JP7714529B2 - Ａｔｐベースの細胞選別と過剰増殖がん幹細胞 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９００，１３９号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。

本開示は、代謝的に過活動である攻撃的な過剰増殖性がん幹細胞（「ＣＳＣ」）表現型を同定、分離、および治療し、転移の可能性を阻止する、または低下させるためのＡＴＰベースの細胞選別に関する。

研究者らは新たな抗がん治療を開発しようと努力を重ねている。従来のがん療法（例えば放射線照射、シクロホスファミドなどのアルキル化薬、および５－フルオロウラシルなどの代謝拮抗薬）は、増殖の速いがん細胞を選択的に検出し、細胞増殖やＤＮＡ複製に関与する細胞機構に障害を与えてこれを根絶することを試みるものである。その他に、変異腫瘍抗原を増殖の速いがん細胞に選択的に結合させる免疫療法を用いるがん療法がある（例えばモノクローナル抗体）。残念ながら、こうした治療の後に腫瘍が同じまたは異なる部位に再発することは少なくなく、すべてのがん細胞が根絶されているわけではないことが示唆される。再発の原因は、化学療法投与量の不足および／または治療抵抗性のがんクローンの出現である可能性がある。そのため、新規のがん治療戦略が必要とされている。

変異解析の進歩により、がんの発生過程で起こる遺伝子変異を詳細に研究することが可能になった。現代の腫瘍学では、ゲノムの状況についての知識があるにもかかわらず、がんのサブタイプにまたがる主要なドライバー変異を同定することが困難となっている。患者の腫瘍はそれぞれ独特であり、１つの腫瘍に複数の異なるクローン細胞が含まれている可能性があるという厳しい現実があるようだ。そこで必要となるのが、異なるがん種間の共通点を重視する新たな手法である。腫瘍と正常細胞の代謝の違いを標的とすることは、新規のがん治療戦略として有望である。ヒト乳がん試料の転写プロファイリングデータの解析から、ミトコンドリア生合成および／またはミトコンドリア翻訳に関連する９５個を超えるｍＲＮＡ転写物の上昇が明らかとなった。さらに、９５個のうち３５個超が、ミトコンドリアリボソームタンパク質（ＭＲＰ）をコードするｍＲＮＡを上方制御した。同様にヒト乳がん幹細胞のプロテオーム解析でも、いくつかのミトリボソームタンパク質と、ミトコンドリア生合成に関連する他のタンパク質の著しい過剰発現が明らかとなった。

ミトコンドリアは、細胞の要求を満たし、細胞の微小環境に適応するために、絶えず分裂、伸長し、互いに結合して管状ネットワークまたは断片化した微小体を形成する極めて活動的な細胞小器官である。ミトコンドリアの融合と分裂のバランスは、ミトコンドリアの形態、量、機能、および空間分布を決定することから、ＡＴＰ産生、マイトファジー、アポトーシス、およびカルシウム恒常性など、ミトコンドリアに依存する極めて多くの重要な生物学的過程に影響する。一方でミトコンドリアの動態は、ミトコンドリア代謝、呼吸、および酸化ストレスによって制御されることがある。したがって、分裂と融合活性のアンバランスが、がんを含むいくつかの病態に悪影響を及ぼすことは驚きではない。がん細胞では断片化したミトコンドリアがたびたび見られ、がんに伴って分裂の亢進や融合の低下が認められることも少なくないが、ミトコンドリアの動態が腫瘍形成にどのように影響するかに関する包括的な機序の理解はなおも必要とされている。

特に腫瘍増殖や転移性播種が進むに従って、がん細胞の生体エネルギーや生合成の需要増加に応えるため、代謝機能の維持や強化が必要となる。当然ながら、ミトコンドリア依存性代謝経路は、いくつかの燃料源からエネルギーを抽出することによって、がん細胞に不可欠な生化学的プラットフォームを提供する。

がん幹様細胞は、正常な成体幹細胞や胚性幹細胞と同じ特性的特徴を持つ、腫瘍細胞の比較的小さな亜集団である。そのためＣＳＣは、腫瘍再発と遠隔転移の臨床的特徴をもたらし、最終的に化学療法と放射線療法を受けているがん患者を治療失敗や早死に至らせる腫瘍再生と全身の有機体拡散の「主要な生物学的原因」であると考えられている。前臨床動物モデルでは単離されたＣＳＣが実験的に腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）として挙動することから、ＣＳＣは腫瘍の開始にも機能を果たしている証拠が示されている。全世界のがん患者の約９０％が転移性疾患により早期に死亡していることから、ＣＳＣを効果的に標的として根絶する新規の治療法の開発は急務であり、アンメットクリニカルニーズとなっている。従来の治療法の大半はＣＳＣを標的としておらず、原発腫瘍や遠隔部位でＣＳＣの出現頻度を増加させることが少なくない。

近年、エネルギー代謝とミトコンドリア機能は、腫瘍開始、転移拡散、抗がん療法への耐性に関与する腫瘍塊内の際立った細胞亜集団であるＣＳＣの維持と増殖に関わる特定の動態と関連付けられている。例えば、ＣＳＣではミトコンドリア質量が特異的かつ独特な増加を示し、ミトコンドリア生合成が亢進し、ミトコンドリアタンパク質翻訳の活性が向上する。これらの挙動は、ミトコンドリア機能への厳格な依存を示唆している。これらの観察と一致して、ミトコンドリア代謝機能とＯＸＰＨＯＳの亢進が、複数の腫瘍型のＣＳＣで検出されている。

ＣＳＣを除去する新たな戦略の１つが、細胞代謝を利用することである。ＣＳＣは最もエネルギーに満ちたがん細胞である。本手法では、代謝阻害剤を用いてＡＴＰ枯渇を誘導し、ＣＳＣを餓死させる。これまでに本発明者らは、抗ＣＳＣ特性を有し、ＡＴＰ枯渇を誘導するオフターゲットのミトコンドリア副作用を有する多数のＦＤＡ承認薬、例えばミトコンドリアタンパク質翻訳阻害剤として機能する抗生物質ドキシサイクリンなどを同定してきた。ドキシサイクリンは、長時間作用型のテトラサイクリンアナログで、現在、ざ瘡、酒さ性ざ瘡、およびマラリア予防など、多様な形態の感染症の治療に使用されている。最近の第ＩＩ相臨床試験では、術前のドキシサイクリン経口投与（２００ｍｇ／日、１４日間）により、早期乳がん患者のＣＳＣ負荷が、９０％近くの陽性反応率で１７．６５～６６．６７％減少した。

しかしながら、腫瘍塊に適応機構が備わってミトコンドリア機能の欠如が克服されることがあるため、がん療法における抗ミトコンドリア剤の単独使用にはある程度の限界がある。これらの適応機構には、例えば、腫瘍細胞内および周囲のニッチにおいて、内在性と外在性両方の要因によって引き起こされる代謝可塑性の多方向の過程で、酸化代謝から代替エネルギー経路にシフトするＣＳＣの能力がある。特に、ＣＳＣではこうした代謝柔軟性の操作が、治療の観点で有利となる可能性がある。そこで必要とされるのが、こうした代謝シフトを防ぐ、またはシフトを利用してがん細胞の増殖を抑制する治療手法である。

アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）は、あらゆる生細胞と生命体の生体エネルギー「通貨」である。化学的には、ＡＴＰはアデニン、リボース糖、および三リン酸基を含むヌクレオシド三リン酸である。末端のリン酸基でＡＴＰが切断されると、ＡＤＰと無機リン酸（Ｐｉ）の２つの主要反応生成物が生成され、それによって大量の貯蔵エネルギーが放出される。真核細胞では、ミトコンドリアがＴＣＡサイクルと酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）によって大量のＡＴＰを産生するのに対し、解糖で得られるＡＴＰは微量である。ミトコンドリアの機能不全はＡＴＰ枯渇を引き起こし、ミトコンドリアによるアポトーシス（細胞死）に至る。

ＭＣＦ７乳がん細胞では、ミトコンドリアによるＯＸＰＨＯＳがＡＴＰ産生の８０％を、解糖が残りの２０％を担っている。すなわち、正常細胞と同様にがん細胞もミトコンドリアのＡＴＰ産生に大きく依存している。しかしながら、がん細胞のＡＴＰレベルが、「幹細胞性」や細胞周期進行の他、転移拡散の特性的特徴である足場非依存性増殖を起こす能力にどのように関わっているのかは、まだほとんどわかっていない。

ＡＴＰは細胞代謝のバロメーターとして非常に重要であることから、さまざまな細胞刺激に応答してＡＴＰレベルを測定および追跡するための発光プローブや蛍光プローブが数多く開発されている。例えば、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１（ＣＡＳ番号：１８４７４８５－９７－５、ＩＵＰＡＣ名：［２－［３’，６’－ビス（ジエチルアミノ）－３－オキソスピロ［イソインドール－１，９’－キサンテン］－２－イル］フェニル］ボロン酸）はＡＴＰに結合した場合にのみ蛍光性となり、ＡＤＰなど他の栄養素は認識しない。ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、生体細胞や組織中のＡＴＰレベルを動的に可視化することができる。

本開示の目的は、「最適」ながん細胞までをも標的化し、根絶する実行可能なＡＴＰ枯渇戦略を説明することである。

本開示の別の目的は、特定の過剰増殖表現型の細胞の特異的な組成を説明することである。

本開示の別の目的は、ミトコンドリアを標的とし、ＡＴＰ枯渇を引き起こすことによって、ＣＳＣを代謝的に飢餓状態にする新たな医薬化合物を含む新たな抗がん治療手法を特定することである。

国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２４０３号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３９３５４号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５７０９３号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６２１７４号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６６５４１明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３３４６６号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６２９５６号明細書 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３７８６０号明細書

本手法は、がん細胞集団を代謝的に分画し、過剰増殖細胞亜集団を分離する蛍光ＡＴＰ撮像プローブの使用を説明する。得られた組成物は、迅速な薬剤開発やスクリーニングから、転移や薬剤耐性の予測および予防まで、多くの有利な目的に使用し得る。また本手法は、がんの転移の前兆となる５つの遺伝子シグネチャーの他、がん細胞の代謝分画、ならびに転移の診断および予防の方法も提供する。

ＡＴＰベースのバイオマーカーを用いた生体エネルギー細胞の「層別化」を利用して、同定、診断、治療、および治療薬開発のために「最適」ながん細胞を単離し得る。具体的には、Ｂｉｏｔｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１などの蛍光ＡＴＰ撮像プローブを使用して細胞集団を染色し、得られたＡＴＰベースの蛍光を使用して、集団をＡＴＰ－ｈｉｇｈ、さらに必要に応じてバルクおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団に代謝的に分画し得る。この新規の手法を用いて本明細書に開示するデータには、多量のミトコンドリアＡＴＰが、自然転移を含む攻撃的ながん細胞の挙動の主要な決定要因であるという最初の証拠が含まれている。

がん細胞集団には、表現型多様性および代謝不均一性が非常に多く存在する。この不均一性があることで、「最適」ながん細胞は現在の治療法を回避でき、その結果、薬剤耐性による腫瘍再発や遠隔転移が生じる。

細胞内の高いＡＴＰレベルは、攻撃的で増殖性の高いがん細胞表現型を示す代謝バイオマーカーとして使用し得る。本手法では、生体染色色素ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＡＴＰ－Ｒｅｄ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州バーリントン）などの蛍光ＡＴＰマーカーを使用して、がん細胞集団のミトコンドリアＡＴＰレベルを定量し、フローサイトメトリーによってＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗのがん細胞亜集団を単離し得る。これらの亜集団の表現型解析から、高いミトコンドリアＡＴＰレベルは、がん細胞に過剰増殖、幹細胞性、足場非依存性、抗酸化能、および多剤耐性をもたらす代謝形質であることが示されている。４つのヒト乳がん細胞株、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８で定量的に同様の結果が得られた。

ＡＴＰを他のＣＳＣマーカー、例えばＣＤ４４またはＡＬＤＨ活性と組み合わせることによって、ＣＳＣ集団は有利には２つの亜集団に分画し得る。ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、足場非依存性増殖のレベルがＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団と比べて約２倍である。したがって、ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗがん細胞は休眠性が高いＣＳＣ集団である。重要なこととして、これらの結果は、ＣＳＣではＡＴＰレベルが休眠の機能制御因子であり得ることを示している。

本手法は、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の幹細胞性、転移、および検出におけるミトコンドリアＡＴＰ合成に関係する相補的なバイオインフォマティクスデータも含む。本明細書では、ＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢを含む５つのメンバーのＡＴＰ関連転移遺伝子シグネチャーを開示する。これらの転移に基づいた臨床所見によれば、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞遊走と細胞浸潤の両方、またｉｎ ｖｉｖｏでは自然転移を起こす能力の劇的な増加を示した。

したがって本手法は、がん細胞の幹細胞性、多剤耐性、および転移を体系的に同定、調査し、標的とする新たな細胞プラットフォームを提供する。本開示は、ＡＴＰ枯渇を誘発することによってがん療法を改善するための、ｉ）栄養遮断、およびｉｉ）カロリー制限模倣物の有益な治療上の利益も機構的に説明する。

本手法の実施形態では、生体染色色素ＡＴＰ－Ｒｅｄ１を分子プローブとして使用し、細胞、より具体的には、がん細胞およびＣＳＣのＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団を同定および単離する。がん細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、大きく、エネルギーが高く、過剰増殖で、足場非依存性増殖を行うことから、より「幹様」の表現型と一致している。こうしたＡＴＰが豊富な細胞は、ＡＴＰ枯渇療法を用いて、エネルギー的に「最適」なＣＳＣを根絶し、薬剤耐性を低下させ、転移を予防し得る。

