JP7728873B2 - Ｇｉｔｒアンタゴニスト及びその使用方法 - Google Patents

Ｇｉｔｒアンタゴニスト及びその使用方法

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Description

本開示は、概して生物学及び医学に関し、より具体的には、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）としても知られるグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）のアンタゴニスト、特にＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）結合を欠き、ＧＩＴＲアゴニズムを刺激し得ないく一価アンタゴニスト形式に関する。本開示は更に、それを含む組成物、及び自己免疫疾患又は障害の治療におけるそれらの使用に関する。
ＧＩＴＲは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び活性化Ｔ細胞を含む様々な免疫細胞で発現されることが知られている。例えば、Ｔｉａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：１－７を参照されたい。ＧＩＴＲはシングルパスＩ型膜貫通タンパク質であり、その細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はＴＮＦＲスーパーファミリーに典型的な３つのシステインに富むドメインで構成される。
ＧＩＴＲは、その三量体リガンドＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）との相互作用により多量体化され活性化され、その結果、ＴＲＡＦ２／ＴＲＡＦ５を介したＮＦｋＢ活性化が誘導される。例えば、Ｐｅｄｒｏｓ，Ｃ．，Ａｌｔｍａｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｏｎｇ，Ｋ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２４１２、及びＳｎｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１０） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５（１２）：７２２３－７２３４を参照されたい。ＧＩＴＲＬ誘導性のＧＩＴＲシグナル伝達の結果には、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出の共刺激、並びにＴｒｅｇ抑制効果の無効化が含まれる。また、ＧＩＴＲは抗体結合を通じてアゴナイズされ、このＧＩＴＲ活性化はアゴニスト抗体又はＧＩＴＲＬ－ＦｃのＦｃγＲへの結合によって更に増強される可能性があることも示されており、この増強は、結合力の増加又は受容体の多量体化によって媒介されると考えられている。したがって、ＧＩＴＲアンタゴニストが表面に結合すると、おそらく細胞表面上のＦｃγＲとの結合を通じて、ＧＩＴＲの多量体化及びその後の活性化をもたらすアゴニスト活性を示す可能性がある。したがって、ＧＩＴＲＬのその受容体への結合を効率的にブロックし、実質的にＦｃγＲに結合する能力を持たずに受容体の活性化を防止する一価抗ＧＩＴＲ抗体フラグメントが望まれている。ＦｃγＲ結合の可能性がないことを確認する最も簡単な方法は、Ｆｃドメインが完全に欠如した抗体フラグメントを生成することである。しかしながら、ＦａｂなどのＦｃドメインが完全に欠如した抗体フラグメントは半減期（ｔ１／２）が短いことが知られており、治療薬として使用する際には課題が生じる。
薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルを改善し得る、生物療法のｔ１／２を延長するためのいくつかの戦略が存在する。そのような戦略では、通常、バルキング部分又は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介したリサイクリングが使用される。このようにして、抗体（Ａｂ）又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃなど）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などのポリマー、脂肪酸及びその他の脂質、Ｎ－又はＯ－グリコシル化、並びに血清アルブミン又は他の血漿タンパク質（トランスフェリンなど）は、所与の生物療法に共有結合及び／又は非共有結合して、その半減期を延長することができる。
ＷＯ２０１７／０９６１８９（Ａｇｅｎｕｓ）として特許協力条約（ＰＣＴ）に基づいて公開された国際特許出願は、とりわけ、抗ヒトＧＩＴＲアンタゴニスト抗体（二重特異性抗体、例えば、ヒトＧＩＴＲに結合する第１の抗原結合ドメイン、及びヒト免疫細胞により発現される抗原に特異的に結合しない第２の抗原結合ドメインを含む抗体を含むがこれに限定されない）、並びにそれらを使用する方法を開示している。いくつかの実施形態において、及びある特定のインビトロアッセイにおいて、ＷＯ２０１７／０９６１８９に開示されているある特定の抗ヒトＧＩＴＲ抗体はアンタゴニストとして作用する。しかしながら、出願人であるＡｇｅｎｕｓによって発表されたその後の報告では、ラギフィリマブとしても知られるＩＮＣＡＧＮ１８７６がＧＩＴＲのアゴニスト抗体であると記載されている。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａｎａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７、Ａｐｒｉｌ １－５，２０１７；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６４３を参照されたい。
したがって、１）最適な拮抗活性を得るために望ましい会合及び解離速度でヒトＧＩＴＲに結合し、２）ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの結合をブロックしてＧＩＴＲ活性化を防止し、３）ヒトＧＩＴＲの検出可能な刺激を欠き、４）十分な薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルを有し、自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎（ＡｔＤ）、関節炎症、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）及び／若しくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの他の炎症性障害の治療及び／又は予防のための単独療法としての実証可能なインビボ有効性を有する、５）サイトカイン放出の有意な誘導を引き起こさない、６）低い免疫原性（すなわち、カニクイザル及び／又はヒトにおいて十分な非免疫原性）を有する、並びに７）熱安定性、溶解性、低い自己会合性、及び薬物動態特性を含むがこれらに限定されない、インビトロ及びインビボでの物理的及び化学的安定性（これらは、自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、ＡｔＤ、関節炎症、関節炎、ＲＡ、又はＩＢＤ、ＣＤ及び／若しくはＵＣなどの他の炎症性障害の治療における開発及び／又は使用に許容される）を示す、抗ヒトＧＩＴＲ抗体の必要性が依然として存在する。
したがって、本発明は、１）最適な拮抗活性を得るために望ましい会合及び解離速度でヒトＧＩＴＲに結合し、２）ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの結合をブロックしてＧＩＴＲ活性化を防止し、３）ヒトＧＩＴＲの検出可能な刺激を欠き、４）十分な薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルを有し、自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎症、関節炎、関節リウマチ、又はＩＢＤ、ＣＤ及び／若しくはＵＣなどの他の炎症性障害の治療及び／又は予防のための単独療法としての実証可能なインビボ有効性を有する、５）サイトカイン放出の有意な誘導を引き起こさない、６）低い免疫原性（すなわち、カニクイザル及び／又はヒトにおいて十分な非免疫原性）を有する、並びに７）熱安定性、溶解性、低い自己会合性、及び薬物動態特性を含むがこれらに限定されない、インビトロ及びインビボでの物理的及び化学的安定性（これらは、自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、ＡｔＤ、関節炎症、関節炎、ＲＡ、又はＩＢＤ、ＣＤ及び／若しくはＵＣなどの他の炎症性障害の治療における開発及び／又は使用に許容される）を示す、新規ヒトＧＩＴＲアンタゴニスト化合物を提供する。
本開示は、１）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２又は７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、２）配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含む、抗ヒトＧＩＴＲ抗原結合フラグメントを含む化合物を提供する。
