JP7711208B2 - Ｄｌｌ３に対する結合分子及びその使用 - Google Patents

Ｄｌｌ３に対する結合分子及びその使用

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Description

本開示は、免疫学の分野に属し、より具体的には、本開示は、ＤＬＬ３に対する結合分子及びその抗原結合断片、前記結合分子又はその抗原結合断片を含む誘導体、医薬組成物及びそれらのがんの治療における使用に関する。
肺がんは、罹患率及び死亡率の上昇が最も速く、人間の健康と生命にとって最大の脅威となっている悪性腫瘍の１つである。病理的には、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんの２つのカテゴリーに分けられる。
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、肺がんで最も重要な１つで、肺がん患者の８０％以上がこのタイプに属する。現在、肺がんの標的療法、ＰＤ－１免疫薬、遺伝子配列決定がブームになっており、これに伴って得られた飛躍的な進歩が、主に非小細胞肺がんに集中しているため、この肺がんのサブグループで選択可能な有効な治療を大幅に増やしており、非小細胞肺がん患者の５年生存率を大きく改善している。
小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）は、高い侵襲性、致命性及び広汎な転移性を有する肺がんであり、肺がんの約１５％を占めており、病理学的、分子的、生物学的、臨床的に他の肺がんと大きく異なる。毎年、診断されたＳＣＬＣ患者が２３万４０００例を超え、毎年、世界中、約２５万人の死亡を起こしていると推定されている。ＳＣＬＣの特徴は、腫瘍が迅速に増殖し、血管の分布が広く、ゲノムが不安定であり、早期に播種性転移が起こることである。過去の３０年間、ＳＣＬＣの検出、治療又は生存率の改善に限界が見られたため、ＳＣＬＣは難治性がんに分類されている。手術、放射線療法又は両者の併用などの局所治療では完全に治癒する可能性が極めて低い。白金系製剤をもととする併用化学療法は依然として治療の基礎で、第一選択の標準方式は、白金系製剤（カルボプラチン又はシスプラチン）と他の細胞毒性薬（例えば、エトポシド）との併用であり、小細胞肺がんの化学療法は寛解率が非常に高いが、特に進展型患者では、常に再発を伴う。限局型患者の場合は、生存期間の中央値が１４～２０か月であり、進展型の場合は９～１１か月しかなく、再発患者の場合は、生存期間がさらに短くなり、選択可能な治療がほとんどない。ＦＤＡに推奨されているのはただトポテカンに過ぎず、しかしながら、その血液毒性が制限されるので、治療反応率は、５～２４％にとどまって満足できず、生存期間の中央値は２５週未満である。現在、まだ具体的な第三選択治療が推奨されていないため、新しい効果的な治療薬が求められる。
Ｄｅｌｔａ様３は、ＤＬＬ３とも呼ばれ、ＤＬＬ３遺伝子にコードされるタンパク質であり、Ｎｏｔｃｈファミリーのリガンドの１つである。ＤＬＬ３は、ＤＬＬ１と３６％相同性しか備えず、他のｄｅｌｔａｔｙｐｅ ｄｓｌ（ｄｅｌｔａ／ｓｅｒａｔｅ／ｌａｇ－２）タンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４と異なり、ＤＬＬ３が胎児の脳における正常な組織で最も多く発現され、沿軸中胚葉の成長と発達で重要な役割を果たしている。小細胞肺がん及び大細胞神経内分泌がん患者の約８５％で腫瘍細胞の表面に発現され、また、多形神経膠芽腫、黒色腫、膵臓がん、直腸がんなどでも高発現されることが研究から明らかになった。しかしながら、健康な組織及び非神経内分泌腫瘍では発現されない。当該タンパク質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の制御に関与しているため、Ｎｏｔｃｈ経路が発するシグナルは、最終的にがんの無制限の増殖を促進する。正常な組織では、ＤＬＬ３のｍＲＮＡ発現が脳、食道、膵臓に限る。
更なる研究では、腫瘍組織及び正常な組織標本を分析したところ、原発性ＳＣＬＣ生検標本、ＳＣＬＣ細胞株及び正常な肺生検標本のトランスクリプトーム全体の配列決定データにおけるＤＬＬ３の発現を検出することで、ＳＣＬＣにおいてＤＬＬ３のｍＲＮＡが正常な肺よりも約３５倍上昇していることが示される。これらのＳＣＬＣ腫瘍サンプルが、正常な組織及びオンコゲノムからの他の腫瘍タイプのトランスクリプトームデータと比較し、原発性ＳＣＬＣ腫瘍サンプル及び低悪性度神経膠腫（Ｌｏｗ ｇｒａｄｅ ｇｌｉｏｍａ、ＬＧＧ）、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、ＧＢＭ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ、ＳＫＣＭ）におけるＤＬＬ３の発現が上昇すると一層証明されている。また、臨床的に肺がんゲノムプロジェクトのＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐ ｄａｔａでも、ＮＳＣＬＣと比べて、原発性ＳＣＬＣ腫瘍標本におけるＤＬＬ３が上昇することが示されている。
Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａデータベースから得られたデータによれば、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの発現がＳＣＬＣ細胞株では特に上昇していることがより一層証明されている。要するに、複数の技術プラットフォーム及びサンプルから得られたこれらの発現データに示されているように、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡは原発性ＳＣＬＣ腫瘍、ＳＣＬＣ ＰＤＸ、従来のＳＣＬＣ細胞株及びＬＣＮＥＣ ＰＤＸでは過剰に発現され、正常な組織におけるｍＲＮＡ発現は、主に脳に限る。
本開示は、ＤＬＬ３に対する結合分子及びその抗原結合断片を提供することを目的とし、前記結合分子又はその抗原結合断片は、ＤＬＬ３と特異的に結合でき、同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４に非特異的に結合しない。
本開示の第１の態様は、ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片を提供し、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、
ｉ）アミノ酸配列が配列番号６、９、１２、１５又は１８から選ばれる重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｉｉ）アミノ酸配列が配列番号７、１０、１３、１６又は１９から選ばれる重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
ｉｉｉ）アミノ酸配列が配列番号８、１１、１４、１７、２０、１１０又は１１１から選ばれる重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、
ａ）配列番号６、７及び８、又は
ｂ）配列番号９、１０及び１１、又は
ｃ）配列番号１２、１３及び１４、又は
ｄ）配列番号１５、１６及び１７、又は
ｅ）配列番号１８、１９及び２０、又は
ｆ）配列番号６、７及び１１０、又は
ｇ）配列番号６、７及び１１１である。
一実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号１～５、２１～２９から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、又は、配列番号１～５、２１～２９のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の第２の態様は、他のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片を提供し、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、
ｉ）アミノ酸配列が配列番号５７、６３、６９、７２、７８、８４、９３又は９９から選ばれる重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｉｉ）アミノ酸配列が配列番号５８、６４、７０、７３、７９、８５、９４又は１００から選ばれる重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉｉｉ）アミノ酸配列が配列番号５９、６５、７１、７４、８０、８６、９５又は１０１から選ばれる重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｉｖ）アミノ酸配列が配列番号６０、６６、７５、８１、８７、９０、９６又は１０２から選ばれる軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｖ）アミノ酸配列が配列番号６１、６７、７６、８２、８８、９１、９７又は１０３から選ばれる軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
ｖｉ）アミノ酸配列が配列番号６２、６８、７７、８３、８９、９２、９８、１０４、１１２、１１３又は１１４から選ばれる軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、
ａ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１及び６２、又は
ｂ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び６８、又は
ｃ）配列番号６９、７０、７１、６６、６７及び６８、又は
ｄ）配列番号７２、７３、７４、７５、７６及び７７、又は
ｅ）配列番号７８、７９、８０、８１、８２及び８３、又は
ｆ）配列番号８４、８５、８６、８７、８８及び８９、又は
ｇ）配列番号８４、８５、８６、９０、９１及び９２、又は
ｈ）配列番号９３、９４、９５、９６、９７及び９８、又は
ｉ）配列番号９９、１００、１０１、７５、７６及び７７、又は
ｊ）配列番号７２、７３、７４、１０２、１０３及び１０４、又は
ｋ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１２、又は
ｌ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１３、又は
ｍ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１４である。
一実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号３０、３２、３４、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４９又は５１のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を含み、又は、配列番号３０、３２、３４、３５、３７、３９、４２、４４、４６、４９又は５１のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号３１、３３、３６、３８、４０、４１、４３、４５、４７、４８、５０、５２、５３、５４、５５又は５６のいずれかから選ばれるアミノ酸配列を含み、又は、配列番号３１、３３、３６、３８、４０、４１、４３、４５、４７、４８、５０、５２、５３、５４、５５又は５６のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、下記の群から選ばれる配列を含む。
１）配列番号３０及び３１、又は
２）配列番号３２及び３３、又は
３）配列番号３４及び３３、又は
４）配列番号３５及び３６、又は
５）配列番号３７及び３８、又は
６）配列番号３９及び４０、又は
７）配列番号３９及び４１、又は
８）配列番号４２及び４３、又は
９）配列番号４４及び３６、又は
１０）配列番号３５及び４５、又は
１１）配列番号４６及び４７、又は
１２）配列番号４６及び４８、又は
１３）配列番号４９及び５０、又は
１４）配列番号５１及び５２、又は
１５）配列番号５１及び５３、又は
１６）配列番号４６及び５４、又は
１７）配列番号４６及び５５、又は
１８）配列番号４６及び５６。
