方法。
実施形態９。ソートすることが、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づく、活性化Ｔ細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを含む、実施形態６～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０。上記ＡＩＭが、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１。蛍光活性化細胞ソーティングが、上記ＡＩＭに対する蛍光標識抗体を用いる検出に基づく、実施形態９または実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２。ＩＩで分析した活性化Ｔ細胞にて、機能分析及び／または表現型分析をさらに行うことを含み、任意選択的に、上記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、フローサイトメトリー分析、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、多量体分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態６～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３。上記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上のタンパク質及び／またはＲＮＡ発現レベルを測定する、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４。末梢血単核球細胞がＴ細胞及び表面結合ＭＨＣをもたらす、実施形態６～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５。上記Ｔ細胞を上記固有のＨＴＯで標識する上記分子が、細胞表面分子に結合する抗体を含む、実施形態６～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６。上記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢであるか、またはこれを含む、実施形態６～１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７。上記方法が、上記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することを含み、上記ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列がそれぞれ、ＴＣＲα鎖可変領域配列及び／またはＴＣＲβ鎖可変領域配列である、実施形態６～１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８。上記方法が、上記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を識別することを含み、上記方法が、治療薬の作製において、上記ＴＣＲα鎖配列及び／またはＴＣＲβ鎖配列を利用することをさらに含む、実施形態６～１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９。（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、
（ｂ）抗原、
（ｃ）抗原を特異的に識別するハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、上記ＨＴＯが、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記ＨＴＯ、
ならびに、任意選択的に、
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地
を含む生体サンプルを含む、組成物。
実施形態２０。（ａ）上記ＭＨＣが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現し、任意選択的に、
上記Ｔ細胞及びＡＰＣが自己由来であり、
上記Ｔ細胞及び上記ＡＰＣがそれぞれヒトドナーから単離され、及び／または、
上記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
（ｂ）上記抗原が、
（Ｉ）
（ｉ）細菌抗原もしくはその部分、
（ｉｉ）ウイルス性抗原もしくはその部分、
（ｉｉｉ）アレルゲンもしくはその部分、
（ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
（ｖ）これらの組み合わせ
からなる群から選択され、及び／または、
（ＩＩ）
（ｉ）アミノ酸配列、
（ｉｉ）ヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）細胞溶解物、及び
（ｉｖ）これらの組み合わせ
を含み、
（ｃ）上記ＨＴＯコンジュゲート分子が、
（Ｉ）細胞表面分子に結合する抗体、もしくは
（ＩＩ）脂質
を含み、及び／または、
（ｄ）上記培地が、上記Ｔ細胞及び／またはＡＰＣの生存能を支持するサイトカインを含む、
実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１。上記抗体が、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーに結合するか、または、
上記脂質が細胞膜に組み込まれる、実施形態２０に記載の組成物。
実施形態２２。上記Ｔ細胞及び／または上記ＡＰＣの生存能を支持する上記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２０または実施形態２１に記載の組成物。
実施形態２３。第２の生体サンプルをさらに含み、上記第２の生体サンプルが、
（ａ）第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣであって、第２のＴ細胞が、第２の表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能である、上記第２のＴ細胞及び第２の表面結合ＭＨＣ、
（ｂ）第２の抗原、
（ｃ）第２の抗原を特異的に識別する第２のＨＴＯであって、上記ＨＴＯが、上記第２のＴ細胞を上記第２のＨＴＯで標識する第２の分子にコンジュゲートする、上記第２のＨＴＯ、
ならびに、任意選択的に、
（ｄ）上記第２のＴ細胞の活性化を支持する培地
を含み、
（ｉ）上記Ｔ細胞及び第２のＴ細胞が同一の対象から単離され、
（ｉｉ）上記抗原及び上記第２の抗原が同一ではなく、
（ｉｉｉ）上記Ｔ細胞を上記ＨＴＯで標識する上記分子、及び、上記第２のＴ細胞を上記第２のＨＴＯで標識する上記第２の分子が同一であり、上記ＨＴＯ及び上記第２のＨＴＯが同一ではない、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２４。上記組成物が、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞のソートを可能にする剤をさらに含む、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５。ＡＩＭの発現に基づき活性化Ｔ細胞のソートを可能にする上記剤が、上記ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体である、実施形態２４に記載の組成物。
実施形態２６。上記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴからなる群から選択される、実施形態２４または実施形態２５に記載の組成物。
実施形態２７。上記組成物が、組成物のフローサイトメトリー分析またはＣＩＴＥ－ｓｅｑに有用な抗体及び／またはＭＨＣ多量体を含む、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２８。複数の固有の抗原、及び、
複数の固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、それぞれが、上記複数の固有の抗原のうちの１つのみに特異的に結合する、上記ＨＴＯ
を含むキット。
実施形態２９。上記キットが、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞のソートを可能にする剤をさらに含み、任意選択的に、ＡＩＭの発現に基づき活性化Ｔ細胞のソートを可能にする上記剤が、上記ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体である、実施形態２８に記載のキット。
実施形態３０。上記複数の固有のＨＴＯのそれぞれが、同一の分子にコンジュゲートし、上記キットが、固有のＨＴＯがコンジュゲートした複数の分子を含む、実施形態２８または２９に記載のキット。
実施形態３１。上記複数の固有の抗原のそれぞれが、単一のタンパク質からの、固有かつ重なり合うペプチド配列を含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載のキット。