いくつかの例では、本明細書の化合物は、式（アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）まで）：Ｘ－Ｌ－Ｍ（式中、ＬのＮ末端は、ＸのＨＣのＣ末端に融合されており、ＬのＣ末端はＭのＮ末端に融合されている）、又はＸ－Ｌ－Ｍ（式中、ＬのＮ末端はＸのＬＣのＣ末端に融合されており、ＬのＣ末端はＭのＮ末端に融合されている）、又はＭ－Ｌ－Ｘ（式中、ＬのＮ末端はＭのＣ末端に融合されており、ＬのＣ末端はＸのＨＣのＮ末端に融合されている）、又はＭ－Ｌ－Ｘ（ＬのＮ末端はＭのＣ末端に融合されており、ＬのＣ末端はＸのＬＣのＮ末端に融合されている）のものであり、式中、Ｍはｔ１／２延長部分として作用する化合物であり、Ｌ（存在する場合）はリンカーであり、ＸはヒトＧＩＴＲに結合する抗体Ｆａｂフラグメントである。いくつかの例では、Ｍはアルブミン結合ＶＨＨであり、Ｌは（ＧＧＧＧＱ）ｎを含むアミノ酸配列を有し得、ｎは１～１５、特に約４～約８であり得る。他の例では、Ｍは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、Ｌは配列番号１１又は１２から選択されるアミノ酸配列を有し得る。更に他の例では、Ｌは、Ｌが配列番号１１又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％～約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するように、１つ以上の付加、欠失、挿入、又は置換を有し得る。
本開示はまた、本明細書の少なくとも１つの化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物についても記載する。
更に、本開示は、化合物及び医薬組成物を医薬に使用する方法を記載する。
更に、本開示は、医薬の製造における本明細書の化合物の使用を記載する。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、類似体、医薬組成物、及び方法の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載されている。
また、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が１つ及び１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
定義
本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値（単数又は複数）の統計学的に意味のある範囲内を意味する。このような値又は範囲は、所与の値又は範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、更により典型的には５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書で使用する場合、受容体の１つ以上に関して、「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）」などは、以下に記載されるインビトロアッセイなどの当該技術分野で既知のアッセイを使用して測定される、受容体に結合して受容体での応答を誘導する本明細書における融合などの化合物の能力を意味する。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」は、化学的観点から、１つ以上のアミン基及び１つ以上のカルボン酸基の存在を特徴とし、他の官能基を含んでもよい分子を意味する。当該技術分野で既知であるように、標準アミノ酸として指定され、あらゆる生物によって産生されるペプチド／タンパク質の大部分の構成要素として使用され得る２０個のアミノ酸のセットが存在する。本開示のアミノ酸配列は、２０個の天然に存在するアミノ酸の標準的な１文字又は３文字のコードを含む。
本明細書で使用される場合、「類似体」は、標的受容体を活性化し、その受容体の天然アゴニストによって誘発される少なくとも１つのインビボ又はインビトロ効果を誘導する、合成のペプチド又はポリペプチドなどの化合物を意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のものであってもよい。例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成された免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、更にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に分割され得る。
ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、又はＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能な国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照のこと）に記載されているものを含む、周知のスキームに従って行われ得る。Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義は、本明細書に記載の抗ヒトＧＩＴＲ抗体に使用される。
「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の部分を指す。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ又はＦａｂ’が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）を伴う、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体軽鎖全体からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価である。すなわち、それは、単一の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上の残基を含むＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少しの追加の残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントと異なる。本明細書に記載のＦａｂ又はＦａｂ’は、ヒトＦａｂ若しくはＦａｂ’、又はヒトＣＬ及びＣＨ１を含むキメラＦａｂ若しくはＦａｂ’であり得る。
本明細書で使用される「結合する」という用語は、別段の定めがない限り、ある種の化学結合又は別のタンパク質若しくは分子との引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味し、当該分野において既知である一般的な方法によって決定されるように、２つのタンパク質又は分子の密接な近接をもたらす。
本明細書で使用する場合、「生物療法薬」などは、少なくとも１つの治療活性／適用性を有する、抗体、凝固因子、凝血因子、サイトカイン、酵素、成長因子、ホルモン、及びそれらのフラグメントなどのアミノ酸又は核酸ベースの化合物、並びに治療用のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子を意味する。
本明細書で使用する場合、「保存的置換」は、参照分子と、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを除いて同一である、参照ペプチド又はポリペプチドの変異体を意味する。一般に、保存的に修飾された変異体は、参照アミノ酸配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。より具体的には、保存的置換は、特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格構造、及び剛性など）が類似しており、得られる置換されたペプチド又はポリペプチドの生物学的活性への影響が最小限であるアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。機能的に類似したアミノ酸の保存的置換は当該技術分野で周知であるため、本明細書で徹底的に説明する必要はない。
