JP7717767B2 - 細胞傷害性ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｔｌａ－４）に対する新規モノクローナル抗体 - Google Patents

細胞傷害性ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｔｌａ－４）に対する新規モノクローナル抗体

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Description

技術分野
本発明は、概して、CTLA-4に対する抗体およびその組成物、ならびにがん、感染、または他のヒト疾患の抗CTLA-4抗体を用いる処置における免疫療法に、関連する。
発明の背景
がん免疫療法は、がんを処置することについての最新の研究分野となっている。細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）は、免疫チェックポイントの、立証された標的の1つである。T細胞の活性化の後、CTLA-4はそれらT細胞上に迅速に発現し、これは通常、抗原がTCRと結合してから1時間以内である。CTLA-4は、CD28との競合を介して、T細胞のシグナリングを抑制することができる。CD28は、良く特徴付けされたT細胞共刺激シグナルの1つを媒介する：CD28の、抗原提示細胞上のそのリガンドであるCD80（B7-1）およびCD86（B7-2）への結合は、インターロイキン-2および抗アポトーシス因子の産生を誘導することによって、T細胞の増殖をもたらす。CTLA-4の、CD80およびCD86への結合の親和性は、CD28のそれよりもはるかに高いため、CTLA-4は、CD28のCD80およびCD86への結合に打ち勝つことができ、T細胞活性化の抑制をもたらす。活性化T細胞上での誘導された発現に加えて、CTLA-4は、制御性T細胞（Treg）の表面上で構成的に発現されており、これは、接触を介する抑制にCTLA-4が必要である可能性、ならびにトランスフォーミング増殖因子ベータおよびインターロイキン-10などの免疫抑制性サイトカインのTregによる産生にCTLA-4が関連している可能性を示唆する。
CTLA-4の阻害は腫瘍の退縮を誘導することができ、これは多数の前臨床および臨床研究において証明されている。CTLA-4に対する2つの抗体が臨床開発中である。IgG1カッパアイソタイプの完全ヒト抗CTLA-4モノクローナル抗体であるイピリムマブ（MDX-010、BMS-734016）は、進行期黒色腫の処置のための単剤療法として承認されている免疫調節薬である。イピリムマブの提案されている作用機序は、活性化T細胞のサブセット上に発現しているCTLA-4と、プロフェッショナル抗原提示細胞上のCD80／CD86分子との相互作用の、妨害である。これは、CTLA-4とCD80／CD86との相互作用によって促進される、T細胞の活性化の抑制性調節の阻害によって、T細胞の増強をもたらす。結果として生じるT細胞の活性化、増殖、および腫瘍へのリンパ球の浸潤は、腫瘍細胞死をもたらす。市販の剤形は、注入用溶液のための5 mg/mL濃縮液である。イピリムマブはまた、前立腺がんおよび肺がんを含む他の腫瘍タイプについて臨床研究中である。別の抗CTLA-4抗体であるトレメリムマブは、黒色腫および悪性中皮腫において単剤療法として評価された。
発明の開示
本発明は、単離された抗体、特にモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を提供する。
1つの局面において、本発明は抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該抗体または抗原結合断片は、ヒト、サル、およびマウスのCTLA-4に結合する。
前述の抗体または抗原結合断片は、CTLA-4のCD80またはCD86への結合を抑制する。
前述の抗体または抗原結合断片において、該抗体または抗原結合断片の結合エピトープは、CTLA-4のN145またはN145にある多糖を含む。
1つの局面において、本発明は抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該抗体または抗原結合断片は、ヒトCTLA-4、サルCTLA-4に結合し、ここで該抗体または抗原結合断片の結合エピトープは、CTLA-4のP138を含む。
1つの局面において、本発明は抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該抗体または抗原結合断片は、
a) 4.77E-10 M以下のKDでヒトCTLA-4に結合し；かつ
b) 1.39E-09 M以下のKDでマウスCTLA-4に結合する。
前述の抗体において、該抗体または抗原結合断片は、以下の特性のうちの少なくとも1つを示す：
a) 4.77E-10 M～2.08E-10 MのKDでヒトCTLA-4に結合し、かつ1.39E-09 M～9.06E-10 MのKDでマウスCTLA-4に結合する；
b) 刺激されたPBMCからのインターロイキン-2の放出を増強する；
c) 第VIII因子、FGFR、PD-1、CD22、VEGF、CD3、HER3、OX40、および4-1BBからなる群より選択されるいずれのタンパク質にも、実質的に結合しない。
本発明は、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
本発明は、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
本発明は：
a) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；ならびに
b) SEQ ID NO: 8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
本発明は：
a) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；ならびに
b) SEQ ID NO: 8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
さまざまな態様において、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 1からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 2からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 10からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 4からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 11からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 5からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 6からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 13からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する；
または、該抗体もしくはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 7からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
b) SEQ ID NO: 14からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
該抗体もしくは抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
前記抗体の配列は、表1および配列表に示される。
（表１）抗体の推定アミノ酸配列
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 15～41からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（CDR）を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の局面において、本発明は：CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域；ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで重鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO: 15、16、17、および18、ならびにそれらの保存的改変物からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
好ましくは、ここで前述の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域CDR3配列は、SEQ ID NO: 19、20、21、および22、ならびにそれらの保存的改変物からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、ここで前述の抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO: 23、24、25、26、27、および28、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、ここで前述の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域CDR2配列は、SEQ ID NO: 29、30、31、および32、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、ここで前述の抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO: 33、34、35、および36、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、この発明の抗体において前述の抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO: 37、38、39、40、および41、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
より好ましい態様において、本発明は抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合し、かつ：CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域；ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで：
a) 重鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO: 33、34、35、および36のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、CDR2配列は、SEQ ID NO: 23、24、25、26、27、および28のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、CDR3配列は、SEQ ID NO: 15、16、17、および18のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；
