JP7724632B2 - 標的核酸の光制御増幅試薬、光制御増幅方法および検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、光応答性デオキシヌクレオシド三リン酸を含む標的核酸の光制御増幅試薬、光照射により標的核酸の増幅反応を開始する標的核酸の光制御増幅方法および標的核酸の検出方法に関するものである。

臨床診断で用いられる遺伝子検査では、臨床試料中に含まれる極微量の標的核酸を増幅して信号強度を増大させることで、高感度かつ良好な再現性のある測定を実現している。標的核酸がＤＮＡである場合の増幅方法としては、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法が挙げられる。また、標的核酸がＲＮＡである場合の増幅方法としては、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献１および２、非特許文献１）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献３）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法（特許文献４および非特許文献２）などが報告されている。ＲＮＡの増幅方法は、比較的低温（例えば４１℃から４６℃）の一定温度での反応が可能であるため、自動化への適用が容易である。一方、急激な昇温・降温を必要とするＰＣＲ法では、大量処理を目的とした自動化への適用は容易ではなかったが、鎖置換活性を有する酵素を添加することで、比較的低温の一定温度下でのＤＮＡ増幅も可能となっている（特許文献５）。しかしながら、前述した比較的低温の一定温度下での標的核酸の増幅が可能な反応では、室温下においても反応が進行する可能性がある。

試料中に含まれる微量な標的ＲＮＡを正確に定量する技術としてデジタルＮＡＳＢＡ法（特許文献６）が挙げられるが、前記のように、室温下においても増幅反応が進行する可能性があるため、すなわち反応液を調製した後、微小区画に分配するまでに増幅反応が進行する可能性があるため、高精度な定量は極めて困難であった。したがって、試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをより高効率に再現性良く検出するためには、特に室温下における前記増幅反応を制御する必要があった。

標的核酸の増幅反応を制御する方法としては、プライマーや核酸構成成分となるｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオシド三リン酸）を光分解性保護基で保護した基質を用いて、光照射により増幅反応を抑制する方法があげられる（非特許文献３および４）。しかしながら、これまでに、核酸の構成成分となるｄＮＴＰの３’位のヒドロキシ基を光分解性保護基で保護した光応答性ｄＮＴＰを標的核酸の構成原料として用い、光照射により増幅反応を開始するような、標的核酸の光制御増幅方法は報告されていなかった。

特開平２－００５８６４号公報 特表平４－５０３４５１号公報 特表平４－５００７５９号公報 特開２０００－０１４４００号公報 特開２０１５－１１６１３６号公報 米国公開２０１４／０１４１５０２号公報

ｄｅ Ｂａａｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３９，１８９５－１９０２（２００１） Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７－８６（２００３） Ｊｉａｎ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，４２，１６４６２－１６４６７（２００７） Ｗｅｉｄｏｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１９，６３３９－６３４９（２００７）

本発明は以上のような事情に基づいてなされたものであり、試料中に存在する微量の標的核酸の増幅反応を光照射により開始する、標的核酸の光制御増幅方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、標的核酸の増幅反応の開始を光照射により制御しうる光応答性ｄＮＴＰを含む、標的核酸の光制御増幅試薬およびその増幅試薬を用いる標的核酸の光制御増幅方法により、前記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は以下の［１］から［８］に示す実施形態を含むものである。

［１］ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、リボヌクレオシド三リン酸と、デオキシヌクレオシド三リン酸とを含む、前記標的核酸の増幅試薬（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）であって、
下記＜１＞および＜２＞のうち、少なくともいずれか一つの態様を満たす、前記標的核酸の光制御増幅試薬：
＜１＞前記第一および／または前記第二のプライマーが、該プライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されている下記一般式（０）で表されるプライマー、

なお一般式（０）中、Ｚは第一または第二のプライマーを構成するオリゴデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｘは下記式（２）から（５）のいずれかの核酸塩基を表す。

そしてＹは下記一般式（７）で表されるｏ－ニトロベンジル基

（一般式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはヒドロキシメチル基を表す。）
または下記一般式（６）で表される３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基を表す。

（一般式（６）中、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に炭素数１から８のアルキル基を表す。または、Ｒ^１およびＲ^２はそれらが結合する窒素原子と一体となって５から７員環の複素環を形成してもよい。Ｒ^３およびＲ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはフェニル基を表す。）
＜２＞前記デオキシヌクレオシド三リン酸を構成する、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸およびデオキシシチジン三リン酸のうち、少なくともいずれか一つが光分解性保護基で修飾されている下記一般式（１）で表される光応答性デオキシヌクレオシド三リン酸。

なお一般式（１）中、Ｘは下記式（２）から（５）のいずれかの核酸塩基を表す。

そしてＹは下記一般式（７）で表されるｏ－ニトロベンジル基

（一般式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはヒドロキシメチル基を表す。）
または下記一般式（６）で表される３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基を表す。

（一般式（６）中、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に炭素数１から８のアルキル基を表す。または、Ｒ^１およびＲ^２はそれらが結合する窒素原子と一体となって５から７員環の複素環を形成してもよい。Ｒ^３およびＲ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはフェニル基を表す。）
［２］標的核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］に記載の標的核酸の光制御増幅試薬。

［３］［１］または［２］に記載の標的核酸の光制御増幅試薬を用いて標的核酸を増幅する方法であって、光照射により標的核酸の増幅反応を開始することを特徴とする標的核酸の増幅方法。

［４］標的核酸がＲＮＡである［３］に記載の標的核酸の増幅方法。

［５］ＲＮＡの増幅方法が、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法またはＴＲＣ法のいずれかの方法である、［４］に記載のＲＮＡの増幅方法。

［６］ＲＮＡの増幅方法が、ＴＲＣ法である、［５］に記載のＲＮＡの増幅方法。

［７］［１］または［２］に記載の光制御増幅試薬と、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブとを含む、前記標的核酸の検出試薬。

［８］［７］に記載の標的核酸の検出試薬を用いて標的核酸を増幅する方法であって、光照射により標的核酸の増幅反応を開始し、増幅した標的核酸を検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。

本発明の標的核酸の光制御増幅試薬を用いることにより、試料中に存在する微量の標的核酸の増幅反応を光照射により制御することができる。すなわち、比較的低温の一定温度下での試料中に含まれる標的核酸の増幅反応において、核酸増幅反応の開始を光で制御することができ、従来困難であった標的核酸の高精度な定量を行なうことができる。

以下、本発明について詳細に説明する。

＜１＞本発明の光制御増幅試薬
一般式（１）で表される光応答性デオキシヌクレオシド三リン酸（以下、光応答性ｄＮＴＰ（１）と呼ぶことがある。）および／または一般式（０）で表される光応答性デオキシリボヌクレオチドで修飾されたプライマーを含む、本発明の標的核酸の光制御増幅試薬は、比較的低温の一定温度下での試料中に含まれる標的核酸の増幅反応において用いることで、核酸増幅反応の開始を光で制御することができる。