実施形態３２。上記単一のタンパク質が、病原性抗原、腫瘍関連抗原、または移植抗原からなる群から選択される、実施形態３１に記載のキット。
実施形態３３。患者の、ワクチンに対する、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３４。患者の、免疫療法に対する、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３５。患者における、当該患者の免疫療法の間における、Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３６。自己抗原に対する患者のＴ細胞応答を分析するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３７。移植抗原に対する患者のＴ細胞応答を分析するための、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３８。活性化Ｔ細胞の１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を識別するための、実施形態１～１８のいず れか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットの使用。
実施形態３９。上記１つ以上のＴＣＲ可変領域配列が、ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３配列、及び／または、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３配列を含む、実施形態３８に記載の使用。
実施形態４０。ヒト治療薬の作製における、実施形態３８または３９で識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列の使用。
実施形態４１。上記ヒト治療薬が、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載の組成物、または、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載のキットを使用して識別した１つ以上のＴＣＲ可変領域配列を含むＴ細胞を含む、実施形態４０に記載の使用。
本発明を、多数の実施形態を参照して具体的に図示及び説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書にて開示した様々な実施形態に対して、形態及び詳細の変化を加えることが可能であり、本明細書にて開示した様々な実施形態は、特許請求の範囲に限定を加えるものとは意図されないことが、当業者によって理解されよう。
本明細書に記載する方法の非限定的実施形態を、図１に示す。本明細書の実施例は、細分化技術を、機能アッセイ、例えば活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の細胞濃縮、及びシングルセルトランスクリプトーム配列決定と組み合わせて使用し、同族Ｔ細胞及び抗原反応性、例えば、Ｔ細胞エピトープ反応性をスクリーニングすることが可能であり、このような方法が、初代ヒト細胞において特に有用であるというデータを提供する。
方法のより具体的かつ例示的な適用を説明する前に、一般的な方法をここで示す。
一般的な材料及び方法
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）：凍結保存したＰＢＭＣを、購入した（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）か、または、メーカーの指示に従い、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４５－００１，７４９）試薬を用いる密度勾配遠心分離により単離したヒト対象由来の新鮮な血液から単離し、冷凍培地（９０％ヒト血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、１０％組織培養等級ＤＭＳＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，２４３８））で、後の分析のために凍結保存した。
ペプチド：ペプチドを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にてカスタム合成した。凍結乾燥したペプチドを、原液に対して１０～５０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに再構築させた後、使用のために、適切なアッセイ培地に１０μｇ／ｍＬで希釈した。メーカーの指示に従い、ＣＥＦ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｏｏｌ（Ａｎａｓｐｅｃ，ＡＳ－６１０３６－００３）を１０ｕｇ／ｍＬで使用し、Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，００－４９７０－９３）を使用した。
初代細胞培養物：凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、５％ヒト血清ＡＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｈ３６６７）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１５１４０１６３）を含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧＭＰ ＤＣ無血清培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，２０８０１－０５００）でインキュベートした。培養液は、樹状細胞及びＴ細胞支持サイトカイン：Ｔ細胞培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ樹状細胞培地、カタログ番号２０８０１－０５００ ＋ ５％ヒト血清ＡＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ３６６７））＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０３７８－０１６）、５ｎｇ／ｍＬのＴ細胞支持サイトカインＩＬ－７及びＩＬ－１５（それぞれ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、カタログ番号１４１０－０５０及び１４１３－０５０）、ならびに、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０）を含む補充液であった。
オリゴタグ細分化抗体の生成：全てのヒトＴ細胞において、細胞表面標的に対して非常に特異的なモノクローナル抗体（ＣＤ２，ＲＰＡ－２．１０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００２０２）を、公開されている方法を用いて、ポリＡテールを含む固有の１５塩基オリゴヌクレオチド配列の組み合わせに、カスタムでコンジュゲートした。上述のＳｔｏｅｃｋｉｕｓ ２０１７，ｂｉｏＲｘｉｖを参照されたい。
直接エクスビボＩＦＮγ／グランザイムＢ ＥＬＩＳＰＯＴ：二重ヒトＩＦＮγ／グランザイムＢ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイキットをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から購入し、メーカーの手順に従い使用した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを解凍して、ウェルあたり２００，０００個の細胞で、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートで２００ｕＬにて、ペプチド刺激をしながら４８時間インキュベートした。ＥＬＩＳＰＯＴの反応性を、メーカーの自動ソフトウェアを用いて、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒで読み出した。
フローサイトメトリーによるＴ細胞の抗体及び表現型特性決定：蛍光標識抗体を商業ベンダーから購入した。表面タンパク質のフローサイトメトリー表現型特性決定を行うために、細胞を回収し、洗浄し、対象となる抗体を含有するフローサイトメトリーＢＤ ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃５５４６５７）に再懸濁した。細胞を３０分間４℃でインキュベートし、その後２回洗浄してから、Ａ３ Ｓｙｍｐｈｏｎｙサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリー収集を行った。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。ゲートを、蛍光－１（ＦＭＯ）対照に基づき設定した。