b) かつ、軽鎖可変領域CDR1配列は、SEQ ID NO: 37、38、39、40、および41のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、CDR2配列は、SEQ ID NO: 29、30、31、および32のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、CDR3配列は、SEQ ID NO: 19、20、21、および22のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで該抗体または抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 15を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 23を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 33を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 19を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 29を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 37を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 16を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 24を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 34を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 20を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 30を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 38を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 17を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 25を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 35を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 19を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 31を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 39を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 18を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 26を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 36を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 22を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 32を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 40を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 16を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 27を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 34を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 20を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 30を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 38を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 17を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 25を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 35を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 21を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 31を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 39を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
別の好ましい抗体またはその抗原結合断片は：
a) SEQ ID NO: 18を含む重鎖可変領域CDR1；
b) SEQ ID NO: 28を含む重鎖可変領域CDR2；
c) SEQ ID NO: 36を含む重鎖可変領域CDR3；
d) SEQ ID NO: 22を含む軽鎖可変領域CDR1；
e) SEQ ID NO: 32を含む軽鎖可変領域CDR2；
f) SEQ ID NO: 41を含む軽鎖可変領域CDR3；
を含み、
該抗体または該抗原結合断片は、CTLA-4に特異的に結合する。
前記抗体のCDR配列は、表2および配列表に示される。
（表２）抗体のCDR配列
本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。
本発明の抗体は、ヒト化抗体であり得る。
本発明の抗体は、完全ヒト抗体であり得る。
本発明の抗体は、ラット抗体であり得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、以下の特性のうちの少なくとも1つを示し得る：
a) 2.08E-09 M以下のKDでヒトCTLA-4に結合する、および／または1.39E-09 M以下のKDでマウスCTLA-4に結合する；
b) 刺激されたPBMCからのインターロイキン-2の放出を増強する。
さらなる局面において、本発明は、該抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。
本発明は、該抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現ベクターを提供する。
本発明はまた、1つまたは複数のクローニングベクターもしくは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、本発明の宿主細胞を培養する段階、および抗体を単離する段階を含む方法を提供し、
ここで該抗体は、SDラットにおけるヒトCTLA-4細胞外ドメインおよびマウスCTLA-4細胞外ドメインでの免疫感作によって調製される。
本発明は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の導入遺伝子を含む、ラットなどのトランスジェニック動物を提供し、ここで該ラットはこの発明の抗体を発現する。
本発明は、この発明のラットから調製されるハイブリドーマを提供し、ここで該ハイブリドーマは前記抗体を産生する。
さらなる局面において、本発明は、本発明における抗体または前記抗体の抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、もしくは担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物を提供する。
本発明は、治療物質と連結された、この発明の前記抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
ここで本発明は、前記免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、もしくは担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片を調製する方法を提供し、該方法は以下の段階を含む：
(a) (i) SEQ ID NO: 33～36からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO: 23～28からなる群より選択されるCDR2配列；およびSEQ ID NO: 15～18からなる群より選択されるCDR3配列を含む、重鎖可変領域抗体配列；ならびに／または
(ii) SEQ ID NO: 37～41からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO: 29～32からなる群より選択されるCDR2配列、およびSEQ ID NO: 19～22からなる群より選択されるCDR3配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列
を提供する段階；ならびに
(b) 該改変抗体配列をタンパク質として発現する段階。
本発明はまた、対象において免疫応答を調節する方法を提供し、該方法は、この発明における前記抗体のいずれか1つの抗体または抗原結合断片を対象に投与する段階を含む。
本発明はまた、免疫障害もしくはがんの処置または予防のための医薬の製造における、前記抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
本発明はまた、対象において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供し、該方法は、腫瘍細胞の増殖を抑制するために、前記抗体または前記抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。
ここで本発明は、腫瘍細胞が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚のまたは眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、および直腸がんからなる群より選択されるがんのものである、該方法を提供する。
ここで本発明は、抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはラット抗体である、該方法を提供する。
この発明の特徴および利点
本発明者らは、CTLA-4に対するヒト化抗体を、専有のハイブリドーマ技術を活用して作製し、ここで該抗体は、CTLA-4の、そのリガンドであるCD80およびCD86への結合を、抑制した。この発明において報告される抗体は、ヒトおよびサル両方のCTLA-4タンパク質に特異的に結合して高い結合親和性を有し；かつ、免疫応答を強力に調節し、かつインターロイキン-2の産生を増加させる。
該抗体の1つは、ヒトおよびサルのCTLA-4に結合したのみならず、ネズミのCTLA-4にも結合し、これは、マウス腫瘍モデルにおけるその有効性の前臨床での検証を大いに促進し得る。
[本発明1001]
ヒト、サル、およびマウスのCTLA-4に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
抗体が、CD80またはCD86へのCTLA-4の結合を抑制する、本発明1001の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1003]
抗体または抗原結合断片の結合エピトープが、CTLA-4のN145またはN145にある多糖を含む、本発明1001または1002の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1004]
抗体または抗原結合断片がヒト、サルのCTLA-4に結合し、抗体または抗原結合断片の結合エピトープがCTLA-4のP138を含む、抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1005]
(a) 4.77E-10 M以下のK D でヒトCTLA-4に結合し；かつ
(b) 1.39E-09 M以下のK D でマウスCTLA-4に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1006]
(a) 4.77E-10 M～2.08E-10 MのK D でヒトCTLA-4に結合し、かつ1.39E-09 M～9.06E-10 MのK D でマウスCTLA-4に結合する特性；
(b) 刺激されたPBMCからのインターロイキン-2の放出を増強する特性
のうちの少なくとも1つを示す、本発明1005の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を含み、
CTLA-4に特異的に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1008]
SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
CTLA-4に特異的に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1009]
(a) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、および7からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；ならびに
(b) SEQ ID NO: 8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択される配列と少なくとも70%、80%、90%、または95%相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
CTLA-4に特異的に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1010]