本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はＦｃを含み、より好ましくは、Ｆｃはマウス又はヒトに由来し、より好ましくは、Ｆｃの配列は天然のものであり又は修飾されているものである。
本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、二重特異性結合分子、多重特異性結合分子、ヒト化抗体、キメラ抗体、再形成抗体、完全ヒト抗体、全長抗体、重鎖抗体、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、直鎖状抗体又は単一ドメイン抗体であってもよい。
本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の形式であってもよい。
本開示は、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片を捕捉マーカー又は検出マーカーにカップリングして形成される複合体をさらに提供し、好ましくは、前記検出マーカーは放射性核種、発光物質、有色物質又は酵素を含む。
本開示は、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片が他の生物学的に活性な分子にカップリングして形成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）をさらに提供し、好ましくは、前記他の生物学的に活性な分子は低分子薬であり、好ましくは、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片と前記他の生物学的に活性な分子はリンカーによって接続される。
本開示は、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片をコードする核酸、当該核酸を含む組換えベクター、及び前記核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。好ましくは、前記宿主細胞は原核細胞（好ましくは大腸菌）、又は真核細胞（好ましくは、哺乳動物細胞又は酵母、より好ましくは、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞）である。
本開示は、適切な条件で前記宿主細胞を培養し、前記細胞から精製して発現産物を得ることを含む、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片の製造方法をさらに提供する。
本開示は、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片の腫瘍を治療する或いは寛解する薬物の調製における使用をさらに提供する。
一実施形態において、前記薬物は、ＤＬＬ３を異常発現する腫瘍細胞を標的とする。
一実施形態において、前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及びこれら腫瘍の転移性がんから選ばれる。
本開示は、本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片の検出試薬又は診断試薬の調製における使用をさらに提供する。
一実施形態において、前記検出試薬はＤＬＬ３の発現を検出するために用いられ、前記診断試薬は腫瘍を診断するために用いられ、好ましくは、前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及びこれら腫瘍の転移性がんから選ばれる。
本開示は、（１）サンプルを本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片に接触させること、及び（２）前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片とＤＬＬ３の複合物の形成を検出し、任意的に、前記ＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片は検出可能に標識されることを含む、サンプルにおけるＤＬＬ３の発現の検出方法をさらに提供する。
本開示は、有効量の本開示のＤＬＬ３に結合する分子又はその抗原結合断片を含み、或いは、有効量の本開示の抗体薬物複合体を含み、或いは、有効量の本開示の核酸を含み、或いは、有効量の本開示の組換えベクターを含み、或いは、有効量の本開示の宿主細胞を含む、医薬組成物をさらに提供する。
一実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
好ましくは、前記医薬組成物は、１種又は複数種の追加の他の治療剤をさらに含む。
本開示は、容器及び容器内に配置された本開示の医薬組成物を含む、カートリッジ又はキットをさらに提供する。
本開示は、ＤＬＬ３発現細胞の死を誘導する方法をさらに提供し、前記方法は、前記細胞を本開示の医薬組成物に接触させることを含み、前記ＤＬＬ３発現細胞は、腫瘍細胞である。
一実施形態において、前記腫瘍細胞は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及びこれら腫瘍の転移性がんの細胞から選ばれる。
本開示は、被験体におけるＤＬＬ３の発現に関連する疾患を治療する方法をさらに提供し、前記方法は、必要とする被験体に対して、本開示の医薬組成物、或いは、前記カートリッジ又はキットを投与することを含む。
一実施形態において、前記疾患は、腫瘍、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及びこれら腫瘍の転移性がんである。
一実施形態において、前記方法は、前記被験体に追加の治療剤を投与することをさらに含む。
本開示の技術案は、次の有益な効果を有する。本開示のＤＬＬ３に結合する分子及びその抗原結合断片は、ＤＬＬ３に特異的に結合でき、同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４に非特異的に結合しない。
図面は、本明細書に開示の新特徴をさらに説明する。これらの図面を参照すると、本明細書に開示された特性及び利点がよりよく理解されるが、これらの図面は、本明細書に開示された原理の具体的な実施形態のみを説明するために使用され、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。 本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３）に結合する状況を示す。 本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。 図２Ｂは、本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３）に結合する状況を示す。 図３Ａは、本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１に結合する状況を示す。 図３Ｂは、本開示のラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ４に結合する状況を示す。 図４は、本開示のラクダに由来するｈＤＬＬ３－３－１ヒト化抗体の変異体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。 図５Ａは、本開示のマウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。 図５Ｂは、本開示のマウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３）に結合する状況を示す。 図６は、本開示のマウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。 図７Ａは、本開示のマウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１に結合する状況を示す。 図７Ｂは、本開示のマウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ４に結合する状況を示す。 図８は、本開示のマウスハイブリドーマに由来するＨ２－３９Ｅ２Ｄ１１ヒト化抗体の変異体のＤＬＬ３発現細胞（ＳＨＰ－７７）に結合する状況を示す。
＜用語＞
本明細書に記載されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、各々の刊行物、特許又は特許出願が特定にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
以下、本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、解決手段及び試薬に限定されるものではなく、これらが変化することができることを理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、発明を実施するための実施形態を説明するためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解すべきである。別途定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、いずれも当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、数値範囲を含み、かつ本発明のいくつかの態様は、範囲形式で記載することができる。他の説明がない限り、数値範囲又は範囲で記載される形式は、単に便宜性及び簡潔性のためであることを理解すべきであり、本発明の範囲を厳密に限定するものと見なすべきではない。従って、範囲形式の記載は、本明細書にすでに明示されているとおり、取りうる全ての部分範囲と該範囲内で取りうる全ての特定の数値が具体的に開示するものと考えるべきである。当該数値の広さに関わらず、前記原則は等しく適用される。範囲で説明する時には、当該範囲が範囲の端点を含む。
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、「約」という用語は、指定された値の±２０％、又は場合によっては±１０％、又は場合によっては±５％、又は場合によっては±１％、又は場合によっては±０．１％を含む変化を意味する。
本明細書において使用されるアミノ酸の３文字記号及び１文字記号は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、完全抗体（例えば、完全長モノクローナル抗体）及びその任意の抗原結合断片（即ち、抗原結合部分）又はその単鎖を含んでもよいし、また完全抗体又はその抗原結合断片又はその単鎖において改変（例えば、他のペプチドセグメントを接続、機能単位を組み換えるなど）を行って形成された抗原特異的結合能を有する産生物を含んでもよい。
一実施形態において、本明細書において使用される「抗体」という用語は、典型的には、共有ジスルフィド結合と非共有結合との相互作用によって一体に保持された２本重（Ｈ）ポリペプチド鎖（ＨＣ）と２本軽（Ｌ）ポリペプチド鎖（ＬＣ）を含むＹ型四量体タンパク質を指す。天然ＩｇＧ抗体は、このような構造を有する。各軽鎖は。１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とからなる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と１つの定常ドメイン（ＣＨ）とを含む。
当分野では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主な種類の抗体が知られ、対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれ、ＩｇＧ及びＩｇＡは、さらに異なるサブクラス、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。いかなる脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる、２種類の明らかに異なるタイプの１つに分類され得る。
ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合、当該定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは、第４のドメインＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、プロリン及びシステインに富む、可変長のセクションである柔軟性ヒンジ領域に分離される。各クラスの抗体は、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、一種の抗体から別種の抗体へのアミノ酸組成の顕著な変化を示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成しており、完全なＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する（即ち、これは２価である）。重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）ドメインは、それぞれ超可変領域（ＨＶＲ）又はより一般的に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる極度の可変性を有する３つの領域を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ４つのフレームワーク領域ＦＲを有する、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で表される。従って、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般的に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））におけるＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４の配列に現れる。
「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域と定義するために用いられ、前記領域は、少なくとも一部の定常領域を含む。当該用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域を含む。
本明細書において使用されるとき、広義の「抗体」のタイプは、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び霊長類化抗体、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体（組換えにより産生したヒト抗体を含む）、組換えにより産生した抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、単価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体（突然変異タンパク質及びその変異体を含む）などを含む。
「モノクローナル抗体」（又は「マブ」と呼ばれる） という用語は、単一細胞のクローンより産生された、実質的に均質で、ある特定の抗原エピトープのみに対する抗体を指す。モノクローナル抗体は、本分野で知られている様々な技術を用いて調製することができ、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ表示技術、遺伝子組換え動物、合成技術又は上記技術の組み合わせなどを含む。
なお、本発明のモノクローナル抗体可変領域のＣＤＲ及びＦＲの区分は、Ｋａｂａｔに基づいて特定される。他の命名及び番号付けシステム、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＡＨｏなども当業者に知られている。従って、本発明のマブ配列を基礎とし、任意の命名システムから誘導された１種以上のＣＤＲを含むヒト化抗体は、いずれも本発明の範囲内に明確に保持される。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のＣＤＲ以外のすべて又は一部のアミノ酸がヒト免疫グロブリンに由来する対応アミノ酸に置換された抗体を指す。少量のアミノ酸による追加、欠失、挿入、置換又は修飾は許容され、それらが特定の抗原に対する抗体の結合能を解消させなければよい。「ヒト化」抗体には元の抗体と同様な抗原特異性が保持されている。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指し、例えば、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体と指す。
「抗体断片」という用語は、完全抗体の少なくとも一部を含む。本明細書において使用されるとき、抗体分子の「断片」は、抗体の「抗原結合断片」を含み、「抗原結合断片」という用語は、免疫グロブリン又は抗体における、選択された抗原又はその抗原エピトープに特異的に結合又は反応するポリペプチド断片、又はこの断片からさらに誘導された融合タンパク質産物、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗原受容体の細胞外結合領域などを指す。例示的な抗体断片又はその抗原結合断片は、可変軽鎖断片、可変重鎖断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、線形抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及び抗体断片で形成された二重特異性抗体又は多重特異性抗体などを含むが、これらに限定されない。
「抗原」という用語は、抗体又は抗体結合断片に認識され、抗体又は抗体結合断片に特異的に結合する物質を指し、広義には、抗原は、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一のドメイン、複数のドメイン、又は完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含む、選択された標的の任意の免疫原性断片又は決定基を含むことができる。ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖及び脂質、これらの一部及びこれらの組み合わせが、いずれも抗原を構成することができる。非限定的な例示的抗原は、腫瘍抗原又は病原体抗原などを含む。「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子であってもよい。任意の形式の抗原又は該抗原を含む細胞又は製剤は、いずれも抗原決定基に対して特異性を有する抗体を生成するために用いることができる。抗原は、単離された全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、その表面に少なくとも一部の抗原を発現させる細胞で免疫化される）、又は可溶性タンパク質（例えば、当該タンパク質のＥＣＤ部分のみで免疫化される）、又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。当該抗原は、遺伝子修飾された細胞において産生することができる。前記任意の抗原は、単独で使用してもよく、本分野で周知の１種以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用してもよい。当該抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を引き起こすのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードすることができる。任意のベクターを使用してその中に抗原を発現させる細胞を形質転換することができ、前記ベクターは、アデノウイルススベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質のような非ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
「エピトープ」という用語とは、抗原における、免疫グロブリン又は抗体に特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の三次折り畳みにより並列するが隣接しないアミノ酸で形成することができる。隣接するアミノ酸からなるエピトープは、通常に、変性溶媒への暴露の際に保持される一方で、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、通常に、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは、通常に、独特の空間的コンフォメーションで少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。特定の抗体によりそれの結合するエピトープを決定する方法は、本分野で周知であり、免疫ブロット及び免疫沈殿検出分析などを含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、例えば、Ｘ線結晶分析法、二次元核磁気共鳴などの本分野における技術及び本明細書に記載の技術を含む。
「二重特異性結合分子」、「多重特異性結合分子」という用語とは、それぞれ、２種又は２種以上の異なる抗原（又はエピトープ）に対して特異性を有する結合分子（例えば、抗体又は抗体断片を含む分子）を指し、好ましくは、二重特異性抗体である。
本開示に記載の可変領域を使用して抗体、結合分子、二重特異性結合分子又は多重特異性結合分子を調製する時、定常領域は特に限定されず、当業者に知られる定常領域又は自ら取得した定常領域を使用してもよいし、定常領域の部分にアミノ酸変異を導入してもよい（例えば、Ｆｃγ受容体又はＦｃＲｎとの結合を向上させる或いは低減させる変異）。
本開示の結合分子、抗原結合断片、抗体、二重特異性結合分子又は多重特異性結合分子を得る方法は特に限定されず、いかなる方法で得てもよく、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ５～８、１５を参照する。本発明の結合分子、抗原結合断片、抗体、二重特異性結合分子又は多重特異性結合分子は通常の方法で調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、発現ベクターにクローニングし、且つ組換えを行ってもよい。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクトすることができる。より推奨される従来技術として、哺乳類の発現系は、抗体、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端のグリコシル化を引き起こす。ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することで安定的なクローンを得る。陽性クローンがバイオリアクターの無血清培地において拡大培養され、抗体が生産される。抗体を分泌した培養液に対して、通常の技術で精製、収集することができる。抗体は通常の方法で濾過・濃縮することができる。可溶性の混合物及び重合体のほうは、例えば、モレキュラーシーブ、イオン交換などの通常の方法で除去することができる。
「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」という用語とは、共有結合により治療活性物質又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）にカップリングして形成された抗体を指し、これにより治療活性物質又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）は、抗体の結合標的を標的とし、その薬理学的機能を働くことができる。治療活性物質又は医薬品有効成分は、ＡＤＣの標的細胞、好ましくは悪性又はがん細胞を殺すことができる細胞毒素であってもよい。治療活性物質、医薬品有効成分又は細胞毒素の共有結合は、非部位特異的な方式で、ペイロードをリシン又はシステイン残基に結合させる標準的な化学リンカーを用いて行ってもよく、或いは、好ましくは、結合は、部位特異的な方式で行われ、これは結合部位と生成されたＡＤＣの薬物と抗体の比率の完全制御を可能にする。
「親和性」又は「結合親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とそれに結合するパートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。用語「ＫＤ」とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指す。結合親和性は、本分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリーなどを使用して決定することができる。