抗原特異的Ｔ細胞反応性アッセイ：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ勾配単離により単離した。ＰＢＭＣを、Ｔ細胞培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘＧＭＰ ＤＣ培地、カタログ番号２０８０１－０５００ ＋ ５％ヒト血清ＡＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ３６６７））＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０３７８－０１６）、１０００Ｕ／ｍＬで因子ＧＭ－ＣＳＦを、及び、５００Ｕ／ｍＬで因子ＩＬ－４を支持する樹状細胞（それぞれ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，＃１４１２－０５０、及びＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，＃１４０３－０５０）、５ｎｇ／ｍＬのＴ細胞支持サイトカインＩＬ－７及びＩＬ－１５（それぞれ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、＃１４１０－０５０及び１４１３－０５０）、ならびに、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０）内の培養皿に播種、例えばアリコートした。個別の抗原、例えば、対象となるペプチドを、１０ｕｇ／ｍＬ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）でアッセイウェルに添加し、固有の生体サンプルを形成した。
一晩培養液を、ペプチド刺激の２４時間後に回収し、ソート及びシングルセル配列決定のために調製した。１０日間の予増殖培養のために、最初のペプチド添加の後１週間、細胞に新鮮な培地及びサイトカインを１日おきに供給した。次に、対象となる個別のペプチドを、一晩の再刺激のためにＴ細胞増殖培養液に添加し、活性化誘発マーカー、例えばＣＤ１３７／４－１ＢＢの発現を情報制御し、抗原特異的ＡＩＭに基づく機能的Ｔ細胞ソーティングを可能にした。ペプチド再刺激の後、細胞を、フローサイトメトリー特性決定のために調製するか、またはさらに処理して、細分化、プール、及びシングルセル配列決定を可能にした。
機能的Ｔ細胞アッセイ性能後の細胞細分化：機能的刺激の後、個別のアッセイウェルからの細胞を９６ウェルアッセイブロックに収集し、洗浄して、対象となる細分化試薬を含有する、フローサイトメトリーＢＤ ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃５５４６５７）に再懸濁した。細胞を、それぞれ１μｇ／１０６個の細胞で、１種類または２種類のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）抗体のいずれかで染色した。細胞を３０分間４℃でインキュベートし、２回洗浄した後プールした。オリゴヌクレオチドタグデキストラマーを分析に含めたら、サンプルをデキストラマーで染色し、その後、以下のオリゴタグデキストラマー染色手順に従い、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ及びフローサイトメトリー抗体染色に進んだ。
ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体染色及び蛍光抗体染色：細分化染色手順の後、プールして細分化したサンプルを、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体、加えて、蛍光タグフローサイトメトリー抗体の両方を含有するＢＤ ＢＳＡ染色緩衝液に、それぞれの最適濃度で再懸濁した。細胞を３０分間４℃でインキュベートし、２回洗浄した後、シングルセル配列決定のためにソートした。
オリゴタグデキストラマー染色及びＦＡＣＳソーティング：凍結保存した健常なドナーＰＢＭＣを、３７℃の水浴にて簡潔に解凍した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮した。細胞を遠心分離により洗浄し、ベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，７０６６４）及び５０ｎＭのダサチニブ（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ，１３９２）を含有するＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１４１９０－２５０）を４５分間３７℃で処理した。細胞を９６ウェルアッセイブロック（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９６０）に移し、遠心分離にかけ、上清を吸引した。適切なカスタムＩｍｍｕｄｅｘ ｄＣＯＤＥ－ＰＥデキストラマープール（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、暗室で３０分間、室温で１ｕＬ／１００ｕＬにて添加した。次に、蛍光色素標識表面マーカーを添加し、細胞をさらに３０分間４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を直ちにソートした。フローサイトメトリー抗体染色及び洗浄は、染色緩衝液（ＢＤ，５５４６５７）で行った。ＦＡＣＳ用表面マーカーは、以下のマーカー及び蛍石を含んだ：ソーターにて添加した生／死－ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ，１０２３６２７６００１）、ＣＤ３ ＢＵＶ７３７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１２７５０）、ＣＤ４ ＢＶ５１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３９１９）、ＣＤ８ ＢＵＶ８０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１２８８９）、ＣＣＲ７ ＡＦ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５３２１８）、及びＣＤ４５ＲＯ ＢＶ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０４２３８）。
ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞 ＦＡＣＳソーティング：再刺激の２４時間後に、細胞を収集して、以下の表面抗体：ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１２７５０）及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０９８２８）を用いるＡｓｔｒｉｏｓセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＦＡＣＳ用の蛍光標識抗体で染色した。前散布図、横散布図、及び蛍光チャネルに対するゲートを、デブリ及びダブレットを排除しながら、生細胞を選択するように設定した。１００μｍノズルを使用して、さらなる処理のためにシングルＣＤ３＋ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋細胞をソートした。
クロムシングルセル分配及びライブラリー調製：ソートした細胞を次に、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ Ｃｈｉｐ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１０００２８７）にロードし、クロムコントローラーを通して処理し、ＧＥＭ（エマルション中のゲルビーズ）を生成した。メーカーの手順に従い、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ Ｃｈｉｐ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１０００２８７）を用いてＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを調製した。
バイオインフォマティクス法