本手法のいくつかの実施形態は、ヒトがん細胞集団からの細胞の亜集団という形態で、過剰増殖性がん幹細胞の精製組成物という形態を取り得、がん細胞集団は蛍光アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）撮像プローブに反応して一定範囲の蛍光シグナルを発現し、細胞の亜集団は一定範囲のＡＴＰベースの蛍光シグナルの上部を発現する。蛍光ＡＴＰ撮像プローブは、例えば、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１であり得る。上部、つまりＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、実施形態に応じて、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％、５％、または１％であり得る。他の部分も使用し得る。いくつかの実施形態では、組成物はＣＤ４４マーカーに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物はＡＬＤＨマーカーに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物は凍結している。

いくつかの実施形態では、本手法は、蛍光ＡＴＰ撮像プローブで染色されたがん幹細胞亜集団を含み、かつがん細胞集団のＡＴＰベースの蛍光シグナル範囲の目標部分を発現する精製細胞組成物の形態を取り得る。がん細胞集団は一定範囲のＡＴＰベースの蛍光シグナルを発現し、またＡＴＰベースの蛍光シグナル範囲の目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上部（例えば、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団）および／またはＡＴＰベースの蛍光シグナルの下部（例えば、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団）であり得る。目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位または下位１０％、５％、もしくは１％、または選択する他の部分であり得る。

いくつかの実施形態は、蛍光ＡＴＰ撮像プローブでヒトがん細胞集団を染色し、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの目標部分を有するヒトがん細胞集団の分画を分離し、分離した細胞を精製することによって得られる細胞の精製組成物の形態を取り得る。目標部分は、例えばＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位５％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位１０％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位５％などであり得る。分離した細胞は、ＣＤ４４マーカーおよびＡＬＤＨマーカーのうち１つに対して陽性である。

いくつかの実施形態は、ＡＴＰベースの細胞分画の方法という形態を取り得る。細胞集団の細胞は、ＡＴＰと結合すると蛍光を発する蛍光ＡＴＰ撮像プローブで染色し得る。細胞集団における染色した細胞のＡＴＰベースの蛍光シグナルは測定し得る。染色した細胞は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの目標部分に基づいて分離し得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびＡＴＰベースの蛍光シグナルの目標部分のゲーティングを用いて、染色した細胞を分離し得る。ゲートを設定し、測定した蛍光シグナルの上位１０％を有する染色した細胞、および／または測定した蛍光シグナルの下位１０％を有する染色した細胞を回収し得る。当然のことながら、他の割合も使用し得る。細胞集団は、例えば、血液、尿、唾液、腫瘍組織、非がん組織、または転移巣に由来し得る。いくつかの実施形態は、分離した細胞のＡＬＤＨ活性を測定すること、分離した細胞の足場非依存性増殖を測定すること、分離した細胞のミトコンドリア質量を測定すること、分離した細胞の解糖および酸化的ミトコンドリア代謝を測定すること、分離した細胞の細胞周期進行および増殖速度を測定すること、ならびに分離した細胞の倍数性を測定することをさらに含み得る。

本手法の実施形態は、細胞集団から代謝的に活性な細胞を分離および回収する方法という形態を取り得る。細胞集団の細胞は、ＡＴＰと結合すると蛍光を発するＡＴＰ標識色素で染色し得る。染色した細胞の蛍光シグナルを細胞集団で測定し得、次いで、測定した蛍光シグナルに基づいて、染色した細胞を測定し得る。測定した蛍光シグナルが所定の閾値超および所定の閾値未満のいずれかである、分離した細胞の少なくとも一部は、ＦＡＣＳ装置を用いるなどして回収し得る。所定の閾値は、測定した蛍光シグナルの一定割合の上部、例えば上位２５％、上位２０％、上位１５％、上位１０％、上位５％、上位２％、および上位１％などを含む。本手法から逸脱することなく、他の割合も使用し得る。いくつかの実施形態では、分離した細胞は、第２のマーカー、例えばＣＤ４４（＋）、ＣＤ１３３（＋）、ＥＳＡ（＋）、ＡＬＤＥＦＬＯＵＲ（＋）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ－Ｈｉｇｈ、ＥｐＣＡＭ（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ３４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ１０６（＋）、ＣＤ１６６（＋）、およびＳｔｒｏ－１（＋）に基づいてさらに分離し得る。本手法から逸脱することなく、他のマーカーも使用し得る。第２のマーカーは、いくつかの実施形態では、磁気ビーズに抗体を塗布した形態を取り得る。

本手法は、生体試料でがん幹細胞を同定および処理する方法という形態もとり得る。生体試料は患者から入手し得、次いで、生体試料中の細胞はＡＴＰ標識色素で染色し得、ＡＴＰ標識色素はＡＴＰと結合すると蛍光を発する。細胞集団における染色した細胞の蛍光シグナルを測定し得、次いで、がん幹細胞の存在を示す所定の閾値と比較し得る。測定した蛍光シグナルが所定の閾値を超えた場合、ＡＴＰ枯渇療法剤を患者に投与し得る。ＡＴＰ枯渇療法剤は、例えばドキシサイクリン、チゲサイクリン、アジスロマイシン、パモ酸ピルビニウム、アトバコン、ベダキリン、ニクロサミド、イリノテカン、アクチノニン、ＣＡＰＥ、ベルベリン、ブルチエリジン、メリチジン、オリゴマイシン、ＡＲ－Ｃ１５５８５８、ミトリボスシン（Ｍｉｔｏｒｉｂｏｓｃｉｎ）、ミトケトスシン（Ｍｉｔｏｋｅｔｏｓｃｉｎ）、ミトフラボスシン（Ｍｉｔｏｆｌａｖｏｓｃｉｎ）、ＴＰＰ誘導体、ドデシルＴＰＰ、２－ブテン－１，４－ビス－ＴＰＰ、またはドキシサイクリン、アジスロマイシン、およびアスコルビン酸の組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態では、本手法は抗がん活性の候補化合物を試験する方法という形態を取り得る。がん細胞集団は、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１など、ＡＴＰと結合すると蛍光を発するＡＴＰ標識色素で染色し得る。染色した細胞のＡＴＰベースの蛍光シグナルを測定し得、染色した細胞をＡＴＰベースの蛍光シグナルの目標部分に基づいて分離して、過活動がん細胞亜集団を作成し得る。候補化合物は過活動がん細胞亜集団に投与し得、過活動がん細胞亜集団に対する候補化合物の効果を測定し得る。ＡＴＰ標識色素はＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１であり得る。ＡＴＰベースの蛍光シグナルの目標部分は、例えば上位２５％、上位２０％、上位１５％、上位１０％、上位５％、上位２％、および上位１％であり得る。いくつかの実施形態では、過活動がん細胞亜集団は、ＣＤ４４マーカーおよびＡＬＤＨマーカーのうち１つに対して陽性である。実施形態は、過活動がん細胞亜集団のＡＬＤＨ活性を測定すること、過活動がん細胞亜集団細胞の足場非依存性増殖を測定すること、過活動がん細胞亜集団のミトコンドリア質量を測定すること、過活動がん細胞亜集団の解糖および酸化的ミトコンドリア代謝を測定すること、過活動がん細胞亜集団の細胞周期進行および増殖速度を測定すること、ならびに過活動がん細胞亜集団の倍数性を測定することも含み得る。

本手法は、がん患者における転移のリスクを診断および予防する方法という形態もとり得る。患者のがんの生体試料中のＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢの５つのメンバーの遺伝子シグネチャーの発現量を決定し、次いで、患者の非がん性の生体試料中のＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢのベースライン発現量と比較し得る。検出した発現量がベースライン発現量を超えた場合、ＡＴＰ枯渇化合物を患者に投与し得る。ＡＴＰ枯渇化合物は、例えばドキシサイクリン、チゲサイクリン、アジスロマイシン、パモ酸ピルビニウム、アトバコン、ベダキリン、ニクロサミド、イリノテカン、アクチノニン、ＣＡＰＥ、ベルベリン、ブルチエリジン、メリチジン、オリゴマイシン、ＡＲ－Ｃ１５５８５８、ミトリボスシン、ミトケトスシン、ミトフラボスシン、ＴＰＰ誘導体、ドデシルＴＰＰ、２－ブテン－１，４－ビス－ＴＰＰ、またはドキシサイクリン、アジスロマイシン、およびアスコルビン酸の組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態は、生体試料中の末梢循環腫瘍細胞を同定するキットという形態を取り得る。キットは、生体試料中のＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢの上方制御を同定する試薬、例えばこれらの遺伝子をコードするタンパク質を対象とする抗体を含み得る。キットは、一例として、ＣＴＣを検出するリキッドバイオプシー法のために使用し得る。

本手法は、生体試料中の末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法という形態もとり得る。生体試料中のＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢの発現量を決定し得、次いで、決定した発現量が対照に対して上方制御されている場合、ＣＴＣは存在すると特定される。生体試料は、例えば血液、尿、唾液、腫瘍組織、非がん組織、または転移巣であり得る。試料は、本明細書に記載する方法を用いて、さらに処理してＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞を分離し得る。

こうした実施形態は、本明細書、本明細書に添付された請求の範囲、および参照により本明細書に援用される出願を考慮することで、当業者には明らかとなろう。

両方の３次元培養条件（足場非依存性腫瘍とｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍）下で、すべて２次元接着培養に対して転写的に上方制御されたＡＴＰ関連遺伝子のヒートマップを示す。 ＧＳＥ２０３４ ＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓのボルケーノプロットを示す。 ＧＳＥ５９０００ ＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓのボルケーノプロットを示す。 転移の予後バイオマーカーとして、両方のデータセットで高度に上方制御されたＡＴＰ関連遺伝子を特定するのに使用される、２つの乳がん転移のＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（ＧＳＥ２０３４およびＧＳＥ５９０００）を交差させたベン図を示す。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤＨ１との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＡＬＤＨ２との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＳＯＸ２との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＶＩＭとの正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤ４４との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＥＰＣＡＭとの正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＭＫＩ６７との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＲＲＰ１Ｂとの正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＸＣＲ４との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＶＣＡＭ１との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤＫ１との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤＫ２との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤＫ４との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと遺伝子ＣＤＫ６との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１ＣとＵＱＣＲＢとの正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１ＣとＣＯＸ２０との正相関を示すデータプロットである。 ＡＴＰ５Ｆ１ＣとＮＤＵＦＡ２との正相関を示すデータプロットである。 ＥＲ（＋）、無再発生存期間（Ｎ＝３，０８２）のカプラン・マイヤー曲線を示す。 ＥＲ（＋）、無遠隔転移生存期間（Ｎ＝１，３９５）のカプラン・マイヤー曲線を示す。 ＥＲ（＋）、リンパ節陰性、タモキシフェン治療歴あり、無再発生存期間（Ｎ＝４７１）のカプラン・マイヤー曲線を示す。 ＡＴＰ－ＡＢＣ遺伝子発現プロファイルのヒートマップを示す。 ＯＸＰＨＯＳ遺伝子発現プロファイルのヒートマップを示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のウエスタンブロット解析である。 本実施形態による代謝分画手順の実施形態を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈ（上位５％）およびＡＴＰ－ｌｏｗ（下位５％）細胞亜集団を単離するための、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１を用いたＭＣＦ７細胞の代謝分画の一例を示す。 ３つの細胞亜集団（ＡＴＰ－ｌｏｗ５％、バルク５％、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ５％）の細胞増殖に関する連続的なリアルタイムアッセイ系の結果を示す。 ３つの細胞亜集団（ＡＴＰ－ｌｏｗ５％、バルク５％、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ５％）の細胞増殖に関する連続的なリアルタイムアッセイ系の結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７亜集団における細胞の発光の変化を示す棒グラフである。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈ、バルク、およびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のマンモスフェア形成アッセイの結果を示す。 アッセイ後の細胞亜集団の比較画像を示す。 ＣＤ４４およびＡＬＤＨ陽性亜集団のシグナル強度を示す。 この解析のＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏの結果を示す。 ３次元マンモスフェアのＭＣＦ７細胞の代謝プロファイリングに関する結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞の代謝プロファイリングに関する結果を示す。 １０％ゲートを用いた、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを示す。 １０％ゲートを用いた、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の３次元マンモスフェア形成を示す。 ２４時間後のＭＣＦ７細胞集団におけるＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団（１０％）の発光を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の代謝フラックス解析の結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の代謝フラックス解析の結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の代謝フラックス解析の結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の代謝フラックス解析の結果を示す。 ヨウ化プロピジウムを用いた、ＤＮＡ含有量を検出するＦＡＣＳ解析によるＭＣＦ７細胞の細胞周期進行を示す。 ヨウ化プロピジウムを用いた、ＤＮＡ含有量を検出するＦＡＣＳ解析によるＴ４７Ｄ細胞の細胞周期進行を示す。 ヨウ化プロピジウムを用いた、ＤＮＡ含有量を検出するＦＡＣＳ解析によるＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の細胞周期進行を示す。 ヨウ化プロピジウムを用いた、ＤＮＡ含有量を検出するＦＡＣＳ解析によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞周期進行を示す。 ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団（下位５％）の薬剤耐性結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団（上位５％）の薬剤耐性結果を示す。 ＭＣＦ７細胞における二重標識細胞（ＣＤ４４とＡＴＰ）のマンモスフェアアッセイ形式の結果を示す。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における二重標識細胞（ＣＤ４４とＡＴＰ）のマンモスフェアアッセイ形式の結果を示す。 ＭＣＦ７細胞における二重標識細胞（ＡＬＤＨ活性とＡＴＰ）のマンモスフェアアッセイ形式の結果を示す。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における二重標識細胞（ＡＬＤＨ活性とＡＴＰ）のマンモスフェアアッセイ形式の結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団におけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の遊走アッセイの結果を示す。 ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団におけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤アッセイの結果を示す。 ｉｎ ｖｉｖｏのＣＡＭアッセイでの自然転移を示す。 Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰ－ＭＣＦ７細胞の発光変化を示す。 Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰ－ＭＣＦ７細胞の細胞周期進行の結果を示す。 Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰ－ＭＣＦ７細胞のマンモスフェア形成アッセイの結果を示す。

以下の説明は、本手法の実施を可能にするために十分詳細に本手法の実施形態を示すものである。これらの特定の実施形態を参照して本手法を説明するが、当然のことながら、本手法は異なる形態で具体化でき、また本説明は、任意の添付の請求項を、本明細書に記載する特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態を提供することにより、本開示は完璧で完全なものとなり、また当業者に本手法の範囲を完全に伝えるものとなる。

