JP7727632B2 - イヌインターロイキン－４受容体α抗体 - Google Patents

イヌインターロイキン－４受容体α抗体

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２０年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０１５，２２０号、２０２０年４月２４日に出願された米国特許出願第６３／０１５，２０９号、２０１９年１２月２０日に出願された米国特許出願第６２／９５１，７７８号、および２０１９年１２月２０日に出願された米国特許出願第６２／９５１，７９３号の優先権を主張し、これらのすべての内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、イヌＩＬ－４受容体αに対する高い結合親和性を有し、イヌＩＬ－４受容体αへのイヌＩＬ－４および／またはＩＬ－１３の結合を遮断することができるイヌＩＬ－４受容体αに対する抗体に関する。本発明はさらに、イヌＩＬ－４受容体αに対する抗体に結合するエピトープに関する。本発明はまた、イヌにおけるアトピー性皮膚炎の処置における本発明の抗体の使用に関する。
免疫系は、宿主を感染性疾患および癌から保護するために協働して機能する常在性のおよび再循環する特殊化された細胞のネットワークを含む。この機能を実行する免疫系の能力は、白血球によって分泌され、そして、インターロイキンと総称されるタンパク質群の生物学的活性に大きく依存する。よく研究されているインターロイキンには、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－３１（ＩＬ－３１）およびインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）として同定された４つの重要な分子がある。ＩＬ－４およびＩＬ－１３は、ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、マクロファージ、肥満細胞および好塩基球を含む多くの細胞型によって分泌され得る密接に関連したタンパク質である。ＩＬ－４およびＩＬ－１３は、多くの重複する機能を示し、Ｔ細胞依存性液性免疫応答の発生にとって非常に重要である。ＩＬ－４は、２つの受容体、すなわちＩ型およびＩＩ型のＩＬ－４受容体に高い親和性で結合することが知られている。Ｉ型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４受容体α鎖および共通γＣ鎖からなる。ＩＩ型ＩＬ－４受容体は、ＩＬ－４受容体α鎖およびＩＬ－１３受容体α１鎖からなる。ＩＬ－１３は、ＩＩ型ＩＬ－４受容体に結合し、ＩＬ－１３受容体α２と呼ばれる固有の受容体に結合する。ＩＬ－１３受容体α２へのＩＬ－１３の結合はシグナルを伝達せず、この受容体はまた、可溶性形態で分泌される。したがって、ＩＬ－１３受容体α２はしばしばデコイ受容体と呼ばれてきた。ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－２２およびＩＬ－３１は、細胞外病原体（例えば、組織または管腔内に存在する寄生生物）に対する保護のために必要とされる免疫応答を発生させるための重要なサイトカインであるが、これらのサイトカインは、アトピー性皮膚炎を含むヒトおよび動物におけるアレルギー性疾患の病態形成にも関与している。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、再発性の掻痒性および慢性炎症性皮膚疾患であり、ヒトにおける免疫系調節不全および表皮バリア異常を特徴とする。アトピー性皮膚炎の病理学的および免疫学的特質は、広範な調査の対象であった［Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ＆Ａｌｌｅｒｇｙ－ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ １０：４８６－４９６（２０１１）およびＨａｒｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ ３２：１３２－１３９（２０１３）に概説されている。］。アトピー性皮膚炎はまた、愛玩動物、特にイヌにおける一般的な症状であり、その有病率はイヌ集団の約１０～１５％であると推定されている。イヌおよびネコにおけるアトピー性皮膚炎の病態形成［Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄｓ １７２（８）：２０１－２０７（２０１３）に概説されている。］は、様々な免疫細胞による皮膚浸潤ならびにＩＬ－４、ＩＬ－１３およびＩＬ－３１が優勢であることを含むＣＤ４＋Ｔｈ２極性化されたサイトカイン環境を含む、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎の病態形成と著しい類似性を示す。さらに、ＩＬ－２２は、アトピー性皮膚炎に特徴的な表皮の肥厚をもたらす過剰な上皮増殖に関与している。
例えば、イヌＩＬ－３１に対する抗体は、イヌにおけるアトピー性皮膚炎に関連する掻痒症に対して著しい効果を有することが示されている［米国特許第８，７９０，６５１号；米国特許第１０，０９３，７３１号］。さらに、ヒトＩＬ－３１受容体α（ＩＬ－３１ＲＡ）に対する抗体が試験され、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎に関連する掻痒に対して著しい効果を有することが見出された［Ｒｕｚｉｃｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７６（９），８２６－８３５（２０１７）］。したがって、ＩＬ－３１がその受容体ＩＬ－３１ＲＡに結合するのを遮断することにより、アトピー性皮膚炎に伴う掻痒が軽減される。
ヒトＩＬ－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）に対して産生されたモノクローナル抗体が開発されており、これらの抗体のいくつかは、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎を処置するためのそれらの治療効果について広く試験されている［例えば、米国特許出願公開第２０１５／００１７１７６号を参照されたい。］。より最近では、イヌＩＬ－４のイヌＩＬ－４Ｒαへの結合を遮断するイヌＩＬ－４Ｒαに対するイヌ化抗体も開示されている［参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号］。ＩＩ型ＩＬ－４受容体はＩＬ－４受容体α鎖およびＩＬ－１３受容体α１鎖からなるので、イヌＩＬ－４およびイヌＩＬ－１３の両方がＩＩ型イヌＩＬ－４受容体に結合するのを遮断することができるイヌＩＬ－４Ｒαに対する抗体が得られており、それによってアトピー性皮膚炎に関連する炎症を阻止するのに役立つ［米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号］。
ＩＬ－１０関連Ｔ細胞由来誘導因子（ＩＬ－ＴＩＦ）としても知られるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）は、ＩＬ－１０サイトカインファミリーに属する。ＩＬ－２２は、ヒトにおいて抗ＣＤ３刺激時に正常なＴ細胞によって産生される。マウスＩＬ－２２発現はまた、リポ多糖注射時に様々な器官において誘導され、ＩＬ－２２が炎症応答に関与し得ることを示唆する。ＩＬ－２２は、ＩＬ－１０Ｒ２（ＩＬ－１０Ｒβとしても知られる）とインターロイキン－２２受容体（ＩＬ－２２Ｒ）とのヘテロ二量体複合体からなる受容体複合体に特異的に結合し、該受容体複合体を介してシグナル伝達する［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｐａｇｅｓ １－１３（２０１８：ｅ００４３４）を参照］。インターロイキン－２２受容体は、インターロイキン－２２Ｒ、α１；ＩＬ－２２ＲＡ１；ＩＬ－２２Ｒ１；ｚｃｙｔｏｒ１１；およびＣＲＦ２－９としても知られている［Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（１７）９５１１－９５１６（２００１）；Ｇｅｌｅｂａｒｔ ａｎｄ Ｌａｉ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（１２）：１１０６－１１１０（２０１０）］。ＩＬ－２２は創傷治癒中に上皮細胞増殖を誘導し、その欠乏は制御されない増殖を可能にし、腫瘍発生を促進し得る［Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９１：２５９－２６３（２０１２］。ＩＬ－２２は、いくつかの肝細胞腫細胞株においてＳＴＡＴ－１およびＳＴＡＴ－３を活性化し、急性期タンパク質の産生を上方制御することが示されている。インターロイキン－２２およびＩＬ－２２Ｒに対する抗体は、ＩＬ－２２のＩＬ－２２Ｒとの相互作用を遮断し、それによって上皮増殖をもたらす関連シグナル伝達経路を遮断することによって抗増殖剤として作用する。
しかしながら、アトピー性皮膚炎の処置における最近の成功にもかかわらず、使用されている現在の治療法は、いずれも皮膚バリア機能の改善を伴いながら、皮膚炎症に対する著しい効果と同時に抗掻痒作用の迅速な開始をもたらすことはない。したがって、アトピー性皮膚炎の症候の１以上に対処することができるより優れた治療法を設計する必要がある。
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であることの自認として解釈されるべきではない。
米国特許第８，７９０，６５１号 米国特許第１０，０９３，７３１号 米国特許出願公開第２０１５／００１７１７６号 米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号
Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＆ Ａｌｌｅｒｇｙ－ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ １０：４８６－４９６（２０１１） Ｈａｒｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ ３２：１３２－１３９（２０１３） Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄｓ １７２（８）：２０１－２０７（２０１３） Ｒｕｚｉｃｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７６（９），８２６－８３５（２０１７） Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｐａｇｅｓ １－１３（２０１８：ｅ００４３４） Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（１７）９５１１－９５１６（２００１） Ｇｅｌｅｂａｒｔ ａｎｄ Ｌａｉ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（１２）：１１０６－１１１０（２０１０） Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９１：２５９－２６３（２０１２）
本発明は、特定の態様において単離され、先行技術における特性よりも優れた特性、例えば、先行技術の抗イヌＩＬ－４受容体α抗体より強固な結合を有するイヌＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）に対する新しいイヌ化抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、特異性をもってイヌインターロイキン－４受容体αに結合する哺乳動物抗体またはその抗原結合断片であって、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット、ＣＤＲ重１（ＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ重２（ＨＣＤＲ２）およびＣＤＲ重３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号２８のアミノ酸配列を含む、哺乳動物抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の態様において、本発明は、特異性をもってイヌインターロイキン－４受容体αに結合する哺乳動物抗体またはその抗原結合断片であって、３つの重ＣＤＲのセット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号４９のアミノ酸配列を含む、哺乳動物抗体またはその抗原結合断片を提供する。