トランスクリプトーム、ＴＣＲ（ＶＤＪ）、細分化、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、及びデキストラマーライブラリーを配列決定し、そのままの配列決定データを、１０Ｘ ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ分析パイプラインを用いて処理した。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ分析により、フィーチャー－バーコードＵＭＩ計数マトリックス、及びＴＣＲ（ＶＤＪ）アミノ酸配列が生成した。フィーチャーは、遺伝子発現、抗体の細分化、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体、及びデキストラマー捕捉を含む。フィーチャー－バーコードマトリックスを入力として用いて、ＲパッケージＳｅｕｒａｔ ｖ３．１．４（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１８）を下流分析に用いた。遺伝子ＵＭＩ計数の標準的なｌｏｇ正規化を行い、続いて、１０００個の最も変更可能な遺伝子を識別し、データのスケーリングと有心化を行った。次に、主成分分析（ＰＣＡ）を行い、５０個のＰＣを演算し、ソートした。次に、Ｓｅｕｒａｔのグラフベースのクラスター化アプローチを用いて、クラスター化を行った。ｋ近傍（ＫＮＮ）グラフを、２０次元ＰＣＡ空間でのＥｕｃｌｉｄｅａｎ距離に基づき演算し、続けて、様々な解像度でクラスター化した。各解像度において、トップマーカー遺伝子を識別して使用し、異なるクラスターにまたがる遺伝子発現のヒートマップを作成した。目視検査の際に、最適なクラスター化解像度を測定した。トップ遺伝子マーカーとしてのミトコンドリア遺伝子を含む、死細胞クラスターに属する細胞を全て、下流分析から取り除いた。検出した遺伝子の数が５００以下であり、ミトコンドリア遺伝子発現の画分が０．２５以上である細胞を、取り除いた。アッセイの主たる目標の１つは、ＴＣＲ－抗原相互作用により駆動される、様々な抗原に対するＴ細胞の反応性を識別することであるため、一本ＴＣＲ鎖、または非生産鎖、または、２つ以上のαもしくはβ鎖を含むあらゆる細胞もまた、取り除いた。検出された遺伝子が多数である、及び／または、検出されたＵＭＩが多数である、あらゆるアウトライナー細胞もまた、取り除いた。残りの細胞に関しては、他のフィーチャー（ＣＩＴＥ－ｓｅｑ、細分化、デキストラマー）からのデータを次に処理した。これらのフィーチャーに対応する計数マトリックスからのデータは、有心対数比変換を用いて正規化した後、基準化した。細分化データを用いて、ＭｕｌｔｉＳｅｑＤｅｍｕｘアルゴリズムＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：６１９－２６；デフォルトパラメーター）を用いて細胞を脱多重化した。細分化スキームに従い、ハッシュタグに割り当てられなかったあらゆる細胞を、多重化の後で取り除いた。各細胞に関して、細胞の、固有の機能的クローン型を定義する対形成したＴＣＲアミノ酸配列を入手した。脱多重化の後、ハッシュタグ化アッセイウェルと関連する全ての細胞における、各Ｔ細胞クローンのクローン型サイズを計算した。＞２０のサイズを有するあらゆるクローン型は、ハッシュタグ化ウェルにて、特異的抗原に対する潜在的な反応性を有するとみなされた。
実施例１：多量体染色に相当する抗原特異的Ｔ細胞集団を機能的に識別可能な、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）としてのＣＤ１３７／４－１ＢＢの識別
材料及び方法
一般的に、本実施例に記載する方法では、健常なＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋ヒトドナー由来のＴ細胞を、本明細書に記載の方法に従い、同族合成ペプチドの存在下で予増殖させ、次に、蛍光標識抗体及びデキストラマー多量体で、フローサイトメトリー分析のために染色し、抗原特異的Ｔ細胞集団を識別した。
結果
図２Ａにおいて、樹状細胞（ＤＣ）は、健常なヒトドナー由来の全末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から誘導した。簡潔に述べると、ＣＤ１４＋単球を、抗ＣＤ１４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いる磁気選択によりＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋細胞を、ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦを補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地で５日間培養した。５日目に、ＤＣを、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に対して特異的な、ＣＭＶ ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号１６）、またはＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１５）合成短鎖ペプチドで、２時間パルス処理した。次に、ＩＦＮαを細胞に添加し、活性化した。７日目に、自己由来のＴ細胞を培養液に添加し、培地を、５％ヒト血清＋支持サイトカイン（ＩＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２）を補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＣｅｌｌＧｒｏ培地で交換した。これらの自己由来のＤＣ及びＴ細胞を１０日間培養し、関連する、以前から存在する抗原特異的Ｔ細胞集団を増殖させた。培養液での、１０日間の予増殖の後、Ｔ細胞を、関連するペプチドまたはＤＭＳＯ陰性対照で２４時間再刺激した。対象となる細胞表面標的を、フローサイトメトリー特性決定（Ａ３ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ分析器，ＢＤ）により、蛍光標識モノクローナル抗体及びデキストラマー多量体を用いて評価した。
培養液由来のＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の画分は、刺激前は低い（ｘ軸、左パネル）が、多量体は、対象となるＣＤ８＋ Ｔ細胞集団をロバストに染色する：２５．５％ＣＭＶ ｐｐ６５ ＣＤ８＋ Ｔ細胞、７．７９％ ＭＡＲＴ１＋ Ｔ細胞（ｘ軸、中央パネル）ことを、図２Ａのフローサイトメトリードットプロットは示す。言い換えれば、この特定の実施例で用いた細胞培養条件は、以前から存在するメモリーＴ細胞を増殖させたが、新規のＴ細胞増殖は誘発しなかった。しかし、同族ペプチドによる、２４時間の再刺激の後、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ発現はＣＤ８＋ Ｔ細胞で上方制御され、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋集団（ｘ軸）の総合サイズは、多量体＋集団に類似する（右パネル）。
図２Ｂでは、本実施例に記載するのと同一の細胞培養液及び染色法を用いて、４個のＨＬＡ－Ａ＋０２０１＋健常ドナー（ＨＤ１、ＨＤ２、ＨＤ３、及びＨＤ２７）から単離した細胞を、ＤＭＳＯまたはＣＭＶ ｐｐ６５合成ペプチドの存在下で１０日間培養した。陰性対照多量体に対する、１０日間の増殖の後での、ＣＭＶｐｐ６５多量体＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の画分を、フローサイトメトリーにより評価した（図２Ｂ、上パネル）。ＤＭＳＯ対照に対する、ＣＭＶ ｐｐ６５合成ペプチドによる２４時間の再刺激の後での、ＣＤ８＋ Ｔ細胞でのＣＤ１３７／４－１ＢＢの発現もまた、フローサイトメトリーにより評価した（図２Ｂ、下パネル）。ＣＭＶに対して血清陽性である、４名のドナーのうちの３名は、測定可能なＣＭＶ ｐｐ６５＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＨＣ１、ＨＤ２、ＨＤ２７）を有したが、ＣＭＶ血清陰性のドナー（ＨＤ３）は、検出可能なＣＭＶ ｐｐ６５＋ Ｔ細胞を有しなかった（図２Ｂ）。一般に、多量体＋ ＣＤ８＋及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の集団サイズは一致する（図２Ｂ）。
図３Ａ～３Ｂでは、健常なＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋ヒトドナー（ＨＤ３及びＨＤ２７）由来の、全末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、支持サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２）、及び、ＤＭＳＯまたはＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１５）合成短鎖ペプチドを含む培地で１０日間培養し、それぞれ、ベースライン集団（ＤＭＳＯ）を提供するか、または、関連する、以前から存在するＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞を増殖させる。培養液中での、１０日間の予増殖の後、Ｔ細胞を、ＤＭＳＯ陰性対照またはＭＡＲＴ１ペプチドで２４時間再刺激した。健常なドナー２７（ＨＤ２７）由来の、ＭＡＲＴ１多量体＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）でソートし、５’ ＲＮＡ及びＴＣＲシングルセル配列決定ライブラリー調製のために、１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓシングルセル分配器に封入し、続いて、ハイスループット次世代配列決定を行った。完全な対形成したα及びβ ＴＣＲ情報を生み出した細胞のみを評価した。多量体＋及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋サンプルにまたがる重なり合いを評価した。
