JP7724765B2 - ナチュラルキラー細胞の増殖を亢進する、および細胞障害性を増強するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年７月３１日に出願された米国仮出願第６２／８８１，３１１号、および２０１９年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／９３２，３４２号の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりそれぞれの全体を援用する。

技術分野
本明細書に開示する方法および組成物のいくつかの実施形態は、操作された免疫細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＴ細胞の増殖の亢進、および／または細胞障害性の増強に関する。

背景技術
細胞免疫療法における操作された細胞の使用は免疫系の様々な態様を利用して病気や損傷を受けた細胞を標的とする、および破壊する事で、がんまたはその他の疾患を処置することが可能である。このような治療には、治療に必要な投与量に十分な数の操作された細胞が必要である。

ＡＳＣＩＩテキストファイル中の資料の参照による援用
本願は、同時に提出される以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照により援用する：ファイル名：ＮＫＴ ０３４ＷＯ＿ＳＴ ２５．ｔｘｔ；作成日：２０２０年７月２０日；サイズ：１２３ＫＢ。

概要
いくつかの実施形態では、細胞免疫療法において使用する免疫細胞の増殖を亢進するための様々な方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、免疫細胞を、１以上の可溶性サイトカインを添加した培地中でフィーダー細胞株と共培養する方法を提供し、ここで、サイトカインは共培養中に少なくとも１度培地に追加される。いくつかの実施形態では、該免疫細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、増殖させたＮＫ細胞はキメラ受容体を発現するように細胞を操作する事（例えば、がん免疫療法における使用のために）などの細胞工学に対して意外にも従順である。いくつかの実施形態では、可溶性インターロイキン添加培地を用いて共培養したＮＫ細胞（またはその他の免疫細胞）は、可溶性インターロイキン添加培地中での共培養の対象でないＮＫ細胞よりも強固に係るキメラ受容体を発現する。さらに、いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は予想外の細胞障害性の増強を示す。

いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団をフィーダー細胞集団と培養培地中で共培養する工程、培養培地にインターロイキン２（ＩＬ２）を添加する工程、および培養培地にインターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、およびその組み合わせ、から選択された少なくとも１つの可溶性刺激剤を添加する工程を含む、免疫療法において使用するためのナチュラルキラー細胞の増殖を亢進するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞集団は４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するよう操作された細胞を含む。

いくつかの実施形態では、であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とＮＫ細胞を接触させてＮＫ細胞にＣＡＲを発現させる工程、ＮＫ細胞集団をフィーダー細胞集団と培養培地中で共培養する工程、培養培地にインターロイキン２を添加する工程、培養培地に少なくとも１つの可溶性刺激剤を添加する工程、を含む、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞障害性を増強する方法であって、ここで可溶性刺激剤はインターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン２１、およびその組み合わせから選択され、ここで、培地に該少なくとも１つの可溶性刺激剤を添加する事によって、該少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較してＣＡＲを発現するＮＫ細胞の細胞障害性が増強される、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加によって、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞の増殖が亢進する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加によって、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞の増殖が亢進する。いくつかの実施形態では、例えば、活性（例えば、標的細胞または細胞に対する細胞障害性）、寿命（培養中、またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれか）、活性（例えば、活性の増強または活性の持続性）などの１以上のＮＫ細胞の追加的な特徴が増強される。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞の持続性および／または細胞障害性と比較して、この培養方法はＮＫ細胞の１以上の持続性および／または細胞障害性を増強する。いくつかの実施形態では、得られるＮＫ細胞は、（ｉ）ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｃの発現の増加、および／または（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ６２リガンドの発現の減少、または同等な発現、によって特徴付けられる記憶細胞様の表現型を示し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）における発現はどちらも、１以上の可溶性刺激分子が無い事を除いて同一の条件で培養したＮＫ細胞との比較による。有利なことに、いくつかの実施形態では、得られるＮＫ細胞は、少なくとも１つの可溶性刺激剤を含むがフィーダー細胞を含まない培地中で培養したＮＫ細胞と比較して、対象に投与した際にサイトカイン離脱徴候の減少を示す。これは、使用する高濃度のサイトカインへの依存をＮＫ細胞が示す、その他のＮＫ細胞を増殖させる方法とは対照的である。このような方法では、患者に投与されるなど培養環境から除かれた際にＮＫ細胞は生存率の低下を示し、そのため腫瘍細胞の根絶におけるＮＫ細胞の有用性および／または有効性が限定され得る。

いくつかの実施形態では、培地を補うために使用される可溶性刺激剤は、ＩＬ１２およびＩＬ１８の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２およびＩＬ１８を組み合わせて使用する場合、ＩＬ２１は使用しない。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１は使用されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、共培養を開始してから１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、または２４時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、共培養を開始してから１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、または２４時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、共培養を開始してから１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、共培養を開始してから１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、または２４時間以内の時点で、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度の可溶性ＩＬ１２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、共培養を開始してから２４時間以内の時点で、約５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、共培養を開始してから１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、共培養を開始してから１２０時間以内の時点で、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の可溶性ＩＬ１２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、共培養を開始してから１２０時間以内の時点で、約５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８を含み、およびここで、培養培地には、１回目のＩＬ２の培地への添加よりも高い濃度で２回目のインターロイキン２を添加し、およびここで、前記濃度が共培養を開始してから１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、または２４時間以内の時点で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８を含み、およびここで、培養培地には、１回目のＩＬ２の培地への添加よりも高い濃度で２回目のインターロイキン２を添加し、およびここで、共培養を開始してから１２０時間以内の時点で前記濃度が存在する。

いくつかの実施形態では、フィーダー細胞集団はＫ５６２細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞集団は７２１．２２１細胞株ではない。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）は、共培養前に照射処理される。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞（例えば、Ｋ５６２）細胞は、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両者を発現する。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞（例えば、Ｋ５６２）細胞は、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両者を発現し、かつ共培養の開始前に照射処理される。

いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの刺激剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。ＩＬ１２を用いるいくつかの実施形態では、ＩＬ１２は、約７ｎｇ／ｍｇ未満の濃度で細胞培養培地に添加される。ＩＬ１８を用いるいくつかの実施形態では、ＩＬ１８は、約４０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で細胞培養培地に添加される。複数の刺激性サイトカインを用いるいくつかの実施形態では、ＩＬ１２の濃度は約７ｎｇ／ｍＬ未満であり、ＩＬ１８の濃度は約４０ｎｇ／ｍＬ未満である。いくつかのこのような実施形態では、ＩＬ２は初期濃度で存在し、および後に追加のＩＬ２が添加される。いくつかのこのような実施形態では、このＩＬ２の初期濃度は約５０ ＩＵ／ｍＬから約５００ ＩＵ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度となるように培地にＩＬ２を添加する。さらなる実施形態では、約５０ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度となるように培地にＩＬ２を添加する。いくつかの実施形態では、ＩＬ２の初期濃度は約５０ ＩＵ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度となるように追加のＩＬ２を後で培地へと添加する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、前記共培養から１２０時間以内の時点で約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合型ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤は前記インターロイキン１２および前記インターロイキン１８の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、前記共培養から１２０時間以内の時点で約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、前記共培養から１２０時間以内の時点で約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度の可溶性ＩＬ１２を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、前記共培養から１２０時間以内の時点で約５０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の可溶性ＩＬ１２および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の可溶性ＩＬ１８を含み、ここで、培養培地は、１回目の培養培地へのＩＬ２の添加よりも高い濃度で２回目のインターロイキン２を添加され、ここで、各濃度は前記共培養から１２０時間以内の時点におけるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は追加量の少なくとも一つの可溶性刺激剤を培地に添加する事をさらに含む。いくつかの実施形態では、培地への２回目の添加は、１回目の添加後１２時間から１２０時間の間である。さらなる実施形態では、さらなる培地への添加は、後の時点で行われる。いくつかの実施形態では、可溶性剤、例えば、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の濃度は、それぞれの２回目の時点において、１回目の時点と同じである。ある実施形態では、それらの後の濃度は異なっている（例えば、より高い）。

いくつかの実施形態では、標的がん細胞上のマーカーに結合し、かつ結合の際にＮＫ細胞による標的がん細胞に対する細胞障害効果の発揮を誘導するように構成された、操作されたキメラ受容体を含む操作されたナチュラルキラー細胞集団を提供し、ここで、ＮＫ細胞は少なくとも１つの可溶性刺激剤の存在下での培養において増殖し、ここで、可溶性刺激剤はインターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン２１、およびその組み合わせから選択され、およびここで操作されたＮＫ細胞集団は、少なくとも部分的に、（ｉ）ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｃの発現の増加、および／または（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ６２リガンドの発現の減少、または同等な発現によって特徴付けられる記憶細胞様の表現型を示し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）における発現はどちらも、可溶性刺激分子が無い事を除いて同一の条件で培養したＮＫ細胞との比較によるものである。

いくつかの実施形態では、操作されたキメラ受容体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、操作されたキメラ受容体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターにＮＫ細胞を接触させる工程をさらに含む。ある実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体グループＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドの１以上を標的とするように構成される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２サブドメインを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生産されるＮＫ細胞は、がんの処置のための医薬の調製において使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生産されるＮＫ細胞は、がんの処置のためのものである。本明細書に開示される任意の方法を使用して増殖させた治療有効量の操作されたＮＫ細胞を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法もまた、提供される。

いくつかの実施形態では、細胞増殖用の培養培地であって、約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度で供されるＩＬ２；約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で供されるＩＬ１２；および約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で供されるＩＬ１８、を含む培養培地がまた提供される。

いくつかの実施形態では、細胞増殖用の組み合わせ培養培地であって、組み合わせには約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度で供されるＩＬ２、約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で供されるＩＬ１２、および約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で供されるＩＬ１８、および細胞膜表面に結合するＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）、を含む培養培地がまた提供される。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５はフィーダー細胞の細胞膜表面に結合する。いくつかの実施形態では、培養培地および／または組み合わせ培養培地は少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つの無機塩、および少なくとも１つのビタミンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、免疫療法において使用するナチュラルキラー細胞の増殖を亢進するための方法であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団をフィーダー細胞集団と培養培地中で共培養する工程、第１の時点において少なくとも１つの刺激剤を培養培地に添加する工程であって、ここで可溶性刺激剤がインターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン２１、およびその組み合わせから選択される工程、および第２の時点において追加量の少なくとも１つの可溶性刺激剤を培養培地に添加する工程、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は第２の期間中フィーダー細胞と共培養される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤を培地に添加することによって、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下においてフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞の増殖が亢進される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間である。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞集団は、４－１ＢＢＬおよび膜結合型ＩＬ－１５の１以上を発現するように操作された細胞を含む、いくつかの実施形態では、方法はまた、インターロイキン２の培養培地への添加を含む。いくつかの実施形態では、第１の時点と第２の時点は、１２時間以上１２０時間未満離れている。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される濃度は、当該分子または剤の培養培地中における終濃度である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される濃度は、所定の容量の培地に添加される前に、溶解された（該当する場合）分子または剤の濃度である。ある実施形態では、該濃度は１２、２４、７２または１２０時間以内の時点で存在する。ある実施形態では、１以上の剤が使用される場合、各剤の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ、または約１ ＩＵ／ｍＬから約１０００ ＩＵ／ｍＬである（および、例えば１２、２４、７２または１２０時間以内の時点で存在する）。その他の実施形態では、１以上の剤が使用される場合、全ての剤の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ、または約１ ＩＵ／ｍＬから約１０００ ＩＵ／ｍＬの間である（および、例えば１２、２４、７２または１２０時間以内の時点で存在する）。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの可溶性刺激剤はＩＬ１２およびＩＬ１８の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第１の時点は、ＮＫ細胞とフィーダー細胞の共培養の開始時であり、および／または第２の時点は第２の期間の開始時である。いくつかの実施形態では、第１の時点および第２の時点は約２４から１２０時間離れており、および刺激剤の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、（ｉ）約１０ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度はそれぞれ、第１の時点とそれぞれの第２の時点とで同じである。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度はそれぞれ、第１の時点とそれぞれの第２の時点で異なる。いくつかの実施形態では、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度は互いに等しい。

いくつかの実施形態では、方法はまた、キメラ受容体をコードする核酸コンストラクトを、増殖させたＮＫ細胞にトランスダクションする工程を含み、ここでキメラ受容体の発現は、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞のキメラ受容体の発現と比較して、増強される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の細胞障害性は、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞のキメラ受容体の細胞障害性と比較して、予想外に増強される。

がんの処置のための、および／またはがんの処置のための医薬の調製のための本明細書に開示する方法によって増殖させたＮＫ細胞の使用もまた、本明細書において提供される。

図面の簡単な説明
以下の図面の説明は、本明細書に記載の発明の非限定的な実施形態を表す実験および結果に関する。

図１Ａおよび１Ｂは、本明細書に開示する実施形態に従ってＮＫ細胞の増殖を亢進させるために使用する増殖プロトコルの非限定的な例を示す。 同上。

図２は、本明細書に開示する方法論の非限定的な実施形態を含む、様々な増殖の方法論を用いた、ＮＫ細胞の増殖倍率を比較したデータを示す。

図３Ａ－３Ｂは、４人の異なるドナーから得た様々な条件下でのＮＫ細胞の増殖に関するデータを示す。図３Ａはフィーダー細胞のみで（上の行）またはサイトカインの添加を用いて（下の行）増殖させたＮＫ細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄの発現を測定したフローサイトメトリーのデータを示す。図３Ｂは、様々な条件下で、ＮＫＧ２Ｄを備えるキメラ受容体コンストラクト（ＮＫＸ１０１）を用いた代表的なトランスダクションの平均蛍光強度を測定した。 同上。