本説明では、当業者には理解されるはずのさまざまな用語を使用する。以下に、誤解を避けるために明確化を行う。用語「治療する」、「治療された」、および「治療」は、治療される状態、障害、または疾患、特にがんに関連する、またはこれによって引き起こされる少なくとも１つの症状の軽減または緩和を含む。特定の実施形態では、治療は、本発明の化合物によって治療されるがんに関連する、またはこれによって引き起こされる少なくとも１つの症状を軽減および／または緩和することを含む。いくつかの実施形態では、治療は、宿主における特定のがんのある種の細胞、例えばＣＳＣの死を引き起こすことを含み、がん細胞がさらに増殖するのを防ぐこと、および／または、例えばエネルギーを生成する機構をそのような細胞から奪ってＣＳＣ機能を阻害することによって達成し得る。例えば、治療はがんの１つもしくは複数の症状の軽減、またはがんの根治である可能性がある。別の例として、本手法を使用して、がんにおけるミトコンドリア代謝を阻害し、がんのＣＳＣを根絶し（例えば、増殖するより速い速度で殺す）、がんのＴＩＣを根絶し、がんの末梢循環腫瘍細胞を根絶し、がんの増殖を阻害し、ＣＳＣを標的にして阻害し、ＴＩＣを標的にして阻害し、末梢循環腫瘍細胞を標的にして阻害し、転移を予防し（すなわち、転移の可能性を低下させ）、再発を予防し、化学療法に対するがん感受性を増強し、放射線療法に対するがん感受性を増強し、光線療法に対するがん感受性を増強し得る。

用語「がん幹細胞」および「ＣＳＣ」は、動物宿主に移植すると自己再生能、分化能、および腫瘍形成能を有する、腫瘍内のがん細胞の亜集団を指す。ＣＳＣは、「バルク」がん細胞と比べて、ミトコンドリア質量が増加し、ミトコンドリア生合成が亢進し、ミトコンドリアタンパク質翻訳の活性が向上している。本明細書で使用する「末梢循環腫瘍細胞」は、原発腫瘍から脈管系またはリンパ系に流れ込んだがん細胞であり、血液循環に乗って全身に運ばれる。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈの末梢循環腫瘍細胞検査を用いて、末梢循環腫瘍細胞を検出し得る。

語句「ＡＴＰ－ｈｉｇｈ」および「ＡＴＰ－ｌｏｗ」は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルを有する細胞亜集団を指し、それぞれ開始細胞集団におけるＡＴＰベースの蛍光シグナルの上部および下部を表す。上部は、開始細胞集団のＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位２５％、または上位２０％、または上位１５％、または上位１０％、または上位５％、または上位２％、または上位１％を表し得る。下部は、開始細胞集団のＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位２５％、または下位２０％、または下位１５％、または下位１０％、または下位５％、または下位２％、または下位１％を表し得る。

本明細書で使用する語句「薬学的に有効な量」は、プロテインキナーゼ活性の調節、調整、もしくは阻害などの治療結果、例えばプロテインキナーゼの活性阻害、またはがんの治療を達成するために、宿主、または宿主の細胞、組織、もしく器官に投与するのに必要な量を示す。当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも少ない量で、医薬組成物に用いられる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増加させることができよう。

バイオインフォマティクス解析から、３次元足場非依存性増殖、幹細胞性、および遠隔転移におけるミトコンドリアＡＴＰ合成の役割が明らかとなる。特にミトコンドリアＡＴＰ合成は、バイオインフォマティクス手法において、３次元足場非依存性増殖および転移の重要な決定因子である。既存のプロテオームプロファイリングデータを照会し、２つの異なるＥＲ（＋）乳がん細胞株（ＭＣＦ７とＴ４７Ｄ）で２次元単層と３次元マンモスフェアを比較した。全体として、３次元マンモスフェアでは、両細胞株で共通する１，５１９個のタンパク質のうち２２個のＡＴＰ関連タンパク質が、両方のデータセットで上方制御されていることがわかった。以下の表１に、これらのタンパク質のアクセッション番号と、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞（スフィアと２次元接着培養）における発現量の倍率変化を示す。２１個のＡＴＰ関連タンパク質のうち、ＡＴＰ５Ｆ１Ｂ、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＡＴＰ５ＩＦ１、ＡＴＰ５ＭＧ、ＡＴＰ５ＰＢ、ＡＴＰ５ＰＤ、およびＡＴＰ５ＰＯを含む７つのミトコンドリアＡＴＰ合成酵素のサブユニットが検出された。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアを用いると、３次元足場非依存性増殖の予測上流制御因子が２つの細胞株間で高度に保存されており、腫瘍成長および腫瘍細胞増殖に関連する既存のＩＰＡデータセットと特異的に関連していることが観察された。

また、ＧＥＯ転写プロファイリングデータセットを再解析し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（トリプルネガティブ乳がん細胞株）の２次元培養、３次元培養、およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖を比較した。図１Ａは、両方の３次元培養条件（足場非依存性腫瘍とｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍）下で、すべて２次元接着培養に対して転写的に上方制御されたＡＴＰ関連遺伝子のヒートマップを示す。１列目が遺伝子名、２列目が２次元のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の発現プロファイル、３列目が３次元のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の発現プロファイル、４列目が異種移植片のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の発現プロファイルを示す。濃いセルは倍率変化が小さく、明るいセルは倍率変化が大きいことを示す。ヒートマップは倍率変化のｌｏｇを示し、例えば最も明るいセルは＋／－４である。２次元のＭＤＡ－ＭＢ－２３１列では明るいセルが負の変化（例えば、ＡＴＰ１１Ａ－ＡＳ１の倍率変化は－４ｌｏｇ）を示すのに対し、３次元および異種移植片列では明るいセルは正の変化（例えば、ＡＴＰ１２Ａの倍率変化は４ｌｏｇ）を示す。

ヒト乳がん転移に関連する２つの異なるＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓにおけるＡＴＰ関連遺伝子（ＯＸＰＨＯＳおよびＡＴＰ関連トランスポーター）の転写発現は、転移に関連するＡＴＰ関連遺伝子を同定するのに有用であった。図１Ｂおよび１Ｃは、ＧＳＥ２０３４およびＧＳＥ５９０００ ＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓのボルケーノプロットを示す。具体的には、図１Ｂでは、転移のあるシナリオと転移のないシナリオにおける遺伝子発現を比較し（ＧＳＥ２０３４）、図１Ｃでは転移のあるシナリオと原発腫瘍における遺伝子発現を比較している（ＧＳＥ５９０００）。ボルケーノプロットは、ＯｎｃｏＬａｎｄのＭｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ ＯｍｉｃＳｏｆｔ Ｓｕｉｔｅ）で提供されているアノテーションを調べ、未修正のｐ値カットオフ＜０．０５でアノテートされた遺伝子で、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＩＰＡ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて機能「コア解析」を実施して作成した。ＡＴＰ関連遺伝子（ＯＸＰＨＯＳとＡＴＰ関連トランスポーター）の転写プロファイルは、両方のＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓで、転移に特異的に関連して増加した。

図１Ｄは、転移の予後バイオマーカーとして、両方のデータセットで高度に上方制御されたＡＴＰ関連遺伝子を特定するのに使用される、２つの乳がん転移のＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（ＧＳＥ２０３４およびＧＳＥ５９０００）を交差させたベン図を示す。２つのＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓの交差は、図１Ｂおよび１Ｃに関連して説明したように、ＩＰＡソフトウェアを使用して行った。１，０５５個の遺伝子の重複セットに含まれていたＡＴＰ関連遺伝子はわずか５個だった。これらのＡＴＰ関連遺伝子、ＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢは両方の転移ＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓで高度に上方制御されており、したがって、がんの転移の予測に関して予後的重要性を有する。これら５個のＡＴＰ関連遺伝子は、転移の徴候となるＡＴＰ関連転移遺伝子シグネチャーとして使用し得る。中でも、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ（ＡＴＰ５Ｃ１としても知られる）は、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素の可溶性触媒コアＦ１のγサブユニットをコードする。ＵＱＣＲＢは、ミトコンドリア複合体ＩＩＩの必須成分であり、機能的にユビキノンと結合し、電子伝達に関与する。ＣＯＸ２０は、ミトコンドリア複合体ＩＶの構築に不可欠なシャペロンである。ＮＤＵＦＡ２は、ミトコンドリア複合体Ｉの機能に必須である。また、ＡＢＣＡ２は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター遺伝子ファミリーのメンバーである。

本物の乳がん転移巣では、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ転写発現は、ｉ）５個の転移マーカー遺伝子（ＥＰＣＡＭ、ＭＫＩ６７、ＲＲＰ１Ｂ、ＶＣＡＭ１、ＣＸＣＲ４）；ｉｉ）４個の細胞周期制御遺伝子（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）；およびｉｉｉ）１１個のＣＳＣマーカー遺伝子（ＣＤＨ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ１ＢＡ１、ＡＬＤＨ９Ａ１、ＳＯＸ２、ＶＩＭ、ＣＤＨ２、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＡＬＤＨ１Ｂ１、ＣＤ４４、ＡＬＤＨ３Ｂ２、統計的有意性の順番に記載）の同時発現と正に相関している。図２Ａ～２Ｎは、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと、ＣＤＨ１、ＡＬＤＨ２、ＳＯＸ２、ＶＩＭ、ＣＤ４４、ＥＰＣＡＭ、ＭＫＩ６７、ＲＲＰ１Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＶＣＡＭ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６の順に、それぞれの遺伝子との正相関を示すデータプロットである。

さらにＡＴＰ５Ｆ１Ｃ転写発現は、ミトコンドリア複合体Ｉ～Ｖ、ｍｔ－ＤＮＡにコードされた転写物、および転移遺伝子シグネチャーの５つのメンバーのうち他の３つ、すなわちＵＱＣＲＢ、ＣＯＸ２０、およびＮＤＵＦＡ２の同時発現とも正に相関している。図２Ｏ～２Ｑは、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃと、それぞれＵＱＣＲＢ、ＣＯＸ２０、およびＮＤＵＦＡ２との正相関を示すデータプロットである。この転移遺伝子シグネチャーの２つのメンバー、ＡＴＰ５Ｆ１ＣとＵＱＣＲＢの発現は、ヒト骨格筋組織における最大酸素摂取量（Ｖ_{０２ｍａｘ}）およびタイプ１線維（ミトコンドリアに富む）の割合の高さと機能的に相関している。

骨格筋におけるＡＴＰ５Ｆ１Ｃの発現も、運動トレーニング後に、患者の筋力向上に応じて有意に増加する。逆に、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃの発現は歳をとるに従って減少し、プロジェリア症候群の患者では低下していた。これらの結果は、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃの高発現が、細胞レベルでのミトコンドリアＡＴＰ産生増加のバイオマーカーであることを強く示唆している。

特に診断時にリンパ節陰性であり、タモキシフェン治療を受けたＥＲ（＋）患者（ハザード比（無再発生存期間）＝２．７７；Ｐ＝３．４Ｅ－０６；Ｎ＝４７１）では、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃが遠隔転移および腫瘍再発の予後バイオマーカーとなることを、カプラン・マイヤー（ＫＭ）解析を用いて確認した。図３Ａは、ＥＲ（＋）、無再発生存期間（Ｎ＝３，０８２）のカプラン・マイヤー曲線を示し、図３Ｂは、ＥＲ（＋）、無遠隔転移生存期間（Ｎ＝１，３９５）のカプラン・マイヤー曲線を示し、図３Ｃは、ＥＲ（＋）、リンパ節陰性、タモキシフェン治療歴あり、無再発生存期間（Ｎ＝４７１）のカプラン・マイヤー曲線を示す。

これらの結果は、ミトコンドリア複合体ＩＶを検出する組織化学的活性染色を用いて、外科的に切除されたリンパ節内の乳がん転移巣においてミトコンドリア活性が機能的に上方制御されていることを示すこれまでの研究とも一致する。さらに本発明者らは以前に、Ｎ＝２８の乳がん患者由来の試料を用いて、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ（４．６４倍；ｐ＝１．１４Ｅ－０５）を含むＡＴＰ５遺伝子ファミリーの１６のメンバーが、ヒト乳がん細胞において、隣接する間質細胞に対して転写的に上方制御されていることを指摘した。

既存のＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（ＧＳＥ５５４７０）を用いて、乳がん末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の転写バイオマーカーとしてのＡＴＰ関連遺伝子およびＯＸＰＨＯＳ遺伝子の使用を患者で評価した。図４Ａは、データセットにおけるＡＴＰ－ＡＢＣ遺伝子発現プロファイルのヒートマップを示し、凡例を含む。図４Ｂは、図４Ａと同じ凡例に基づき、ＯＸＰＨＯＳ遺伝子発現プロファイルのヒートマップを示す。一般に、セルの色が明るいほど、発現の絶対値が高い。本出願に関連して使用される白黒では、正と負の倍率変化の区別は難しい。対照血液を示す最初の５列の大部分は、元のヒートマップでは緑色で、発現の倍率変化が負であることを示す。残りのセルの大部分は赤色で、発現の倍率変化が正であることを示す。概して、ＣＴＣ中のＡＴＰ含有量が多いと、全血中でＣＴＣを同定、追跡するバイオマーカーとして有用であり得、それにより、がん診断が改善し、転移拡散を予防する可能性がある。

図４Ｃは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のウエスタンブロット解析の結果を示す。結果は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてミトコンドリアマーカーとＣＴＣマーカーが共に上方制御されていることを示している。ＡＴＰ５Ｆ１Ｃを含む複合体Ｉ～Ｖのミトコンドリアマーカーは、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対して、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ですべて過剰発現していた。さらに、ＣＴＣと転移の２つの既知のマーカー（ＶＣＡＭ－１とＥｐ－ＣＡＭ）は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団で過剰発現していた。βアクチンとβチューブリンを、同等のタンパク質負荷のマーカーとして使用した。