再刺激の前に、両方のドナーは、検出可能なＭＡＲＴ１＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有した（図３Ａ、上パネル）。同族ペプチドによる２４時間の再刺激の後、両方のドナー（ＨＤ３及びＨＤ２７）は、細胞表面でＣＤ１３７／４－１ＢＢを上方制御した（図３Ａ、下パネル）。しかし、あるドナー（ＨＤ２７）は、多量体＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞よりもはるかに多いＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞を有した（図３Ａ）。この不一致を試験するために、多量体及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ染色により識別した機能的Ｔ細胞クローンを、多量体＋及びＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ サンプルにまたがる重なり合いを評価することにより、さらに評価した。多量体＋と、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞との間で共有されるＴＣＲ配列には、著しい重なり合いがあった（図３Ｂ）。概して、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋画分は、ＭＡＲＴ１多量体＋集団よりも多くの、クローン集団を含有した。最もクローン増殖したＭＡＲＴ１多量体＋ ＴＣＲは、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞で検出され、多くの、より量が少ないＴＣＲもまた、両方の濃縮集団にまたがり検出可能であった。しかし、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋集団は、多量体＋集団で検出されなかったＴＣＲを捕捉した。加えて、多くの、ＭＡＲＴ１多量体＋集団由来の、より少量のＴＣＲ配列は、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋集団でより大きなクローンサイズとして存在した。
図２Ａ～Ｂ、及び３Ａ～Ｂに示すデータは、活性化誘発マーカーＣＤ１３７／４－１ＢＢが、抗原特異的活性化の後でヒトＴ細胞にて上方制御され、本明細書に記載の方法に従うと、培養した、多量体＋とＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞との間の、シングルセル対形成したα／β鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列の間で、著しい重なり合いが存在することを示す。そのため、ＣＤ１３７／４－１ＢＢは、例えば、抗原特異的Ｔ細胞用の機能的濃縮活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）として、機能アッセイで使用することができる。加えて、機能的マーカーとしてのＣＤ１３７／４－１ＢＢの使用は、従来の多量体染色と同様に効率的であり、これに類似する機能アッセイ結果をもたらす。
実施例２：ハッシュタグオリゴヌクレオチド、及び、活性化Ｔ細胞のＣＤ１３７／４－１ＢＢ濃縮を用いる、初代ヒト細胞における同族Ｔ細胞及びエピトープ反応性の特性決定
実施可能な方法としての、細分化、ＡＩＭソーティング、及び／またはシングルセル配列決定分析をさらに検証して、同族抗原及びＴＣＲ反応性を評価し特性決定するために、ＰＢＭＣ及び固有のウイルスペプチドを含む固有の生体サンプルを、ハッシュタグオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗ＣＤ２抗体で細分化し、プールした。ＣＤ１３７／４－１ＢＢ染色により機能的活性化を識別し、機能アッセイにおけるＣＤ１３７／４－１ＢＢの使用を、ＥＬＩＳＰＯＴ／及びデキストラマー染色の、従来の機能アッセイと比較した。
材料及び方法
ＥＬＩＳＰＯＴ：ＣＭＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザに対して既知の血清陽性を有する、健常なＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、ＤＭＳＯ、または、個別のＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋制限ウイルスペプチド刺激（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、インフルエンザＡ）により、ウェルあたり２×１０５個の細胞の濃度で、Ｄｕａｌ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ／ＧｒａｎｚｙｍｅＢ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイプレート（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）に、４８時間プレーティングした。インキュベーションの後、ＥＬＩＳＰＯＴ反応性が発生し、メーカーの指示及び自動ソフトウェアを用いて、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ分析器で読み取った。
細分化及びＡＩＭ濃縮のためのＰＢＭＣ培養：健常なＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋ヒトドナー由来の全末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、培地、支持サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２）、及び、個別のＨＬＡ－Ａ＊０２０１＋制限ウイルスペプチド（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、インフルエンザＡ）で１０日間培養し、関連する、以前から存在する抗原特異的Ｔ細胞を増殖させた。培養液での、１０日間の予増殖の後、Ｔ細胞を、関連するペプチドまたはＤＭＳＯ陰性対照で２４時間再刺激した。対象となる細胞表面標的を、フローサイトメトリー特性決定（Ａ３ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ分析器，ＢＤ）により、蛍光標識モノクローナル抗体を用いて評価した。ウイルスペプチド刺激にまたがる、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の相対画分を、フローサイトメトリーにより評価した（ゲートを上回る全ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合として提供した、ＣＤ８＋ ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞画分）。
細分化。ＡＩＭ濃縮、及びシングルセル配列決定。固有のハッシュタグオリゴヌクレオチドで標識したモノクローナルヒト抗ＣＤ２抗体を、本実験で記載するＰＢＭＣ生体サンプルの各アッセイウェルに添加し、同一の細胞が受けた刺激で、所与のウェルからのＴ細胞を固有にバーコード化した。次に、全アッセイウェルサンプルをプールし、ＦＡＣＳソーティング用の蛍光タグ表面抗体、及び、ｓｃＳＥＱフェノタイピング用のＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体で染色した。ＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞をソートし、脱多重化した、例えば、シングルセル配列決定（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’ＲＮＡ及びＴＣＲ）により分析した。発現は、全発現により各細胞の遺伝子発現を正規化するＬｏｇＮｏｒｍａｌｉｚｅ法を用いて正規化する。数学的には、正規化した発現は、ｌｏｇ１ｐ（ＵＭＩ．Ｃｏｕｎｔ＊ｓｃａｌｉｎｇ．ｆａｃｔｏｒ／（全ＵＭＩ計数））に等しく、式中、ｓｃａｌｉｎｇ．ｆａｃｔｏｒ＝１０，０００であり、ｌｏｇ１ｐはｌｏｇである。