図４は、フィーダー細胞のみを用いる、またはサイトカインを添加する条件下で、増殖後の様々な時点におけるＮＫ細胞の細胞障害性に関するデータである。 同上。

図５Ａ－５Ｂは、ＮＫ細胞の記憶表現型を示す特定のマーカーの発現に関するデータを示す。

図６は、示されたサイトカインによって増殖中に刺激される、またはされない場合におけるＮＫ細胞の抗腫瘍活性に関するｉｎ ｖｉｖｏのデータを示す。 同上。

図７Ａ－７Ｂは、様々な条件下でのＮＫ細胞の増殖に関する。図７Ａは、過飽和、飽和、または準飽和、として定められた様々なＩＬ１２／ＩＬ１８の濃度を示す。図７Ｂは、様々な培養条件下でのＮＫ細胞増殖のデータを示す。 同上。

図８は、培養培地中のＩＬ１２および／またはＩＬ１８の濃度を変化させて培養したＮＫ細胞によるインターフェロンガンマの放出に関するデータを示す。

図９Ａ－９Ｈは、示した条件における、培養から７日後のＮＫ細胞増殖の評価に関する。図９Ａは各培養群についての要約データを示す。図９Ｂは群の統計比較を提供する。 図９Ｃは、４ｎｇ／ｍｌのＩＬ１８と様々な濃度のＩＬ１２を含む特定の滴定データセットの増殖倍率のデータ（７日目）を示す。 図９ＤはＩＬ１８を２０ｎｇ／ｍｌとした場合の類似のデータを示す。 図９Ｅは２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８、４０ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および示した濃度のＩＬ１２を用いた培養の７日目における操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。 図９Ｆは２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８、４００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および示した濃度のＩＬ１２を用いた培養の８日目における操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。 図９Ｇは４ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８、４０ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および示した濃度のＩＬ１２を用いた培養の７日目における操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。 図９Ｈは４ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８、４００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および示した濃度のＩＬ１２を用いた培養の８日目における操作されたＮＫ細胞の生存率を示す。

図１０Ａ－１０Ｂは、ＮＫ細胞の細胞障害性の評価に関する。図１０Ａは培養から８日目の各培養群におけるＮＫ細胞の細胞障害性の要約データを示す。図１０Ｂは細胞障害性の統計比較を提供する。

図１１Ａ－１１Ｂは、ＮＫ細胞の細胞障害性の評価に関する。図１１Ａは培養から１５日目の各培養群におけるＮＫ細胞の細胞障害性の要約データを示す。図１１Ｂは細胞障害性の統計比較を提供する。

図１２は、キメラ受容体コンストラクトをトランスダクションし、および様々な条件下で培養した２人のドナー由来のＮＫ細胞の発現データを示す。 同上。

図１３は、キメラ受容体コンストラクトをトランスダクションし、および様々な条件下で培養した追加の２人のドナー由来のＮＫ細胞の発現データを示す。 同上。

図１４Ａ－１４Ｂは細胞障害性のデータを示す。図１４ＡはＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体をトランスダクションし、および示した条件において培養したＮＫ細胞の細胞障害性に関する要約データを示す。図１４Ｂは群の統計比較を示す。

図１５Ａ－図１５Ｄは、ＮＫＧ２Ｄ標的キメラ受容体をトランスダクションされたＮＫ細胞の示した条件下で培養後の細胞障害効果に関する。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＧＦＰコードベクターまたはＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体をコードするベクターのどちらかをトランスダクションした後１３日後の、２人の異なるドナーに由来するＮＫ細胞の細胞障害性に関するデータを示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、トランスダクション後２１日目の、同じ２人のドナーに対応する細胞障害性のデータを示す。 同上。

図１６Ａ－１６Ｂは、ＮＫ細胞の表現型に関するデータを示す。図１６Ａは、ＮＫ細胞による記憶様の表現型に関連するマーカーの、示した培養条件における経時的な発現に関するデータを示す。図１６Ｂは培養中における経時的なマーカーの発現の進行を示すフローサイトメトリーデータを示す。 同上。

図１７Ａ－１７Ｄは、ＮＫ細胞による、様々な培養条件における選択されたマーカーに関する発現データの要約を示す。図１７ＡはＣＤ６２リガンドに関する発現データを示し、図１７ＢはＮＫＧ２Ｃの発現を示し、図１７ＣはＣＤ５７の発現を示し、および図１７ＤはＣＤ６２ＬおよびＮＫＧ２Ｃの発現を示す。 同上。

図１８は、トランスダクション後２１日目における、ＮＫＧ２Ｄリガンド指向性キメラ受容体またはＧＦＰを発現するＮＫ細胞の細胞障害性のデータを示す。

図１９は、変化させた培養条件下で成長させたＮＫ細胞の細胞生存率および増殖データを示す。

図２０は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをトランスダクションし、および示した条件を用いて培養したＮＫ細胞の発現データ（フラッグタグに基づく）を示す。このデータは、増殖１５日目に取得した。

図２１は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをトランスダクションし、および示した条件を用いて培養したＮＫ細胞の発現データ（フラッグタグに基づく）を示す。このデータは、増殖２２日目に取得した。

図２２Ａ－２２Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の細胞障害性に関するデータを示す。図２２Ａにおいて、ＮＫ細胞は、示した条件を用いて増殖しおよび示したＥ：Ｔ比を用いてＮａｌｍ６細胞に対して障害させた（３人のドナーの平均）。 図２２Ｂは細胞障害性データの要約を示す。 図２２Ｃはエフェクター対標的比の関数としての細胞障害性データを示した。

図２３は、肝細胞がん異種移植モデルにおける、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体を発現するＮＫ細胞の細胞障害性を評価するための実験設定の概略を示す。

図２４は、示した処置を受けたマウスの経時的な腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の要約を示す。

図２５は、増殖培養条件が、ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞障害性に与える影響を評価するための実験設定の概略を示す。

図２６Ａ－２６Ｆは、新鮮な、または凍結保存したＮＫ細胞の、細胞障害性、生存率のデータ、ＮＫ細胞の持続性に関するデータ、およびＣＡＲ発現に関するデータを示す。図２６Ａは、示した条件下で増殖させたＮＫ細胞の異種移植モデルにおけるＮａｌｍ６細胞に対する細胞障害性に関するデータを示す。 図２６Ｂは、示した処置を受けたマウスの生存曲線を示す。 図２６Ｃは、増殖培養条件に基づいて分けた、注入後１８日後のマウス血液中におけるヒトＮＫ細胞の検出に関するデータを示す。 図２６Ｄは、増殖培養条件に基づいて分けた、注入後１８日後のマウス血液中におけるＣＡＲ－陽性のＮＫ細胞の検出に関するデータを示す。 図２６Ｅは、追加の刺激分子の存在または非存在下における増殖１５日目の、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するＮＫ細胞（新鮮または凍結保存のいずれか）の割合に関する発現データを示す。 図２６Ｆは、追加の刺激分子の存在または非存在下における増殖２２日目の、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するＮＫ細胞（新鮮または凍結保存のいずれか）の割合に関する発現データを示す。

図２７Ａ－２７Ｃは、本明細書に開示される実施形態を参照する様々なＣＤ１９指向性ＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性に関する。図２７Ａは、ＮＫ細胞に発現する、様々なヒト化ＣＤ１９指向性ＣＡＲコンストラクトの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を評価するための実験プロトコルの概略図を示す。試験される様々な実験群は示した通りである。「ＩＬ１２／ＩＬ１８」と指定された細胞について、この細胞は、本明細書に開示される実施形態を参照して、可溶性ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の存在下で増殖させる。 図２７Ｂおよび図２７Ｃは、Ｎａｌｍ６腫瘍細胞を投与され、および示したコンストラクトで処置された動物から得た生物発光データを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図２８Ａ－２８Ｊは、図２７Ｂ－Ｃからの生物発光データのグラフ図を示す。図２８Ａは、非導入ＮＫ細胞を受けた動物からの生物発光（フラックス（光子／秒）として）を示す。図２８Ｂは、ビヒクルとしてＰＢＳを受けた動物で測定したフラックスを示す。 図２８Ｃは、ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的例として）を発現する予め冷凍したＮＫ細胞を受けた動物において測定したフラックスを示す。図２８Ｄは、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８を使用して増殖させた、ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的例として）を発現する予め冷凍したＮＫ細胞を受けた動物において測定したフラックスを示す。 図２８Ｅおよび図２８Ｆは、ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的例として）を発現する新鮮ＮＫ細胞を受けた動物において測定したフラックスを示す。 図２８Ｇおよび図２８Ｈは、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８を使用して増殖させた、ＮＫ１９ ＮＦ２ ＣＡＲ（ＣＡＲの非限定的例として）を発現する予め新鮮ＮＫ細胞を受けた動物において測定したフラックスを示す。 図２８Ｉは、腫瘍接種後最初の３０日にわたって種々の群で測定した生物発光を示す折れ線グラフを示す。 図２８Ｊは、腫瘍接種後最初の５６日にわたって種々の群で測定した生物発光を示す折れ線グラフを示す。

図２９は、示した治療を受けたときのマウスの体重に関する経時的なデータを示す。

図３０Ａ－３０Ｃは、ＣＡＲを発現するように操作された（本明細書に開示されるように）、および１以上の刺激性サイトカインの存在または非存在下で増殖させたＮＫ細胞を特徴付けるデータに関するデータを示す。図３０Ａは、動物の血液中における経時的な、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合に関するデータを示す。 図３０Ｂは、動物の血液中における、５０日の期間にわたる、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合に関するデータを示す。 図３０Ｃは、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合に関しての経時的な、および試験した生存細胞数に基づくデータを示す。

図３１Ａ－３１Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現およびＣＡＲを発現する細胞の特徴に関連する、３匹の異なるマウスから得たデータ（それぞれ３１Ａ、３１Ｂ、および３１Ｃ）を示す。 同上。

図３２Ａ－３２Ｃは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現およびＣＡＲを発現する細胞の特徴に関連する、３匹の異なるマウスから得たデータ（それぞれ３２Ａ、３２Ｂ、および３２Ｃ）を示す。 同上。

図３３Ａ－３３Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与（図２７Ａのプロトコル）から４日後に採取した血液サンプルから得た発現データの要約を示す。図３３Ａは、示した実験群についての全血サンプルから得たＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。 図３３Ｂは、各実験群について特定の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合を示す。 図３３Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性の腫瘍細胞の数に関連するデータを示す。

図３４Ａ－３４Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与（図２７Ａのプロトコル）から１２日後に採取した血液サンプルから得た発現データの要約を示す。図３４Ａは、示した実験群についての全血サンプルから得たＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。 図３４Ｂは、各実験群について特定の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合を示す。 図３４Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性の腫瘍細胞の数に関連するデータを示す。

図３５Ａ－３５Ｅは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与（図２７Ａのプロトコル）から１８日後に採取した血液サンプルから得た発現データの要約を示す。図３５Ａは、示した実験群についての全血サンプルから得たＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を示す。 図３５Ｂは、フィコエリトリン（ＰＥ）－コンジュゲート抗体を使用して測定した、各実験群のＣＤ１９－陽性腫瘍細胞の割合を示す。 図３５Ｃは、各実験群について検出されたＧＦＰ陽性の腫瘍細胞の数に関連するデータを示す。 図３５Ｄは、抗ＣＤ１９ ＦＣ抗体を使用して測定した、各実験群について特定の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合を示す。 図３５Ｅは、各処置群における、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の割合を示す。

図３６は、４週間にわたって収集した、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の半減期に関連するデータであって、それぞれＮＫ細胞の２つの投与量について、リンパ球１０，０００個当たりのＮＫ細胞数として測定した。２つの投与量は、（ｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する２００万個のＮＫ細胞、および（ｉｉ）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する５００万個のＮＫ細胞である。これらのデータは３回目のＮＫ細胞投与後に収集されたものです。

図３７は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするＣＡＲを発現するように操作され、および追加の刺激性サイトカインを使用せずに増殖させた凍結保存したＮＫ細胞の半減期について収集したデータを示す。

詳細な説明
がん免疫療法またはその他の疾患に対する細胞療法は、細胞を操作して目的のコンストラクトを発現させる技能に関して非常に発展してきたが、患者に投与するために臨床的に適切なそれらの細胞の数が依然必要とされている。これは特に、操作されかつ後に投与されるべき天然の免疫細胞がその他の種類の免疫細胞に比べて少ない場合に重要である。この場合、より大量の出発材料から開始する必要があるが、これは現実的でない場合もあり、それかまたはＮＫ細胞などの目的の免疫細胞を（ある場合では優先的に）増殖させるためのより効率的な方法および組成物を開発するかのいずれかが必要である。そのため、本明細書のいくつかの実施形態では、有利なことにＮＫ細胞（またはその他の免疫細胞）の増殖の亢進のみならず、それらの細胞の細胞障害性の増強を可能にする方法および組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示する改変した「フィーダー」細胞を免疫細胞の出発集団と共培養し、かつ増殖中のある時点で種々のサイトカインを当該共培養に添加する事から得られる、増殖しおよび活性化したＮＫ細胞集団を提供する。

免疫細胞の増殖において使用するための細胞。
いくつかの実施形態では、増殖させるべき免疫細胞集団との共培養において細胞株が使用される。このような細胞株は、本明細書において「刺激細胞」または「フィーダー細胞」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では免疫細胞の集団全体を増殖させ、またいくつかの実施形態では選択された免疫細胞の亜集団を増殖させる。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞を、その他の免疫細胞の亜集団（例えばＴ細胞）よりも増殖させる。その他の実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞の両方を増殖させる。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞自体が遺伝子的に改変される。ある実施形態では、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞に対する阻害効果を有するＭＨＣＩ分子を発現しない。ある実施形態では、フィーダー細胞はＭＨＣＩの発現を完全に欠く必要はないが、フィーダー細胞は野生型の細胞と比較して低いレベルでＭＨＣＩ分子を発現し得る。例えば、いくつかの実施形態では、野生型の細胞がＭＨＣをＸのレベルで発現する場合、使用される細胞株は、Ｘの９５％以下、Ｘの９０％以下、Ｘの８５％以下、Ｘの８０％以下、Ｘの７０％以下、Ｘの５０％以下、Ｘの２５％以下、および列記した数値間の任意の発現レベルでＭＨＣを発現し得る。いくつかの実施形態では、刺激細胞は不死化された、例えばがん細胞株である。しかし、いくつかの実施形態では、刺激細胞は初代細胞である。