本明細書で使用する場合、「有効量」は、それを必要とする個体に単回又は複数回投与すると、診断又は治療中のそのような個体において所望の効果をもたらす（すなわち、個人の状態に臨床的に測定可能な差異を生じさせ得る、例えば、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）２０、ＡＣＲ５０、ＡＣＲ７０；疾患活動性スコア（ＤＡＳ）；乾癬面積及び重症度指数（ＰＡＳＩ）５０、ＰＡＳＩ７５、ＰＡＳＩ９０、ＰＡＳＩ１００；全身性エリテマトーデス疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）；Ｍａｙｏスコア疾患活動性指数（ＤＡＩ）；クローン病活動性指数（ＣＤＡＩ）；Ｇｅｂｏｅｓスコア（ＧＳ）；ロバーツ組織病理学指数（ＲＨＩ）；アトピー性皮膚炎重症度指数（ＡＤＳＩ）；並びにＥＵＬＡＲシェーグレン症候群疾患活動性指数（ＥＳＳＤＡＩ）などの１つ以上の臨床疾患活動性尺度の低下をもたらし得る）、本明細書に記載の化合物の１つ又は複数、又はその薬学的に許容される塩の量又は用量を意味する。有効量は、既知の技法の使用によって、及び同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者であれば容易に決定することができる。個体についての有効量を決定する際には、哺乳動物の種、その大きさ、年齢、及び全体的な健康状態、関与する特定の疾患又は障害、疾患又は障害の程度又は関与度又は重症度、個体の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される調製物の生物学的利用能の特徴、選択される用法、併用薬の使用、並びに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の因子が考慮される。
本明細書で使用する場合、「長期間の作用」は、本明細書の少なくとも１つの化合物及び生物療法を含む結合親和性及び活性が、天然生物療法よりも長い期間継続し、このため、少なくとも、１日１回又は更には週３回、週２回、若しくは週１回程度の頻度で投薬することが可能になることを意味する。時間作用プロファイルは、以下の実施例で利用されるものなどの既知の薬物動態試験方法を使用して測定され得る。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体の領域を指す。任意選択で、Ｆｃ領域は、抗体重鎖のヒンジ領域の一部分又はヒンジ領域全体を含み得る。
本明細書で使用する場合、「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質」又は「ＧＩＴＲ」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）としても知られ、哺乳動物種、特にヒトなどの任意の種から得られるか、又はそれに由来するＧＩＴＲタンパク質を意味する。ＧＩＴＲには、天然ＧＩＴＲ（すなわち、全長）とその変形（すなわち、天然ＧＩＴＲの付加、欠失、挿入、及び／又は置換）との両方が含まれる。ヒトＧＩＴＲ全長（ただしシグナルペプチドを含まない）の１つの配列を配列番号２０に示す（ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５も参照されたい）。ヒトＧＩＴＲ ＥＣＤ（ただしシグナルペプチドは含まない）の１つの配列を配列番号２１に示す。
本明細書で使用する場合、「半減期」又は「ｔ１／２」は、本明細書に記載の融合タンパク質などの化合物の量の半分が、生物学的プロセスにより、個体の血清又は血漿などの流体又は他の生理学的空間から除去されるのにかかる時間を意味する。代替的に、ｔ１／２は、そのような融合タンパク質の量が、その薬理学的、生理学的、又は放射線学的活性の半分を失うのにかかる時間を意味することもある。
本明細書で使用する場合、「最大の半分の効果濃度」又は「ＥＣ５０」は、用量反応曲線などのアッセイエンドポイントの５０％の活性化／刺激をもたらす化合物の濃度を意味する。
本明細書で使用する場合、「と組み合わせて」は、本明細書の融合タンパク質のうちの少なくとも１つを、１つ以上の追加の治療薬と同時に、順次に、又は１つ以上の追加の治療薬と組み合わせた単一の調合で投与することを意味する。
本明細書で使用する場合、「それを必要とする個体」は、例えば、本明細書に列挙されるものを含む、治療又は療法を必要とする状態、疾患、障害、又は症状を有する、ヒトなどの哺乳動物を意味する。具体的には、治療される好ましい個体はヒトである。
本明細書で使用する場合、「長時間作用型」は、本明細書の化合物の結合親和性及び活性が、天然のペプチド又はタンパク質よりも長い期間継続し、このため、少なくとも、１日１回又は更には週３回、週２回、週１回、若しくは月１回程度の頻度で投薬することが可能になることを意味する。本明細書の化合物の時間作用プロファイルは、以下の実施例に記載のものなどの既知の薬物動態試験方法を使用して測定され得る。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチドの類似体を組み込んだＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡ分子等の一本鎖及び／又は二本鎖ヌクレオチド含有分子を含むヌクレオチドのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によってその中に組み込まれた基質も含み得る。
本明細書で使用する場合、「非標準アミノ酸」は、細胞内で自然に発生し得るが、ペプチド合成には関与しないアミノ酸を意味する。非標準アミノ酸はペプチドの構成要素である可能性があり、多くの場合、ペプチド内の標準アミノ酸の修飾によって（すなわち、翻訳後修飾を介して）生成される。非標準アミノ酸には、上記の標準アミノ酸とは反対の絶対キラリティーを有するＤ－アミノ酸が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「オリゴマー」は、より小さい分子、そのモノマーのコピーに由来し得る、いくつかの類似又は同一の繰り返し単位を有する分子を意味する。これらのモノマーは、強い結合又は弱い結合、共有結合又は非共有結合（例えば分子内）のいずれかの結合によって接続され得る。
本明細書で使用する場合、「患者」、「対象」、及び「個体」は、本明細書では互換的に使用され、動物、特にヒトを意味する。ある特定の例では、個体は、本明細書の化合物又は組成物を投与することから利益を得る状態、疾患、障害又は症状を更に特徴とする。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される緩衝液」は、当業者に知られている標準的な医薬緩衝液のいずれかを意味する。
本明細書で使用する場合、「配列類似性」は、例えば、２つ以上の配列の全長又は比較ウィンドウにわたる一致など、生物学的化合物の２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列の定量的特性を意味する。配列類似性は、（１）同一性パーセント又は（２）類似性パーセントにより測定され得る。同一性パーセントは、２つの生物学的化合物間で同一の残基のパーセンテージを最短配列の長さで割ったものを測定し、一方、類似性パーセントは、同一性を測定し、加えて、評価に配列ギャップ及び残基類似性を含む。配列類似性を決定するための方法及びアルゴリズムは当該技術分野で周知であるため、本明細書で徹底的に説明する必要はない。同一のヌクレオチド又はアミノ酸位置の特定のパーセンテージは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である。
本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔ）」とは、本明細書の化合物の投与が状態、疾患、障害、又は症状の進行又は重症度を減弱する、抑制する、逆転させる、遅延させる、又は停止する目的のために示される、状態、疾患、障害、又は症状を有する個体を管理及びケアすることを意味する。治療することには、本明細書の化合物又は本明細書の化合物を含む組成物を個体に投与して、症状若しくは合併症の発症を予防する、症状若しくは合併症を緩和する、又は状態、疾患、障害、若しくは症状を排除することが含まれる。治療することには、本明細書の化合物又は本明細書の化合物を含む組成物を個体に投与して、例えば、自己免疫の減少（若しくは予防）及び／又はアレルギー性疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、関節炎症、関節炎、関節リウマチ、又はＩＢＤ、ＣＤ及び／若しくはＵＣなどの他の炎症性障害の低減（若しくは予防）などをもたらすことが含まれる。治療される個体は、哺乳動物、特にヒトである。
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、被験者の生物学的又は医学的応答、例えば、酵素若しくはタンパク質の活性の低下又は阻害を誘発するか、あるいは症状を改善するか、状態を緩和するか、疾患の進行を減速若しくは遅延するか、又は疾患などを予防する、タンパク質あるいは核酸あるいはベクターあるいは組成物の量を指す。１つの非限定的な実施形態では、「治療有効量」という用語は、被験者に投与されたときに、状態、又は障害又は疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、予防及び／又は改善するために有効である、タンパク質又は核酸又はベクター又は組成物の量を指す。
