JP7719018B2 - 脂肪肝関連症状の治療のための物質 - Google Patents

Description

本発明は脂肪肝疾患及び関連障害の治療に関する。

肝脂肪症（ＨＳ）は、肝細胞傷害の証拠のない肝臓内の脂肪の蓄積として定義され、それは世界中で最も一般的な慢性肝疾患である（Ｖｅｔｅｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ、２００７）。ＨＳは非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の特徴であり、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及び心血管疾患と強く関連している（Ｒａｔｚｉｕ ｅｔ ａｌ、２０１０）。ＮＡＦＬＤ患者の最大３０％が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を発症するが、これは炎症や瘢痕化が最終的に肝硬変や肝細胞癌（ＨＣＣ）につながり得る深刻な病気である（Ｄｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ、２０１４）。

ＨＳの発生及びその重大な肝障害への移行をもたらす根本的な分子メカニズムは、とらえどころのないままであり、それは薬物標的の同定及び有効な治療戦略を設計するために使用され得るバイオマーカーの発見を制限する。

現在のところ、ＨＳ及びそれに関連した臨床状態のための医薬治療はほとんどなく（Ｍａｃｈａｄｏ＆Ｃｏｒｔｅｚ‐Ｐｉｎｔｏ、２０１２）、本発明者らは、統合システム生物学に基づくアプローチがこれらの重要な満たされていない医学的ニーズに対処するのに役立ち得ることを認識した。これに関連して、ゲノム規模の代謝モデル（ＧＥＭ）を使用して、ＨＳの発生及び関連障害に関与する分子メカニズムについてのより多くの洞察を得ることができ、次に治療的発見を可能にすることができる。ＧＥＭは、特定の細胞／組織において生じることが知られている生化学的反応の集まりであり、これらのモデルは、代謝関連障害の根底にある分子メカニズムを明らかにするために細胞、生理学及び臨床データの統合において使用されている。

本発明者らは、脂質異常症の病態生理学の理解に基づいてＮＡＦＬＤの治療戦略を設計した。ＧＥＭ ｉＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ２３２２には、脂質代謝に関する広範な情報が含まれている（Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ、２０１４）。これは、ＮＡＦＬＤの根底にある分子メカニズムに対する過剰量の脂質の影響を調べるために必要である。したがって、このＧＥＭは、リポタンパク質の動態及びそれらの肝臓代謝に対する潜在的影響を研究するためのプラットフォームとして使用することができる。

ＮＡＦＬＤにおける根本的な代謝障害を明らかにするために、本発明者らは、肝臓、脂肪、筋肉及び他の末梢組織並びに赤血球間の相互作用を考慮に入れて、脂質代謝の動態を研究することによってＨＳの程度が異なる被験体間の肝臓における代謝差を調べた。個人化されたゲノムスケールの代謝モデリングを使用して、本発明者らはＮＡＦＬＤの根本的な分子メカニズムを解明し、それを治療戦略の開発に使用した。

様々な程度のＨＳを有する被験体を特徴付けし、ＶＬＤＬ動態を測定した。続いて、ＶＬＤＬ動態データを、実験的に得られた追加のフラックスデータと統合して、肝臓ＧＥＭを使用して各被験者の肝臓代謝をシミュレートした。次に肝臓とＨＳの予測細胞内フラックスの間の相関をＮＡＦＬＤの代謝異常を検出するために評価した。システムレベルの分析では、ＮＡＤ＋とＧＳＨの代謝の変化（ＮＡＤとＧＳＨの必要性の増加）がＮＡＦＬＤの一般的な機能であることが示された。それゆえ、ＮＡＦＬＤを有する被験体は、おそらく空腹状態におけるグリシンの利用可能性が限られているために、ＧＳＨのデノボ合成を減少させたと仮定された。血漿メタボロミクスの分析は、グリシン並びにセリン、ベタイン及びＮ‐アセチルグリシン（グリシンに変換することができる）の血漿レベルが、低ＨＳの被験者と比較して高ＨＳの被験者においてより低いことを示した。さらに、メタボロミクスデータの分析は、グリシン、セリン、ベタイン及びＮ‐アセチルグリシンの血漿レベルとＨＳとの間の有意な負の相関関係を明らかにした。マウス試験において、ＮＡＤ＋及びＧＳＨの前駆体の補給はＨＳを有意に減少させることが示された。最後に、概念実証のヒト試験において、セリン（グリシンの前駆体）を補給した後、ＮＡＦＬＤ患者においてＨＳが有意に減少するのに対して、肝機能のマーカーは有意に改善されることが見出された。

解糖の分岐に由来するセリンはグリシンに変換することができ、それは次にＴＨＦを用いて一炭素代謝のための炭素単位を提供する。ＮＡＦＬＤ患者及び対照は同様の葉酸レベルを有することが以前に示されており、したがって本発明者らは、ＴＨＦがグリシン生合成を制限している可能性は低いと結論する。

空腹状態における遊離脂肪酸（ＦＡ）の放出増加は、肥満及びＮＡＦＬＤなどの関連障害の既知の特徴である（Ｋａｒｐｅ ｅｔ ａｌ、２０１１； Ｎｅｓｔｅｌ＆Ｗｈｙｔｅ、１９６８）。本発明者らは、ＶＬＤＬの低排出と同時に肝臓へのＦＡの流入（すなわち、高純脂肪流入（ＮＦＩ））がフラックスに大きな影響を与えることを示した。ＧＳＨ代謝回転、並びに脂肪酸化の増加、酸化的リン酸化の増加とそれに続く酸素需要の増加及びケトジェネシスの増加は、高いＮＦＩと強く相関していた。

したがって、ＧＳＨ、ＮＡＤ＋、酸化的リン酸化、酸素消費及びケトン産生の増加は、すべて高ＨＳに対処するために理想的には満たされるであろうすべてのモデル予測要求である。基質の濃度が減少しているためにこれらの要求のいずれもがインビボで容易には満たすことができない場合、細胞の健康が危うくなる可能性がある。例えば、高ＨＳにおけるＧＳＨの予測需要がＧＳＨの供給の増加によって満たされない場合、レドックスバランスは高ＨＳにおける正常な細胞の健康にとって不十分であるという危険にさらされる可能性がある。実際、本発明者らは、ＧＳＨの形成に関与する酵素の発現が肥満被験体において有意に低いことを示した。シミュレーションがＨＳの増加に対する肝臓の理想的な応答、脂肪酸化の上方制御並びにＧＳＨ及びＮＡＤ＋の利用可能性の増加を実証したことを考慮すると、ＮＡＦＬＤ被験体に治療戦略を提供する。

この分析において可能性のある代謝ストレスのリスクが最も高い被験体は、高いＦＡ流入及びＨＳを有する被験体であった。重要なのは、ＨＳだけがＧＳＨの需要の高さを説明する単一の特徴ではなく、つまりＨＳが高い人が必ずしも危険にさらされているわけではないことを意味する。代謝窮迫は、高いＮＦＩ及びＦＡ流入のみと十分に相関すると予測されたので、したがって、高いＨＳであるが低いＦＡ流入を有する被験体は必ずしも疾患の危険性があるわけではないと主張することができる。事実、肝臓内の脂質小滴の拡大は、過剰なＦＡを処理する１つの方法である。このように、ＨＳプロセス自体は理論的には肝臓の代謝ストレスを減少させるのに役立ち得る。同様に、ＶＬＤＬ分泌の増加、ケトン分泌の増加及び酸化的リン酸化の増加はすべて、肝臓が過剰なＦＡを処理することができる手段である。

マウスにおけるシステムレベル分析を通して、グリシンがＧＳＨのデノボ合成のための制限的基質であることが観察されている（Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ、２０１５）。無菌マウスと従来飼育マウスを比較した最近の研究では、腸内微生物叢が胃腸管に沿ったＡＡの分布を変え、宿主に対する遊離ＡＡのバイオアベイラビリティに影響を与えることが示された（Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ、２０１５ｂ）。ＡＡ、特にセリン及びグリシンの利用における微生物により引き起こされる不均衡が宿主の生物学的機能に影響を及ぼし得ることもまた示されている。さらに、腸内微生物叢の存在は、肝臓、脂肪及び胃腸管組織におけるＮｎｔの発現の増加、並びに血漿及び肝臓グリシンレベルの平行した減少をもたらした。

本開示のデータは、脂肪組織からのＦＡ放出の増加及び肝臓からのＶＬＤＬ分泌の減少が肝臓の代謝ストレスを高めることを示している。したがって、ＨＳを有する被験体におけるＨＳの程度と共に脂肪組織からのＦＡ放出を考慮することは臨床的価値がある。

結論として、パーソナライズされたゲノムスケールの代謝モデリングはＮＡＦＬＤの進行に関与する分子メカニズムを解明するために使用されており、予測は追加の血漿メタボロミクスデータを生成することによって検証されている。さらに、マウス及びヒトにおける概念実証試験は、ＮＡＤ＋及びＧＳＨの前駆体の補給がＨＳの予防及び治療に有用であることを示した。

上記のモデル化の結果を考慮して、本発明者らは以下の洞察に基づく治療戦略を提供した。

肝臓に蓄積した脂肪などの脂肪を除去するために、肝細胞はミトコンドリア内のβ酸化によって脂肪酸を燃焼させる。Ｌ‐カルニチンは、ミトコンドリアへの脂肪酸の輸送を促進するために補給され得る。さらに、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を補充してミトコンドリア中のβ酸化を促進することができるが、これは有毒な副生成物を生成する。肝細胞は、有害な副産物を中和する抗酸化剤を自然に産生する。酸化防止剤の形成はグリシンの利用可能性によって制限される。したがって、グリシン及び／又はセリン（グリシンの前駆体）を補足して抗酸化剤の形成を増加させることができる。グリシン及び／又はセリンを十分に補給した後、システインは抗酸化剤の形成を制限するようになる。したがって、酸化防止剤の形成をさらに増加させるために、グリシン及び／又はセリンに加えてシステイン及び／又はＮ‐アセチルシステイン（ＮＡＣ）を補給することができる。補給は有毒な副産物の中和を高めるだけではなく、脂肪酸のβ酸化も促進する。