実施形態に応じて様々な種類の細胞がフィーダー細胞として使用され得る。これらには、とりわけＫ５６２細胞、あるＷｉｌｍ’ｓ腫瘍細胞株（例えば、Ｗｉｌｍｓ腫瘍細胞株ＨＦＷＴ）、子宮内膜腫瘍細胞（例えば、ＨＨＵＡ）、黒色腫細胞（例えば、ＨＭＶ－ＩＩ）、肝芽腫細胞（例えば、ＨｕＨ－６）、小細胞肺がん細胞（例えば、Ｌｕ－１３０およびＬｕ－１３４－Ａ）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＮＢ１９およびＮＢ６９）、胚性がん精巣細胞（例えば、ＮＥＣ１４）、子宮頸がん細胞（ＴＣＯ－２）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＴＮＢ１）、７２１．２２１ＥＢＶにより形質転換したＢ細胞株、を含むが、これに限らない。

さらなる実施形態では、フィーダー細胞は、ＭＨＣＩ発現が低下（または欠如）しているだけでなく、ＭＨＣＩＩ発現も低下（または欠如）している。ある実施形態では、元々ＭＨＣクラスＩ分子を発現し得るその他の細胞株を、それらの細胞のＭＨＣＩ発現を抑制またはノックアウトする遺伝子改変と組み合わせて使用し得る。遺伝子改変は、遺伝子編集技術（例えば、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステム；ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を用いたＲＮＡ編集；ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮなど）、阻害ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または細胞表面におけるＭＨＣＩ分子の発現を破綻させるおよび／または抑制するその他の分子的方法、の使用によって達成され得る。

以下にさらに詳述するとおり、いくつかの実施態様では、フィーダー細胞は、免疫細胞増殖および活性化を促進するために、ある刺激分子（例えばインターロイキン、ＣＤ３、４－１ＢＢＬなど）を発現するよう操作される。操作されたフィーダー細胞は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に開示されており、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。いくつかの実施態様では、インターロイキン１２、１８および／または２１などの刺激分子を、例えば所定の時点でかつ特定の量を、共培養培地に別々に加えて、免疫細胞の所望の亜集団の増殖の亢進をもたらす。

刺激分子
上記に略述するように、ある分子は、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞の増殖を促進し、これには操作されたＮＫ細胞またはＴ細胞を含む。実施形態によっては、刺激分子は、免疫細胞集団を増殖させるために使用されるフィーダー細胞表面に発現する。例えば、いくつかの実施形態ではＫ５６２フィーダー細胞集団は、４－１ＢＢＬおよび／または膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。さらなる実施形態は、さらなる膜結合型インターロイキンまたは刺激剤に関する。このようなさらなる膜結合性の刺激分子は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８に見られ、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、操作されたフィーダー細胞および操作されたＮＫ細胞が共培養される培養培地への１以上の刺激分子の添加に関する。いくつかの実施形態では、１以上のインターロイキンが添加される。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＬ２が培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２が培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ１８が培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１が培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、および／またはＩＬ２１の２以上の組み合わせが培地に添加される。ある実施形態では、ｍｂＩＬ１５を有するフィーダー細胞の使用に代えて可溶性ＩＬ１５が培地に添加される（単独で、またはＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１のいずれかと組み合わせて）。

いくつかの実施形態では、培地は１以上のビタミン、無機塩および／またはアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、培地は、グリシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン（例えば、Ｌ－システイン ２ＨＣｌ）、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン（例えば、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物）、およびＬ－バリンの内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種または全てを含む。いくつかの実施形態では、培地は、ビオチン、塩化コリン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、パラアミノ安息香酸、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、及びビタミンＢ１２の内の１、２、３、４種、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、培地は、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ_３）_２ ４Ｈ_２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（例えば、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水））、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、およびリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）（例えば、無水リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４））の内の１、２、３、４種またはそれ以上を含む。

いくつかの実施形態では、培地はＤ－グルコースおよび／またはグルタチオン（任意には還元型グルタチオン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、培地は約１％から約２０％の範囲の量の血清（例えばウシ胎児血清）をさらに含む。いくつかの実施形態では、血清は熱不活化される。いくつかの実施形態では、培地は血清を含まない。いくつかの実施形態では、培地はゼノフリーである。

実施形態によっては、ＩＬ２は培地を補い、ＮＫ細胞の増殖を亢進するか、またはその他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ２の濃度は、約１ ＩＵ／ｍＬから約１０００ ＩＵ／ｍＬの範囲であって、例えば、約１ ＩＵ／ｍＬから約５ ＩＵ／ｍＬ（例えば、１、２、３、４、および５）、約５ ＩＵ／ｍＬから約１０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、５、６、７、８、９、および１０）、約１０ ＩＵ／ｍＬから約２０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、約１０、１２、１４、１６、１８、および２０）、約２０ ＩＵ／ｍＬから約３０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、約２０、２２、２４、２６、２８、および３０）、約３０ ＩＵ／ｍＬから約４０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、３０、３２、３４、３６、３８、および４０）、約４０から約５０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、４０、４２、４４、４６、４８、５０）、約５０ ＩＵ／ｍＬから約７５ ＩＵ／ｍＬ（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、および７５）、約７５ ＩＵ／ｍＬから約１００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、および１００）、約１００ ＩＵ／ｍＬから約２００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、１００、１２５、１５０、２７５、および２００）、約２００ ＩＵ／ｍＬから約３００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、２００、２２５、２５０、２７５、および３００）、約３００ ＩＵ／ｍＬから約４００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、３００、３２５、３５０、３７５、および４００）、約４００ ＩＵ／ｍＬから約５００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、４００、４２５、４５０、４７５、および５００）、約５００ ＩＵ／ｍＬから約７５０ ＩＵ／ｍＬ（例えば、５００、５５０、６００、６５０、７００、および７５０）、または約７５０ ＩＵ／ｍＬから約１０００ ＩＵ／ｍＬ（例えば、７５０、８００、８５０、９００、９５０、および１０００）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２は培養中の複数の時点において添加され得る。あるこのような実施形態では、使用されるＩＬ２の濃度は選択される時点によって異なる。

実施形態によっては、ＩＬ１２Ａおよび／またはＩＬ１２Ｂは培地を補い、ＮＫ細胞の増殖を亢進するか、またはその他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ１２（ＩＬ１２ＡまたはＩＬ１２Ｂのいずれか）の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であって、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間であり、終点を含むその間の任意の濃度を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂの混合物が使用される。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ａ：ＩＬ１２Ｂの特定の比率が使用され、例えば、１：１０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０：、１：５００、１：１０００、１：１０，０００、１０，０００：１、１０００：１、５００：１、２５０：１、１５０：１、１００：１、１０：１および終点を含むその間の任意の比率が使用される。

いくつかの実施形態では、インターロイキン１８（ＩＬ１８）はＮＫ細胞の増殖を亢進するか、またはその他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ１８の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であって、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。

いくつかの実施形態ではインターロイキン２１（ＩＬ２１）はＮＫ細胞の増殖を亢進するか、またはその他の特徴を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ２１の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であって、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。

いくつかの実施形態ではインターロイキン１５（ＩＬ１５）は、ＮＫ細胞の増殖を亢進するか、またはその他の特徴を増強するために可溶性の形態（フィーダー細胞上のｍｂＩＬ１５の代わりに、またはそれに加えて）で使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ１５の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であって、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。

いくつかの実施形態ではインターロイキン２２（ＩＬ２２）はＮＫ細胞の増殖を促進するために使用される。いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ２２の濃度は約０．０１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍＬの範囲であって、例えば、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約０．０５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、および０．０５）、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約０．１ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９および０．１）、約０．１ｎｇ／ｍＬから約０．５ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５）、約０．５ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０）、約１．０ｎｇ／ｍＬから約２．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、および２．０）、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２．０、３．０、４．０、および５．０）、約５．０ｎｇ／ｍＬから約１０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０および１０．０）、約１０．０ｎｇ／ｍＬから約１５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、および１５．０）、約１５．０ｎｇ／ｍＬから約２０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、および２０．０）、約２０．０ｎｇ／ｍＬから約２５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２４．０、および２５．０）、約２５．０ｎｇ／ｍＬから約３０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５．０、２６．０、２７．０、２８．０、２９．０、および３０．０）、約３０．０ｎｇ／ｍＬから約５０．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、および５０．０）、約５０．０ｎｇ／ｍＬから約７５．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、および７５．０）、約７５．０ｎｇ／ｍＬから約１００．０ｎｇ／ｍＬ（例えば、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、および１００．０）、および終点を含むその間の任意の濃度を含む。

２つの刺激剤を使用する場合、その２つの相対比は、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：５００、１：７５０、１：１、０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１、０００：１、７５０：１、５００：１、２５０：１、２００：１、１５０：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、および終点を含む列記した比率間の任意の比率の範囲であり得る。同様に、例えば３つ、あまたはそれ以上の剤が使用される場合、これらの追加剤およびその他の剤間の比率は、前述の比率の何れかを採用し得る。

以下に詳述するように、実施形態によっては、刺激分子は、増殖過程の間の特定の時点で添加されるか、またはそれらが共培養過程を通して培養培地の成分として存在するように添加され得る。

共培養および免疫細胞増殖の方法。
いくつかの実施形態では、末梢血ドナーサンプルから単離されたＮＫ細胞を、４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現するよう改変したＫ５６２細胞と共培養する。その他のアプローチではその他の膜結合型サイトカインの発現を含むが、複数の刺激分子をもつフィーダー細胞を生成は困難であり得る（例えば、所望のレベルでの様々な刺激分子の発現、増殖中の適切な時点での発現を達成する事など）。したがって、本明細書に開示するいくつかの実施形態は、特定の時点で、様々な刺激剤を特定の濃度で培養培地に添加する事に関する。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は培養器に播種され、およびコンフルエント付近に達することができる。そして免疫細胞を、いくつかの実施形態では約０．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２から約５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の範囲、終点を含むその間の任意の密度を含む、所望の濃度で該培養物に添加し得る。

いくつかの実施形態では、免疫細胞を末梢血サンプルから分離する。その後、いくつかの実施形態では、免疫細胞は一緒に増殖させられるか、または細胞、例えばＮＫ細胞、の単離された亜集団が用いられる。

その後、ＮＫ細胞を、フィーダー細胞および任意には１つ以上のサイトカイン（培養培地中、または外因性の補助因子として）と共に播種し、および第１の期間、例えば約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または終点を含む列記の間の任意の時間、培養される。

いくつかの実施形態では、増殖の第１の期間の終了後、増殖させた細胞（例えば、ＮＫ細胞）はキメラ抗原受容体などの操作されたコンストラクトをトランスダクションされる。任意の種々のキメラ抗原受容体が操作された細胞、例えばＮＫ細胞などにおいて発現され得、これには国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２４６５０、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００１４１、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００１８１、および／またはＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０８２４、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０，０３５７５２、米国仮出願第６２／９２４９６７号、６２／９６０２８５号、および／または６２３／０３８６４５号に記載されるものを含み、ここに本明細書の一部として参照により各々のその全体を援用する。

ウイルストランスダクション後、操作された細胞は第２の期間、例えば例えば約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または終点を含む列記の間の任意の時間、培養される。本明細書で提示するあるデータは、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン（例えば、ＮＫＸ１０１）またはＣＤ１９（ＮＫ１９－１またはＮＫＸ１０１）を発現するキメラ受容体複合体のウイルス性の発現に関する事を留意されたい。しかし、任意の好適なキメラ受容体またはキメラ抗原受容体が使用され得る。

ＩＬ１２および／またはＩＬ１８などの１つ以上の刺激剤の培地への添加は培養過程の間の任意の時点で起こり得る。例えば、１つ以上の刺激剤は培養の開始において、例えば０時点（例えば培養開始時）に添加されてよい。剤は２回、３回、４回、５回またはそれ以上の回数を添加されてよい。後続の添加は、以前の添加と同じ濃度であってよく、または同じでなくともよい。複数回の添加の間隔は様々であり得、例えば、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間またはそれ以上、および終点を含むその間の任意の時間間隔であり得る。

刺激剤の複数回の添加が行われる場合、第１の補給的添加の濃度は、第２の（および／または任意の補給的追加）濃度と同じ濃度であるか異なる濃度であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、複数の時点にわたる刺激剤の添加は、強まる、弱まる、一定である、または複数の非等価な濃度にわたって変化し得る。

いくつかの実施形態では、増殖させる細胞に対するフィーダー細胞のある比率が使用される。例えば、いくつかの実施形態では、約５：１のフィーダー細胞：「標的」細胞比が使用される。いくつかの実施形態では、１：１の比率が使用され、さらなる実施形態では、約１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１、０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１、０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、および終点を含む、任意の列記の間の比率、の範囲であり得る。

実施例
当該実施例で開示する材料および方法は、本願で提供する様々な実施形態に適用可能な材料および方法（試薬および条件を含む）の非限定的な例である。

実施例１－増殖条件の初期評価
図１Ａは、増殖過程の非限定的な例を示す。本実施例では、刺激性サイトカインを０日目に添加し、および同じ投与量を４日目に再投与するが、これは本明細書で議論する、ある実施例で使用された。図１Ｂは単回投与過程の非限定的な実施形態を表し、これは本明細書で議論する、ある実施形態で使用された。

図２は、種々の方法を用いたＮＫ細胞の増殖倍率に関するデータを示す。一番左のデータセットはＫ５６２（ｍｂＩＬ１５および４－１ＢＢＬを発現する）フィーダー細胞のみを用いたＮＫ細胞の増殖を示し、一方右側の３つの各データセットは、培地にＩＬ１２およびＩＬ１８を様々な濃度で添加した際に増殖倍率が上昇する事を示す。いずれの量でも、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加が存在する場合には、ＮＫ細胞の増殖は顕著に増加し、これにより追加の刺激剤がＮＫ細胞の増殖を亢進し得ることを実証した。

