JP7711050B2 - アデノウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９０９，８５３号明細書の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、バイオテクノロジーに関する。より詳細には、宿主に抗原を送達し、免疫応答を誘発するための複製不全アデノウイルスベクターなどのアデノウイルスベクターの分野および使用に関する。

電子的に提出された配列表への参照
本出願は、ファイル名「004852.120WO1 Sequence Listing」、２０２０年８月１３日の作成日、および２６２ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含んでいる。ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

組換えアデノウイルスベクターは、遺伝子治療用途およびワクチンに広く適用されている。ＡｄＶ－５ベクターベースのワクチンは、様々な動物モデルにおいて強力かつ保護的な免疫応答を誘発することが示されている（例えば、国際公開第２００１／０２６０７号パンフレット；国際公開第２００２／２２０８０号パンフレット；Shiver et al., Nature 415:331 (2002); Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver and Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)を参照）。しかしながら、組換えＡｄＶ－５ベクターベースのワクチンの有用性は、ヒト集団におけるＡｄＶ－５特異的中和抗体（ＮＡｂ）の高い血清有病率によって制限される可能性がある。抗ＡｄＶ－５免疫の存在は、マウス、アカゲザル、およびヒトでの研究において、ＡｄＶ－５ベースのワクチンの免疫原性を実質的に抑制することが示されている。

最も一般的なヒトアデノウイルス、例えばＡｄＶ－５に以前に感染したか、またはそれで治療された個体における既存の免疫の存在を回避するための１つの有望な戦略は、そのような既存の免疫に遭遇しないアデノウイルス血清型からの組換えベクターの開発を含む。そのような戦略の１つは、血清有病率の低い（または全くない）アデノウイルスからのキャプシドタンパク質配列（例えば、ヘキソンおよび／またはファイバータンパク質配列）による、天然のキャプシドタンパク質配列（例えば、ヘキソンおよび／またはファイバータンパク質配列）の置換を含む、キメラアデノウイルスの使用に基づく。

したがって、大量に生産可能で、宿主において既存の免疫に遭遇しないが、それでも免疫原性があり、ベクターに挿入された異種核酸によってコードされる抗原に対する強い免疫応答を誘導することができる、代替的なアデノウイルスベクターに対する必要性が当該分野において存在する。

本明細書において提供されるのは、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列である。キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体は、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチド配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ペントンポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

また、本明細書では、本明細書に記載の単離された核酸を含むベクターも提供される。特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。

特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失をさらに含む。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ３欠失をさらに含む。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、またはヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つからの、１つ以上のアデノウイルス核酸配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）Ｅ４ｏｒｆ６を含み得る。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、例えば、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列を含み得る。

特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、少なくとも１つの導入遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子は、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失に位置し、および／または右逆位末端反復配列（ｒＩＴＲ）に隣接している。

また、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む組換え細胞も提供される。また、アデノウイルスベクターを製造する方法も提供される。本方法は、（ａ）本明細書に記載の組換え細胞を、アデノウイルスベクターを製造するための条件下で培養すること；および（ｂ）組換え細胞からアデノウイルスベクターを単離することを含む。

また、本明細書に記載のアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。

また、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法も提供される。方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。

また、医薬組成物を製造する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。

また、それを必要とする対象において導入遺伝子を発現させる方法も提供される。本方法は、（ａ）発現される導入遺伝子を必要とする対象を同定すること；（ｂ）本明細書に記載の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを対象に接触させること；および（ｃ）対象において導入遺伝子を発現させること、を含む。特定の実施形態において、それを必要とする対象における導入遺伝子の発現は、疾患または障害を治療または予防する。特定の実施形態において、ベクターを対象に接触させることは、例えば、対象から細胞を単離し、その細胞をベクターと接触させることを含み得る。対象は、例えば、ヒト対象であり得る。

前述の概要、および本願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。しかしながら、本願は、図面に示される正確な実施形態に限定されないことを理解されたい。

図１は、Ａｄ２０－４２－４２野生型ウイルス（配列番号１）の完全なゲノムマップを示している。 図２は、アデノウイルスベクターゲノムの構築のためのスキームを示している。 図３は、アダプタープラスミドにおけるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の模式図を示している。 図４は、アダプタープラスミド：ｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．Ｅｍｐｔｙの模式図を示している。 図５は、中間プラスミド：ｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＳｂｆＩ ｆｉｎａｌ ｉｎｔｅｒｍの模式図を示している。 図６は、右端プラスミド：ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ Ｓｒｆｌ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６の模式図を示している。 図７Ａ～７Ｂは、Ａｄ２０－４２－４２．ＦＬｕｃによって誘導される細胞性免疫応答を示している。図７Ａは、免疫化の手順の模式図を示している。図７Ｂは、Ａｄ２０－４２－４２．ＦＬｕｃによって誘導される細胞性免疫応答を実証するグラフを示している。 図８は、Ａｄ２０－４２－４２ベクターとＡｄ２６ベクターとの間で大きな交差中和が観察されなかったことを示している。 図９は、ヒト対象における異なるアデノウイルス構築物の血清有病率の結果を実証するグラフを示している。 図１０は、Ａｄ２０－４２－４２、ＨＡｄ５およびＨＡｄ３５ベクターの形質導入ポテンシャルを実証するグラフを示している。ルシフェラーゼの発現は、タンパク質１ミリグラム（ｍｇ）あたりの相対光単位（ＲＬＵ）として提示されている。 図１１は、Ａｄ５ＬａｃＺおよびＡｄ２０－４２－４２ＬａｃＺで形質導入された細胞についての代表的なＬａｃＺ染色を示している。形質導入は、ＦＸが追加された３つのベクター用量で実施された：１０，０００、５，０００、および１，０００個のウイルス粒子（ＶＰ）／細胞。 図１２Ａ～１２Ｂは、ＣＡＲまたはシアル酸を発現または欠損しているＣＨＯ細胞、およびデスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現または欠損しているＴＣ１細胞のＨＡｄＶ５およびＡｄ２０－４２－４２形質導入を実証するグラフを示している。 図１２Ａ～１２Ｂは、ＣＡＲまたはシアル酸を発現または欠損しているＣＨＯ細胞、およびデスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現または欠損しているＴＣ１細胞のＨＡｄＶ５およびＡｄ２０－４２－４２形質導入を実証するグラフを示している。図１２Ｃ～１２Ｄは、ＣＤ４６の異なるアイソフォーム（ＢＣ１、ＢＣ２、Ｃ１、Ｃ２）を欠損（陰性）または発現しているＣＨＯ細胞のＨＡｄＶ５およびＡｄ２０－４２－４２形質導入を実証するグラフを示している。 図１２Ｃ～１２Ｄは、ＣＤ４６の異なるアイソフォーム（ＢＣ１、ＢＣ２、Ｃ１、Ｃ２）を欠損（陰性）または発現しているＣＨＯ細胞のＨＡｄＶ５およびＡｄ２０－４２－４２形質導入を実証するグラフを示している。 図１３は、ルシフェラーゼをコードするＨＡｄＶ５およびＡｄ２０－４２－４２のマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの分布を示している。マウスは、クロドロネート処理なし（ＣＬ－；右上および右下のパネル）またはクロドロネート処理あり（ＣＬ＋；左上および左下のパネル）で前処理され、各ベクターが静脈内注射された。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が注射された。ルシフェラーゼの発現は、低い状態から高い状態へと移る。 図１４Ａ～Ｄは、ＡｄＶベクター（それぞれＨＡｄＶ－５およびＡｄ２０－４２－４２）の定量化を示している。クロドロネートの非存在下（ＣＬ－；図１４Ａおよび１４Ｃ）または存在下（ＣＬ＋；図１４Ｂおよび１４Ｄ）におけるマウスの静脈内形質導入後のＤＮＡコピー数が示されている。ベクターゲノムはｑＰＣＲによって定量化された。 図１４Ａ～Ｄは、ＡｄＶベクター（それぞれＨＡｄＶ－５およびＡｄ２０－４２－４２）の定量化を示している。クロドロネートの非存在下（ＣＬ－；図１４Ａおよび１４Ｃ）または存在下（ＣＬ＋；図１４Ｂおよび１４Ｄ）におけるマウスの静脈内形質導入後のＤＮＡコピー数が示されている。ベクターゲノムはｑＰＣＲによって定量化された。

本開示は、少なくとも部分的に、キメラキャプシドポリペプチドまたはその機能的誘導体を含むキメラアデノウイルスベクターの単離に基づいており、ここで、キメラキャプシドポリペプチドは、第１のアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス－４２）由来のファイバーポリペプチドおよびヘキソンポリペプチド、ならびに第２のアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス－２０）由来のペントンポリペプチドを含む。アデノウイルスベクターは、低い血清有病率を維持しながら、免疫応答を誘発することができる。アデノウイルスベクターはワクチンのために製剤化され、目的の特定の抗原に対する防御免疫を誘導するために使用され得る。アデノウイルスベクターはまた、それを必要とする対象において目的の導入遺伝子を発現するように構築され得る。

様々な出版物、論文および特許が、背景および明細書全体において引用または記載されている；これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などの考察は、本発明の文脈を提供することを目的としている。そのような考察は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または特許請求されたいかなる発明に関しても、先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当該技術分野の通常の熟練者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。それ以外の場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書で規定される意味を有する。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形への参照を含むことに留意しなければならない。

特に明記しない限り、本明細書に記載の濃度または濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は典型的には、記載されている値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬから１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％から１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）から１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、全ての可能な部分範囲、そのような範囲内の整数および値の端数を含むその範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

別段の指示がない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識または確認することができるであろう。このような同等物は、本発明に包含されることが意図されている。

本明細書で使用される場合、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（contains）」または「含む（containing）」という用語、またはそれらの他の任意の変形は、記載された整数または整数の群を含むが、他の整数または整数の群を排除しないことを意味し、非排他的または開放的であることが意図されると理解されるであろう。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的にリストされていない他の要素またはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の要素を含み得る。さらに、明示的に反対の記載がない限り、「または（or）」は包括的論理和を指し、排他的論理和を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、次のいずれかによって満たされる：Ａが真（または存在）およびＢが偽（または存在しない）、Ａが偽（または存在しない）およびＢが真（または存在）、ならびにＡおよびＢの両方が真（または存在）。