(a) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、および7からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；ならびに
(b) SEQ ID NO: 8、9、10、11、12、13、および14からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、
CTLA-4に特異的に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1011]
SEQ ID NO: 15～41からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（CDR）を含み、
CTLA-4に特異的に結合する、
抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1012]
CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域；ならびに
CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片であって、
重鎖可変領域CDR3配列が、SEQ ID NO: 15、16、17、および18、ならびにそれらの保存的改変物からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
該抗体または抗原結合断片はCTLA-4に特異的に結合する、
前記抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1013]
軽鎖可変領域CDR3配列が、SEQ ID NO: 19、20、21、および22、ならびにそれらの保存的改変物からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1012の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1014]
重鎖可変領域CDR2配列が、SEQ ID NO: 23、24、25、26、27、および28、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1012または1013の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1015]
軽鎖可変領域CDR2配列が、SEQ ID NO: 29、30、31、および32、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1012～1014のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1016]
重鎖可変領域CDR1配列が、SEQ ID NO: 33、34、35、および36、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1012～1015のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1017]
軽鎖可変領域CDR1配列が、SEQ ID NO: 37、38、39、40、および41、ならびにそれらの保存的改変物のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1012～1016のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1018]
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはラット抗体である、本発明1001～1017のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1019]
抗体が、
(a) 2.08E-09 M以下のK D でヒトCTLA-4に結合し、かつ／または1.39E-09 M以下のK D でマウスCTLA-4に結合する特性；
(b) 刺激されたPBMCからのインターロイキン-2の放出を増強する特性
のうちの少なくとも1つを示す、
本発明1001～1004または1007～1018のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1020]
本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
[本発明1021]
本発明1020の核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
[本発明1022]
本発明1021のクローニングベクターまたは発現ベクターを1つまたは複数含む、宿主細胞。
[本発明1023]
本発明1022の宿主細胞を培養する段階と、抗体を単離する段階とを含む、本発明1001～1019のいずれかの抗体を作製するための方法。
[本発明1024]
抗体が、SDラットにおけるヒトCTLA-4細胞外ドメインおよびマウスCTLA-4細胞外ドメインでの免疫感作によって調製される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の導入遺伝子を含み、本発明1001～1019のいずれかの抗体を発現する、トランスジェニックラット。
[本発明1026]
本発明1001～1019のいずれかの抗体を産生する、本発明1025のラットから調製されたハイブリドーマ。
[本発明1027]
本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物。
[本発明1028]
治療物質と連結された、本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫コンジュゲート。
[本発明1029]
本発明1028の免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物。
[本発明1030]
以下の段階を含む、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法：
(a) (i) SEQ ID NO: 33～36からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO: 23～28からなる群より選択されるCDR2配列、およびSEQ ID NO: 15～18からなる群より選択されるCDR3配列を含む、重鎖可変領域抗体配列；ならびに／または
(ii) SEQ ID NO: 37～41からなる群より選択されるCDR1配列、SEQ ID NO: 29～32からなる群より選択されるCDR2配列、およびSEQ ID NO: 19～22からなる群より選択されるCDR3配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列
を提供する段階；ならびに
(b) 該改変抗体配列をタンパク質として発現する段階。
[本発明1031]
本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節する方法。
[本発明1032]
免疫障害もしくはがんの処置または予防のための医薬の製造における、本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片の使用。
[本発明1033]
腫瘍細胞の増殖を抑制するために、本発明1001～1019のいずれかの抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
[本発明1034]
腫瘍細胞が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚のまたは眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、および直腸がんからなる群より選択されるがんのものである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはラット抗体である、本発明1033または1034の方法。
図1は、ELISAにおける、キメラ抗体のヒトCTLA-4への結合のグラフを示す。 図2は、ELISAにおける、キメラ抗体のカニクイザルCTLA-4への結合のグラフを示す。 図3は、ELISAにおける、キメラ抗体のマウスCTLA-4への結合のグラフを示す。 図4は、FACSによる、キメラ抗体の、細胞上のヒトCTLA-4への結合のグラフを示す。 図5は、SPRによる、キメラ抗体のヒトCTLA-4への結合の結果を示す。 図6は、キメラ抗体の、リガンド結合の阻害の結果を示す。 図7は、キメラAbが、CTLA-4のCD80発現細胞またはCD86発現細胞への結合を抑制したグラフを示す。 図8は、キメラ抗体が、SEBで刺激されたPBMCからのサイトカイン放出を増強した結果を示す。 図9は、ELISAにおける、ヒト、カニクイザル、およびマウスのCTLA-4へのヒト化抗体の結合のグラフを示す。 図10aは、細胞上のCTLA-4へのヒト化抗体の結合（FACS）のグラフを示す。 図10bは、FACSによる、ヒト化抗体の親和性のグラフを示す。 図11は、ELISAによって、ヒト化抗体がリガンド結合を阻害することを示す。 図12は、FACSによって、ヒト化抗体がCTLA-4のそのリガンドへの結合を阻害することを示す。 図13は、SEBアッセイにおいて、ヒト化抗体がサイトカイン放出を増強することを示す。 図14は、異なる条件での、W3162-1.146.19-Z12またはW3162-1.154.8-Z35のSECプロファイルを示す。 図14-1の説明を参照のこと。 図14-1の説明を参照のこと。 図14-1の説明を参照のこと。 図15は、抗体W3162-146.19-z12のインビボでの有効性の結果を示す。 図16は、W3162抗体がCTLA-4に特異的に結合することを示す。 図17。抗CTLA4抗体の、ヒトCTLA-4／CTLA-4変異体への結合活性。(A) イピリムマブ、(B) W3162-1.146.19-z12、および(C) W3162-1.154.8-z35の抗体は、2μg/mlでプレコートされたヤギ抗ヒトIgG Fc抗体によって捕捉され、そしてその後、希釈されたhCTLA4-His（WT）またはそのムテイン（N113QおよびN145Q）とともにインキュベートされ、その後、HRP-抗His抗体が検出のために添加された。 図18は、ヒトCTLA-4上にマッピングされた、結合残基またはエピトープを示す：それぞれ、(A) CD80の結合部位（PDB: 1I8L）、(B) CD86の結合部位（PDB: 1I85）、(C) トレメリムマブの結合部位（PDB: 5GGV）、(D) イピリムマブの結合部位、(E) W3162-1.146.19-z12の結合部位、および(F) W3162-1.154.8-z35の結合部位。IAH1のCTLA-4構造が、グリコシル化の構造を示すために、D～Fについて使用された。
詳細な説明
本発明がより容易に理解されることができるように、いくつかの語が最初に定義される。追加の定義は、詳細な説明の全体にわたって説明される。
「細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4」、「タンパク質CTLA-4」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「CD152」との語は、互換性をもって使用され、かつ、ヒトのCTLA-4または他の種のCTLA-4の変種、アイソフォーム、種ホモログを、およびCTLA-4と共通するエピトープを少なくとも1つ有するアナログを、含む。
本明細書において「抗体」と称される語は、全長抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）、またはそれらの単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を含むタンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略される）、および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略される）、および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と名付けられた超可変性の領域へとさらに細分化されることができ、CDRの間には、フレームワーク領域（FR）と名付けられた、より保存された領域が存在する。VHおよびVLそれぞれは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、それらはアミノ末端からカルボキシル末端へと、以下の順で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