図３Ａは、Ｋ５６２細胞のみと共に（上段）、またはＩＬ１２／ＩＬ１８を添加してのいずれかで増殖させた４人の異なるドナー由来のＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現に関するフローサイトメトリーのデータを示す。曲線が右側にシフトし、高さの増加が見られたように（ＮＫＸ１０１をトランスダクションした細胞に関連する）、ＮＫＧ２Ｄの発現が増加する。ＮＫＸ１０１という項目は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドに結合することができる、短縮型ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインを発現する操作されたＮＫ細胞を意味する。いくつかの実施形態では、短縮型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８αＴＭドメインと共役する。いくつかの実施形態では、短縮型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと共役する。いくつかの実施形態では、コンストラクトはさらに膜結合型ＩＬ１５を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＸ１０１は、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。ＮＫＧ２Ｄの発現の増強をさらに支持するものが図３であり、添加の可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８を使用した際のより強い平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、細胞上でのＮＫＧ２Ｄのより多くの存在を示す。したがって、フィーダー細胞に可溶性ＩＬ１２／１８を補う事で、ＮＫ細胞の増殖を亢進するだけでなく、それらのＮＫ細胞によるキメラ受容体の発現も亢進する。より多いＮＫ細胞の数がより多量の、腫瘍などの望ましくない細胞を標的とする受容体を発現するといった事は、予想外の利益である。

ＮＫ細胞が腫瘍を標的とするように、その他の受容体が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、受容体は腫瘍細胞上のＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと共役した、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ（例えばＦＭＣ６３ ｓｃＦｖまたはその変異体）を含む。いくつかの実施形態では、このＣＡＲをコードする核酸配列は、さらにＩＬ１５をコードする。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５は宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）によって膜結合型で発現されるように構成される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、または２７に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８に対して少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはヒト化ＣＤ１９結合部分を含む。

図４は、ＮＫ細胞の増殖中における可溶性ＩＬ１２／１８の添加を使用する事が、それらの増殖させたＮＫ細胞の細胞障害性の増強を実際にもたらすデータを示す。図４は、ウイルストランスダクション後１４日目と２１日目の２つの時点における、２人の異なるドナーからから得られたデータを示す。ＮＫ細胞の増殖に使用した培養条件は、可溶性ＩＬ１２／１８を使用する（点線）またはＫ５６２（４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現する）のみ（実線）、のいずれかである。ＧＦＰをトランスダクションした細胞をコントロールとして使用し、図４上でＮＫＸ１０１の曲線を矢印で示す。データが示すように、Ｋ５６２細胞のみでの増殖と比較して、ＩＬ１２／１８を使用すると、トランスダクション後２１日目におけるＮＫ細胞の細胞障害性が増強された（下のパネル）。一方、この特定の実験では１４日目における効果は限定的であり、いくつかの実施形態では、おそらくドナーおよび／または特定のＩＬの濃度に依存するものであり、いくつかの実施形態ではトランスダクション後１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３日後等のより早い時点において細胞障害性の増強が達せられていた。時間とは無関係に増殖過程の最中における可溶性インターロイキンの使用が増殖させた細胞の細胞障害性を著しく増強し得ることは予想外である。

いくつかの実施形態では、操作したＮＫ細胞の細胞障害性の増加は、少なくとも部分的には、特異的な表現型への細胞の移行による。図５Ａおよび５Ｂは、ＮＫ細胞の記憶に関連する特定のマーカーに関する経時的なデータを示す。図５Ａはフィーダー細胞単独で増殖させたＮＫ細胞におけるＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、およびＣＤ６２Ｌの発現を示し、一方で図５Ｂはフィーダー細胞と可溶性ＩＬ１２／１８を使用した場合である。ＩＬ１２／１８を加えて増殖させたそれらのＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｃの発現が２１日目では急増している。ＮＫＧ２Ｃはサイトカインで誘導されるＮＫ細胞記憶のマーカーである。ＣＤ６７Ｌの増加もまた、可溶性ＩＬ１２／１８を用いて増殖させたＮＫ細胞の後半の時点で見られた。ＣＤ６７Ｌはリンパ球の遊走の増加（細胞活性の増加の証拠）に関連する。まとめると、これらのデータは、ＮＫ細胞の増殖中における可溶性インターロイキンの使用は、抗原に対するＮＫ細胞記憶およびそれらの抗原を持つ細胞に対する細胞障害性の増強に関連する異なるシグナル伝達経路を作動させ得る事を示唆する。

図６は、Ｋ５６２細胞のみを用いて基礎となるＮＫ細胞を増殖させた場合対、可溶性ＩＬ１２／１８を含む増殖培地と交換した場合における、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞の抗腫瘍効果に関するｉｎ ｖｉｖｏデータを示す。動物モデルとして、０日目にマウスに４ｘ１０^６個のＳＮＵ ４９９肝臓がん細胞を投与し（腹腔内投与）、その後ＩＬ１２／１８を増殖培地に添加して、または添加しないで増殖させた、ＮＫＸ１０１を発現する３ｘ１０^６ＮＫ細胞（またはコントロール）を投与した。左のパネルに示すように、コントロールマウスは早くも７日目には著しい腫瘍量を有していて、腫瘍シグナルが存在し、かつあるマウスでは１４日目と２１日目においてわずかに増加した。Ｉｎ ｖｉｖｏの生物発光イメージング（ＢＬＩ）を画像の下に示す。右のパネルはＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞を用いて行った実験を示す。画像に示されるように、腫瘍量は７日目では存在するが、１４日目には大部分が検出されず、およびそれが２１日目まで維持された。中央のパネルは、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞についての実験画像を示し、ここでＮＫ細胞は可溶性ＩＬ１２／１８を使用して増殖させた。腫瘍量への効果は少なくともＮＫＸ１０１細胞（「標準的」増殖）と同程度に効果的であったが、ＮＫＸ１０１の有効性が顕著な程度であるため、ＩＬ１２／１８を用いたことで向上した効果を検出することが困難であり得る。それにもかかわらず、本明細書に開示するいくつかの実施形態によると、可溶性ＩＬ１２／１８をＮＫ細胞増殖培地に添加して使用すると、増殖の亢進のみならず、キメラ受容体の発現の亢進および細胞障害性の増強がもたらされた。

実施例２－増殖および有効性のさらなる評価
上述のように、本明細書に開示するいくつかの実施形態では、操作された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはその組み合わせなど、の増殖を亢進する、および／または細胞障害性を増強するために、１つ以上の可溶性刺激因子が使用される。本実施例のために行われる実験は、確立された増殖系との比較により、選択された刺激分子の様々な濃度での有効性を評価するために行われる。実施形態によってはその他の刺激剤が使用され得るが、本実施例では可溶性インターロイキン１２および可溶性インターロイキン１８を用いた。これらのサイトカインを添加し（種々の濃度は以下に記載する）、かつ得られた増殖させた細胞を、膜結合型インターロイキン１５および４－１ＢＢＬを発現するように改変したＫ５６２細胞（米国特許第７，４３５，５９６号および同第８，０２６，０９７号により完全に記載される、またここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。）を使用して増殖させた細胞と比較した。増殖させた細胞を増殖、サイトカイン分泌、細胞障害性および表現型について評価した。

複数のドナーから得た、様々な条件を使用して増殖させたＮＫ細胞を使用して実験を立ち上げた。１つの群のＮＫ細胞はｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞（Ｋ５６２／４－１ＢＢＬ／ｍｂＩＬ１５）上で増殖させた。別の群のＮＫ細胞は、細胞表面にＩＬ１２およびＩＬ１８を発現するようにさらに改変したｍｂＩＬ１５を発現する細胞上で増殖させた。その他の群には様々な培養条件を用い、および増殖アッセイを行い様々な濃度の刺激性サイトカインの効果を調べた。例えば、１つの群の細胞は、一定濃度のＩＬ１２（５ｎｇ／ｍＬ）および様々な濃度のＩＬ１８に曝露した。追加の群は、別の一定濃度のＩＬ１２（２．５ｎｇ／ｍＬ）および様々な濃度のＩＬ１８に曝露した。可溶性形態のＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露されるこれらの培養物は、培養０日目にＩＬ１２／１８の投与に曝露される（および４日目に再度曝露される）ことに留意する。上述のように、０日目および４日目の可溶性サイトカインの追加は、図２－１８、および図２３－２４に示されるデータを作成する実験において使用された。その他の実験では、可溶性サイトカインへの曝露は０日目のみ使用した。

図７Ａは、ＮＫ細胞の増殖に用いた様々な培養条件の模式的な表である。図７Ｂは様々な条件に曝露してから７２時間後の細胞数に関するデータである。一番下のグラフに見られるように、ＩＬ１８単独の添加では、いずれの濃度でもＮＫ細胞の増殖への影響は限定的であった。対照的に、ＩＬ１２単独の添加は用量依存的にＮＫ細胞の増殖を増加させた。ＩＬ１２を（２．５ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬのいずれも）様々な濃度と組み合わせると、ＮＫ細胞の増殖をさらに亢進し、これら２つのインターロイキン間の相乗的な相互作用を示唆した。２．５ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬでのＩＬ１２についてのデータはどちらも強いＮＫ細胞の増殖を実証し、ＩＬ１８が約０．１から約１ｎｇ／ｍＬでの間の濃度で存在するときに最大値近くに達した。ＩＬ１８をより高濃度で添加してもＮＫ細胞の増殖を積極的に促進することができ、最高濃度の５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１８と５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１２を組み合わせると、２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１２と比較して、わずかに増殖が促進される結果となった。過飽和濃度のＩＬ１２またはＩＬ１８を用いた増殖のデータは、スケールから外れており、示していない。

図８は、ＩＬ１２またはＩＬ１８のどちらかの濃度を変化させて７２時間培養した後のＩＦＮｇの濃度に関するデータを示す。データプロットは、選択されたインターロイキンの濃度の増加に関連するＩＦＮｇの濃度（ＥＬＩＳＡアッセイ中の吸光度によって測定される）を表す。増殖データと同様に、ＩＬ１２の添加は、ＩＬ１８の添加と比較して、より大きなＩＦＮｇの産生をもたらした。とはいえ、添加するＩＬ１８の濃度を増加させると、ＩＦＮｇの産生が増加した。一方、ＩＬ１２は試験したほぼすべての濃度においてＮＫ細胞によるＩＦＮｇ産生が増加した。増殖と同様に、いずれかの濃度のＩＬ１２と約１ｎｇ／ｍＬ（またはそれ以上）の濃度のＩＬ１８との組み合わせにより、ＩＦＮｇ産生が増強された。ＩＬ１２（いずれかの濃度）と約０．５ｎｇ／ｍＬ以下の濃度のＩＬ１８の組み合わせは、ＩＬ１２単独で達成されたものと同様のＩＦＮｇ産生をもたらした。一方、約１ｎｇ／ｍＬ以上のＩＬ１８を含めると、ＩＦＮｇ産生が有意に増強され、やはりＮＫ細胞への相乗的な刺激が示唆された。

図９Ａ－９Ｂは、示した培養条件下で７日間増殖させた後のＮＫ細胞（非導入）の増殖に関するデータものである。第１のグループは、両者共に飽和濃度のＩＬ１２（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１８（２５ｎｇ／ｍＬ）用いて増殖させた。第２のグループは、飽和濃度のＩＬ１２（２０ｎｇ／ｍＬ）と準飽和濃度のＩＬ１８（０．０５ｎｇ／ｍＬ）を用いて増殖させた。第３のグループは、膜結合型ＩＬ１５、ＩＬ１２およびＩＬ１８各々を発現するように操作されたフィーダー細胞（このフィーダー細胞株に関するさらなる詳細は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８７号に見出され、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。）を用いて増殖させた。第４のグループは、コントロールとして、確立されたフィーダー細胞株（ｍｂＩＬ１５及び４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞）上で増殖させた。図９Ａは、計算された増殖データを示し、図９Ｂは、統計解析を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、特定の滴定曲線およびＮＫ細胞増殖についてのデータを示す。図９Ｃは、ＩＬ１８を４ｎｇ／ｍＬで一定に保持した、様々な濃度のＩＬ１２におけるデータを示す。図９Ｄは、ＩＬ１２を変化させ、ＩＬ１８を２０ｎｇ／ｍＬとした場合の類似のデータを示す。まとめると、これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加は、可溶性形態またはフィーダー細胞（ｍｂＩＬ１５を発現するＫ５６２細胞など）上に膜結合型のどちらであっても、ＮＫ細胞の増殖を著しく亢進することを示唆する。興味深いことに、ＩＬ１２は、低濃度であってもＩＬ１８を添加することによってその活性が増強され、増殖の主要な駆動因子であるように見える（例えば、ＩＬ１８の飽和および準飽和濃度における同様の増殖数を参照のこと。これらのデータは、ＩＬ１２とＩＬ１８の組み合わせがＮＫ細胞の増殖を強固に亢進することを示した。

図１０Ａ－１０Ｂは、示した条件下（およびＩＬ－２を４０ ＩＵ／ｍＬで培地に添加）で８日間増殖させた後の非導入のＮＫ細胞についての細胞障害性のデータである。標的細胞は、Ｒｅｈ 急性リンパ球性白血病（非－Ｔ、非－Ｂ）細胞であり、エフェクター対標的比は１：１である。培養条件に関わらず、全ての細胞が約４０％から約６５％の細胞傷害性を示した。ＩＬ１２またはＩＬ１８を全く含まず、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で増殖させた細胞が、可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８において培養したいずれの群よりも著しい、最も高い細胞障害性を示した。膜結合型ＩＬ１２およびＩＬ１８を持つフィーダー細胞を用いた場合、可溶性サイトカインを用いた場合の細胞障害性よりも高い程度の細胞障害性を示した。