代謝経路を考慮して、本発明者らは上記の物質に対する以下の代替物を同定した。

治療効果を得るために、４つ全ての物質を含む必要はない。しかしながら、本発明者らは、セリン（又はその１以上の代替物）を最も重要な物質として、そしてＮＲ（又はその１以上の代替物）を２番目に重要な物質として同定した。さらに、本発明者らは、最適な１日モル用量がＮＲよりもセリンに対して高いことを見出した。

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、定期的に共存し、相乗的に有害転帰を引き起こす可能性がある一般的な症状である。ＮＡＦＬＤとＴ２Ｄの両方が存在すると、糖尿病の合併症が発症する可能性が高まるだけでなく、肝硬変、肝細胞癌及び死亡を含むより重篤なＮＡＦＬＤのリスクが増大する。

脂肪肝（肝脂肪症）は、インスリン抵抗性に関連する代謝危険因子及び／又はアルコール消費の非存在下でのメタボリックシンドローム又は慢性的なアルコール乱用のいずれかによる非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及びアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）の病因における最も初期の異常である。チェックしないと、ＮＡＦＬＤとＡＦＬＤの両方が、脂肪性肝炎、線維症、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、及び最終的な死に至る。

ＮＡＦＬＤの原発性肝脂肪症は、大多数の患者における肥満、インスリン抵抗性及び／又は脂質異常症などのメタボリックシンドローム（ＭＳ）を反映する代謝危険因子と関連している。

したがって、上記の治療戦略は、ＮＡＦＬＤ及びＨＳだけでなく、ＡＦＬＤ、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性及び脂質異常症にも使用することができる。

したがって、本開示の実施形態の以下の項目別リストが提供される。

１．以下を含む組成物：
Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリン；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシスチン；
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネート、ここで
Ａ）対Ｄ）のモル比は２５０：１～１．５：１である。

２．Ａ）対Ｂ）のモル比が１６：１～１：４、例えば１２：１～１．５：１、好ましくは１０：１～３：１である、項目１に記載の組成物。

３．Ａ）対Ｃ）のモル比が１５０：１～１：１、例えば１００：１～４：１、好ましくは５０：１～８：１である、より好ましくは３０：１～１３：１である、項目１又は２に記載の組成物。

４．Ａ）対Ｄ）のモル比が１５０：１～３：１、好ましくは９０：１～１０：１、より好ましくは５０：１～２０である、項目１～４のいずれか１項に記載の組成物。

５．Ａ）がセリン、好ましくはＬ‐セリンである、項目１～４のいずれか１つに記載の組成物。

６．Ｂ）がＮ‐アセチルシステインである、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。

７．Ｃ）がカルニチンである、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。

８．Ｄ）がニコチンアミドリボシドである、前記項目のいずれか一項に記載の組成物。

９．水溶液又は懸濁液である、上記項目のいずれか１つに記載の組成物。

１０．以下を含む水溶液又は懸濁液：
Ａ）セリン；
Ｂ）Ｎ‐アセチルシステイン；
Ｃ）カルニチン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、ここで
Ａ）対Ｂ）のモル比は１２：１～１：１．５、好ましくは１０：１～３：１であり、
Ａ）対Ｃ）のモル比は１００：１～４：１、好ましくは５０：１～８：１、より好ましくは３０：１～１３：１であり、
Ａ）対Ｄ）のモル比は１５０：１～３：１、好ましくは９０：１～１０：１、より好ましくは５０：１～２０：１である。

１１．以下を含む水溶液又は懸濁液：
Ａ）セリン；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン及び／又はシステイン；
Ｃ）任意にカルニチン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、ここで
Ａ）対Ｄ）のモル比は９０：１～１０：１、好ましくは５０：１～２０：１、より好ましくは４５：１～２５：１である。

１２．Ａ）の濃度が０．２０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．４０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．６０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌである、項目９～１１のいずれか一項に記載の溶液又は懸濁液。

１３．Ｄ）の濃度が０．００６～０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０１２～０．０８ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０１８～０．０７ｍｍｏｌ／ｍｌである、項目９～１２のいずれか１項に記載の溶液又は懸濁液。

１４．Ｂ）の濃度が０．０９～０．９０ｍｍｏｌ／ｍｌ、例えば０．０９～０．５４ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．１１～０．４０ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０１３～０．３０ｍｍｏｌ／ｍｌである、項目９～１３のいずれか１項に記載の溶液又は懸濁液。

１５．Ｃ）の濃度が０．００９～０．３８ｍｍｏｌ／ｍｌ、例えば０．００９～０．１９ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０１６～０．１６ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０２８～０．３８ｍｍｏｌ／ｍｌである、項目９～１４のいずれか１項に記載の溶液又は懸濁液。

１６．項目９～１５のいずれか１項に記載の溶液又は懸濁液を含むボトルなどのパッケージ。

１７．パッケージの容積が２５～１０００ｍｌ、例えば５０～５００ｍｌである、項目１６に記載のパッケージ。

１８．被験体の治療の治療方法において使用するための、前記項目のいずれか一項に記載の組成物、溶液又は懸濁液。

１９．前記治療方法が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性及び脂質異常症からなる群から選択される病状の治療方法である、項目１８に記載の組成物、溶液又は懸濁液。

２０．前記治療方法が前記物質の経口投与を含む、項目１８又は１９に記載の組成物、溶液又は懸濁液。

２１．前記治療方法が、
Ａ）０．４８～２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば１．８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば２．９～４．６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
任意にＢ）０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．３１～１．８４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４３～１．２３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
任意にＣ）０．０３１～１．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３１～０．６２０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０６２～０．５０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０９３～０．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；及び
Ｄ）０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３９～０．３１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０５９～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量での経口投与を含む、項目２０に記載の組成物、溶液又は懸濁液。

２２．非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患、２型糖尿病又は肥満からなる群から選択される病状の治療方法であって、それを必要とする被験体に、
Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリンを、０．４８～２４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば１．８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば２．９～４．６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシスチンを、０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．３１～１．８４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４３～１．２３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシンを、０．０３１～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３１～０．６２０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０６２～０．５０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０９３～０．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネートを、０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３９～０．３１ｍｍｏｌ、例えば０．０５９～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量での経口投与を含む、上記方法。

２３．病状が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目２２に記載の方法。

２４．治療が１～１２週間、例えば２～８週間の期間行われる、項目２２又は２３記載の方法。

２５．Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリン、
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシスチン、
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシン、及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネート
を含む、被験体の治療の治療方法における同時、個別又は逐次使用のための物質。

２６．Ａ）はセリンであり、Ｂ）はＮ‐アセチルシステインであり、Ｃ）はカルニチンであり、Ｄ）はニコチンアミドリボシドである、項目２５に記載の物質。

２７．前記治療方法が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、及び脂質異常症からなる群から選択される病状の治療方法である、項目２６に記載の物質。

２８．前記治療方法が前記物質の経口投与を含む、項目２５～２７のいずれか一項に記載の物質。

２９．前記治療方法が下記の経口投与を含む、項目２８に記載の物質：
Ａ）０．４８～２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば１．８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば２．９～４．６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
任意にＢ）０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．３１～１．８４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４３～１．２３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
任意にＣ）０．０３１～１．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３１～０．６２０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０６２～０．５０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０９３～０．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；及び
Ｄ）０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３９～０．３１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０５９～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量。

Ａ）肥満度指数（ＢＭＩ）、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ‐ＩＲ）、血漿トリグリセリド（ＴＧ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴレベルは、独立して測定された肝脂肪と有意に相関している。Ｂ）被験者は、高ＨＳと低ＨＳの２つのグループに分類される。肥満度指数（ＢＭＩ）、空腹時血漿インスリン（ＦＰＩ）、血漿トリグリセリド（ＴＧ）及び血漿（ＡＬＴ）レベルは、２つの群の間で有意に異なることが見出されている。データは平均値±ＳＤとして提示されている。

肝臓の予測される細胞内フラックスと脂肪肝（ＨＳ）との間の相関を評価し、全ＶＬＤＬ産生におけるＡ）アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）及びＢ）トリグリセリド（ＴＧ）含有量と比較する。

高ＨＳを有する被験者における有意に変化した代謝産物の同定。～５２０の代謝産物の血漿レベルは、非標的メタボロミクスプロファイリングによって検出され、有意に（Ｐ値＜０．５）変化した代謝産物がヴォルカノプロットを用いて提示されている。

ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＮＮＴ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＲ）、グルタメート‐システインリガーゼ、触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、及びグルタメート‐システインリガーゼ、修飾サブユニット（ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現を１２人の肥満手術を受けた病的肥満の被験者及び７人の健康な個体から得られた肝臓で測定した。

ＮＡＤ＋及びＧＳＨ前駆体の補給はＮＡＦＬＤを予防する。１０匹のマウスを１４日間、飲料水中のＮＲ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）、セリン（３００ｍｇ／ｋｇ／日）強制経口投与及び１ｇ／ｌのＮＡＣ（Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐システイン）で処置した。図５ａ：Ａ）トリグリセリド、Ｂ）コレステロールエステル、Ｃ）セラミド、Ｄ）スフィンゴミエリン、Ｅ）ホスファチジルエタノールアミン（ホスファチジルコリンに対して正規化）を含む肝臓脂質を、西洋食を与えたマウス（ｎ＝１０）及びカクテルを補給したマウス（ｎ＝１０）で示す。Ｆ）補給前後の同じマウスの肝臓からの血清アミノ酸の定量。図５ｂ：Ｇ）マウスの肝臓から抽出したトリグリセリドの分子種の分析。対照群（未処置）からの結果は１００％として表し、処置群からの結果は対照群の％として表す。図５ｃ：ヒト血漿Ｈ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、Ｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、Ｊ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びＫ）トリグリセリド（ＴＧ）レベルを、セリンの補給前後の試験に関与した各ヒト被験者において示す。各試験被験者は、１４日間、１日当たり１回の経口用量のＬ‐セリン（２００ｍｇ／ｋｇ）を受けた。