オリゴタグデキストラマー活性化及び染色。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞陰性濃縮（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて濃縮した。次に、細胞をベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びダサチニブ（Ａｘｏｎ）で４５分間インキュベートし、その後、３０分間室温で、オリゴタグデキストラマープールで染色した。次に、細胞を、蛍光標識ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１２７５０）、ＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５６３９１９）、ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１２８８９）、ＣＣＲ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３５３２１８）、ならびに、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０４２３８）及びＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体で、さらに３０分間、氷上で染色した。Ａｓｔｒｉｏｓセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を利用して、前散布図、横散布図、及び蛍光チャネルにおける蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）ゲーティングを、デブリ及びダブレットを排除しながら、生細胞を選択するように設定した。さらなる処理のために、１００μｍのノズルを用いて、単一のＣＤ３＋ ＣＤ８＋ デキストラマー＋をソートした。
ＲＮＡ配列決定クラスター化。ＲＮＡ転写産物発現を、ＡＩＭ濃縮からソートしたＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞で評価した。ｋ近傍（ＫＮＮ）グラフを用いるＳｅｕｒａｔのグラフベースのクラスター化アプローチを用いて、クラスター化を行い、２０次元ＰＣＡ空間でのＥｕｃｌｉｄｅａｎ距離に基づき演算し、続けて、様々な解像度でクラスター化した。
結果
図４Ａ及び４Ｂに示すように、生体サンプル内の、抗原特異的細胞の割合は、細分化及びＡＩＭ濃縮により識別され（図４Ｂ）、これは、従来のＥＬＩＳＰＯＴ機能アッセイ（図４Ａ）により識別した割合と相関する。したがって、本明細書に記載する予増殖及び再刺激手順は、抗原特異的Ｔ細胞集団の相対機能を維持するようである。
本明細書で提供する方法論の確認を図６に示す。本明細書で開示される方法、図５に示す非限定的な実施形態により濃縮及び分析した、抗原特異的細胞のシングルセル配列分析は、さらなる確認をもたらす。図６Ａ～Ｃに示すように、シングルセル配列分析は、大部分の細胞を個別のＨＴＯに割り当てた（８０％）が、約８％は「ダブレット」に分類され、「ＨＯＴなし」は、細胞の約１２％で識別された。各ＨＴＯ、及び故に、各反応性（ＥＢＶ ＹＶＬ－９、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、インフルエンザＭ）に対応する細胞の相対数は、図４Ａに示すＥＬＩＳＰＯＴ、及び、図４Ｂに示すフローサイトメトリー分析を含む、直交する機能アッセイで識別した細胞の相対数を反映した。生じた各刺激の、非現実的な等しい増殖を有する各細分化により識別した細胞の相対数を図６Ｂに示す。
ＣＭＶ ｐｐ６５、ＥＢＶ ＢＭＬＦ１、またはインフルエンザＭクローンに細分化したＣＤ１３７／４－１ＢＢ＋ Ｔ細胞の反応性は、並行したオリゴタグプールデキストラマーベースの実験により確認した。ＨＴＯ－４０、ＨＴＯ－４７、及びＨＴＯ－４８細分化ＣＤ１３７／４１ＢＢ増殖ＴＣＲが、ハッシュタグにより識別された抗原、即ち、インフルエンザＭ（ＨＴＯ－４０）、ＥＢＶ－ＢＭＬＦ１（ＨＴＯ－４７）、及びｐｐ６５－ＣＭＶ（ＨＴＯ－４８）に対する反応性を示すことを、図６Ｄは示す。このことは、これらの抗原に対応するハッシュタグウェルにおいて、≧２０のクローンサイズを有するＴ細胞クローンの存在により観察される。固有のクローンの数は、全クローン（ＴＣ）により示される。これらの増殖クローンの反応性は、並行したオリゴタグプールデキストラマーベースの実験により確認される。≧１０のクローンサイズを有する、デキストラマー実験におけるクローンに同一である、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ増殖クローンの数は、ＯＣにより示される。これらの重なり合うクローン（ＯＣ）は、細分化抗原に対応するデキストラマーの高い発現、及び、無関係な抗原に対応するデキストラマーの低い発現を示す。
さらなる確認を、ｓｃＳＥＱデータの脱多重化において示す。７つの固有のクラスターを、個別の細胞の遺伝子発現パターン及びレベルに基づき、ＲＮＡトランスクリプトーム分析から解像した（図７Ａ）。特に、ｓｃＳＥＱデータの脱多重化により発見された各抗原特異的Ｔ細胞の集団サイズの比較（図７Ｂ）は、機能的フローサイトメトリーアッセイで発見された抗原特異的Ｔ細胞の集団サイズ（図４Ｂ）に一致する。データは、抗原特異的Ｔ細胞は、ｓｃＳＥＱデータのＨＴＯ脱多重化により識別可能であり、各抗原特異的Ｔ細胞に対する相対的な集団サイズは、脱多重化の後で維持されたことを示している。さらに、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ試薬は、本明細書に記載する細分化、ＡＩＭソーティング、及びシングルセル配列分析と適合性がある。このようなＣＩＴＥ－ｓｅｑ試薬を用いることにより、重要な層の情報を追加して、細胞のサブセット識別及びフェノタイピングを改善することができる。非限定例として、ＣＩＴＥ－ｓｅｑデータは、各細胞の表面におけるタンパク質の量の測定をもたらすが、ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、各細胞における転写物の量の測定をもたらす。タンパク質の量及びＲＮＡ－ｓｅｑの発現は相関しない場合があり、故に、両方の測定が相補的な情報をもたらす。これは、図８Ａに示すＣＤ４ ＣＩＴＥ－ｓｅｑデータと、図８Ｂに示すＣＤ４ ＲＮＡ－ｓｅｑデータとの比較により強調される。
実施例３：抗原特異的Ｔ細胞の機能及び表現型分析
例えば、７～１０日間の予増殖を行うことなく、ＰＢＭＣで直接実施する、抗原特異的Ｔ細胞の機能及び表現型分析のための、細分化、ＡＩＭソーティング、シングルセル配列決定、及びＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体染色の使用を、本明細書で記載する。
材料及び方法
細胞表面抗体染色：細胞分配、ライブラリー調製、及び配列決定を伴う、５’ヒトＴＣＲα／β
０．０４％のＢＳＡと共にＰＢＳに懸濁したシングルセルを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にロードした。ＲＮＡｓｅｑ、Ｖ（Ｄ）Ｊ、及び、抗体由来のタグライブラリーを、抗体由来のタグプライマー付加により、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ ＆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて調製した。増幅の後、ｃＤＮＡを小型（＜３００ｂｐ）、及び大型（＞３００ｂｐ）の断片画分に分けた。ＲＮＡｓｅｑ及びＶ（Ｄ）Ｊライブラリーを、＞３００ｂｐ画分から調製した。細胞表面抗体由来のライブラリーを、＜３００ｂｐ画分から調製した。ＴＣＲα／βに対するＶ（Ｄ）Ｊライブラリーアリコートを濃縮するために、ｃＤＮＡを２つの２０ｎｇアリコートに分け、プライマーを用いて２ラウンドで増幅した。
具体的には、第１ラウンドの増幅に関して、使用したプライマーは、短鎖Ｒ１に関してはＭＰ１４７（ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ；配列番号１７）、ヒトＴＲＡＣに関してはＭＰ１２０（ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡ；配列番号１８）、及び、ヒトＴＲＢＣに関してはＭＰ１２１（ＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡ；配列番号１９）であった。第２ラウンドの増幅に関して、第１ラウンドの２０ｎｇのアリコートを、ＭＰ１４７、ＭＰ１２８（ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ；配列番号２０）（ネストＲ２＋ヒトＴＲＡＣ）、及び、ＭＰ１２９（ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ；配列番号２１）（ネストＲ２＋ヒトＴＲＢＣ）を用いて増幅した。Ｖ（Ｄ）Ｊライブラリーを、２５ｎｇの各ｈＴＲＡＣ及びｈＴＲＢＣ増幅ｃＤＮＡから調製した。ＲＮＡｓｅｑ及び抗体由来のタグライブラリー（ＵＭＩ及び細胞バーコードに対して、リード１ ２６－ｂｐ、８－ｂｐ ｉ７サンプルインデックス、及びリード２ ５５－ｂｐ転写物リード）、ならびに、Ｖ（Ｄ）Ｊライブラリー（リード１ １５０ｂｐ、８－ｂｐ ｉ７サンプルインデックス、及びリード２－１５０－ｂｐリード）に対して、対形成末端配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００で行った。
結果
ドナーから単離したＰＢＭＣを、５つの固有のＨＰＶペプチドのうちの１つでインキュベートした。ＣＤ１３７／４－１ＢＢ及びシングルセル配列分析に基づくＡＩＭソーティングを用いるＨＴＯ配列に基づき、抗原特異的Ｔ細胞をクラスター化した（図９Ａ）。ＨＴＯサンプルにまたがり（陽性シグナル閾値を超えて）共有されていないＴＣＲクローンを示す細胞を識別し、これらのクローンのＴＣＲ配列を入手した（例えば、図９Ｂを参照されたい）。図９Ｂは、各細胞クローンが、グレースケールで異なる色で表される、例示的な図解を示し、クローンの各細胞を、グレースケールで同一色で示す。各クローンにおける、各ハッシュタグ及び細胞の数に対する、ハッシュタグ制限クローンの数、即ち、１個のみのＨＴＯと関連するクローンの数を、下表１に示す。