図１１Ａ－１１Ｂは、非導入のＮＫ細胞による、培養（４００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２濃度）１５日目の、エフェクター対標的比１：１における、Ｒｅｈ細胞に対する細胞障害性のデータを示す。これらのデータは、試験した群の細胞障害性の程度の大きさを示すだけでなく、群間の差が限定的である事を示す。つまり、全ての群が、培養条件間で有意な差が無いような程度での増加した細胞障害性を示した。ある実施形態よると、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の使用は、培養の早期段階において増殖に影響を与える経路またはシグナル伝達カスケードを誘導する。いくつかの実施形態では、この経路またはカスケードは細胞障害性への遅い影響を有する。いくつかの実施形態では、ある刺激の使用は、例えば記憶様の表現型などへと、ＮＫ細胞における表現型の変更を誘導し、標的細胞への細胞障害効果を発揮するようにＮＫ細胞をプライミングする。いくつかの実施形態では、表現型の変更の誘導には、評価されるＮＫ細胞の特徴に応じて、認識されるまで１－２、３－４、５－６、７－８またはそれ以上の日数を要する。

上述の実験は非導入のＮＫ細胞を用いて行ったものの、それらは様々な濃度のＩＬ１２およびＩＬ１８を含むことによって、ＮＫ細胞の増殖を亢進し、および細胞障害性を増強し得ることを示した。さらなる実験は、キメラ受容体をトランスダクションしたＮＫ細胞を用いて行った（ＧＦＰをトランスダクションした細胞または非導入（ＮＴ）のＮＫ細胞との比較による）。非限定的な例として、採択されるキメラ受容体は、ＣＤ８アルファヒンジドメインおよびＣＤ８アルファＴＭドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および膜結合型ＩＬ１５と共役する短縮型のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。図１２は様々な条件下で培養した種々のドナーに由来するＮＫ細胞上のキメラ受容体の発現（４５＿４として示す）を評価するフローサイトメトリーのデータを示す。図１２の左側では、データは２人のドナー由来（上側：２２７、下側：７３２）の、ｍｂＩＬ１５を発現するフィーダー細胞上で培養したＮＫ細胞についてのデータを示す。「４５＿４」として示された曲線がＮＫＧ２Ｄのより高い発現を示す（ＮＫＧ２Ｄを含むキメラ受容体をトランスダクションされた細胞における予測に比べて）。右列は、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８を０日目にそれぞれ２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ培地に添加し、ｍｂＩＬ１５を発現するフィーダー細胞上で培養したＮＫ細胞についての発現結果を示す。図１３は２人の追加のドナーについての対応するデータを示す。図１２および図１３両者のＭＦＩデータから観察されるように、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用はＮＫＧ２Ｄの発現を亢進し、特定の刺激因子がＮＫ細胞の増殖を強く駆動し得るという以前のデータをさらに補強する。これらのデータはまた、ＩＬ１２およびＩＬ１８などの刺激分子の使用をトランスダクションされたＮＫ細胞にも適用し得る事を確認した。

刺激性サイトカインがトランスダクションされたＮＫ細胞の増殖を亢進することが確認されたので、細胞障害性について評価した。図１４Ａおよび１４Ｂは、示したコンストラクトをトランスダクションされ、示した培養条件で増殖させたＮＫ細胞の細胞障害性に関するデータを示す。群は以下である：ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で成長させた、ＧＦＰをトランスダクションしたＮＫ細胞；ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で成長させ、ＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露した、ＧＦＰをトランスダクションしたＮＫ細胞；ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で成長させた、ＮＫＸ１０１をトランスダクションしたＮＫ細胞；およびｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で成長させ、ＩＬ１２およびＩＬ１８に曝露した、ＮＫＸ１０１をトランスダクションしたＮＫ細胞。標的細胞はＲｅｈ細胞で、Ｅ：Ｔは１：１である。４人の異なるドナーに由来する細胞を用いて、増殖から１３日後に細胞障害性を評価した。示すように、ＧＦＰをトランスダクションしたＮＫ細胞およびＮＫＸ１０１をトランスダクションしたＮＫ細胞は両者共に細胞障害性を示し、ＮＫＸ１０１を発現する細胞のほうが、標的細胞に対するより強い効果を示した。使用した増殖の培養条件に基づいた、著しい差は検出されなかった。

図１５Ａ－１５Ｂは、異なるＥ：Ｔ比を試験する、２人のドナーからの追加的な細胞障害性のデータを示す。これらのデータは図１４で見られたものと一致する傾向を示した。図１５Ａは１人目のドナーについて、４つの培養条件におけるデータを示し、図１５Ｂは２人目のドナーについて対応するデータを示す。なお、ドナー５４３（図１５Ａ）はサイトメガロウイルスについて陰性であり、およびドナー２２４（１５Ｂ）はＣＭＶ陽性であった。ＣＭＶ陽性の個体は記憶様の表現型を有するＮＫ細胞の亜集団を有しており、つまりそれらは標的細胞へより迅速に応答するという特徴を持つ。１５Ａ－１５Ｂのデータは増殖後１３日目に取得した。これらの曲線は上記のデータと類似しており、およびこの比較的早い時点ではＩＬ１２／ＩＬ１８の存在または非存在は、ＮＫ細胞に誘導される細胞障害性に対しての影響は限定的なものである。図１５Ｃおよび１５Ｄは同じドナー／条件で、増殖後２１日目のデータを示す。注目すべきことに、ＩＬ１２／ＩＬ１８の使用は、試験したＥ：Ｔの大部分で標的細胞に対する細胞障害性の増強をもたらした。これらのデータは、増強された細胞障害性の誘導に遅れがあるものの、後半の時点では検出可能である点で非導入のＮＫ細胞における上述のデータと一致する。上述のように、この効果は、ＮＫ細胞における表現型変化を誘導するために必要な時間によるものだろう。

図１６Ａ－１６Ｂは、異なる条件下で培養したＮＫ細胞の表現型の経時的な評価に関する。図１６Ａは、示した条件下で経時的に５週間培養したときのＮＫＧ２ＣおよびＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の発現量を示す。ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を用いた場合、５週間の培養において、ＣＤ６２ＬおよびＮＫＧ２Ｃ発現量は両者共に顕著に変化しなかった。しかし対照的に、それらのフィーダー細胞を使用し、かつ０日目にＩＬ１２およびＩＬ１８を培地へ添加すると、ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ６２Ｌ両者の発現に顕著な影響があった。ＣＤ６２Ｌは、培養１週間後にはＮＫ細胞の約５０％において早くも存在していた。１週間後に増加した一方で、その後ＣＤ６２Ｌの発現は急激に減少し、培養から４週間後ではわずかにしか検出できなかった。対照的に、ＮＫＧ２Ｃの発現は培養１週間後ではわずかな増加であったが、５週間後には４０％を超える細胞がＮＫＧ２Ｃを発現し、ＮＫ細胞上におけるＮＫＧ２Ｃの発現が増加した。よって、５週目の培養物は、刺激性サイトカイン無しで成長させたＮＫ細胞に比べて増加したＮＫＧ２Ｃを有し、および刺激性サイトカイン無しで成長させたＮＫ細胞と比較して低下した、または等しいＣＤ６２Ｌ発現を有する、という特徴を有し得る。図１６ＢはＮＫ細胞による、変化した記憶様の表現型の進行を補足するさらなるデータを示す。図１６Ｂは、ｍｂＩＬ１５発現細胞と培養した（左側）、またはｍｂＩＬ１５発現細胞に加えて０日目にＩＬ１２およびＩＬ１８を添加して培養した（右側）、培養１４日目（上段）および２１日目（下段）のドナーＮＫ細胞のＦＡＣＳ解析による発現データを示す。ＣＤ５７の発現についても示し、発現が陽性である細胞の割合が比較的低いため、ＮＫ細胞を培養すると該マーカーの発現が消失する傾向が確かめられた（新鮮なＮＫ細胞はより高いＣＤ５７発現を有するはずである）。ｍｂＩＬ１５の列に見られるように、ＮＫＧ２Ｃの発現（Ｘ軸）は顕著な変化ではない。対照的に、（矢印で示したように）、ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞の割合は、可溶性ＩＬ１２と可溶性ＩＬ１８に最初に曝露した後、さらに１週間培養すると４０％増加する。

図１７Ａ－１７Ｄは、示した条件下における、培養１４日目のＮＫ細胞上のマーカーの発現に関する要約データを示す。図１７Ａに示すように、この時点では、可溶性または膜結合型のどちらであってもＩＬ１２およびＩＬ１８の使用によってＣＤ６２Ｌは増強される。上述のように、培養のさらなる時間経過においてこの発現は減少する。図１７Ｂは、１日目にＩＬ１２およびＩＬ１８を培地に導入した際の、ＮＫＧ２Ｄの発現の増強を示す。その他のデータと同様に、ＩＬ１８の濃度を変化させた場合においても、ＮＫ細胞の表現型（増殖および細胞障害性など）に対する効果がおおよそ等しいことは注目すべきである（例えば、飽和または準飽和濃度のＩＬ１８において効果が見られた）。図１７Ｄに示すように、細胞が（新鮮な単離された細胞というよりもむしろ）培養されたものである事を反映して、全ての条件下でＣＤ５７の発現量は比較的低かった。図１７ＤはＣＤ６２ＬおよびＮＫＧ２Ｃの二重陽性マーカー発現を示し、やはり培養におけるＩＬ１２およびＩＬ１８の存在によって発現量は増加した。これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８（可溶性または膜結合型のいずれか）を用いて培養したＮＫ細胞が、より強い記憶様表現型へと表現型が移行することを反映している。いくつかの実施形態では、この表現型はＮＫ細胞、特にキメラ受容体を発現するように操作されたＮＫ細胞の増殖能および／または細胞障害性を増強し、より強力ながん免疫療法産物を作成する。

図１８は、ＩＬ１２およびＩＬ１８の使用が後半の時点（増殖後２１日目の細胞障害性を示す）においても、操作されたＮＫ細胞の細胞障害性を増強することを示す。注目すべきことに、ＮＫＸ１０１をトランスダクションしたＮＫ細胞を表す図の中央の２点は、いずれの群よりも優れた細胞障害効果を示した事である。重要なことに、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で、可溶性ＩＬ１２およびＩＬ１８を用いて培養したＮＫＸ１０１をトランスダクションしたＮＫ細胞が最も高い水準の標的細胞に対する細胞障害性を示した（非限定的な例として、ここでの標的細胞はＲｅｈ白血病細胞である）。よって、いくつかの実施形態によると、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびＩＬ２１などの可溶性刺激因子を、ＮＫ細胞の培養において使用することで、細胞増殖の予想し得ない亢進（これは臨床的に有用な細胞数の生産に高度に関連する）および標的細胞に対する細胞障害性の予想し得ない増強がもたらされる。

実施例３－増殖、凍結保存及び細胞障害性の評価
本明細書に開示するように、いくつかの実施形態では、増殖させた、操作されたＮＫ細胞は、自己移植する計画における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、同種移植アプローチが使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は「既製品（ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）」として設計され、これは既に増殖し、操作され、およびその後、後日患者へ投与するために保存されている、既存のＮＫ細胞集団を意味する。いくつかの実施形態では、保存は凍結保存による。何れの凍結－解凍サイクルにおいても、細胞の生存率および活性が問題となる。図１９は、ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を用いて培養した、または培養開始時に可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８を添加し、かつｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を用いて培養した、３人の異なるドナー由来のＮＫ細胞の特徴に関するデータを示す。表の下側の３行は可溶性ＩＬ１２およびＩＬ１８が培養においてＮＫ細胞に対してよい影響を与える事を証明する。増殖後６日目におけるＩＬ１２／１８培地中のＮＫ細胞の生存率はわずかに高いばかりであるが、総細胞数つまり増殖倍率は、ＩＬ１２／１８を用いた場合に顕著に高かった。

このデータに基づいて、細胞に抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体をトランスダクションし、およびＩＬ１２および１８の存在または非存在下で培養した（ｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞を用いた）。細胞の一部を凍結保存し、およびその後対応する新鮮な細胞と比較した。ＦＡＣＳを用いて、ＦＬＡＧの発現についてＮＫ細胞を評価した（ＦＬＡＧはＮＫ１９－１コンストラクト内のタグであるが、対応するタグのないコンストラクトも本明細書において提供されるものと理解されたい）。図２０に示すように、３人のドナー由来のＮＫ細胞は、新鮮な細胞と凍結保存された細胞の両者共にＣＤ１９ ＣＡＲの発現を維持する。ＩＬ１２／１８の存在がＣＡＲ発現に及ぼす影響は限定的なもののように思われる。図２１は増殖２２日目における同じドナー由来の細胞を示す。興味深いことに、２１日目と比較して、１４日目における抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の割合は低下していた。２１日目におけるコンストラクトの発現は、新鮮なＮＫ細胞（例えば、凍結していないもの）と大体同じであった（３－４行目と７－８行目の比較による）。これらのデータは本明細書に開示する方法に従って培養したＮＫ細胞が、堅牢な細胞集団であり、凍結保存における生存が可能であり、および生存を維持し、および細胞障害性を誘導するコンストラクトの顕著な発現量を維持し得る事を示唆する。