「抗体」との語は、この開示において使用される場合、それがインビトロまたはインビボで産生されたかどうかに関わらず、免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体を指し、かつ、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。該語は、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、および移植（grafted）抗体を含む。「抗体」との語はまた、Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAbなどの抗体断片、および抗原結合機能、すなわちCTLA-4に特異的に結合する能力を保持する他の抗体断片を含む。典型的にはそのような断片は、抗原結合断片を含み得る。
「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、および「結合断片」との語は、抗体と抗原との間の特異的な結合のための役割を担うアミノ酸を含む、抗体分子の一部分を指す。例として、抗原が大きい場合、抗原結合断片は、該抗原の一部に結合するのみであってよい。抗原結合断片との特異的な相互作用のための役割を担う抗原分子の一部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」と称される。
抗原結合断片は、典型的には抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）を含むが、しかしながら、必ずしも両方を含まなくてはならないわけではない。たとえば、いわゆるFd抗体断片は、VHドメインのみからなるが、インタクトな抗体の抗原結合機能のいくつかを依然として保持する。
上記に沿って、「エピトープ」との語は、上記に定義される結合断片によって特異的に結合／同定される、抗原決定基を定義する。結合断片は、標的の構造、たとえばヒトCTLA-4およびネズミCTLA-4に独特である立体構造エピトープまたは連続エピトープに対し、特異的に結合／相互作用しうる。立体構造エピトープまたは不連続エピトープは、一次配列においては離れているが、ポリペプチドが未変性のタンパク質／抗原へと折りたたまれる時には分子の表面上で集合する、2以上の別々のアミノ酸残基の存在によるポリペプチド抗原として、特徴付けられる。エピトープに寄与する2以上の別々のアミノ酸残基は、1つまたは複数のポリペプチド鎖の、離れた区域に存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖が3次元構造へと折りたたまれてエピトープを構成する時に、分子の表面上で集合する。対照的に、連続エピトープまたは線状エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の線状セグメントに存在する、2以上の別々のアミノ酸残基からなる。
「CTLA-4のエピトープに結合する」との語は、線状のアミノ酸配列によって定義されてよく、またはCTLA-4ポリペプチドの一部における、第3次の、すなわち3次元の立体構造によって定義されてもよいCTLA-4の特定のエピトープに対して、抗体が特異的な結合力を有することを指す。結合とは、CTLA-4の一部分についての抗体親和性が、他の関連ポリペプチドについてのそれらの親和性よりも実質的に大きいことを意味する。「実質的に大きい親和性」との語は、他の関連ポリペプチドについての親和性と比べ、CTLA-4の一部分についての親和性において、測定可能な増加が存在することを意味する。好ましくは親和性は、他のタンパク質についてのものと比べて、CTLA-4の特定の一部分について、少なくとも1.5倍であるか、2倍であるか、5倍であるか、10倍であるか、100倍であるか、103倍であるか、104倍であるか、105倍であるか、106倍であるか、またはより大きい。好ましくは結合親和性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって、または蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析もしくは表面プラズモン共鳴（SPR）によって、決定される。より好ましくは結合特異性は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析によって取得される。
「交差反応性」との語は、本明細書において記載される抗原断片の、ヒト、サル、および／またはネズミ（マウスもしくはラット）における同じ標的分子への結合を指す。したがって、「交差反応性」とは、異なる種において発現される同じ分子Xに対するものであってX以外の他の分子に対するものではない種間反応性として、理解されるべきものである。たとえばヒトCTLA-4を認識するモノクローナル抗体の、サルの、および／またはネズミ（マウスもしくはラット）のCTLA-4に対する異種間の特異性は、たとえばFACS分析によって決定され得る。
本明細書において使用される場合、「対象」との語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」との語は、すべての脊椎動物を含んでおり、それはたとえば哺乳類および非哺乳類であり、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等である。特記されている場合を除き、「患者」または「対象」との語は互換性をもって使用される。
「処置」および「治療方法」との語は、治療的処置、および予防的な／防止のための手段の、両方を指す。処置を必要とする個体は、特定の医学的障害を最終的に有し得る個体だけでなく、該障害をすでに有する個体をも含んでよい。
「保存的改変」との語は、すなわち、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の改変であって、これは、該ヌクレオチド配列によってコードされる抗体または該アミノ酸配列を含む抗体の結合の特徴に、有意に影響をおよぼさず、また、それを変更することもしない。そのような保存的な配列の改変は、ヌクレオチドならびにアミノ酸の、置換、付加、および欠失を含む。改変は、部位特異的変異導入およびPCRを介する変異導入などの、当技術分野において公知の標準的な技術によって、配列に導入されることができる。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
以下の実施例における実験手法は、他に指定されていない限り、従来の手法である。
実施例1：研究材料の調製
1. 可溶性CTLA-4の発現および精製
ヘキサヒスチジン（6xHis）タグまたはFcタグを有する、ヒトのおよびマウスのCTLA-4細胞外ドメイン（ECD）遺伝子は、発現ベクターへとクローニングされ、その後、Expi293 Expression System Kitを用いるExpi293細胞のトランスフェクションに使用された。細胞はExpi293 Expression Medium中で、135 rpmで回転する旋回振とうプラットフォーム上で、8% CO2を有する加湿空気を含む37℃のインキュベーター内で培養された。採取された上清はタンパク質精製のために使用された。ヘキサヒスチジンでタグ付けされたタンパク質はNi-NTAカラムを用いて精製され、Fcでタグ付けされたタンパク質はプロテインAカラムを用いて精製された。
2. 細胞株の開発
全長ヒトCTLA-4の遺伝子は、安定な細胞株の開発のため、発現ベクター中にクローニングされた。手短に述べると、1 x 106個／mLの密度の30 mLの量の293F細胞が、Plasfect試薬を用いて、30μgのDNAでトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、37℃、8% CO2、および100 rpmの振とう速度にセットしたインキュベーター内に入れられた。トランスフェクションの24～48時間後、最終濃度で4～6μg/mLのブラストサイジンが、安定なクローンを選択するために使用された。選択されたクローンは、抗CTLA-4抗体を用いるFACSによって試験された。
カニクイザルCTLA-4を発現する細胞を得ることを目的として、全長カニクイザルCTLA-4の遺伝子は、細胞プールの開発のため、発現ベクター中にクローニングされた。手短に述べると、1 x 106個／mLの密度の30 mLの量の293F細胞が、Plasfect試薬（Life Technology）を用いて、30μgのDNAでトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、37℃、8% CO2、および100 rpmの振とう速度にセットしたインキュベーター内に入れられた。トランスフェクションの24時間後、最終濃度で4μg/ mLのブラストサイジンが、細胞プールを選択するために使用された。選択された細胞プールは、抗CTLA-4抗体を用いるFACSによって試験された。
実施例2：抗体ハイブリドーマの作製
1. 免疫感作
ヒトCTLA-4およびネズミCTLA-4は、SDラットの免疫感作のために使用された。具体的には、3匹のSDラットが、30μg／動物の、アジュバント中のヒトのおよびマウスのCTLA-4 ECDタンパク質で、免疫感作された。アジュバントは、Titer-Max、Adju-Phos、およびCpG-ODNを含んでいた。ラットは、1週間に1回、足蹠から、および皮下の両方で、注入された。血清中の抗体力価は、ELISAによって毎月測定された。抗体力価が十分に高い時に、最大の力価を有するラットは、アジュバント非含有のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中にあるヒトのおよびマウスのCTLA-4 ECDタンパク質を用いた、最終の追加免疫を与えられた。数日後、脾臓およびリンパ節がラットから採取され、そして融合のため、リンパ球が分離された。
2. 細胞融合
細胞融合は以下のように実施された：骨髄腫細胞であるSP2/0細胞は、融合の前の週に解凍され、そして、それらを対数増殖の状態に維持するために、融合の前日まで毎日、1:2に分割された。免疫感作されたラットのリンパ節から単離されたBリンパ球、および骨髄腫細胞は、それぞれトリプシンで処置され、そして反応は、FBSの添加によって停止された。Bリンパ球は、1:1の比で骨髄腫細胞と組み合わされた。細胞混合物はその後、洗浄され、そして0.3 Mスクロース、0.1 mM酢酸マグネシウム、および0.1 mM酢酸カルシウムを含む電気融合溶液中に、細胞2 x 106個／mlで再懸濁された。電気細胞融合は、製造者の標準的なプロトコルにしたがい、Btx Electro Cell Manipulator（Ecm 2001）を用いて実施した。その後、融合チャンバーからの細胞懸濁液は、新鮮な培地を含む滅菌フラスコ内にすみやかに移され、そして2時間、37℃のインキュベーター内でインキュベートされた。細胞懸濁液はその後混合され、そして60個の96ウェルプレート（細胞1 x 104個／ウェル）に移された。96ウェルプレートは、37℃かつ5% CO2で培養され、定期的にモニターされた。クローンが十分に大きくなった時（7～10日後）に、180μL／ウェルの上清が除去され、そしてその後、1ウェルにつき200μLの新鮮な培地が添加された。72時間後、100μLの上清は、スクリーニングのため、組織培養プレートから96ウェルアッセイプレートへと移された。
3. ハイブリドーマのスクリーニング
多数のハイブリドーマクローンが、遺伝子操作されたヒトCTLA-4発現細胞への結合だけでなく、ヒト、ネズミ、およびサルのCTLA-4タンパク質への結合についても、スクリーニングされた。特異的なCTLA-4の結合および阻害活性が、第一のおよび第二のスクリーニングを通じて確認されたら、陽性ハイブリドーマ株は、限界希釈を用いて、96ウェルプレート中にサブクローニングされた。プレートは、リガンドであるCD80およびCD86のCTLA-4への結合との競合について陽性クローンがさらにスクリーニングされるまで、37℃、5% CO2で培養された。選択された陽性クローンの培養上清は、抗体の精製およびさらなる特徴付けのために収集された。リード候補は、VHおよびVLの配列決定のために選択された。
4. ハイブリドーマからのVHおよびVL配列の決定
選択されたハイブリドーマクローンの抗体のVHおよびVL遺伝子は、RT-PCRまたは5’ RACEによって単離された。具体的には、全RNAは、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を用いて、ハイブリドーマ細胞から単離された。第一鎖cDNAは、オリゴdTを用いて逆転写された。抗体のVHおよびVL遺伝子は、3’ 定常領域縮重プライマーおよび5’ 縮重プライマーのセットを用いて、cDNAから増幅された。5’ 縮重プライマーは、Ig可変配列の上流シグナル配列のコード領域に基づいて設計された。PCR産物はその後、pMD18-Tベクター中にライゲーションされ、そして10μLのライゲーション産物が、Top10コンピテント細胞中に形質転換された。形質転換された細胞は、カルベニシリン含有2xYTプレート上にプレーティングし、そして37℃で一晩インキュベートした。15個の陽性コロニーが、BiosuneによるDNA配列決定のため、無作為に採取された。あるいは、5’ RACEが、選択されたハイブリドーマクローンのVHおよびVL配列を同定するために使用された。まずRNAは、5’-RACEキット（Takara-28001488）を用いて、cDNAへと最初に逆転写され、3’ 縮重プライマー、および3’ アダプタープライマー（ExTaq: Takara-RR001B）を用いるPCRがそれに続いた。PCR断片は、pMD18-Tベクター（Takara-D101C）中に挿入され、そして配列決定のため送られた（Biosune, Shanghai）。