関連する態様において、特異性をもってイヌインターロイキン－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）に結合する哺乳動物抗体またはその抗原結合断片は、３つの軽鎖ＣＤＲのセット：ＣＤＲ軽１（ＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ軽２（ＬＣＤＲ２）およびＣＤＲ軽３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖をさらに含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号３４のアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、哺乳動物抗体またはその抗原結合断片は、イヌＩＬ－４Ｒαに結合し、イヌＩＬ－４Ｒαのイヌインターロイキン－４（ｃＩＬ－４）への結合を遮断する。関連する態様において、哺乳動物抗体またはその抗原結合断片は、イヌＩＬ－４Ｒαに結合し、イヌＩＬ－４Ｒαのイヌインターロイキン－１３（ｃＩＬ－１３）への結合を遮断する。さらに他の態様において、哺乳動物抗体またはその抗原結合断片は、イヌｃＩＬ－４Ｒαに結合し、イヌｃＩＬ－４ＲαのｃＩＬ－４およびｃＩＬ－１３への結合を遮断する。
特定の態様において、イヌＩＬ－４Ｒαに対する哺乳動物抗体はマウス抗体である。関連する態様において、イヌＩＬ－４Ｒαに対する哺乳動物抗体は、イヌ化マウス抗体である。特定の態様において、イヌ化抗体は、ＩｇＧ－Ｄ ｃＦｃを含む重鎖を含むが、天然に存在するＩｇＧ－Ｄヒンジ領域が配列番号６のアミノ酸配列を含むヒンジ領域によって置き換えられている。他の態様において、イヌ化抗体は、ＩｇＧ－Ｄ ｃＦｃを含む重鎖を含むが、天然に存在するＩｇＧ－Ｄヒンジ領域が配列番号７のアミノ酸配列を含むヒンジ領域によって置き換えられている。さらに他の態様において、イヌ化抗体は、ＩｇＧ－Ｄ ｃＦｃを含む重鎖を含むが、天然に存在するＩｇＧ－Ｄヒンジ領域が配列番号８のアミノ酸配列を含むヒンジ領域によって置き換えられている。さらに他の態様において、イヌ化抗体は、ＩｇＧ－Ｄ ｃＦｃを含む重鎖を含むが、天然に存在するＩｇＧ－Ｄヒンジ領域が配列番号９のアミノ酸配列を含むヒンジ領域によって置き換えられている。
特定の態様において、イヌ化抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む改変されたイヌＩｇＧ－Ｂ（ＩｇＧ－Ｂｍ）を含む重鎖を含む。ある特定の態様において、イヌ化抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。他の態様において、イヌ化抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。さらに他の態様において、イヌ化抗体は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の態様において、イヌ化抗体は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。代替の態様において、イヌ化抗体は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖をさらに含む。
特定の態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４６に結合する。より特定の態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、イヌＩＬ－４Ｒαの以下のアミノ酸残基：配列番号５のＳ１１１、Ｈ１１２、Ｔ１１３、Ｔ１１９、Ｙ１２２、Ｔ１２４およびＨ１２７のうちの１、２、３、４、５、６または７つすべてに結合する。関連する態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７に結合する。より特定の態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、イヌＩＬ－４Ｒαの以下のアミノ酸残基：配列番号５のＹ１５０、Ｔ１５３、Ｙ１５４、Ｔ１５８、Ｒ１６０、Ｓ１６４、Ｔ１６５、Ｓ１６８、Ｓ１７１、Ｙ１７２、Ｓ１７３のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１すべてに結合する。さらにより特定の態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４６および配列番号４７の両方に結合する。この種のなおさらなる特定の態様において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、イヌＩＬ－４Ｒαの以下のアミノ酸残基：配列番号５の：Ｓ１１１、Ｈ１１２、Ｔ１１３、Ｔ１１９、Ｙ１２２、Ｔ１２４およびＨ１２７の１、２、３、４、５、６もしくは７つすべてに、ならびに／またはイヌＩＬ－４Ｒαの以下のアミノ酸残基：配列番号５のＹ１５０、Ｔ１５３、Ｙ１５４、Ｔ１５８、Ｒ１６０、Ｓ１６４、Ｔ１６５、Ｓ１６８、Ｓ１７１、Ｙ１７２、Ｓ１７３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１すべてに結合する。
本発明はまた、ＣＤＲ、イヌ化抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および／またはイヌ化抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖、をコードする、単離された核酸を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、このような核酸を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに、本発明は、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合断片を、薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と共に含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、アトピー性皮膚炎を有するイヌに前記組成物の１つを投与することを含む、アトピー性皮膚炎を処置する方法を提供する。特定の態様において、本発明は、それを必要とするイヌに、治療有効量の本発明の薬学的組成物を投与することを含む、アトピー性皮膚炎に関連する炎症の遮断を補助する方法を提供する。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明を参照することによってよりよく理解されよう。
図１は、ＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）抗体によるＩＬ－４媒介性ＳＴＡＴ－６リン酸化の阻害を示すグラフである。ｃ４Ｈ３［国際公開第２０１６／１５６５８８号参照］およびｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３と呼ばれる２つの異なるイヌ化モノクローナル抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体を、ＳＴＡＴ－６リン酸化を阻害する能力について評価した。データは、両抗体がＩＬ－４の存在下でＳＴＡＴ－６リン酸化の用量依存的阻害をもたらすことを示す。ＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）抗体の非存在下におけるＩＬ－４対照をグラフの右上の部分に示す。 図２は、ＩＬ－４Ｒα抗体によるＩＬ－１３媒介性ＳＴＡＴ－６リン酸化の阻害を示すグラフである。ｃ４Ｈ３［国際公開第２０１６／１５６５８８号参照］およびｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３と呼ばれる２つの異なるイヌ化モノクローナル抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体を、ＳＴＡＴ－６リン酸化を阻害する能力について評価した。データは、両抗体がＩＬ－１３の存在下でＳＴＡＴ－６リン酸化の用量依存的阻害をもたらすことを示す。ＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）抗体の非存在下におけるＩＬ－１３対照をグラフの右上の部分に示す。 図３は、ＥＬＩＳＡによって評価された、λまたはκ軽鎖のいずれかを含有するイヌ化抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体の結合を示す。結果は、λ軽鎖を含有するイヌ化抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体（ｃ１５２ＣｌＬ１－Ｈ１、ｃ１５２ＣｌＬ１－Ｈ２およびｃ１５２ＣｌＬ１－Ｈ３）が、イヌＩＬ－４Ｒαの他に、同じＣＤＲを含有するがκ軽鎖を有するイヌ化抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体（ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３）にも結合することを示す。１５２ｍｃはマウス－イヌキメラ抗体陽性対照であり、Ｉｓｏ－Ｃｔｒ、陰性対照は無関係のイヌ化抗体である。 図４は、ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３抗体に対する、イヌＩＬ－４Ｒα上の配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列を含むエピトープを示す。
アトピー性皮膚炎のためのより良い治療が必要とされていることに応じて、本発明は、イヌ化抗体、イヌ化抗体を含む製剤、および、アトピー性皮膚炎に関連する皮膚炎症に対して著しい効果を達成することができる方法論を提供する。
略語
本発明の詳細な説明および実施例を通じて、以下の略語が使用される。
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ 補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して定義される、免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域
ＥＣ５０ ５０％の有効性または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
ＦＲ 抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域。
ＩＣ５０ ５０％阻害をもたらす濃度
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔによって先駆的に開発された免疫グロブリンのアラインメントおよびナンバリングシステム［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］
ｍＡｂ モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂも）
Ｖ領域 異なる抗体間で配列が可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。Ｖ領域は、軽鎖中のｋａｂａｔ残基１０９および重鎖中のｋａｂａｔ残基１１３に広がる。
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ 免疫グロブリン軽鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンκ軽鎖可変領域
定義
本発明がより容易に理解され得るように、特定の技術的および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような単語の単数形は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、それらの対応する複数の言及を含む。
「投与」および「処理」は、動物、例えばイヌ対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合、外因性の医薬、治療剤、診断剤または組成物の動物、例えばイヌ対象、細胞、組織、器官または生物学的流体への接触を指す。細胞の処理は、細胞への試薬の接触の他、細胞と接触している流体への試薬の接触を包含する。