凍結保存がＮＫ細胞に与える影響についてさらなる解析をおこなった。標的細胞としてＮａｌｍ６－赤色核細胞株を使用し、および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞株による標的とした。非限定的な例として、この実験には配列番号１にコードされるＣＡＲを採用した。アッセイの結果を図２２Ａ－２２Ｂに示す。図２２Ａはアッセイ時間にわたる細胞数曲線（３人のドナーの平均）を示す。示されるように、非導入のＮＫ細胞およびＮａｌｍ６細胞単独では、Ｎａｌｍ６標的細胞の増加と同程度の増加を示した。可溶性ＩＬ１２／１８を用いて成長させた非導入のＮＫ細胞はわずかな細胞障害効果を示した（ウェル当たりの細胞数曲線における下方シフト）。注目すべきことに、培養から１４日目の凍結保存された細胞がＮａｌｍ６細胞に対する顕著な細胞障害効果を示し、実験の最後の時間まで成長を制限した。重要なことに、可溶性ＩＬ１２／１８を添加した培養において成長させた１４日目の凍結保存された細胞は、Ｎａｌｍ６細胞の成長を完全に制限した。いくつかの実施形態では、より長い期間増殖させた細胞（新鮮または凍結保存した細胞のいずれ）もまた腫瘍の成長を顕著に抑制し得る。１４日目における要約データを図２２Ｂに示す。非導入のＮＫ細胞に関して、可溶性ＩＬ１２／１８を０日目に培地に加えたＮＫ細胞の増殖は、標的腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性を顕著に増加した。ＣＡＲを発現するＮＫ細胞についても類似のデータが見られた。ＣＡＲの存在でも８０％近くの標的細胞に対する細胞障害性をもたらすが、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞を可溶性ＩＬ１２／１８を用いて培養する事で、細胞障害性が著しく増加した。図２２Ｃは、増殖中の培養培地にＩＬ１２／１８が存在する、または存在しない場合において、様々なＥ：Ｔ比で培養したＮＫ細胞の細胞障害性のさらなるデータを示す。示されるように、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現する操作された細胞はほぼすべてのＥ：Ｔにおいて細胞障害性の増強を示した。標的細胞の数が増加するにつれて、本明細書に記載のようにＩＬ１２およびＩＬ１８を使用して増殖させたＮＫ細胞の細胞障害性は、フィーダー細胞のみで増殖させた細胞に比べて向上した細胞障害効果を示した。まとめると、これらのデータは培養培地中のＩＬ１２／１８の使用がＮＫ細胞の増殖の亢進および細胞障害性の増強をもたらすことの証拠を示した。加えて、これらのデータは細胞が凍結保存された後でさえ、細胞の活性が保存されていることのさらなる重要な証拠を提供する。このデータは、いくつかの実施形態によると、強い抗腫瘍効果を持つ「冷凍庫から取り出された」操作されたＮＫ細胞産物が生成された事を示す。

図２３は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験の概略を示し、ここでは肝細胞がん細胞をドナーマウスに注入し、および様々な培養条件下で成長させたＮＫ細胞を投与する。その後生物発光を使用して腫瘍量を観察する。投与される細胞は、１日目に可溶性ＩＬ１２／１８を添加した培地中で成長させた非導入ＮＫ細胞、ＩＬ２を用いて成長させたＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞、または１日目に可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８を添加した培地中で成長させたＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞である。全ての細胞はｍｂＩＬ１５発現フィーダー細胞上で成長させた。図２４は経時的な腫瘍量解析の結果を示す。コントロールの動物、および非導入のＮＫ細胞を受けた動物は経時的に穏やかな腫瘍の成長を示した。対照的に、ＮＫＸ１０１を発現し、かつＩＬ１２／１８またはＩＬ２を用いて成長させたＮＫ細胞を受けた動物は顕著に優れた抗腫瘍効果を示した。どちらの群においても腫瘍量は減少するが、ＩＬ２の群では１４日目から２１日目にわたって僅かな増加が見られた。これらのデータは、培養ＮＫ細胞の細胞障害性を増強する事を目的として、増殖培養培地中にＩＬ１２，ＩＬ１８、またはＩＬ２１等の刺激性サイトカインを使用する事をさらに補強する。

図２５は、類似の実験設定を示し、今回はＮａｌｍ６細胞を異種移植し、および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞で処置する。図２６Ａは得られた生物発光データを示す。先の実験と同様に、コントロール動物および非導入ＮＫ細胞を投与した動物では腫瘍量が急速に増加したが、後の時点になるにつれて減少した。ＮＫ１９－１（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞を受けた動物は腫瘍成長の効果的な遅延を示し、後の時点まで顕著な増加を制限した。ＮＫ１９－１を発現し、かつＩＬ１２／１８を用いて成長させた細胞は腫瘍成長の顕著な制御を示し、実験の後期の段階まで増加を制限し、および全体を通してその他の群と比較して顕著に低い腫瘍量であった。生存率に関するさらなるデータを図２６Ｂに示す。ＰＢＳ（コントロール）またはＮＴ ＮＫ細胞を受けたマウスは、３０日目あたりで生存率が急速に低下した。ＮＫ１９－１を受けた動物はこれらの群よりも長く生存し、およびＮＫ１９－１ ＩＬ１２／１８動物はその他の群の全てが生存しなくなった時点においても依然８０％の生存率であった。図２６Ｃおよび２６Ｄは、ＮＫ細胞をＩＬ１２／１８を添加した培地中で培養した場合の、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞の持続性に関するデータを示す。図２６Ｃは全マウス末梢血の内、ヒトＣＤ５６＋細胞（ＮＫ細胞のマーカー）の割合の測定を示す。示されるように、可溶性１２／１８を使用したＮＫ細胞の増殖は、投与から１８日後でさえも、マウス血液内のヒトＮＫ細胞の割合を顕著に増加させる結果をもたらす。このことは、増殖中に刺激性サイトカインを使用する事でＮＫ細胞に増強した持続性が付与される事を証明する。同様に、一般にｉｎ ｖｉｖｏで持続するのはＮＫ細胞だけでなく、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞も可溶性ＩＬ１２／ＩＬ１８（またはその他の刺激分子）の使用を通して持続性が増強される。図２６Ｄは、異種移植を受けたマウスにおける、注入から１８日後の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ陽性ＮＫ細胞の割合（マウスの総末梢血細胞数の内）を示す。先の図と同様に、これらのデータは、操作された免疫細胞、例えばキメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞は、増殖時に少なくとも１つの刺激性サイトカインを使用して増殖させることで、増強したｉｎ ｖｉｖｏ 持続性を示す事を示す。ＮＫ細胞によるＣＡＲの発現に対する、増殖培養および凍結保存において使用されるサイトカイン（またはその欠如）の効果を評価するために、さらなる実験が行われた。図２６Ｅは、培養１５日目において、増殖培養においてサイトカインを使用した場合にも、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態の発現は変化しない事を示す。すなわち、本明細書で示された、１以上の追加の刺激分子を使用した増殖培養に基づく増強効果が、ＣＡＲの発現の低下によって相殺されない事を示す。さらに、ＮＫ細胞の凍結保存は、操作されたＮＫ細胞によるＣＡＲの発現に悪影響を及ぼさない。図２６Ｆは、培養におけるさらなる時間経過後にＣＡＲの発現が減弱されない事を確認する。これらのデータは、ＩＬ１２およびＩＬ１８などの刺激性サイトカインの影響下で成長させたＮＫ細胞による細胞障害性、ＣＡＲ発現の持続性およびＣＡＲ発現の安定性の増強を再度支持するものである。同様に、操作されたＮＫ細胞の凍結保存はこれらの有益な特徴に顕著に不利な影響を及ぼさない。

実施例４－細胞障害性、ＮＫ細胞の特徴、およびＮＫ細胞の生存に対する凍結保存および増殖の影響を評価するためのさらなる実験。
凍結保存および解凍の過程が、生存率、持続性または細胞障害性を低下させるなど、操作されたＮＫ細胞に悪影響を与えるかを調べるためにさらなる実験を行った。図２７Ａは採択された実験プロトコルを模式的に示し、および使用した実験群およびその他の条件を示す。上述のように「ＩＬ１２／１８」に割り当てられた処置群について、本明細書に記載の実施形態に沿って細胞を可溶性ＩＬ１２および／またはＩＬ１８の存在下で増殖させた。処置群には新鮮な非導入ＮＫ細胞（Ｇ１）およびＰＢＳ（Ｇ２）をコントロールとして含む。実験群には、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するよう操作されたＮＫ細胞を凍結保存および解凍し、追加的な刺激性サイトカインの非存在下（Ｇ３）および存在下（Ｇ４）で増殖させた細胞、ならびに抗ＣＤ１９ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現するよう操作された新鮮なＮＫ細胞であって追加的な刺激性サイトカインの非存在下（Ｇ５、Ｇ６）および存在下（Ｇ７、Ｇ８）で増殖させた細胞、を含む。血液の採取およびイメージングは図２７Ａに示した時点において行った。

図２７Ｂおよび２７Ｃは、示した実験群におけるＩｎ ｖｉｖｏの生物発光イメージングを示す。図２８Ａ－２８Ｈは、経時的な生物発光強度を反映した折れ線グラフである。これらのデータは処置後の最初の３０日を示す図２８Ｉ、および５６日目までを示す図２８Ｊに要約される。図２８ＩはＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と２つのコントロール群の間の明確な差を示すが、各実験群は、実験の最初の３０日間にわたって計測したＢＬＩにおいて（ＢＬＩの増加は腫瘍成長の増加を示す）、検出できない程度に限定された増加を示し、腫瘍成長の抑制を示した。図２８Ｊは５６日間にわたるデータを示し、ここでは種々のＣＡＲコンストラクトを発現しかつ示した条件下で処理された実験群の、腫瘍細胞の成長の阻害における分離が大きくなっている。コントロール群（Ｇ１およびＧ２）は腫瘍成長の顕著な増加を示したため、これらの群については３０日で実験を終了した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、可溶性インターロイキンを使用せずに増加させた新鮮なＮＫ細胞を受ける群（Ｇ５）では、３０日から５６日の間にＢＬＩが急激に増加した。この群の別の実験的複製（Ｇ６）はより顕著な腫瘍成長阻害能を示した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、可溶性インターロイキンを使用せずに増加させた冷凍のＮＫ細胞を受ける群（Ｇ３）もまた、３０日から５６日の間にＢＬＩの増加を示したが、しかし新鮮な細胞で検出された増加と同程度ではなかった。新鮮かまたは冷凍したかに関わらず、（本明細書に開示する実施形態に沿って）抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、追加的な刺激因子を増殖中に用いて増殖させたＮＫ細胞を受ける実験群は最も効力な腫瘍成長の阻害を示した。注目すべきは、どちらも冷凍保存されたＮＫ細胞である群４および群８は腫瘍の成長を最も阻害した。操作された新鮮なＮＫ細胞を投与した際に収集したデータと結合すると、これらのデータは、いくつかの実施形態のよると、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞は新鮮に調製され、投与された場合のみならず、凍結させて調製し、次いで解凍して投与した場合にも効果的である事を示す（例えば、ある同種の実施形態のような）。

図２９は、実験中の５６日間にわたり、示したコンストラクトで処置したマウスの体重の折れ線グラフを示す。体重減少は、腫瘍成長の増加に相関し、例えば、腫瘍の進行は、マウスの健康状態の悪化をもたらし、かつ体重の減少と対応する（例えば、消耗）。示されるように、コントロール群は、３０日目までに相当な体重の減少を示すが、１つを除き全ての実験群は実験の大部分で体重が増加する。上記生物発光データに一致して、新鮮対凍結調製物の大部分は、体重に対して実質的に類似する効果を示す顕著な傾向がある。いくつかの実施態様によると、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞は、新鮮に調製され、投与された場合以外でも有効である。加えて、いくつかの実施形態によると、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞は、凍結させて調製し、次いで解凍して投与した場合以外にも効果的である事を示す（例えば、ある同種の実施形態のような）。

１つ以上の追加的な刺激因子を使用し、または使用せずに増殖させたＮＫ細胞の特徴を評価するためにさらなるデータを収集した。図３０Ａは培養中のＮＫ細胞の寿命（例えば、持続性）に関するデータを示す。これらのデータは、操作された（活性のあるキメラ受容体（ＡＣＲ）陽性に基づく）ＮＫ細胞（ＣＤ５６陽性に基づく）の割合を示す。これらのデータは、ＩＬ１２および／またはＩＬ１８などの追加的な刺激因子を培養中に用いて、または用いずに培養したＮＫ細胞がｉｎ ｖｉｖｏにおいて類似の持続性プロファイルを示し、このような操作されたＮＫ細胞が約７日間にわたって血中で比較的一定のレベル（５－１０％）で存在する事を示す。操作されたＣＡＲの発現およびＣＤ５６陽性の検出に基づく再計測では、動物の血中に存在するＮＫ細胞の割合を５０日間にわたって計測し、このデータを図３０Ｂに示す。７日間にわたる、類似のプロファイルとは対照的に、１つ以上の追加の刺激因子を使用せずに増殖させたＮＫ細胞は、約２５－３０日後にその数が低下し始めた。これらの細胞の数は約４８日目までゆっくりと減少し続け、４８日目には細胞数はほとんど０であった。約２５－３０日目の同じ時点から、追加的な刺激因子（いくつかの実施形態に沿って、例えばＩＬ１２および／またはＩＬ１８）を用いて増殖させた操作されたＮＫ細胞は約１０％で４５日目まで血中に存在し続けた。最後の３日間においてのみわずかに（約５－７％に）減少した。これらのデータは、ＩＬ１２、ＩＬ１８、またはＩＬ２１などの１以上の追加的な刺激分子の使用が、このような刺激分子を使用せずに培養／増殖させたＮＫ細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、操作されたＮＫ細胞に増強した持続性を与える事を強く示す。図３０Ｃは、異なる方法での持続性データを表し、これは計測した生細胞１００００個当たりの操作されたＣＡＲ発現ＮＫ細胞の数の計測に基づく。これらのデータは図３０Ｂにおける一般的な傾向と強く類似しており、１以上の刺激分子（例えば、可溶性ＩＬ１２／およびまたは可溶性ＩＬ１８）を使用して増殖させた細胞が、このような刺激分子無しで増殖させた操作されたＮＫ細胞と比較して、延長された期間にわたって血中により多数残存する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、サイトカインに基づくある増殖方法において一般的なサイトカイン依存をこの方法により回避するという点で特に有利である。ある方法では、高濃度の可溶性サイトカインの使用によって、細胞の成長を促進するが、しかし細胞はそれらの濃度に慣れて成長し、患者への投与時などのそれらの人工的な条件下にない環境に晒された際に離脱徴候（例えば、アポトーシス、生存率の低下、またはその他の機能の低下）を示す。本明細書に開示する方法に従って増殖させた操作されたＮＫ細胞が示す、継続的な高濃度のサイトカインを必要としない特徴は、少なくとも部分的に、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のより長い寿命（および活性寿命）に貢献する。