総合すると、バイオインフォマティクスデータと解析から、ミトコンドリアＡＴＰ合成増加が、３次元足場非依存性増殖および転移の重要なドライバーである可能性があることがわかる。この解析に基づいて、ＡＴＰレベルが最も高いがん細胞は、ＡＴＰレベルが低いがん細胞と比べて、増殖性が高く、より幹様で、３次元足場に依存しない増殖を行い、その他の攻撃的な挙動を示すと考えられる。同様に、ＡＴＰレベルが最も低い細胞は、休眠性が高いとみられる。いずれの亜集団も、特にがん研究や薬剤スクリーニングでの使用にとって大きな価値がある。本手法は、代謝分画によって、がん細胞集団からこれらの亜集団を分離する方法を提供する。がん細胞集団には数多くの亜集団が存在する。ＣＳＣは、自己再生能を有し、分化が可能で、移植されると腫瘍形成能を示す、がん細胞の小さな亜集団である。しかしながら、本明細書に記載するように、すべてのＣＳＣが同じように生成されるわけではない。ＡＴＰレベルに基づいて分離、精製されたＣＳＣは、自然発生するがん細胞集団にも、ＣＤ４４、ＣＤ２４、およびＣＤ１３３などの従来のマーカーを用いて分離、精製されたＣＳＣにすらも見られない特有の表現型特性を有している。

本手法において、細胞、好ましくはがん細胞は、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１などの蛍光ＡＴＰ標識色素およびフローサイトメトリーを用いて、代謝条件に基づいて分画し得る。最終的にＡＴＰレベルは、「幹細胞性」や増殖能といったがん細胞の表現型形質を決定する。そのため、ＡＴＰ標識色素を使用して、全細胞集団内からエネルギー的に「最適」ながん細胞を同定、精製できる。本発明者らは、蛍光生体染色色素であるＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１を選択し、生がん細胞のＡＴＰに標識した。当然のことながら、後から開発されたプローブを含む他の蛍光ＡＴＰ撮像プローブも、本手法から逸脱することなく使用し得る。好ましくは、蛍光ＡＴＰ撮像プローブはミトコンドリアＡＴＰを標的とする。

ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、通常、非蛍光性であるが、ＡＴＰと結合すると蛍光性になり、ＡＤＰを含む他の関連ヌクレオチドや代謝物とは結合しない。より具体的には、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、糖（アラビノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、リボース、ソルボース、スクロース、またはキシロース）または他のヌクレオチド（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、またはＧＴＰ）を認識しない。重要なこととして、この蛍光ＡＴＰ撮像プローブはＡＴＰに対して「ターンオン」の蛍光反応を示し、約６倍に蛍光が増強される。蛍光顕微鏡を用いると、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、細胞のＡＴＰ産生の主要源であるミトコンドリア内で主に検出される。したがって、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、フローサイトメトリーによってがん細胞集団を代謝的に分画する蛍光プローブとして好ましい。

がん細胞集団は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団に分離または分画した後、表現型の特徴付けを行い得る。亜集団は、上下の蛍光シグナルの割合（例えば、上位および下位２０％、上位および下位１％など）に関して定義し得、細胞選択および回収のためのＦＡＣＳのゲーティングカットオフ値は、選択した割合に基づいて決定する。本明細書に開示するデータは、ゲーティングカットオフ値として主に上位および下位５％、ならびに上位および下位１０％に依拠したが、当然のことながら、本手法から逸脱することなく他の割合も使用し得る。言うまでもなく、割合は５０％未満とすべきであり、割合が大きくなるほど、所定の細胞集団に対する表現型の特徴付けの特異性が低くなることが予想されよう。

図５Ａは、本実施形態による代謝分画手順の実施形態を示す。蛍光ＡＴＰ撮像プローブは培地に溶解し、インキュベートし得る（５０１）。本明細書に記載する結果は、蛍光ＡＴＰ撮像プローブとして５μＭのＢｉｏｔｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄを培地に溶解し、３０分間、細胞でインキュベートして得た。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄してトリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させ、４０μｍのセルストレーナーでろ過した（５０３）。３次元スフィアまたは２次元接着条件から得た細胞は、ＦＡＣＳのソーター（例えば、ＳＯＮＹのＳＨ８００）を用いて解析した（５０５）。細胞は、ＡＴＰベースの蛍光シグナル（例えば、上位／下位１％、２％、３％、４％、５％、１０％など）を用いて所望のＡＴＰ含有量でゲートし、選別した（５０７）。図５Ｂは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ（上位５％）およびＡＴＰ－ｌｏｗ（下位５％）細胞亜集団を単離するための、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１によるＭＣＦ７細胞の代謝分画の例を示す。比較のためにバルク（５％）集団も選択した。右図は、さまざまな蛍光強度での細胞数を示したもので、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ（上位５％）亜集団、ＡＴＰ－ｌｏｗ（下位５％）亜集団、およびバルク培地の領域を同定している。図５Ｂの左図は、各亜集団のＡＴＰベースの蛍光シグナルの平均値を示す。平均シグナル強度に基づいて、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞はＡＴＰ－ｌｏｗ集団と比べてＡＴＰレベルが約１５倍高く；バルク細胞集団と比べてＡＴＰレベルが２倍と推定される。

図６Ａおよび６Ｂは、３つの細胞亜集団（ＡＴＰ－ｌｏｗ５％、バルク５％、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ５％）すべてにおける細胞増殖の連続的なリアルタイムアッセイ系の結果を示す。細胞増殖はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）ＲＴＣＡ ＤＰ装置を用いて評価した。細胞は、最初にＡＴＰ含有量で選別し、計数してからＲＴＣＡ ＤＰ Ｅ－Ｐｌａｔｅに播種（共通培地で１×１０^４）してリアルタイム増殖解析を行った。３つの亜集団（ＡＴＰ－ｌｏｗ５％、バルク５％、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ５％）すべてをグラフに示す。結果から、１２０時間後、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ集団の増殖性は、バルク細胞集団に対して約２倍、ＡＴＰ－ｌｏｗ集団に対して約５倍高いことがわかる。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３を示す。一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図６Ａからわかるように、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は他の亜集団と比較してＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘが有意に高く、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団は他の亜集団と比較してＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ有意に低かった。図６Ｂは、各亜集団のＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘの経時的な傾きを示す。各時点（２４、４８、７２、９６、および１２０時間）において、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞集団の傾きは、他の２つの亜集団と比較して有意に高かった。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３を示す。二元配置分散分析、テューキー法で修正、＊ｐ＜０．０１。１２０時間の評価全体を通して、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の増殖速度が最も高かったのは明らかである。結果から、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ集団の増殖性は、バルク細胞集団に対して少なくとも約２倍、ＡＴＰ－ｌｏｗ集団に対して少なくとも約５倍高いことがわかる。これは、ミトコンドリアのＡＴＰレベルがＭＣＦ７細胞増殖の重要な決定因子であること、また、本手法の蛍光ＡＴＰ撮像プローブによる代謝分画が、最も増殖性の高い細胞集団と最も増殖性の低い細胞亜集団を同定するための有効な技術であることを示している。

さらなるアッセイで、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７亜集団はエネルギー的に過剰増殖し、３次元足場非依存性増殖、がん幹細胞マーカー、およびミトコンドリア質量が有意に増加したことが確認された。ＡＴＰ－Ｒｅｄ１の選択性を確認するため、フローサイトメトリー後に、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて細胞のＡＴＰレベルを測定した。しかしながら、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏはルシフェラーゼベースのアッセイであるため、ＡＴＰレベルを検出するには細胞溶解が必要であり、そのため生細胞選別や撮像に使用できない。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸプレートリーダーを使用し、発光によって相対的なＡＴＰ含有量を評価した。図７Ａの棒グラフは、ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞集団に対して、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７亜集団の細胞がＡＴＰレベルで少なくとも１５倍の増加を示し、一方でバルク細胞が約７倍の増加を示したことを示している。このグラフでは、ＭＣＦ７集団におけるＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＡＴＰレベルが、バルク細胞の少なくとも２倍であることもわかる。

３次元マンモスフェアアッセイを用いて、ＣＳＣ活性およびＣＳＣ増殖の機能的な読み出し情報である足場非依存性増殖を測定した。図７Ｂは、５％をゲートカットオフとして用いた、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ、バルク、およびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の３次元マンモスフェアアッセイの結果を示す。図７Ｃは、アッセイ後の細胞亜集団の比較画像を示す。３次元マンモスフェアの画像は、ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ２顕微鏡を使用して取得した。それぞれ、選別した３つの細胞集団の細胞の代表的な画像である。４倍対物レンズを使用した。スケールバーは１，０００μｍである。ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞亜集団は、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団に対して３次元スフェロイド形成が９倍増加し、バルク亜集団のほぼ２倍のマンモスフェア形成が見られた。これらのデータは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞はバルクＣＳＣ集団よりも３次元足場非依存性増殖を行う能力が高いことを示唆している。

確立された２つのＣＳＣマーカーであるＣＤ４４とＡＬＤＨ活性を使用して、亜集団の「幹細胞性」を調べた。図７Ｄは、ＦＡＣＳのゲーティングカットオフ値を５％とした場合、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞亜集団（右の棒）が、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団（左の棒）と比べてＣＤ４４の細胞表面発現でほぼ４倍、ＡＬＤＨ活性で約５．５倍となっていることを示している。ミトコンドリア質量の確立されたマーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ－Ｄｅｅｐ－Ｒｅｄでも同様の結果が得られ、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７亜集団で、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団と比べて３倍の増加が認められた。ミトコンドリア質量はＣＳＣにおける幹細胞性の特異的マーカーである。

これらは、本手法の代謝分画によってＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＣＳＣ活性が高まることを示している。重要なこととして、ＡＬＤＨ活性の高さは、ＣＳＣのＥＭＴ（上皮間葉転換）のバイオマーカーであると考えられているのに対し、ＣＤ４４は、むしろ上皮ＣＳＣマーカーであると考えられている。つまり、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団では、上皮ＣＳＣと間葉ＣＳＣの両方が有意に増加している。

抗酸化能と多分化能を示す蛍光生体プローブは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞集団も選択する。ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１撮像プローブの有効性を、特にＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞集団の選択性について、他のいくつかの蛍光生体染色色素と比較した。このために、ＭＣＦ７細胞の２次元単層をトリプシンで回収し、ｉ）シスチン取り込み（「シスチン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）ＦＩＴＣ」）およびγ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性（ＧＧＴ）などの抗酸化能；ｉｉ）多能性幹細胞；ｉｉｉ）低酸素；ならびにｉｖ）老化（βガラクトシダーゼ活性、β－Ｇａｌ）について、他の５つの蛍光ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒプローブのパネルでライブ染色を行なった。次いで、フローサイトメトリーの直後に、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて総ＡＴＰレベルを測定した。

図７Ｅは、この解析のＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏの結果を示し、下位５％（各プローブの左の棒）に対する上位５％（各プローブの右の棒）の発光の倍率変化を表している。驚くことに、抗酸化能（シスチン取り込みとＧＧＴ活性）および多分化能を示すプローブは、すべてＭＣＦ７細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団を選択した。しかしながら、追加で試験した蛍光生体プローブのうち、シスチンＦＩＴＣの取り込みを直接測定するＢｉｏＴｒａｃｋｅｒプローブは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団の選択において最も有効であったが、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１ほど有効ではなかった（３倍と２０倍）。興味深いことに、高い抗酸化能は幹細胞性や薬剤耐性表現型と厳密に関連していることが知られている。低酸素プローブも、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団を積極的に選択した。これは、低酸素とミトコンドリア生合成の増加との関連に起因し得る。しかしながら、老化プローブ（βガラクトシダーゼ活性）は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞集団もＡＴＰ－ｌｏｗ細胞集団も選択しなかった。

図８Ａおよび８Ｂは、３次元マンモスフェアおよびＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞の代謝プロファイリングに関する結果を示す。３次元足場非依存性増殖の根底にある代謝に対する理解を深めるために、２次元単層または３次元スフェロイドで培養したＭＣＦ７細胞の細胞内ＡＴＰレベルを比較した。後者の細胞集団はＣＳＣが非常に豊富であることが知られている。２次元接着単層または３次元マンモスフェアとして増殖させたＭＣＦ７細胞中の代謝物のレベルを、Ｐｒｏｍｅｇａのキット（Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏ、ＮＡＤＰ－ＮＡＤＰＨ－Ｇｌｏ、ＮＡＤ－ＮＡＤＨ－Ｇｌｏ）を用いて比較した。２次元単層および３次元マンモスフェアは、最初にトリプシンで単一細胞に解離し、２５ゲージ針で注入して、４０μｍのセルストレーナーでろ過した。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、これらの相対発光量を評価した。なお、３次元マンモスフェアから得られた細胞は、いずれも２次元単層に対して、ＡＴＰレベルが２倍超、還元型グルタチオンレベルがほぼ２倍、ＮＡＤＰ－ＮＡＤＰＨレベルが２倍超、ＮＡＤ－ＮＡＤＨレベルがほぼ１．５倍の増加を示した。データは、接着細胞に対する平均増加倍率±ＳＤ、ｎ＝４を表す。対応のないｔ検定、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

図８Ａは、ＡＴＰ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、ＮＡＤＰ－ＮＡＤＰＨ、およびＮＡＤ－ＮＡＤＨを標的とするプローブについて、３次元スフェロイド（右の棒）と２次元単層（接着、左の棒）の発光の変化を比較したものである。３次元マンモスフェアから得られたＭＣＦ７細胞の定量分析では、ＡＴＰレベルが２次元単層細胞に対して２．３倍の増加を示した。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比とＮＡＤＰ／Ｈレベルの両方で約２倍の増加が認められ、ＮＡＤ／Ｈでも同様の結果が得られた。これらのデータは、３次元足場非依存性増殖には抗酸化能の向上も必要であり得るという考えと一致している。