図６は、肝細胞における脂肪酸のβ酸化に関連する生化学的経路のモデルを示し、これはセリン、ＮＡＣ、ＮＲ及びＬ‐カルニチンの補給の影響を強調している。

ＨＳを有する被験体の個別化されたモデル化を通して、本発明者らは、肝臓が蓄積された脂肪酸を肝臓中で酸化することによって、それらを除去する能力を有することを観察した。最大３段階の戦略が開発された：ｉ）ミトコンドリア中への脂肪酸の取り込みを増加させる、ｉｉ）ミトコンドリア中の脂肪酸の酸化を増加させる、及びｉｉｉ）ＧＳＨの利用可能性を増加させる（図６）。分子産物のカクテル又は組み合わせは、これらの代謝プロセスのうちの２つ以上を後押しし、最終的に肝臓中の脂肪酸の量を減らすために補足され得る。Ｌ‐カルニチン及びＮＲは、それぞれ、サイトゾルからミトコンドリアへの脂肪酸の移動を増加させるため、及びミトコンドリア中の脂肪酸酸化に必要とされるＮＡＤ＋のレベルを高めるために、カクテル又は組み合わせに含めることができる。増加した脂肪酸酸化速度と組み合わされた減少した電子伝達鎖機能は、増加したレベルの活性酸素種と組み合わされた不完全な脂肪酸酸化の生成物の蓄積をもたらす可能性があり、インスリン抵抗性に寄与し得る。これらを避けるために、カクテル又はその組み合わせの内容物にセリンとＮＡＣを含めることでＧＳＨのレベルを上げることができる。

本開示の第１の態様として、以下を含む組成物が提供される。
Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリン；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシスチン；
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネート。

第１の態様の一実施形態では、組成物はＡ）、Ｂ）、Ｃ）及び任意選択でＤ）を含む。

群Ａ）では、セリン及びグリシンが好ましい。群Ａ）の最も好ましい物質はセリンであり、これは通常Ｌ‐セリンとして提供される。以下の実験の部に示されるように、モデルによって予測されたセリンの効果は、ヒトの研究及び動物の研究において確認されている。

群Ｂ）において、Ｎ‐アセチルシステイン（ＮＡＣ）及びシステインが好ましい。群Ｂ）の最も好ましい物質はＮＡＣである。以下の実験の部に示すように、モデルによって予測されたＮＡＣの効果は動物実験で確認されている。

群Ｃ）の物質は好ましくはカルニチン、任意にカルニチン塩、例えばカルニチン酒石酸塩の形態のものである。最も好ましくは、群Ｃ）の物質は、Ｌ‐カルニチン、任意にＬ‐カルニチン塩、例えばＬ‐カルニチン酒石酸塩の形態のものである。本発明者らのモデルは、高いＨＳを有する被験体において脂肪酸の取り込みを増加させる必要があることを示している（データは示さず）。カルニチンはそのような取り込み量の増加を達成するために補給することができる。

群Ｄ）の物質は、好ましくはニコチンアミドリボシド（ＮＲ）である。下記の実験の部に示されるように、モデルによって予測されたＮＲの効果は動物実験で確認されている。

群Ａ）の物質は群Ｄ）の物質よりも高いモル量で含まれるのが好ましい。有効性及び毒性も考慮される場合（下記の用量についての考察を参照のこと）、Ａ）対Ｄ）のモル比は通常２５０：１から１．５：１の間、典型的には１５０：１から３：１の間である。好ましくは、モル比は９０：１～１０：１、より好ましくは５０：１～２０：１である。

群Ｂ）の物質を含む実施形態において、効力及び毒性を考慮すると、Ａ）対Ｂ）のモル比は、典型的には１６：１から１：４、好ましくは１２：１から１．５：１以上であり、より好ましくは１０：１から３：１の間である。

群Ｃ）の物質を含む態様において、効力及び毒性を考慮すると、Ａ）対Ｃ）のモル比は、通常１５０：１から１：１、典型的には１００：１から４：１、好ましくは５０：１～８：１、より好ましくは３０：１～１３：１である。

上記の比率は、組成物を消費する患者が適切な用量のそれぞれの物質を得ることができることを必然的に伴う。

一実施形態では、第１の態様の組成物は、固体粉末などの固体である。そのような粉末は、例えば患者／消費者、看護師、又は医師により、水と混合することができる。しかしながら、第一の態様の組成物は、好都合には、水溶液又は懸濁液（「カクテル」）であり、これは便利な経口投与を容易にする。そのような水溶液又は懸濁液は、飲む準備ができていることが好ましい。

第１の態様の特に好ましい実施形態として、以下を含む水溶液又は懸濁液が提供される。
Ａ）セリン；
Ｂ）Ｎ‐アセチルシステイン；
Ｃ）カルニチン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、
ここでＡ）対Ｂ）のモル比は１２：１～１：１．５、好ましくは１０：１～３：１であり、
Ａ）対Ｃ）のモル比は１００：１～４：１、好ましくは５０：１～８：１、より好ましくは３０：１～１３：１であり、
Ａ）対Ｄ）のモル比は１５０：１～３：１、好ましくは９０：１～１０：１、より好ましくは５０：１～２０：１である。

第１の態様の別の特に好ましい実施形態として、以下を含む水溶液又は懸濁液が提供される。
Ａ）セリン；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン及び／又はシステイン；
Ｃ）任意にカルニチン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、
ここでＡ）対Ｄ）のモル比は９０：１～１０：１、好ましくは５０：１～２０：１、より好ましくは４５：１～２５：１である。

第１の態様による溶液又は懸濁液の実施形態において、
‐Ａ）の濃度は、典型的には０．２０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．４０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．６０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌであり；及び／又は
‐Ｄ）の濃度は、典型的には０．００６～０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０１２～０．０８ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０１８～０．０７ｍｍｏｌ／ｍｌである。

第一の態様による溶液又は懸濁液に含まれる場合：
‐Ｂ）の濃度は、通常０．０９～０．９０ｍｍｏｌ／ｍｌ、典型的には０．０９～０．５４ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．１１～０．４０ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０１３～０．３０ｍｍｏｌ／ｍｌであり；
及び／又は
‐Ｃ）の濃度は、通常０．００９～０．３８ｍｍｏｌ／ｍｌ、典型的には０．００９～０．１９ｍｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．０１６～０．１６ｍｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．０２８～０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌである。

第１の態様の溶液又は懸濁液は、便利な取り扱い及び流通のために包装で提供されてもよい。さらに、そのような包装の容積は、一度に又は１日の間に包装の全内容物を飲むことが、溶液又は懸濁液中の適切な用量の物質の経口投与をもたらすようなものであり得る。一実施形態では、パッケージの容積は２５～１０００ｍｌである。容積は５０～５００ｍｌが好ましい。消費者／患者が１日に２つ以上のパッケージを飲まなければならないと意図される場合、その容積は典型的には比較的少なく、例えば２５～５００ｍｌ、好ましくは２５～４００ｍｌである。

一実施形態では、包装された溶液又は懸濁液は４８～４７８ミリモルのＡ）を含む。それによって、Ａ）の用量は有効であるが毒性はない。好ましい実施形態では、Ａ）は５～５０ｇ、より好ましくは１０～５０ｇの量のセリンである。

補足的な実施形態の代替において、包装された溶液又は懸濁液は、Ｄ）がＮＲであるとき２．０～３９．２ｍｍｏｌのＤ）を、及びＤ）がＮＲでないとき２．０～１９６ｍｍｏｌのＤ）を含む。それによって、Ｄ）の用量は有効であるが毒性はない。好ましい実施形態では、Ｄ）は０．５～１０ｇ、より好ましくは１．５～６ｇの量のＮＲである。

第一の態様の組成物が粉末であるとき、それは包装されてもよい。上記の議論から、そのような粉末のパックは、Ｄ）がＮＲであるとき４８～４７８ミリモルのＡ）及び／又は２．０～３９．２ミリモルのＤ）を、及びＤ）がＮＲでないとき２．０～１９６ミリモルのＤ）を含み得ることが分かる。さらに、そのような充填粉末は、好ましくは５～５０ｇの量のセリン及び／又は０．５～１０ｇの量のＮＲを含む。より好ましくは、そのような充填粉末は、１０～５０ｇの量のセリン及び／又は１．５～６．０ｇの量のＮＲを含む。

本開示の物質は、好ましくは第一の態様の組成物、溶液又は懸濁液の大部分である。例えば、群Ａ）～Ｄ）に含まれる物質は、第一の態様の組成物、溶液又は懸濁液の乾燥重量の少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％に達することがある。一実施形態において、セリンの重量は、第一の態様の組成物、溶液又は懸濁液の乾燥重量の少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、例えば少なくとも４０％である。

第１の態様の組成物は、１つ又は複数の甘味料（たとえばスクラロース）及び／又は１つ又は複数の香味剤などの１つ又は複数の呈味剤を含むことができる。それはまた、ポリエチレングリコール潤滑剤（例えば、Ｐｏｌｙｇｌｙｋｏｌ ８０００ ＰＦ（Ｃｌａｒｉａｎｔ））のような潤滑剤を含んでもよい。

上記の説明から、組成物は治療目的に使用できることがわかる。本開示の第２の態様として、被験体の治療の治療方法に使用するための第１の態様による組成物、溶液又は懸濁液が提供される。