図３１Ａ－３１Ｃは、本明細書に開示する実施形態に従って製造された操作されたＮＫ細胞を評価する追加のデータを示す。これらのデータは、本明細書に開示するいくつかの実施形態に従って、可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８を使用して増殖させた、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞を新鮮に（凍結保存せずに）投与された３匹のマウスの血液（投与後５１日目）から収集した。データはＣＤ５６陽性（ＮＫ細胞を示す）かつＣＤ１９－Ｆｃ陽性（操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を示す）の全血サンプルから得た細胞の割合を示す。図３１Ａ、３１Ｂ、および３１Ｃのそれぞれに示すように、二重陽性細胞の割合（右上の囲った領域）は約４．７５から約６．７％の範囲であった。図３２Ａ－３２Ｃは図３１と同じマウスの全血の解析を示すが、ＣＤ１９－Ｆｃ陽性（操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞を示す）およびＣＤ３陽性（Ｔ細胞を示す）の細胞を同定したものである。これらのデータは抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞の大部分がＣＤ３に陰性である事を示し、それらがＴ細胞でない事を意味する。いくつかの実施形態に従って、あるＮＫ細胞の製造方法では、初期のドナー全血サンプルからのＴ細胞の除去に関数する工程を行うが、わずかな数のＴ細胞は残存し得る。しかし、いくつかの実施形態では、図３２Ａ－３２Ｃに示すデータを参照すると、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する操作された細胞はＮＫ細胞の特徴（ＣＤ５６陽性）を示すが、Ｔ細胞の特徴を示さない（ＣＤ３陰性）。

図３３、３４、および３５は、腫瘍移植後の様々な時点での動物の全血に由来する細胞をさらに評価するデータに関する。図３３は投与後４日目のデータに関し、図３４は腫瘍移植後１２日目のデータに関し、および図３５は腫瘍移植後１８日目のデータに関する。これらのデータは、非導入ＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）もしくはＰＢＳのいずれかを受けた、コントロールとして処置した動物の全血由来の細胞に関し、または培養中にＩＬ２または培養中にＩＬ１２／ＩＬ１８を用いて増殖させた、操作されたＮＫ細胞を受けるその他の１群に関し、各条件について新鮮および凍結処置群を含む。図３３Ａは、４日目の細胞の全血に由来するＮＫ細胞（ＣＤ５６－ｐｏｓ／ＣＤ３－ｎｅｇ）の割合を示す。この点について、各処置群は比較的類似しており、全血細胞の約３－５％が操作されたＮＫ細胞である。図３３Ｂは抗ＣＤ１９－ＣＡＲの非限定的な実施形態を特異的に発現する細胞の割合に関するデータを示す。図３３Ａと同様に、各処置群における抗ＣＤ１９－ＣＡＲを発現する細胞の割合は約３－５％の範囲であった。図３３Ｃは投与後４日目の血液中に存在するＧＦＰ陽性腫瘍細胞の割合に関するデータを示す。前の図に示したＢＬＩイメージングと一致して、いずれの処置群における存在する検出可能な腫瘍細胞はわずかである。検出された低シグナルは、ＧＦＰ＋腫瘍細胞が循環器から様々な組織へ移動したことを反映しているのかもしれない（ＢＬＩイメージングで検出できる可能性はあるが、血液サンプル自体では検出できない）。図３４Ａ－３４Ｃは、腫瘍移植後１２日目の対応するデータを示す。より早い時点の場合と同様に、各処置群の結果、サンプル中の血液細胞の約３％－５％がＮＫ細胞であった（図３４Ａ）。図３４Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲコンストラクト陽性である細胞の割合を示す。この時点では、発現レベルは処置群間で同様であったが、各実験群は、コントロール群を顕著に上回るレベルで存在した。また、１２日目において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）のパーセントは、わずかに高く（血球の約７－９％）、循環器における操作された細胞の持続性が増加したことを示唆している。図３４Ｃは、全血中の腫瘍細胞の数を示している。興味深いことに、ＢＬＩイメージングでは、特にコントロールで蛍光の増加が見られたにもかかわらず、全ての群でＧＦＰ発現はわずかであった。ここでも、これらのデータは、ある種の浮遊腫瘍細胞が示す生理的な「滞留」を反映しているのかもしれない。

図３５Ａは、腫瘍移植後１８日目のＮＫ細胞（ＣＤ５６陽性に基づく）の割合を示す。全ての実験群はコントロール群と比較して顕著に高い割合を示し、群は全血中の細胞の約１５％から２５％の範囲であった。この割合の増加は、図３０Ｂおよび３０Ｃに示すＮＫ細胞の増加の時間窓と一致する。この特定の実験における統計学的な差はなかったものの、これらのデータはＩＬ１２／ＩＬ１８培地で増殖させ、および冷凍保存したＮＫ細胞が、実験群の内で最も増殖した事を示す。いくつかの実施形態によると、フィーダー細胞に加えてサイトカインに基づいて増殖させ、かつ冷凍保存と組み合わせる事で、より通常のサイトカイン条件下で（例えば、サイトカイン依存なしで）生存可能であって、より長期間健康な状態を維持し得る、より強靭なＮＫ細胞が得られた。図３５Ｂおよび３５Ｃは、１８日目における腫瘍量の２つの測定を示す。図３５Ｂは、抗ＣＤ１９ＰＥ共役抗体を用いて測定した、血中のＣＤ１９陽性細胞（この非限定的な実施形態における操作されたＣＡＲの標的）の割合を示す。これらのデータは、コントロール群における腫瘍量の増加傾向を示し、および対照的に、処置群の操作されたＮＫ細胞による腫瘍の成長を抑制する能力を示す。図３５ＣはＧＦＰシグナルの検出（例えば、ＢＬＩによる）による事を除いて、類似のデータを示す。これらのデータは、ＰＥベース対ＧＦＰベースの検出の感度による差があるものの、類似の傾向を示す。実験群のＮＫ細胞は、コントロールと比較して、腫瘍細胞の増殖を阻害する能力の増強を示す。図３５Ｄは操作された抗ＣＤ１９を発現しているＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６およびＣＤ１９Ｆｃ両者が陽性）の数についてのデータに関する。図３５Ａのデータと類似して、これらのデータは、血液サンプル中における増加したＮＫ細胞の割合は、操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞であって、それらの持続性の向上を反映している事を示す。図３５Ｅは各実験群のＣＡＲ陽性のＮＫ細胞集団のほとんど全てが、本明細書に開示する抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞である事を確認するデータを示す。

本明細書に開示する実施形態に従って増殖させた操作されたＮＫ細胞の持続性をさらに調査するために、本明細書に開示するように可溶性サイトカインを使用して増殖させた操作されたＮＫ細胞を２通りの用量でマウスに投与し、その細胞数をその後の４週間にわたって追跡した（図２７Ａの投与プロトコルによる）。図３６はこれらのデータのボックスプロットを示す。略述すると、ボックスプロットのＸ軸は、２つの様式：ｉ）３回目投与後の時間、またはｉｉ）腫瘍移植からの総時間（括弧内に示す）、で時間を表す。Ｙ軸は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の数（白血球１００００個当たり）を表す。２００万個のＮＫ細胞投与時のボックスプロットは下側のボックスの軌跡（破線矢印で示す）、５００万個投与時のボックスプロットは上側のボックスの軌跡（実線矢印で示す）である。これらのデータは、１つ以上の刺激分子（ＩＬ１２および／またはＩＬ１８など）を使用する条件下（本明細書のいくつかの実施形態に記載されるように、フィーダー細胞と組み合わせて）で増殖させた操作されたＮＫ細胞の半減期が、フィーダー細胞のみの条件で増殖させた操作されたＮＫ細胞と比較して延長されることを示す。２００万個の操作されたＮＫ細胞用量の半減期は～１５日目である。１つ以上のクリアランスおよび／または分布容積における分散に基づいて、５００万個の操作されたＮＫ細胞は～１８日目である。これらは、１つ以上の追加的な刺激分子を使用せずに増殖させた操作された別のＮＫ細胞の投与とは対照的であり、図３７に示すように５００万個の細胞の投与における半減期は～５日目である事を示す。したがって、本明細書に開示するいくつかの実施形態によると、フィーダー細胞系と組み合わせて１つ以上の追加のサイトカインを使用して操作されたＮＫ細胞を増殖させることで、ＮＫ細胞の増殖を亢進させ、それらの細胞の持続性および／または細胞傷害性を増強することを可能にする。

上記実施形態の特定の特性および態様の種々の組み合わせまたは部分的な組み合わせは1つ以上の本発明を構成し、および依然1つ以上の本発明の範囲に該当する事が意図される。さらに、ある実施形態に関連するあらゆる特定の特性、態様、方法、性質、特徴、品質、属性、要素などを、本明細書に記載する他の全実施形態で使用し得る。従って、開示する実施形態の種々の特性および態様を、開示する発明の種々のモードをもたらすために、互いに組み合わせても置き換えてもよいことが理解される。故に、本明細書に開示する本発明の範囲は、上記した特定の開示される実施形態により限定されないことが意図される。さらに、本発明は、種々の修飾および別の形態を受け入れ可能であるが、その具体例は図面に説明され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は開示する特定の形態または方法に限定されず、むしろ逆に、本発明は、記載する種々の実施形態および添付する特許請求の範囲の精神および範囲内に入る全ての修飾、均等物および代替を包含することは理解されるべきである。本明細書に開示するあらゆる方法は、記載する順番で実施する必要はない。本明細書に開示する方法は、実施者がすべきある行為を含む；しかしながら、明示的であれ暗示的であれ、何らかの第三者によるこれら行為の指示も含み得る。例えば、「増殖させたＮＫ細胞集団を投与する」などの操作には、「増殖させたＮＫ細胞集団の投与を指示する」事を含む。さらに、本発明の特性または態様がマーカッシュ群で記載されるとき、当業者は、本発明はまたその記載により、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載される事を認識するはずである。

ここに開示する範囲はまた任意かつ全ての重複、下位範囲およびこれらの組み合わせを含む。「最大」、「少なくとも」、「以上」、「以下」、「から」などの用語は、記載する数値を含む。「約」または「凡そ」などの用語が前にある数値は、記載した数値を含む。例えば、「９０％」は「９０％」を含む。ある実施態様において、対照配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列は、対照配列に対する９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。さらに、配列があるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を「含む」と記載されているとき、このような記載は、特に断らない限り、該配列が、記載した配列を「含む」、それ「からなる」またはそれ「から本質的になる」ことも含む。

「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示があるか、または文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味する。本明細書および特許請求の範囲で用いられる「および／または」なる語句は、そのように結合された要素の「どちらかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」と共に記載されている複数の要素は、同じ方法で解釈されるべきであり、すなわち、そのように結合された要素の「１つまたは複数」を意味する。その他の要素は、「および／または」で具体的に特定された要素以外に、任意に存在してもよい。本明細書および特許請求の範囲で用いられる「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、要素のリストで用いられるとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素のリストのうち少なくとも１つ、要すれば１以上を含み、任意に追加のリストされていない要素を含むものとする。「ただ１つ（Ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」または「正確に１つ（ｅｘａｃｔｅｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」など、明らかに反対を示す用語のみが、数または要素のリストのうち正確に１つの要素を含むことを意味する。従って、群の１以上のメンバーの間に「または」を含む請求項は、反対の指示がない限り、群のメンバーの１つ、２以上または全てが所定の製品またはプロセスに存在するか、採用されているか、またはその他の関連性がある場合に満たされると考えられる。群の正確に１つのメンバーが、所定の製品またはプロセスに存在する、採用される、またはその他の方法で関連する、態様が提供される。群の複数のメンバー、または全てのメンバーが、所定の製品またはプロセスに存在し、採用され、またはその他の点で関連する態様が提供される。任意の１以上の請求項は、任意の態様、面、特徴、要素または特性あるいはそれらの組み合わせを明示的に除外するように修正されてもよい。何れか１以上の請求項は、任意の薬剤、組成物、量、投与量、投与経路、細胞タイプ、標的、細胞マーカー、抗原、標的化部位またはそれらの組み合わせを除外するように修正されてもよい。

いくつかの実施形態において、核酸コードの縮重を考慮した、本明細書に開示する任意の核酸に対応するアミノ酸配列が提供される。さらに、明示したものと異なるが、機能的類似性または同等性を有する配列（核酸であれアミノ酸であれ）も、本発明の範囲内で意図される。これは、変異体、短縮化、置換または他の種類の修飾を含む。