本明細書で使用する場合、「可変重鎖ホモ二量体」、「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨ部分」は、単一ドメイン抗体の形態、特に、サイズが約１５ｋＤａと非常に小さい、重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）の単一の単量体可変領域の抗体フラグメントを意味する。ここで、操作／修飾ＶＨＨベース化合物を薬物動態エンハンサーとして使用して、生物療法の作用期間を延長し、かつ／又はそのｔ１／２を改善することができることが見出された。ＶＨＨベース化合物は血清アルブミンに結合するが、ＶＨＨベース化合物は、ＩｇＧ（Ｆｃドメインを含む）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、又は他の長期持続性血清タンパク質に結合するために使用することができる。したがって、ＶＨＨベース化合物は、ペプチド若しくはタンパク質などの化合物、又は更に例えば小分子などの他の分子のｔ１／２を改善するために使用することができる。
ある特定の略語が次のように定義される。「ＡＣＲ」は、尿アルブミン／尿クレアチニン比を指し、「ＡＵＣ」は、曲線下面積を指し、「ＡＵＣ０－ｉｎｆ」は、０時間から無限時間までの曲線下の面積を指し、「ｃＡＭＰ」は、環状アデノシン一リン酸を指し、「Ｃ０」は、時間ゼロにおける推定血漿濃度を指し、「ＣＬ」は、ＩＶ投与後のクリアランスを指し、「ＣＬ／Ｆ」は、ＳＱ投与後の見かけのクリアランスを指し、「Ｃｍａｘ」は、観察された最大血漿濃度を指し、「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスを指し、「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を指し、「ＥＣＤ」は、細胞外ドメインを指し、「ＥＤＣ」は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を指し、「ＥＴＡ」は、エタノールアミンを指し、「ＧＳ」は、グルタミン合成酵素を指し、「ＨＣ」は、重鎖を指し、「ＨＩＣ」は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを指し、「ｈｒ」は、１時間又は複数時間を指し、「ＩＶ」は、静脈内を指し、「ｋＤａ」は、キロダルトンを指し、「ＬＣ」は、軽鎖を指し、「ＬＣ－ＭＳ」は、液体クロマトグラフィー質量分析法を指し、「ｍｉｎ」は、分を指し、「ＭＳ」は、質量分析を指し、「ＭＳＸ」は、メチオニンスルホキシイミンを指し、「ＮＨＳ」は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを指し、「ＯｔＢｕ」は、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルを指し、「ＰＥＩ」は、ポリエチレンイミンを指し、「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は、逆相高速液体クロマトグラフィーを指し、「ｓｅｃ」は、秒を指し、「ＮａＯＡｃ」は、酢酸ナトリウムを指し、「ｒｃｆ」は、相対遠心力を意味し、「ＲＴ」は、室温を意味し、「ＲＵ」は、共鳴単位を意味し、「ＳＱ」は、皮下を指し、「ＳＥＣ」は、サイズ排除クロマトグラフィーを指し、「ＳＥＭ」は、平均標準誤差を指し、「ＳＰＲ」は、表面プラズモン共鳴を意味し、「ｔ１／２」は、半減期を指し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指し、「Ｔｍａｘ」は、観察された最大濃度の時間を指し、「Ｔｒｔ」は、トリチルを指す。
抗ヒトＧＩＴＲ抗原結合フラグメント化合物
本開示は、１）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２又は７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、２）配列番号４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含む、抗ヒトＧＩＴＲ抗原結合フラグメント化合物を提供する。いくつかの例では、抗ヒトＧＩＴＲ抗原結合フラグメント化合物は、ヒトカッパＣＬ及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ１を含むＦａｂを含む。
ＶＨＨベース半減期延長剤を有する化合物
簡潔に説明すると、本明細書のある特定の化合物は、式（Ｎ末端からＣ末端まで）：Ｘ－Ｌ－Ｍを有し、式中、Ｍはｔ１／２延長部分として作用する化合物であり、Ｌ（存在する場合）はリンカーであり、ＸはヒトＧＩＴＲに結合する抗体Ｆａｂフラグメントである。いくつかの例では、Ｌは、（ＧＧＧＧＱ）ｎ、（ＧＧＧＱ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＰＧＰＱ）ｎ、（ＰＧＰＡ）ｎ、ＧＧＧＧ（ＡＰ）ｎＧＧＧＧ、（ＧＧＥ）ｎ、（ＧＧＧＧＥ）ｎ、（ＧＧＫ）ｎ、（ＧＧＧＧＫ）ｎ、ＧＧＧＧ（ＥＰ）ｎＧＧＧＧ、ＧＧＧＧ（ＫＰ）ｎＧＧＧＧ、（ＰＧＰＥ）ｎ又は（ＰＧＰＫ）ｎを含むアミノ酸配列を有し得、ｎは１～１５、特に約５～約１０であり得る。いくつかの例では、Ｍはアルブミン結合ＶＨＨであり、Ｌは（ＧＧＧＧＱ）ｎのアミノ酸配列を含むペプチドであり、ｎは１～１５、特に約４～約８であり得る。他の例では、Ｍは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、Ｌは配列番号１１又は１２から選択されるアミノ酸配列を有し得る。更に他の例では、Ｌは、Ｌが配列番号１１又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％～約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するように、１つ以上の付加、欠失、挿入、又は置換を有し得る。更に他の例では、Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特に（ＰＥＧ）ｎなどのポリマーであり得、ｎは１～２０であり得る。
いくつかの例では、本明細書に開示される化合物は、式（Ｎ末端からＣ末端まで）：Ｘ－Ｌ－Ｍを有し、式中、Ｍは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれと少なくとも約９０％～約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ（存在する場合）はリンカーであり、ＸはヒトＧＩＴＲに結合するＦａｂである。いくつかの例では、Ｌは（ＧＧＧＧＱ）ｎを含むアミノ酸配列を有し得、ｎは１～１５、特に約４～約８であり得る。他の例では、Ｌは配列番号１１又は１２から選択されるアミノ酸配列を有し得る。更に他の例では、Ｌは、Ｌが配列番号１１又は１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％～約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するように、１つ以上の付加、欠失、挿入、又は置換を有し得る。更に他の例では、Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特に（ＰＥＧ）ｎなどのポリマーであり得、ｎは１～２０であり得る。好ましくは、化合物はヒトＧＩＴＲアンタゴニストである。
医薬組成物及びキット
いくつかの例では、抗ヒトＧＩＴＲ Ｆａｂ、抗ヒトＧＩＴＲ Ｆａｂ融合体、又はそのアルブミン結合ＶＨＨへのコンジュゲート（本明細書に開示される抗体Ｉ及び抗体ＩＩなど）などの、本明細書に開示される抗ヒトＧＩＴＲ抗原結合フラグメント化合物は、医薬組成物として製剤化することができ、非経口経路（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は経皮）によって投与することができる。そのような薬学的組成物及びそれを調製するための技法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，「Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ ｅｄ．，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい。特定の例では、組成物は、ＳＱ又はＩＶで投与される。しかしながら、代替的には、組成物は、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；及びクリーム、ローション、吸入剤などを含む現在使用されている任意のその他の形態などの他の薬学的に許容される経路のための形態で製剤化され得る。
上述のように、それらのインビボ適合性及び有効性を改善するため、本明細書のＶＨＨベース融合対又はＶＨＨベースコンジュゲートは、任意の数の無機及び有機酸／塩基と反応して、薬学的に許容される酸／塩基付加塩を形成し得る。薬学的に許容される塩及びそれらを調製するための一般的な技法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ」（２ｎｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１１））。本明細書における使用のための薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、及び／又は酢酸塩が挙げられる。
本明細書の化合物は、医師によって投与され得るか、又は注射を使用して自己投与され得る。ゲージサイズ及び注入量は、当業者によって容易に決定され得ることが理解される。ただし、注入量は約２ｍＬ以下、更には約１ｍＬ以下であり、ニードルゲージは約２７Ｇ以上又は約２９Ｇ以上であり得る。