「生物学的活性」という用語とは、抗体が抗原に結合し、測定可能な生物学的応答をもたら能力を指し、前記生物学的応答は、インビトロ又はインビボで測定することができる。
本開示の医薬組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容可能な担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、生理食塩水、滅菌水、賦形剤、安定剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸等）、緩衝剤）、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ等）又は結合剤等が挙げられる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。また、製剤中にヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を混合することによって、より大きな液量を皮下投与することも可能である。
本開示の結合分子又は抗原結合断片は、他の薬物と組み合わせて使用されてもよく、有効成分を混合して単一の投与単位を形成させてもよいし、それぞれ独立的な投与単位として、それぞれ使用してもよい。
「有効量」という用語は、本開示の結合分子又は抗原結合断片を含む医薬製剤の投与量であって、患者に単一又は複数の投与量で投与された後に、治療された患者において予期の効果をもたらす投与量を意味する。有効量は、当業者である主治医が、例えば、人種の違い、体重、年齢や健康状態、関連する具体的な疾患、疾患の重症度、個々の患者の応答、投与された具体的な抗体、適用モード、投与された製剤の生物学的利用特性、選択された投与スキーム、及び、それに伴うあらゆる治療法の使用という、複数の要因を考慮することで容易に決定することができる。
「カートリッジ」又は「キット」という用語は、有効量の１種以上の単位投与形態の本開示の医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、「カートリッジ」又は「キット」は、滅菌容器を含むことができ、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ブリスターパック又は本分野に既知の他の適切な容器の形態であってもよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬物を保持するのに適切な他の材料からなる。また、カートリッジは、本開示の医薬組成物を個体に投与する説明書をさらに含む。説明書には、一般的に、本発明の医薬組成物を用いて疾患を治療する方法が含まれる。
本明細書において使用される「個体」又は「被験体」という用語は、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の個体は、ヒト、非ヒト霊長類動物（例えば、カニクイザル、アカゲザル又は他の種類のマカックザル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「疾患」又は「病症」又は「障害」などという用語は、細胞、組織又は器官の正常な機能を損傷・妨害する任意の変化又は失調を指す。例えば、前記「疾患」は、腫瘍、病原体感染、自己免疫疾患、Ｔ細胞機能障害性疾患、又は免疫寛容の欠陥（例えば、移植拒絶）を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「腫瘍」という用語は、細胞又は組織の病理学的な増殖を特徴とする疾患、及び、その後の他の組織又は器官への遊走又は浸潤を指す。腫瘍増殖は、一般的に、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発・阻害しない。
本明細書において使用される「治療」という用語は、個人又は処理細胞に起因する疾患を変化させようとする過程での臨床的介入を指し、予防してもよいし、臨床病理上で介入してもよい。治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、何らかの疾患による直接的又は間接的な病理結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、予後の緩和又は改善などを含むが、これらに限定されない。
（実施例）
以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。これら実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。以下の実施例において具体的な条件を明記していない実験方法は、一般的に、分子クローニング試験ガイド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ， ２００２）に記載されているような従来の条件に従い、或いは、製造元に推奨される条件に従った。
実施例１：ヒトＤＬＬ３及びカニクイザルＤＬＬ３抗原の情報
実施例で使用されるヒトＤＬＬ３は、Ｋａｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入され（カタログ番号：ＤＬＬ－ＨＭ１０３）、その全長アミノ酸配列（配列番号１０５）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＮＹＪ７）は、次に示されるとおりであった。
注：二重下線の部分は、シグナルペプチド（１～２６）であり、下線の部分は、ＤＬＬ３細胞外領域（２７～４９２）であり、点線の部分は、膜貫通領域（４９３～５１３）であり、斜体の部分は、細胞内領域（５１４～６１８）であった。
実施例で使用されるカニクイザルＤＬＬ３（ｃｙｎｏ－ＤＬＬ３）は、Ｋａｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入され（カタログ番号：ＣＭ１０３）、その全長アミノ酸配列（配列番号１０６）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ａ０Ａ２Ｋ５ＷＳＲ４）は、次に示されるとおりであった。
注：二重下線の部分は、シグナルペプチド（１～２６）であり、下線の部分は、ＤＬＬ３細胞外領域（２７～４９０）であり、点線の部分は、膜貫通領域（４９１～５１３）であり、斜体の部分は、細胞内領域（５１４～６１８）であった。
実施例２：同ファミリーのメンバーであるＤＬＬ１及びＤＬＬ４抗原の情報
実施例で使用されるヒトＤＬＬ１は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入され（カタログ番号：１１６３５－Ｈ０８Ｈ）、その全長アミノ酸配列（配列番号１０７）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｏ００５４８）は、次に示されるとおりであった。
注：二重下線の部分は、シグナルペプチド（１～１７）であり、下線の部分は、ＤＬＬ３細胞外領域（１８～５４５）であり、点線の部分は、膜貫通領域（５４６～５６８）であり、斜体の部分は、細胞内領域（５６９～７２３）であった。
実施例で使用されるヒトＤＬＬ４は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入され（カタログ番号：１０１７１－Ｈ０８Ｈ）、その全長アミノ酸配列（配列番号１０８）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＮＲ６１）は、次に示されるとおりであった。
注：二重下線の部分は、シグナルペプチド（１～２６）であり、下線の部分は、ＤＬＬ３細胞外領域（２７～５２９）であり、点線の部分は、膜貫通領域（５３０～５５０）であり、斜体の部分は、細胞内領域（５５１～６８５）であった。
実施例３：ラクダへの免疫、重鎖からなる抗体の免疫ライブラリーの構築
ヒトＤＬＬ３抗原（実施例１に記載されるように）でラクダを免疫した。免疫を行う日は、それぞれ、０日目、２１日目、３５日目、４９日目で、合計で４回の免疫を行った。それぞれ、２８日目、４２日目、７３日目に血液サンプルを採取して血清を分離し、タンパク質レベルＥＬＩＳＡで血清における免疫応答の状況を検出した。血清力価が１：１２８０００を超えると検出したら、免疫終了し、免疫されたラクダから改めて１００ｍＬの血液サンプルを採取し、製造元の取扱説明書に従い、Ｓｏｌａｒｂｉｏ社のリンパ球分離溶液を使用し、それぞれラクダＰＢＭＣを分離し、トータルＲＮＡ（ＯＭＥＧＡ細胞トータルＲＮＡ抽出キット）を抽出した後、Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ逆転写キットで鋳型としてｃＤＮＡを合成し、設計された特異性プライマーでネステッドＰＣＲ増幅を行ってＶＨＨ遺伝子断片を得、ＶＨＨ断片を回収した後、Ｓｆｉ Ｉで消化されてｐＡＤＬ－２３ｃファージミドベクターに接続させ、ＴＧ１電気形質転換コンピテントセルでＤＬＬ３ラクダ免疫ライブラリーを構築した（ライブラリーの容量は１．１２Ｅ８）。
実施例４：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３の陽性クローンのスクリーニング
ヒトＤＬＬ３及びカニクイザルＤＬＬ３と交差結合できる陽性抗体を得るために、前記ライブラリーを増幅させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを加え、ファージとして組み立てた後、１×１０１２ｐｆｕのラクダ免疫ライブラリーファージを投入し、磁気ビーズに結合したビオチン化ヒトＤＬＬ３タンパク質（８μｇ／ｍＬ）と室温で１時間インキュベートし、０．０５％のＰＢＳＴで結合していないファージを洗い落とした後、１００ｍＭのトリエチルアミンでＤＬＬ３に特異的に結合したファージを溶出させ、勾配希釈後、対数増殖期の大腸菌ＳＳ３２０へ感染した後、アンピシリン入りプレートにコーティングして３７℃で一晩培養し、単一コローンをピックアップし、ＩＰＴＧ誘導発現を行い、上清はＥＬＩＳＡ検出のために用いる。ＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ２μｇ／ｍＬでヒトＤＬＬ３又はカニクイザルＤＬＬ３抗原をコーティングして４℃で一晩保持し、０．０５％のＰＢＳＴで３回洗浄した後、５％のスキムミルクにより室温で１時間ブロッキングし、０．０５％のＰＢＳＴで３回洗浄した後、各ウェルに３０μＬの誘導された上清を加え、陰性対照ウェルに培地を加え、室温で１時間インキュベートし、最後にａｎｔｉ－Ｍｙｃ ＨＲＰで検出し（ＩＰＴＧに誘導発現されたＶＨＨにｈｉｓ及びｃ－Ｍｙｃタグが付いている）、ＥＬＩＳＡ検出で得られたヒト及びカニクイザルＤＬＬ３に結合するＯＤ４５０値が１．０を超え、培地に結合する陰性対照のＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０との比がいずれも３を超えるクローンに対して配列決定し、本開示の５つの重鎖抗体可変領域のアミノ酸配列を得、結果を表１に示す。
前記アミノ酸配列において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより抗体可変領域のＣＤＲとＦＲを区分し、各抗体の３つのＣＤＲの配列構成を表２に示す。
実施例５：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体の構築及び真核細胞におけるその一過性トランスフェクション発現
配列決定の終了した本開示の重鎖抗体可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域をスプライシングして、生成された目的遺伝子断片をｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、トランスフェクショングレードの発現プラスミドを調製した。重鎖抗体可変領域は、接続短鎖ペプチドによりヒトＩｇＧ１定常領域に接続されてもよく、即ち、重鎖抗体可変領域－接続短鎖ペプチド－ヒトＩｇＧ１定常領域が形成される。本実施例で用いられる接続短鎖ペプチドの配列は、ＧＧＧＧＳである。
導入されたヒトＩｇＧ１定常領域の配列（配列番号１０９）は、次のとおりであった。