治療方法は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性及び脂質異常症からなる群から選択される病状の治療方法であり得る。

好ましい態様において、治療方法は、ＮＡＦＬＤ及びＡＦＬＤからなる群より選択される病状の治療方法である。特に好ましい実施形態では、治療方法は、ＮＡＦＬＤと呼ばれる一群の状態の一部である、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療方法である。ＮＡＳＨは通常、ＮＡＦＬＤの最も極端な形態であると考えられており、しばしば肝硬変の主な原因と見なされている。

第２の態様の実施形態では、治療方法は前記組成物、溶液又は懸濁液の経口投与を含む。

人体において毒性レベルに達することなく治療効果を達成するために、本発明者らは、本開示の物質について以下の用量を見出した。
Ａ）セリンによって代表される
１日量の範囲：５０～２０００ｍｇ／ｋｇ（０．４７８～２４ｍｍｏｌ／ｋｇ）、単回投与量は５００ｍｇ／ｋｇ（４．７８ｍｍｏｌ／ｋｇ）を超えないことが好ましい
推奨用量：４００ｍｇ／ｋｇ／日（３．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）
Ｂ）Ｎ‐アセチルシステイン（ＮＡＣ）で代表される
１日量の範囲：５０～５００ｍｇ／ｋｇ（０．３０６～３．０６ｍｍｏｌ／ｋｇ）
推奨用量：１００ｍｇ／ｋｇ／日（０．６１３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）
Ｃ）Ｌカルニチンによって代表される
１日量の範囲：５～２００ｍｇ／ｋｇ（０．０３１～１．２４ミリモル／ｋｇ）
推奨用量：３０ｍｇ／ｋｇ／日（０．１８６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）
Ｄ）ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）で代表される
１日量の範囲：５～１００ｍｇ／ｋｇ（０．０１９６～０．３９２ｍｍｏｌ／ｋｇ）^＊
推奨用量：３０ｍｇ／ｋｇ／日（０．１１８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日）
^＊Ｄ）がＮＲではない場合、１日量の範囲は０．０１９６‐１．９６ミリモル／ｋｇである。

したがって、第２の態様の治療方法は例えば以下の経口投与を含み得る。
Ａ）０．４８～２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、典型的には０．４８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、好ましくは１．８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、より好ましくは２．９～４．６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
任意にＢ）０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、好ましくは０．３１～１．８４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、より好ましくは０．４３～１．２３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
任意にＣ）０．０３１～１．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、典型的には０．０３１～０．６２０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、好ましくは０．０６２～０．５０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、より好ましくは０．０９３～０．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；及び／又は
Ｄ）０．０１９６～１．９６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、典型的には０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、好ましくは０．０３９～０．３１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、より好ましくは０．０５９～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量、ただしＤ）がＮＲである場合、用量は０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日以下である。

１日量は、消費者／患者に１日当たり１回以上の投与量を投与することによって達成することができる。例えば、患者は、１日に１回、２回又は３回、上記の溶液又は懸濁液の飲料を摂ることができる。各用量又は飲料は、好ましくは４．７８ｍｍｏｌ／ｋｇ以下のＡ）を含む。

第二の態様の治療方法は、１～１２週間、例えば２～８週間、好ましくは３～８週間の期間実施することができる。治療が長期間行われると、副作用の危険性が高まる。より短い期間は治療効果にとって十分ではないかもしれない。

本開示の第３の態様として、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝疾患、２型糖尿病又は肥満からなる群から選択される病状の治療方法が提供され、それを必要としている被験体への以下のものの経口投与を含む：
Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリンを、０．４８～２４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば１．８～４．８ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば２．９～４．６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシスチンを、０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．３１～１．８４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．４３～１．２３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシンを、０．０３１～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３１～０．６２０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０６２～０．５０ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０９３～０．３７ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で；
Ｄ）ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネートを、例えば０．０１９６～１．９６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０３９～０．３１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日、例えば０．０５９～０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量で、ただし
Ｄ）がＮＲである場合、用量が０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日以下であることを条件とする。

第１及び第２の態様の実施形態及び例は、必要な変更を加えて第３の態様にも当てはまる。

患者／消費者にとって、本開示の物質を同時に摂取する必要はない。物質が別々に又は連続的に、好ましくは１日以内に、より好ましくは１時間以内に摂取される場合にも治療効果が達成され得る。

本開示の第４の態様として、被験体の治療の治療方法における同時、個別又は逐次使用のための、以下のものを含む物質が提供される。
Ａ）セリン、グリシン、ベタイン、Ｎ‐アセチルグリシン、Ｎ‐アセチルセリン、ジメチルグリシン、サルコシン及び／又はホスホセリン；
Ｂ）任意にＮ‐アセチルシステイン、システイン及び／又はシステイン；
Ｃ）任意にカルニチン、デオキシカルニチン、γ‐ブチロベタイン、４‐トリメチルアンモニオブタナール、３‐ヒドロキシ‐Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６‐トリメチル‐Ｌ‐リシン及び／又はリシン；及び
Ｄ）ニコチンアミドリボシド、キノリネート、デアミノ‐ＮＡＤ＋、ニコチネートＤ‐リボヌクレオチド、ニコチンアミドＤ‐リボヌクレオチド、ニコチネートＤ‐リボヌクレオシド、ニコチンアミド及び／又はニコチネート。

第４の態様は、例えば、Ａ）を含む第１のユニット、Ｄ）を含む第２のユニット、任意にＢ）を含む第３のユニット、及び任意にＣ）を含む第４のユニットなどの２つ以上のユニットの組み合わせ製剤であり得る。

第１及び第２の態様の実施形態及び例は、必要な変更を加えて第３から第４までの態様に適用される。

実験
実験手順
被験者
ＨＳに対する肝臓の反応を研究するために、さまざまな程度のＨＳを有する８６人の被験者を募集した。被験者の臨床的特徴を表１に示す。また、肥満外科手術を受けた病的肥満の１２人の被験者からの肝臓組織サンプルを収集した。病的肥満被験者の特徴を表２に示す。同定された標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を肥満及び健康な被験者の肝臓において測定した。肝臓に対するセリンの効果を示すために、さらに６人の被験者を募集し、セリン補給前後の被験者の特徴を表３に示す。本試験に含まれる被験者は、ウイルス性肝炎、危険なアルコール摂取、代謝障害（例、ヘモクロマトーシス）などの他の慢性の肝疾患の除外を含むＮＡＦＬＤのすべての基準を満たした。

表１ ８６人の試験参加者の臨床的特徴。データは平均値±ＳＤとして提示されている。Ｐ値は、低脂肪肝及び高脂肪肝（ＨＳ）の被験者間の有意差のレベルを示す。

表２ 高ＨＳの肥満手術を受けた１２人の肥満被験者の臨床的特徴。データは平均値±ＳＤとして提示されている。

表３ セリン補給試験に関与した６人の被験者の臨床的特徴。データは平均値±ＳＤとして提示されている。Ｐ値は、セリンの経口補給前後の有意差を示す。

肝脂肪、皮下脂肪及び腹腔内脂肪の測定
磁気共鳴実験は、３つの１．５Ｔ臨床撮像装置（１×Ｓｏｎａｔａ及び２×Ａｖａｎｔｏ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して実施した。肝脂肪含有量はプロトン磁気共鳴分光法を用いて決定し、皮下腹部及び内臓の脂肪は磁気共鳴画像法によって測定した（Ａｄｉｅｌｓら、２００６年； Ｌｕｎｄｂｏｍら、２０１１年）。

フラックスデータの測定
安定同位体注入を使用して、絶食した被験者のうち７３人においてリポタンパク質のフラックスを測定した。ｄ３‐ロイシン及びｄ５‐グリセロールのボーラス注入の後、大きい（ＶＬＤＬ１）及び小さい（ＶＬＤＬ２）ＶＬＤＬサブ画分を超遠心分離により単離し、血漿中の遊離ロイシン、アポＢ中のロイシン及びＴＧ中のグリセロールの濃縮をガスクロマトグラフィー‐質量分析（Ａｄｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ、２００５）を用いて測定した。代謝フラックスは、以前に記載されたように数学的モデリングを使用して計算された（Ａｄｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ、２００５）。

筋肉量と体脂肪量の計算
各被験者の筋肉量は、彼らの体脂肪量に基づいて以前に記載された関係（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ、２０１４）を用いて除脂肪量から計算された。残りの２９人の被験者における体脂肪量の不足を予測するために、ＢＭＩと被験者の４４人の体脂肪量との間に線形式を当てはめた。線形式は次のように定義された：脂肪量（ｋｇ）＝１．７６３＊ＢＭＩ－２６．７５（Ｒ＾２＝０．６９）。この式を用いて、２９人の被験者について体脂肪量を計算し、次いで、それらの被験者の体重から体脂肪量を差し引くことによって除脂肪体重を計算した。最後に、各被験者の筋肉量を、以前に導き出された式（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ、２０１４）に基づいて計算した：筋肉量＝０．６３＊除脂肪量－４．１。

空腹時の肝臓ＧＥＭの入力と出力
空腹時には、肝臓は糖新生基質、非エステル化ＦＡ及びＡＡを摂取し、血糖（脳のエネルギー基質として）、ＶＬＤＬ（体の他の部分のエネルギー基質として）、ケトン体及び血漿タンパク質を産生する 。肝臓によって分泌されるタンパク質（主にアルブミン）は、タンパク質をリサイクルすることができるので、必ずしも肝臓にとっての純損失ではない。しかしながら、この試験では、尿からの尿素の喪失を肝臓からのタンパク質の正味の喪失の代用として使用した。

したがって、モデルの入力変数は、ｉ）ＡＡ、ｉｉ）乳酸塩、及びｉｉｉ）ＦＡ及びグリセロールである。出力変数は、ｉｖ）糖新生及びグリコーゲン分解に由来するグルコース、ｖ）ケトン体、並びに測定されたＶＬＤＬ分泌である。