実施例3：キメラ抗体の作製および特徴付け
1. キメラ抗体の作製
VHおよびVLの推定アミノ酸配列は、表3に列挙される。下線を引いた配列は、カバット表記システムによって定義されるCDRである。これらのラット抗体の可変領域はヒト抗体の定常領域と融合され、そしてキメラ抗体は、Expi293細胞から発現され、そしてプロテインAクロマトグラフィーを用いて精製された。
（表３）ラット抗CTLA-4抗体の可変領域配列
2. キメラ抗体の特徴付け
2.1 抗体は、ヒト、サル、およびネズミのCTLA-4に結合した（ELISA、FACS、およびSPR）
ラット可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体は、哺乳類細胞から発現され、そしてプロテインA親和性クロマトグラフィーを用いて精製された。
抗体は、CTLA-4結合ELISAにおいて試験された。図1、2、および3に示されるように、4つの抗体すべては、ヒトのおよびサルのCTLA-4に、イピリムマブ（WBP316-BMK1）に匹敵するEC50で結合したが、1つの抗体、W3162-1.146.19のみ、0.01 nMのEC50でネズミCTLA-4にも結合した。抗体が細胞表面上でCTLA-4に結合できることを確認するため、CTLA-4発現細胞株が、FACSアッセイにおいて使用された。これらの抗体はまた、細胞表面上のCTLA-4（図4）に、1.14 nMから9.42 nMの範囲のEC50で結合した。W3162-1.146.19は、細胞表面上のCTLA-4に3.25 nMのEC50で結合し、かつW3162-1.154.8は、細胞表面上のCTLA-4に1.26 nMのEC50で結合した。
4つの抗体の結合キネティクスは、SPRを用いて測定された。抗体は、固定化されたヤギ抗ヒトFcに捕捉され、そしてその後、異なる濃度のヒトCTLA-4 ECDが順に注入された。リファレンスチャンネルおよび緩衝液チャンネルについてのセンサーグラムは、試験センサーグラムから差し引かれた。データは、1:1結合分析に適合させて使用された。図5および表4に示されるように、4つの抗体のすべては、イピリムマブ（WBP316-BMK1）よりも高い親和性の、2.08E-09 nM～6.80E-11 nMの範囲のKDで、ヒトCTLA-4 ECDドメインに結合した。
（表４）ヒトCTLA-4 ECDへの抗体結合のキネティクス
2.2 キメラ抗体の、リガンドとの競合
CTLA-4は、CD28よりも20～50倍高い親和性で、CD80およびCD86の両方に結合することが知られている [Krummel 1996]。したがって、抗CTLA-4抗体は、それらがCD80およびCD86のCTLA-4への結合と競合できるかどうかが試験された。ELISAおよびFACSの両方が、競合アッセイとして使用された。ELISAに基づく競合アッセイにおいて、ヒトCTLA-4はプレート上にコートされ、そしてビオチン化リガンドと混合された抗体は、プレート中に添加された。結合したリガンドは、HRPコンジュゲートストレプトアビジンによって検出された。図6aおよび6bに示されるように、4つの抗体すべては、リガンドであるCD80（B7-1、L1）およびCD86（B7-2、L2）と、CTLA-4への結合において競合し、かつ、それらのうちW3162-1.101.2を除く3つは、イピリムマブ（WBP316-BMK1）に匹敵するEC50を有していた。FACSアッセイにおいて、抗体およびビオチン化ヒトCTLA-4の混合物は、CD80発現細胞またはCD86発現細胞に添加され、そして結合したヒトCTLA-4は、PEコンジュゲートストレプトアビジンによって検出された。図7a（上のパネル）および図7b（下のパネル）に示されるように、4つの抗体すべては、リガンド発現細胞へのCTLA-4の結合を効果的に阻害することができた。W3162-1.154.8を除く3つの抗体は、CD80細胞へのCTLA-4の結合を完全に阻害することができたが、一方でイピリムマブWBP316-BMKは、200 nMという、使用された最大濃度であってさえも、この結合を部分的に阻害することができたのみであった（図7a）。CD86細胞へのCTLA-4の結合を阻害するFACSアッセイにおいて（図7b）、4つの抗体すべては、CD86細胞へのCTLA-4の結合を完全に阻害することができたが、一方でイピリムマブは、200 nMという、使用された最大濃度であってさえも、この結合を部分的に阻害することができたのみであった。W3162-1.101.2のキネティクスは異なっているようであった：阻害は、低濃度ではイピリムマブよりも効果的ではなく、高濃度ではイピリムマブよりも効果的であった。他の3つの抗体は、試験されたすべての濃度で、CTLA-4の阻害においてイピリムマブよりも効果的であった。
2.3 キメラ抗体のSEBアッセイにおける機能
1.34 nM、3.35 nM、8.71 nM、21.4 nM、53.6 nM、134 nMの異なる濃度の抗CTLA-4抗体の機能が、改変されたT細胞刺激アッセイ（SEBアッセイ）において試験された。ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）は、CTLA-4がそこにおいて重要な役割をはたすことが報告されたヒトT細胞の、活性化の刺激物として、使用された。T細胞の活性化は、IL-2の分泌によって測定された。図8に示されるように、4つの抗体すべては、用量依存的な様式でIL-2の分泌を促進し、イピリムマブに匹敵するかまたはこれより優れていた。
実施例4：ヒト化抗体の特徴付け
1. ヒト化
「ベストフィット（Best Fit）」アプローチが、抗体の軽鎖および重鎖をヒト化するために使用された。
3つの抗CTLA-4抗体（ELISAおよびFACSにおけるその相対的に低い結合活性のため、W3162-1.101.2を除く）が、CDR移植技術を用いるヒト化のために選択された。抗体の可変領域のCDR（表5において下線が引かれている）およびFRは、カバットシステムを用いて定義された。配列の相同性および構造の類似性に基づき、ラットのFR1～3領域の遺伝子は、ヒト化されたFR1～3領域によって置き換えられ、一方で、ラット遺伝子のFR4領域は、最も類似の構造を有するJHおよびJK遺伝子に由来する、ヒト化されたFR4領域によって置き換えられた。可変領域の、翻訳後修飾（PTM）のホットスポットは、PTMのリスクを減少させるために改変された。鋳型の配列およびコドンの最適化を確認した後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は合成され、そして発現ベクター中にクローニングされ、そしてその後、ヒト化抗体の発現のために使用された。ヒト化抗体は、プロテインAクロマトグラフィーを用いて精製され、そしてヒト、サル、およびネズミのCTLA-4への結合のキネティクスが、SPRの手法を用いて測定された。
（表５）ヒト化抗CTLA-4抗体の可変領域配列
（表６）ヒト化抗CTLA-4抗体の可変領域
2. ヒト化抗体の特徴付け
2.1 抗体は、ヒト、サル、およびネズミのCTLA-4に結合した
2.1.1 CTLA-4結合ELISA
ヒト化抗体は、哺乳類細胞から発現され、そしてプロテインA親和性クロマトグラフィーを用いて精製された。イピリムマブは商業的供給源からであった。アイソタイプ対照抗体、異なるタグ（hFcまたは6xHis）を有するヒトCTLA-4 ECD、およびネズミCTLA-4.ECD-hFcは、WuXi Biologicsによって調製された。ネズミCTLA-4.ECD-6xHis、およびカニクイザルCTLA-4 ECD-6xHisは、Sino Biologicalから購入した。HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG Fcは、Bethylから購入した（カタログ：A80-304P）。
ELISAは、抗ヒトCTLA-4抗体の、ヒト、ネズミ、およびカニクイザルのCTLA-4タンパク質への結合を試験するために使用された。96ウェルプレートは、ヒトCTLA-4.ECD-6xHis（1.0μg/mL）、カニクイザルCTLA-4.ECD-6xHis（0.5μg/mL）、またはマウスCTLA-4.ECD-6xHis（0.5μg/mL）で、4℃で16～20時間コートされた。DBPS中の2% BSAでの1時間のブロッキングの後、陽性および陰性対照抗体だけでなく試験抗体もプレートに添加され、そして室温で1時間インキュベートされた。抗体のプレートへの結合は、HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体（1:5000希釈）により、1時間のインキュベーションで検出した。色は、100μLのTMB基質を8分間調合することによって発色させ、そしてその後、100μLの2N HClによって停止させた。450 nMでの吸光度は、マイクロプレート分光光度計を用いて測定された。
図9に示されるように、2つの抗体、W3162-1.146.19-z12-IgGkおよびW3162-1.154.8-z35-IgGkは、ヒトCTLA-4に、それぞれ0.03 nM、および0.04 nMのEC50で結合した、これは、イピリムマブ（WBP316-BMK1）の0.01 nMのEC50よりわずかに高い（図9A）。2つの抗体はまた、0.05 nMのEC50でサルCTLA-4に結合した（図9B）が、しかし、W3162-1.146.19-z12-IgGkのみ、0.19 nMのEC50でネズミCTLA-4に結合した。W3162-1.154.8-z35-IgGkとイピリムマブのどちらも、ネズミCTLA-4に結合しなかった（図9C）。
2.1.2 CTLA-4結合FACS
ヒトCTLA4発現293F細胞株は、WuXi Biologicsによって開発された。PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG Fc断片は、Jacksonから購入した（カタログ番号 109-115-098）。1ウェルにつき1 x 105個という数の細胞が、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、そして上清を除去する前に、1500 rpmで4分間4℃で遠心分離された。試験抗体、陽性対照、および陰性対照の連続希釈物は、再懸濁された細胞に添加され、そして1時間4℃でインキュベートされた。細胞は、200μLの、1% BSA含有DPBSで2回洗浄された。1% BSA含有DPBS中に希釈されたPEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG（1:100）が細胞に添加され、そして4℃で1時間インキュベートされた。追加の洗浄段階は、200μLの、1% BSA含有DPBSを用いて2回実施され、1500 rpmで4分間の4℃での遠心分離がそれに続いた。最後に細胞は、100μLの、1% BSA含有DPBS中に再懸濁され、そして蛍光の値はフローサイトメトリーによって測定され、そしてFlowJoによって分析された。
これらの抗体はまた、FACSアッセイにおいて、細胞表面上のヒトCTLA-4に結合することができた。図11（図10aおよび図10b）に示されるように、W3162-1.146.19-z12-IgGk、W3162-1.154.8-z35-IgGk、およびイピリムマブは、それぞれ1.58 nM、0.66 nM、および0.83 nMという、わずかに異なるEC50を有していた。
2.2 これらの抗体の結合キネティクス
2.2.1 これらの抗体の結合キネティクスはSPRを用いて測定された
実験は、SPR技術に基づき、抗体の、CTLA-4 ECDに対するオンレート定数（ka）およびオフレート定数（kd）を測定するためのものであった。親和定数（KD）は、その結果として決定された。
Biacore T200、Series S Sensor Chip CM5、Amine Coupling Kit、および10x HBS-EPは、GE Healthcareから購入した。ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体は、Jackson ImmunoResearch Labから購入した（カタログ番号109-005-098）。固定化段階において、活性化緩衝液は、400 mM EDCおよび100 mM NHSを注入の直前に混合することによって調製された。CM5センサーチップは、活性化緩衝液を用いて420秒間活性化された。10 mM NaAc（pH 4.5）中の、30μg/mLのヤギ抗ヒトIgG Fcγ抗体は、その後200秒間、5μL／分の流速でFc1～Fc4チャンネルへ注入された。チップは、1 M エタノールアミン-HCl（GE）によって不活性化された。その後、抗体はチップ上に捕捉された。手短に述べると、ランニング緩衝液（HBS-EP+）中の、4μg/mLの抗体は、30秒間、10μL／分の流速でFc3チャンネルに個々に注入された。8つの異なる濃度（20 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nM、0.3125 nM、および0.15625 nM）の分析物CTLA-4（WBP316.hCTLA-4.ECD-6xHis）、ならびにブランクのランニング緩衝液は、120秒の結合段階の間、Fc1～Fc4チャンネルに30μL／分の流速で順に注入され、2400秒の解離段階がそれに続いた。再生緩衝液（10 mM グリシン、pH 1.5）は、各解離段階の後に、30秒間、10μL／分で注入された。