「投与」および「処理」はまた、例えば、試薬、診断薬、結合化合物によるまたは別の細胞による細胞のインビトロおよびエクスビボ処理を意味する。「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコまたはヒト）、最も好ましくはイヌを含む。
「処置する」または「処置している」は、例えば、その治療剤が治療活性を有する、１以上の症候を有するまたは症状を有することが疑われるイヌ対象または患者に、内部または外部に、本発明の、抗体のいずれかを含有する組成物のような治療剤を投与することを意味する。典型的には、治療剤は、任意の臨床的に測定可能な程度だけ、そのような症候（類）の退縮を誘導または進行を阻害することにより、処置された対象または集団において１以上の疾患／症状症候を軽減および／または改善するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患／症状症候を軽減するのに有効である治療剤の量（「治療有効量」とも称される）は、患者（例えば、イヌ）の疾患／症状状態、年齢、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する薬学的組成物の能力のような因子によって異なり得る。疾患／症状症候が軽減または改善されたかどうかは、その症候の重症度または進行状態を評価するために獣医またはその他の熟練した医療従事者によって通常使用される任意の臨床的測定によって評価することができる。本発明の態様（例えば、処置方法または製造品）は、あらゆる対象において標的疾患／症状症候（類）を軽減するのに有効であるわけではないことがあり得るが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー・テルプストラ検定およびウィルコクソン検定などの当技術分野で公知の任意の統計学的検定によって決定された場合に、統計学的に有意な数の対象において標的疾患／症状症候（類）を軽減するはずである。
「処置」は、ヒト、獣医学的対象（例えば、イヌ）または研究対象に適用される場合、治療的処置ならびに研究および診断用途を指す。「処置」は、ヒト、獣医学的対象（例えば、イヌ）、または研究対象、または細胞、組織もしくは器官に適用される場合、本発明の抗体の、例えばイヌもしくはその他の動物対象、細胞、組織、生理学的区画、または生理学的流体への接触を包含する。
本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に明記しない限り、すべての家畜犬、カニス・ルプス・ファミリアリスまたはカニス・ファミリアリスを含む。
本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科の任意のメンバーを指す。この科のメンバーには、家畜ネコ、純血および／または雑種の愛玩ネコ、ショーキャット、研究室ネコ、クローニングされたネコおよび野生のまたは野生化したネコを含む、野生、動物園および家庭のメンバーが含まれる。
本明細書で使用される場合、「イヌフレーム」という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の、イヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。イヌ化抗体に関して、大半の態様において、天然のイヌＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖において対応する外来ＣＤＲ（例えば、マウス抗体由来のもの）で置き換えられる。イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は、例えば、下記に例示されるようにおよび／またはその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第１０，１０６，６０７号に開示されるように、イヌ抗体内の外来ＣＤＲの立体構造を保存するために、および／またはＦｃ機能を改変するためにいくつかの外来非ＣＤＲ残基を含有してもよい。
「Ｆｃ」と略記される「断片結晶化可能領域」は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する抗体のＣＨ３－ＣＨ２部分に対応する。４つのイヌＩｇＧの各々のイヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃ）は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１）によって最初に記載され、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１５７：３１－４１（２０１４）および米国特許第１０，１０６，６０７号］も参照されたい。
本明細書で使用される場合、イヌＦｃ（ｃＦｃ）「ＩｇＧ－Ｂｍ」は、ＩｇＧ－Ｂの配列番号１０のアミノ酸配列中に２つのアミノ酸残基置換、Ｄ３１ＡおよびＮ６３Ａを含み（下記参照）、ｃ末端リジン（「Ｋ」）がないイヌＩｇＧ－Ｂ Ｆｃである。配列番号１０の３１位のアスパラギン酸残基（Ｄ）および配列番号１０の６３位のアスパラギン残基（Ｎ）は、いずれもＩｇＧ－Ｂｍにおいてはアラニン残基（Ａ）によって置換されている。これらの２つのアミノ酸残基置換は、天然に存在するイヌＩｇＧ－Ｂの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を著しく減弱させるのに役立つ［その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第１０，１０６，６０７号を参照］。ＩｇＧ－Ｂにおいて行うことができるアミノ酸置換と類似し、二重特異性抗体においてヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸置換を含み得る、ＩｇＧ－Ｂｍへのさらなるアミノ酸置換も意図される。ＩｇＧ－Ｂのアミノ酸配列、配列番号４５は、以下のものである。
ＩｇＧ－Ｂｍのアミノ酸配列、配列番号１０を以下に提供する。
ＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
本明細書中で使用される場合、抗体のアミノ酸配列における別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、例えば、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置き換える」と等価であり、アミノ酸配列中の特定の位置における特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられている（または置換されている）ことを示す。このような置換は、具体的に設計することができる、すなわち、例えば組換えＤＮＡ技術によってアミノ酸配列中の特定の位置のアラニンをセリンで意図的に置き換えることができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基または一連のアミノ酸残基は、より自然な選択過程を介して、例えば細胞によって産生された抗体がその抗原上の所与の領域、例えば、エピトープもしくはその一部を含有する領域に結合する能力に基づいて、および／または抗体が、その特定のＣＤＲが置き換えているＣＤＲと同じカノニカル構造を保持する特定のＣＤＲを含むように、１以上のアミノ酸残基によって置き換えることができる。このような置換／置き換えは、「変異型」ＣＤＲおよび／または変異型抗体をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を示す抗体の任意の形態を指す。抗体は、単量体、二量体、またはより大きな多量体であり得る。したがって、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体を具体的に包含するが、これらに限定されない。「親抗体」は、イヌ治療用抗体として使用するための抗体のイヌ化などの意図された使用のための抗体の改変の前に免疫系を抗原に曝露することによって得られる抗体である。
本明細書で使用される場合、例えばその結合パートナー（リガンド）へのイヌ受容体の結合を「遮断する」または「遮断している」または「結合を遮断している」本発明の抗体は、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー）で決定された場合に、イヌ受容体のそのイヌリガンドへの結合を（部分的にまたは完全に）遮断するおよびその逆である抗体である。
典型的には、本発明の抗体または抗原結合断片は、その活性がモルベースで表される場合、（親抗体と比較した場合に）そのイヌ抗原結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、親抗体としてのイヌ抗原結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれより多くを保持する。本発明の抗体または抗原結合断片は、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異型」または「機能が保存された変異型」と呼ばれる）を含み得ることも意図される。
「単離された抗体」は、精製状態を指し、このような文脈において、分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物のような他の生物学的分子、または細胞残屑および増殖培地のような他の材料を実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載される結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しなければ、そのような材料が完全に存在しないこと、または水、緩衝液もしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、第１の抗体由来の可変ドメインおよび第２の抗体由来の定常ドメインを有する抗体であり、第１および第２の抗体は異なる種に由来する。［米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４）］。典型的には、得られたキメラ抗体が、親（例えば、げっ歯類）抗体よりもそれぞれヒトまたはイヌ対象において有害な免疫応答を誘発する可能性がより低くなるように、可変ドメインは、げっ歯類などの実験動物由来の抗体（「親抗体」）から得られ、そして、定常ドメイン配列は、動物対象抗体、例えばヒトまたはイヌから得られる。
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、イヌおよび非イヌ（例えば、マウス）抗体の両方からの配列を含有する抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが（例えば、以下に例示されるような６つのＣＤＲを含む）非イヌ免疫グロブリンの超可変ループに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべて（および典型的には残りのフレームのすべてまたは実質的にすべて）がイヌ免疫グロブリン配列のフレームワーク（ＦＲ）領域である少なくとも１つ以上の、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。本明細書で例示されるように、イヌ化抗体は、マウス抗イヌ抗原抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲの両方を、イヌフレームまたは改変されたイヌフレームと共に含む。例えば、改変されたイヌフレームは、そのイヌ抗原へのイヌ化抗体の結合および／またはイヌ抗原の天然の結合パートナーへのそのイヌ抗原の結合を遮断するイヌ化抗体の能力を増加させるためにイヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、本明細書に例示される１以上のアミノ酸変化を含む。