以上から、２次元単層細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、３次元足場非依存性増殖を起こす能力を有すると予想される。低接着条件下では、通常、ＭＣＦ７細胞の９０％超が、アポトーシス細胞死の特殊な形態であるアノイキスを起こす。ＡＴＰレベルが高ければ、細胞－基質接着がないために起こる懸濁液中での増殖という大きなストレスに、ＣＳＣがより抵抗できると推測される。しかし、エネルギー貯蔵量が多ければ、複数のストレス要因に対する耐性も付与され、結果として多剤耐性に至る可能性がある。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗのＭＣＦ７細胞は、Ｐｒｏｍｅｇａのキット（Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏ、ＮＡＤＰ－ＮＡＤＰＨ－Ｇｌｏ、ＮＡＤ－ＮＡＤＨ－Ｇｌｏ）を用いて、ＮＡＤ／Ｈ、および２つの重要な抗酸化物質、ＧＳＨとＮＡＤＰ／Ｈについて、代謝プロファイリングを行った。最初に２次元単層の細胞をＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１で染色し、フローサイトメトリーを用いてＡＴＰ含有量による選別を行った。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、これらの相対発光量を評価した。なお、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞は、いずれもＡＴＰ－ｌｏｗのＭＣＦ７細胞に対して、ＡＴＰレベルがほぼ２５倍、還元型グルタチオンレベルが６倍、ＮＡＤＰ－ＮＡＤＰＨレベルがほぼ８倍、ＮＡＤ－ＮＡＤＨレベルが２倍超の増加を示した。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ５％細胞に対する平均増加倍率±ＳＤ、ｎ＝４を表す。対応のないｔ検定、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。図８Ｂに示すように、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の細胞は、いずれもＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の細胞に対して、ＮＡＤ／Ｈを１．５倍超、ＮＡＤＰ／Ｈを７．５倍超、還元型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比）を７倍超含有する。これらのデータは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＣＦ７細胞はエネルギーがより高く、その結果、抗酸化能が増強されていることを示している。高レベルの抗酸化物質は、がん細胞の薬剤耐性と関連することが知られており、多剤耐性表現型を示している。したがって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７亜集団の細胞は、３次元の代謝表現型を模倣しており、集団からＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞を分離するという本手法が、多くの使用可能性を持つ特有の表現型を生み出すことを実証している。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の表現型は、数多くのがん腫に存在する。ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団はすべて、３次元足場非依存性増殖の増加を示している。他の３つのヒト乳がん細胞株、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞から、ＦＡＣＳゲーティングカットオフ値１０％でＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団の組成物を作成した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団におけるＡＴＰの相対量は、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて別々に検証した。最初に２次元単層細胞をＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１で染色し、フローサイトメーターを用いてＡＴＰ含有量による選別を行った。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、これらの相対発光量を評価した。この一連の実験では、カットオフ値を１０％として、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞集団を画定した。この代謝分画方式は他の乳がん細胞株にもうまく適用できることに留意されたい。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ１０％細胞に対する平均増加倍率±ＳＤ、ｎ＝３を表す。対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。

図９Ａおよび９Ｂは、１０％ゲートを用いた、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏおよび３次元マンモスフェア形成を示す。図９Ａは、これらすべての細胞株のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団が、ルシフェラーゼを用いたＣｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイで確認したように、総ＡＴＰレベルが２～３倍増加し、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の表現型に特徴的なＡＴＰの増加を示したことを表している。図９Ｂからわかるように、３次元スフェロイドのアッセイでも同様の結果が得られ、調べた細胞株に応じてＣＳＣ活性および増殖が１．７５～３倍増加したことが示されている。最初に２次元単層の細胞をＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１で染色し、フローサイトメーターを用いてＡＴＰ含有量による選別を行った。細胞を計数した後、５×１０^３個の細胞をｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした６ウェルプレートに播種し、５日後に計数した。ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞集団はすべて、３次元足場非依存性増殖能の増強を示していることに留意されたい。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ１０％細胞に対する平均増加倍率±ＳＤ、ｎ＝３を表す。対応のないｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の細胞は、酸化的ミトコンドリア代謝、解糖速度、および細胞周期進行の増加を示す。図１０Ａは、２４時間後のＭＣＦ７細胞集団におけるＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団（１０％）の発光を示す。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸプレートリーダーを使用し、プレーティングの２４時間後に、発光によって相対的なＡＴＰ含有量を評価した。この実験では、多くの細胞が必要であったため、カットオフ値を１０％として、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞集団を画定した。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ１０％細胞に対する平均増加倍率±ＳＤ、ｎ＝３を表す。対応のないｔ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。観察されたＡＴＰレベルの増加は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞を２次元単層としてプレーティングした２４時間後には３分の１に低下し、エネルギーの高いＡＴＰ－ｈｉｇｈの表現型が比較的一過性であり、より幹様な表現型と一致することを示している。

図１０Ｂ～１０Ｅは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団の代謝フラックス解析の結果を示す。ＯＣＲ（酸素消費速度）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６を使用して、代謝フラックス解析で決定した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞集団は、基礎呼吸と最大呼吸に加え、ミトコンドリアＡＴＰ産生も増加を示していることに留意されたい。細胞集団はプレーティングの２４時間後に解析した。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ１０％細胞に対する増加倍率（％）±ＳＤ、ｎ＝３を表す。対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。ＥＣＡＲ（細胞外酸性化速度）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６を使用して、代謝フラックス解析で決定した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞集団は解糖が増加を示していることに留意されたい。細胞集団はプレーティングの２４時間後に解析した。データは、ＡＴＰ－ｌｏｗ１０％細胞に対する平均増加倍率（％）±ＳＤ、ｎ＝３を表す。対応のないｔ検定、ｎｓ＝有意差なし、＊＊＊ｐ＜０．０００５。図１０Ｂおよび１０Ｃのエネルギープロファイルは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団がＡＴＰ－ｌｏｗ集団に対して代謝的に活性であることを示している。細胞接着の２４時間後、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７単層細胞は、基礎呼吸が２倍、最大呼吸が１．５倍、ＡＴＰ産生が３倍の増加を示した。同様に、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７単層細胞も基礎解糖速度が１．５倍の増加を示した。図１０Ｄおよび１０Ｅの解糖速度は、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の生体エネルギーがＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団よりも有意に高いことを示している。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団の増殖能の評価から、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団は、さまざまながん種でＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団よりも増殖性が著しく高いことが明らかとなった。図１１Ａ～１１Ｄは、ヨウ化プロピジウムを用いた、ＤＮＡ含有量を検出するＦＡＣＳ解析による、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞周期進行を示す。見てわかるように、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団は、Ｇ０／Ｇ１期からＳ期およびＧ２／Ｍ期に移行し、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団よりも増殖性が著しく高かった。より具体的には、Ｇ０／Ｇ１期が約８０～８８％から６０～６４％に減少したのに対し、Ｓ期は４～８％から９～２１％に増加した。同様に、Ｇ２／Ｍ期が７～１２％から１７～３０％に増加した。４つの細胞株すべてで、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団に対して、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞亜集団において細胞周期進行のこうした明らかな促進が認められた。全体として、これは試験した４つの細胞株すべてで、Ｓ期の細胞数で１．９～３．６倍、Ｇ２／Ｍ期の細胞数で１．８～３．８倍の増加を示している。興味深いことに、Ｓ期における最大の増加がＭＣＦ７細胞で認められたのに対し、Ｇ２／Ｍ期における最大の増加はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で認められた。

一方、各細胞株のＡＴＰ－ｌｏｗ集団は基本的に静止状態にあり、細胞の８０～８８％が細胞周期のＧ０／Ｇ１期にあって、細胞周期停止の主要な表現型を示していた。すなわち、ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団は現在のがん細胞の休眠状態の定義によく合致している。

したがって、高いＡＴＰレベルは、「幹細胞性」形質、足場非依存性増殖、および細胞増殖の主要な決定因子である。このように、本明細書に記載する実用的な手法により、全細胞集団から生体エネルギー的に「最適」で最も増殖性の高いがん細胞をうまく単離し、特有の表現型特性を有する細胞の新たな組成を形成することができる。これらの特性は、薬剤耐性と密接な関係がある。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＣＦ７細胞は多剤耐性表現型を示す。３次元マンモスフェアアッセイを、薬剤耐性の機能的な読み出し情報として使用して、４種の薬剤クラスに対するＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗのＭＣＦ７細胞亜集団の感受性差を探索した。薬剤クラスは、タモキシフェン、ドキシサイクリン、ＤＰＩ、およびパルボシクリブを含む。図１２ＡはＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団（下位５％）の結果を示し、図１２ＢはＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団（上位５％）の結果を示す。図１２Ａおよび１２Ｂには、薬剤クラスごとに２種類の濃度を示す。

タモキシフェンは、ＥＲ（＋）乳がん細胞を臨床的に標的として日常的に使用されるＦＤＡ承認薬であり、タモキシフェン耐性や治療失敗に至った結果、腫瘍再発や遠隔転移が起こることも少なくない。興味深いことに、ＡＴＰ－ｌｏｗのＭＣＦ７細胞による３次元マンモスフェア形成は、タモキシフェン治療に対する感受性が非常に高く、１μＭで約４０％、５μＭで９０％超の減少が認められた。これに対し、図１２Ｂから、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞による３次元マンモスフェア形成は、５μＭでは溶媒で処理した対照の８０％超と高いままで、タモキシフェンに著しい耐性を示したことがわかる。したがって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞は明らかにタモキシフェン耐性である。

図１２Ｂから、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞はミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ阻害剤、すなわちジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）にも耐性を示したがことがわかる。例えばＡＴＰ－ｌｏｗ細胞のＤＰＩ治療では、３次元マンモスフェア形成が１００ｎＭで９０％超減少した。これに対し、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞のＤＰＩ治療（１００ｎＭ）では、３次元マンモスフェア形成の減少はわずか５５％程度だった。したがって、いずれの亜集団もミトコンドリア阻害剤に対して感受性はあるものの、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞では明らかに耐性が高かった。

ドキシサイクリンはミトコンドリアのリボソーム翻訳を阻害するＦＤＡ承認抗生物質である。図１２Ａと図１２Ｂを比較すると、ＡＴＰ－ｌｏｗのＭＣＦ７細胞で非常に有効であった濃度、すなわち２５μＭおよび５０μＭで、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団はドキシサイクリンに対して大幅な耐性を示したことがわかる。

ＦＤＡ承認ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブの有効性は、図１２Ａおよび１２Ｂからも明らかである。ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞のパルボシクリブ治療により、３次元マンモスフェア形成が１２．５ｎＭで約７５％減少した。しかしながら、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞のパルボシクリブ治療（１２．５ｎＭ）では、３次元スフェロイド形成の減少はわずか５０％程度だった。このように、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ細胞もＣＤＫ４／６阻害剤に対して耐性が高かった。したがって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、いくつかの薬剤種に対して耐性を示す表現型である。

幹細胞性の確立されたマーカーであるＣＤ４４およびＡＬＤＨ活性とＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１を比較した。ＡＴＰ－Ｒｅｄ１と他のＣＳＣマーカーの有効性を直接比較するために、ＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方に二重標識法を適用した。細胞は、検出用に異なる蛍光チャネルを用いてＣＤ４４とＡＴＰについて二重標識を行った。これにより、ＣＤ４４とＡＴＰについて４つの実験群、ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈ、ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗ、ＣＤ４４－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈ、およびＣＤ４４－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｌｏｗを得た。

細胞選別後、得られた４つの亜集団には、幹細胞性の機能的な読み出し情報として、３次元マンモスフェアアッセイを行った。ＡＴＰとＣＤ４４の細胞表面発現を比較した。細胞選別後、ＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ－２３１株の両方を使用し、幹細胞性の機能的な読み出し情報として、異なる細胞亜集団で３次元足場非依存性増殖を測定した。簡単に説明すると、最初に２次元単層をＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ（ＰＥチャネル）と抗ＣＤ４４（ＡＰＣチャネル）の両方で共染色し、ＳＯＮＹのＳＨ８００セルソーターを用いて、フローサイトメトリーを行った。細胞を計数した後、５×１０^３個の細胞をｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした６ウェルプレートに播種し、プレーティングの５日後に３次元マンモスフェアを計数した。図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、ＣＤ４４－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞は、これらの亜集団の表現型特性から予想されるとおり、足場非依存性増殖が最も少なかった。そのため、ＣＤ４４－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞を正常化のポイントとして選択した。ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈとＣＤ４４－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈの２つの細胞亜集団が、最大の足場非依存性増殖を示した。したがって高レベルのＡＴＰは、ＣＤ４４と比べると、ＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ－２３１の両方の細胞で幹細胞性の主要な決定因子となる。

ＣＤ４４－ｈｉｇｈ集団のみを検討することにし、ＣＤ４４－ｈｉｇｈ集団を、増殖能の高い亜集団（ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈ）と増殖能の低い亜集団（ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗ）の２つに分類できるようＡＴＰで二重標識した。これにより、ＣＤ４４－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗ集団は、明らかに足場非依存性増殖が有意に少ないことが示され、ＣＤ４４（＋）ＣＳＣの「休眠性」が高い亜集団となっている。

ＡＬＤＨ活性とＡＴＰを用いた二重標識でも、ほぼ同じ結果が得られた。細胞選別後、ＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ－２３１株の両方を使用し、幹細胞性の機能的な読み出し情報として、異なる細胞亜集団で３次元足場非依存性増殖を測定した。簡単に説明すると、最初に２次元単層をＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ（ＰＥチャネル）とＡＬＤＨ活性（ＡＰＣチャネル）の両方で共染色し、ＳＯＮＹのＳＨ８００セルソーターを用いて、フローサイトメトリーを行った。細胞を計数した後、５×１０^３個の細胞をｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした６ウェルプレートに播種し、プレーティングの５日後に３次元マンモスフェアを計数した。図１３Ｃおよび１３Ｄは、ＡＤＬＨ活性とＡＴＰで二重標識した、それぞれＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株のマンモスフェア形成アッセイの結果を示す。予想どおり、最大の足場非依存性増殖を示した２つの細胞集団はＡＬＤＨ－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈとＡＬＤＨ－ｌｏｗ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈであった。したがって高レベルのＡＴＰは、ＡＬＤＨと比べると、ＭＣＦ７とＭＤＡ－ＭＢ－２３１の両方の細胞で幹細胞性の主要な決定因子となる。同様に、ＡＴＰを用いて二重標識すると、ＡＬＤＨ－ｈｉｇｈ集団を、増殖能の高い亜集団（ＡＬＤＨ－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｈｉｇｈ）と増殖能の低い亜集団（ＡＬＤＨ－ｈｉｇｈ／ＡＴＰ－ｌｏｗ）の２つに分類できる。