無血清培地においてＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に接種して、３７℃、８％ ＣＯ２の環境でシェーカーに置いて培養した。細胞密度を調整し、目的遺伝子断片を含有する組換え発現ベクターとＰＥＩトランスフェクション試薬を適切な比率で混合し、細胞培養振盪フラスコに追加し、６日間細胞培養した後、発現上清を集め、高速遠心分離で細胞破片を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムでアフィニティー精製を行った。Ａ２８０の測定値がベースラインに下がるまで、ＰＢＳでカラムをリンスした。ｐＨ３．０～３．５の酸性溶出液で目的タンパク質を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～９．０）で中和した。溶出サンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳに交換し、使用に備えるために分注した。最終的に精製されたキメラ抗体に対して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。
実施例６：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のＤＬＬ３発現細胞に対する結合
ＨＥＫ２９３細胞（中国科学院から購入）にｃｙｎｏ－ＤＬＬ３抗原全長遺伝子（配列について、実施例１を参照）をトランスフェクトし、細胞の培養及び継代を行い、単一コローンをピックアップし、フローサイトメトリーで単一コローン細胞のＤＬＬ３タンパク質の発現レベルを同定し、拡大培養し、使用に備えるために冷凍して保管した。
ＳＨＰ－７７及びＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞を培養し、ＳＨＰ－７７細胞の培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであり、ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞の培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ハイグロマイシン）であり、Ｔ７５細胞培養フラスコを使用し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養した。細胞を使用する時に滅菌ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで約５分間消化した後、完全培地で停止させた。
消化された細胞を１０００ｒｐｍの回転速度で、常温で５分間遠心分離して、上清を捨て、１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）において細胞を再懸濁した。細胞を計数し、細胞密度を１Ｅ６／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に接種し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨て、使用に備えるために４℃で静置した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳ中）で被検抗体サンプルを希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳ中）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。取扱説明書に従い、１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を１：２００に希釈し、希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で細胞を再懸濁し、３００メッシュのガーゼで細胞を濾過し、フローサイトメーターにおいてＰＥチャネルの平均蛍光強度を検出した。
フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ソフトウェアｆｌｏｗｊｏで各サンプルのＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称す）を分析し、分析により得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄに導入し、抗体の細胞に対する半数効果濃度（以下、ＥＣ５０と略称す）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を分析し、結果を表３及び図１に示す。
実施例７：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３重鎖抗体のヒト化
ＶＨＨ移植のフレームワーク鋳型として、配列のアライメントにより重鎖抗体候補と相同性の高い生殖系列遺伝子配列を選択した。抗体ＣＤＲ領域候補を選ばれたヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトした後、個別のアミノ酸の復帰変異を行って、ヒト化抗体が得られ、ヒト化可変領域のアミノ酸配列を表４に示す。
実施例８：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の調製
実施例５の記載を参照し、ヒト化抗体の可変領域とヒトＩｇＧ１定常領域をスプライシングし、生成された目的遺伝子断片をｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、トランスフェクショングレードの発現プラスミドを調製した。
無血清培地においてＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に接種し、３７℃、８％ ＣＯ２の環境でシェーカーに置いて培養した。細胞密度を調整し、目的遺伝子断片を含有する組換え発現ベクターとＰＥＩトランスフェクション試薬を適切な比率で混合し、細胞培養振盪フラスコに追加し、６日間細胞培養した後、発現上清を集め、高速遠心分離で細胞破片を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムでアフィニティー精製を行った。Ａ２８０の測定値がベースラインに下がるまで、ＰＢＳでカラムをリンスした。ｐＨ３．０～３．５の酸性溶出液で目的タンパク質を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～９．０）で中和した。溶出サンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳに交換し、使用に備えるために分注した。最終的に精製されたヒト化抗体に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。
実施例９：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のインビトロでの細胞結合の実証
ＳＨＰ－７７及びＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞を培養し、ＳＨＰ－７７細胞の培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであり、ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞の培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ハイグロマイシン）であり、Ｔ７５細胞培養フラスコを使用し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養した。細胞を使用する時、滅菌ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで約５分間消化した後、完全培地で停止させた。
消化された細胞を１０００ｒｐｍの回転速度で、常温で５分間遠心分離して、上清を捨て、１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）において細胞を再懸濁した。細胞を計数し、細胞密度を１Ｅ６／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に接種し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨て、使用に備えるために４℃で静置した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で被検抗体サンプルを希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。取扱説明書に従い、１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を１：２００に希釈し、希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で細胞を再懸濁し、３００メッシュのガーゼで細胞を濾過して、フローサイトメーターにおいてＰＥチャネルの平均蛍光強度を検出した。
フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ソフトウェアｆｌｏｗｊｏで各サンプルのＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称す）を分析し、分析により得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄに導入し、抗体の細胞に対する半数効果濃度（以下、ＥＣ５０と略称す）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を分析し、結果を表５及び図２に示す。
実施例１０：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のＢｉａｃｏｒｅ親和性実験
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置で抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のヒトＤＬＬ３に対する親和性及び薬物動態特性を分析した。まず、ＣＭ５チップをＥＤＣ及びＮＨＳで活性化し、次に抗ヒトＦｃのマウスモノクローナル抗体を固定し、さらにエタノールアミンでブロッキングした。
ヒトＤＬＬ３に対する親和性及び薬物動態特性を測定するために、ＤＬＬ３ヒト化抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ２０）緩衝液で０．２μｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬ／分ｃの流速で４５秒間捕捉した。ヒトＤＬＬ３を２倍段階希釈し、一連濃度（１００ｎＭ～０．３９ｎＭ）が得られ、５０μＬ／分間の流速で９０秒間結合させ、６００秒間解離した。
各サイクルの実験が終了した後、３ＭのＭｇＣｌ２溶液で３０μＬ／分間の流速で３０秒間リンスし、捕捉された抗体を抗原と共に除去し、チップの再生を完了した。元のデータに対してＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（３．０．１２．１５６５５）で分析し、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでフィッティングし、結果を表６に示す。
実施例１１：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４に対する結合実験
濃度が１μｇ／ｍＬになるように、抗原タンパク質であるヒトＤＬＬ１（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１１６３５－Ｈ０８Ｈ）又はヒトＤＬＬ４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０１７１－Ｈ０８Ｈ）を１×ＰＢＳに溶解し、次に抗原（１００μＬ／ウェル）を高親和性ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４２３５０１）に加え、４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で抗原を洗浄し、３回洗浄した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳＴにおいて）（２００μＬ／ウェル）で抗原をブロッキングし、３７℃で１．５時間インキュベートした。