各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な状態の抗体は２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は、一般に同じである。典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲには、通常フレームワーク領域が整列しており、特異的なエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはいずれも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，５ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１），Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５（１９７８），Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７），Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）］の定義に従う。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ならびに重鎖可変ドメイン中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）由来のアミノ酸残基を含む。［配列によって抗体のＣＤＲ領域を定義するＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照；構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義するＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）も参照］。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－ＣおよびＩｇＧ－Ｄと呼ばれる。２つの公知の軽鎖サブタイプは、λおよびκと呼ばれる。本発明の特定の態様では、イヌ免疫細胞の結合および活性化とは別に、本発明の、イヌまたはイヌ化抗体の抗原に対するイヌまたはイヌ化抗体は、最適には以下の２つの属性を有する。
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如、ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィーに基づく技術などの業界標準技術を使用して大規模に容易に精製される。
天然に存在するイヌＩｇＧアイソタイプは、いずれも両方の基準は満たさない。例えば、ＩｇＧ－Ｂは、プロテインＡを使用して精製することができるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。他方、ＩｇＧ－ＡはプロテインＡに弱く結合するが、ＡＤＣＣ活性も示す。さらに、ＩｇＧ－ＣもＩｇＧ－ＤもプロテインＡカラムで精製することはできないが、ＩｇＧ－ＤはＡＤＣＣ活性を示さない。（ＩｇＧ－ＣはかなりのＡＤＣＣ活性を有する）。本発明がこれらの問題に対処する１つの方法は、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を欠き、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィーを使用して容易に精製することができる、本発明の抗原に対して特異的な本発明の改変されたイヌＩｇＧ－Ｂ抗体を提供することによるものである。
本明細書で使用される場合、「抗炎症抗体」とは、特にアトピー性皮膚炎に関して、ヒト、イヌおよび／またはネコなどの哺乳動物を含む動物において抗炎症剤として作用することができる抗体である。特定の態様において、抗炎症抗体は、ＩＬ－４または受容体ＩＬ－４ＲαなどのＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達経路中の特定のタンパク質に結合する。抗炎症抗体のその対応する抗原（例えば、ＩＬ－４またはＩＬ－４Ｒα）への結合は、例えばＩＬ－４のＩＬ－４Ｒαとの結合を阻害し、この経路のシグナル伝達を妨害および／または防止し、それによってアトピー性皮膚炎に関連する慢性炎症を妨害または防止する。
本明細書で使用される場合、「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列が最適に整列されている場合の、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。２つの比較された配列の両方中の位置が同じ塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれの中の位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、比較される位置の総数で除した２つの配列によって共有される相同な位置の数×１００である。例えば、配列が最適に整列されたときに、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致しているまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、２つの配列が最大のパーセント相同性を与えるように整列されたときに行われる。配列同一性は、２つの配列が最適に整列されたときに、２つのポリペプチドのアミノ酸が等価な位置において同じである程度を指す。
本明細書で使用される場合、両配列のアミノ酸残基が同一である場合に、１つのアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」である。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合に、アミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されているタンパク質、またはポリペプチドの一部によって含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって行われる。特定の態様において、さもなければ２つのアミノ酸配列間の対応関係を変化させ得る選択された欠失または挿入が考慮される。配列類似性には、同一の残基および同一でない生化学的に関連するアミノ酸が含まれる。同様の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸。
「保存的に改変された変異型」または「保存的置換」は、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく変化を頻繁に行うことができるような、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造および剛性など）を有する他のアミノ酸によるタンパク質中のアミノ酸の置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化させないことを認識する［例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄ．；１９８７）を参照］。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性がより低い。例示的な保存的置換を、すぐ下の表Ａに示す。
本発明の抗体の機能保存的変異型も本発明によって意図される。本明細書で使用される「機能保存的変異型」は、抗原親和性および／または特異性のような所望の特性を変化させることなく１以上のアミノ酸残基が変化されている抗体または断片を指す。そのような変異型としては、上記表Ａの保存的アミノ酸置換のような類似の特性を有するアミノ酸でアミノ酸を置き換えることを含み、これらに限定されない。
「単離された核酸分子」とは、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはこれらのいくつかの組み合わせのＤＮＡまたはＲＮＡであって、単離されたポリヌクレオチドが自然においてその中に見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部を伴っていないもの、または単離された核酸分子が自然において連結されていないポリヌクレオチドに連結されているものを意味する。本開示において、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、そのままの状態の染色体を包含しないことを理解されたい。指定された核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０もしくは最大２０もしくはそれより多くの他のタンパク質もしくはその一部もしくは断片に対するコード配列を含み得、または、記載された核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含み得、および／またはベクター配列を含み得る。
本発明は、本発明の単離されたイヌ化抗体、症状の処置、例えばイヌにおけるアトピー性皮膚炎の処置における抗体の使用方法を提供する。イヌでは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ばれる４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧ－Ａ（またはＩｇＧＡ）、ＩｇＧ－Ｂ（またはＩｇＧＢ）、ＩｇＧ－Ｃ（またはＩｇＧＣ）およびＩｇＧ－Ｄ（またはＩｇＧＤ）と呼ばれるイヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表す。２つの重鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＣＨ－１、ＣＨ－２およびＣＨ－３と呼ばれる３つの定常ドメインとからなる。ＣＨ－１ドメインは、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」と呼ばれるアミノ酸配列を介してＣＨ－２ドメインに接続されている。
これらの４つの重鎖の核酸およびアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１）］によって最初に同定された。これらの重鎖に対するアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＡＡＬ３５３０１．１を有し、ＩｇＧＢは、アクセッション番号ＡＡＬ３５３０２．１を有し、ＩｇＧＣはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０３．１を有し、ＩｇＧＤは、アクセッション番号（ＡＡＬ３５３０４．１）を有する。イヌ抗体は、２種類の軽鎖、κおよびλも含有する。これらの軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅから入手することができる。例えば、κ軽鎖アミノ酸配列は、アクセッション番号ＡＢＹ５７２８９．１を有し、λ軽鎖は、アクセッション番号ＡＢＹ５５５６９．１を有する。
本発明においては、４つのイヌＩｇＧ Ｆｃ断片のそれぞれに対するアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記によって決定されたＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの同定された境界に基づいている。イヌＩＬ－４Ｒαに結合するイヌ化マウス抗イヌ抗体としては、限定されないが、イヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－ＣおよびＩｇＧ－Ｄ重鎖ならびに／またはイヌκもしくはλ軽鎖をマウス抗イヌＩＬ－４ＲαＣＤＲと共に含む本発明の抗体が挙げられる。したがって、本発明は、イヌＩＬ－４Ｒαに結合し、その天然の結合パートナーであるイヌＩＬ－４および／またはイヌＩＬ－１３へのそのイヌＩＬ－４Ｒαの結合を遮断する本発明の単離されたイヌ化マウス抗イヌ抗体を提供する。
したがって、本発明はさらに、イヌ化マウス抗体、および症状の処置、例えば、イヌにおけるアトピー性皮膚炎の処置における本発明の抗体の使用方法を提供する。
本発明はさらに、イヌ化抗体を作製するために対応する軽鎖と合致させることができる完全長イヌ重鎖を提供する。したがって、本発明はさらに、本発明のイヌ化マウス抗イヌ抗原抗体（単離されたイヌ化マウス抗イヌ抗体を含む）、ならびに症状の処置、例えばイヌにおけるアトピー性皮膚炎の処置における本発明の抗体の使用方法を提供する。
本発明はまた、１以上のエフェクター機能を増強し、減少させ、または除去するためにｃＦｃが遺伝子改変されているイヌ断片結晶化可能領域（ｃＦｃ領域）を含む本発明の抗体を提供する。本発明の一態様において、遺伝子改変されたｃＦｃは、１以上のエフェクター機能を減少させ、または除去する。本発明の別の態様において、遺伝子改変されたｃＦｃは、１以上のエフェクター機能を増強する。ある特定の態様において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、遺伝子改変されたイヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域である。別のこのような態様において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、遺伝子改変されたイヌＩｇＧＣ Ｆｃ領域である。特定の態様において、エフェクター機能は、増強され、減少され、または除去された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。別の態様において、エフェクター機能は、増強され、減少され、または除去された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。さらに別の態様において、ｃＦｃ領域は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増強し、減少させ、または除去するように遺伝子改変されている。