本発明の光制御増幅試薬の一態様は、以下の（Ａ）から（Ｉ）の成分を含む試薬である。なお以下の（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方には、その５’末端側に以下の（Ｇ）のプロモータ配列を付加している。また一般的に使用される増幅反応に必要という理由以外の理由で、より好ましい別の成分を添加してもよい。
（Ａ）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド（第一のプライマー）、
（Ｂ）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド（第二のプライマー）、
（Ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｄ）光応答性ｄＮＴＰ（１）、
（Ｅ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
（Ｈ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）。ただし、（Ｄ）に記載の光応答性ｄＮＴＰ（１）と同一の核酸塩基をもつｄＮＴＰは含まないか、または、光照射前に増幅反応が開始しない程度に含んでいてもよい。
（Ｉ）リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰｓ：ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）。

前述したように（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方は、その５’末端側に前記（Ｇ）のプロモータ配列を付加している。なお付加するプライマーと前記プロモータ配列との間に、数から数十ヌクレオチドからなるエンハンサー配列を挿入してもよい。

（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｆ）の酵素は、それぞれ異なる酵素を用いてもよいし、一部または全部を共通の酵素としてもよい。例えば、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｆ）の酵素活性を全て包含する酵素であり、光制御増幅試薬として特に好ましい態様である。

（Ｇ）の酵素の一例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。なお（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方に付加させるプロモータ配列は、（Ｇ）で用いる成分（ポリメラーゼ）に対応した配列を付加させればよい。

（Ｄ）の光応答性ｄＮＴＰ（１）は、下記一般式（１）で表されるデオキシリボヌクレオシド三リン酸である。

本発明において、光応答性ｄＮＴＰ（１）は、化学的に許容される塩を含むものとし、それを含み一般式（１）で表す。

Ｘは、アデニン塩基（２）、グアニン塩基（３）、チミン塩基（４）、およびシトシン塩基（５）のいずれかの核酸塩基である。

Ｙは、特定の波長の照射により脱保護される光分解性保護基であり、下記一般式（７）で表されるｏ－ニトロベンジル基、

（一般式（７）中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはヒドロキシメチル基を表す。）
または下記一般式（６）で表される３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基を表す。

一般式（６）中、Ｒ^１およびＲ^２は各々独立に炭素数１から８のアルキル基を表す。なおＲ^１およびＲ^２はそれらが結合する窒素原子と一体となって５から７員環の複素環を形成してもよい。またＲ^３およびＲ^４は各々独立に水素原子、炭素数１から６のアルキル基またはフェニル基を表す。

一般式（６）中のＲ^１およびＲ^２で表される炭素数１から８のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、へキシル基、へプチル基、オクチル基を例示することができる。また、Ｒ^１およびＲ^２は、それらが結合する窒素原子と一体となって５から７員環の複素環を形成してもよく、このとき、形成される複素環の炭素原子は、窒素原子および酸素原子からなる群より選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子で置き換えられていてもよい。該複素環としては、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンを例示することができる。

一般式（７）中のＸ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４ならびに一般式（６）中のＲ^３およびＲ^４で表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分岐状または環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、へキシル基を例示することができる。

一般式（７）で表されるｏ－ニトロベンジル基としては、ｏ－ニトロベンジル基、４－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロベンジル基、３－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロベンジル基、２－（ヒドロキシメチル）－６－ニトロベンジル基、５－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロベンジル基、４－メチル－２－ニトロベンジル基、３－メチル－２－ニトロベンジル基、２－メチル－６－ニトロベンジル基、５－メチル－２－ニトロベンジル基、４－エチル－２－ニトロベンジル基、３－エチル－２－ニトロベンジル基、２－エチル－６－ニトロベンジル基、５－エチル－２－ニトロベンジル基を例示することができる。

一般式（６）で表される３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基としては、３－（ジメチルアミノ）ベンジル基、３－（ジエチルアミノ）ベンジル基、３－（ジプロピルアミノ）ベンジル基、３－（ジブチルアミノ）ベンジル基、３－（ジオクチルアミノ）ベンジル基、３－（エチルメチルアミノ）ベンジル基、３－（エチルプロピルアミノ）ベンジル基、３－ピロリジノベンジル基、３－ピペリジノベンジル基、１－［３－（ジメチルアミノ）フェニル］エチル基、１－［３－（ジエチルアミノ）フェニル］エチル基、［３－（ジメチルアミノ）フェニル］（フェニル）メチル基、［３－（ジエチルアミノ）フェニル］（フェニル）メチル基、１－［３－（ジメチルアミノ）フェニル］－１－メチルエチル基、１－［３－（ジエチルアミノ）フェニル］－１－メチルエチル基、を例示することができる。

Ｙは光分解性の高い点で、ｏ－ニトロベンジル基または３－（ジエチルアミノ）ベンジル基が好ましい。

（Ｄ）の光応答性ｄＮＴＰ（１）は、光照射により、ＤＮＡ伸長の基質として利用可能な未修飾のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を与える。用いる光応答性ｄＮＴＰ（１）は、式（２）から（５）で表される４種の核酸塩基（アデニン塩基（２）、グアニン塩基（３）、チミン塩基（４）、またはシトシン塩基（５））を有する光応答性ｄＮＴＰ（１）のうちいずれか一種であってもよく、いずれか二種または三種であってもよく、全てであってもよい。

なお前記（Ａ）および／または前記（Ｂ）のプライマーが、該プライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されている下記一般式（０）で表されるプライマーであってもよい。

一般式（０）中、Ｚは第一または第二のプライマーを構成するオリゴデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｘは、アデニン塩基（２）、グアニン塩基（３）、チミン塩基（４）、およびシトシン塩基（５）のいずれかの核酸塩基であり、Ｙは、上記一般式（７）で表されるｏ－ニトロベンジル基または上記一般式（６）で表される３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基を表す。

本発明の光制御増幅試薬が上記一般式（０）で表されるプライマーを含む場合、前記（Ｄ）（光応答性ｄＮＴＰ（１））は含んでもよいし、含まなくてもよい。ただし前記（Ｄ）を含まない場合、前記（Ｈ）（デオキシヌクレオシド三リン酸）は４種（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）全てを含む必要がある。

次に、本発明で用いる光応答性デオキシリボヌクレオシド三リン酸（１）の製造方法について説明する。

例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０４，１６４６２－１６４６７（２００７）やＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，６３３９－６３４９（２００７）に開示された方法を参考に合成できるデオキシリボヌクレオシド（７）を原料として用いて、デオキシリボヌクレオシド（７）のヒドロキシ基を三リン酸化することで、本発明で用いるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（１）を製造することができる。

（式中、ＸおよびＹは前記と同じ意味を表す。）
すなわち、デオキシリボヌクレオシド（７）とクロロ亜リン酸サリチルを塩基の存在下に反応させた後に、ピロリン酸塩で処理することにより、環状化合物（８）を得る（工程－Ａ）。次いで、これを水存在下に酸化剤と反応させることにより（工程－Ｂ）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（１）を製造することができる。