これらの抗体の結合キネティクスは、SPRを用いて測定された。抗体は、固定化された抗ヒトFcに捕捉され、そして異なる濃度のCTLA-4-ECDが順に注入された。リファレンスチャンネルおよび緩衝液チャンネルについてのセンサーグラムは、試験センサーグラムから差し引かれた。データは、ヒト、サル、およびマウスのCTLA-4.ECD-6xHisに対する、1:1結合分析のために使用された。表7に示されるように、ヒト化抗体であるW3162-1.146.19-Z12、W145、およびW3162-1.154.8-Z35は、ヒトCTLA-4-ECDドメインに、それぞれ0.477 nM、1.84 nM、および0.0968 nMの親和性で結合した。ラット抗体と比較したときに、ヒト化抗体は匹敵する親和性を有していた。W3162-1.146.19-Z12、およびW3162-1.154.8-Z35は、イピリムマブ（KD = 3.68 nM）よりも有意に高い親和性を有する。抗体W3162-1.146.19-Z12はまた、ネズミCTLA-4に結合することができ、ヒト化前後のその親和性は、表9に示される。ヒト化後の、その1.39 nMの親和性は、その親の抗体の0.906 nMの親和性よりもわずかに低い。
W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.145.10-z7、およびW3162-1.154.8-Z35の、カニクイザルCTLA-4-ECDへの結合の親和性は、それぞれ1.92 nM、0.598 nM、0.131 nMであった（表8）。
（表７）ヒトCTLA-4 ECDへの抗体結合のキネティクス
（表８）サルCTLA-4 ECDへの抗体結合のキネティクス
（表９）マウスCTLA-4 ECDへの抗体結合のキネティクス
2.2.2 FACSによる親和性試験
FITCコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG FcはJackson Immunoresearch Labから購入し（カタログ番号 109-095-098）、そしてBD CantoIIがこのアッセイに使用された。手短に述べると、ヒトCTLA-4を発現するHEK293細胞は、96ウェルU底プレート（BD）中に、細胞5 x 104個／ウェルの密度で移された。試験抗体は、1:2倍で1% BSA含有PBS中に連続的に希釈され、そして細胞とともに4℃で1時間インキュベートされた。1500 rpmでの4分間の遠心分離後、上清は破棄された。二次抗体であるFITCコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG Fc（1個のIgGにつき3.2個のFITC、Jackson Immunoresearch Lab）は14μg/mlの最終濃度で、再懸濁された細胞に添加され、4℃で30分間暗所でインキュベートされた。細胞はその後1回洗浄され、そして1% BSA含有PBS中に再懸濁され、そして、フローサイトメトリー（BD）によって分析された。蛍光強度は、定量的ビーズ（Quantum（商標） MESF Kits, Bangs Laboratories）に基づき、結合した分子／細胞へと変換された。KDは、Graphpad Prism5を用いて算定した。
細胞表面のCTLA-4へのヒト化抗体の結合の親和性は、Benedictの手法 [Benedict 1997 JIM] から改変したフローサイトメトリーの手法によって測定した。CTLA-4発現CHO細胞への抗体の結合の蛍光を測定した後、結合した抗体および遊離の抗体は、図5に示されるように、分析し、方程式にあてはめた。データおよび式に基づき、算定された親和性定数KDが表10に示される。ヒト化抗体であるW3162-1.146.19-Z12、およびW3162-1.154.8-Z35の親和性は、それぞれ5.05 nM、および0.35 nMの高い親和性を有していたが、一方で、イピリムマブの親和性は0.97 nMである。
（表１０）FACSによる親和性試験
2.3 リガンドとの競合
ヒト化抗体が、CD80およびCD86へのCTLA-4の結合を阻害するその能力を維持するかどうかを試験するため、ELISAおよびFACSの両方が、競合アッセイにおいて使用された。2つのCTLA-4リガンド、CD80およびCD86は、Sino Biologicalから購入した（カタログ番号10698-H08Hおよび10699-H08H）。ビオチン化抗Hisタグ抗体は、Genscriptから購入した（カタログ番号A00613）。HRPコンジュゲートストレプトアビジンは、Invitrogenから購入した（カタログ番号SNN1004）。
2.3.1 ELISAに基づく競合アッセイ
ELISAは、ヒトCTLA-4の、そのリガンドであるヒトCD80およびCD86への結合を、抗体が抑制することができるかどうかを試験するために使用された。プレートは、ヒトCTLA-4.ECD.hFc（0.5μg/mL）で、4℃で16～20時間コートされた。DBPS中の2% BSAでの1時間のブロッキングの後、陽性および陰性対照抗体だけでなく試験抗体も、0.25μg/mLのCD80-6xHisまたはCD86-6xHisとあらかじめ混合され、そしてその後プレートに添加され、そして室温で1時間インキュベートされた。0.05% Tween 20含有PBSで3回洗浄した後、ビオチン化抗Hisタグ抗体は、1:2000希釈され、そして添加された。プレートは、室温で1時間インキュベートされた。結合したリガンドは、HRPコンジュゲートストレプトアビジン（1:20000）によって検出された。色は、100μLのTMB基質を8分間調合することによって発色させ、そしてその後、100μLの2N HClによって停止させた。450 nMでの吸光度は、マイクロプレート分光光度計を用いて測定された。
図11に示されるように、W3162-1.146.19-z12-IgGkおよびW3162-1.154.8-z35-IgGkは、コートされたCTLA-4とのリガンドの結合の阻害において、イピリムマブと類似の効果を有しており、CD80についてのIC50は0.87 nM、0.63 nM、および0.40 nMであり、かつCD86については0.71 nM、0.50 nM、および0.42 nMであった。
2.3.2 FACSアッセイ
抗体が、細胞表面上のCD80およびCD86へのCTLA-4の結合を阻害することができるかどうかを試験するため、本発明者らは、この競合を試験するFACSを使用した。CD80発現CHO細胞株、およびCD86発現CHO細胞株は、WuXi Biologicsによって開発された。ビオチン化CTLA-4.ECD.hFcは、WuXi Biologicsによって作製された。PEコンジュゲートストレプトアビジンは、eBioscienceから購入した（カタログ番号12-4317）。
CD80発現細胞またはCD86発現細胞は、1ウェルにつき1 x 105個で96ウェルプレートの各ウェルに添加され、そして上清を除去する前に、1500 rpmで4分間4℃で遠心分離された。試験抗体、陽性対照、および陰性対照の連続希釈物は、ビオチン化ヒトCTLA4.ECD.hFcと混合された。細胞表面上でのリガンドの密度は異なるため、0.02μg/mLのhCTLA-4.ECD.hFc-ビオチンがヒトCD80細胞に使用され、かつ0.08μg/mLのhCTLA-4.ECD.hFc-ビオチンがヒトCD86細胞に使用された。その後、抗体およびCTLA-4の混合物は、細胞へと添加され、そして1時間4℃でインキュベートされた。細胞は、200μLのFACS緩衝液（1% BSA含有DPBS）で2回洗浄された。FACS緩衝液中で1対333希釈されたストレプトアビジンPEは、細胞に添加され、そして4℃で1時間インキュベートされた。追加の洗浄段階は、200μLのFACS緩衝液を用いて2回実施され、1500 rpmで4分間の4℃での遠心分離がそれに続いた。最後に細胞は、100μLのFACS緩衝液中に再懸濁され、そして蛍光の値はフローサイトメトリーによって測定され、そしてFlowJoによって分析された。
結果は図12に示される。2つのヒト化抗体は、イピリムマブよりも効果的に、CTLA-4／リガンドの結合を阻害することができた。使用された最大の濃度において、イピリムマブは、CD80とのCTLA-4の結合の32%、およびCD86とのCTLA-4の結合の40%を阻害したのみであった。比較すると、抗体W3162-1.146.19-Z12は、CD80へのCTLA-4の結合の71%を阻害し、かつCD86へのCTLA-4の結合の73%を阻害した、そして抗体W3162-1.154.8-Z35は、CD80へのCTLA-4の結合の89%を阻害し、かつCD86へのCTLA-4の結合の98%を阻害した。イピリムマブ、W3162-1.146.19-Z12、およびW3162-1.154.8-Z35のCD80に対するIC50は、それぞれ3.23 nM、6.60 nM、および0.07 nMであった。イピリムマブ、W3162-1.146.19-Z12、およびW3162-1.154.8-Z35のCD86に対するIC50は、それぞれ2.52 nM、5.15 nM、および0.28 nMであった。
2.4 SEBで刺激されたPBMCのサイトカイン放出
抗CTLA4抗体は、それらが、SEB（The Second Military Medical Universityより）での刺激の後にヒトPBMCのサイトカイン放出を増強することができるかどうかを試験された。健康なドナーからの末梢血が得られ、フィコール GE Healthcare, 17-1440-02）密度勾配遠心分離によって細胞が単離された。浮遊層が除去されたのち、培地を用いた数回の洗浄によって血小板が除去された。1 x 105個という数のヒトPBMC細胞が、96ウェルプレートの各ウェルに添加された。試験抗体、陽性対照、および陰性対照の連続希釈物は、SEB（10 ng/mL）と混合され、そしてその後、ペレット化した細胞に添加され、そして3日間37℃でインキュベートされた。ヒトIL-2濃度を測定するために上清が収集された。
ヒトIL-2試験のため、プレートは、1.0μg/mlのヒトIL-2抗体（R&D System MAB602）で、4℃で16～20時間プレコートされた。DBPS中の2% BSA（BovoGen）での1時間のブロッキングの後、IL-2を含む上清がプレートに添加され、室温で2時間インキュベートされた。PBST（0.05% Tween 20含有）で3回洗浄した後、ビオチン化ヒトIL-2抗体（R&D system, BAF202）は希釈され、そして0.5 g/mLの濃度で添加された。プレートは室温で1時間インキュベートされた。結合したビオチン化抗体は、1:20000希釈されたストレプトアビジンコンジュゲートHRP（Invitrogen, SNN1004）によって検出された。1時間のインキュベーション後、色は、100μLのTMB基質を調合することによって発色させ、そしてその後、100μLの2M HClによって停止させた。450 nmおよび540 nmでの吸光度は、マイクロプレート分光光度計を用いて測定された。
細胞に基づくアッセイにおいて、ヒト化抗体（8.60 nM、21.4 nM、53.6 nM、134 nM、335 nM）は、それらが、スーパー抗原SEBで刺激されたヒトPBMCを増強できるかどうかを試験された。3日間の刺激の後、PBMCからのIL-2は、ELISAを用いて測定された。アイソタイプ対照抗体と比較して、2つのヒト化抗体（W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.154.8-Z35）の両方、およびイピリムマブは、用量依存的な様式で、PBMCからのIL-2の放出を増強することができた（図13）。
2.5 熱安定性
リード抗体の安定性は、異なる温度で試験された。手短に述べると、100μLの各抗体試料がピペットで個々のチューブへと移され、試料は、4℃もしくは37℃で20時間、または45℃もしくは50℃で2時間インキュベートされた。その後、試料は12,000 rpmで10分間遠心分離された。これらの試料は生じ得る沈殿を発見するために観察され、そして該試料は、SEC-HPLCによって、純度および溶出時間について分析された。
異なる条件でのW3162-1.146.19-Z12のSECプロファイルは図14a～14dに示された。高温条件下での希釈時間と主ピークのパーセンテージ（92.39%～92.48%）のどちらも、低温（92.24%）下でのそれと比較して、有意に変化することはなかった。異なる高温条件でのW3162-1.154.8-Z35のSECプロファイルは図14e～14hに示された。希釈時間と主ピークのパーセンテージ（97.14%～97.17%）のどちらも、低温下（96.84%）と比較して、有意に変化することはなかった。データのこのセットは、試験された高温条件下で抗体が安定であったことを示す。