本明細書で使用される場合、複数の記載された要素の間の接続詞「および／または（and/or）」は、個々の選択肢と組み合わされた選択肢の両方を包含するものと理解される。例えば、２つの要素が「および／または」で結合されている場合、第１の選択肢は、第２の要素がない場合の第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素がない場合の第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１と第２の要素を一緒に適用できることを指す。これらの選択肢のいずれかが、本明細書で使用される「および／または」という用語の意味の範囲内にあり、したがって、その要件を満たすと理解される。複数の選択肢の同時適用可能性もまた、「および／または」という用語の意味の範囲内にあり、したがって、その要件を満たすと理解される。

本明細書で使用される場合、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される用語「からなる（consists of）」、または「からなる（consist of）」もしくは「からなる（consisting of）」などの変形は、任意の記載された整数または整数の群を含むことを示すが、追加の整数または整数の群が指定された方法、構造、または組成物に加えられ得ないことを指し示す。

本明細書で使用される場合、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される用語「から本質的になる（consists essentially of）」、または「から本質的になる（consist essentially of）」、もしくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、任意の記載された整数または整数の群を含み、記載された方法、構造または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変更しない任意の記載された整数または整数の群を任意選択的に含むことを指し示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．のセクション２１１１．０３を参照。

本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトを含むが、これらに限定はされない。

また、好ましい発明の構成要素の寸法または特性に言及するときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「一般的に」、「実質的に」、および同様な用語は、記載された寸法／特性が厳密な境界またはパラメータではなく、当業者であれば理解できるように、機能的に同一または類似する、それからの軽微な差異を除外しないことを指し示すことも理解されたい。少なくとも、数値パラメータを含むそのような参照は、当技術分野で受け入れられている数学的および工業的原則（例えば、丸め、測定または他の系統的誤差、製造公差など）を使用して、最下有効桁を変動させないような変化を含む。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列（例えば、ヘキソンおよびファイバーポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド）の文脈における「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または目視検査により測定される最大の対応のために比較およびアライメントされた場合に、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定のパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。

配列比較では、典型的には１つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照）によって行われ得る。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。このアルゴリズムでは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした際に一致するか、正の値の閾値スコアＴを満たす長さＷの短いワードをクエリ配列中において同定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、上記）。これらの最初の近隣ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次に、ワードのヒットは、累積アライメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。

累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアが、達成された最大値から数量Ｘだけ低下した場合；１つ以上の負のスコアの残基アライメントの累積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；または、いずれかの配列の終わりに到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照）。

パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

本明細書で使用される場合、「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と同義的に参照される「ポリヌクレオチド」という用語は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または、より一般的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖の領域の混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成る混成分子を限定することなく含む。さらに、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を参照する。また、ポリヌクレオチドという用語には、安定性もしくは他の理由のために、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基および、イノシンのような通常は見られない塩基を含む。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得る；よって、「ポリヌクレオチド」は、天然に一般に見出されるような、化学的、酵素的、もしくは代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびに、ウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短い核酸の鎖も包含する。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、セグメントの複製または発現をもたらすために、別の核酸セグメントが作動可能に挿入され得るレプリコンである。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、任意のタイプの細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞であり得る。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子でトランスフェクトされた細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、そのようなトランスフェクトされた細胞の子孫または潜在的な子孫である。細胞の子孫は、例えば、後の世代で起こり得る突然変異もしくは環境的な影響、または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、親細胞と同一である場合も、そうでない場合もある。

本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳を包含し、さらに、全ての天然に存在する転写後および翻訳後修飾も包含する。発現されたポリペプチドは、宿主細胞の細胞質内、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境中に存在するか、または細胞膜に固定され得る。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、従来的なアミノ酸残基の１文字または３文字のコードが使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用され得る。ポリマーは線状または分枝状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。この用語は天然に、または介入によって修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの他の操作または修飾も包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、ならびに当技術分野で知られている他の修飾も定義内に含まれる。

本明細書に記載のペプチド配列は、ペプチドのＮ末端領域が左側にあり、Ｃ末端領域が右側にあるという通常の慣習に従って書かれている。アミノ酸の異性体は知られているが、特に明記しない限り、表されているのはアミノ酸のＬ型である。

本明細書で使用される場合、「防御免疫」または「防御免疫応答」という用語は、ワクチン接種された対象が、ワクチン接種が行われた病原体による感染を制御することができることを意味する。病原体は、例えば、抗原性遺伝子産物または抗原性タンパク質、またはそれらの断片であり得る。通常、「防御免疫応答」を獲得した対象は、軽度から中等度の臨床症状のみを発症するか、症状を全く発症しない。通常、特定の病原体に対する「防御免疫応答」または「防御免疫」を有する対象は、当該病原体による感染の結果として死亡することはない。

「アジュバント」という用語は、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。

本明細書で使用される場合、「抗原性遺伝子産物またはその断片」または「抗原性タンパク質」という用語は、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌タンパク質、またはそれらの断片を含み得る。好ましくは、抗原性タンパク質または抗原性遺伝子産物は、宿主における防御免疫応答を上昇させることができ、例えば、疾患または感染（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌の疾患または感染）に対する免疫応答を誘導し、および／または疾患または感染から対象を保護する免疫を対象において疾患または感染に対して産生（すなわち、ワクチン接種）する。

本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、通常は一緒に結合されていない２つ以上の遺伝子、核酸、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含む遺伝子、核酸、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味する。「キメラ」遺伝子、核酸、またはタンパク質は、２つ以上の無関係な配列（例えば、２つ以上の別個のタンパク質をコードする２つ以上の別個の核酸）間の融合物であり得る。「キメラ」遺伝子、核酸、またはタンパク質は、２つ以上の関連する配列間の融合物であり得る（例えば、核酸は同じタンパク質をコードするが、核酸は異なる原料物質、すなわち、一方の核酸はあるヒトアデノウイルスに由来し、他方の核酸は第２の無関係なヒトアデノウイルスに由来する）。

アデノウイルスベクター
特定のアデノウイルスへの曝露は、特定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらし、これは、アデノウイルスベクターの有効性に影響を及ぼし得る。ヒトアデノウイルスによる感染は、ヒトでは一般的であるため、ヒト集団におけるヒトアデノウイルスに対する中和抗体の有病率は高い。個体におけるそのような中和抗体の存在は、ヒトアデノウイルスバックボーンに基づく遺伝子導入ベクターの有効性を低下させると予想され得る。有効性の低下を回避する１つの方法は、中和抗体の標的であるアデノウイルスキャプシドタンパク質のエピトープを置き換えることである。キャプシドタンパク質上の標的配列は、有病率が低く、したがって中和抗体がヒト集団ではまれである他のアデノウイルス（例えば、複数のヒトアデノウイルスのキメラアデノウイルス）からのタンパク質配列で置き換えられ得る。

「キャプシドタンパク質」は、アデノウイルスの血清型および／または指向性の決定に関与する、アデノウイルス（例えば、ＡＤ２０および／またはＡＤ４２）のキャプシド上のタンパク質またはその機能的断片または誘導体を指す。キャプシドタンパク質は、典型的には、ファイバー、ペントン、および／またはヘキソンタンパク質を含む。特定の実施形態において、キャプシドタンパク質は、アデノウイルスのキャプシドタンパク質の全体または全長である。他の実施形態では、キャプシドタンパク質は、アデノウイルスの全長キャプシドタンパク質の断片または誘導体である。特定の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターによってコードされるヘキソン、ペントンおよびファイバーは、異なるアデノウイルスバックグラウンドに由来する。

本明細書で使用される「キメラアデノウイルスキャプシド」は、アデノウイルス起源のキャプシドを指し、これは、ファイバー、ペントン、および／またはヘキソンポリペプチドを含み、ここで、ファイバー、ペントン、および／またはヘキソンポリペプチドは、異なるアデノウイルス起源（例えば、Ａｄ４２のファイバーおよびヘキソンポリペプチドとＡｄ２０のペントンポリペプチド）に由来するものである。

「ヘキソンポリペプチド」は、アデノウイルスヘキソンコートタンパク質、その機能的断片および誘導体を指す。

「ファイバーポリペプチド」は、アデノウイルスファイバータンパク質、その機能的断片および誘導体を指す。

「ペントンポリペプチド」は、アデノウイルスペントンタンパク質、その機能的断片および誘導体を指す。

アデノウイルスに対する中和抗体の１つの標的は、主要なコートタンパク質であるヘキソンタンパク質である。血清型を規定し中和抗体と結合するヘキソンタンパク質またはヘキソンタンパク質内の可変配列を、ヒト集団においてまれなアデノウイルス由来のヘキソンタンパク質またはヘキソンタンパク質内の可変配列に置き換えることは、ヒトにおいて一般的に見られる抗体による中和を受けにくいアデノウイルスベクターを構築することを可能とし得る。

ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）は、異なるアデノウイルス血清型の間で最も高い変動性を表すヘキソンポリペプチドの領域である。一般に、これらのＨＶＲは（無傷のウイルス粒子の文脈の中で）ヘキソンタンパク質三量体の溶媒に曝露される表面に対応すると考えられており、関連して、抗体を介したアデノウイルス中和の重要な決定因子であると予想されている（Roberts et al., Nature 441:239-43 (2006)）。したがって、所与のアデノウイルスベクターのヘキソンＨＶＲを、ヒトにおける血清有病率が低い（または全くない）アデノウイルスのものと置き換えることは、ヒト標的集団における既存の抗ベクター体液性免疫を回避するための可能な手段を表す。その結果、ＨＡｄＶ－５ベースのベクター内でのヘキソン配列の置換を主に含む、ヘキソンキメリズムの概念を探求する複数の研究が行われた（Roy et al., J Virol. 72:6875-9 (1998); Gall et al., J Virol. 72:10260-4 (1998); Youil et al., Hum. Gene Ther. 13:311-20 (2002); Wu et al. J Virol. 76:12775-82 (2002); Roy et al., Virology. 333:207-14 (2005); Roberts et al., Nature 441:239-43 (2006); Bradley et al., J Virol. 86:1267-72 (2012); Yu et al., Biochem Biophys Res Commun. 421:170-6 (2012); Bruder et al, PLoS One. 7(4):e33920 (2012)）。