工程－Ａの後に得られた環状化合物（８）は単離精製してもよいし、そのまま単離精製することなく次の工程－Ｂに供してもよい。

本発明において、環状化合物（８）は、その化学的に許容される塩を含むものとし、それを含み一般式（８）で表す。

本製造方法に用いるクロロ亜リン酸サリチルは市販されている。

本製造方法に用いることのできる塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、ピコリン等の有機塩基を例示することができる。

本製造方法に用いることのできるピロリン酸塩としては、ビス（テトラブチルアンモニウム）ピロリン酸二水素、ビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸を例示することができる。これらは市販されている。

本製造方法に用いることのできる酸化剤としては、ヨウ素を例示することができる。

本製造方法は、反応を阻害しない溶媒であれば溶媒中で行なってもよい。本製造方法で用いることのできる溶媒として、例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジンを例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてもよい。中でも収率が良い点で、ジメチルホルムアミドを用いることが好ましい。

本製造方法に用いるデオキシリボヌクレオシド（７）とクロロ亜リン酸サリチルとのモル比は、１：０．８から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：２がさらに好ましい。

本製造方法に用いるデオキシリボヌクレオシド（７）と塩基とのモル比は、１：０．８から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：２がさらに好ましい。

本製造方法に用いるデオキシリボヌクレオシド（７）とピロリン酸塩とのモル比は、１：０．８から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：２がさらに好ましい。

本製造方法に用いるデオキシリボヌクレオシド（７）と酸化剤とのモル比は、１：０．８から１：２０の範囲が好ましく、中でも収率が良い点で１：１から１：５がさらに好ましい。

本製造方法に用いるデオキシリボヌクレオシド（７）と水とのモル比は、特に制限はなく、デオキシリボヌクレオシド（７）に対して等量以上用いれば良く、溶媒として用いることが好ましい。

本製造方法の反応温度は、－７８℃以上１５０℃以下の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率が良い点で０℃以上１２０℃以下の範囲にあることが好ましい。

本製造方法で得られるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（１）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定は無いが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。

次に、前記（Ａ）および／または前記（Ｂ）のプライマーが、該プライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されている一般式（０）で表されるプライマーの製造方法について説明する。

例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０４，１６４６２－１６４６７（２００７）に開示された方法を参考に合成できるデオキシリボヌクレオシドを原料として用いて、３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されている一般式（０）で表されるプライマーを合成することができる。核酸塩基がチミン塩基であるデオキシリボヌクレオシド（９）を原料として用いるプライマーの合成法を下記に記す。

５’位がＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチリル）基で保護されているデオキシリボヌクレオシド（９）を塩基存在下に、臭化４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロベンジル（１０）と反応させた後に、ベンゾイル基、ＴＢＳ（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）基の脱保護を行なうことで、３’位が光分解性保護基で修飾されたデオキシリボヌクレオシド（１１）が得られる。続いて、光反応性保護基に置換しているヒドロキシメチル基を無水コハク酸と反応させてカルボキシル基を導入し、該カルボキシル基を３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン等を用いて活性化エステル（１２）に変換できる。得られた活性化エステル（１２）をポリスチレンやシリカゲル等の担体に固定化されたアミン（１３）（例えば、Ａｍｉｎｏ－ＳｙｎＢａｓｅ ＣＰＧ １０００／１１０［ＬＧＣ ＬＩＮＫ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製］）と反応させることにより、３’位が光分解性保護基で修飾されている固定化デオキシリボヌクレオシド（１４）が得られる。得られた固定化デオキシリボヌクレオシド（１４）を通常の自動ＤＮＡ合成法に付すことにより、３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されたプライマーを合成することができる。

＜２＞標的核酸の光制御増幅方法
次に本発明の光制御増幅試薬を用いる、本発明の標的核酸の光制御増幅反応について説
明する。

標的核酸は任意の塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を上記（Ａ）および（Ｂ）に含んでいる限り、任意に決定できる。当該標的核酸の由来に特に限定はなく、例えば、ＰＣＲ法に代表される核酸増幅反応により合成されたポリヌクレオチドであってもよいし、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであってもよいし、血液、組織、細胞等から抽出されたポリヌクレオチドであってもよいし、食品、土壌、排水等から抽出されたポリヌクレオチドであってもよい。

標的核酸がＤＮＡの場合は、標的核酸の増幅方法としては、ＰＣＲ法などを用いることができる。

標的核酸がＲＮＡの場合は、標的核酸の増幅方法としては、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法などを用いることができる。これらの方法は、標的ＲＮＡに対してプロモータ配列を含むプライマーと、逆転写酵素およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を用いて、プロモータ配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列を含むＲＮＡを生成し、以後は、当該生成されたＲＮＡを、前記プロモータ配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応を行なうものである。

標的核酸の増幅反応に用いる溶媒に特に制限はないものの、緩衝液を用いることが好ましい。用いることのできる緩衝液としては、トリス－塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）－ＫＯＨ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液を例示することができる。前述の緩衝液に任意の濃度で無機塩またはカルボン酸塩を添加してもよい。該無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化マグネシウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムを例示することができ、該カルボン酸塩としては、酢酸マグネシウム、酢酸マンガンを例示することができる。これらの無機塩およびカルボン酸塩のうち２種類以上を混合して用いてもよい。無機塩またはカルボン酸塩の添加濃度は０Ｍ以上５Ｍ以下の範囲が好ましい。さらに、緩衝液に混和可能な有機溶媒を０％以上８０％以下の割合で添加してもよい。該有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ヘキサメチルリン酸トリアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコール、グリセリンを例示することができ、これらの有機溶媒のうち２種類以上を混合して用いてもよい。

本発明の標的核酸の増幅方法では、標的核酸の光制御増幅試薬と標的核酸を混合し光照射を行なうことにより増幅反応が開始する。すなわち、光応答性ｄＮＴＰ（１）が、遊離のデオキシリボヌクレオシド三リン酸として含んでいる場合、光照射がなければ、光応答性ｄＮＴＰ（１）と同一の核酸塩基を有するｄＮＴＰは増幅反応系中に存在しない。したがって、この状態の光制御増幅試薬に標的核酸を添加しても増幅反応は進行しない。一方、光応答性ｄＮＴＰ（１）に、光照射を行なうと、光応答性保護基が遊離し、ＤＮＡ伸長の基質の一つである、未修飾のｄＮＴＰが光制御増幅試薬に存在するようになる。したがって、この状態の光制御増幅試薬に標的核酸を添加し、かつ当該試薬を適切な増幅反応条件（適切な温度など）にすることで、当該標的核酸の増幅反応が進行する。

また光応答性ｄＮＴＰ（１）が、第一および／または第二のプライマーを構成するデオキシリボヌクレオチド（すなわち一般式（０）の態様）として含んでいる場合、光照射がなければ、光応答性ｄＮＴＰ（１）に修飾した光分解保護基が、前記プライマーと標的核酸とのハイブリダイゼーションを阻害するため、標的核酸を添加しても増幅反応は進行しない。一方、光応答性ｄＮＴＰ（１）（一般式（０））に、光照射を行なうと、光応答性保護基が遊離し、前記プライマーが標的核酸とハイブリダイズ可能となる。したがって、標的核酸を添加した光制御増幅試薬を適切な増幅反応条件（適切な温度など）にすることで、当該標的核酸の増幅反応が進行する。