上記は、本手法が、ＡＴＰを休眠状態に関する第２のマーカーとして用い、ＣＳＣを、活性の高い過剰増殖亜集団と休眠性の高い亜集団に亜分画するための強力かつ有効な手法であることを証明している。この結果は、ＡＴＰレベルがＣＳＣの休眠状態の機能制御因子であることも示している。

細胞の遊走、浸潤、および自然転移におけるミトコンドリアＡＴＰの役割も探索した。データは、ミトコンドリアＡＴＰが、がん細胞の転移過程に関わるエネルギーのバイオマーカーであることを証明している。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、細胞運動性と転移を研究するための確立されたモデルである。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団が細胞の遊走および浸潤を行う能力を、トランスウェルを用いた修正ボイデンチャンバーアッセイによって評価した。比較のためにバルク（５％）集団も選択した。浸潤を調べるために、トランスウェルは細胞外マトリクス、すなわちマトリゲルでコートし、単純な細胞遊走を防いだ。細胞の遊走および浸潤アッセイの両方に、化学誘引物質として血清を使用した。遊走および浸潤のパラメータは、クリスタルバイオレット染色強度と細胞数の両方を用いて、別々に定量化した。

図１４Ａおよび１４Ｂは、この遊走および浸潤解析の結果を示す。ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、細胞遊走を起こす能力が、ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞に対して２０～４０倍の増加を示した。予想どおり、バルク（５％）細胞は中間の表現型を示した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、浸潤を起こす能力が、ＡＴＰ－ｌｏｗ細胞集団に対して１５～２５倍の増加を示した。このため、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はｉｎ ｖｉｖｏでの前転移性細胞亜集団に相当する。

さらなる評価のために、鶏卵の漿尿膜（ＣＡＭ）を用いた、確立されたｉｎ ｖｉｖｏ転移アッセイを使用して、自然転移を定量的に測定した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団を細胞選別で単離した後、各卵（Ｅ９日目）のＣＡＭ上に３０，０００個の細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を接種し、次いで無作為にいくつかの群に分けた。Ｅ１８日目に、下部ＣＡＭを採取し、ヒトＡｌｕ配列の特異的プライマーを用いたｑＰＣＲで解析し、転移細胞数を評価した。特異性の陰性対照として、未注入の卵も並行して評価した。各実験条件について２０個超の卵を処理した。

図１５は、ｉｎ ｖｉｖｏのＣＡＭアッセイでの自然転移の結果を示す。データから、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団よりも転移性が４．５倍高かったことがわかる。これらの亜集団は同じ細胞株に由来していた。したがって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は前転移性ＣＳＣ亜集団に相当する。図４Ｃに関連して上記で説明したように、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、２つのＣＴＣおよび転移マーカー（ＶＣＡＭ－１とＥｐ－ＣＡＭ）も過剰発現しており、過剰増殖ＣＳＣが、遠隔転移の播種に関与するＣＴＣであることを示している。

したがって、本手法を用いて、がんが転移する可能性を検出することができる。例えば、がんの生体試料を代謝的に分画してＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の含有量を評価し得、その含有量を用いて、がんが転移する可能性を推定し得る。がん患者のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の細胞を早期に検出、解析することによって、転移のリスクを診断し、本明細書に記述するＡＴＰ枯渇療法剤などによる適切な治療を特定する極めて貴重な機会が得られる。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７細胞を精製するＴｅｍｐｏ－ＡＴＰタンパク質バイオセンサーは、がん細胞における幹細胞性の新たなバイオマーカーとしてのＡＴＰの使用を独立的に検証する。蛍光タンパク質バイオセンサーであるＴｅｍｐｏ－ＡＴＰは、生細胞中のＡＴＰレベルを検出するまったく異なるプローブであり、これを使用してＡＴＰのレベルの高低を検出した。

細胞質蛍光タンパク質ＡＴＰバイオセンサーを組換えにより過剰発現しているＴｅｍｐｏ－ＡＴＰ－ＭＣＦ７細胞は、細胞選択のためのピューロマイシン耐性マーカーを用いて、Ｔｅｍｐｏ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンフランシスコ）が特別に作製した。このタンパク質ベースの蛍光ＡＴＰバイオセンサーは、励起波長が５１７～５１９ｎｍ、発光が５３５ｎｍである。ＧＦＰ様蛍光レポータータンパク質とインフレームで融合したＡＴＰ結合ペプチドからなる。Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰ－ＭＣＦ７細胞は、フローサイトメーター（励起＝５１７～５１９ｎｍ；発光＝５３５ｎｍ）を用いて、細胞質のＡＴＰ含有量のサロゲートマーカーとしてＧＦＰ含有量によって分類した。細胞を計数した後、次いで同数の単一細胞を用いて、代謝および表現型の挙動を評価した。

結果を図１６Ａ～１６Ｃに示す。ＧＦＰ－ｌｏｗ亜集団に対するＧＦＰ－ｈｉｇｈ亜集団の発光の相対的増加を図１６Ａに示す。細胞周期進行のデータを図１６Ｂに、マンモスフェア形成アッセイの結果を図１６Ｃに示す。これまでの検討から予想されたとおり、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＴｅｍｐｏ－ＭＣＦ７細胞は、ＡＴＰが有意に増加し、還元型グルタチオン、ＮＡＤＰ／Ｈ、およびＮＡＤ／Ｈがより減少し、さらに細胞周期進行および３次元足場非依存性増殖が増加を示した。Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰのデータは、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１の結果、特に、高いＡＴＰレベルが、抗酸化能、細胞増殖、および３次元足場非依存性増殖の重要な決定因子であることを独立的に検証している。Ｔｅｍｐｏ－ＡＴＰも有効ではあったが、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は細胞の主要なＡＴＰ産生源であるミトコンドリア内に直接局在するため、有効性が有意に高かった。

本手法は、大量のＡＴＰ産生が、がん細胞における「幹細胞性」形質および増殖の主要なドライバーであることを実証している。本明細書に開示する観察は、がん細胞集団で観察される代謝不均一性の分子基盤、ならびに、ｉ）急速な細胞周期進行、およびｉｉ）足場非依存性増殖など、いずれもｉｎ ｖｉｖｏでのＣＳＣの転移性播種に必要とされる表現型の挙動との関係を説明することができよう。

実証したように、ＡＴＰは、がん細胞集団を代謝的に分画し、過剰増殖および休眠状態の亜集団を同定するバイオマーカーとして使用し得る。このことは、ＡＴＰ枯渇療法は、過剰増殖性亜集団の治療に有効であり得、かつ腫瘍の再発および転移の可能性を低下させ得る、または排除し得ることを示している。

本手法に基づいて、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１のような生細胞のＡＴＰレベルを測定できる重要な蛍光色素を、代謝分画のための撮像プローブとして使用し得る。より具体的には、ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ ＡＴＰ－Ｒｅｄ１染色を、全細胞集団をフローサイトメトリーにかける生体エネルギー分画法と組み合わせて、集団のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団を単離し得る。上記で検討した多くの例で、ＥＲ（＋）ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ７細胞を使用してきたが、当然のことながら、本手法は任意の細胞株および任意のがん種に使用し得る。代謝分画の手法により、全細胞集団の中で最も「エネルギーに満ちた」がん細胞を単離することが可能となる。有利には、得られたＡＴＰ－ｈｉｇｈのがん細胞亜集団を、ＡＴＰ枯渇療法による根絶のための標的とし、創薬および薬剤開発の基盤として役立て得る。表現型の特性を考えると、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団は、再発および転移の可能性を阻止する、または低下させる治療法の評価にも使用し得る。

並行する一連の研究で、本発明者らは、ＡＴＰ枯渇療法を効果的に実現するのに使用できそうなミトコンドリア標的の治療薬を２０種類以上確認した。これらの治療薬候補には以下がある：ＦＤＡ承認薬（ドキシサイクリン、チゲサイクリン、アジスロマイシン、パモ酸ピルビニウム、アトバコン、ベダキリン、ニクロサミド、イリノテカン）；天然物／機能性食品（アクチノニン、ＣＡＰＥ、ベルベリン、ブルチエリジン、メリチジン）；および実験化合物（オリゴマイシン、ＡＲ－Ｃ１５５８５８、ミトリボスシン（２０１８年３月１４日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２４０３号明細書（特許文献１）を参照。また、参照によりその全体が援用される）、ミトケトスシン（２０１８年６月２５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３９３５４号明細書（特許文献２）を参照。また、参照によりその全体が援用される）、ミトフラボスシン（２０１８年１０月２３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５７０９３号明細書（特許文献３）を参照。また、参照によりその全体が援用される）、ＴＰＰ誘導体（ドデシル－ＴＰＰおよび２－ブテン－１，４－ビス－ＴＰＰを含む。２０１８年１１月２１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６２１７４号明細書（特許文献４）を参照。また、参照によりその全体が援用される））。２種類の抗生物質とビタミンＣとの３種の組み合わせ（ドキシサイクリン、アジスロマイシン、およびアスコルビン酸）は、より低い抗菌レベルで、ミトコンドリアを標的とし、ＡＴＰ枯渇およびＣＳＣ増殖を誘発するのに特に強力であることがわかっている（２０１９年１２月１６日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６６５４１明細書（特許文献５）を参照。また、参照によりその全体が援用される）。ＡＴＰ枯渇化合物は、有効性、細胞膜透過、および／またはミトコンドリアの取り込みを増加させるために改変された既存の化合物であり得、これらについては、例えば２０１８年５月１８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３３４６６号明細書（特許文献６）（参照によりその全体が援用される）および２０１８年１１月２９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６２９５６号明細書（特許文献７）（参照によりその全体が援用される）に記載されている。例えば、ミリスチン酸塩などの脂肪酸と結合させたドキシサイクリンは、ＡＴＰ枯渇化合物として使用し得る。ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団が、当技術分野で通常処方される用量の化合物に耐性を示す場合など、状況によっては、化合物の用量を増やして投与することが適切となり得る。化合物は投与し得る。当然のことながら、前述の化合物のいずれかをＡＴＰ枯渇療法剤として使用し、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団を標的として、再発および転移の可能性を阻止し得る、または低下させ得る。当然のことながら、患者のがんの生体試料中のＡＢＣＡ２、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ、ＣＯＸ２０、ＮＤＵＦＡ２、およびＵＱＣＲＢの５つのメンバーの遺伝子シグネチャーの発現量が、患者の非がん性の生体試料中の発現量に対して上昇していることが認められた場合、前述の化合物のいずれかを、がん患者に投与する治療薬として使用し得る。

化合物の多くは、安全性プロファイルが優れたＦＤＡ承認の抗生物質を別の用途に用いたものであるため、第ＩＩ相臨床試験が必要となる。例えば、ドキシサイクリンの第ＩＩ相臨床予備試験では、ＣＤ４４およびＡＬＤＨ１を特異的ＣＳＣマーカーとして使用して実証されたように、５０年以上使用されているこの抗生物質が、初期乳がん患者のＣＳＣ集団を代謝的に標的とするのに実際に有効であることがすでに示されている。ミトコンドリアＡＴＰ枯渇療法は、断食および／またはカロリー制限を機能的に模倣することによって、より効果的にＣＳＣを餓死させることが期待されている。本手法では、ＡＴＰ枯渇療法の効果を高めるために、抗がん治療の一環として断食および／またはカロリー制限を実施し得る。例えば、ＡＴＰ枯渇療法を受ける患者は、治療用化合物の投与を受ける前に、１２、１６、２４、３６、または４８時間などの時間にわたって絶食し得、および／または、治療用化合物の投与を受けた後に、１２、１６、２４、３６、または４８時間などの時間にわたって絶食し得る。いくつかの実施形態では、絶食は、ＡＴＰ枯渇効果を高めるために、治療用化合物の投与の前後に行い得る。これは、がんの予防、および老化する中でヒトの寿命を延ばす可能性にとって重要な意味を持つ。

ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の細胞は、抗酸化能が増強された多剤耐性の表現型を示す。これまでの研究で、高い抗酸化能が、還元型グルタチオンレベルの上昇、ＮＡＤＰＨの上昇、およびＮＲＦ２シグナルの活性化により、多剤耐性の発現に大きく寄与することが示されている。ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＣＦ７細胞は、還元型グルタチオンレベルが上昇した高い抗酸化能を有し、４種類の薬剤（タモキシフェン、パルボシクリブ、ドキシサイクリン、およびＤＰＩ）に対して本質的に耐性を示す。したがって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈというＣＳＣの表現型の存在は、がん治療中の多剤耐性の原因を機構的に説明するのに役立ち得る。この関連で、現在のがん療法では、代謝的に「最適」ながん細胞のみが生き残る可能性がある。そうすると、これらの細胞は再発や転移の最大のリスクとなる。