アデノウイルスに対する中和抗体の第２の標的は、ファイバータンパク質である。ファイバータンパク質をヒト起源のまれなアデノウイルス由来のファイバー配列で置き換えること、より好ましくはファイバータンパク質内の可変配列を置き換えることもまた、ヒトにおいて一般的に見られる抗体による中和を受けにくいアデノウイルスベクターの構築を可能とし得る。上記のファイバー置換とヘキソン置換の組み合わせは、ヒト集団において一般的に存在する抗体による中和に対するさらなる耐性を与えることができる。

アデノウイルスに対する中和抗体の第３の標的は、ペントンタンパク質である。ペントンタンパク質をヒト起源のまれなアデノウイルスのペントン配列に置き換えることもまた、ヒトにおいて一般的に見られる抗体による中和を受けにくいアデノウイルスベクターの構築を可能とし得る。上記のヘキソン置換、ファイバー置換、およびペントン置換の組み合わせは、ヒト集団において一般的に存在する抗体による中和に対するさらなる耐性を与えることができる。

本開示は、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列を提供する。キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体は、例えば、ファイバーポリペプチド、ヘキソンポリペプチド、およびペントンポリペプチドを含み得る。ファイバーおよびヘキソンポリペプチドは、例えば、第１のアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス－４２）に由来することができ、ペントンポリペプチドは、例えば、第２のアデノウイルス（例えば、ヒト－アデノウイルス－２０）に由来することができる。

ポリペプチドの「機能的誘導体」は、例えば、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が、欠失、挿入、修飾、および／または置換されていてもよいポリペプチドの修飾されたバージョンを適切に指す。未修飾のアデノウイルスキャプシドタンパク質の誘導体は、例えば、（ａ）そのキャプシド内に誘導体キャプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、未修飾のキャプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じか、より低い血清有病率を保持する場合；および／または（ｂ）そのキャプシド内に誘導体キャプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、未修飾のキャプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じか、より高い宿主細胞感染性を保持する場合；および／または（ｃ）そのキャプシド内に誘導体キャプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、未修飾キャプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じか、より高い免疫原性を保持する場合；および／または（ｄ）そのキャプシド内に誘導体キャプシドタンパク質を含むアデノウイルスが、未修飾のキャプシドタンパク質を含むアデノウイルスと比較して、実質的に同じか、より高いレベルの導入遺伝子生産性を保持する場合、機能的であるとみなされる。

「アデノウイルスベクター」は、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するか、またはそれを含む組換えベクターを指す。

好ましい実施形態において、キメラアデノウイルスキャプシドは、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド；配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド；および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ファイバーポリペプチド配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヘキソンポリペプチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ペントンポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態では、本明細書に開示の単離された核酸を含むベクター、好ましくはアデノウイルスベクターが提供される。本アデノウイルスベクターは、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸であって、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含む、単離された核酸を含む。

典型的には、本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター上に組換えアデノウイルスゲノム全体を含む。本発明の核酸分子は、クローニングによって得られるか、または合成的に生成されるＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。

当業者は、複数の血清型に由来する要素が、単一のアデノウイルスベクター、例えば、ヒトまたはサルのアデノウイルスにおいて組み合わせられ得ることを認識するであろう。したがって、異なる血清型からの望ましい特性を組み合わせたキメラアデノウイルスベクターが生成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスベクターは、キメラヘキソンおよび／またはファイバーポリペプチド配列の既存の免疫の非存在と、ｒＡｄ４、ｒＡｄ５、ｒＡｄ２６、またはｒＡｄ３５などの既存のアデノウイルスベクターの高レベルな抗原および／または導入遺伝子の送達および提示能力とを組み合わせ得る。

ワクチンとして、および／または導入遺伝子発現のためのビークルとして使用するためのアデノウイルスベクターの利点は、操作の容易さ、大きな規模での良好な製造性、および報告されている多数のアデノウイルスベクターの研究、開発、製造および臨床試験における長年の経験に基づく優れた安全性記録を含み得るが、これらに限定はされない。ワクチンとして使用されるアデノウイルスベクターは、一般に、導入遺伝子にコードされたタンパク質または導入遺伝子にコードされた抗原遺伝子産物に対する、細胞性免疫応答を含む良好な免疫応答を提供する。本発明によるアデノウイルスベクターは、任意のタイプのアデノウイルスに基づくことができ、特定の実施形態では、任意のグループまたは血清型であり得るヒトアデノウイルスである。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ由来のヒトアデノウイルスに基づく。他の好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、または５０に基づく。他の実施形態では、それは、チンパンジーまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルスであり、任意の血清型であり得る。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、チンパンジーアデノウイルス１型、３型、７型、８型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７．１型、２８．１型、２９型、３０型、３１．１型、３２型、３３型、３４型、３５．１型、３６型、３７．２型、３９型、４０．１型、４１．１型、４２．１型、４３型、４４型、４５型、４６型、４８型、４９型、５０型、６７型、またはＳＡ７Ｐに基づく。

より好ましい実施形態では、第２の組成物のチンパンジーアデノウイルスベクターは、ＣｈＡｄＶ３である。組換えチンパンジーアデノウイルス血清型３（ＣｈＡｄ３またはｃＡｄ３）は、ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）と同様な特性を持つサブグループＣのアデノウイルスである。ＣｈＡｄ３は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の候補ワクチンを評価するヒト試験において安全かつ免疫原性であることが示されている（Barnes E, et al. 2012 Science translational medicine 4: 115ra1）。ＣｈＡｄ３ベースのワクチンは、ヒトＡｄ５ベクターワクチンに匹敵する免疫応答を誘導できることが報告された。例えば、Peruzzi D, et al. 2009 Vaccine 27: 1293-300およびQuinn KM, et al. 2013 J Immunol 190: 2720-35；国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット：国際公開第２０１１／０１３０６２７号パンフレットなどを参照されたい。

アデノウイルスベクター、その構築方法、およびその増殖方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、第５，８３７，５１１号明細書、第５，８４６，７８２号明細書、第５，８５１，８０６号明細書、第５，９９４，１０６号明細書、第５，９９４，１２８号明細書、第５，９６５，５４１号明細書、第５，９８１，２２５号明細書、第６，０４０，１７４号明細書、第６，０２０，１９１号明細書および第６，１１３，９１３号明細書、ならびにVirology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)のそれぞれ第６７章および第６８章のThomas Shenk, “Adenoviridae and their Replication”とM. S. Horwitz, “Adenoviruses”、および本明細書に記載の他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)、および本明細書に記載の他の参考文献に記載されているような、標準的な分子生物学的技術を伴う。

特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失および／またはＥ３欠失を含む。Ｅ１またはＥ３の欠失は、例えば、遺伝子の完全な欠失または、Ｅ１またはＥ３遺伝子産物を機能的に欠陥にする部分的な欠失を含み得る。したがって、特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えば、それがゲノムのＥ１領域に欠失を含むために、複製欠損となっている。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失した場合、これらの領域によってコードされる機能はトランスで、好ましくはプロデューサー細胞によって提供されなければならず、すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全体がアデノウイルスから欠失している場合、これらはプロデューサー細胞中に、例えばそのゲノム中に組み込まれるか、いわゆるヘルパーアデノウイルスまたはヘルパープラスミドの形で存在する必要がある。アデノウイルスはまた、複製に不要なＥ３領域中の欠失を有していてもよく、したがって、そのような欠失は補完される必要はない。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４領域の１つ以上はまた、不活化される領域に目的の導入遺伝子（通常はプロモーターに連結されている）を挿入することなどによって、他の手段によって不活化され得る。

使用され得るプロデューサー細胞（当技術分野および本明細書において「パッケージング細胞」または「補完細胞」と呼ばれることもある）は、所望のアデノウイルスが増殖され得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルスの欠損を補完するプロデューサー細胞中で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくは、それらのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有し、それにより、Ｅ１領域に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Gao et al, 2000, Hum Gene Ther 11: 213-19）、２９３などといった、任意のＥ１補完プロデューサー細胞が使用され得る。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサー細胞におけるアデノウイルスベクターの産生は（Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703）において概説されている。

特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、１つ以上のヒトアデノウイルス核酸配列を含むキメラアデノウイルスベクターである。ヒトアデノウイルスの核酸は、例えば、ヒトアデノウイルス－４（Ａｄ－４）、ヒトアデノウイルス－５（Ａｄ－５）、ヒトアデノウイルス－２６（Ａｄ－２６）、またはヒトアデノウイルス－３５（Ａｄ－３５）から選択され得る。特定の実施形態において、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターは、ヒトＡｄ５のアデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、例えば２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞などのＡｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能とする（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるFallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照）。

特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。「導入遺伝子」は、ベクター中に天然には存在しない核酸である異種核酸を指し、本発明によれば、導入遺伝子は、対象において免疫応答を誘発する抗原性遺伝子産物または抗原性タンパク質をコードし得る。導入遺伝子はまた、それを必要とする対象における疾患を治療または予防するための治療用タンパク質もコードし得る。導入遺伝子は、例えば、標準的な分子生物学的技術によってベクターに導入され得る。導入遺伝子は、例えば、アデノウイルスベクターの削除されたＥ１またはＥ３領域中、またはＥ４領域とｒＩＴＲの間の領域にクローニングされ得る。導入遺伝子は一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態において、導入遺伝子は、導入遺伝子挿入部位に挿入される。

必要に応じて、本発明の実施形態によるファイバー、ヘキソン、およびペントンポリペプチド配列を含むキメラアデノウイルスキャプシド配列、および／または導入遺伝子は、処理される宿主（例えば、ヒト）における適切な発現を確実にするためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、当技術分野で広く適用されている技術である。

導入遺伝子は、アデノウイルス由来のプロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下（すなわち、作動可能に連結されている）にあっても、または異種プロモーターの制御下にあってもよい。適切な異種プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターを含む。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の目的の異種遺伝子の上流に位置する。

好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される核酸配列を含む。

医薬組成物および／または免疫原性組成物
別の一般的な側面では、本発明の単離されたポリヌクレオチド、本発明の単離されたポリペプチド、本発明のベクター、本発明のアデノウイルスベクター、および／または本発明の宿主細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、本発明の単離されたポリヌクレオチド、本発明の単離されたポリペプチド、本発明の単離されたベクター（例えば、アデノウイルスベクター）、および／または本発明の宿主細胞を、薬学的に許容できる担体と一緒に含む生成物を意味する。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、および／または宿主細胞、ならびにそれらを含む組成物はまた、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造においても有用である。