１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で被検抗体を希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。ＰＢＳＴでプレート（３００μＬ／ウェル）を洗浄し、３回洗浄した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに加え、常温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で抗体を３回洗浄した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳＴにおいて）で二次抗体を希釈した（ＤＬＬ４に用いるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）は、１：２００００で希釈され、ＤＬＬ１に用いるＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、１：１００００で希釈され）。希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに加え、常温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）でプレートを６回した。発色溶液を調製し（ＴＭＡとＴＭＢは、１：１で混合された）、発色溶液（１００μＬ／ウェル）をプレートに加え、暗所で５分間インキュベートした。５０μＬのＥＬＩＳＡ停止液をプレートに加え、均一的に振とうした。
ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいてＯＤ４５０を読み取り、ＯＤ４５０でＧｒａｐｈＰａｄにおいてプロットし、ＥＣ５０の値を求めた。結果を図３に示し、検測抗体は、同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４のいずれも非特異的に結合しなかったことが示された。
実施例１２：ラクダに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の変異体の調製
本開示の重鎖抗体に対する翻訳後修飾（ＰＴＭ）分析を行ったところ、ｈＤＬＬ３－３－１の可変領域に１つの脱アミド化部位が存在することが見出され、１０３位のアミノ酸に対して単一部位の部位特異的変異を行い、２つのｈＤＬＬ３－３－１の変異体を調製した。それぞれがｈＤＬＬ３－３－１－ＮＡ、ｈＤＬＬ３－３－１－ＱＳであった。前記２つの変異体の可変領域のアミノ酸配列を表７に示す。
実施例５の記載を参照しながら、前記２つの変異体を調製し、哺乳動物細胞株における一過性トランスフェクション発現を経、ＳＨＰ－７７細胞を用いて親和性の検出を行い、その結果を表８及び図４に示し、２つの変異体は細胞レベルの結合が明らかに変化しない場合に翻訳後修飾のリスクを解消できることが示された。ヒトＤＬＬ３抗原タンパク質を用いて親和性検出を行い、その結果を表９に示す。
実施例１３：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３抗体の獲得
抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体は、マウスを免疫することで生成された。実験では６週齢雌Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ白色マウスが使用された（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）。飼育環境はＳＰＦであった。マウスを購入した後、実験室環境で１週間飼育し、１２／１２時間の明暗サイクルで切り替わり、温度は２０～２５℃で、湿度は４０～６０％であった。免疫抗原は、Ｈｉｓタグの付いたヒトＤＬＬ３組換えタンパク質（ｈｕＤＬＬ３－Ｈｉｓ）であった。Ｔｉｔｅｒｍａｘ（ｓｉｇｍａ、ロット番号：Ｔ２６８４）をアジュバントとして使用される。抗原とアジュバント（ｔｉｔｅｒｍａｘ）の比率は１：１であり、抗原を乳化した後に接種し、接種日は０日目、１４日目、３５日目、５６日目であり、脾細胞の融合を行う３日前にブースター接種を行った。期間中、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ方法でマウス血清を検出し、マウス血清中の抗体力価を決定した。５回目の免疫後、血清中の抗体力価が高く且つ力価がプラトー傾向にあるマウスを選択し、脾細胞の融合を行い、最適化された電気融合ステップで脾臓リンパ球と骨髄腫細胞のＳｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７ＴＭ）を融合させてハイブリドーマ細胞を得た。
融合後のハイブリドーマ細胞を７～１４日間培養した後、培地上清を取り出し、ＤＬＬ３組換えタンパク質を使用し、ＥＬＩＳＡ実験でハイブリドーマ上清に対して抗体のスクリーニングを行い、得られた陽性抗体株に対して、さらにＤＬＬ３を安定発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を用い、ブランクＣＨＯ－Ｋ１細胞と比較して、非特異的に結合する抗体ハイブリドーマ株を除き、フローサイトメトリーでスクリーニングを行い、組換えタンパク質に結合し且つ細胞発現抗原にも結合するハイブリドーマを選んだ。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を集め、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し、逆転写した（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔａｋａｒａ＃２６８０Ａ）。逆転写で得られたｃＤＮＡに対してｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）でＰＣＲ増幅させた後、配列決定し、本開示の１０個のモノクローナル抗体可変領域のアミノ酸配列を得、それらを表１０Ａに示す。
前記アミノ酸配列において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムで抗体可変領域のＣＤＲとＦＲを区分し、各抗体の６つのＣＤＲ配列の構成を表１０Ｂに示す。
実施例１４：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体の構築及びその真核細胞における一過性トランスフェクション発現
配列決定の終了した本開示のモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をそれぞれＩｇＧ１重鎖定常領域、κ軽鎖定常領域にスプライシングし、生成された目的遺伝子断片をｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、トランスフェクショングレードの発現プラスミドを調製した。
無血清培地においてＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に接種し、３７℃、８％ ＣＯ２の環境でシェーカーに置いて培養した。細胞密度を調整し、目的遺伝子断片を含有する組換え発現ベクターとＰＥＩトランスフェクション試薬を適切な比率で混合し、細胞培養振盪フラスコに追加し、細胞培養６日後、発現上清を集め、高速遠心分離で細胞破片を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムでアフィニティー精製を行った。Ａ２８０の測定値がベースラインに下がるまで、ＰＢＳでカラムをリンスした。ｐＨ３．０～３．５の酸性溶出液で目的タンパク質を溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～９．０）で中和した。溶出サンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳに交換し、使用に備えるために分注した。最終的に精製されたキメラ抗体に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。
実施例１５：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３キメラ抗体のインビトロ細胞結合の実証
ＳＨＰ－７７及びＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞を培養し、ＳＨＰ－７７細胞の培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであり、ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏ ＤＬＬ３細胞の培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ハイグロマイシン）であり、Ｔ７５細胞培養フラスコを使用し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養した。細胞を使用する時、滅菌ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで約５分間消化した後、完全培地で停止させた。
消化された細胞を１０００ｒｐｍの回転速度で、常温で５分間遠心分離して、上清を捨て、１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）において細胞を再懸濁した。細胞を計数し、細胞密度を１Ｅ６／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に接種し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨て、使用に備えるために４℃で静置した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で被検抗体サンプルを希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。取扱説明書に従い、１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を１：２００に希釈し、希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で細胞を再懸濁し、３００メッシュのガーゼで細胞を濾過し、フローサイトメーターにおいてＰＥチャネルの平均蛍光強度を検出した。
フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ソフトウェアｆｌｏｗｊｏで各サンプルのＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称す）を分析し、分析により得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄに導入し、抗体の細胞に対する半数効果濃度（以下、ＥＣ５０と略称す）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を分析し、その結果を表１１及び図５に示す。
実施例１６：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３抗体のヒト化
１０個のキメラ抗体は、発現精製試験及び細胞レベルの結合試験などを経、さらに３つのクローンをピックアップし、ヒト化設計を行った。
マウス抗ヒトＤＬＬ３モノクローナル抗体のヒト化は、当分野の多くの文献に開示される方法のように行われた。要するに、親（マウス抗体）の定常ドメインがヒト定常ドメインで置換され、マウス抗体とヒト抗体の相同性に基づいて、ヒト抗体配列を選択した。得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲの典型的な構造において、重鎖、軽鎖可変領域の配列をヒト抗体生殖系列データベースと比較して、相同性の高いヒト生殖系列鋳型を得た。
選択された対応するヒト化鋳型にマウス抗体のＣＤＲ領域を移植し、ヒト化可変領域を置換し、そして、ＩｇＧ定常領域（好ましくは、重鎖はＩｇＧ１、軽鎖はκ）に組換えを行った。次に、マウス抗体の三次元構造をもととし、埋没残基、ＣＤＲ領域に直接的に相互作用する残基、及びＶＬとＶＨの立体構造に重要な影響を与える残基に対して復帰変異を行い、ヒト化軽鎖・重鎖可変領域配列を組み合わせた抗体を設計し、それらを表１２に示す。