表１に示すように、ＨＴＯ－３により識別した細胞は、同族抗原に対して特異的なＴＣＲを発現する、最大数のＴＣＲクローンを示し、この次に、ＨＴＯ－５にクラスター化した細胞が続く。クローンはアミノ酸配列により識別され、いくつかのＨＴＯ－３制限ＴＣＲの、ＴＣＲα及びβ対の例示的なＣＤＲ３配列を下表２に示す。
細分化制限された、即ち、ＨＴＯサンプルにまたがり共有されていないこれらのＴ細胞クローンは、機能的Ｔ細胞応答と関連するマーカーを、より多く発現することを、シングルセル配列決定分析は示す。（図９Ｃ；図９Ｂもまた参照されたい）。
抗原に特異的に結合し、加えて、抗原特異的Ｔ細胞を発現する細胞の表現型特徴ももたらす、固有のＴ細胞受容体のアミノ酸配列を速やかに識別する固有の方法を、本明細書で示す。このハイスループット法を用いると、新規かつ潜在的にパーソナライズされた治療法を、速やかに識別して生成することができる。
等価物
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを目的としている。
本出願を通して引用される、全ての非特許文献、特許出願、及び特許の内容全体は、それら全体が本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (30)

  1. Ｔ細胞を活性化可能な抗原の識別方法であって、前記方法が、
    （Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、前記ＡＩＭが、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記固有の生体サンプルが、
    （ａ）表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、
    （ｂ）固有の抗原であって、前記固有の抗原が、前記表面結合ＭＨＣに結合可能である、固有の抗原、
    （ｃ）（ｉ）前記固有の抗原を特異的に識別するために使用され、かつ（ｉｉ）分子にコンジュゲートされる、固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、ここで、前記分子は、Ｔ細胞の細胞膜に取り込まれ、および／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する、固有のＨＴＯ、及び
    （ｄ）前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞であって、前記固有の抗原が前記表面結合ＭＨＣに結合すると、前記Ｔ細胞が前記固有の抗原を認識可能である、前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞
    を含む、前記ソートすることと、
    （ＩＩ）（Ｉ）でソートした前記活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、前記固有のＨＴＯを識別することであって、前記固有のＨＴＯを識別することが、前記固有の抗原を識別する、前記識別することと、
    を含む、前記方法。
  2. 前記シングルセル配列決定分析が、以下のうちの１つ以上：
    （ｉ）前記活性化Ｔ細胞により発現した１つ以上の遺伝子、ならびに／または
    （ｉｉ）前記固有の抗原に特異的に結合し、かつ、前記活性化Ｔ細胞により発現したＴＣＲのＴＣＲα及び／もしくはβ鎖ヌクレオチド配列
    もまた識別する、請求項１に記載の方法。
  3. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞を活性化可能な抗原に特異的に結合する前記ＴＣＲのＴＣＲα鎖の配列及び／またはＴＣＲβ鎖の配列の識別方法であって、前記方法が、
    （Ｉ）ＡＩＭの発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、前記ＡＩＭが、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記固有の生体サンプルが、
    （ａ）表面結合ＭＨＣ、
    （ｂ）固有の抗原であって、前記固有の抗原が、前記表面結合ＭＨＣに結合可能である、固有の抗原、
    （ｃ）（ｉ）前記固有の抗原を特異的に識別するために使用され、かつ（ｉｉ）分子にコンジュゲートされる固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、ここで、前記分子は、Ｔ細胞の細胞膜に取り込まれ、および／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する、固有のＨＴＯ、及び
    （ｄ）前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞であって、前記固有の抗原が前記表面結合ＭＨＣに結合すると、前記Ｔ細胞が前記固有の抗原を認識可能である、前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞
    を含む、前記ソートすることと、
    （ＩＩ）（Ｉ）でソートした前記活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、前記固有のＨＴＯを識別することであって、前記固有のＨＴＯを識別することが、前記固有の抗原に特異的に結合し、かつ、前記活性化Ｔ細胞により発現した前記ＴＣＲの前記ＴＣＲα及び／もしくはＴＣＲβ鎖のヌクレオチド配列を識別する、前記識別することと、
    を含む、前記方法。
  4. 前記固有の生体サンプルが、前記Ｔ細胞の活性化を支持する培地をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ソートする前に、
    （Ｉ）でソートされた前記組成物が複数の固有の生体サンプルを含むように、複数の固有の生体サンプルを作製すること、
    を含み、前記複数の固有の生体サンプルのそれぞれが、
    （ａ）細胞表面ＭＨＣを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、
    （ｂ）前記ＡＰＣにより発現される前記細胞表面ＭＨＣに結合する別個の抗原、
    （ｃ）（ｉ）前記別個の抗原を特異的に識別し、かつ（ｉｉ）分子にコンジュゲートされる別個のＨＴＯであって、ここで、前記分子は、Ｔ細胞の細胞膜に取り込まれ、および／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する、別個のＨＴＯ、ならびに
    （ｄ）前記別個のＨＴＯを含むＴ細胞
    を含み、
    前記ＡＰＣ及び前記Ｔ細胞が対象から単離されたものである、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. それぞれの固有の生体サンプルが、前記Ｔ細胞及び前記ＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、またはこれらの組み合わせを含む、請求項５または請求項６に記載の方法。
  8. ソートすることが、前記ＡＩＭの前記発現に基づく、活性化Ｔ細胞の蛍光活性化細胞ソーティングを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 蛍光活性化細胞ソーティングが、前記ＡＩＭに結合する蛍光標識抗体を用いる検出に基づく、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ＩＩで分析した前記活性化Ｔ細胞にて、さらなる機能分析及び／または表現型分析を行うことを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、フローサイトメトリー分析、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析、多量体分析、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記さらなる機能分析及び／または表現型分析が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ６９、ＣＤ２７８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＩＦＮγ、ＧＺＭＨ、ＧＮＬＹ、ＣＤ３８、ＣＣＬ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上のタンパク質及び／またはＲＮＡ発現レベルを測定する、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