本開示はまた、本明細書の化合物、又はその薬学的に許容される塩を合成するために有用な新規な中間体及び方法を提供し、したがってこれらを包含する。中間体及び化合物は、当該技術分野で周知の様々な手法によって調製することができる。例えば、組換え合成を使用する方法を以下の実施例で例解する。記載される技法の各々についての具体的なステップは、化合物を調製するための異なる方法において組み合わせることができる。試薬及び出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
本明細書の化合物は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。化合物又はそれを含む医薬組成物の例示的な用量は、個体の１キログラム（ｋｇ）当たりのミリグラム（ｍｇ）又はマイクログラム（μｇ）量であり得る。このようにして、１日用量は約１μｇ～約１０００ｍｇとなり得る。
ここで、医薬組成物中の化合物の有効量は、約２．５ｍｇ～約１０００ｍｇの用量であり得る。しかしながら、いくつかの例では、有効量（すなわち用量／投薬量）が前述の範囲の下限を下回っても十分すぎる可能性があること、また一方で他の例では、有効量がより多くの用量となってもよく、許容できる副作用を伴って用いられてもよいことが当業者には理解される。
本明細書の化合物に加えて、医薬組成物はまた、例えば、特定の状態、疾患及び障害（例えば、心血管、神経学的、免疫学的、代謝的、腫瘍学的、心理学的、肺学的及び／又は腎臓の状態、疾患又は障害）の標準治療として典型的に使用される治療薬剤などの少なくとも１つの追加の治療薬剤を含んでもよい。
このように、医薬組成物は、有効量の１つ以上の本明細書の化合物、薬学的に許容される担体、及び任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬剤を含んでもよい。
代替的に、本明細書の化合物は、キットの一部として提供され得る。いくつかの例では、キットは、少なくとも１つの化合物（及び任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬剤）を個体に投与するためのデバイスを含む。ある特定の例では、キットは、少なくとも１つの化合物（及び任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬剤）を投与するための注射器及び針を含む。特定の例では、化合物（及び任意選択で少なくとも１つの追加の治療薬剤）は、注射器内の水溶液中に予め製剤化される。
半減期延長剤として作用するＶＨＨベース化合物又はその融合体及びコンジュゲートを作製及び使用する方法
本明細書の化合物は、当該技術分野で既知の任意の数の標準的な組換えＤＮＡ法又は標準的な化学ペプチド合成法を介して作製することができる。組換えＤＮＡ法に関しては、標準的な組換え技法を使用して、化合物のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを、細菌、酵母、及び哺乳動物細胞などの宿主細胞に導入して、化合物を産生させることができる。（例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，４ｔｈ ｅｄ．，２０１２）を参照されたい）。
組換えＤＮＡ法に関して、本明細書の化合物は、組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質又は前駆体タンパク質分子を産生させることにより調製することができる。ｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含むＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、本明細書の化合物をコードするその中のコード配列は、遺伝暗号の冗長性又は縮退の結果として変化してもよい。端的には、本明細書の化合物をコードするＤＮＡ配列を宿主細胞に導入して、本化合物又はその前駆体を生成する。宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＫ１２株又はＢ株などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
本発明の化合物又はその前駆体を産生するために、適切な宿主細胞を、発現ベクターなどの発現系で一過性又は安定にトランスフェクト又は形質転換する。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、又は宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、及びジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。
本発明の化合物を調製するために、本明細書に記載されるステップの各々のための特定の生合成ステップ又は合成ステップを使用してもよいし、使用しなくてもよいし、又は異なる方法で組み合わせてもよい。
化学ペプチド合成法に関しては、標準的な手動又は自動の固相合成手順を使用することができる。例えば、自動ペプチド合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）から市販されている。固相合成用の試薬は、商用供給業者から容易に入手可能である。干渉基のブロック、反応中のアミノ酸の保護、カップリング、脱保護、及び未反応のアミノ酸のキャッピングのために、固相合成装置を製造業者の指示に従って使用することができる。
本方法には、本明細書に記載のステップが含まれてもよく、これらは、必ずではないが記載の順序で実行されてもよい。しかしながら、他の順序も考えられる。更に、個々の又は複数のステップは、時間的に並行して及び／若しくは重複して、並びに／又は個別に、又は複数回繰り返されるステップで実行されてもよい。更に、本方法には、追加の不特定のステップが含まれてもよい。
したがって、そのような方法には、例えば自己免疫状態、疾患若しくは障害を有する個人、又はそれらに罹患しやすい個人を選択することが含まれ得る。
方法にはまた、同じく本明細書に記載されるような医薬組成物の形態であり得る、本明細書の少なくとも１つの化合物の有効量を個体に投与することが含まれ得る。いくつかの例では、化合物／医薬組成物は追加の治療薬剤を含み得る。
化合物及び任意選択の追加の治療薬剤の濃度／用量／投薬量は、本明細書の他の場所で論じられている。
投与経路に関して、化合物又はそれを含む医薬組成物は、例えば、経口、注射（すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、脳内、脳室内、筋肉内、眼内、門脈内若しくは病変内）、徐放システム、又は埋め込みデバイスなどによる既知の方法に従って投与され得る。ある特定の例では、化合物又はそれを含む医薬組成物は、ボーラス注射によって又は連続的にＳＱ投与され得る。
投薬頻度に関して、化合物又はそれを含む医薬組成物は、毎日、隔日、週３回、週２回、週１回（すなわち、毎週）、隔週（すなわち、１週間おきに）、又は毎月投与され得る。ある特定の例では、化合物又はそれを含む医薬組成物は、１日おきにＳＱ投与、週３回ＳＱ投与、週２回ＳＱ投与、週１回ＳＱ投与、１週間おきにＳＱ投与、又は毎月ＳＱ投与される。特定の例では、化合物又はそれを含む医薬組成物は、週１回ＳＱ投与（ＱＷ）される。
代替的に、ＩＶ投与される場合、化合物又はそれを含む医薬組成物は、１週間おきにＩＶ投与、週３回ＩＶ投与、週２回ＩＶ投与、週１回ＩＶ投与、１週間おきにＩＶ投与、又は毎月ＩＶ投与される。特定の例では、化合物又はそれを含む医薬組成物は、週１回ＩＶ投与（ＩＷ）される。
化合物又はそれを含む医薬組成物が有効量の少なくとも１つの追加の治療薬剤と組み合わせて投与される場合に関して、追加の治療薬剤は、化合物又はそれを含む医薬組成物と同時に、別々に、又は連続的に投与することができる。
更に、追加の治療薬剤は、化合物又はそれを含む医薬組成物と同じ頻度で（すなわち、１日おき、週２回、又は更には毎週）投与され得る。代替的に、追加の治療薬剤は、化合物又はそれを含む医薬組成物とは異なる頻度で投与され得る。他の場合には、追加の治療薬は、ＳＱで投与され得る。他の場合には、追加の治療薬は、ＩＶで投与され得る。更に他の場合には、追加の治療薬は、経口で投与され得る。
方法は、上記で論じたもの以外の追加の治療薬剤と組み合わせることができることが更に企図される。
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
ポリペプチド発現
実施例１：抗体Ｉの組換え発現
抗体Ｉは、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＹＩＤＥＴＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＧＩＧＧＧＶＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＧＲＰＬＩＴＳＫＶＡＤＬＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＰＰ（配列番号１４）の重鎖アミノ酸配列、及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＦＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＹＱＹＹＮＹＰＳＡＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１６）の軽鎖アミノ酸配列を有する抗ヒトＧＩＴＲ Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体である。