一般式（１）で表される光応答性ｄＮＴＰまたは一般式（０）で表されるプライマーのＹがｏ－ニトロベンジル基（一般式（７））の場合、２００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の波長の光を照射することで、ニトロベンジル基の脱保護が進行する。光分解速度が速い点から３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長の光を用いることが好ましい。光応答性ｄＮＴＰ（１）または一般式（０）で表されるプライマーのＹが３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基の場合、２００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長の光を照射することで、３－（ジアルキルアミノ）ベンジル基の脱保護が進行する。光分解速度が速い点から３００ｎｍ以上３４０ｎｍ以下の波長の光を用いることが好ましい。光の放射照度は特に限定されるものではないが、０．１ｍＷ／ｃｍ^２以上３Ｗ／ｃｍ^２以下の範囲の光を用いることが好ましい。光の照射時間は特に限定されるものではないが、３０分以内の照射時間が好ましく、５分以内の照射時間がさらに好ましい。

標的核酸の増幅反応を行なう温度は、０℃以上８０℃以下の範囲の中から、用いる溶媒の組成を考慮の上、適宜設定すればよい。なお増幅反応をＴＲＣ法で行なう場合、４０℃以上５０℃以下の範囲で行なうと好ましい。

＜３＞本発明の検出方法
本発明の標的核酸の増幅方法において、増幅した標的核酸は以下の方法で検出することができる。

本発明の光制御増幅試薬で増幅した標的核酸は、予めまたは増幅反応後に検出用成分を添加し、当該成分由来の蛍光強度や化学発光強度を測定することで、標的核酸を検出すればよい。検出用成分の好ましい態様として、標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。

前記プローブの一例として、標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素を結合したＤＮＡが挙げられる。前記ＤＮＡ部分の配列は、標的核酸中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な部分と相補的または相同的な配列である必要がある。前記ＤＮＡ部分の長さは、標的核酸の特異的分析のため、６ヌクレオチド以上１００ヌクレオチド以下、さらに好ましくは１０ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。なお前記ＤＮＡ部分は、増幅した標的核酸と相補結合を形成した場合に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による３’末端からの伸長が生じないように、当該３’末端が標的核酸と非相補的な配列が付加されているか、または、その３’末端が化学的に修飾（例えばアミノ化）されていることが好ましい。

インターカレーター性蛍光色素は、前述したＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると二本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、例えば、インターカレーター性蛍光色素を、二本鎖部分へのインターカレーションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合すればよい。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行なう上で簡便で好ましい。また市販の試薬セット（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｃ６－Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）を使用してもよい。

インターカレーター性蛍光色素としては、二本鎖にインターカレーションすることで、例えば発する蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。具体的には、蛍光強度の変化が特に著しい、チアゾールオレンジやオキサゾールイエロー、ならびにそれらの誘導体が、好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。

インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介してＤＮＡ部分に結合させる位置は、当該ＤＮＡ部分の５’末端、３’末端または中央部等、インターカレーター性蛍光色素の二本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。

標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブの別の例として、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）が挙げられる。モレキュラービーコンは、標的核酸の一部と相補的または相同的な配列を有するＤＮＡであり、その両端に蛍光色素とクエンチャーを有するステムループ構造になっている。ステムループ構造の状態では、蛍光色素の蛍光がクエンチャーにより抑制されているが、ループ配列中に存在する標的ＲＮＡに相補的な領域が反応中に生じた増幅産物とハイブリダイズするとステム部分が開裂し蛍光を発する。ステムの形成は、分子内でＤＮＡの二本鎖を形成し、会合能の高い蛍光色素（Ｃｙ３など）とクエンチャー（アゾ化合物など）のペアをＤＮＡに導入することで形成できる。

標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブのさらに別の例として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブが挙げられる。この場合、標的核酸の配列において、増幅に用いた第一および第二のプライマーの内側に設計された２本のプローブを使用する。２本のプローブのうち、一方のプローブの３’末端にはドナー蛍光色素を、もう一方のプローブの５’末端にはアクセプター蛍光色素を、それぞれ修飾する。ハイブリダイゼーションした際に、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が近接するように設計することで、２本のプローブが反応中に生じた増幅産物とハイブリダイゼーションすることにより生じるＦＲＥＴ現象により、標的核酸を検出できる。

標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブのさらにまた別の例として、ＴａｑＭａｎプローブが挙げられる。この場合、標的核酸の配列において、増幅に用いた第一および第二のプライマーの内側に設計された１本のプローブを使用する。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端には蛍光色素（レポーター色素）を、３’末端にはクエンチャーを、それぞれ標識する。レポーター色素の蛍光はクエンチャーにより抑制されているが、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応時に、標的ＲＮＡにプローブがハイブリダイズしていると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、レポーター色素が遊離することで生じる蛍光により検出できる。

次に本発明を実施例および合成例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお反応に用いた試薬および無水溶媒は市販品（東京化成工業社製、関東化学社製、富士フイルム和光純薬社製、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を精製せずに用いた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは４００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００および４００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤで測定した。化学シフト値については、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準物質に用いてｐｐｍで示した。ｓはｓｉｎｇｌｅｔを、ｄはｄｏｕｂｌｅｔを、ｔはｔｒｉｐｌｅｔを、ｑはｑｕａｒｔｅｔを、ｑｕｉｎｔはｑｕｉｎｔｅｔを、ｂｒｓはｂｒｏａｄ ｓｉｎｇｌｅｔを、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔを、それぞれ表している。