2.6 非特異的結合
FACSアッセイおよびELISAアッセイの両方が、抗体が他の標的に結合するかどうかを試験するために使用された。FACSアッセイにおいて、異なる細胞株（Ramos、Raji、MDA-MB-453、BT474、Jurkat、Hut78、A431、A204、CaLu-6、A375、HepG2、BxPC-3、HT29、FaDu、293F、CHO-K1）は、1ウェルにつき細胞1 x 105個に調節された。試験抗体およびアイソタイプ対照抗体は、1%BSA含有PBS中で10μg/mlに希釈され、そして4℃で1時間、細胞とともにインキュベートされた。細胞は、180μLの、1%BSA含有PBSで2回洗浄した。PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG Fc断片（Jackson、カタログ番号109-115-098）は、1%BSA含有PBS中で5μg/mlの最終濃度に希釈され、その後、再懸濁された細胞に添加され、そして4℃で30分間暗所でインキュベートされた。追加の洗浄段階は、180μLの、1% BSA含有PBSを用いて2回実施され、1500 rpmで4分間の4℃での遠心分離がそれに続いた。最後に細胞は、100μLの、1% BSA含有PBS中に再懸濁され、そして蛍光の値はフローサイトメトリー（BD CantoII）によって測定され、そしてFlowJoによって分析された。
ELISAアッセイにおいて、試験抗体、アイソタイプ対照抗体は、第VIII因子、FGFR-ECD、PD-1、CTLA-4.ECD、VEGF、HER3.ECD、OX40.ECD、4-1BB.ECD、CD22.ECD、CD3e.ECDを含む、10個の異なる標的抗原への結合を試験された。96ウェルプレートは、4℃で一晩、個々の抗原（2μg/mL）でコートされた。PBS中の2% BSAでの1時間のブロッキングの後、プレートを300μLのPBSTで3回洗浄した。アイソタイプ対照抗体だけでなく試験抗体も、2%BSA含有PBS中で10μg/mLに希釈され、その後プレートへと添加され、そして室温で2時間インキュベートされた。300μLのPBSTでの3回の洗浄後、HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体（2% BSA中で1:5000希釈）はプレートに添加され、そして室温で1時間インキュベートされた。最後にプレートは、300μLのPBSTで6回洗浄された。色は、100μLのTMB基質を12分間調合することによって発色させ、そしてその後、100μLの2M HClによって停止させた。450 nMでの吸光度は、マイクロプレート分光光度計を用いて測定された。
CTLA-4に加えて、関連性のない他のタンパク質が、抗体W3162-1.146.19-Z12およびW3162-1.154.8-Z35がこれらの抗原に結合できるかどうかを試験するために使用された。図16に示されるように、抗原のパネルの中でCTLA-4のみが、該2つの抗体によって検出された。他の抗原は、このELISAアッセイにおいてシグナルを生じなかった。対照的に、抗OX40抗体はOX40に実際に結合し、この抗原がプレート上にコートされていたことを示す。
該2つの抗体の特異性はまた、FACSアッセイにおいて、異なる細胞株のパネル上で試験された。該抗体は、これらの細胞株のいずれに対しても、検出可能なシグナルを生じなかった（データは示さない）。
2.7 インビボでの有効性
抗体W3162-1.146.19-Z12はヒトおよびネズミ両方のCTLA-4に交差反応するため、この抗体の抗腫瘍効果が、同系マウスモデルにおいて試験された。マウスがん細胞株CT26が、異種移植マウスモデルを構築して抗CTLA-4抗体W3162-1.146.19-Z12を試験するために使用された。BioXCellから購入した抗ネズミCTLA-4抗体が、陽性対照として使用された（BioXCell-BE0131）。腫瘍細胞は、10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを補ったRPMI-1640培地中で、37℃、5% CO2雰囲気下で、インビトロで単層培養として維持された。腫瘍細胞は、週に2回、該細胞をトリプシン-EDTA処置によって剥離させた後に定法どおりに継代された。指数増殖期にある増殖中の細胞が採取され、そして腫瘍接種のために計数された。雌のBalb/Cマウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Co., Ltdから購入した。6～8週齢で体重およそ18～22 gのマウスが研究に使用された。各マウスは、50μLのマトリゲルと混合された0.1 mLのPBS中の、1 x 105個の腫瘍細胞を、右腋窩において皮下に接種された。平均腫瘍体積が60～80 mm3に達した時に、動物は無作為にグループ分けされた。抗CTLA-4抗体およびアイソタイプ対照が、処置のために使用された：1週間に2回、マウスへ静脈内注入された。腫瘍のサイズは、週に2回、副尺付きノギスによって測定され、そして腫瘍の体積は式 a x b2 x π / 6 によって算定され、ここで、 a は長さであり、 b は幅である（a ＞ b）。
平均腫瘍体積がおよそ70 mm3に達した時に、W3162-1.146.19-Z12（1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg）、および対照抗体（10 mg/kg）が、2週間のあいだ、週に2回注入された。動物は、腫瘍増殖および体重について経時的にモニターされた。図15に示されるように、W3162-1.146.19-Z12は、用量依存的な様式で、腫瘍の増殖を有意に抑制する。1 mg/kgの用量でW3162-1.146.19-Z12は、対照群と比較して腫瘍増殖を抑制した。3 mg/kgの用量でW3162-1.146.19-Z12は、19日目において腫瘍体積を160 mm3に抑制し、その一方で10 mg/kgのW3162-1.146.19-Z12は、研究期間の最後で腫瘍の退縮を誘導した。
2.8 エピトープマッピング
アラニンスキャニングが、抗体のCTLA-4エピトープを同定するために使用された。この実験において、hCTLA4上のアラニン残基をグリシン残基へと変異させ、そしてすべての他の残基をアラニンへと変異させた。ヒトCTLA4細胞外ドメイン（ECD）の各残基について、点アミノ酸置換を、2つの連続するPCR工程を用いて生じさせた。ヒトCTLA4のECDおよびC末端HisタグをコードするpcDNA3.3-hCTLA4_ECD.Hisプラスミドが鋳型として使用され、そして、変異導入プライマーのセットが、QuikChange lightning multi site-directed mutagenesis kit（Agilent technologies, Palo Alto, CA）を用いる第一工程のPCRに使用された。Dpn Iエンドヌクレアーゼが、変異鎖の合成反応後に親の鋳型を消化するために使用された。第二工程のPCRにおいて、CMVプロモーター、CTLA4の変異ECD、Hisタグ、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）ポリアデニル化から構成される直線状のDNA発現カセットが増幅され、そしてHEK293F細胞（Life Technologies, Gaithersburg, MD）において一過性に発現された。加えて、3つのプラスミドベクターが、グリカンのエピトープを試験するために構築された：pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His（N113Q）、pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His（N145Q）、およびpcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His（N113Q、N145Q）。これらの3つのムテインは、HEK293F細胞（Life Technologies, Gaithersburg, MD）において一過性に発現された。
変異がどのように抗体の結合に影響をおよぼすかを試験するため、捕捉ELISAが実施された。手短に述べると、モノクローナル抗体であるイピリムマブ、W3162-1.146.19-z12、およびW3162-1.154.8-z35（2μg/mL）は、2μg/mLでプレコートされたヤギ抗ヒトIgG Fc（Bethyl Laboratories, Montgomery, TX）によってプレートに捕捉された。定量化されているCTLA4ムテインを含む上清との相互作用の後、HRPコンジュゲート抗His抗体（1:5000; Rockland Immunochemicals, Pottstown, PA）が検出抗体として添加された。TMBは、HRPの物質として使用された。吸光度は、対照変異体の平均にしたがって正規化された。結合の倍率変化に対して追加のカットオフ（＜ 0.55）がセットされた後、最終的に決定されたエピトープ残基が同定された。
抗体W3162-1.146.19-z12、W3162-1.154.8-z35、およびイピリムマブ（W316-BMK1）のヒトCTLA4への結合活性が実施され、3つの抗体すべてがヒトCTLA4に結合することが見いだされた（図17）。
抗体のCTLA-4への結合に影響をおよぼす、試験された点変異は、表11に示された。ヒトCTLA4の結晶構造（PDBコード 1AH1）に照らして、いずれの抗体にも、いくつかのアミノ酸残基（たとえばMet38、Val40、Tyr60、Val71、Val73、Arg75、Val84、Cys85、Cys129、Ile149）が直接的に接触する可能性は低かった。観察された結合の減少は、アラニン置換後のCTLA4構造の不安定性、またはむしろ崩壊から生じた可能性が極めて高い。最終的に決定されたエピトープ残基は表12に列挙され、そして図18において印がつけられた。
図18DおよびEに示されるように、イピリムマブとW3162-1.146.19-z12のエピトープは、N145およびP138などのわずかな残基を除き、互いにオーバーラップする。比較すると、W3162-1.154.8-z35は、他の2つの抗体よりも小さいCTLA-4の領域（図18F）に結合した。3つの抗体のすべては、MYPPPYモチーフを含む、CTLA-4のリガンド結合ドメイン（図18AおよびB）に結合した。
イピリムマブとW3162-1.146.19-z12のオーバーラップしたエピトープは、抗体W3162-1.146.19-z12の独特の異種間結合の理由を説明するものではなかった。CTLA-4上のN145変異は、W3162-1.146.19-z12のCTLA-4への結合に影響をおよぼしたのみであり、他の2つの抗体には影響をおよぼさないので、本発明者らはさらに、潜在的なエピトープとしてN-グリコシル化部位に注目した。抗体結合活性に対する、CTLA4の2つのグリコシル化部位における変異の影響は、図17に示される。変異CTLA-4へのイピリムマブまたはW3162-1.154.8-z35の結合は、有意に変化することはなかった（図17AおよびC）。対照的に、変異型CTLA-4 N145QへのW3162-1.146.19-z12の結合は有意に減少したが、一方でこの抗体の、N113Qを有するCTLA-4への結合は、変化しなかった。データのこのセットは、CTLA-4のN145にあるグリカン（図18E）が、W3162-1.146.19-z12のエピトープになることができたことを示す。N145残基は、カニクイザルおよびマウスのCTLA-4において保存されている。
本発明の説明は、上記において実施例によってなされている。しかしながら、本発明は実施例に限定されるものではないことが、当業者によって理解される。本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化されてよい。本発明の範囲は、したがって、上述の説明よりはむしろ添付の請求の範囲によって示され、かつ、請求の範囲の等価物の趣旨および範囲内にあるすべての変更が、それに包含されることが意図される。
（表１１）抗体の結合に対する、CTLA4の点変異の影響
a 結合における倍率変化は、いくつかのサイレントアラニン置換の結合と関連する。
（表１２）3つの抗体の、同定されたエピトープ
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> WuXi Biologics (Shanghai) Co.,Ltd.
<120> Novel monoclonal antibodies to cytotoxic
T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4)
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3