エフェクター機能を欠くイヌＩｇＧの変異型を作製するために、多数の変異体イヌＩｇＧＢ重鎖を作製した。これらの変異型は、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分中に以下の単一のまたは組み合わされた置換の１以上を含み得る：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａ。変異型重鎖（すなわち、このようなアミノ酸置換を含有する）を発現プラスミド中にクローニングし、軽鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞中に形質移入した。免疫エフェクター機能の媒介についてのそれらの可能性を評価するために、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合について、ＨＥＫ２９３細胞から発現および精製された完全な状態の抗体を評価した［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１０６，６０７号を参照されたい。］
本発明はまた、その天然のＩｇＧ－Ｄヒンジ領域の代わりに、以下からのヒンジ領域を含む改変されたイヌＩｇＧ－Ｄを提供する。
ＩｇＧ－Ａ：ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰ 配列番号６
ＩｇＧ－Ｂ：ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭ 配列番号７；または
ＩｇＧ－Ｃ：ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ 配列番号８。
あるいは、ＩｇＧ－Ｄヒンジ領域は、セリン残基をプロリン残基で置換することによって遺伝子改変することができる、すなわちＰＫＥＳＴＣＫＣＩＰＰＣＰＶＰＥＳ、配列番号９（プロリン残基（Ｐ）は下線が付され、太字で示されており、天然に存在するセリン残基を置換する）。このような修飾は、ｆａｂアーム交換を欠くイヌＩｇＧ－Ｄをもたらし得る。改変されたイヌＩｇＧ－Ｄは、組換えＤＮＡ技術の標準的な方法［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）］を用いて構築することができる。これらの変異型を構築するために、改変されたＩｇＧ－Ｄをコードするように、イヌＩｇＧ－Ｄのアミノ酸配列をコードする核酸を改変することができる。次いで、改変された核酸配列は、タンパク質発現のために発現プラスミド中にクローニングされる。
本明細書に記載されるイヌ化マウス抗イヌ抗体の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むイヌ抗体κ軽鎖と、マウス重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧとを含むことができる。
核酸
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする核酸を含む（例えば、以下の実施例を参照）。
それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間に最大の一致を与えるようにアルゴリズムのパラメータが選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較が行われる場合に、変化しないＣＤＲを除いた、本明細書中に提供されるイヌ化抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。本発明は、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間に最大の一致を与えるようにアルゴリズムのパラメータが選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて比較が行われる場合に、参照アミノ酸配列のいずれかに少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸をさらに提供し、本発明に含まれる。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のパーセント同一性は、整列初期設定パラメータおよび同一性の初期設定パラメータを用いて、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して決定することができる。同じまたは類似の初期設定パラメータを使用して配列類似性を決定するために、これらの市販のプログラムを使用することもできる。あるいは、例えば、初期設定パラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用して、初期設定フィルタ条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。
以下の参考文献は、配列分析のためにしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０（１９９４）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５－３５２，（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”（１９７８），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３－３５８（１９７８），Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００（１９９３）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．” ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）。
本発明の抗体は、当分野で公知の方法によって組換え的に生産することができる。本明細書に開示される抗体または断片を発現させるための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞および多数の他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって、特に好ましい細胞株が選択される。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくは断片、軽鎖および／またはその抗原結合断片をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞がその中で増殖されている培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはこれからの他の部分）の発現は、いくつかの公知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的または部分的に論じられている。
一般に、特定の細胞株またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。したがって、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を産生するために使用される特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存する。しかしながら、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるまたは本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンとは無関係に本発明を構成する。同様に、特定の態様においては、フコシル化されていないＮ－グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、典型的には、インビトロおよびインビボの両方でそれらのフコシル化された対応物より強力な有効性を示すことが示されているので、これらの抗体は有利であり得る［例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６－３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号を参照］。
イヌＩＬ－４受容体α受容体
Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（アクセッション番号ＸＭ＿５４７０７７．４；米国特許第７，２０８，５７９号も参照）の検索を通じて、予測された完全長イヌＩＬ－４受容体α鎖（配列番号１）をコードするｃＤＮＡを同定した。この予測されるｃＤＮＡは、２５アミノ酸のリーダー配列を含む８２３アミノ酸（配列番号２）をコードし、アクセッション番号ＸＰ＿５４７０７７．３として同定される。成熟した予測されるイヌＩＬ－４受容体α鎖タンパク質（配列番号４）は、ヒトＩＬ－４受容体α鎖（アクセッション番号ＮＰ＿０００４０９．１）と６５％の同一性およびブタＩＬ－４受容体α鎖（アクセッション番号ＮＰ＿９９９５０５．１）と７０％の同一性を共有する。成熟した予測されるイヌＩＬ－４受容体α鎖タンパク質は、配列番号３として同定されるヌクレオチド配列によってコードされる。予測される成熟したＩＬ－４受容体α鎖のヒトＩＬ－４受容体α鎖の公知の配列との比較により、成熟したイヌＩＬ－４受容体α鎖タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が同定され、配列番号５と名付けられている。これはすべて、以前に［米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号；その全体が本明細書に組み入れられる］に記載されている。
シグナル配列を有するイヌＩＬ－４受容体α鎖完全長ＤＮＡ［配列番号１］
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太字のシグナル配列を有するイヌＩＬ－４受容体α完全長タンパク質［配列番号２］
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シグナル配列を有しないイヌＩＬ－４受容体α成熟完全長タンパク質［配列番号４］
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シグナル配列を有しないイヌＩＬ－４受容体α成熟完全長ＤＮＡ［配列番号３］
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イヌＩＬ－４受容体α鎖細胞外ドメイン［配列番号５］
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抗体タンパク質操作
例として、限定ではなく、イヌ重鎖定常領域は、ＩｇＧ－Ｂまたは本明細書で使用されるＩｇＧ－Ｂｍなどの改変されたｃＦｃ［参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第１０，１０６，６０７号を参照］に由来し得、イヌ軽鎖定常領域はκに由来し得る。
抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、親（すなわち、マウス）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のイヌフレームワークおよび／またはイヌフレーム残基に対する改変を含むように操作することができる。特定の状況では、以下に例示されるように、個々のＣＤＲを改変することができる。
薬学的組成物および投与
本発明の抗体を含む薬学的または無菌組成物を調製するために、これらの抗体は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と混合することができる。［例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照］。