合成例１

２５ｍＬ容量二口フラスコに３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシアデノシン（１１５ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（１ｍＬ）により５回共沸した後、脱水ピリジン（１ｍＬ）により５回共沸した。アルゴン雰囲気下にして、脱水ピリジン（２ｍＬ）を加え、１，４－ジオキサン（１ｍＬ）に溶かしたクロロ亜リン酸サリチル（７３ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間反応させた後、トリブチルアミン（２２０μＬ，０．９０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）（２ｍＬ）に溶かしたピロリン酸トリブチルアンモニウム塩（１９８ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を加え、１時間反応させた。続いて１％（ｗ／ｖ）ヨウ素溶液（ピリジン／水＝９：１）を溶液が茶色に呈色するまで加えた後、３０分間反応させた。水（２ｍＬ）を加え、さらに３０分間撹拌した。反応終了後、酢酸エチル（１０ｍＬ）を加え激しく撹拌し、有機相を取り除く操作を３回行なった。回収した水相を減圧濃縮し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（酢酸トリエチルアミン緩衝液：メタノール，１０：０→８：２）により精製した後、減圧濃縮を行なった。得られた残渣をメタノール（１ｍＬ）に溶かし、そこに０．６Ｍ過塩素酸ナトリウム／アセトン溶液（１０ｍＬ）を加えた。この溶液を遠心分離し、上澄みを取り除いた。さらにアセトン（１０ｍＬ）を加え、遠心分離をし、上澄みを取り除く操作を３回行なった。得られた白色固体を減圧乾燥することで、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシアデノシン三リン酸（ＮＢ－ｄＡＴＰ）（３４ｍｇ，５１μｍｏｌ，１７％，^１Ｈ ＮＭＲ ｐｕｒｉｔｙ ９５％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ８．４５（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｍ，１Ｈ），７．６８－７．７３（ｍ，２Ｈ），７．５２（ｍ，１Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝６．２，８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（ｍ，２Ｈ），４．６１（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．０７－４．１９（ｍ，２Ｈ），２．６６－２．７８（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ；^３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，１６１ＭＨｚ）：δ－６．２９（ｍ，１Ｐ），－１１．０（ｍ，１Ｐ），－２１．８（ｍ，１Ｐ）ｐｐｍ；ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ Ｃ_１７Ｈ_２０Ｎ_６Ｏ_１４Ｐ_３；［Ｍ－Ｈ^＋］－：６２５．０４９０（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ：６２５．０２５０）．
合成例２
Ｎ^６，Ｎ^６－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－２’－デオキシアデノシン（２．８８ｇ，５．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、ヨウ化ナトリウム（１００ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）、１．５Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液（６．７８ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７．６３ｍＬ，７．６ｍｍｏｌ）および蒸留水（１０ｍＬ）を加えて室温で５分間撹拌した。得られた混合液にｍ－（ジエチルアミノ）ベンジルクロライド（３．０２ｇ，１５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（９．０ｍＬ）溶液を加え、遮光下室温で１５時間反応させた。水相と有機相を分離し、水相を塩化メチレン（５０ｍＬ）で二回抽出した。有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０）により精製し、Ｎ^６，Ｎ^６－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（６２５ｍｇ，１７％）を黄色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．８４（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６４－６．６１（ｍ，３Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），２．７０－２．５９（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ），１．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），０．８８（ｓ，９Ｈ），０．０７（ｓ，３Ｈ），０．０６（ｓ，３Ｈ）．
合成例３
合成例２で得た、Ｎ^６，Ｎ^６－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（６２５ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ）を遮光容器に量り取り、塩化メチレン（３０ｍＬ）に溶解して活性化（８０℃で３時間真空乾燥）させたシリカゲル（６．０ｇ）を加えて減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を減圧下８０℃で１３時間加熱した。得られた固体をメタノールおよびクロロホルムで洗浄し、ろ液を濃縮することで、５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（３６９ｍｇ，８１％）を黄色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．３２（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．１７（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６３－６．５９（ｍ，３Ｈ），６．４７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），６．０５（ｂｒｓ，２Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｍ，１Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝１１．０．４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），２．６４－２．６１（ｍ，２Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，３Ｈ），０．０５（ｓ，３Ｈ）．
次いで、５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（３６９ｍｇ，０．７０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。得られた混合液に１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム－テトラヒドロフラン溶液（０．７０ｍＬ，０．７０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下したのち、室温まで昇温した。室温で２時間反応させ、メタノール（３．０ｍＬ）を加えて反応を停止した。反応液を濃縮し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝９０：１０）により精製し、３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（２０２ｍｇ，７０％）を黄色固体で得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．３２（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６５－６．６２（ｍ，３Ｈ），６．５７（ｍ，１Ｈ），６．２８（ｍ，１Ｈ），５．７４（ｂｒｓ，２Ｈ），４．５４（ｓ，２Ｈ），４．４９（ｍ，１Ｈ），４．３９（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｍ，１Ｈ），３．３６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），３．０１（ｍ，１Ｈ），２．４４（ｍ，１Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）．
合成例４
合成例３で得た、３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン（７０．０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を脱水トルエン（３．０ｍＬ）で二回、脱水ピリジン（３．０ｍＬ）で三回共沸し、水を除去した。乾燥した固体の脱水ピリジン（２．０ｍＬ）溶液に対してクロロ亜リン酸サリチル（４０．０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（１．０ｍＬ）を加えて室温で１時間半反応させた。続いてビス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（８２．０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）およびトリブチルアミン（０．１２ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間反応させた。ヨウ素（３２ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）／ピリジン（９．０ｍＬ）／蒸留水（１．０ｍＬ）の溶液を、反応液が赤色を呈するまで加えた。反応液を室温で１５分程度撹拌しても退色しないことを確認したのち、蒸留水（２．０ｍＬ）を加えて室温で１２時間反応させた。反応液を酢酸エチル（６０ｍＬ）で洗浄し、水相を濃縮した。得られた残渣をオクタデシル基修飾シリカゲルカラムクロマトグラフィー（水：メタノール＝９：１）により精製し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を蒸留水（１．３ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に懸濁させ、過塩素酸ナトリウム（８５０ｍｇ）のアセトン（１０ｍＬ）溶液を加えて遠心分離を行ない、上澄みを除去したのち減圧下溶媒を留去した。同様の操作を２回行ない、３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシン三リン酸（ＤＥＡＢ－ｄＡＴＰ）（１３ｍｇ，１２％）を白色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ８．１４（ｍ，１Ｈ），７．５６（ｍ，３Ｈ），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｍ，２Ｈ，ｏｂｓｃｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｐｒｏｔｏｎ ｏｆ Ｄ_２Ｏ），４．５８（ｍ，１Ｈ，ｏｂｓｃｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｐｒｏｔｏｎ ｏｆ Ｄ_２Ｏ），４．４０（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，４Ｈ），２．６６（ｍ，２Ｈ），１．０１（ｍ，６Ｈ）；^３１Ｐ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ，１６２ＭＨｚ）：δ－８．０（ｍ，１Ｐ），－１１．４（ｄ，１Ｐ），－２１．５（ｍ，１Ｐ）；ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ Ｃ_２１Ｈ_３０Ｎ_６Ｏ_１２Ｐ_３；［Ｍ－Ｈ^＋］－：６５１．１１７９（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ：６５１．１１８）．

合成例５
２－ニトロ－ｐ－キシレングリコール（５．００ｇ，２７．３ｍｍｏｌ）およびイミダゾ－ル（３．７２ｇ，５４．６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下ＤＭＦ（１５．０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。得られた溶液に対して、塩化ｔ－ブチルジメチルシリル（４．２５ｇ，２７．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０．０ｍＬ）溶液を加えた。得られた混合液を室温に昇温して１．５時間反応させたのち、メタノール（２０ｍＬ）を加えて室温で３０分撹拌し反応を停止した。減圧下で反応液中の溶媒を留去し得られた残渣に蒸留水（２００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ）で５回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により精製し、４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロベンゼンメタノール（１．９ｇ，２３％）を白黄色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ_２－ＯＨ），４．７９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２－ＯＴＢＳ），２．５１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），０．９５（ｓ，９Ｈ，ＴＢＳ），０．１１（ｓ，６Ｈ，ＴＢＳ）．
合成例６
合成例５で得た、４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロベンゼンメタノール（６４８ｍｇ，２．１７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１．７１ｇ，６．５１ｍｍｏｌ）、四塩化炭素（２．１６ｇ，６．５１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（９２９ｍｇ，７．１６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（７．３ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応液に蒸留水（５０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１）により精製し、臭化４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロベンジル（７４７ｍｇ，８３％）を白色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．００（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．５１（ｍ，２Ｈ），４．８２（ｓ，ＣＨ_２－Ｂｒ），４．７９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２－ＯＴＢＳ），０．９５（ｓ，９Ｈ，ＴＢＳ），０．１１（ｓ，６Ｈ，ＴＢＳ）．
合成例７
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（２．７２ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／ジメチルアセトアミド（１０：１）の混合溶媒（２５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（６０７ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ）を加え室温で１０分間撹拌後、塩化ベンゾイル（７７３ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）を加え室温で１５時間反応させた。反応後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３：１→１：１）により精製することで、Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジンおよび３’－Ｏ－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジンの混合物を得た（１．７８ｇ，５５％，Ｎ－Ｂｚ体：Ｏ－Ｂｚ体＝６．５：１）を無色固体として得た。

Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．８８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝０．８４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３７－７．４２（ｍ，４Ｈ），７．２５－７．３０（ｍ，５Ｈ），７．１９－７．２３（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），６．３４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｑ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３１（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．２３－２．３４（ｍ，２Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ）．
３’－Ｏ－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．０２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝０．９６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３７－７．４２（ｍ，４Ｈ），７．２５－７．３０（ｍ，５Ｈ），７．０９－７．１４（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），６．５０（ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４７－２．６４（ｍ，１Ｈ），１．３７（ｓ，３Ｈ）．
合成例８
合成例６で得た、臭化４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロベンジル（３７７ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２．０ｍＬ）に溶解し室温で１０分間撹拌させた後、合成例７で得た、Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジンおよび３’－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジンの混合物（５２１ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ，Ｎ－Ｂｚ体：Ｏ－Ｂｚ体＝４：１）、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（２３６ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１．６２ｍＬ，１．６２ｍｍｏｌ）ならびに塩化メチレン（６ｍＬ）の混合溶液を滴下して、室温３時間で反応させた。反応液をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３０：１）により精製し、生成物（１４６ｍｇ）を得た。続いて、得られた生成物をアンモニアの２Ｍエタノール／塩化メチレン溶液（１６ｍＬ，エタノール：塩化メチレン＝２．５：１）に溶解し室温で６．５時間撹拌させた後、減圧下溶媒を留去して得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製することで３’－Ｏ－［４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（４６．７ｍｇ，２工程７％）を無色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．０５（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２１－７．３１（ｍ，７Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．９，１．２Ｈｚ，４Ｈ），６．３９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｑ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，２Ｈ），４．７６（ｂｒｓ，２Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５３－２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２１－２．２９（ｍ，１Ｈ），１．４７（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），０．１２（ｓ，６Ｈ）．
合成例９
合成例８で得た、３’－Ｏ－［４－［［（ｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ］メチル］－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（１５７ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３．８ｍＬ）溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ ＴＨＦ溶液（０．２３ｍＬ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えて０℃で２時間反応させた。酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１→１：４）により精製することで、３’－Ｏ－［４－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（１２４ｍｇ，９２％）を無色オイル状で得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．１０（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝８．６，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝７．０，１．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３１－７．２０（ｍ，７Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．４Ｈｚ，４Ｈ），６．３９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｑ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，２Ｈ），４．７９（ｓ，２Ｈ），４．３１（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．５３（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．５４（ｄｑ，Ｊ＝１３．６，５．４Ｈｚ，１Ｈ），２．１７－２．２８（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝０．９６Ｈｚ，３Ｈ）．
合成例１０
合成例９で得た、３’－Ｏ－［４－（ヒドロキシメチル）－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（１３０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３．６ｍＬ）溶液に対し無水コハク酸（２２ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３６ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（２２ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え室温で１８時間反応させた。酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、精製水（２０ｍＬ）で洗浄した。減圧下溶媒を留去して生成物（７８．２ｍｇ）を無色オイル状で得た。得られた生成物（２１．６ｍｇ）のジメチルホルムアミド（３．６ｍＬ）溶液に対し３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（９０ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（７０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）を加え室温で１８時間反応させた。酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、精製水（２０ｍＬ）で洗浄した。減圧下溶媒を留去して得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝３：１）により精製することで、３’－Ｏ－［［［［［４－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン）－３－イルオキシ］カルボニルエチル］カルボニル］オキシメチル］－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（６５ｍｇ，２工程３８％）を無色オイル状で得た。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．３６（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．２，０．４８Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄｔ，Ｊ＝７．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｄｔ，Ｊ＝７．４，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３０
－７．２１（ｍ，７Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．０Ｈｚ，４Ｈ），６．３９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｑ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．５０－２．５８（ｍ，１Ｈ），２．１６－２．２８（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ）．
合成例１１

プラスチック製の遠沈管にＡｍｉｎｏ－ＳｙｎＢａｓｅ ＣＰＧ １０００／１１０ （ＬＣＡＡ）（ＬＧＣ ＬＩＮＫ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（４００ｍｇ，ローディング量１０５μｍｏｌ／ｇ）を入れ固相合成器にセットし、合成例１０で得た、３’－Ｏ－［［［［［４－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン）－３－イルオキシ］カルボニルエチル］カルボニル］オキシメチル］－２－ニトロ］ベンジル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチリル）チミジン（６１．６ｍｇ，６４．５μｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８．４ｍｇ，６４．５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を加え室温で３日間反応させた。反応終了後吸引ろ過により固相を取り出し酢酸エチルで洗浄し乾燥させることで固相担持されたチミジン誘導体（３４９．５ｍｇ）を得た。チミジン誘導体の固相中のローディング量は１００．５μｍｏｌ／ｇであった。

以下、核酸増幅法としてＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法を用いたときの実施例を用いて、本発
明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

実施例１ ｄＡＴＰ濃度のＴＲＣ反応への影響
ＴＲＣ法における、ｄＡＴＰ添加濃度による検出時間への影響を調べた。

（１）Ｃ型肝炎ウイルス標準ＲＮＡ（以下、単に標準ＲＮＡとも表記する）遺伝子が挿入されたプラスミドから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、前記標準ＲＮＡ（配列番号１）を調製した。当該標準ＲＮＡを注射用水を用いて１０^３コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１２μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料２μＬを添加した。なお標準ＲＮＡ検出用プローブであるモレキュラービーコンプローブ（配列番号２）は、標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１０８番目から１２３番目まで］を含む。また第一のプライマー（配列番号３）は、標準ＲＮＡの相補鎖の一部（具体的には配列番号１の１２５番目から１４５番目まで：配列番号５）の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号６）を付加したオリゴヌクレオチドである。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
１５０ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ モレキュラービーコンプローブ（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１０８番目から１２３番目まで］を含む：配列番号２）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ 第二のプライマー（標準ＲＮＡの相同鎖の一部［配列番号１の１番目から１６番目まで］：配列番号４）
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各種濃度（０から３３００μＭ）のｄＡＴＰ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤６μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ 塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ 塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）
９．０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
２．５％（ｗ／ｖ） グリセロール
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が２．３を超えた時間を検出時間とした。