配列番号１４の重鎖及び配列番号１６の軽鎖を有する抗体を、ＣＨＯＫ１細胞誘導体（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用する哺乳動物細胞発現系で生成する。配列番号１４及び配列番号１６をコードするｃＤＮＡ配列を、ＧＳ含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド；Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）にサブクローニングする。ｃＤＮＡ配列を、シグナルペプチド配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２２）のコード配列とフレーム中に融合させて、組織培養培地への抗体の分泌を増強させる。発現をウイルス性ＣＭＶプロモーターにより駆動する。
一過性トランスフェクションを介して抗体を生成する場合、ＰＥＩベースの方法を使用して、ＣＨＯＫ１細胞を、等化学両論比の組換え発現プラスミドでトランスフェクトする。端的には、密度４×１０６細胞／ｍＬの適切な体積のＣＨＯＫ１の懸濁細胞を振盪フラスコに移し、ＰＥＩ及び組換えプラスミドＤＮＡの両方を細胞に加える。細胞を浮遊培養において３２℃で６日間インキュベートする。インキュベーション期間の終了時に、細胞を低速遠心分離によって除去し、抗体を馴化培地から精製する。
代替的に、また抗体を安定なトランスフェクションを介して生成するために、ＣＨＯＫ１細胞を、エレクトロポレーション及び適切な量の組換え発現プラスミドを使用して安定にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を適正な細胞密度で浮遊培養中に維持する。トランスフェクトされた細胞の選択を、２５μＭのＭＳＸ含有無血清培地中で増殖させることにより達成し、約３５℃～３７℃及び約５～７％ＣＯ２でインキュベートする。その後、細胞を低速遠心分離によって除去し、抗体を馴化培地から精製する。
抗体はＣＨＯ細胞から培地中に分泌され、これをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続く陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。具体的には、採取した培地からの抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）上に捕捉する。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）又はトリス含有緩衝液などの洗浄緩衝液で樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。タンパク質を、１０ｍＭクエン酸ｐＨ３などの低ｐＨ溶液で樹脂から溶出させる。抗体を含有する画分を低ｐＨでプールし、可能性のあるウイルスを不活化することができる。ｐＨ８．０の０．１Ｍトリスなどの塩基を加えることで、ｐＨを中性化してもよい。抗体を、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製してもよい。抗体は、２０カラム容量にわたる２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の０～１Ｍ ＮａＣｌ勾配を使用してカラムから溶出することができる。
精製した抗体は、リン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換するか、代替的にＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（旭化成メディカル株式会社）などのウイルス保持フィルタを通過させ、続いて再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での接線流限外濾過を使用してリン酸緩衝生理食塩水に濃縮／透析濾過することができる。
したがって、抗体は、この様式で、又は当業者によって容易に決定される類似の様式で、調製される。
実施例２：抗体ＩＩの組換え発現
抗体ＩＩは、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＹＩＤＥＴＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＧＩＧＧＧＶＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＧＲＰＬＩＴＳＫＶＡＤＬＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＰＰ（配列番号１５）の重鎖アミノ酸配列
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＦＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＹＱＹＹＮＹＰＳＡＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１６）の軽鎖アミノ酸配列を有する抗ヒトＧＩＴＲ Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体である。
配列番号１５及び配列番号１６をコードするｃＤＮＡ配列を発現プラスミド中で使用することを除いて、配列番号１５の重鎖及び配列番号１６の軽鎖を有する抗体を、実質的に実施例１について説明したように生成する。
実施例３：ＳＰＲによるアルブミンオルソログへの抗体の結合
ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウシ及びウサギ血清アルブミンに対する抗体（すなわち、抗ヒトＧＩＴＲ Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体）のインビトロ結合を、２５℃でＳＰＲによって測定する。具体的には、これらの種の血清アルブミンに対する抗体Ｉ及びＩＩの親和性を、それぞれ以下の表３及び表４に要約する。
様々な血清アルブミンへの抗体Ｉ及び抗体ＩＩの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器で行われる。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ ２９１４９６０３）表面への血清アルブミンの固定化を、製業者の指示（Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ ＢＲ－１０００－５０）に従って行う。簡単に説明すると、センサチップ表面（フローセル１及び２）のカルボキシル基は、７５ｍｇ／ｍｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及び１１．５ｍｇ／ｍｌのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合物７０μＬを１０μｌ／分で注入することによって活性化する。ヒト、カニクイザル、ラット、マウス、イヌ、ブタ、ウシ、及びウサギの血清アルブミンを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０（ＢＲ－１００３－４９）で０．８、０．８、０．８、２．５、０．８、１、１、及び１．５μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分で１００秒間、活性化チップ表面（フローセル２、チャネル１～８）上に注入した。ヒト血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号Ａ８７６３）から入手した。カニクイザル血清アルブミンは、Ａｔｈｅｎｓ Ｒ＆Ｔ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）（カタログ番号１６－１６－０１１２０２－ＣＭ）から入手した。ラット血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号Ａ４５３８）から入手した。マウス血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号Ａ３１３９）から入手した。イヌ血清アルブミンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｎｏｖｉ，ＭＩ）（カタログ番号ＤＳＡ－１２１３ ＮＣ０７３９１５３）から入手した。ブタ血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号Ａ４４１４）から入手した。ウシ血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（カタログ番号Ａ７０３０）から入手した。ウサギ血清アルブミンは、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）（カタログ番号３０Ｒ－３３０３）から入手した。