治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の許容され得る担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る［例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照］。一態様において、本発明の抗体は、酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５～６で適切な濃度に希釈され、等張性のためにＮａＣｌまたはスクロースが添加される。安定性を高めるために、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のようなさらなる作用物質が添加され得る。
単独でまたは別の作用物質と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の局面においては、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、イヌにおける使用のための投薬量の範囲を製剤化する際に使用することができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くなしにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
投与様式は変化し得る。適切な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内を含む。特定の態様において、本発明の抗体は、注射のような侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる態様において、本発明の抗体またはその薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば、経口；例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与も本発明の範囲内である。
組成物は、当技術分野で公知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、例えばプレフィルドシリンジまたは自動注射器を含む皮下針での注射によって投与することができる。本明細書に開示される薬学的組成物はまた、米国特許第６，６２０，１３５号；同第６，０９６，００２号；同第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されている装置などの無針皮下注射装置を用いて投与され得る。
本明細書に開示される薬学的組成物はまた、注入によって投与され得る。薬学的組成物を投与する周知のインプラントおよびモジュール形態の例としては、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧式薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号を含む。他の多くのこのようなインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に周知である。
あるいは、本発明の抗体は、全身的にではなく局所的に、しばしばデポー製剤または持続放出製剤中で投与し得る。
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症候のレベル、治療用抗体の免疫原性、ならびに生物学的マトリックス中の標的細胞の到達可能性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えながら、標的疾患／症状状態の改善をもたらすのに十分な治療用抗体を送達する。したがって、送達される生物学的製剤の量は、部分的には、具体的な治療用抗体および処置されている症状の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量を選択する際の指針が利用可能である［例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２（２０００）参照］。
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野で知られているまたは疑われているパラメータまたは因子を使用して獣医によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりも幾分少ない量で始まり、その後、任意の負の副作用に比して所望のまたは最適な効果が達成されるまで少しの増分ずつ増加される。重要な診断尺度には、症候の診断尺度が含まれる。
本明細書において提供される抗体は、連続注入によって、または例えば毎日、週に１～７回、毎週、隔週、毎月、隔月、３ヶ月ごと、半年ごと、毎年などに投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内、または吸入によって提供され得る。総１週用量は、一般に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれより多くである［例えば、Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７－４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２－１６９８（２００２）；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１－４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３－１４４（２００３）］。０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれより多くのような、イヌの血清中の本発明の抗体の所定の標的濃度を達成するための用量も提供され得る。他の態様において、本発明の抗体は、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で、毎週、隔週、「４週間ごと」、毎月、隔月または３ヶ月ごとに皮下または静脈内投与される。
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害に関連する症候の発症の遅延および／またはこのような障害の症候の重症度の低下を含む。これらの用語はさらに、既存の制御されないまたは望ましくない症候を改善すること、さらなる症候を予防すること、およびそのような症候の根本的な原因を改善または予防することを含む。したがって、これらの用語は、障害、症状および／もしくは症候を有する、またはこのような障害、疾患もしくは症候を発症する可能性を有する脊椎動物対象（例えば、イヌ）に有益な結果が与えられたことを表す。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、単独でまたは追加の治療剤と組み合わせて、細胞、組織または対象、例えばイヌに投与された場合に、疾患もしくは症状の１以上の症候またはこのような疾患もしくは症状の進行の測定可能な改善を引き起こすのに有効である本発明の抗体の量を指す。治療有効用量はさらに、症候の少なくとも部分的な改善、例えば、関連する医学的症状の処置、治癒、予防もしくは改善、またはこのような症状の処置、治癒、予防もしくは改善の速度の増加をもたらすのに十分な抗体の量を指す。組み合わせに適用される場合、治療有効用量は、組み合わせて、連続的に、または同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わされた量を指す。有効量の治療薬は、診断尺度またはパラメータの少なくとも１０％；通常、少なくとも２０％；好ましくは少なくとも約３０％；より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらすであろう。有効量はまた、症状の重症度を評価するために主観的尺度が使用される場合に主観的尺度の改善をもたらすことができる。
［実施例１］
抗ＩＬ－４受容体α抗体
一般的な材料および方法
組換えタンパク質は、選択されたタンパク質のアミノ酸配列を商業的製造業者（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に提供することによって得られ、商業的製造業者は、このアミノ酸配列をコードする適切なヌクレオチド配列を選択した。ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）などの公に入手可能なＤＮＡデータベースからも得ることができる。次いで、商業的製造業者は、核酸を化学的に合成し、次に、合成された核酸は、ＡＴＵＭによって、対応する組換えタンパク質を産生するために発現プラスミド（ｐＤ２６１０－ｖ１０；ＡＵＴＭから入手可能）にクローニングされた。ＨＥＫ－２９３細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかの中にプラスミドを配置して、組換えタンパク質を発現させ、次いで、発現させた組換えタンパク質を従来の方法によって単離した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを１７日間にわたって複数回（各回１０μｇで）免疫した。免疫抗原は、イヌＩＬ－４Ｒα鎖細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－ヒトＦｃ融合タンパク質であった。免疫化後、各マウスから血清を収集し、イヌＩＬ－４受容体α鎖ＥＣＤ ＨＩＳタグ付きタンパク質との反応性について試験した。最も高い血清抗ＩＬ－４受容体α鎖ＥＣＤ力価を有するマウスの脾臓細胞を骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞株に融合した。融合の約２週間後、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－４受容体α鎖ＥＣＤ ＨＩＳタグ付きタンパク質に対する反応性について、推定ハイブリドーマ細胞からの上清を試験した。ＥＬＩＳＡにおいて強い陽性シグナルを生じるハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングし、イヌＩＬ－４受容体α鎖ＥＣＤ ＨＩＳタグ付きタンパク質に対する反応性について再度試験した。抗イヌＩＬ－４受容体α抗体には、抗体ｃ１５２Ｈ１１ＶＬ３－ｃＣＬｋ－ｓ／ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ３－ｃＩｇＧ－Ｂｍおよび抗体ｃ１４６Ｅ２ＶＬ３－ｃＣＬｋ－ｓ／ｃ１４６Ｅ２ＶＨ３－ｃＩｇＧ－Ｂｍが含まれる。
これらの２つの抗体ファミリーについての６つのＣＤＲ（３つの個々の軽鎖（ＬＣ）および３つの重鎖（ＨＣ）配列）のセットを、以下の表１Ａ（核酸配列）および表１Ｂ（アミノ酸配列）に示す。表１Ｂは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む１５２Ｈ１１に対する改変されたマウスＨＣＤＲ３を含むが、残りは改変されていないマウスＣＤＲである。表１Ａは、表１Ｂに列挙される１２のＣＤＲをコードする核酸を提供する。表１Ｃは、１５２Ｈ１１に対する改変されていないマウスＨＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号４９）およびこの改変されていないマウスＨＣＤＲ３をコードする核酸配列（配列番号４８）の両方を提供する。１５２Ｈ１１抗体ファミリーの改変されたマウスＨＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号２８）は、配列番号４９のアミノ酸配列のＣ末端のシステイン残基がセリン残基で置き換えられている点で、対応する改変されていないマウスＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と異なっている。１５２Ｈ１１抗体ファミリーの改変されていないマウスＨＣＤＲ３（配列番号４９）は、ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ１－ｃＩｇＧＢｍ（配列番号３６）およびｃ１５２Ｈ１１ＶＨ２－ｃＩｇＧＢｍ（配列番号３７）の両方に見出されるが、ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ３－ｃＩｇＧＢｍ（配列番号３８）は改変されたマウスＨＣＤＲ３（配列番号２８）を含む。イヌ化抗体についての完全長軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、表１Ｃの直後に提供されている。
ｃ１５２Ｈ１１ＶＬ３－ｃＣＬｋ－ｓ（κ軽鎖）：［配列番号３５］