<210> 1
<211> 114
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Ser Ile Ser Pro Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly

<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 25
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1 5 10 15

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<211> 17
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Lys

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1 5 10 15
Gly

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Lys

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<400> 39
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1 5 10 15

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1 5 10

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<211> 10
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<213> Artificial Sequence
<400> 41
Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr
1 5 10

<210> 42
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagag cggcggagga ctggtgcaac ctggcggaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcgacct gaccttcagc aactacgaca tggcctgggt gagacaggcc 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggccagc atcagcccca gcggcggcaa cacctactac 180
agggacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggcacctg 300
tggttcgcct actggggcca gggcacactg gtgaccgtga gcagc 345

<210> 43
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
caggtgcagc tgcaggagag cggacccgga ctggtgaagc cctccgagac cctgagcctg 60
acctgcagcg tgacctacca caccatcacc agcggctacg actggacctg gatcagaaag 120
ccccccggca aaggcatgga gtggatcggc tacatcagct acagcggcaa caccaactac 180
aaccccagcc tgaagagcag ggtgaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctgaagctga gcagcgtgac agccgccgat accgccgtgt actactgcgc cagcatgatg 300
gtgccccact actacgtgat ggacgcctgg ggacagggca ccctggtgac agtgagcagc 360

<210> 44
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacttca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggacaag gcctggagtg gatgggcaga gtggatcccg agcagggcag ggccgactac 180
gccgagaagt tcaagaagag ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc caggagagcc 300
atggacaact acggcttcgc ctactggggc cagggaaccc tggtgaccgt gagcagc 357

<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60
atcacctgcc aggccagcca ggacatcggc agcaacctga tctggttcca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagcctat gatctactac gccacccacc tggccgatgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcagaag cggcaccgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag tacaagcagt accccagaac cttcggcggc 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 46
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcccgccagc 60
atcagctgca ggtccagcca gagcctgctg aacagcgacg gcaacaccta cctgtactgg 120
tacctgcaga agcctggcca gagcccccag ctgctgatct acctggtgtc caagctgggc 180
agcggcgtgc ctaacaggtt tagcggcagc ggcagcggca ccgatttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgcg tgcagggcac ccacgatcct 300
tggaccttcg gcggcggaac caaggtggag atcaag 336

<210> 47
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
gagatcgtgc tgacccagag ccccgacttc cagagcgtga cccccaagga gaaggtgacc 60
atcacctgca gcgccaacag cgccctgagc tacatgtact ggtaccagca gaagcccgac 120
cagagcccca agctgtgggt gcacggcacc agcaatctgg ccagcggcgt gcctagcaga 180
tttagcggca gcggcagcgg caccgatttc accctgacca tcaacagcct ggaggccgag 240
gacgccgcta cctactactg ccaccactgg agcaacaccc agtggacctt cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaag 318

Claims (17)

  1. 軽鎖可変（VL）領域および重鎖可変（VH）領域を含み、ヒトおよびサルのCTLA-4に結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、
    該VL領域が、配列番号41で定義される軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、配列番号32で定義されるLCDR2、および配列番号22で定義されるLCDR3を含み、かつ
    該VH領域が、配列番号36で定義される重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、配列番号28で定義されるHCDR2、および配列番号18で定義されるHCDR3を含む、
    抗体またはその抗原結合断片。
  2. 抗体が、CD80またはCD86へのCTLA-4の結合を抑制する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 抗体または抗原結合断片の結合エピトープが、CTLA-4のP138を含む、請求項1～2のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 4.77E-10 M以下のKDでヒトCTLA-4に結合する、請求項1～3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. (a) 4.77E-10 M～9.68E-11 MのKDでヒトCTLA-4に結合する特性；
    (b) 刺激されたPBMCからのインターロイキン-2の放出を増強する特性
    のうちの少なくとも1つを示す、請求項4に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはラット抗体である、請求項1～5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
  8. 請求項7に記載の核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
  9. 請求項8に記載のクローニングベクターまたは発現ベクターを1つまたは複数含む、宿主細胞。
  10. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物。
  11. 治療物質と連結された、請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫コンジュゲート。
  12. 請求項11に記載の免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および担体のうちの1つまたは複数とを含む、薬学的組成物。
  13. 以下の段階を含む、抗CTLA-4抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法：
    (a) (i) 配列番号36で定義されるCDR1配列、配列番号28で定義されるCDR2配列、および配列番号18で定義されるCDR3配列を含む、重鎖可変領域抗体配列；ならびに
    (ii) 配列番号41で定義されるCDR1配列、配列番号32で定義されるCDR2配列、および配列番号22で定義されるCDR3配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列
    を提供する段階；ならびに
    (b) (a)の抗体配列をタンパク質として発現する段階。
  14. 免疫障害もしくはがんの処置または予防のための医薬の製造における、請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
  15. 請求項1～6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を含む、対象における腫瘍細胞の増殖を抑制するための、医薬。
  16. 腫瘍細胞が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚のまたは眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、および直腸がんからなる群より選択されるがんのものである、請求項15に記載の医薬。
  17. 抗体が、ヒト化抗体である、請求項15または16に記載の医薬。
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