血清アルブミンは、遊離アミンを介してカルボキシメチルデキストランでコーティングされたセンサチップＣＭ５上に、ヒト、カニクイザル、ラット、マウス、イヌ、ブタ、ウシについては２９～５２共鳴単位（ＲＵ）、またウサギ血清アルブミンについては１１８共鳴単位（ＲＵ）の表面密度で共有結合により固定化されている。表面（フローセル１及び２）の過剰な反応基を、ｐＨ８．５の１Ｍエタノールアミン塩酸塩－ＮａＯＨを７０μｌ注入することにより不活性化する。
実施例１及び２の抗体を、（すなわち、それぞれ抗体Ｉ及びＩＩ）ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ポリソルベート２０）で、１０００、３３３．３、１１１．１、３７．０４、１２．３５、４．１２、１．３７、０．４５７、０．１５２、０．０５１、及び０．０１７ｎＭの濃度に希釈する。１５０μｌの試料を、チップの表面の固定化血清アルブミン全体に個々に順次注入し、２５℃、６０μｌ／分の流量で６００秒間解離させる。ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ＢＲ－１００３－５４）を６０μｌ／分で１００秒間注入して、表面を再生する。得られたセンサグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０．１１．１５４２３）の１：１結合反応速度モデルフィッティングを使用して分析し、結合速度パラメータの会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び平衡解離定数（ＫＤ）を計算する。ＫＤは、抗体Ｉとのヒト、カニクイザル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及びウシの血清アルブミン結合について、それぞれ０．２５、４．４、５３、４４、１００、２０、及び４６０ｎＭとして決定される（表３）。ＫＤは、抗体ＩＩとのヒト、カニクイザル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及びウシの血清アルブミン結合について、それぞれ０．４、５．９、４２、５１、９９、２０及び４３０ｎＭとして決定される（表４）。


実施例４：ＧＩＴＲ発現細胞への抗体の結合
ＪｕｒｋａｔヒトＧＩＴＲ／ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ２細胞（ＣＳ１８４００４）をＰｒｏｍｅｇａから購入し、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．３）＋４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ＋６００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８に維持した。
ＮＦｋＢレポーターｐＮｉＦｔｙ２－Ｌｕｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をエレクトロポレーションによってＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）に導入し、トランスフェクタントを４００μｇ／ｍＬゼオシンで２週間選択する。得られたＪｕｒｋａｔ ＮＦｋＢｌｕｃ細胞株にカニクイザルＧＩＴＲレンチウイルスを形質導入し、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンで１週間選択する。Ｊｕｒｋａｔ ｃｙｎｏ ＧＩＴＲ／ＮＦｋＢｌｕｃ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．３）＋４００μｇ／ｍＬゼオシン＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン中で維持する。
ＪｕｒｋａｔヒトＧＩＴＲ／ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ２及びＪｕｒｋａｔカニクイザルＧＩＴＲ／ＮＦｋＢｌｕｃ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％アジ化ナトリウム）に１００万細胞／ｍＬで再懸濁し、５μｌ Ｆｃブロック／ｍＬ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加し、４℃で２０分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１ｅ６細胞／ｍＬでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ポリプロピレン９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、１００，０００細胞／ウェルとする。ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した２Ｘ抗体用量滴定液１００μｌ／ウェルを細胞に添加し、４℃で４５分間インキュベートする。細胞を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１２．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇ軽鎖カッパ／ＰＥ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＰＡ１－７４４０８）に再懸濁し、４℃で４５分間インキュベートする。細胞を２００μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥａｓｙＣｙｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで読み取り、ＧｕａｖａＳｏｆｔ ３．３ ＩｎＣｙｔｅソフトウェアを使用して蛍光強度の中央値を計算する。ＥＣ５０値を３回の実験反復のそれぞれについて計算し、ＥＣ５０幾何平均＋／－誤差（デルタ法）を、これら３つの結果から計算する。表５に示す細胞結合の結果は、抗体Ｉ及び抗体ＩＩの両方がヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲ（「ｃｙｎｏ ＧＩＴＲ」）に強力に結合することを示している。一方、この研究の陰性対照として使用したアダリムマブＦａｂ－ａｌｂＶＨＨは、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲへの結合が無視できる程度であることを示した（データは示さず）。
実施例５：ヒト及びＣｙｎｏ ＧＩＴＲにおける抗体のインビトロＧＩＴＲＬ拮抗作用
ＪｕｒｋａｔヒトＧＩＴＲ／ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ２細胞又はＪｕｒｋａｔ ｃｙｎｏ ＧＩＴＲ／ＮＦｋＢｌｕｃ細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）中で３７℃、５％ＣＯ２で一晩飢餓状態にし、翌日アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）に２ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁する。２５μＬ／ウェルの細胞懸濁液を、５ｅ５細胞／ウェルとなるように白色不透明９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に添加する。アッセイ培地に希釈した５０μＬ／ウェルの２Ｘ抗体用量滴定液を添加し、続いてすぐに、アッセイ培地に希釈した４Ｘ（１２ｎＭ）ヒトＧＩＴＲＬ又はｃｙｎｏ ＧＩＴＲＬをそれぞれ２５μＬ／ウェルで添加する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで室温に１５分間置く。１００μＬ／ウェルのＢｉｏＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルごとに加え、室温で５分間振盪しながらインキュベートする。発光を、Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えたＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＮｅｏ２プレートリーダーで測定する。３回の反復実験のそれぞれからＧＩＴＲアンタゴニスト抗体処理によるＧＩＴＲＬ阻害についてＩＣ５０値を計算し、誤差を伴うＩＣ５０幾何平均（デルタ法）を、これら３つの結果から計算する。
表６のルシフェラーゼレポーター機能バイオアッセイの結果は、抗体Ｉ及び抗体ＩＩの両方が、ヒトＧＩＴＲのヒトＧＩＴＲＬ刺激及びｃｙｎｏ ＧＩＴＲのｃｙｎｏ ＧＩＴＲＬ刺激を強力に阻害することを実証している。
実施例６：ヒト及びＣｙｎｏ ＧＩＴＲにおける抗体のインビトロアゴニズム