結果を表１に示す。反応液中のｄＡＴＰ濃度が１６５μＭ以上であれば、増幅反応への影響がないことがわかる。

実施例２ 光分解性保護基のＴＲＣ反応への影響（その１）
ｄＮＴＰに修飾する光分解性保護基のＴＲＣ反応への影響を調べた。

（１）文献記載（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，６３３９－６３４９（２００７））の合成法により、アデノシンの３’末端側ヒドロキシ基に光分解性保護基として２－ニトロベンジル基を修飾した、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシアデノシンを合成した。

（２）（１）で合成した３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシアデノシンを含む溶液が一定の濃度となるようＤＭＳＯに溶解した。

（３）以下の組成からなる反応液８μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
１５０ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ モレキュラービーコンプローブ（配列番号２）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号４）
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（４）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤１０μＬを添加した。なお、ＤＭＳＯ濃度が実施例１（９％（ｖ／ｖ））とは異なる濃度となっているが、ＴＲＣ反応への影響がないことは事前に確認済である。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ 塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ 塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）
２．５％（ｗ／ｖ） グリセロール
１０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ（光分解性保護基として０から１００μＭ含む、（２）
で調製）
（５）実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。

結果を表２に示す。光分解性保護基として２－ニトロベンジル基（ｏ－ニトロベンジル基）を用いた場合、その濃度が５０μＭ以下であれば、ＴＲＣ反応への影響はないことがわかる。

実施例３ 光分解性保護基を修飾した２’－デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）のＴＲＣ反応への影響
（１）１．６５ｍＭの３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－２’－デオキシアデノシン三リン酸（ＮＢ－ｄＡＴＰ、合成例１で合成）溶液に対し、紫外光（波長３６５ｎｍ、強度７００μＷ／ｃｍ^２）を１分間から４０分間照射した。なお対照として未修飾のｄＡＴＰ溶液に対し、前記光源を４０分間照射したもの、ならびに前記光源を照射しないＮＢ－ｄＡＴＰ溶液および未修飾のｄＡＴＰ溶液も用意した。

（２）以下の組成からなる反応液１２μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
１５０ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ モレキュラービーコンプローブ（配列番号２）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号４）
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．３３ｍＭ 照射または未照射のｄＡＴＰもしくはＮＢ－ｄＡＴＰ（（１）で調製）
（３）実施例１（３）と同様な方法で開始剤を添加後、実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。

ｄＡＴＰ溶液もしくはＮＢ－ｄＡＴＰ溶液に対し、紫外光を未照射または１分間から４０分間照射したときの結果を表３に、ＮＢ－ｄＡＴＰ溶液に対し、紫外光を未照射または１分間から１０分間照射したときの結果を表４に、それぞれ示す。反応液にｄＡＴＰを添加したときは紫外光照射の有無によるＴＲＣ反応への影響はなかった（表３）。一方、反応液にＮＢ－ｄＡＴＰを添加したときは、紫外光照射時間によりＴＲＣ反応への影響が変化した。紫外光未照射および照射時間０．０１７分以下では、未修飾ｄＡＴＰが、ＴＲＣ
反応に必要な量、反応液に含まれていないため、ＴＲＣ反応が進まなかった（表３および表４）。紫外光を０．５分間から５分間照射したときは、当該照射により生じた未修飾のｄＡＴＰによりＴＲＣ反応が進行し、未修飾のｄＡＴＰを添加したときと同等の検出時間となった（表３および表４）。紫外光を１０分間以上照射したときは、当該照射により生じた光分解性保護基（２－ニトロベンジル基）によりＴＲＣ反応が阻害され、未修飾のｄＡＴＰを添加したときよりも検出時間は遅くなった（表３および表４）。

実施例４ ＮＢ－ｄＡＴＰを用いたＴＲＣ反応の光制御
ｄＡＴＰの代わりにＮＢ－ｄＡＴＰを添加したＴＲＣ反応液を使用し、光照射によるＴＲＣ反応の制御効果を調べた。

（１）以下の組成からなる反応液１２μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
各０．３３ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
１５０ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ モレキュラービーコンプローブ（配列番号２）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号４）
１２．８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１６６Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．３３ｍＭ ｄＡＴＰまたはＮＢ－ｄＡＴＰ
（２）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、実施例１（３）の記載の組成からなる開始剤６μＬを添加した。保温の際には、４６℃の保温機に、紫外光（波長３６５ｎｍ、強度７００μＷ／ｃｍ^２）照射時間分ずらして保温を始め、検討しているＰＣＲチューブへの紫外光照射が同時に終わるようにした。

（３）紫外光照射終了後、実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。なお検出時間の０分は保温機から蛍光分光光度計へ移動した時点としている。

結果を表５に示す。紫外光を照射しないときは、反応液に未修飾ｄＡＴＰがないためＴＲＣ反応が進まなかった。紫外光を１分照射したときは、当該光照射により反応液に未修飾ｄＡＴＰが存在するものの、その量が少ないため、反応時間は約２５分と遅かった。紫外光を１．５分間から４分間照射したときは、当該照射により生じた未修飾のｄＡＴＰによりＴＲＣ反応が進行し、紫外光照射時間を合わせても１１分前後で検出できた。紫外光を５分間以上照射したときは、当該照射により生じた光分解性保護基（２－ニトロベンジル基）によりＴＲＣ反応が阻害され、未検出となった。本結果より、反応液に含まれるデオキシヌクレオシド三リン酸のうち、少なくとも一つ（本実施例ではデオキシアデノシン三リン酸）を光分解性保護基で修飾することで、ＴＲＣ反応を光で制御できることがわか
る。

実施例５ 光分解性保護基のＴＲＣ反応への影響（その２）
実施例２から４では光分解性保護基として２－ニトロベンジル基を用いたが、本実験では同様に光分解性保護基として利用できる３－（ジエチルアミノ）ベンジル基について、ＴＲＣ反応への影響を調べた。

（１）合成例２から３により、アデノシンの３’末端側ヒドロキシ基に光分解性保護基として３－（ジエチルアミノ）ベンジル基を修飾した、３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシンを合成した。

（２）（１）で合成した３’－Ｏ－［３－（ジエチルアミノ）ベンジル］－２’－デオキシアデノシンを含む溶液が一定の濃度となるようＤＭＳＯに溶解した。

（３）実施例２（３）に記載の組成からなる反応液８μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、実施例１（１）で調製したＲＮＡ試料２μＬを添加した。

（４）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤１０μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１８．４ｍＭ 塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ 塩化カリウム
０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）
２．５％（ｗ／ｖ） グリセロール
１０％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ（光分解性保護基として０から２００μＭ含む、（２）で調製）
（５）実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。