上記に開示したデータは、ミトコンドリアの「力」とタモキシフェン耐性の直接的な因果関係も示している。例えば、タモキシフェンの濃度を高めながら長期的に曝露することで生成され、タモキシフェン耐性を獲得したＭＣＦ７－ＴＡＭＲ細胞は、ミトコンドリアのＯＸＰＨＯＳおよびＡＴＰ産生のレベルの上昇を示した。ＭＣＦ７－ＴＡＭＲ細胞では、タモキシフェン耐性の獲得は、２つの主要な抗酸化タンパク質（ＮＱＯ１とＧＣＬＣ）の過剰発現およびミトコンドリア代謝に対するそれらの好ましい代謝効果によるものであったことが、偏りのないプロテオーム解析から明らかとなった。また、ＭＣＦ７細胞でＮＱＯ１またはＧＣＬＣを組換え過剰発現させると、ミトコンドリアＡＴＰ産生およびタモキシフェン耐性が自律的に約２倍増加した。さらに、乳がん患者の獲得タモキシフェン耐性と臨床上関連するエストロゲン受容体（ＥＲα；ＥＳＲ１）における体細胞変異（Ｙ５３７Ｓ）の組換え過剰発現によって、ミトコンドリア生合成の増加、ＯＸＰＨＯＳ、および高いＡＴＰ産生が遺伝的にもたらされた。ＭＣＦ７－ＴＡＭＲ細胞とＭＣＦ７－ＥＳＲ１（Ｙ５３７Ｓ）細胞のプロテオームプロファイルから、機能的に活性化された生物学的過程においてかなりの重複があることも示された。また、ミトコンドリアＡＴＰ産生と機能的に関連した６０個の遺伝子産物は、ＥＲ（＋）／ルミナールＡ型乳がん患者においてタモキシフェン耐性を予測するものであった。これらの予測的バイオマーカーには、１８種のミトコンドリアリボソームタンパク質（ＭＲＰ）と、２０種を超えるミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ複合体の構成要素があった。本明細書に開示するデータは、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団の「未感作」ＭＣＦ７細胞は、事前にタモキシフェンに曝露されていなくても、タモキシフェンに対して本質的に耐性があることを示している。このことは、乳がんのホルモン療法の有効性を最適化する上で、臨床的に重要な意味を持つ。

従来の化学療法レジメンによる治療は、「バルク」がん細胞を選択的に死滅させる一方で、実際にはＣＳＣの数を増加させることがこれまでに報告されている。本開示以前に、この現象を説明する代謝仮説は提示されていない。Ｃｈａｎら（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）は、がん細胞集団全体に対するゲムシタビンとエトポシドの効果を調べた。驚くことに、ゲムシタビンとエトポシドによる治療後、生き残った細胞の集団で、ミトコンドリア呼吸が増加し、ＡＴＰ含有量とミトコンドリア質量が増加を示したことを観察していた。しかしながら、彼らはこれらの観察結果について機構的な説明は行わず、ＣＳＣ集団についても考慮しなかった。代わりに、ＡＴＰを測定しても化学療法剤の有効性を評価するのに役立つ情報は得られないと結論づけるにとどまった。本明細書に開示するデータを考慮すると、彼らの結果は、ゲムシタビンとエトポシドががん細胞のＡＴＰ－ｌｏｗおよびバルク亜集団を選択的に死滅させ、そのため、より幹様で薬剤耐性のある「エネルギーに満ちた」ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団が増加したという別の解釈ができる。したがって、がん細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団を根絶するのに役立つ新たな創薬を開始する必要がある。

長期にわたって治療したさまざまな大腸がんおよび卵巣がんの細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、Ａ２７８０）では、細胞内のＡＴＰレベルが高いことが、オキサリプラチンとシスプラチンに対する薬剤耐性獲得の主な原因であることが示唆されたが、解糖および／またはミトコンドリア代謝の増加など、多様な機序が提案されている。しかしながら、これまでの研究では、薬剤耐性細胞集団を長期にわたって選択した後にしかＡＴＰレベルを測定していなかった。そのため、ＡＴＰ産生と薬剤耐性の直接的な因果関係を確立することはできなかった。

以前、本発明者らは、「エネルギーに満ちた」がん幹細胞（ｅ－ＣＳＣＳ）を単離するために、自己蛍光を用いて細胞内のＦＡＤ、ＦＭＮ、およびリボフラビン含有量を検出するという、より間接的な方法を用いた。２０１９年６月１９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３７８６０号明細書（特許文献８）を参照のこと。また、同出願は参照によりその全体が援用される。しかしながら、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１の使用は直接的な方法で、大幅に改善している。例えば、高自己蛍光（ＡＦ；上位５％）を用いてＭＣＦ７の２次元単層を分画すると、足場非依存性増殖が１．５倍増加し、ＡＴＰ産生がほぼ２倍増加した、細胞のＡＦ－ｈｉｇｈ集団が得られた。これに対し本手法では、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１（上位５％）を使用することで、足場非依存性増殖が９倍増加し、ＡＴＰ含有量が１５倍超増加したＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＣＦ７単層細胞の亜集団が得られた。他のがん細胞株（Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８）のＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団も、同様に過剰増殖の特性を示した。したがって、直接的なエネルギーバイオマーカーとしてＡＴＰを使用することは、自己蛍光よりもはるかに優れている。さらに、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１は、試験した他の３つの乳がん細胞株を代謝的に分画する上でも有効であった。

腫瘍の休眠に対する従来の考え方によれば、休眠状態のがん細胞は、細胞増殖の速度が遅くなる、および／または細胞周期が停止する（静止）ことで、治療による細胞死を回避し、多剤耐性に至る。本明細書で開示するデータは、まさにその逆を示している。読み出し情報として３次元マンモスフェアアッセイを用いたところ、ＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団のＭＣＦ７細胞は、細胞の８７％超が細胞周期のＧ０／Ｇ１期にあり増殖性が低かったが、４種類の薬剤に対する感受性が高かった。逆に、ＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＭＣＦ７細胞は、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期にある細胞が３８％超と、増殖性が有意に高く、明らかな多剤耐性表現型を示した。したがって高レベルのミトコンドリアＡＴＰは、がん細胞のエネルギー的に「最適」な集団であり、細胞増殖と薬剤耐性の両方の重要なドライバーといえる。

本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植動物モデルを使用し、一連の異なる抗ミトコンドリア療法を用いた治療が、ｉ）代謝的にＡＴＰ枯渇を誘発し、ｉｉ）がん細胞の転移を強力に阻害するのに十分であることを示している。これらの結果は、ＣＳＣの転移過程に高いＡＴＰレベルが重要であることを示しており、また、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＣＳＣが過剰増殖、幹様、足場非依存性であり、抗酸化能と内因性の多剤耐性が増大していることを示す、本明細書に開示したデータと一致する。したがって、本手法を用いて単離し得るＡＴＰ－ｈｉｇｈのＣＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の再発および転移に関与しているとみられる。

上述のバイオインフォマティクス解析により、ＡＴＰ関連遺伝子が、幹細胞性、増殖、および転移と密接に関連しており、特にＡＴＰ５Ｆ１ＣはミトコンドリアＡＴＰ合成酵素の触媒コアのγサブユニットをコードすることが示されている。さらに、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃは、タモキシフェン治療を受けているＥＲ（＋）患者の腫瘍再発および遠隔転移の予後バイオマーカーであり、また治療失敗のマーカーでもある。また、ＡＴＰ－ｈｉｇｈのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞遊走と細胞浸潤の両方、またｉｎ ｖｉｖｏでは自然転移を起こす能力の劇的な向上を示した。このように、ミトコンドリアＡＴＰは転移性播種において重要な役割を果たす。したがって、ミトコンドリアＡＴＰ合成阻害剤は、転移を予防する、つまりＡＴＰ－ｈｉｇｈ亜集団のＣＳＣを根絶する治療薬候補として有効であろう。

本手法の医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体中の（上記で確認した）ＡＴＰ枯渇化合物を含む。溶液が所望される場合、水溶性化合物または塩のために選択される担体は水であり得る。水溶性に関しては、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、またはこれらの混合物などの有機ビヒクルが好適である可能性がある。さらに、本方法から逸脱することなく、水溶性を向上させる方法を使用し得る。後者の例では、有機ビヒクルは相当量の水を含むことができる。いずれの例でも溶液は、当業者に知られている適切な方法で、例示として０．２２ミクロンのフィルターでろ過することによって滅菌できる。滅菌後、溶液は脱パイロジェン化ガラスバイアルなどの適切な容器に分注することができる。分注は、任意で無菌法で行う。次いで、滅菌したクロージャーをバイアルに装着し、所望により、バイアルの内容物を凍結乾燥させることができる。解糖阻害剤またはＯＸＰＨＯＳ阻害剤などの第２の阻害剤化合物を含む実施形態は、当技術分野で利用可能な第２の阻害剤の形態を同時投与し得る。本手法は、別段の記載がない限り、特定の投与形態に限定されることを意図していない。

ＡＴＰ枯渇化合物に加えて、本手法の医薬製剤は、当技術分野で知られる他の添加剤を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、酸（例えば塩酸）などのｐＨ調整剤、および基剤または緩衝液（例えば酢酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム）を含み得る。いくつかの実施形態では、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールなどの抗菌防腐剤を含み得る。抗菌防腐剤は、多回投与用に設計されたバイアルに製剤を入れる場合に含まれることが多い。本明細書に記載の医薬製剤は、当技術分野でよく知られた技術を用いて凍結乾燥できる。

ＡＴＰ枯渇化合物の経口投与を含む実施形態では、医薬組成物は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、溶液、懸濁液などの形態で摂取できる。クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびリン酸カルシウムなどさまざまな賦形剤を含む錠剤は、デンプン（例えばジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン）などさまざまな錠剤分解物質および特定の複合ケイ酸を、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、およびアカシアなどの結合剤と一緒に使用し得る。さらに、錠剤化のために、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの滑沢剤を含有させ得る。同様の種類の固形組成物を、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用し得る。この関連の材料には、ラクトース（乳糖）および高分子量ポリエチレングリコールがある。経口投与のために水性懸濁液および／またはエリキシルが所望される場合、本開示主題の化合物は、さまざまな甘味料、香料、着色料、乳化剤、および／または懸濁剤の他、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、およびこれらのさまざまな組み合わせなどの希釈剤と組み合わせることができる。カルボシアニン化合物と第２の阻害剤化合物とを有する実施形態において、第２の阻害剤化合物は、カルボシアニン化合物の形態に限定されることなく、別の形態でも投与し得る。

本明細書で提供する追加的な実施形態は、本明細書に開示するＡＴＰ枯渇化合物のリポソーム製剤を含む。リポソーム懸濁液を作製する技術は、当技術分野でよく知られている。化合物が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、同じものを脂質小胞に組み込むことができる。そのような場合、活性化合物は水溶性であるため、リポソームの親水性中心またはコア内に実質的に入れ込むことができる。使用する脂質層は、任意の従来組成物である可能性があり、コレステロールを含んでも含まなくてもよい。目的の活性化合物が水不溶性である場合、やはり従来のリポソーム形成技術を用いて、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に塩を実質的に入れ込むことができる。いずれの例でも、標準的な超音波処理および均質化技術を用いるように、作製するリポソームの大きさを小さくできる。本明細書に開示する活性化合物を含むリポソーム製剤は、凍結乾燥して凍結乾燥物を作製することができ、これを水などの薬学的に許容される担体で再構成してリポソーム懸濁液を再生できる。

医薬組成物に関して、本明細書のＡＴＰ枯渇化合物の薬学的に有効な量は、医療従事者が決定するものとし、患者の状態、体格、および年齢、ならびに送達経路によって異なる。非限定的な一実施形態では、約０．１～約２００ｍｇ／ｋｇの投与量が治療効果を有し、重量比は、塩を使用する場合を含め、被験者の体重に対するＡＴＰ枯渇化合物の重量である。いくつかの実施形態では、投与量は、約１から５、１０、２０、３０、または４０μＭの間までの活性化合物の血清濃度を得るために必要な化合物の量とすることができる。いくつかの実施形態では、経口投与のために約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、およびいくつかの実施形態では約１０～約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を採用することができる。筋肉内投与には、通常、約０．５～５ｍｇ／ｋｇの投与量を採用することができる。いくつかの実施形態では、静脈内または経口投与のために、投与量を約１～約５０μｍｏｌ／ｋｇ、または、任意で約２２～約３３μｍｏｌ／ｋｇの化合物とすることができる。経口投与形態は、例えば錠剤または他の固体投与形態あたり５ｍｇから、５０、１００、２００、または５００ｍｇを含む、任意の適切な量の活性物質を含むことができる。

以下の段落では、本明細書に記載するデータおよび実施形態に関連して使用される材料および方法について説明する。当然のことながら、当業者は、本手法から逸脱することなく、当技術分野において一般に受け入れられている代替の材料および方法を使用し得る。

細胞株および試薬：ＥＲ（＋）［ＭＣＦ７とＴ４７Ｄ］およびトリプルネガティブ［ＭＤＡ－ＭＢ－２３１とＭＤＡ－ＭＢ－４６８］ヒト乳がん細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＡＴＰ－Ｒｅｄ１（ＢｉｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）ＡＴＰ－Ｒｅｄ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｄｙｅ；＃ＳＣＴ０４５としても知られる）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．から購入した。

図１Ａのヒートマップは、以前にＮＣＢＩデータベースに登録したＧＳＥ３６９５３ ＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔを用いて作製した。総ＲＮＡは、２次元接着培養、３次元足場非依存性増殖、およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖の３種類の増殖条件下で、ＴＮＢＣ細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から調製した。解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０Ａｒｒａｙで実施した。ヒートマップは、ＱＩＡＧＥＮ ＯｍｉｃＳｏｆｔ Ｓｕｉｔｅソフトウェアで作成した。ＡＴＰ関連遺伝子は、両方の３次元培養条件（足場非依存性腫瘍とｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍）下で、すべて２次元接着培養に対して転写的に上方制御されていた。

ＡＴＰ－Ｒｅｄ１での生体染色後のフローサイトメトリー：ヒト乳がん細胞株は、最初に２次元単層または３次元スフェロイドとして増殖させた。次いで細胞を回収し、解離して単一細胞懸濁液にしてから、ＳＯＮＹのＳＨ８００セルソーターを用いたフローサイトメトリーで解析または選別した。簡単に説明すると、細胞のＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ亜集団は、プローブのＡＴＰ－Ｒｅｄ１で生体染色した後に単離した。ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団は、ＡＴＰ－Ｒｅｄ１シグナル内でゲーティングによって選択した。別段の記載がない限り、蛍光シグナルが最も弱い（下位５％または１０％）細胞、または蛍光シグナルが最も強い（上位５％または１０％）細胞を、それぞれＡＴＰ－ｌｏｗおよびＡＴＰ－ｈｉｇｈとして回収した。ゲート外の細胞は、ゲート設定により選別時に破棄した。しかしながら、このような設定は、選別時に高純度を確保するために必要な場合が多い。データはＦｌｏｗＪｏ１０．１ソフトウェアで解析した。

Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いたＡＴＰアッセイ：Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（＃Ｇ７５７０）はＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．から入手し、製造指示に従って使用して、溶解細胞のＡＴＰレベルを測定した。Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏはルシフェラーゼベースのアッセイ系である。

３次元足場非依存性増殖アッセイ：単一細胞懸濁液は、酵素分離（トリプシンＥＤＴＡ×１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ３９２４）および手作業での分離（２５ゲージ針）によって調製した。５０００個の細胞を、マンモスフェア培地（ＤＭＥＭ－Ｆ１２／Ｂ２７／２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ）、非接着条件下で、２－メタクリル酸ヒドロキシエチル（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ３９３２）でコートした６ウェルプレートに播種した。細胞は、３７℃、大気圧、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素／空気の加湿インキュベーターで５日間増殖させて維持した。５日後、目盛付接眼レンズを装着した顕微鏡を用いて、直径が５０μｍより大きな３次元スフェロイドを計数し、スフェロイドを形成した細胞の割合を算出し、１に正規化した（１＝１００％ＭＦＥ；マンモスフィア形成効率）。マンモスフィアアッセイは３連で実施し、独立して３回くり返した。

代謝フラックス解析：細胞外酸性化速度と酸素消費速度は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６アナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて解析した。細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭで維持した。１ウェルあたり乳がん細胞２０，０００個をＸＦｅ９６ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ_２加湿雰囲気中３７℃で少なくとも１２時間インキュベートし、細胞を接着させた。約２４時間後、ＭＣＦ７細胞は、予め温めたＸＦアッセイ培地で、またはＯＣＲ測定用に１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加し、ｐＨ７．４に調整したＸＦアッセイ培地で洗浄した。次いで細胞は、１７５μＬ／ウェルのＸＦアッセイ培地で、３７℃の非ＣＯ_２インキュベーターで１時間維持した。インキュベート中に、２５μＬの８０ｍＭグルコース、９μＭオリゴマイシン、および１Ｍ ２－デオキシグルコース（ＥＣＡＲ測定用）、または１０μＭオリゴマイシン、９μＭ ＦＣＣＰ、１０μＭロテノン、１０μＭアンチマイシンＡ（ＯＣＲ測定用）を、ＸＦアッセイ培地で、ＸＦｅ９６センサーカートリッジの注入口に投入した。測定値は、タンパク質含有量（ＳＲＢアッセイ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２含有量で正規化した。データセットは、ＸＦｅ９６ソフトウェアおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、一元配置分散分析とスチューデントのｔ検定により解析した。実験はすべて、５連で実施し、独立して３回くり返した。

ＦＡＣＳによる細胞周期解析：Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いたＦＡＣＳ解析によって、ＡＴＰ－ｈｉｇｈおよびＡＴＰ－ｌｏｗ細胞亜集団で細胞周期解析を実施した。簡単に説明すると、トリプシン処理後、再懸濁させた細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＨｏｅｓｃｈｔ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃の暗条件下で４０分間インキュベートした。４０分後、細胞を洗浄し、獲得のためにＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ）で、またはＦＡＣＳのために選別緩衝液［３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ×１］で再懸濁した。条件ごとに５０，０００イベントを解析した。ゲーティングされた細胞は、手作業で細胞周期ステージに分類した。

統計的有意性：解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いて実施した。データは平均値±ＳＤ（または、指示がある場合は±ＳＥＭ）で表した。実験はすべて、少なくとも独立して３回行い、試験した各実験条件について４つ以上の技術的複製を用いた（代表的なデータが示されている場合など、特に明記しない限り）。統計的有意差は、スチューデントのｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を用いて決定した。複数群間の比較では、一元配置分散分析を用いて統計的有意差を求めた。ｐ＜０．０５を有意とみなし、すべての統計的検定は両側で行った：ｐ＊＜０．０５；ｐ＊＊＜０．０１；ｐ＊＊＊＜０．００５；ｐ＊＊＊＊＜０．０００１。

バイオインフォマティクス解析：ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ乳がん細胞株を用いて、２次元単層と３次元マンモスフェアを比較する偏りのない非標識プロテオミクスを前述のように実施した。情報解析は、ＮＣＢＩデータベースに登録されている、３次元増殖、転移、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に関連する、さまざま公開なＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（ＧＳＥ３６９５３；ＧＳＥ２０３４；ＧＳＥ５９０００；ＧＳＥ５５４７０）を用いて実施した。遺伝子発現プロファイリングデータは、これらのＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓから抽出した。ヒートマップはＱＩＡＧＥＮ ＯｍｉｃＳｏｆｔ Ｓｕｉｔｅソフトウェアで作成した。ボルケーノプロットは、ＯｎｃｏＬａｎｄのＭｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ ＯｍｉｃＳｏｆｔ Ｓｕｉｔｅ）で提供されているアノテーションを調べて作成した。さらに、アノテーションされた遺伝子で、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＩＰＡ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて機能「コア解析」を実施した。遺伝子の共発現プロファイルは、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）を用いて、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ、２０２０）から抽出し、ｍＲＮＡ発現プロファイリング（ＲＮＡ Ｓｅｑ Ｖ２ ＲＳＥＭ）は、患者１４６人の転移性乳がん試料のＲＮＡ配列決定によって行った。

カプラン・マイヤー（ＫＭ）解析：ＡＴＰ５Ｆ１ＣのＫＭ解析を実施するために、オープンアクセスのオンライン生存解析ツールを用いて、乳がん患者最大３，９５１人の公開マイクロアレイデータを照会した。この目的では、主にＥＲ（＋）患者のデータを解析した。偏ったアレイデータは解析から除外した。これにより、ＡＴＰ５Ｆ１Ｃ（ＡＴＰ５Ｃ１としても知られる）を有意な予後マーカーとして同定できた。自動選択された最適なカットオフ値でハザード比を計算し、ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定でｐ値を計算し、Ｒでプロットした。ＫＭ曲線は、単変量解析を用いて、ＫＭプロッター（高解像度ＴＩＦＦファイル）を使用してオンラインで作成した：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ。

本手法により、腫瘍再発（ＲＦＳ、無再発生存期間）および遠隔転移（ＤＭＦＳ、無遠隔転移生存期間）のマーカーとしてＡＴＰ５Ｆ１Ｃのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ検証を直接実施できた。これらの解析にはすべて、データベースの２０２０年最新版を利用した。

細胞遊走アッセイ：簡単に説明すると、０．１％ＢＳＡを含む０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中の２．５×１０^４個の細胞を、孔径８μｍの、コートしていない膜改変ボイデンチャンバー（トランスウェル）のウェルに添加した。下部のチャンバーには、化学誘引物質としてＤＭＥＭ中の１０％ウシ胎児血清を入れた。細胞は３７℃でインキュベートし、６時間にわたって遊走させた。非侵襲性細胞は綿棒でこすって膜の上面から除去した。チャンバーは１００％メタノールで希釈した０．５％クリスタルバイオレットで３０～６０分間染色し、水ですすいだ後、明視野顕微鏡で観察した。浸潤および遊走の値は、膜ごとに５つのフィールドを計数して得た（２０倍対物レンズ）、３つの独立した実験の平均である。細胞外マトリクス（すなわちマトリゲル）でプレコートしたトランスウェルを用いて、攻撃的な細胞浸潤を測定し、単純な細胞遊走を防いだことに留意されたい。

転移アッセイ：ニワトリ胚転移アッセイをＩＮＯＶＯＴＩＯＮ（Ｓｏｃｉｅｔｅ：８１１３１０１２７、フランス、ラ・トロンシュ）で実施した。フランスの法律では、卵生胚を用いた科学実験に倫理審査による承認は必要ない（命令Ｎｏ．２０１３－１１８、２０１３年２月１日；第Ｒ－２１４－８８条）。動物実験は、ＩＮＯＶＯＴＩＯＮに対する動物実験許可Ｎｏ．３８１０２９およびＢ３８５１６１０００１に基づいて実施した。白色レグホンの受精卵を３７．５℃、相対湿度５０％で９日間インキュベートした。各実験条件について２０個超の卵を処理した。その時点（Ｅ９）で、卵殻から気嚢に小さな穴を開けることで漿尿膜（ＣＡＭ）を下げ、ＣＡＭ上方の卵殻に１ｃｍ^２の窓を開けた。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞株は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。Ｅ９日目に、細胞をトリプシンで剥離し、完全培地で洗浄し、移植用培地に懸濁させた。フローサイトメトリーによるＡＴＰベースの細胞選別後、各卵のＣＡＭ上に３０，０００個の細胞を接種し（Ｅ９日目）、次いで卵を無作為にいくつかの群に分けた。Ｅ１８日目に、下部ＣＡＭの１ｃｍ^２を採取し、各群８つの試料で転移細胞の数を評価した（ｎ＝１０）。ゲノムＤＮＡをＣＡＭから抽出し（市販キット）、ヒトＡｌｕ配列の特異的プライマーを用いてｑＰＣＲで解析した。各試料のＣｑ、平均Ｃｑ、および各群の転移の相対量の算出は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアで直接管理される。特異性の陰性対照として、未注入の卵も並行して評価した。すべてのデータについて、事後検定を伴う一元配置分散分析を実施した。

本手法の実施形態の説明で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。説明および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を意味しない限り、複数形も含むことが意図されている。本手法は、以下の詳細な説明を考慮すれば明らかとなるように、多数の代替案、修正案、および等価物を包含する。

当然のことながら、本明細書では、「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語を用いて本手法のさまざまな要素を説明し得るが、特許請求の範囲はこれらの用語によって制限されるべきではない。これらの用語は、本手法の１つの要素を別の要素と区別するためにのみ使用される。したがって、本手法の教示から逸脱することなく、後述する第１の要素は、要素の一態様と称することも、同様に、第３の要素と称することもできよう。したがって、「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語は、関連する要素に必ずしも順序などの階層を与えることを意図しておらず、識別の目的のみに使用される。作業（またはステップ）の順序は、特許請求の範囲に示される順番に限定されるものではない。

特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。さらに当然のことながら、一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本願および関連技術の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義しない限り、理想化された、または過度に形式的な意味で解釈されるべきでない。本明細書に記載したすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。用語に矛盾がある場合、本明細書が優先する。

また、本明細書で使用する「および／または」は、関連する列挙された項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組み合わせ、ならびに選択的に解釈される場合の組み合わせの欠如（「または」）を指し、これらを包含する。

文脈上他を意味しない限り、本明細書に記載する本手法のさまざまな特徴は、任意の組み合わせで使用できることが特に意図される。さらに本手法は、いくつかの実施形態において、実証的な実施形態に関して説明する任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることも企図する。

本明細書で使用する移行句「から基本的になる」（およびその文法的な変形）は、引用された材料またはステップ「および請求項の基本的かつ新規な１つまたは複数の特性に実質的に影響しないもの」を包含すると解釈されるものとする。したがって、本明細書で使用する用語「から基本的になる」は、「を含む」と等価であると解釈すべきでない。

本明細書において、例えば量または濃度など測定可能な値に言及する際に使用する用語「約」は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、さらには±０．１％の変動値を包含することを意味する。本明細書において測定可能な値について提示する範囲は、その中の任意の他の範囲および／または個々の値を含み得る。

このように、本手法の特定の実施形態を説明してきたが、添付の特許請求の範囲は、以下にクレームするその精神または範囲から逸脱することなく、その多くの明白な変形が可能であることから、上記の説明で示した特定の詳細に限定されないことが理解されよう。

Claims (14)

1. ヒトがん細胞集団からのがん幹細胞の亜集団からなる過剰増殖性がん幹細胞の精製組成物であって、前記がん細胞集団は蛍光アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）撮像プローブに反応して一定範囲の蛍光シグナルを発現し、前記がん幹細胞の亜集団は前記一定範囲のＡＴＰベースの蛍光シグナルの上部を発現し、かつ前記ヒトがん細胞集団から分離されている組成物。
2. 前記上部は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記上部は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位５％を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記組成物は、ＣＤ４４マーカーおよびＡＬＤＨマーカーのうち１つに対して陽性である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記細胞の亜集団はＡＴＰ－Ｒｅｄ１で染色される、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物は凍結している、請求項１に記載の組成物。
7. 蛍光アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）撮像プローブで染色されたがん幹細胞亜集団を含み、がん細胞集団のＡＴＰベースの蛍光シグナル範囲の目標部分を発現する精製細胞組成物であって、前記亜集団は前記がん細胞集団から分離されており、前記がん細胞集団は一定範囲のＡＴＰベースの蛍光シグナルを発現し、前記ＡＴＰベースの蛍光シグナル範囲の目標部分は、前記ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上部および前記ＡＴＰベースの蛍光シグナルの下部のうち１つを含み、前記目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位２５％である組成物。
8. 前記目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％およびＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位５％のうち１つを含む、請求項７に記載の組成物。
9. 前記目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位１０％およびＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位５％のうち１つを含む、請求項７に記載の組成物。
10. 前記組成物は、ＣＤ４４マーカーおよびＡＬＤＨマーカーのうち１つに対して陽性である、請求項８に記載の組成物。
11. 前記細胞の亜集団は蛍光ＡＴＰ撮像用色素で染色される、請求項１に記載の組成物。
12. 前記目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位５％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位１０％、およびＡＴＰベースの蛍光シグナルの下位５％のうち１つを含む、請求項７に記載の組成物。
13. 前記目標部分は、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位１０％、ＡＴＰベースの蛍光シグナルの上位５％のうち１つを含み、かつ前記分離した細胞は、ＣＤ４４マーカーおよびＡＬＤＨマーカーのうち１つに対して陽性である、請求項７に記載の組成物。
14. 前記蛍光ＡＴＰ撮像プローブはＡＴＰ－Ｒｅｄ１を含む、請求項１または７に記載の組成物。