  13. 末梢血単核球細胞が前記Ｔ細胞及び表面結合ＭＨＣをもたらす、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記Ｔ細胞を前記固有のＨＴＯで標識する前記分子が、細胞表面分子に結合する抗体を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢであるか、またはこれを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記方法が、前記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列及び／またはＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を識別することを含み、前記ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列及び／または前記ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列がそれぞれ、ＴＣＲα鎖可変領域ヌクレオチド配列及び／またはＴＣＲβ鎖可変領域ヌクレオチド配列である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記方法が、前記抗原に特異的に結合するＴＣＲのＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列及び／またはＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を識別することを含み、前記方法が、治療薬の作製において、前記ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列及び／または前記ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を利用することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. （ａ）ＡＰＣの表面で発現した表面結合ＭＨＣ、
    （ｂ）固有の抗原であって、前記固有の抗原が、前記表面結合ＭＨＣに結合可能である、固有の抗原、
    （ｃ）（ｉ）前記固有の抗原を特異的に識別し、かつ（ｉｉ）分子にコンジュゲートされる固有のＨＴＯであって、ここで、前記分子は、Ｔ細胞の細胞膜に取り込まれ、および／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する、固有のＨＴＯ、
    （ｄ）前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞であって、前記固有の抗原が前記表面結合ＭＨＣに結合すると、前記Ｔ細胞が前記固有の抗原を認識可能である、前記固有のＨＴＯを含むＴ細胞、ならびに
    （ｅ）ＡＩＭの発現に基づき活性化Ｔ細胞のソートを可能にする剤
    を含む生体サンプルを含む、組成物。
  19. 前記Ｔ細胞の活性化を支持する培地、をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. （ａ）
    （ｉ）前記Ｔ細胞及び前記ＡＰＣは自己由来であり、
    （ｉｉ）前記Ｔ細胞及び前記ＡＰＣがそれぞれヒトドナーから単離され、ならびに／または、
    （ｉｉｉ）前記ＡＰＣが、単球由来の樹状細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
    （ｂ）前記固有の抗原が、
    （Ｉ）
    （ｉ）細菌抗原もしくはその部分、
    （ｉｉ）ウイルス性抗原もしくはその部分、
    （ｉｉｉ）アレルゲンもしくはその部分、
    （ｉｖ）腫瘍関連抗原もしくはその部分、及び
    （ｖ）これらの組み合わせ
    からなる群から選択され、ならびに／または、
    （ＩＩ）
    （ｉ）アミノ酸配列、
    （ｉｉ）ヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）細胞溶解物、及び
    （ｉｖ）これらの組み合わせ
    を含み、
    （ｃ）Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する前記分子が、Ｔ細胞の細胞表面分子または脂質に結合する抗体を含み、ならびに／または
    （ｄ）前記培地が、前記Ｔ細胞及び／または前記ＡＰＣの生存能を支持するサイトカインを含む、
    請求項１９に記載の組成物。
  21. （ｉ）Ｔ細胞により発現される前記細胞表面マーカーが、β２マイクログロブリン、ＣＤ２９８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるか、または、
    （ｉｉ）Ｔ細胞の前記細胞膜に組み込まれる前記分子が脂質を含む、
    請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記Ｔ細胞及び／または前記ＡＰＣの前記生存能を支持する前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０または請求項２１に記載の組成物。
  23. 第２の固有の生体サンプルをさらに含み、前記第２の固有の生体サンプルが、
    （ａ）ＡＰＣの前記表面で発現した第２の表面結合ＭＨＣ、
    （ｂ）第２の固有の抗原であって、前記第２の固有の抗原が、前記第２の表面結合ＭＨＣに結合可能である、前記第２の固有の抗原、
    （ｃ）（ｉ）前記第２の固有の抗原を特異的に識別し、かつ（ｉｉ）前記分子にコンジュゲートされる第２の固有のＨＴＯであって、ここで、前記分子は、Ｔ細胞の前記細胞膜に取り込まれ、および／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する、第２の固有のＨＴＯ、ならびに
    （ｄ）前記第２の固有のＨＴＯを含む第２のＴ細胞であって、前記第２の固有の抗原が前記第２の表面結合ＭＨＣに結合すると、前記第２のＴ細胞が前記第２の固有の抗原を認識可能である、前記第２の固有のＨＴＯを含む第２のＴ細胞
    を含み、
    （ｉ）前記Ｔ細胞及び前記第２のＴ細胞が同一の対象から単離され、
    （ｉｉ）前記固有の抗原及び前記第２の固有の抗原が同一ではなく、かつ
    （ｉｉｉ）Ｔ細胞の前記細胞膜に組み込まれ、及び／または、Ｔ細胞により発現される細胞表面マーカーに結合する前記分子が、前記固有の生体サンプル及び前記第２の固有の生体サンプルについて同一であり、前記固有のＨＴＯ及び前記第２の固有のＨＴＯが同一ではない、
    請求項１８～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、前記第２のＴ細胞の活性化を支持する培地、をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記ＡＩＭの発現に基づき前記活性化Ｔ細胞のソートを可能にする前記剤が、前記ＡＩＭに特異的に結合する蛍光標識抗体である、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記ＡＩＭがＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１０７、ＩＦＮγ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、及び／またはＴＩＧＩＴからなる群から選択される、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記組成物が、前記組成物のフローサイトメトリー分析またはＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析に有用な抗体及び／またはＭＨＣ多量体を含む、請求項１８～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 患者の、
    （ｉ）ワクチンに対する、
    （ｉｉ）免疫療法に対する、
    （ｉｉｉ）前記患者の免疫療法の間における、
    （ｉｖ）自己抗原に対する、または
    （ｖ）移植抗原に対する、
    Ｔ細胞が媒介する免疫応答を分析するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法、または、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  29. 活性化Ｔ細胞の１つ以上のＴＣＲ可変領域ヌクレオチド配列を識別するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法、または、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  30. 前記１つ以上のＴＣＲ可変領域ヌクレオチド配列が、ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列のＣＤＲ３ヌクレオチド配列、及び／または、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列のＣＤＲ３ヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の使用。
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