ｉ）ＡＡ
空腹状態では、いくつかのＡＡは筋肉組織によって放出される。Ｐｏｚｅｆｓｋｙら（Ｐｏｚｅｆｓｋｙら、１９７６）は、絶食状態における筋肉組織からのＡＡ放出を実験的に定量した。彼らは、筋肉から放出される全ＡＡの約６０％がグルタミンとアラニンであり、これらが肝臓の糖新生に使われる主要な基質であることを発見した。これらの実験的に測定された値は、各被験者の筋肉量に基づいてモデルに組み込まれた。

脂肪組織はまたＡＡを血中に放出する。本試験における被験者は様々な程度の肥満を有していたので、ＡＡの放出が痩身被験者と肥満被験者とで異なるかどうかを知ることは重要である。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２００２年）は、ＡＡの放出は人が持っている脂肪組織の量に比例するが、それは血流にも依存し、それは脂肪組織の量が増えるにつれて減少することを見出した。したがって、脂肪組織からのＡＡの放出は肥満と無関係である。したがって、脂肪組織量に基づくＡＡの追加の入力がモデルに含まれた。この寄与はＦｒａｙｎ及びＫａｒｐｅ（Ｆｒａｙｎ＆Ｋａｒｐｅ、２０１４）の研究に基づいて計算され、そこで彼らは脂肪組織に出入りする血液量を測定した（３‐４ ｍｌ／分、１００ｇ脂肪組織）。

別の方法（Ａｒｄｉｌｏｕｚｅ ｅｔ ａｌ、２００４）は、ＢＭＩ、性別及び年齢に基づいて、次の式に従ってヒトの体脂肪量に関する情報を提供した。体脂肪率＝（１．２＊ＢＭＩ）＋（０．２３＊年齢）－（１０．８＊性別）－５．４、ここで、性別は女性が０人、男性が１人である（Ｄｅｕｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、１９９１）。これにより、平均体脂肪量が約１５ｋｇとなり、脂肪組織全体の平均血流が約３１．５Ｌ／時間となった。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、２００２）は体脂肪に基づくＡＡの放出についての値（μｍｏｌ／Ｌ）を提供しているので、脂肪組織によるＡＡの放出（ｍｍｏｌ／時間）は各被験者について計算され、個別化モデルへの入力として使用された。

筋肉組織及び脂肪組織は、飢餓時の肝臓に対するＡＡの唯一の供給源ではありません。ラット肝臓は飢餓の最初の２４時間の間に全細胞内タンパク質の約２５％を異化することが示されている（Ｃｕｅｒｖｏ＆Ｄｉｃｅ、１９９６）。本分析において、筋肉及び脂肪組織から放出された総ＡＡは、ＡＡに対する肝臓の要求を満足させないようである。１６時間の絶食中、ヒトで測定された尿素排泄率は３９２±４４ｍｍｏｌ尿素／２４時間であった（Ｎｏｒｒｅｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ、２００１）。ＡＡ当たり１．４５個の窒素原子の平均窒素含有量及び１３６．５ｇ／ｍｏｌの平均ＡＡモル質量を仮定すると、１６時間の絶食後の肝臓におけるＡＡの消費は、したがって平均して８０ｇ／日近く（３９２ｍｍｏｌ／２４ｈ＊１３６．５ｇ／ｍｏｌ／１０００／１．４５＝７７．６ｇＡＡ／日）であった。この値は、絶食の４０時間後（４４０ｍｍｏｌ／２４時間）でほぼ一定であり、絶食中の肝臓におけるＡＡ消費の維持（又は増加さえも）を示している。筋肉及び脂肪組織によって放出されるＡＡの総量は、３５ｇ／日に近いと計算され、本試験では、肝臓はそれ自体比較的大量に‐約４０～４５ｇ／日で異化する可能性があることを示している。ヒト肝臓のＡＡ組成は、Ｂｅｎｇａ＆Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ（Ｂｅｎｇａ＆Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ、１９９５）によって測定されている。現実的なＡＡ純消費量の値を達成するために、肝臓中のＡＡのモル比をモデルへの追加の投入反応に組み込んだ。

ｉｉ）乳酸
乳酸は肝臓の糖新生基質として使われる。Ｗａｌｌａｃｅ（Ｗａｌｌａｃｅ、２００２）は、安静状態を仮定すると、赤血球、腎臓、髄質及び網膜によって産生される乳酸塩の総量は１日あたり約４０ｇであると主張した。さらに、体の他の部分から余分な４０ｇが産生され、合計で約８０ｇになる。これは約３．３ｇ／時間＝３７ｍｍｏｌ／時間に相当し、モデルへの入力として使用された。

ｉｉｉ）ＦＡとグリセロール
ＦＡは、ＶＬＤＬ中のＴＧの産生のために肝臓によって使用される。グリセロールは、ＴＧ分解とそれに続く脂肪組織によるＦＡ放出の副産物であり、糖新生基質として使用することができる。脂肪組織からのＦＡ及びグリセロール放出は、ＭｃＱｕａｉｄらによる研究（ＭｃＱｕａｉｄ ｅｔ ａｌ、２０１１）に基づいて推定され、脂肪組織からのＦＡ及びグリセロール放出の値は、絶食状態の各被験者について検索された。この平均値は、約３０μｍｏｌ／分、ｋｇ脂肪質量であり、これは１．８ｍｍｏｌ／時間、ｋｇ脂肪質量に等しい。グリセロール放出対ＦＡ放出のモル比は１：３であるので、グリセロール放出は０．６ｍｍｏｌ／時間、ｋｇ脂肪質量として設定された。これらの値は両方とも上限と見なされた。しかしながら、Ｂｉｃｋｅｒｔｏｎら（Ｂｉｃｋｅｒｔｏｎら、２００７）は、絶食中の被験者における筋肉への総ＦＡ流入を測定し、脂肪組織によって放出されたＦＡの約４％のみが筋肉によって取り込まれることを見出した。したがって、１．８ｍｍｏｌ／時間の放出ＦＡをモデルへの入力として使用した。

ｉｖ）糖新生及びグリコーゲン分解
乳酸、グルタミン、アラニン、グリセロールが主な糖新生基質である。もう一つのグルコース源はグリコーゲン分解である。ＭｃＱｕａｉｄら（ＭｃＱｕａｉｄら、２０１１）及びＨｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎら（Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎら、１９９７）は、通常の夜間絶食条件下では、糖新生及びグリコーゲン分解の肝臓グルコース産生量への寄与はほぼ等しいことを報告した。ＭｃＱｕａｉｄら（ＭｃＱｕａｉｄら、２０１１）はまた、一晩の絶食後のヒトにおけるグリコーゲン分解は約５．５μｍｏｌ／ｋｇ／分であることを見出した。これは、本試験における被験者に対するグリコーゲン分解からの平均貢献度約５．７ｇグルコース／時間に相当する。ケトン体の産生量がまだ低いときには、脳は空腹時の早い時期に約６ｇのグルコース／時間を必要とする（Ｂｏｕｒｒｅ、２００６）。これは、一晩の絶食状態の間、肝臓からの全グルコース出力が１０～１５ｇ／時間のオーダーであり、それは明らかに６ｇ／時間より高いことを示唆している。結論として、グルコース産生量に対する糖新生の絶対最小寄与は１６．７ｍｍｏｌ／時間（３ｇ／時間）として設定された。

ｖ）ケトン体
肥満のヒトにおける総ケトン体産生量は、２～３日の絶食後最大約６０ｍｍｏｌ／時間及び１７～２４日の絶食後最大約７５ｍｍｏｌ／時間に劇的に増加する（Ｒｅｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ、１９７４）。しかし、夜間の断食の間、グリコーゲン分解は脳のエネルギー需要の大部分を満たすはずであり、それゆえアセト酢酸とβ‐ヒドロキシ酪酸のケトン体産生率はモデルの下限０．１ｍｍｏｌ／時間に設定された。

肝組織のための個別化ゲノムスケール代謝モデル
肝臓中の肝細胞の機能的ＧＥＭであるｉＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ２３２２は、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ＨＰＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）の肝細胞特異的プロテオミクスデータに基づいて再構築された（Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１５）。ｉＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ２３２２をフラックスバランス分析と組み合わせて使用することで、試験に参加した各被験者について肝臓のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ代謝シミュレーションが可能になった。主要な代謝産物の測定／計算された取り込み及び分泌速度を各ＧＥＭに組み込み、各患者の細胞内肝臓フラックスを予測した。肝組織ＧＥＭの個別化シミュレーションの間、モデルによる酸素、リン酸塩、ミネラルなどの摂取は許可され、空腹状態がシミュレートされたので他の代謝産物の摂取は阻止された。すべての境界を設定した後、すべての被験者のフラックスは、セルが経済的な理由から経路使用量を最小限に減らすという仮定に基づいて、フラックスの合計を最小化することによって計算された。結果のロバスト性をテストするために、フラックスの合計を最小にすることなくランダムサンプリングによってフラックスも計算され、同じ重要な結果が観察された。

個人化された入力及び出力（ＦＡの取り込み及びＶＬＤＬ分泌）の本発明者らの結論への寄与を調査するために、ランダムコントロール分析（全患者の最大値及び最小値の範囲でのランダム値）を実施した。個別化モデルへの入力又は出力としてランダムＦＡ取り込み又はＶＬＤＬ分泌を単独で使用すると、ＮＮＴ及びＧＳＲ及びＨＳによってもたらされる反応の間の相関が有意に減少することが見出された。さらに、ランダムなＦＡ取り込みとＶＬＤＬ分泌の両方を使用した場合、相関は有意ではなくなった。このように、個別化されたインプットとアウトプットの両方が試験で達成された結論を導いていると結論付けられた。