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＳＬＳＬＳＱＥＥＫＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＬＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＦＴＩＳＳＬＥＰＥＤＶＡＥＦＦＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＮＤＡＱＰＡＶＹＬＦＱＰＳＰＤＱＬＨＴＧＳＡＳＶＶＣＬＬＮＳＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＶＤＧＶＩＱＤＴＧＩＱＥＳＶＴＥＱＤＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＭＳＳＴＥＹＬＳＨＥＬＹＳＣＥＩＴＨＫＳＬＰＳＴＬＩＫＳＦＱＲＳＥＣＱＲＶＤ
ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ１－ｃＩｇＧＢｍ（重鎖）：［配列番号３６］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＱＷＶＡＴＩＳＲＧＧＤＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＫＧＴＬＮＮＲＧＦＡＣＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ２－ｃＩｇＧＢｍ（重鎖）：［配列番号３７］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＤＫＲＬＱＷＶＡＴＩＳＲＧＧＤＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＬＮＮＲＧＦＡＣＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
ｃ１５２Ｈ１１ＶＨ３－ｃＩｇＧ－Ｂｍ（重鎖）：［配列番号３８］
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＤＫＲＬＱＷＶＡＴＩＳＲＧＧＤＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＬＮＮＲＧＦＡＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
ｃ１４６Ｅ２ＶＬ３－ｃＣＬｋ－ｓ（κ軽鎖）：［配列番号３９］
ＤＩＶＬＴＱＴＰＬＳＬＳＶＳＰＧＥＴＡＳＩＹＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＡＳＥＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＥＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＤＤＡＧＶＹＹＣＱＱＮＹＥＮＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＮＤＡＱＰＡＶＹＬＦＱＰＳＰＤＱＬＨＴＧＳＡＳＶＶＣＬＬＮＳＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＶＤＧＶＩＱＤＴＧＩＱＥＳＶＴＥＱＤＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＭＳＳＴＥＹＬＳＨＥＬＹＳＣＥＩＴＨＫＳＬＰＳＴＬＩＫＳＦＱＲＳＥＣＱＲＶＤ
ｃ１４６Ｅ２ＶＨ１－ｃＩｇＧＢｍ（重鎖）：［配列番号４０］
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＡＲＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＡＧＬＤＷＭＧＭＩＨＰＤＳＧＮＩＮＹＮＥＲＦＫＴＲＶＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＡＧＤＩＡＶＹＹＣＡＲＱＬＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
ｃ１４６Ｅ２ＶＨ２－ｃＩｇＧＢｍ（重鎖）：［配列番号４１］
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＡＲＹＷＭＨＷＭＫＱＡＰＧＡＧＬＤＷＩＧＭＩＨＰＤＳＧＮＩＮＹＮＥＲＦＫＴＫＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＡＧＤＩＡＶＹＹＣＡＲＱＬＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
ｃ１４６Ｅ２ＶＨ３－ｃＩｇＧ－Ｂｍ（重鎖）：［配列番号４２］
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＡＲＹＷＭＨＷＭＫＱＡＰＧＡＧＬＤＷＩＧＭＩＨＰＤＳＧＮＩＮＹＮＥＲＦＫＴＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＡＧＤＩＡＶＹＹＣＡＲＱＬＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡＰＳＣＧＳＴＳＧＳＴＶＡＬＡＣＬＶＳＧＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＳＬＴＳＧＶＨＴＦＰＳＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＭＶＴＶＰＳＳＲＷＰＳＥＴＦＴＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＫＶＤＫＰＶＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＡＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
さらに、イヌＩＬ－４受容体α抗体の軽鎖も、下記に提供されるようにλ軽鎖により構築された。
ｃ１５２Ｈ１１ＬＶ１－ｃＣｌ（λ軽鎖）［配列番号４３］
ＱＳＶＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＬＧＱＲＶＴＩＳＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＬＰＧＴＳＰＲＴＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＲＳＧＳＴＡＴＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＨＬＴＶＬＧＱＰＫＡＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＧＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＳＧＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＴＱＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＤＫＷＫＳＨＳＳＦＳＣＬＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＫＶＡＰＡＥＣＳ
ｃ１４６Ｅ２ＬＶ１－ｃＣｌ（λ軽鎖）［配列番号４４］
ＱＳＶＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＬＧＱＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＬＮＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＳＬＬＩＹＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＳＳＡＴＬＴＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＱＮＹＥＮＰＲＴＦＧＧＧＴＨＬＴＶＬＧＱＰＫＡＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＧＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＳＧＶＴＶＡＷＫＡＤＧＳＰＶＴＱＧＶＥＴＴＫＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＤＫＷＫＳＨＳＳＦＳＣＬＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＫＶＡＰＡＥＣＳ
［実施例２］
ＳＴＡＴ－６阻害
以下のように、ＤＨ８２細胞においてＳＴＡＴ－６リン酸化を阻害する能力について、イヌＩＬ－４受容体αに対する抗体を試験した：
材料
１．活発に増殖するＤＨ８２細胞
２．ＤＨ８２ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ（ＡＴＣＣ（登録商標）３０２００３（商標）、１５％ｗ／ｖの最終濃度になるように熱不活化ウシ胎児血清を供給されたイーグル最小必須培地）
３．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ－ＳＴＡＴ６（Ｔｙｒ６４１）Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ：ＡＬＳＵ－ＰＳＴ６－Ａ－ＨＶ
４．組換えイヌＩＬ－４：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：７５２－ＣＬ／ＣＦ
５．組換えイヌＩＬ－１３：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：５８９４－ＣＬ／ＣＦ
６．Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ
ａ．イヌ化抗イヌＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体
ｂ．ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３
ｃ．米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号からの４Ｈ３イヌ化抗体
以下のように、ＤＨ８２細胞においてＳＴＡＴ－６リン酸化を阻害する能力について、イヌＩＬ－４受容体αに対する抗体を試験した：
方法
１．２つの組織培養プレートに、ウェルあたり８×１０４個のＤＨ８２細胞（４×１０５細胞／ｍＬの密度で２００μＬ）を播種し、３７°Ｃで一晩インキュベートした。
２．試験抗体を５００μｇ／ｍＬに予備希釈し、次いでＤＨ８２ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａで３倍段階希釈した。細胞培養プレートから培地を除去し、５０μＬ／ウェルの段階希釈された試験試料を各プレートに移した。
３．ＤＨ８２ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＭｅｄｉａでイヌＩＬ－４を５ｎｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬを１つのプレートの各ウェルに添加した。ＤＨ８２ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＭｅｄｉａでイヌＩＬ－１３を１０ｎｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬを第２のプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。
４．プレートから培地を除去し、１００μＬ／ウェルの、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ－ＳＴＡＴ－６ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔからの新たに調製された１×溶解緩衝液をプレートに添加した。プレートを３５０ｒｐｍのプレート振盪機上で室温にて１０分間撹拌した。
５．ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ－ＳＴＡＴ６ Ａｓｓａｙ ＫｉｔからＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｍｉｘを調製し、９６ウェルの１／２ Ａｒｅａ Ｐｌａｔｅｓ中の３０μＬの細胞溶解物に、１５μＬ／ウェルを添加した。プレートを密封し、３５０ｒｐｍで２分間撹拌し、次いで、室温で２時間インキュベートした。