本明細書で使用される場合、用語「担体」は、医薬製剤において使用するための当技術分野で周知の任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質を含む小胞、ミクロスフィア、リポソーム被包、または他の物質を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解されよう。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明による組成物の有効性または本発明による組成物の生物学的活性を妨害しない非毒性物質を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、および／または宿主細胞医薬組成物における使用に適した任意の薬学的に許容される担体が、本発明において使用され得る。

薬学的に活性な成分を薬学的に許容される担体と共に製剤化することは、当技術分野において、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例えば、第２１版（２００５年）およびそれ以降の版）において知られている。追加の成分の非限定的な例は、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張性調節剤、防腐剤、安定剤、およびキレート剤を含む。本発明の医薬組成物の製剤化には、１つ以上の薬学的に許容される担体が使用され得る。

医薬組成物は、例えば、それを必要とする対象における導入遺伝子の発現のために製剤化され得る（すなわち、それを必要とする対象における導入遺伝子の発現のために設計された医薬組成物）。医薬組成物は、例えば、抗原ポリペプチドまたはその抗原性断片の発現のために製剤化され得る（例えば、それを必要とする対象において免疫反応を誘発するための医薬組成物）。

それを必要とする対象において免疫応答を誘発するように設計された医薬組成物は、例えば、免疫原性組成物と呼ばれ得る。免疫原性組成物は、本発明で使用するための免疫学的に有効な量の精製または部分的に精製されたアデノウイルスベクターを含む組成物である。前記組成物は、当技術分野で周知の方法に従って、ワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として製剤化され得る。このような組成物は、免疫応答を増強するためのアジュバントを含むことができる。製剤中の各成分の最適な比率は、本開示を考慮して当業者に周知の技術によって決定され得る。

本発明の実施形態による免疫原性組成物は、本開示を考慮して当業者に知られている方法を使用して製造され得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコールが含められ得る。

本発明において有用な免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。本発明による同時投与に適したアジュバントは、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、アジュマー、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ，ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－アレチン、ＭＰＣ－０２６、アジュバックス、ＣｐＧ ＯＤＮ、ベータフェクチン、Ａｌｕｍ、およびＭＦ５９を含み、対象において潜在的に安全で、忍容性が高く、効果的なものであるべきである。

投与可能な他のアジュバントは、レクチン、成長因子、サイトカインおよびリンフォカイン、例えば、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇＭＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－Ｉ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはこれらをコードする核酸を含む。

本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含み得る。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効能を妨げるべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内または腹腔内経路に依存し得る。

防御免疫の誘導および／または導入遺伝子の発現方法
本発明の別の一般的な側面は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法、および／または導入遺伝子を発現させる方法に関する。本方法は、例えば、それを必要とする対象を同定すること；それを必要とする対象を本明細書に記載の医薬および／または免疫原性組成物と接触させること；ならびに、それを必要とする対象において免疫応答を誘発し、および／または導入遺伝子を発現させることを含み得る。特定の実施形態では、方法は、例えば、本明細書に記載のアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。

また、本明細書では、ワクチンを製造する方法も提供される。本方法は、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む。

本明細書に記載されるものを含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態による免疫原性組成物のいずれも、ワクチンとして本発明の方法に使用され得る。本明細書に記載されるものを含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態による医薬組成物のいずれも、目的の導入遺伝子を発現させることによって、それを必要とする対象の疾患を治療または予防するための本発明の方法において使用され得る。

ベクターを含む免疫原性組成物／ワクチン／医薬組成物の投与は、典型的には、筋肉内または皮下である。しかしながら、静脈内、皮膚、皮内、鼻腔内などの他の投与様式も同様に想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、針を使用してアデノウイルスベクターの懸濁液を注射することによって達成され得る。代替法は、組成物を投与するための無針注射装置の使用（例えば、ＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（登録商標）を使用）、またはワクチンを含む凍結乾燥粉末の使用である。

静脈内注射、皮膚注射、皮下注射、または患部への注射の場合、ベクターは、パイロジェンを含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態とされるであろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが十分にできる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または他の添加剤が含められ得る。また、徐放性製剤を採用することも可能である。

典型的には、投与は、感染または症状の発症の前に、目的の抗原（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、および／または真菌の病原体）に対する免疫応答を生成する予防的な目的を有することになる。目的の導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの投与はまた、それを必要とする対象における予防的な目的も有し得る。例えば、それを必要とする対象は、目的の導入遺伝子に対応する遺伝子の内因性発現が減少または消失している可能性がある。本発明に従って治療または予防することができる疾患および障害は、免疫応答が防御的または治療的役割を果たすことができ、および／または導入遺伝子の矯正的な発現がそれを必要とする対象における細胞の正常な機能をもたらすものを含む。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、曝露後予防のために投与され得る。

キメラヒトアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物は、対象に投与され、対象において目的の抗原に対する免疫応答を生じさせる。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、組成物の「免疫学的有効量」または「有効量」と定義される。本発明の免疫原性組成物は、体液性ならびに細胞性の免疫応答を誘導することができる。典型的な実施形態では、免疫応答は防御免疫応答である。

医薬組成物は、疾患を治療または予防するために、治療有効量で、それを必要とする対象に投与され得る。治療有効量とは、疾患、障害、もしくは状態の治療をもたらす目的の導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの量；疾患、障害、もしくは状態の進行を防ぐか、もしくは遅らせる量；または、疾患、障害、もしくは状態に関連する症状を低減もしくは完全に緩和する量を意味する。

特定の実施形態によれば、治療有効量とは、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を達成するのに十分な治療薬の量を意味する：（ｉ）治療される疾患、障害、もしくは状態、またはそれに関連する症状の重症度を低減または改善する；（ｉｉ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の持続時間を短縮する；（ｉｉｉ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の進行を防ぐ；（ｉｖ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の退行を引き起こす；（ｖ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の発症もしくは発病を防ぐ；（ｖｉ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状の再発を防ぐ；（ｖｉｉ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院を減らす；（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮する；（ｉｘ）治療される疾患、障害、状態、またはそれに関連する症状を有する対象の生存期間を延長する；（ｘｉ）治療される疾患、障害、状態、またはそれに関連する症状を対象において抑制または軽減する；および／または（ｘｉｉ）別の療法の予防効果または治療効果を増強または改善する。

本明細書で使用される場合、用語「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」は全て、対象において必ずしも識別可能ではないが、対象において識別可能となり得る、疾患、障害または状態に関連する少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善または逆転を指すことが意図される。「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」という用語はまた、疾患、障害、または状態の退行を引き起こすこと、進行を防ぐこと、または少なくとも進行を遅らせることも指し得る。特定の実施形態において、「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」は、疾患、障害、または状態に関連する１つ以上の症状の緩和、発症または発病の予防、または期間の短縮を指す。特定の実施形態において、「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」は、疾患、障害、または状態の再発の防止を指す。特定の実施形態において、「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」は、疾患、障害、または状態を有する対象の生存期間の延長を指す。特定の実施形態において、「治療する（treat）」、「治療している（treating）」、および「治療（treatment）」は、対象における疾患、障害、または状態の排除を指す。

実際に投与される量、および投与の速度と時間経過は、治療されるものの性質と重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医およびその他の医師、あるいは獣医学の文脈では獣医師の責任の範囲であり、通常、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に知られている他の因子を考慮する。上記の技術およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980に記載されている。

アデノウイルスベクターの産生およびそのような粒子の組成物への任意選択的な製剤化の後、ベクターは個体、特にヒトまたは別の霊長類に投与され得る。投与は、ヒト、または他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、サル、イヌ、またはネコに対して行われ得る。非ヒト哺乳動物への送達は、治療目的である必要はないが、例えば、アデノウイルスベクターに対する免疫応答のメカニズムの調査において、実験的な文脈で使用され得る。

１つの例示的なレジメンでは、アデノウイルスベクターは、約１０^４から１０^１２ウイルス粒子／ｍｌの濃度を含む約１００μｌから約１０ｍｌの範囲の体積で（例えば、筋肉内に）投与される。好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．１から２．０ｍｌの範囲の体積で投与される。例えば、アデノウイルスベクターは、１００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌで投与され得る。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、０．５ｍｌの体積で投与される。任意選択的に、アデノウイルスベクターは、約１０^７ｖｐ／ｍｌ、１０^８ｖｐ／ｍｌ、１０^９ｖｐ／ｍｌ、１０^１０ｖｐ／ｍｌ、５×１０^１０ｖｐ／ｍｌ、１０^１１ｖｐ／ｍｌ、または１０^１２ｖｐ／ｍｌの濃度で投与され得る。典型的には、アデノウイルスベクターは、１回の投与中に約１０^９から約１０^１２のウイルス粒子（ｖｐ）の量で、より典型的には約１０^１０から約１０^１２ｖｐの量でヒト対象に投与される。例えば、最初の投与の後に、上記のようなブーストを行うことができる。

初回投与に続いて、目的の抗原および／または目的の導入遺伝子をコードする同じアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物、あるいは同じ目的の抗原および／または目的の導入遺伝子をコードする異なるアデノウイルスベクターを含むワクチン／組成物からのブーストまたはキックを行うことができる。

組成物は、所望により、活性成分を含む１つ以上の単位投与形態を含み得るキット、パックまたはディスペンサーにおいて提示され得る。キットは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔またはプラスチック箔を含み得る。キット、パック、またはディスペンサーには、投与に関する説明書が添付され得る。

本発明の組成物は、治療される状態に依存して単独で、または他の治療と組み合わせて、同時または逐次的のいずれかで投与され得る。

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。

実施形態１は、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列であって、キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含む、単離された核酸配列である。

実施形態２は、ファイバーポリペプチド配列が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離された核酸配列である。

実施形態３は、ヘキソンポリペプチド配列が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１または２に記載の単離された核酸である。