メタボロミクスデータ
非標的代謝産物の検出及び定量化は、様々な程度のＨＳを有する被験者から収集された空腹時血漿サンプルに対して、メタボロミクスプロバイダーＭｅｔａｂｏｌｏｎ Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ＵＳＡ）によって行われた。サンプルは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙからの自動化ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ（登録商標）システムを用いて調製した。品質管理目的で、抽出プロセスの最初のステップの前に回収標準が追加された。タンパク質及びタンパク質に結合した又は沈殿したタンパク質マトリックスに捕捉された解離した小分子を除去し、そして化学的に多様な代謝産物を回収するために、２分間激しく振盪しながらタンパク質をメタノールで沈殿させ（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ ２０００）、その後遠心分離した。得られた抽出物を４つの画分に分けた：１つは陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つは陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を用いたＵＰＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる分析用、１つはＧＣ‐ＭＳによる分析用、一つのサンプルはバックアップ用に保存した。

対数変換後、各化合物の最小観測値で、ウェルチの２標本ｔ検定を使用して、高及び低ＨＳの被験者間で有意に異なる代謝物を特定した。Ｐ値は多重検定用に補正した。有意な代謝産物及び有意に相関した代謝産物の同定中に、欠測値に関してデータは帰属されなかった。代謝産物間の相関分析は、両方の代謝産物が試験に関与する少なくとも３０人の被験者において検出された場合に行われた。

マウス実験
２０匹のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに標準的なマウス用固形飼料（Ｐｕｒｉｎａ ７０１２、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ）を与え、１２時間の明暗サイクルで飼育した。８週齢から、マウスに１４日間西洋食（ＴＤ．８８１３７、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＷＩ、米国）を与えた。次いでマウスを１０匹のマウスの２つの群に分けた。マウスの１つの群には、１日強制経口投与でＮＲ（４００ｍｇ／ｋｇ）及びセリン（３００ｍｇ／ｋｇ）及び１４日間飲料水中のＮＡＣ（１ｇ／ｌ）を補った西洋食を与えた。他のグループは１４日間西洋式食事のみを与えられた。すべての手順は地元の動物倫理委員会によって承認され、強制されたガイドラインに従って行われた。

脂質の抽出と分析
脂質は、以前に記載されたように抽出した（Ｌｏｆｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１２）。抽出中に内部標準が追加された。記載されているように（Ｓｔａｈｌｍａｎら、２０１３）、ＨＰＬＣ及び質量分析法の組み合わせを用いて脂質を分析した。手短に言えば、直線相ＨＰＬＣを用いてセラミド（ＣＥＲ）を精製した。ロボット型ナノフローイオン源、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＪ）を備えたＱＴＲＡＰ５５００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、カナダ）を用いて、コレステリルエステル（ＣＥ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を定量した。三重四重極Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結した逆相ＨＰＬＣを用いてＣＥＲを分析した。

ヒト試験：セリンの補給
ＨＳ及び空腹時の肝機能の血漿マーカーレベルに対するセリンの短期間の食事補給の効果を、高ＨＳの６人の被験者において評価した。補給前後の６人の被験者の特徴を表３に示す。各患者は、１日当たり～２０ｇのＬ‐セリン（２００ｍｇ／ｋｇ）の１回経口投与を１４日間受けた。

結果
ＨＳの程度が異なる被験者の特徴
８６人の被験者（男性７５人及び女性１１人）を募集し、各被験者の肝臓脂肪含有量を磁気共鳴分光法を用いて決定した（Ａｄｉｅｌｓら、２００６年； Ｌｕｎｄｂｏｍら、２０１１年）。ＨＳと他の臨床パラメータとの間のピアソン相関係数（ｒ）を計算したところ、ＨＳは体重、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ‐ＩＲ）、血漿トリグリセリド（ＴＧ）、及び肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルと有意に（Ｐ値＜０．０５）正相関していた（図１Ａ）。ＡＬＴ対アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の比もまた、ＨＳと有意に相関した（Ｐ値＜０．０５）（ｒ＝０．５７）。他の肝臓関連臨床パラメータ（ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びγ‐グルタミルトランスフェラーゼ（μＧＴ））、血中脂質関連パラメータ（高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、総コレステロール及びアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ））も炎症マーカーＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）もいずれもＨＳと有意に相関しなかった。

様々な程度のＨＳを有する被験者を、それらの肝脂肪率に基づいて４３人の被験者の２つのグループに分類した：高ＨＳ（＞５．５％）及び低ＨＳ（＜５．５％）（表１）。高ＨＳを有する被験者は、より大きなＢＭＩを伴って有意に（Ｐ値＜０．０５）より重いことが見出された。空腹時血漿グルコース及び空腹時血漿インスリン（ＦＰＩ）濃度は、低ＨＳを有する被験者と比較して高ＨＳを有する被験者において有意に高かった（Ｐ値＜０．０５）（図１Ｂ）。平均血漿ＴＧ濃度は、高ＨＳ及び低ＨＳの被験者でそれぞれ２．０５ｍｍｏｌ／Ｌ及び１．６７ｍｍｏｌ／Ｌであった（図１Ｂ）。アポＢ、ＨＤＬコレステロール及び総コレステロールを含む他の脂質パラメータにおいて、有意な血漿の差異は検出されなかった（表１）。ＡＬＴレベルは、高ＨＳを有する被験者において有意に高かった（図１Ｂ）。要約すると、この試験に関与した低ＨＳの平均被験者は、太り過ぎの、境界線の高トリグリセリド血症であるがインスリン感受性であったが、高ＨＳの平均被験者は肥満、高トリグリセリド血症及びインスリン抵抗性であったがＴ２Ｄを有さなかった。

個別化肝臓組織ＧＥＭ
ＨＳの根底にある分子メカニズムを解明するために、制約ベースのモデリング技術を採用して、さまざまな程度のＨＳを有する被験者間の主要な肝臓代謝変化を同定した。脂肪及び筋肉組織からの非エステル化脂肪酸（ＦＡ）及びアミノ酸（ＡＡ）の分泌速度は、各被験者の体組成に基づいて計算され、赤血球によって分泌される乳酸塩と共に個別化肝臓ＧＥＭへの入力として使用された。ＴＧに富む超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）のレベルが血漿ＴＧの主要な決定要因であるので、安定同位体及びマルチコンパートメントモデリングを用いた速度論的研究を組み合わせて試験に参加した７３人の被験者（６５人の男性及び８人の女性）でＶＬＤＬ速度論のパラメータを推定した。分泌されたＶＬＤＬとＨＳとの間に有意な相関関係（ｒ＝０．５８１、Ｐ値＜０．００１）が観察され、ＶＬＤＬの分泌速度を個別化肝臓ＧＥＭの目的関数として使用した。

増加したＨＳに対する肝臓代謝の所望の動態は、個別化ＧＥＭの制約として入力及び出力を用いてシミュレートされた。各被験体の肝臓における細胞内フラックスを予測し、各被験者の細胞内フラックスとＨＳとの間のピアソン相関係数を計算した。タンパク質合成に関与する反応がＨＳと最も高い相関を有することが見出された（ｒ＝０．５７、Ｐ値＜０．００１）。肝臓によって産生された全ＶＬＤＬ中のアポＢ含有量もまた定量化され、それが測定されたＨＳと有意に相関することが見出された（ｒ＝０．５８１、Ｐ値＜０．００１）（図２Ａ）。この相関は、生成された全ＶＬＤＬ中のＴＧ含有量と測定されたＨＳとの間に観察されたものと非常に類似していた（ｒ＝０．５７６、Ｐ値＜０．００１）（図２Ｂ）。それ故、個別化されたＧＥＭは増加したＨＳに対する肝臓の応答を予測することができることが観察された。

ＨＳとの２番目と３番目に高い相関を有する反応は、それぞれ、Ｈ_２Ｏ_２の還元に関与する反応（ｒ＝０．４８２、Ｐ値＜０．００１）及びニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＮＮＴ）に関連する反応（ｒ＝０．４７９、Ｐ値＜０．００１）であった。ＮＮＴは、ミトコンドリアにおけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ＋のＮＡＤ＋及びＮＡＤＰＨへの相互変換を触媒する。ＮＡＤＰＨは、グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＲ）によって触媒されるグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）の還元を介してグルタチオン（ＧＳＨ）の再生に使用されるので、脂肪酸化のためのＮＡＤ＋並びに酸化還元解毒のためのＮＡＤＰＨを提供することにおいてＮＮＴは重要な役割を果たす。特に、ＧＳＲと関連する反応によって運ばれるフラックスは、ＨＳと最も高い相関を有するもののうちの１つであることが見出された（ｒ＝０．４７８、Ｐ値＜０．００１）。さらに、脂肪酸化に関与する反応がＨＳと有意に相関することが見出された（ｒ＝０．４７７、Ｐ値＜０．００１）。ＮＮＴ及びＧＳＲによって触媒される反応によって運ばれるフラックスの増加は、増加した脂肪酸化に必要な追加のＮＡＤ＋及び増加した脂肪酸化から生じる過剰に生成された活性酸素種を除去するために必要なＧＳＨを生成する。ＮＮＴが正常な細胞代謝及び酸化ストレスに対するミトコンドリア防御に必須であることは以前に報告されている（Ｈｕａｎｇら、２００６）。さらに、ＨＳと分泌型ケトン体との間に有意な相関が観察され、これらは肝臓ＧＥＭの主要な産出物の１つである（ｒ＝０．４７５、Ｐ値＜０．００１）。