結果を表６に示す。光分解性保護基としてジエチルアミノベンジル基を用いた場合、少なくともその濃度が２００μＭまでであれば、ＴＲＣ反応への影響はないことがわかる。

実施例６ 光分解性保護基修飾プライマーを用いたＴＲＣ反応の光制御
（１）合成例１１で得た、固相担持されたチミジン誘導体を用いて、３’末端（４９番目）のチミジンの３’位のヒドロキシ基を光分解性保護基で修飾した、配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなる第一のプライマー（以下、単に「光分解性保護基修飾プライマー」とも表記する）を合成した（ジーンデザイン社に委託）。なお配列番号７に記載の配列からなる第一のプライマーのうち、５’末端側２８塩基はＴ７プロモーター配列（配列番号６）である。合成品はＨＰＬＣを用いて精製し、エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ＥＳＩ－ＭＳ）で分子量を確認後、ＴＥバッファーで１００μＭに希釈された状態で、－２０℃で保管した。

（２）以下の組成からなる反応液８μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（富士フイルム和光純薬社製）
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３６）
２．５％（ｗ／ｖ） グリセロール
各０．３３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．３ｍＭ ＩＴＰ
９４．５ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ モレキュラービーコンプローブ（配列番号２）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号４）
４５．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）注射用水を用いて１０μＭに調製した、（１）で合成した光分解性保護基修飾プライマー溶液、または（光分解性保護基による修飾のない）配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなる第一のプライマー溶液を、紫外光未照射（紫外光照射時間０分）の状態で、上記の反応液に２μＬ添加した（後述の開始剤添加後の最終濃度として１μＭ）。

（４）（３）で調製した１０μＭ 光分解性保護基修飾プライマー溶液に、紫外光照射装置（Ｏｍｎｉｃｕｒｅ ＬＸ４０５Ｓ ＵＶ ＬＥＤ スポット硬化装置、サンエイテック社製）を用いて、紫外光（波長３６５ｎｍ、強度１ｍＷ／ｃｍ^２）を１分間または１０分間照射した。照射後のプライマー溶液２μＬを上記の反応液に添加した。

（５）標準ＲＮＡ（配列番号１）をＴＥバッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸添加）を用いて１０^５コピー／２μＬとなるように希釈後、上記（３）および（４）で調製した、プライマー溶液を添加した反応液に２μＬずつ添加した。

（６）標準ＲＮＡ添加後、反応液を４６℃で３分間保温し、同様に４６℃で３分間保温した実施例１（３）に記載の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

（７）実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。

結果を表７に示す。紫外線照射時間０分の結果から、（１）で合成した光分解性保護基修飾プライマーを第一のプライマーとして用いると、光分解性保護基による修飾のない第一のプライマーを用いたときと比較し、検出時間が約１分遅れていることがわかる。このことからプライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドを光分解性保護基で修飾することで、ＴＲＣ反応を阻害できることがわかる。一方、（１）で合成した光分解性保護基修飾プライマーを第一のプライマーとして用いたとしても、紫外光を１分間または１０分間照射し、前記保護基を分解させると、前記修飾のない第一のプライマーを用いたときと同等の検出時間になった。このことから、プライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドを光分解性保護基で修飾することで、ＴＲＣ反応を光で制御できることがわかる。

実施例７ ＴＲＣ反応の光制御に伴うＴＲＣ反応性への影響
実施例６では、第一のプライマーのみに紫外光を照射したが、本実験では、第一のプライマーを含めた反応液に紫外光を照射し、当該照射によるＴＲＣ反応への影響を調べた。

（１）実施例６（２）に記載の組成からなる反応液８μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した。

（２）実施例６（３）で調製した、１０μＭ 光分解性保護基修飾プライマー（配列番号７）溶液または（光分解性保護基による修飾のない）第一のプライマー（配列番号７）溶液を、上記の反応液に２μＬずつ添加した（後述の開始剤添加後の最終濃度として１μＭ）。

（３）標準ＲＮＡ（配列番号１）をＴＥバッファー（０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸添加）を用いて１０^５コピー／２μＬとなるように希釈後、上記（２）で調製した、プライマー溶液を添加した反応液に２μＬずつ添加した。

（４）標準ＲＮＡ添加後、反応液を４６℃で３分間保温し、同様に４６℃で３分間保温した実施例１（３）に記載の組成からなる開始剤８μＬを添加後、紫外光（波長３６５ｎｍ、強度１ｍｗ／ｃｍ^２）を１分間照射した。

（５）実施例１（４）と同様な方法で測定し、検出時間を求めた。

結果を表８に示す。反応液全体に紫外光を照射しても、実施例６と同等の検出時間であった。このことから反応液全体に紫外光を照射しても、ＴＲＣ反応への影響はないことがわかる。

Claims (3)

1. ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、リボヌクレオシド三リン酸と、デオキシヌクレオシド三リン酸とを含む、前記標的核酸の増幅試薬（ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している）であって、
   前記標的核酸がＲＮＡであり、
   前記標的核酸の増幅試薬が、光照射によりＲＮＡの増幅反応を開始することを特徴とするＴＲＣ法によるＲＮＡの増幅試薬であり、
   下記＜１＞および＜２＞のうち、少なくともいずれか一つの態様を満たす、前記標的核酸の光制御増幅試薬：
   ＜１＞前記第一および／または前記第二のプライマーが、該プライマーの３’末端のデオキシリボヌクレオチドが光分解性保護基で修飾されている下記一般式（０）で表されるプライマー、
   なお一般式（０）中、Ｚは第一または第二のプライマーを構成するオリゴデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｘは下記式（２）から（５）のいずれかの核酸塩基を表す。
   そしてＹは下記一般式（７）で表される２－ニトロベンジル基
   （一般式（７）中、Ｘ^１ 、Ｘ ^３およびＸ^４ は水素原子を表す。Ｘ ^２ は、水素原子又はヒドロキシメチル基を表す。）
   または下記一般式（６）で表される３－（ジエチルアミノ）ベンジル基を表す。
   （一般式（６）中、Ｒ^１およびＲ^２はともにエチル基を表す。Ｒ^３およびＲ^４ は水素原子を表す。）
   ＜２＞前記デオキシヌクレオシド三リン酸を構成する、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸およびデオキシシチジン三リン酸のうち、少なくともいずれか一つが光分解性保護基で修飾されている下記一般式（１）で表される光応答性デオキシヌクレオシド三リン酸。
   なお一般式（１）中、Ｘは下記式（２）から（５）のいずれかの核酸塩基を表す。
   そしてＹは下記一般式（７）で表される２－ニトロベンジル基
   （一般式（７）中、Ｘ^１ 、Ｘ ^３およびＸ^４ は水素原子を表す。Ｘ ^２ は、水素原子又はヒドロキシメチル基を表す。）
   または下記一般式（６）で表される３－（ジエチルアミノ）ベンジル基を表す。
   （一般式（６）中、Ｒ^１およびＲ^２はともにエチル基を表す。Ｒ^３およびＲ^４ は水素原子を表す。）
2. 請求項１に記載の光制御増幅試薬を含む、前記標的核酸の検出試薬。
3. 請求項２に記載の標的核酸の検出試薬を用いて標的核酸を増幅する方法であって、光照射により標的核酸の増幅反応を開始し、増幅した標的核酸を検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。