実施形態４は、ペントンポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離された核酸である。

実施形態５は、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離された核酸を含むベクター。

実施形態６は、ベクターがアデノウイルスベクターである、実施形態５に記載のベクターである。

実施形態７は、アデノウイルスベクターが、導入遺伝子をさらに含み、任意選択的に、導入遺伝子が治療用の導入遺伝子である、実施形態６に記載のベクターである。

実施形態８は、アデノウイルスベクターが、Ｅ１欠失をさらに含む、実施形態６または７に記載のベクターである。

実施形態９は、アデノウイルスベクターが、Ｅ３欠失をさらに含む、実施形態６～８のいずれか１つに記載のベクターである。

実施形態１０は、アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、またはヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つからの、１つ以上のアデノウイルス核酸配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである、実施形態６～９のいずれか１つに記載のベクターである。

実施形態１１は、アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）Ｅ４ｏｒｆ６を含む、実施形態１０に記載のベクターである。

実施形態１２は、アデノウイルスベクターが、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の群から選択される核酸配列を含む、実施形態６～１０のいずれか１つに記載のベクターである。

実施形態１３は、導入遺伝子が、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失に位置し、および／または右逆位末端反復配列（ｒＩＴＲ）に隣接している、実施形態６～１２のいずれか１つに記載のベクターである。

実施形態１４は、実施形態５～１２のいずれか１つに記載のベクターを含む、組換え細胞である。

実施形態１５は、以下を含む、ベクターを製造する方法である：
（ａ）アデノウイルスベクターの産生のための条件下で実施形態１４に記載の組換え細胞を増殖させること；および
（ｂ）組換え細胞からベクターを単離すること。

実施形態１６は、実施形態６～１３のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物である。

実施形態１７は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、実施形態１６に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態１８は、ワクチンを製造する方法であって、実施形態６～１３のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、方法である。

実施形態１９は、（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子；および（ｂ）キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターであって、キメラアデノウイルスキャプシドが、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含む、アデノウイルスベクターである。

実施形態２０は、ファイバーポリペプチド配列が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２１は、ヘキソンポリペプチド配列が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１９または２０に記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２２は、ペントンポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２３は、アデノウイルスベクターが、Ｅ１欠失をさらに含む、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２４は、アデノウイルスベクターが、Ｅ３欠失をさらに含む、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２５は、アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、またはヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つからの、１つまたは複数のアデノウイルス核酸配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２６は、アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）Ｅ４ｏｒｆ６を含む、実施形態２５に記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２７は、アデノウイルスベクターが、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の群から選択される核酸配列を含む、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２８は、導入遺伝子が、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失に位置し、および／または右逆位末端反復配列（ｒＩＴＲ）に隣接している、実施形態１９～２７のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態２９は、導入遺伝子が治療用の導入遺伝子である、実施形態１９～２８のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターである。

実施形態３０は、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含む、組換え細胞である。

実施形態３１は、以下を含む、アデノウイルスベクターを製造する方法である：
（ａ）アデノウイルスベクターの産生のための条件下で実施形態３０に記載の組換え細胞を増殖させること；および
（ｂ）組換え細胞からアデノウイルスベクターを単離すること。

実施形態３２は、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

実施形態３３は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、実施形態３２に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法である。

実施形態３４は、ワクチンを製造する方法であって、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、方法である。

実施形態３５は、それを必要とする対象において導入遺伝子を発現させる方法であって、以下を含む方法である：
ａ．発現される導入遺伝子を必要とする対象を特定すること；
ｂ．対象を実施形態７に記載のベクターまたは実施形態１９～２９のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターと接触させること；および
ｃ．対象において導入遺伝子を表現させること。

実施形態３６は、それを必要とする対象における導入遺伝子の発現が、疾患または障害を治療または予防する、実施形態３５に記載の方法である。

実施形態３７は、対象とベクターを接触させることが、対象から細胞を単離すること、および細胞をベクターと接触させることを含む、実施形態３５に記載の方法である。

実施形態３８は、それを必要とする対象がヒト対象である、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３９は、それを必要とする対象における疾患または障害を治療または予防するための実施形態７に記載のベクターの使用であって、方法が、それを必要とする対象にベクターを接触させることを含み、それを必要とする対象に接触させることが、治療用の導入遺伝子の発現をもたらす、使用である。

実施形態４０は、対象とベクターを接触させることが、対象から細胞を単離すること、および細胞をベクターと接触させることを含む、実施形態３９に記載の使用である。

実施形態４１は、それを必要とする対象における疾患または障害を治療または予防するための、実施形態１９～２９のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターの使用であって、方法が、それを必要とする対象にアデノウイルスベクターを接触させることを含み、それを必要とする対象に接触させることが、治療用の導入遺伝子の発現をもたらす、使用である。

実施形態４２は、対象とアデノウイルスベクターを接触させることが、対象から細胞を単離すること、および細胞をアデノウイルスベクターと接触させることを含む、実施形態４１に記載の使用である。

[実施例１]
新規アデノウイルス分離株Ａｄ２０－４２－４２に基づくＥ１およびＥ３欠失ベクターの生成。
新規のヒトアデノウイルス分離株、Ａｄ２０－４２－４２（配列番号１）を同定し、配列決定した。このヒトアデノウイルス分離株は、系統学的にヒトアデノウイルス種Ｄ（ＨＡｄＶ－Ｄ）に属することが見出され、それはＨＡｄＶ－２０とＨＡｄＶ－４２の天然のキメラである。ペントン遺伝子はＨＡｄＶ－２０に由来し、ヘキソンとファイバー遺伝子はＨＡｄＶ－４２に由来している。図１に、Ａｄ２０－４２－４２ヒトアデノウイルス分離株のゲノムマップを示す。

Ａｄ２０－４２－４２ベースのＡｄベクターの生成に使用された３プラスミド系の説明
Ａｄ２０－４２－４２ベースの組換えアデノウイルスベクターを３プラスミド系を使用して生成した。このプラスミド系は、アデノウイルスゲノムの５’末端をカバーし、Ｅ１領域が削除されて目的の遺伝子（ＬａｃＺ、Ｌｕｃ＋またはｅＧＦＰ）を保持する発現カセットに置き換えられている「アダプタープラスミド」からなる。２つ目の「中間」プラスミドは、アデノウイルスゲノムの中央部分をカバーし、修飾を有していない。アデノウイルス配列の３’末端は「右端」プラスミドによって保持される。右端コンストラクトでは、Ｅ３領域が削除され、Ｅ４領域中の天然のＯＲＦ６／７がＨＡｄＶ－５のＯＲＦ６／７に置き換えられている。

プラスミドは、約２０００ヌクレオチドの位置で互いに重複するウイルスベクター配列を保有しており、ＨＥＫ２９３またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞中でのこれらの配列間の相同組換えを可能とした（図２）。

Ａｄ２０－４２－４２ベースのＡｄベクターゲノムの設計：プラスミド系は、標準的な分子クローニング手順のいくつかのステップにより構築した。Ａｄ２０－４２－４２ベースのＡｄベクターゲノムはそれぞれ、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、異なる導入遺伝子挿入部位、および天然のＥ４オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）６およびｏｒｆ６／７のヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）のものへの置換を含むように設計した（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＣ＿０００００８の塩基対３２９６６～３４０７７）。

アダプタープラスミド
最初に、Ｅ１欠失アダプタープラスミド「ｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．Ｅｍｐｔｙ」を構築した。発現カセットは、削除されたＥ１領域の元の位置に配置した。このカセットは、サイトメガロウイルスの主要前初期プロモーター（すなわち「ＣＭＶプロモーター」）によって駆動され、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル（「ＳＶ４０ポリＡ」）を含んでいる。発現カセットには、目的の多様な遺伝子（ＬａｃＺ、Ｌｕｃ＋およびｅＧＦＰ）の挿入を容易にするマルチクローニングサイトが備えられている。空のアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２は、次のように構築した。

ヌクレオチド１～４６１の野生型アデノウイルス配列をカバーする断片１は、ＰＣＲプライマーによって導入された５’隣接ＰａｃＩ制限酵素部位と３’隣接ＡｖｒＩＩ部位により生成した。断片１のＰＣＲ産物をＰａｃＩとＡｖｒＩＩで二重消化した。

ＳＶ４０ポリＡおよび野生型アデノウイルス配列のヌクレオチド３３６１～５９０８を含む断片２は、２つのＰＣＲアンプリコンを調製し、続いてこれらの２つの産物のアセンブリＰＣＲを行うことによって生成した。「ＳＶ４０ポリＡ」を含む第１のＰＣＲ産物は、以前に構築したプラスミド（ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅｍｐｔｙ；Abbink et al., J. Virol. 81(9):4654-63 (2007)）から増幅させた。ＰＣＲ産物の５’末端にＸｂａＩ制限部位を導入し、その一方で、リバースプライマーによってＡｄ２０－４２－４２ホモログ断片をＰＣＲ産物に導入した。この重複には、天然のＸｂａＩ認識部位（Ａｄ２０－４２－４２ゲノム中に存在）が含まれていたが、認識部位の１つの塩基を変更することで意図的に破壊した。このＰＣＲ断片は１７４ｂｐの長さであった。第２のＰＣＲは、ｐＩＸの先頭（ｐＩＸを含む）からポリメラーゼ遺伝子のほぼ中央までのＡｄ２０－４２－４２ゲノムをカバーしている。このＰＣＲのフォワードプライマーには、ＳＶ４０ポリＡを含むＰＣＲ産物１との重複が含まれていた（ＸｂａＩ認識は破壊されている）。ＰａｃＩ認識部位をリバースプライマーを使用してこのＰＣＲ断片に導入した。このＰＣＲ断片は２５７４ｂｐの長さであった。その後、これらの断片を結合させるために、ＰＣＲ産物１と２を鋳型としてアセンブリＰＣＲを行った。アセンブリＰＣＲの産物サイズは２７１０ｂｐであった。続いて、このアセンブリＰＣＲ産物をＸｂａＩとＰａｃＩで二重消化した。

以前に構築したプラスミド（Abbink et al., J. Virol. 81(9):4654-63 (2007)）をＸｂａＩ、ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで消化して、プラスミドバックボーンとＣＭＶプロモーター（断片２１０８および８８０）を得た。その後、ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅｍｐｔｙの断片（断片２１０８および８８０）と断片１および断片２を使用して４点ライゲーションを行った。この結果、ｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．Ｅｍｐｔｙプラスミドが得られた。