本明細書で使用するあらゆる表題または副題は、構成上の目的のためであり、本明細書に開示する実施形態の限定に使用されるべきではない。
本開示は、以下の態様を提供し得る。
［項１］
免疫療法において使用するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を亢進するための方法であって、以下：
培養培地中でナチュラルキラー細胞集団をフィーダー細胞集団と共培養する工程であって、ここで、該フィーダー細胞集団が、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含む工程；
インターロイキン２（ＩＬ２）を培養培地に添加する工程；および
少なくとも１つの可溶性刺激剤を培養培地に添加する工程であって、ここで、該可溶性刺激剤が、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、およびその組み合わせから選択される工程、
を含む方法。
［項２］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から２４時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である、項１に記載の方法。
［項３］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である、項１に記載の方法。
［項４］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加が、該少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞の増殖の亢進をもたらす、項１に記載の方法。
［項５］
該少なくとも１つの可溶性刺激剤が、前記インターロイキン１２および前記インターロイキン１８の組み合わせを含む、項１に記載の方法。
［項６］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から２４時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である、項１に記載の方法。
［項７］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から２４時間以内の時点で、約１０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１２を含む、項１に記載の方法。
［項８］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から２４時間以内の時点で、約５０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１８を含む、項１に記載の方法。
［項９］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である、項１に記載の方法。
［項１０］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約１０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１２を含む、項１に記載の方法。
［項１１］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約５０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１８を含む、項１に記載の方法。
［項１２］
少なくとも１つの刺激剤が、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含み、ここで、ＩＬ２の培養培地への１度目の添加と比較してより高い濃度で２度目のＩＬ２の培養培地への添加を行い、ここで、前記濃度が前記共培養から２４時間以内の時点で存在する、項１に記載の方法。
［項１３］
少なくとも１つの刺激剤が、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含み、ここで、ＩＬ２の培養培地への１度目の添加と比較してより高い濃度で２度目のＩＬ２の培養培地への添加を行い、ここで、前記濃度が前記共培養から１２０時間以内の時点で存在する、項１に記載の方法。
［項１４］
フィーダー細胞集団がＫ５６２細胞を含む、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項１５］
Ｋ５６２細胞が共培養前に照射処理される、項１４に記載の方法。
［項１６］
Ｋ５６２細胞が４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両者を発現する、項１４に記載の方法。
［項１７］
ＮＫ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターに接触させる工程をさらに含む、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項１８］
ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体グループＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドの内の１つ以上を標的とするように構成された、項１７に記載の方法。
［項１９］
少なくとも１つの刺激剤が、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含む、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項２０］
方法が、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞が示す持続性および／または細胞障害性と比較して、ＮＫ細胞の持続性および／または細胞障害性の１つ以上をさらに増強する、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項２１］
培地に約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度でＩＬ２を添加する、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項２２］
培地に約５０ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度でＩＬ２を添加する、項１－１３のいずれか１項に記載の方法。
［項２３］
ＮＫ細胞が、（ｉ）ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｃの発現の増加、および／または（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ６２リガンドの発現の減少、または同等な発現、によって特徴付けられる記憶細胞様の表現型を示し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）における発現はどちらも、１以上の可溶性刺激分子が無い事を除いて同一の条件で培養したＮＫ細胞との比較による、前述の項いずれか１項に記載の方法。
［項２４］
ＮＫ細胞が、少なくとも１つの可溶性刺激剤を含むが、フィーダー細胞を含まない培地中で培養したＮＫ細胞と比較して、対象に投与した際にサイトカイン離脱徴候の減少を示す、前述の項いずれか１項に記載の方法。
［項２５］
可溶性刺激剤の内の少なくとも１つの追加量を培地に添加する事をさらに含む、前述の項いずれか１項に記載の方法。
［項２６］
培地への2度目の添加が、1度目の添加から１２時間後から１２０時間後の間に行われる、項２５に記載の方法。
［項２７］
可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度がそれぞれ、第１の時点と、それぞれの第２の時点で、同じである、項２５または２６に記載の方法。
［項２８］
がんを処置するための医薬の調製のための、項１－２７のいずれか１項に記載の方法によって増殖させたＮＫ細胞の使用。
［項２９］
がんを処置するための、項１－２７のいずれか１項に記載の方法によって増殖させたＮＫ細胞の使用。
［項３０］
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞障害性を増強するための方法であって以下：
培養培地中でＮＫ細胞集団をフィーダー細胞集団と共培養する工程であって、ここで、該フィーダー細胞集団が、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含む工程；
インターロイキン２（ＩＬ２）を培養培地に添加する工程；
少なくとも１つの可溶性刺激剤を培養培地に添加する工程であって、ここで、該可溶性刺激剤が、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、およびその組み合わせから選択され、ここで、該少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が前記共培養から１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの間である工程；
ＮＫ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるために、ＣＡＲをコードする核酸にＮＫ細胞を接触させる工程；
を含み、
ここで、少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加によって、該ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の細胞障害性が、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、増強される、
方法。
［項３１］
少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加によって、ＮＫ細胞の増殖が、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、亢進される、項３０に記載の方法。
［項３２］
少なくとも１つの可溶性刺激剤が、前記インターロイキン１２および前記インターロイキン１８の組み合わせを含む、項３０または３１に記載の方法。
［項３３］
該少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である、項３０－３２のいずれか１項に記載の方法。
［項３４］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約１０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１２を含む、項３０－３３のいずれか１項に記載の方法。
［項３５］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約５０ｎｇ／ｍＬよりも低い濃度の可溶性ＩＬ１８を含む、項３０－３４のいずれか１項に記載の方法。
［項３６］
少なくとも１つの刺激剤が、（ｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含み、ここで、ＩＬ２の培養培地への１度目の添加と比較してより高い濃度で２度目のＩＬ２の培養培地への添加を行い、ここで、前記濃度が前記共培養から１２０時間以内の時点で存在する、項３０－３５のいずれか１項に記載の方法。


［項３７］
フィーダー細胞集団がＫ５６２細胞を含む、項３０－３６のいずれか１項に記載の方法。
［項３８］
Ｋ５６２細胞が共培養前に照射処理される、項３０－３７のいずれか１項に記載の方法。
［項３９］
Ｋ５６２細胞が４－１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５の両者を発現する、項３０－３８のいずれか１項に記載の方法。
［項４０］
ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＢＣＭＡ、またはナチュラルキラー受容体グループＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドの内の１以上を標的とするように構成された、項３０－３９のいずれか１項に記載の方法。
［項４１］
少なくとも１つの刺激剤が、（ｉ）前記共培養から１２０時間以内の時点における約０．０１ｎｇ／ｍＬから約８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）前記共培養から１２０時間以内の時点における約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含む、項３０－４０のいずれか１項に記載の方法。
［項４２］
方法が、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞が示す持続性と比較して、ＮＫ細胞の持続性をさらに増強する、項３０－４１のいずれか１項に記載の方法。
［項４３］
培地に、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度でＩＬ２を添加する、項３０－４２のいずれか１項に記載の方法。
［項４４］
培地に、前記共培養から１２０時間以内の時点で、約５０ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度でＩＬ２を添加する、項３０－４３のいずれか１項に記載の方法。
［項４５］
ＮＫ細胞が、（ｉ）ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｃの発現の増加、および／または（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ６２リガンドの発現の減少、または同等な発現、によって特徴付けられる記憶細胞様の表現型を示し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）における発現はどちらも、１以上の可溶性刺激分子が無い事を除いて同一の条件で培養したＮＫ細胞との比較による、項３０－４４のいずれか１項に記載の方法。
［項４６］
ＮＫ細胞が、少なくとも１つの可溶性刺激剤を含むが、フィーダー細胞を含まない培地中で培養したＮＫ細胞と比較して、対象に投与した際にサイトカイン離脱徴候の減少を示す、項３０－４５のいずれか１項に記載の方法。
［項４７］
可溶性刺激剤の内の少なくとも１つの追加量を培地に添加する事をさらに含む、項３０－４６のいずれか１項に記載の方法。
［項４８］
培地への2度目の添加が、1度目の添加の１２時間後から１２０時間後の間に行われる、項４７に記載の方法。
［項４９］
可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度がそれぞれ、第１の時点と、それぞれの第２の時点で、同じである、項４７または４８に記載の方法。
［項５０］
がんを処置するための医薬の調製のための、項３０－４９のいずれか１項に記載の方法によって増殖させたＮＫ細胞の使用。
［項５１］
がんを処置するための、項３０－４９のいずれか１項に記載の方法によって増殖させたＮＫ細胞の使用。
［項５２］
標的がん細胞上のマーカーに結合するように構成され、および結合すると、ＮＫ細胞が標的がん細胞に対する細胞障害効果を発揮するように誘導するキメラ抗原を含む、操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団であって、
ここで、該ＮＫ細胞は少なくとも１つの可溶性刺激剤の存在下で増殖し、
ここで、該可溶性刺激剤はインターロイキン１２、インターロイキン１８、インターロイキン２１、およびその組み合わせから選択され、および
ここで、該ＮＫ細胞集団が、少なくとも部分的には、（ｉ）ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｃの発現の増加、および／または（ｉｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ６２リガンドの発現の減少、または同等な発現、によって特徴付けられる記憶細胞様の表現型を示し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）における発現はどちらも、１以上の可溶性刺激分子が無い事を除いて同一の条件で培養したＮＫ細胞との比較による、
操作されたナチュラルキラー細胞集団。
［項５３］
操作されたキメラ受容体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の配列に対して少なくとも９５％同一である配列によってコードされる、項５２に記載のＮＫ細胞集団。
［項５４］
操作されたキメラ受容体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、または２８の配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、項５２に記載のＮＫ細胞集団。
［項５５］
がんを処置するための医薬の調製のための、項５２－５４のいずれか１項に記載のＮＫ細胞の使用。
［項５６］
がんを処置するための、項５２－５４のいずれか１項に記載のＮＫ細胞の使用。
［項５７］
治療有効量の項５２－５４のいずれか１項に記載の操作されたＮＫ細胞を対象に投与する事を含む、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法。
［項５８］
免疫療法において使用するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を亢進するための方法であって、以下：
培養培地中でナチュラルキラー細胞集団をフィーダー細胞集団と共培養する工程であって、ここで、該フィーダー細胞集団が、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５を発現するように操作された細胞を含む工程；
インターロイキン２（ＩＬ２）を培養培地に添加する工程；
第１の時点において、少なくとも１つの可溶性刺激剤を培養培地に添加する工程であって、ここで、該可溶性刺激剤が、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、およびその組み合わせから選択され、ここで、該少なくとも１つの可溶性刺激剤の濃度が、前記共培養から１２０時間以内の時点で約０．０１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬの間である工程；
第２の時点において、該可溶性刺激剤の内の少なくとも１つの追加量を培地に添加する工程であって、ここで第１の時点と第２の時点は１２時間以上１２０時間未満離れている工程；および
ＮＫ細胞をフィーダー細胞と第２の期間にわたり共培養する工程であって、ここで、少なくとも１つの可溶性刺激剤の培地への添加が、該少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞の増殖の亢進をもたらす工程を含む、
方法。
［項５９］
少なくとも１つの可溶性刺激剤がＩＬ１２およびＩＬ１８の組み合わせを含み、ここで、第１の時点が、ＮＫ細胞とフィーダー細胞の共培養の開始時であり、およびここで、第２の時点が、第２の期間の開始時である、項５８に記載の方法。
［項６０］
第１の時点および第２の時点が約２４時間から１２０時間離れており、および刺激剤の濃度が、前記共培養から１２０時間以内の時点で約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間である、項５８または５９に記載の方法。
［項６１］
少なくとも１つの刺激剤が、前記共培養から１２０時間以内の時点で（ｉ）約１０ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）約０．０１ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８、を含む項５８－６０のいずれか１項に記載の方法。
［項６２］
可溶性ＩＬ１２および可溶性ＩＬ１８の濃度がそれぞれ、第１の時点と、それぞれの第２の時点で、同じである、項６１に記載の方法。
［項６３］
増殖させたＮＫ細胞にキメラ受容体をコードする核酸コンストラクトをトランスダクションする事をさらに含み、ここで、該キメラ受容体の発現は、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞上のキメラ受容体の発現と比較して、増強されている、項５８－６２のいずれか１項に記載の方法。
［項６４］
キメラ受容体の細胞障害活性は、少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下でフィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞上のキメラ受容体の細胞障害活性と比較して、増強されている、項６３に記載の方法。
［項６５］
細胞増殖のための培養培地であって、以下：
約５００ ＩＵ／ｍＬ未満の濃度で供されるインターロイキン２；
約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で供されるインターロイキン１２；および
約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で供されるインターロイキン１８を含む、
培養培地。
［項６６］
細胞増殖用の組み合わせ培養培地であって、該組み合わせとして以下：
約５００ＩＵ／ｍＬ未満の濃度で供されるインターロイキン２；
約１０ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で供されるインターロイキン１２；
約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で供されるインターロイキン１８；および
細胞膜表面に結合するインターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）、を含む、
組み合わせ培養培地。
［項６７］
ｍｂＩＬ１５はフィーダー細胞の細胞膜表面に結合されている、項６６に記載の組み合わせ培養培地。
［項６８］
少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つの無機塩、および少なくとも１つのビタミンをさらに含む、項６５または６６に記載の培地。

Claims (5)

1. ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を亢進するための方法であって、以下：
   培養培地中でＮＫ細胞集団をフィーダー細胞集団と共培養すること、ここで該フィーダー細胞集団が、４－１ＢＢＬおよび膜結合型インターロイキン－１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された細胞を含む；
   インターロイキン２（ＩＬ２）を培養培地に添加すること；
   共培養の開始から１２０時間以内に、少なくとも１つの可溶性刺激剤を培養培地に添加すること、ここで該少なくとも１つの可溶性刺激剤が、（ｉ）０．０１ｎｇ／ｍＬから８ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１２、および（ｉｉ）０．０１ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の可溶性ＩＬ１８の組み合わせを含む；および
   ＮＫ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするベクターに接触させて、ＮＫ細胞にＣＡＲを発現させること、を含み、
   ここで前記方法が、前記少なくとも１つの可溶性刺激剤の非存在下で前記フィーダー細胞と共培養したＮＫ細胞と比較して、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する、方法。
2. 培養培地が、共培養の開始から１２０時間以内に、ＩＬ２の培養培地への１度目の添加と比較してより高い濃度で２度目にＩＬ２を添加される、請求項１に記載の方法。
3. 培養培地が、ＩＬ２の培養培地への１度目の添加後１２時間から１２０時間の間に、２度目にＩＬ２を添加される、請求項２に記載の方法。
4. 培養培地が、５００ＩＵ／ｍＬ未満の濃度に２度目にＩＬ２を添加される、請求項２または３に記載の方法。
5. 培養培地が、５０ＩＵ／ｍＬ未満の濃度に１度目にＩＬ２を添加される、請求項２－４のいずれか１項に記載の方法。