実施例１７：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のインビトロ細胞結合の実証
ＳＨＰ－７７細胞を培養し、ＳＨＰ－７７細胞の培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳであり、Ｔ７５細胞培養フラスコを使用し、３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置いて培養した。細胞を使用する時、滅菌ＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡで約５分間消化した後、完全培地で停止させた。
消化された細胞を１０００ｒｐｍの回転速度で、常温で５分間遠心分離して、上清を捨て、１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）において細胞を再懸濁した。細胞を計数し、細胞密度を１Ｅ６／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に接種し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨て、使用に備えるために４℃で静置した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で被検抗体サンプルを希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。取扱説明書に従い、１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を１：２００に希釈し、希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。１６０μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で再懸濁して洗浄し、１５００ｒｐｍの回転速度で、４℃で５分間遠心分離して、上清を捨てた。１００μＬの１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で細胞を再懸濁し、３００メッシュのガーゼで細胞を濾過し、フローサイトメーターにおいてＰＥチャネルの平均蛍光強度を検出した。
フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ソフトウェアｆｌｏｗｊｏで各サンプルのＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称す）を分析し、分析により得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄに導入し、抗体の細胞に対する半数効果濃度（以下、ＥＣ５０と略称す）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を分析し、その結果を表１３及び図６に示す。
実施例１８：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のＢｉａｃｏｒｅ親和性実験
Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ装置で抗ＤＬＬ３ヒト化抗体のヒトＤＬＬ３に対する親和性及び薬物動態特性を分析した。まずＣＭ５チップをＥＤＣ及びＮＨＳで活性化し、次に抗ヒトＦｃのマウスモノクローナル抗体を固定し、さらにエタノールアミンでブロッキングした。
ヒトＤＬＬ３に対する親和性及び薬物動態特性を測定するために、ＤＬＬ３ヒト化抗体を０．２μｇ／ｍＬになるようにＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ２０）緩衝液で希釈し、１０μＬ／分間の流速で４５秒間捕捉した。ヒトＤＬＬ３を２倍段階希釈し、一連濃度（１００ｎＭ～０．３９ｎＭ）が得られ、５０μＬ／分間の流速で９０秒間結合させ、６００秒間解離した。
各サイクルの実験が終了した後、３ＭのＭｇＣｌ２溶液で３０μＬ／分間の流速で３０秒間リンスし、捕捉された抗体を抗原と共に除去し、チップの再生を完了した。初期データに対してソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（３．０．１２．１５６５５）で分析し、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでフィッティングし、その結果を表１４に示す。
実施例１９：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４に対する結合実験
抗原タンパク質であるヒトＤＬＬ１（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１１６３５－Ｈ０８Ｈ）又はヒトＤＬＬ４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１７１－Ｈ０８Ｈ）を１×ＰＢＳ６に溶解し、濃度は１μｇ／ｍＬになった。次に抗原（１００μＬ／ウェル）を高親和性ＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３５０１）に加え、４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で抗原を３回洗浄した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳＴにおいて）（２００μＬ／ウェル）で抗原をブロッキングし、３７℃で１．５時間インキュベートした。
１％のＢＳＡ（ＰＢＳにおいて）で被検抗体を希釈し、初期濃度は１００ｎＭであり、１０倍から７つの濃度に希釈した。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）でプレートを３回洗浄した。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに加え、常温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）で抗体を３回洗浄した。１％のＢＳＡ（ＰＢＳＴにおいて）で二次抗体を希釈した（ＤＬＬ４に用いるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）は１：２００００で希釈され、ＤＬＬ１に用いるＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は１：１００００で希釈された）。希釈された二次抗体（１００μＬ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに加え、常温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（３００μＬ／ウェル）でプレートを６回洗浄した。発色溶液を調製し（ＴＭＡとＴＭＢは１：１で混合された）、発色溶液（１００μＬ／ウェル）をプレートに加え、暗所で５分間インキュベートした。５０μＬのＥＬＩＳＡ停止液をプレートに加え、均一的に振とうした。
ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいてＯＤ４５０を読み取り、ＯＤ４５０でＧｒａｐｈＰａｄにおいてプロットし、ＥＣ５０の値を求めた。結果を図７に示し、被測抗体は、同ファミリーのタンパク質ＤＬＬ１及びＤＬＬ４のいずれも非特異的に結合しなかったことが示された。
実施例２０：マウスハイブリドーマに由来する抗ＤＬＬ３ヒト化抗体の変異体の調製
本開示の抗体に対して翻訳後修飾（ＰＴＭ）分析を行ったところ、Ｈ２－３９Ｅ２Ｄ１１の軽鎖可変領域に１つの脱アミド化部位が存在することが見出され、９９位のアミノ酸に対して単一部位の部位特異的変異を行い、３つのＨ２－３９Ｅ２Ｄ１１の変異体を調製した。それぞれがＨ２－３９Ｅ２Ｄ１１－ＮＡ、Ｈ２－３９Ｅ２Ｄ１１－ＱＳ及びＨ２－３９Ｅ２Ｄ１１－ＡＳであった。前記３つの変異体の可変領域のアミノ酸配列を表１５に示す。
実施例５の記載を参照しながら、前記３つの変異体を調製し、哺乳動物細胞株における一過性トランスフェクション発現を経、ＳＨＰ－７７細胞を用い、親和性の検出を行い、結果を図８に示し、変異体は細胞レベルの結合が明らかに変化しない場合、翻訳後修飾のリスクを解消できることが示された。ヒトＤＬＬ３抗原タンパク質を用い、親和性検出を行い、その結果を表１６に示す。
上記の本開示の形態は、例示的なものにすぎず、当業者であれば、従来とは異なる実験を行う必要なしに、無数の特定の化合物、材料、及び操作の同等物を認識・決定することができる。全てのこれらの同等物は、本発明の範囲内にあり、特許請求の範囲に含まれる。

Claims (36)

  1. ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、下記のａ）～ｍ）
    ａ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１２、又は
    ｂ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１及び６２、又は
    ｃ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び６８、又は
    ｄ）配列番号６９、７０、７１、６６、６７及び６８、又は
    ｅ）配列番号７２、７３、７４、７５、７６及び７７、又は
    ｆ）配列番号７８、７９、８０、８１、８２及び８３、又は
    ｇ）配列番号８４、８５、８６、８７、８８及び８９、又は
    ｈ）配列番号８４、８５、８６、９０、９１及び９２、又は
    ｉ）配列番号９３、９４、９５、９６、９７及び９８、又は
    ｊ）配列番号９９、１００、１０１、７５、７６及び７７、又は
    ｋ）配列番号７２、７３、７４、１０２、１０３及び１０４、又は
    ｌ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１３、又は
    ｍ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７及び１１４、
    から選ばれる一つである、ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記重鎖可変領域は、配列番号４６、３０、３２、３４、３５、３７、３９、４２、４４、４９又は５１から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、又は、配列番号４６、３０、３２、３４、３５、３７、３９、４２、４４、４９又は５１のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は
    前記軽鎖可変領域は、配列番号５４、３１、３３、３６、３８、４０、４１、４３、４５、４７、４８、５０、５２、５３、５５又は５６から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、又は、配列番号５４、３１、３３、３６、３８、４０、４１、４３、４５、４７、４８、５０、５２、５３、５５又は５６のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、
    １）配列番号４６及び５４、又は
    ２）配列番号３０及び３１、又は
    ３）配列番号３２及び３３、又は
    ４）配列番号３４及び３３、又は
    ５）配列番号３５及び３６、又は
    ６）配列番号３７及び３８、又は
    ７）配列番号３９及び４０、又は
    ８）配列番号３９及び４１、又は
    ９）配列番号４２及び４３、又は
    １０）配列番号４４及び３６、又は
    １１）配列番号３５及び４５、又は
    １２）配列番号４６及び４７、又は
    １３）配列番号４６及び４８、又は
    １４）配列番号４９及び５０、又は
    １５）配列番号５１及び５２、又は
    １６）配列番号５１及び５３、又は
    １７）配列番号４６及び５５、又は
    １８）配列番号４６及び５６
    からなる群より選ばれる配列を含む、請求項１に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  4. ｉ）重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、