ＨＳは、ＦＡのデノボ合成、酸化、取り込み及び輸出の間の不均衡に起因する（Ｔａｍｕｒａ＆Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、２００５）。したがって、各被験者の肝臓における、純脂肪流入（ＮＦＩ）として定義されるＦＡの取り込み及び分泌速度の差を計算し、細胞内フラックスとＮＦＩとの間の相関を計算した。特に、ＧＳＲ（ｒ＝０．８１２、Ｐ値＜０．００１）及びＮＮＴ（ｒ＝０．８１１、Ｐ値＜０．００１）によって触媒される反応が、ＮＦＩと最も高い相関関係を有することが見出された。過酸化物及びヒドロペルオキシドを解毒するグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）及びペルオキシレドキシン（ＰＲＤＸ）によって触媒される反応は、ＮＦＩと有意に相関する（ｒ＝０．８１２、Ｐ値＜０．００１）ことも見出された。さらに、ＮＦＩと分泌ケトン体との間に有意な相関関係（ｒ＝０．７８２、Ｐ値＜０．００１）が観察された。

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析は、理論的にはＮＮＴ、ＧＳＲ、ＧＰＸ及びＰＲＤＸによって触媒される反応によってもたらされるフラックスの増加によってＨＳの増加が補償され得ることを示した。しかしながら、フラックスの増加の要求は実際には満たされず、ＮＡＦＬＤ患者のＨＳの増加につながる。シミュレーションがＨＳの増加に対する肝臓の理想的な応答、脂肪酸化の上方制御及びＧＳＨの利用可能性の増加を実証したことを考慮すると、ＮＡＦＬＤ被験者のための治療戦略を提供し得る。

グリシンはＮＡＦＬＤにおけるＧＳＨのデノボ合成のための制限的基質である
ＧＳＨの枯渇は、ミトコンドリア機能障害及び細胞死をもたらし得る（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ‐Ｃｈｅｃａ＆Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ、２００５年；Ｇａｒｃｉａ‐Ｃａｎａｖｅｒａｓら、２０１１年）。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析に基づいて、ＮＮＴの発現の増加は脂肪酸化の増加のためにＮＡＤ＋のレベルを高めることができるが、ＮＮＴ及びＧＳＲは酸化ストレスに抵抗し、肝臓の還元環境を維持するために必要なＧＳＨのレベルを高めることができることが提案された。しかしながら、ＮＮＴ及びＧＳＲの発現はｉｎ ｖｉｖｏで連続的に増加することはできず、それはＮＡＤ＋及びＧＳＨの枯渇をもたらし、最終的には肝臓における脂肪の蓄積をもたらした。実際、ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおけるＮＡＤ＋の肝臓枯渇が報告されている（Ｇａｒｉａｎｉら、２０１６；Ｚｈｏｕら、２０１６）。さらに、健康な被験者と比較して、ＮＡＦＬＤ患者の肝臓（Ｇａｒｃｉａ‐Ｃａｎａｖｅｒａｓら、２０１１）及び血清（Ｋａｌｈａｎら、２０１１）において、より低い濃度のＧＳＨ及びＧＳＳＧの両方、並びにＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の減少が報告されている。

枯渇したＧＳＨはまた、血漿から取り込まれ得るグルタミン、グリシン及びシステインからのＧＳＨのデノボ合成によって置き換えられ得る。これらのＡＡの血漿レベルを検出するために、８６人の被験者からの血漿中の非標的メタボロミクスプロファイリングを実施し、～５２０の代謝産物のレベルを分析した。血漿代謝産物レベルとＨＳの間の相関関係を評価した。グリシン及びＮ‐アセチルグリシン並びにベタイン及びセリン（これはグリシンに変換することができる）の空腹時血漿レベルは、ＨＳと有意に負の相関を示した。ＨＳと有意に相関する血漿代謝産物間の相関係数もまた評価し、血漿グリシンレベルは他の全ての測定代謝産物の中で血漿セリンレベルと最も高い相関を示すことが見出された（ｒ＝０．７７、Ｐ値＜０．０５）。ＨＳとシステイン及びグルタミン（これらはＧＳＨのデノボ合成にも必要とされる）の血漿レベルとの間の有意な相関は検出されなかったことに留意すべきである。

また、血漿代謝物のいずれかが、それらのＨＳのレベルに従って分けられた２つの群の被験者の間に有意差を示したかどうかも調べた。グリシン、セリン、ベタイン及びＮ‐アセチルグリシンのレベルは、低ＨＳの被験者と比較して高ＨＳの被験者において有意に（ウェルシュのＴ検定、Ｐ値＜０．０５）低いことがわかった（図３）。グリシンに関連した代謝物に加えて、ＨＳと相関することが示されているブチリルカルニチン、グリシルフェニルアラニン、ガンマ‐トコフェロール（ビタミンＥ）、キヌレナート、Ｎ‐デルタ‐アセチルオルニチン、Ｎ‐メチルプロリン及び多数の脂質構造のレベルが、ＨＳの高い被験者と低い被験者の間で有意に変化する（ＷｅｌｓｈのＴ検定、Ｐ値＜０．０５）ことも見出された（図３）。

ＧＳＨ形成に関与する酵素の発現低下
ＮＡＦＬＤの発症におけるＧＳＨ代謝の重要な役割が明らかにされた。これに関連して、肥満手術を受けた高ＨＳを有する１２人の肥満被験者の別のコホートから得られたヒト肝臓サンプルにおけるＮＮＴ、ＧＳＲ及びデノボＧＳＨ合成に関与する酵素の発現（表２）を、７人の健康な個人から得られた肝臓サンプルと比較した（以前に（Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１５）に記載されている）。ＮＮＴ、ＧＳＲ及びデノボＧＳＨ合成における律速酵素、すなわちグルタミン酸システインリガーゼ、触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）及びグルタミン酸システインリガーゼ、修飾サブユニット（ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現は、健常者からよりも肥満被験者からの肝臓で有意に低かった（図４）。これは、ＮＮＴ及びＧＳＲの発現が減少するとＨＳが増加する可能性があることを示しており、これは様々な程度のＨＳを有する被験者の個別化モデリングの結果と一致する。

ＧＳＨ及びＮＡＤ＋前駆体の補給はマウスのＨＳを低下させる
分析は、高ＨＳを有する被験体におけるＮＡＤ＋及びＧＳＨの枯渇を示した。ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、トリプトファン、ナイアシン、及びニコチンアミドなどの天然ＮＡＤ＋前駆体の補給は、インビボでＮＡＤ＋レベルを上昇させることが示されている（Ｃａｎｔｏら、２０１２年； Ｈｏｕｔｋｏｏｐｅｒら、２０１０年）。ＧＳＨの血漿中及び肝臓中濃度はＮＡＦＬＤ患者では枯渇しており、ＧＳＨを補給しても増加させることはできない。その代わりに、ＧＳＨは肝臓内で新規に（デノボで）又は救済経路によって合成されなければならない。分析は、グリシンの枯渇による空腹時の高ＨＳを有する被験体において、ＧＳＨのレベルが肝臓のチオールレドックス状態を維持及び調節するのに十分ではないことを示唆した。グリシンは、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）の５，１０‐メチレン‐ＴＨＦへの同時変換を伴うセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを介したセリンの相互変換を介して合成することができる。セリンからグリシンへの変換中に、一炭素代謝のために追加の炭素単位が提供される。総合すると、ＮＲの食事補給は脂肪酸化の増加に必要なＮＡＤ＋のレベルを増加させ、セリンはグリシンのレベル及びＧＳＨのレベルを増加させる（グリシンからの細胞内ＧＳＨ合成による）と仮定された。ＮＡＤ＋及びＧＳＨのための基質の補給は、肝臓で酸化される脂肪の量を増加させ、高脂肪酸化から生じる酸化ストレスを低下させ、ＨＳのレベルを低下させ、最終的に肝機能を改善し得る。

マウスにおけるＨＳの発症に対するＧＳＨ及びＮＡＤ＋補充の効果を評価するために、セリン、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐システイン（ＮＡＣ）及びＮＲを含むカクテルを、高レベルの脂肪及びスクロースを含む西洋食を与えたマウスに補給した。セリンはグリシンに容易に変換することができるのでカクテルに含まれたが、システインはＧＳＨの合成においてグリシンの補充後の制限代謝産物であり得るのでＮＡＣが含まれた。ＮＲは、肝臓中のＮＡＤ＋の量を増やすためにカクテルに含まれていた。西洋食餌を与えられたオスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、セリン３００ｍｇ／ｋｇ／日及びＮＲ４００ｍｇ／ｋｇ／日の胃管栄養法並びに飲料水中の１ｇ／ｌのＮＡＣで１４日間処置し、マウスを最後の処置の４時間後に屠殺した。肝臓のリピドミクス分析を行い、以下のことを観察した：肝臓のＴＧの５０％の減少（図５ａ：Ａ）、コレステロールエステルのレベルの減少傾向（図５ａ：Ｂ）及びセラミド（図５ａ：Ｃ）；スフィンゴミエリンレベルが上昇する傾向（図５ａ：Ｄ）；及びホスファチジルエタノールアミンのレベルに有意な変化はなかった（図５ａ：Ｅ）。グリシン及びセリンのレベルもまた測定され、それらの血漿レベルはカクテルの補給後に有意に増加したことが見出された（図５ａ：Ｆ）。最後に、異なる鎖長を有するＴＧの肝臓レベルを測定し、ミトコンドリアにおいて優先的に酸化されるＴＧのより短い鎖長が補給後に有意に減少することが見出された（図５ｂ：Ｇ）。それ故、個別化モデリングにより予測された代謝産物の補給は肝臓中の脂肪の酸化を促進し、ＨＳを予防することが証明された。したがって、マウス試験は、ＮＡＦＬＤ進行に対する防御のための提案された治療戦略を確認した。