レポーター遺伝子は、ユニークなＫｐｎＩ、ＨＩｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩ部位をＸｂａＩ部位と共に使用し、その後ライゲーションすることによってＭＣＳに挿入した。

中間プラスミド
中間プラスミドは、ヌクレオチド位置２０８８から１８４９４までの野生型アデノウイルスゲノムを修飾することなく保有している。まず、２つのＰＣＲ断片を作成した。１つは、中間断片の５’末端をカバーし、フォワードプライマーに組み込まれたＰａｃＩ部位を有しており、リバースプライマーは、アデノウイルスゲノム中の天然のＳｂｆＩ部位のわずかに下流に設計した（産物サイズ：２２７３ｂｐ）。アデノウイルスゲノム中の別の天然ＳｂｆＩ部位からわずかに上流に設計されたフォワードプライマーにより作成した第２のＰＣＲ断片では、ＰａｃＩ部位がリバースプライマーに組み込まれていた（産物サイズ：２４０７ｂｐ）。両方のＰＣＲ断片をＰａｃＩおよびＳｂｆＩ制限酵素により消化した。

隣接するＰａｃＩ部位を有するｐＢＲ３２２サブクローンバックボーンプラスミド（Abbink et al., J. Virol. 81(9):4654-63 (2007)）をＰａｃＩで消化した（２０８６ｂｐ）。２つの二重消化ＰＣＲ産物とＰａｃＩ消化、脱リン酸化ｐＢｒバックボーンプラスミドを使用して、３点ライゲーションを行った。この結果、プラスミドｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＰａｃＩ－ＳｂｆＩが得られた。前のステップで得られたｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＰａｃＩ－ＳｂｆＩプラスミドをＳｂｆＩ制限酵素で切り開いた。野生型Ａｄ２０－４２－４２ゲノムＤＮＡをＳｂｆＩ制限酵素で消化し、ポリメラーゼ遺伝子からｐＶＩ遺伝子のほぼ中央まで野生型ゲノムをカバーする１１８５８ヌクレオチド長の断片をｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＰａｃＩ－ＳｂｆＩプラスミドにライゲーションした。この結果、「ｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＳｂｆＩ ｆｉｎａｌ ｉｎｔｅｒｍ」プラスミドが得られた。

右端プラスミド
ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２．ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲの構築：Ａｄ－２０－４２－４２ゲノムの右端の５’末端を、ＰＣＲ産物に天然のＳｒｆＩ－ＳｂｆＩ断片が含まれるようにして、ＰＣＲ（断片１、２０９８ｂｐ）により増幅させ、フォワードプライマーにはＰａｃＩ認識部位を補った。また、Ａｄ－２０－４２－４２ゲノムの右端の３’末端をカバーする別の断片は、フォワードプライマーによりＳｂｆＩ認識部位を導入し、リバースプライマーにＰａｃＩ認識部位を組み込んで作製した。ＰＣＲ産物の５’末端の近くに天然のＭｌｕＩ部位が存在していた。その後、両方のＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳｂｆＩ酵素で消化した。

隣接するＰａｃＩ部位を有するｐＢＲ３２２サブクローンバックボーンプラスミド（Abbink et al., J. Virol. 81(9):4654-63 (2007)）をＰａｃＩで消化した（断片サイズ：２１０８ｂｐ）。前のステップで得られた２つのＰａｃＩおよびＳｂｆＩ消化ＰＣＲ断片をｐＢＲバックボーンにクローニングし、ｐＢｒＳｒｆＩ－ＳｂｆＩ／ＭｌｕＩ－ｒＩＴＲプラスミドが得られた。次に、このプラスミドをＳｂｆＩとＭｌｕＩで消化した。Ａｄ２０－４２－４２野生型ゲノムＤＮＡをＳｂｆＩとＭｌｕＩで消化し、ゲノムヌクレオチド位置１７７４２と３３７１４の間の断片を単離して、上記のプラスミド中にクローニングした。この結果、１５３７３位からｒＩＴＲの最後のヌクレオチド（３５１８７）まで野生型Ａｄ２０－４２－４２ゲノムを保有するｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲが得られた。

Ｅ３領域の欠失：Ｅ３領域を欠失させる目的で、ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲプラスミドを鋳型として２つのＰＣＲを実施した。１つ目は、削除する領域から上流に設計した；フォワードプライマーは天然のＡｓｃＩ部位をカバーしており、リバースプライマーにはＳｐｅＩ部位が組み込まれていた。第２のＰＣＲは、Ｅ３領域の下流に設計した。リバースプライマーはＡｄ２０－４２－４２ゲノムの天然のＥｃｏＲＩ部位をカバーし、一方、フォワードプライマーにはＳｐｅＩ部位を組み込んだ。その後、第１の産物をＳｐｅＩとＡｓｃＩで二重消化し、第２の産物をＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで二重消化した。ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ Ｓｒｆ－ｒＩＴＲプラスミドをＡｓｃＩとＥｃｏＲＩで消化し、消化したプラスミドとＰＣＲ産物を用いて３点ライゲーションを行った。それゆえ、野生型Ａｄ２０－４２－４２のゲノムヌクレオチド位置２６６７３から３０７５３の間の断片はゲノムから脱落し、導入したＳｐｅＩ部位によって配列が連結された。この結果、ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２．ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３プラスミドが得られた。

ＨＡｄＶ－５の相同領域による天然のＯＲＦ６／７の置換：ＯＲＦ６／７を置換するために、３つの断片をＰＣＲによって増幅した。２つは、置換されるＯＲＦ６／７の上流と下流の領域をカバーするように設計した。第１のＰＣＲのフォワードプライマーはＡｓｃＩ部位を保有し、第２のＰＣＲのリバースプライマーはＥｃｏＲＩ部位を保有していた。第３のＰＣＲは、以前に作製したプラスミド（ｐＢｒ．Ａｄ２６．ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６（Abbink et al., J. Virol. 81(9):4654-63 (2007)）からＨＡｄＶ－５ ＯＲＦ６／７を得るために行い、それは他の２つのＰＣＲ産物と部分的に重複していた。次に、これらの３つのＰＣＲ産物を融合ＰＣＲにかけ、続いてＡｓｃＩとＥｃｏＲＩで二重消化した。ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２．ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３プラスミドもＡｓｃＩとＥｃｏＲＩで消化し、消化した融合ＰＣＲ産物を２点ライゲーションで挿入して、最終的な右端プラスミド：ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ Ｓｒｆ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６を得た。

Ａｄ２０－４２－４２ベースのアデノウイルスベクターの作製と生産
アデノウイルスベクターゲノム配列、配列番号８、配列番号９および配列番号１０をそれぞれ含むアデノウイルスベクターＡｄ２０－４２－４２．ＬａｃＺ．５ＯＲＦ６、Ａｄ２０－４２－４２．Ｌｕｃ＋．５ＯＲＦ６およびＡｄ２０－４２－４２．ｅＧＦＰ．５ＯＲＦ６を、対応するプラスミドのトランスフェクションにより生成した：（１）アダプタープラスミド「ｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．ＬａｃＺ」（配列番号３）またはｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．Ｌｕｃ＋（配列番号４）またはｐＡｄＡｐｔ２０－４２－４２．ｅＧＦＰ（配列番号５）；（２）中間プラスミド「ｐＢＲ．Ａｄ２０－４２－４２．ＳｂｆＩ ｆｉｎａｌ ｉｎｔｅｒｍ」（配列番号６；図５）；（３）右端プラスミド「ｐＢｒＡｄ２０－４２－４２ ＳｒｆＩ－ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６」（配列番号７；図６）。

Ｅ１補完ＨＥＫ２９３細胞において、３プラスミド系によるトランスフェクションを行った。１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において付着培養物として増殖させたＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする前に、ＡｄベクターゲノムプラスミドをＰａｃＩで消化して、プラスミドからそれぞれのアデノウイルスベクターゲノム断片を放出させた。トランスフェクションは、リポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて標準的な手順で実施した。ウイルスレスキュートランスフェクションを回収した後、ＨＥＫ２９３細胞培養に対する数回の連続感染によりウイルスをさらに増幅させた。ウイルスは、以前に記載されたようにして、２ステップの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心法を用いて粗ウイルス収穫物から精製した（Havenga et al., “Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells,” J. Gen. Virol. 87(8): 2135-43 (2006)）。ウイルス粒子（ＶＰ）の力価は、以前に記載された分光光度法に基づく手順によって測定した（Maizel et al., “The polypeptides of adenovirus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12,” Virology, 36(1):115-25 (1968)）。

[実施例２]
新規アデノウイルスベクターにより誘導される細胞性および体液性の免疫応答
この実施例では、本明細書において生成した新規なＡｄ２０－４２－４２ベースのアデノウイルスベクターの免疫原性を評価するために行った実験について説明する。これらの実験では、筋肉内免疫後のマウスにおいて、ベクターにコードされた（モデル）抗原に対する体液性および細胞性の免疫応答を誘導する能力について、新規ベクターを評価した。試験したベクターは、モデル抗原としてホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するものであった。ベクターを、ヒトアデノウイルス２６型（ＨＡｄＶ－２６、本明細書ではＡｄ２６とも呼ばれる）に基づくベンチマークベクターと並べて比較した。それぞれの抗原に対する免疫応答を、酵素結合免疫スポット法（ＥＬＩＳＰＯＴ）および酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの周知の免疫学的アッセイを用いて測定した。

Ａｄ２０－４２－４２．ＦＬｕｃにより誘導される細胞性免疫応答
新規アデノウイルスベクターＡｄ２０－４２－４２の免疫原性を、Ａｄ２６．ＦＬｕｃ（ベンチマーク対照）、ホタルルシフェラーゼを発現するＡｄ２０－４２－４２ベクター（Ａｄ２０－４２－４２．ＦＬｕｃ）、または導入遺伝子を欠くアデノベクター（Ａｄ２６．Ｅ）で筋肉内注射により免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて評価した。Ａｄ２６．Ｅ群で１０^１０ｖｐが使用された以外は、マウスあたり１０^９および１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）の２種類のベクター用量で投与試験を行った。免疫化の２週間後に動物を屠殺し、血清と脾細胞をサンプリングした（図７Ａ）。