６．弱められた実験室の照明下で、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ｐ－ＳＴＡＴ６ ＡｓｓａｙキットからＤｏｎｏｒ Ｍｉｘを調製し、１５μＬ／ウェルを各プレートに添加した。プレートを密封し、箔で覆い、３５０ｒｐｍで２分間撹拌し、次いで、室温で２時間インキュベートした。
７．Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｏｎ上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ設定を使用して、プレートを読み取った。
イヌＩＬ－４ＲαへのイヌＩＬ－４またはイヌＩＬ－１３のいずれかの結合を遮断することによってαＳＴＡＴ－６リン酸化を阻害する能力について、ｃ４Ｈ３［国際公開第２０１６／１５６５８８号；米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号］およびｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３と呼ばれる２つの異なるイヌ化モノクローナル抗イヌＩＬ－４Ｒα抗体を評価した。図１に示されるデータは、両抗体がＩＬ－４の存在下でＳＴＡＴ－６リン酸化の用量依存的阻害をもたらすが、驚くべきことに、ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３は先行技術の抗イヌＩＬ－４受容体α抗体ｃ４Ｈ３より強固に結合したことを実証している［国際公開第２０１６／１５６５８８号］。ＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）抗体の非存在下におけるＩＬ－４対照をグラフの右上の部分に示す。図２に示されるデータは、両抗体がＩＬ－１３の存在下でＳＴＡＴ－６リン酸化の用量依存的阻害をもたらし、ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３が同様に先行技術の抗イヌＩＬ－４受容体α抗体ｃ４Ｈ３より強固に結合することも実証する。ＩＬ－４Ｒα（ＩＬ－４Ｒα）抗体の非存在下におけるＩＬ－１３対照をグラフの右上の部分に示す。図３は、κ軽鎖をλ軽鎖で置き換えることが、ｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３のＩＬ－４Ｒαへの結合に対して影響を及ぼさなかったことを示す。
［実施例３］
エピトープマッピング
抗体のその同族タンパク質抗原との相互作用は、抗体の特異的アミノ酸（パラトープ）の標的抗原の特異的アミノ酸（エピトープ）との結合を介して媒介される。エピトープは、免疫グロブリンによる特異的反応を引き起こす抗原決定基である。エピトープは、抗原の表面上のアミノ酸の群からなる。関心対象のタンパク質は、異なる抗体によって認識されるいくつかのエピトープを含有し得る。抗体によって認識されるエピトープは、線状エピトープまたは構造的エピトープとして分類される。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続する配列の連なりによって形成されるが、構造的エピトープは、一次アミノ酸配列中では不連続（例えば、遠く離れている）であるが、三次元のタンパク質折り畳み時に集結するアミノ酸から構成される。
エピトープマッピングは、抗体の標的抗原上で抗体によって認識されるアミノ酸配列（すなわち、エピトープ）を同定する過程を指す。標的抗原上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって認識されるエピトープの同定は、重要な用途を有する。例えば、標的抗原上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって認識されるエピトープの同定は、新しい治療薬、診断薬およびワクチンの開発を助けることができる。エピトープマッピングはまた、最適化された治療用ｍＡｂの選択を補助し、最適化された治療用ｍＡｂの作用機序の解明を補助することができる。ＩＬ－４受容体α上のエピトープ情報はまた、固有のエピトープを解明し、ワクチンの保護効果または発症効果を規定することができる。エピトープ同定は、同定されたペプチドエピトープの担体タンパク質または他の免疫刺激剤への化学的または遺伝的カップリングに基づいたサブユニットワクチンの開発をもたらすこともできる。
エピトープマッピングは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して行うことができ、エピトープの疑われる性質（すなわち、線状対構造的）に応じていくつかの方法がエピトープ同定のために使用されている。線状エピトープのマッピングは、より直接的であり、比較的容易に実行することができる。この目的のために、線状エピトープマッピングのための商業的サービスは、多くの場合、ペプチドスキャニングを使用する。この場合には、標的タンパク質の短いペプチド配列の重複するセットが化学的に合成され、関心対象の抗体に結合するそれらの能力について試験される。この戦略は、迅速、高処理であり、実行するのに比較的安価である。他方、不連続なエピトープのマッピングは、技術的により困難であり、その標的タンパク質と一緒になったモノクローナル抗体のＸ線共結晶学、水素－重水素（Ｈ／Ｄ）交換、酵素消化と組み合わされた質量分析、ならびに当業者に公知のいくつかの他の方法などのより特殊な技術を必要とする。
質量分析を使用したイヌＩＬ－４受容体αエピトープのマッピング：
抗イヌＩＬ－４受容体αｍＡｂによって認識されるエピトープを同定するために使用された化学的架橋、質量分析検出および共有結合標識法に基づく方法［９９９ Ｂｒｏａｄｗａｙ、Ｓｕｉｔｅ ３０５、Ｓａｕｇｕｓ、ＭＡ ０１９０６－４５１０ＵＳＡに所在するＣｏｖａｌＸ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）］。
以前の研究におけるイヌＩＬ－４受容体α鎖のエピトープマッピングへのこの技術の適用は、ｍＡｂがイヌＩＬ－４受容体αの細胞外ドメイン内に存在する特異的ペプチドエピトープを認識することを示した［米国特許出願公開第２０１８／０３４６５８０号］。図４に示される、イヌＩＬ－４Ｒαに対するｃ１５２Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３抗体に対して行われた同様の分析によって、以前に同定されたエピトープと合理的な類似性を有するエピトープ（類）に対して、配列番号４６および配列番号４７のアミノ酸配列が特定された。さらに、図４に示されるように、アミノ酸残基Ｓ１１１、Ｈ１１２、Ｔ１１３、Ｔ１１９、Ｙ１２２、Ｔ１２４、Ｈ１２７ Ｙ１５０、Ｔ１５３、Ｙ１５４、Ｔ１５８、Ｒ１６０、Ｓ１６４、Ｔ１６５、Ｓ１６８、Ｓ１７１、Ｙ１７２およびＳ１７３が、特定の接触点として特定された［例えば、アミノ酸残基のナンバリングについては配列番号５を参照］。

Claims (14)

  1. 重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、イヌインターロイキン－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）に結合する単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片であって、
    ＶＨは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ重１（ＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ重２（ＨＣＤＲ２）およびＣＤＲ重３（ＨＣＤＲ３）を含み、そしてここで、
    ＶＬは、３つのＣＤＲ：ＣＤＲ軽１（ＬＣＤＲ１）、ＣＤＲ軽２（ＬＣＤＲ２）およびＣＤＲ軽３（ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、
    （ｉ）前記ＨＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）前記ＨＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）前記ＨＣＤＲ３は、配列番号２８および配列番号４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    （ｉｖ）前記ＬＣＤＲ１は、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、
    （ｖ）前記ＬＣＤＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、そして
    （ｖｉ）前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
    単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合断片がイヌＩＬ－４Ｒαに結合し、イヌＩＬ－４Ｒαのイヌインターロイキン－４への結合を遮断する、請求項１に記載の単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片。
  3. イヌ化抗体またはそのイヌ化抗原結合断片である、請求項１または２に記載の単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片。
  4. 配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む、請求項３に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
  5. 改変されたイヌＩｇＧ－Ｂ（ＩｇＧ－Ｂｍ）を含む重鎖を含む請求項３に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片であって、ここで、ＩｇＧ－Ｂ（ＩｇＧ－Ｂｍ）が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
  6. 配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項５に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
  7. 配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項６に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
  8. 配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項６に記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
  9. （ａ）請求項３、４、５、６、７および８のいずれかに記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片のＶＨをコードする第１の核酸；および
    （ｂ）請求項３、４、５、６、７および８のいずれかに記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片のＶＬをコードする第２の核酸、
    を含む核酸組成物。
  10. 請求項９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物であって、
    ここで、第１の核酸は、第１の発現ベクター中に含まれ、そして、第２の核酸は、第２の発現ベクター中に含まれる、発現ベクター組成物。
  11. 請求項９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物であって、ここで、前記第１の核酸と第２の核酸が同一の発現ベクター中に含まれる、発現ベクター組成物。
  12. 請求項１０または１１に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
  13. 請求項３、４、５、６、７および８のいずれかに記載のイヌ化抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容され得る担体または希釈剤とを含む薬学的組成物。
  14. イヌ対象においてアトピー性皮膚炎に関連する炎症の遮断を補助する方法であって、それを必要とするイヌ対象に治療有効量の請求項１３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
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