セリンの補給はヒトのＨＳを低下させる
ＨＳの減少におけるセリン補給の独特の寄与を確認するために、ＨＳに対するセリンの短期食餌補給の効果及び肝機能の血漿マーカーの空腹時レベルを、高ＨＳの６人の被験者において評価した。補給前後の６人の被験者の特徴を表３に示す。各患者は、１日当たり～２０ｇのＬ‐セリン（２００ｍｇ／ｋｇ）の１回経口投与を１４日間受けた。補給はすべての被験者によって十分に許容された。血漿レベル又はセリンが有意に増加し、補給後にＡＬＴ、ＡＳＴ及びＡＬＰの血漿レベルが有意に減少することが見出された（表３）。特に、ＡＬＴ（図５ｃ：Ｈ）及びＡＳＴ（図５ｃ：Ｉ）の血漿レベルは、全６人の被験者において一貫して減少し、ＡＬＰは、参加している被験者のうち５人において減少した（図５ｃ：Ｊ）。さらに、血漿ＴＧは、５人の試験被験者で減少し、残りの１人の被験者では変化しないことが分かった（図５ｃ：Ｋ）。ＨＳはまた、セリン補給前後の磁気共鳴分光法を用いて測定され、ＨＳはセリン補給後に有意に減少することが実証された（表３）。ＨＳは６人の患者全員で減少し、ＮＡＦＬＤ患者の相対的減少は１．０～２３％の範囲であった。

キャリブレーション試験
９人の健康な被験者（ＢＭＩ＜３０）を募集した。したがって、募集された被験者はＴ２Ｄ又はＮＡＦＬＤに罹患しておらず、いかなる薬物療法も受けていなかった。試験に参加するすべての被験者はインフォームド・コンセント用紙に署名した。

被験者は同じホテルに滞在し、試験中同じ朝食と昼食を摂った。これにより、医薬品の起こりうる副作用を監視することができた。

試験は毎日０８：００に始まり、補給は以下のように実施した。
１日目に、各被験者に、１ｇ（０．００３９ｍｏｌ）のＮＲを１回経口投与した。
２日目に、各被験者に、３ｇ（０．０１９ｍｏｌ）のＬ‐カルニチンを１回経口投与した。
３日目に、各被験者に、５ｇ（０．０３１モル）のＮＡＣを１回経口投与した。
４日目に、各被験体は、１回経口投与の完全医薬品、この場合は１ｇのＮＲ、３ｇのＬ‐カルニチン、５ｇのＮＡＣ及び２０ｇのＬ‐セリンを受けた。
５日目に、各被験者に、２０ｇ（０．１９ｍｏｌ）のＬ‐セリンを１回経口投与した。

完全な医薬品において、ＮＲに対するセリンのモル比は約４８：１であり、ＮＡＣに対するセリンのモル比は約６．１：１であり、Ｌ‐カルニチンに対するセリンのモル比は約１０：１であった。

１、２、３及び５日目に、補給前（０８：００）及び補給後（１２：００）に血液サンプルを採取した。

４日目に血液サンプルを８回（８時、９時、１０時、１１時、１２時、１３時、１４時、及び１５時）採取した（すべての医薬品物質の動態を理解するため）。

試験中に被験者のグルコースレベルを測定するためにグルコースモニタリング装置を使用した。

グルコース、インスリン、ガンマＧＴ、ビリルビン、ＡＬＰ、ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、ＦＦＡ、ＴＡＧ、総コレステロール、ＨＤＬ及びＬＤＬの血漿レベルを補給前後に測定した。

セリン、Ｌ‐カルニチン、ＮＡＣ及びＮＡＤ＋の血漿中濃度は、標的メタボロミクスプラットフォームを用いて測定した。

被験者は試験から離脱せず、副作用は報告されていない。

罹患患者のセリン血漿レベルは健常者のそれの約５０％であることが観察されている。従って、血漿セリンレベルの１倍の増加をもたらす経口セリン用量を見出すことが望まれていた。さらに、血漿セリンレベルの１倍の増加は、肝臓セリンレベルの有意な増加を反映すると予想された。上記で概要で論じたように、システインは、セリン（又はグリシン）の十分な補給後に抗酸化剤の形成を制限するようになる。従って、血漿ＮＡＣレベルの１倍の増加をもたらす経口ＮＡＣ用量を見出すこともまた望まれていた。最後に、上記の概要での考察から得られる、血漿Ｌ‐カルニチンレベルの１倍の増加をもたらす経口Ｌ‐カルニチン用量を見出すことが望まれていた。

胃、腸、血液を表す３コンパートメント常微分方程式（ＯＤＥ）モデルは、公開情報に基づいて開発された。モデルは実験的に測定された血漿濃度に適合した。セリン、Ｌ‐カルニチン及びＮＡＣのそれぞれについての１つのモデルは、摂取後最大２４時間の経過にわたる被験者における問題の物質の平均血漿濃度に基づいて開発された。各物質のバイオアベイラビリティは文献値に従って設定した。

各物質の血漿濃度の内挿を各被験者について構築した。内挿の平均を標的濃度曲線として使用した。モデルはその後この曲線に適合した。モデルを各物質に適合させた後、そのモデルを使用して、１日２回の補給療法を受けたときに得られた血漿濃度を予測した。物質の個々の投与量は、ヒトが消費するための安全な投与量に取って代わることなく平均（長期）血漿濃度の所望の１００％増加を達成するように調整された。

このモデルは、１２．７５ｇ（０．１２１ｍｏｌ）のセリンの１日２回の投与量が、１００％の平均血漿セリン濃度の所望の長期増加をもたらすと予測した。このような１日２回の投与量は、７０ｋｇの患者の場合、３．５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日のセリンに相当する。最大４００ｍｇ／ｋｇ／日（約２５‐３０ｇ／日）の用量がヒトで試験されており、安全であることが示されている。

Ｌ‐カルニチンに関して、モデルは、８．２ｇ（０．０５０９ｍｏｌ）のＬ‐カルニチンの１日２回の投与量が１００％の平均血漿Ｌ‐カルニチン濃度の所望の長期増加をもたらすと予測した。しかし、１日当たり７ｇ（０．０４３４ｍｏｌ）を超えるＬ‐カルニチンの安全性についての長期補給試験は検討されていないため、推奨用量は１日２回３ｇ（０．０１８６ｍｏｌ）に下げられた。これにより、平均血漿濃度が３７％と長期的に増加したが、これは毒性の危険性と血漿濃度の増加との間の妥当なトレードオフと考えられていた。３ｇのＬ‐カルニチンの１日２回投与量は、７０ｋｇの患者の場合、０．５３ｍｍｏｌ／ｋｇ／日のＬ‐カルニチンに相当する。

ＮＡＣに関して、モデルは、１日２回の投与量３．２ｇ（０．０１９６ｍｏｌ）のＮＡＣが１００％の平均血漿ＮＡＣ濃度の所望の長期増加をもたらすであろうと予測した。このような１日２回の投与量は、７０ｋｇの患者の場合、０．５６ｍｍｏｌ／ｋｇ／日のセリンに相当する。４～６グラムのＮＡＣの１日量がヒトにおいて安全であることが示されている。

Ｔｒａｍｍｅｌｌら（２０１６）は、１日２回投与量１ｇ（０．００３９ｍｏｌ）のＮＲの継続使用を支持している。このような１日２回の投与量は、７０ｋｇの患者の場合、０．１１ｍｍｏｌ／ｋｇ／日のＮＲに相当する。

調整された完全な医薬品において、ＮＲに対するセリンのモル比は約３１：１であり、ＮＡＣに対するセリンのモル比は約６．２：１であり、Ｌ‐カルニチンに対するセリンのモル比は約６．５：１であった。

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Claims (10)

1. 以下を含む組成物：
   Ａ）セリン；
   Ｂ）Ｎ‐アセチルシステイン；
   Ｃ）カルニチン;及び
   Ｄ）ニコチンアミドリボシド又はニコチンアミド、ここで
   Ａ）対Ｄ）のモル比は２５０：１～１．５：１であり、
   Ａ）対Ｂ）のモル比は１６：１から１：４であり、ここで
   群Ａ）～Ｄ）に含まれる物質は、組成物の乾燥重量の少なくとも２５％である。
2. Ａ）対Ｂ）のモル比が１２：１～１．５：１である、及び／又は
   Ａ）対Ｃ）のモル比が１５０：１～１：１である、及び／又は
   Ａ）対Ｄ）のモル比が１５０：１～３：１である、
   請求項１に記載の組成物。
3. Ａ）がＬ‐セリンである、及び／又はＣ）がＬ‐カルニチンである、及び／又はＤ）がニコチンアミドリボシドである、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 水溶液又は懸濁液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. Ａ）の濃度が０．２０～２．４ｍｍｏｌ／ｍｌである、及び／又はＤ）の濃度が０．００６～０．１２ｍｍｏｌ／ｍｌである、請求項４に記載の組成物。
6. 固体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
7. 固体粉末である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記粉末が包装され、粉末のパックが４８～４７８ミリモルのＡ）を含み、及び／又は、Ｄ）がニコチンアミドリボシド（ＮＲ）である場合、２．０～３９．２ミリモルのＤ）を含み、Ｄ）がＮＲではない場合、２．０～１９６ミリモルのＤ）を含む、請求項７に記載の組成物。
9. 前記組成物が、以下の経口摂取のためのものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物：
   Ａ）０．４８～２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
   Ｂ）０．３１～３．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；
   Ｃ）０．０３１～１．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量；及び
   Ｄ）０．０２０～０．３９ｍｍｏｌ／ｋｇ／日の用量。
10. 以下を含む医薬組成物：
    Ａ）セリン；
    Ｂ）Ｎ‐アセチルシステイン；
    Ｃ）カルニチン;及び
    Ｄ）ニコチンアミドリボシド又はニコチンアミド、ここで
    Ａ）対Ｄ）のモル比は２５０：１～１．５：１であり、
    Ａ）対Ｂ）のモル比は１６：１から１：４であり、ここで
    群Ａ）～Ｄ）に含まれる物質は、前記医薬組成物の乾燥重量の少なくとも２５％である。