ベクターがコードする抗原に対する細胞性免疫応答をＦＬｕｃ特異的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した。この目的のために、免疫化されたマウスから屠殺時にサンプリングした脾細胞を、１５ｍｅｒの重複するＦＬｕｃペプチドプールで一晩刺激した。抗原特異的免疫応答は、ＩＦＮ－γ分泌細胞の相対数を測定することによって決定した（図７Ｂ）。結果は、Ａｄ２０－４２－４２によって誘導される細胞性免疫応答が、最高免疫量（１０^１０）でＡｄ２６．Ｆｌｕｃについて見られる応答に匹敵することを示している。予想通り、ホタルルシフェラーゼを欠くアデノベクター（Ａｄ２６．Ｅ）に対しては、ＦＬｕｃ特異的な応答は検出されなかった。全体として、データはＡｄ２０－４２－４２が強い細胞性の応答を誘導することを示している。

[実施例３]
新規および既存のアデノウイルスベクター間における血清学的交差中和の評価
新規アデノウイルスワクチンベクターとしてのそれらの潜在的な有用性のためには、本明細書において作成された新規Ａｄ２０－４２－４２アデノウイルスベクターは、ワクチンベクターとして現在開発中の既存のアデノウイルスベクター、例えばヒトアデノウイルス血清型ＨＡｄＶ－２６に基づくベクターとは血清学的に異なることが好ましい。したがって、新規Ａｄ２０－４２－４２アデノウイルスベクターとＨＡｄＶ－２６（Ａｄ２６）に基づく既存のベクターとの間における交差中和試験を行った。この目的のために、アデノウイルス中和アッセイにおいて、これらのベクターに対して産生されたマウス抗血清の交差試験を両ベクターに対して行った。このアッセイに使用したマウス抗血清は、マウスあたり１０^１０個のベクター粒子で免疫した２週間後に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスから採取したものである。アデノウイルス中和アッセイは、以前に記述されたようにして実施した（Spangers et al 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052）。簡単に説明すると、１：１６希釈から始めて、血清を２倍段階希釈し、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合し、続いて（細胞あたり５００ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で）Ａ５４９細胞と一晩インキュベートした。感染の２４時間後に測定された感染細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表していた。所与のベクターに対する中和力価は、ベクターの感染効率を９０％低下させることができる最も高い血清希釈率として定義された。中和力価は任意に以下のカテゴリーに分類した：＜１６（中和なし），１６．１～２００（わずかに交差中和）、２０１～２，０００（交差中和）、＞２，００１（強い交差中和）。結果は、試験したベクター間の主要な交差中和を示していない（図８）。ベクターＡｄ２０－４２－４２とＡｄ２６の間には、わずかな一方向の交差中和が見られただけで、Ａｄ２６抗血清はＡｄ２０－４２－４２に対して２３の中和力価を示したが、Ａｄ２０－４２－４２抗血清はＡｄ２６に対していかなる中和も示さなかった。このように、新規アデノウイルスベクターＡｄ２０－４２－４２は、ヒトアデノウイルスベクターＡｄ２６との交差中和が低いか存在しないことを示した。

[実施例４]
ヒト集団における新規アデノウイルスベクターの血清有病率
ワクチン標的集団における高レベルの既存の抗ベクター体液性免疫は、有効なワクチンプラットフォームとしての新規アデノウイルスベクターの潜在的な使用を妨げ得る。そこで、１０３のヒト血清サンプルにおける血清有病率について、Ａｄ２０－４２－４２ベクターを評価した。ＣＰＥベースのアッセイ（野生型（ｗｔ）ウイルスの場合）およびレポーターアッセイ（Ｌｕｃ＋発現ウイルスの場合）を実施することにより、ヒト血清サンプルによる中和についてベクターを試験した。

実施例３に記載されているように、標準的なアデノウイルス中和アッセイを以前に記述されたようにして実施した（Spangers et al 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5046-5052）。野生型アデノウイルス中和アッセイでは、血清を５５℃で１５分間熱不活性化し、希釈した（１／２、１／４、１／８、１／１６、または１／３２）。次に、血清を含むウェルに、２００細胞培養阻害量５０％（ＣＣＩＤ_５０）に希釈した５０μｌのアデノウイルスストックを添加した。５～６日目に、プレートをＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＣＰＥの阻害について分析した。ＣＰＥの保護が＞９０％の場合、血清を中和に対して陽性と評価した。複製阻害のパーセンテージを陽性および陰性対照と比較して計算した。

上記のように、簡単に説明すると、１：１６希釈から始めて、血清を２倍段階希釈し、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を発現するアデノウイルスベクターと事前に混合し、続いて（細胞あたり５００ウイルス粒子の感染多重度で）Ａ５４９細胞と一晩インキュベートした。感染の２４時間後に、測定された感染細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性レベルは、ベクター感染効率を表していた。所与のベクターに対する中和力価は、ベクターの感染効率を９０％低下させることができる最も高い血清希釈率として定義された。中和力価は任意に以下のカテゴリーに分類した：＜１６（中和なし）、１６～５０、５０～２００、２００～５００、５００～１０００、＞１０００。

結果は、Ａｄ２０－４２－４２アデノウイルスベクターが、同じアッセイで試験したＨＡｄＶ－５ベクターと比較すると、試験したヒト対象において、かなり低い血清有病率（２０～３５％の血清陽性率）を有することを示している（図９）。さらに、新規のＡｄ２０－４２－４２ベクターに対して見られた陽性の中和力価は一般に低く、ほとんどが２００以下であった。対照的に、ＨＡｄＶ－５に対して見られた陽性の中和力価は、より高い範囲にあり、１０００を超えていた。ベクターＨＡｄＶ－３５はＡｄ２０－４２－４２と同様の％の血清陽性率を示したが、ＨＡｄＶ－３５で観察された力価はＡｄ２０－４２－４２よりも高い範囲であった。

まとめると、以上のデータは、Ａｄ２０－４２－４２ベクターに対する既存の体液性抗ベクター免疫が、評価されたワクチン標的集団において低いとみなし得ることを指し示しており、これは、このベクターがこのヒト集団において有効なワクチンベクターとしての可能性を有することを示唆している。

[実施例５]
ヒト血管細胞におけるＡｄ２０－４２－４２ベクターの形質導入能力
目的の細胞を形質導入し、それらがコードするタンパク質を発現する能力は、遺伝子治療に使用されるベクターの本質的な特徴である。新規アデノウイルスベクターＡｄ２０－４２－４２を、ルシフェラーゼアッセイを使用して血管細胞における形質導入能力について試験した。

簡単に説明すると、ＨＳＶＥＣ（ヒト伏在静脈内皮細胞）細胞に対して、血液凝固因子Ｘ（ＦＸ）の存在下または不在下で、ルシフェラーゼおよびＬａｃＺを発現するＡｄ２０－４２－４２ベクターにより用量依存的な形質導入を行い、ＦＸを介したトロピズムの修飾に対する感受性の有無を確認した。ＨＡｄ５とＨＡｄ３５を対照ベクターとして使用した。細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。ＦＸの添加および無添加で、３７℃で３時間、それらにルシフェラーゼを発現するＡｄ５Ｌｕｃ、Ａｄ３５Ｌｕｃ、Ａｄ２０－４２－４２Ｌｕｃ＋を１細胞あたり１０００、５０００、１０，０００個のウイルス粒子（ｖｐ）により感染させた。３時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を完全培地中で４８時間培養した後、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現の分析を行い、タンパク質１ミリグラム（ｍｇ）あたりの相対光単位（ＲＬＵ）として表した。

群間の統計的有意性は、２標本両側スチューデントのｔ検定を用いて計算し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした（ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊）。全ての結果は、いくつかの実験からの平均データを表しており、各条件について４回繰り返している（図１０）。

得られたデータは、ＦＸの存在下で、ＨＡｄ５およびＨＡｄ３５よりも、Ａｄ２０－４２－４２の方が顕著に高い形質導入ポテンシャルを有することを示している。１０，０００ｖｐ／細胞の用量を適用した場合に最高のルシフェラーゼ発現が認められ、ＦＸの存在下では１．５×１０^９のレベルに達し、ＦＸが存在しない場合も約１×１０^８のレベルに達した。したがって、これらの結果は、Ａｄ２０－４２－４２の形質導入がＦＸによって有意に増強され、このベクターがＦＸの存在下で２つの対照ベクターよりも強い形質導入特性を有することを示している。

Ａｄ２０－４２－４２のＨＡｄ５対照ベクターを上回る優れた形質導入プロファイルは、ＦＸの存在下で３つの異なるベクター用量（１０００、５０００および１０，０００ｖｐ／細胞）を用いたＨＳＶＥＣ細胞のＬａｃＺ染色により確認された。染色は単純な光学顕微鏡で観察した（図１１）。

予想通り、結果は、用量が増加するにつれて染色の漸増を示した。図１１の右から左に１０００、５０００、１０，０００ｖｐ／細胞の染色を示す。Ａｄ２０－４２－４２で形質導入された細胞は、ＨＡｄ５で形質導入された細胞と比較して、より強い染色を示した。

全体として、データは、Ａｄ２０－４２－４２が血管細胞を形質導入することができ、これはＦＸの存在下において対照ベクターよりも高いことを示した。これはＡｄ２０－４２－４２を、心血管疾患や癌など、内皮細胞が特徴的な疾患の治療に使用される優れた遺伝子治療ベクター候補とする。

[実施例６]
ＡｄＶ２０－４２－４２の候補受容体
他の多くのベクターの中でそれを区別するＡｄ２０－４２－４２の重要な特徴は、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）ならびにＣＤ４６細胞受容体の両方に結合する可能性と、ＦＸの形質導入促進に対する感受性があることから、よって、Ａｄ２０－４２－４２ベクターを用いた遺伝子治療が可能なヒトの細胞および組織の範囲が広がることである。

Ａｄ２０－４２－４２が複数の受容体に結合する能力を調べ、それらを細胞侵入のためのツールとして使用するために、いくつかの指標となる細胞型を使用した。ＣＡＲを発現または欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；シアル酸を発現または欠損しているＣＨＯ細胞；デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現または欠損しているＴＣ１細胞に対して、Ａｄ２０－４２－４２および対照ベクターとして使用したＨＡｄ５を用いて形質導入した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。１０，０００ｖｐ／細胞により細胞に形質導入し、ルシフェラーゼアッセイを上記のようにして行った。