    ｉｉ）前記ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、二重特異性結合分子、多重特異性結合分子、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、又は直鎖状抗体であること、及び／又は
    ｉｉｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の形式であることから選ばれる一つ又は複数を特徴として備える、前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記重鎖定常領域は、Ｆｃを含む、請求項４に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記Ｆｃは、マウス又はヒトに由来する、請求項５に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片を捕捉マーカー又は検出マーカーにカップリングして形成されることを特徴とする複合体。
  8. 前記検出マーカーは放射性核種、発光物質、有色物質又は酵素を含む、請求項７に記載複合体。
  9. 前記請求項１に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片に生物学的に活性な分子を複合させて形成されることを特徴とする抗体－薬物複合体。
  10. 前記生物学的に活性な分子は、低分子薬である、請求項９に記載の抗体－薬物複合体。
  11. 前記ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片が前記生物学的に活性な分子にリンカーによって接続される、請求項９に記載の抗体－薬物複合体。
  12. 前記請求項１に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、又は、前記核酸を含む組換えベクター、又は、前記核酸若しくは前記組換えベクターを含む宿主細胞。
  13. 前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 前記原核細胞は大腸菌である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 前記真核細胞は、哺乳動物細胞又は酵母である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  16. 前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. 前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を培養し、前記細胞から精製して発現産物を得ることを含む、製造方法。
  18. 腫瘍への治療又は寛解の薬物の調製に使用されるための、前記請求項１～３のいずれか１項記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  19. 前記薬物は、ＤＬＬ３を異常発現する腫瘍細胞を標的とする、請求項１８に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  20. 前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及び上記腫瘍の転移性がんから選ばれる、請求項１８に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  21. ＤＬＬ３の発現への検出、又は、腫瘍への診断に使用されるための、前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
    前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及び上記腫瘍の転移性がんから選ばれる、前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  22. サンプルにおけるＤＬＬ３の発現の検出方法であって、
    （１）サンプルを前記請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片に接触させること、及び
    （２）前記ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片とＤＬＬ３との複合物の形成を検出することであって、前記ＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片は検出可能に標識されることとを含む、方法。
  23. 有効量の前記請求項１に記載のＤＬＬ３に結合する抗体又はその抗原結合断片を含み、又は、有効量の請求項９に記載の抗体－薬物複合体を含み、又は、有効量の請求項１２に記載の核酸又は組換えベクター又は宿主細胞を含む、医薬組成物。
  24. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. １種又は複数種の追加の他の治療剤をさらに含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 容器及び容器内に配置された請求項２３に記載の医薬組成物を含む、カートリッジ又はキット。
  27. ＤＬＬ３発現細胞の死への誘導に使用されるための、請求項２３に記載の医薬組成物であって、前記ＤＬＬ３発現細胞は、腫瘍細胞である、請求項２３に記載の医薬組成物。
  28. 前記腫瘍細胞は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及び上記腫瘍の転移性がんの細胞から選ばれる、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. 被験体におけるＤＬＬ３の発現に関連する疾患への治療に使用されるための、請求項２３に記載の医薬組成物。
  30. 前記疾患は腫瘍である、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及び前記腫瘍の転移性がんから選ばれる、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 前記被験体に追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
  33. 被験体におけるＤＬＬ３の発現に関連する疾患への治療に使用されるための、請求項２６に記載のカートリッジ又はキット。
  34. 前記疾患は腫瘍である、請求項３３に記載のカートリッジ又はキット。
  35. 前記腫瘍は、小細胞肺がん、神経膠芽腫、神経内分泌がん、黒色腫、膵臓がん、直腸がん及び前記腫瘍の転移性がんから選ばれる、請求項３４に記載のカートリッジ又はキット。
  36. 前記被験体に追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項３３に記載のカートリッジ又はキット。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2023217790A1 (en) * 2022-02-10 2024-08-22 Shanghai Qilu Pharmaceutical Research And Development Centre Ltd. Bispecific antigen-binding molecule and use thereof
CN116041519A (zh) * 2022-12-27 2023-05-02 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗dll3的纳米抗体、相关产品和用途
TW202509075A (zh) 2023-05-19 2025-03-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 T細胞銜接蛋白治療癌症之用途
WO2025228330A1 (en) * 2024-04-29 2025-11-06 Fortvita Biologics (Singapore) Pte. Ltd. Antibodies targeting dll3 and antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2026039940A1 (zh) * 2024-08-19 2026-02-26 南京博安生物技术有限公司 一种增强型靶向dll3蛋白的嵌合抗原受体和突变体以及应用
CN120737204A (zh) * 2025-07-09 2025-10-03 成都佰斯维生物科技有限公司 靶向dll3的抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019200007A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Amgen Inc. Chimeric receptors to dll3 and methods of use thereof
WO2019217145A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-dll3 antibodies and uses thereof
WO2020069028A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
WO2020180591A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Allogene Therapeutics, Inc. Dll3 targeting chimeric antigen receptors and binding agents
WO2020210067A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021007371A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dll3-targeting antibodies and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI793062B (zh) * 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI848953B (zh) * 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
EP3864045A2 (en) * 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019200007A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Amgen Inc. Chimeric receptors to dll3 and methods of use thereof
WO2019217145A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-dll3 antibodies and uses thereof
WO2020069028A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
WO2020180591A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Allogene Therapeutics, Inc. Dll3 targeting chimeric antigen receptors and binding agents
WO2020210067A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021007371A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Dll3-targeting antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
岡山医学会雑誌，2009年，第121巻，pp. 119-122

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