これらの実験から得られた結果は、３つの受容体全てをその表面に有する細胞において、シアル酸およびＤＳＧ２に比べて、Ａｄ２０－４２－４２が結合するＣＡＲが潜在的に支配的な膜貫通型受容体であると定義した。

このベクターが、細胞侵入のために多くのアデノウイルスタイプによって一般的に使用される別の受容体であるＣＤ４６に結合する能力を調べるために、同様な実験を行った。この目的のために、この受容体の異なるアイソフォーム（ＢＣ１、ＢＣ２、Ｃ１、およびＣ２）を含む、または欠くＣＨＯ細胞に対して、Ａｄ２０－４２－４２および対照ベクターとして使用したＨＡｄ５を用いて形質導入を行った。Ａｄ２０－４２－４２は、細胞感染の過程で主にＣ２受容体アイソフォームを使用しているように見えることが示された。他方、ＣＤ４６を欠くＫ１細胞は、ほとんど形質導入されなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。

群間の統計的有意性は、２標本両側スチューデントのｔ検定を用いて計算し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした（ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊）。全ての結果は、数回行った実験からの平均データを表しており、各条件について４回繰り返している。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示されている。

これらの知見は、新規アデノウイルスベクターＡｄ２０－４２－４２が、多くの細胞型に存在するＣＡＲとＣＤ４６という両方の受容体に結合することを指し示している。これは、Ａｄ２０－４２－４２ベクターによって形質導入され得る細胞型の範囲を拡大し、これは、遺伝子治療における使用にとり有益となり得る。

[実施例７]
Ａｄ２０－４２－４２のマウスにおける生体内分布
Ａｄ２０－４２－４２の生体内分布、その心血管系（ＣＶＳ）への影響、遺伝子送達ベクターとしての役割を調べる目的で、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を行った。

８～１０週齢の免疫適格性の雄マウスを使用した。動物の６つの群を形成した（各ウイルス試験群は５匹の動物を含み、対照ＰＢＳ群は３匹の動物を含む）。循環マクロファージを枯渇させ、生物全体のレベルでウイルスの通過をより効率的に評価するために、ウイルス投与の４８時間前に２００μｌのクロドロネートリポソーム（ＣＬ）を対応する群に静脈内（ｉｖ）投与した。

治療群には、単一ウイルス用量（１００μｌのＰＢＳで希釈した１０ｘ１０^１１ウイルス粒子（ＶＰ））のＡｄ２０－４２－４２Ｌｕｃ＋または対照ベクターとして使用されたＨＡｄ５Ｌｕｃにより、ｉ．ｖ．感染を行った。対照群には、代わりに同じ時点で１００ｍｌのＰＢＳを注射した。

ウイルス送達の４８時間後、０．５ｍｌのルシフェリンを動物に注射した後に生物発光イメージングを使用してルシフェラーゼ活性の読み出しを行った。動物は吸入麻酔下で維持した。検出されたルシフェラーゼの発現レベルを図１３に示す。

イメージングが完了した後、動物を屠殺し、その臓器（肝臓、心臓、脾臓、腎臓、腸、膵臓、肺）を採取した。ベクターのゲノムはｑＰＣＲによって定量化した。

ＨＡｄ５に感染した動物の対照群において、ＣＬで処置していない群では、ウイルスは主に肝臓と脾臓にそれぞれ２×１０^５と約３×１０^５の生物発光単位のレベルで分布していたが、ＣＬで前処置した群では両臓器とも、さらに高い、５×１０^５に近い分布となっていた（図１４Ａ～図１４Ｂ）。

一方、Ａｄ２０－４２－４２は脾臓指向性のみを有するように見え、他の臓器では検出されなかった。予想通り、総ＤＮＡコピー数は、ＣＬ前処置を行わなかった群（１×１０^５）と比較して、ＣＬを追加した場合（約２．５×１０^６）、有意に高くなっていた（図１４Ｃ～１４Ｄ）。

まとめると、これらのデータは、Ａｄ２０－４２－４２が、研究で見出された脾臓指向性のみを伴う良好な安全性プロファイルを有しており、試験した他の臓器で見られるＤＮＡコピー数はほとんど検出されないことを指し示している。Ａｄ２０－４２－４２ベクターは肝臓への指向性を示さなかったため、これはＡｄ２０－４２－４２ベクターを、肝臓の利用可能性と毒性が低く、したがって、肝臓への遺伝子導入が標的組織での有効性の妨げとなるような遺伝子治療により適したベクターとしている。

上述した実施形態に対しては、それの広義の発明概念から逸脱することなしに、変更がなされ得ることが、当業者には理解されるであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、本説明によって定義される本発明の精神および範囲内の変更をカバーすることが意図されていることが理解される。

以下の態様を包含し得る。
［１］ キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸配列であって、前記キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含む、単離された核酸配列。
［２］ 前記ファイバーポリペプチド配列が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載の単離された核酸配列。
［３］ 前記ヘキソンポリペプチド配列が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、上記［１］または［２］に記載の単離された核酸。
［４］ 前記ペントンポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の単離された核酸。
［５］ 上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の単離された核酸を含むベクター。
［６］ 前記ベクターがアデノウイルスベクターである、上記［５］に記載のベクター。
［７］ 前記アデノウイルスベクターが、導入遺伝子をさらに含む、上記［６］に記載のベクター。
［８］ 前記アデノウイルスベクターが、Ｅ１欠失をさらに含む、上記［６］または［７］に記載のベクター。
［９］ 前記アデノウイルスベクターが、Ｅ３欠失をさらに含む、上記［６］～［８］のいずれか１項に記載のベクター。
［１０］ 前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、またはヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つからの、１つ以上のアデノウイルス核酸配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである、上記［６］～［９］のいずれか１項に記載のベクター。
［１１］ 前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）Ｅ４ｏｒｆ６を含む、上記［１０］に記載のベクター。
［１２］ 前記アデノウイルスベクターが、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の群から選択される核酸配列を含む、上記［６］～［１１］のいずれか１項に記載のベクター。
［１３］ 前記導入遺伝子が、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失に位置し、および／または右逆位末端反復配列（ｒＩＴＲ）に隣接している、上記［７］～［１２］のいずれか１項に記載のベクター。
［１４］ 上記［５］～［１２］のいずれか１項に記載のベクターを含む、組換え細胞。
［１５］ 以下を含む、ベクターを製造する方法：
（ａ）アデノウイルスベクターの産生のための条件下で上記［１４］に記載の組換え細胞を増殖させること；および
（ｂ）前記組換え細胞から前記ベクターを単離すること。
［１６］ 上記［６］～［１３］のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
［１７］ それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法であって、上記［１６］に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
［１８］ ワクチンを製造する方法であって、上記［６］～［１３］のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、方法。
［１９］ それを必要とする対象において導入遺伝子を発現させる方法であって、以下を含む方法：
ａ．発現される導入遺伝子を必要とする対象を特定すること；
ｂ．前記対象を上記［６］のベクターと接触させること；および
ｃ．前記対象において前記導入遺伝子を表現させること。
［２０］ それを必要とする前記対象における前記導入遺伝子の発現が、疾患または障害を治療または予防する、上記［１９］に記載の方法。
［２１］ 前記対象と前記ベクターを接触させることが、前記対象から細胞を単離すること、および前記細胞を前記ベクターと接触させることを含む、上記［１９］に記載の方法。
［２２］ それを必要とする前記対象がヒト対象である、上記［１９］～［２１］のいずれか１項に記載の方法。

Claims (22)

1. キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸であって、前記キメラアデノウイルスキャプシドまたはその機能的誘導体が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するファイバーポリペプチド、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヘキソンポリペプチド、および配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペントンポリペプチドを含む、単離された核酸。
2. 前記ファイバーポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
3. 前記ヘキソンポリペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離された核酸。
4. 前記ペントンポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された核酸。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された核酸を含むベクター。
6. 前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
7. 前記アデノウイルスベクターが、導入遺伝子をさらに含む、請求項６に記載のベクター。
8. 前記アデノウイルスベクターが、Ｅ１欠失をさらに含む、請求項６または７に記載のベクター。
9. 前記アデノウイルスベクターが、Ｅ３欠失をさらに含む、請求項６～８のいずれか１項に記載のベクター。
10. 前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－４、ヒトアデノウイルス－５、ヒトアデノウイルス－２６、またはヒトアデノウイルス－３５のうちの少なくとも１つからの、１つ以上のアデノウイルス核酸配列を含む、キメラアデノウイルスベクターである、請求項６～９のいずれか１項に記載のベクター。
11. 前記アデノウイルスベクターが、ヒトアデノウイルス－５（ＨＡｄＶ－５）Ｅ４ｏｒｆ６を含む、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記アデノウイルスベクターが、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の群から選択される核酸配列を含む、請求項６～１１のいずれか１項に記載のベクター。
13. 前記アデノウイルスベクターが、導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失に位置し、および／または右逆位末端反復配列（ｒＩＴＲ）に隣接している、請求項７～１２のいずれか１項に記載のベクター。
14. 請求項５～１２のいずれか１項に記載のベクターを含む、組換え細胞。
15. 以下を含む、ベクターを製造する方法：
    （ａ）アデノウイルスベクターの産生のための条件下で請求項１４に記載の組換え細胞を増殖させること；および
    （ｂ）前記組換え細胞から前記ベクターを単離すること。
16. 請求項６～１３のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
17. それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に用いるための請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記方法は、前記免疫原性組成物を対象に投与することを含む、免疫原性組成物。
18. ワクチンを製造する方法であって、請求項６～１３のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と組み合わせることを含む、方法。
19. それを必要とする対象において導入遺伝子を発現させる方法に用いるための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項６～１３のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクターを含み、
    前記方法が、以下を含む、医薬組成物：
    ａ．発現される導入遺伝子を必要とする対象を特定すること；
    ｂ．前記対象を前記ベクターと接触させること；および
    ｃ．前記対象において前記導入遺伝子を表現させること。
20. それを必要とする前記対象における前記導入遺伝子の発現が、疾患または障害を治療または予防する、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 前記対象と前記ベクターを接触させることが、前記対象から細胞を単離すること、および前記細胞を前記ベクターと接触させることを含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
22. それを必要とする前記対象がヒト対象である、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。