ＪｕｒｋａｔヒトＧＩＴＲ／ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ２細胞又はＪｕｒｋａｔ ｃｙｎｏ ＧＩＴＲ／ＮＦｋＢｌｕｃ細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）中で３７℃、５％ＣＯ２で一晩飢餓状態にし、翌日アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）に２ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁する。５０μＬ／ウェルの細胞懸濁液を、５ｅ５細胞／ウェルとなるように白色不透明９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に添加する。アッセイ培地に希釈した５０μＬ／ウェルの２Ｘ抗体用量滴定液を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、次いで室温に１５分間置く。１００μＬ／ウェルのＢｉｏＧｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルごとに加え、室温で５分間振盪しながらインキュベートする。発光を、Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えたＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＮｅｏ２プレートリーダーで測定する。２回又は３回の反復実験のそれぞれからＧＩＴＲ抗体処理についてＥＣ５０値を計算し、ＥＣ５０幾何学的誤差（デルタ法）を、これらの結果から計算する。
表７のルシフェラーゼレポーター機能バイオアッセイの結果は、ＧＩＴＲＬの非存在下での抗体Ｉ又は抗体ＩＩによるＪｕｒｋａｔヒトＧＩＴＲ／ＮＦｋＢルシフェラーゼ細胞又はＪｕｒｋａｔ ｃｙｎｏ ＧＩＴＲ／ＮＦｋＢルシフェラーゼ細胞の処理がアゴニスト刺激をもたらさなかったことを実証している。対照的に、抗体Ｉの二価ＩｇＧ変異体（すなわち抗体ＩＩＩ）での処理は、ＧＩＴＲ経路の活性化を誘導した。
実施例７：Ｔ細胞増殖のＧＩＴＲＬ共刺激に対する抗体のインビトロ拮抗作用。
ＧＩＴＲＬ生物学の１つの側面は、Ｔ細胞を共刺激して増殖を増加させる能力である。この実施例では、抗体Ｉ及び抗体ＩＩ処理がヒトＴ細胞増殖のプレート結合ＧＩＴＲＬ共刺激を強力に阻害することが実証される。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、プレートに結合した０．２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体で１．５ｅ６細胞／ｍＬで４日間刺激して、Ｔ細胞上のＧＩＴＲ発現を増加させた。次いで、Ｔ細胞を培養培地中で２日間休ませて、再刺激用の細胞を準備した。次いで、１．５ｅ６細胞／ｍＬの活性化及び休止Ｔ細胞を、抗体Ｉ又は抗体ＩＩ用量滴定液の存在下、プレートに結合した２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体及び１ｎＭヒトＧＩＴＲＬで５日間共刺激した。Ｔ細胞の増殖を、インキュベーションの最後の１８時間の間のＨ３－チミジン取り込みによって測定した。各抗体を３回の用量滴定条件で試験し、３回の別々の実験にわたって４人の異なるドナーで試験した。
表８に示すＧＩＴＲＬ共刺激アッセイの結果は、抗体Ｉ及び抗体ＩＩがＴ細胞増殖のＧＩＴＲＬ共刺激を強力に阻害することを実証している。対照的に、陰性対照として使用されたａｌｂＶＨＨ抗体フラグメントは、Ｔ細胞増殖のＧＩＴＲＬ共刺激を阻害する能力が無視できる程度であることを示した（データは示さず）。
実施例８：ＧＩＴＲＬの存在下でのエフェクターＴ細胞増殖のインビトロ制御性Ｔ細胞抑制の抗体回復。
ＧＩＴＲＬ生物学の１つの側面は、ＧＩＴＲの結合及び活性化を通じてエフェクターＴ細胞増殖の制御性Ｔ細胞抑制を阻害する能力である。この実施例では、抗体Ｉ及び抗体ＩＩ処理が、プレート結合ＧＩＴＲＬの存在下で制御性Ｔ細胞の抑制活性を強力に回復することが実証される。ヒトＴ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離し、それぞれＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ又はＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を、抗体Ｉ又は抗体ＩＩ用量滴定液の存在下で２：１の比率で組み合わせ、２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８及びプレートに結合した１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３及び２ｎＭ ＧＩＴＲＬで刺激した。４日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を除いて、ＣＦＳＥ標識を追跡するフローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を評価した。このアッセイは、４人の個別のドナーを用いて４つの別個の機会で行った。処理ごとに１０，０００のイベントを取得し（試験された抗体濃度ごとに単一の生物学的複製）、Ｔエフェクター細胞の増殖パーセントを計算するために使用した。
表９に示すアッセイ結果は、抗体Ｉ及び抗体ＩＩが、ＧＩＴＲＬの存在下でエフェクターＴ細胞増殖の制御性Ｔ細胞抑制を強力に回復することを実証している。
実施例９：マウスにおける抗体薬物動態
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の抗体Ｉ又は抗体ＩＩの１０ｍｇ／ｋｇを０．１ｍＬ／動物の量で単回ＩＶ又はＳＱ投薬で投与する。薬物動態学的特性評価のために、ＩＶ投薬の１、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、及び３３６時間後又はＳＱ投薬の３、６、１２、２４、４８、９６、１２０、１６８、２４０、及び３３６時間後に３匹の動物／群／時点から血液を採取し、血清に処理する。
抗体Ｉ及びＩＩの血漿濃度を、プレートベースのＧＩＴＲ抗原捕捉酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法によって測定する。組換えヒトＧＩＴＲ Ｆｃキメラ（ｒｈ ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８ Ｆｃ）を捕捉試薬として１ｍｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレート上にコーティングする。血漿標準、対照及び試料とインキュベートした後、ヤギ抗ヒトＩｇ Ｆａｂホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、プレート結合抗体Ｉ又は抗体ＩＩを検出する。各時点で決定された平均濃度の非コンパートメント分析（ＮＣＡ）を使用して、薬物動態パラメータを計算する（Ｎ＝１～３匹の動物／群／時点）。ＮＣＡは、Ｗａｔｓｏｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＬＩＭＳを使用して実行する。表１０に示すように、抗体Ｉ及び抗体ＩＩは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて拡張された薬物動態プロファイルを示す。
実施例１０：ラットにおける抗体の薬物動態
雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ｉ又は抗体ＩＩを、それぞれ２．５ｍＬ／ｋｇ及び１ｍＬ／ｋｇの量で単回ＩＶ又はＳＱ投薬で投与する。薬物動態学的特性評価のために、ＩＶ投薬の１、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２及び５０４時間後又はＳＱ投薬の３、６、１２、２４、４８、９６、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２及び５０４時間後に３匹の動物／群／時点から血液を採取し、血清に処理する。
抗体抗体Ｉ及びＩＩの血漿濃度を、プレートベースのＧＩＴＲ抗原捕捉酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法によって測定する。組換えヒトＧＩＴＲ Ｆｃキメラ（ｒｈ ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８ Ｆｃ）を捕捉試薬として１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。血漿標準、対照及び試料とインキュベートした後、ヤギ抗ヒトＩｇ Ｆａｂホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：１０，０００に希釈）を使用して、プレート結合抗体Ｉ又は抗体ＩＩを検出した。各動物（Ｎ＝２～３）についてＮＣＡを使用して薬物動態パラメータを計算し、パラメータを必要に応じて平均及び標準偏差（ＳＤ）によって要約する。抗体ＩＩを皮下投薬されたＮ＝２匹のラットについて薬物動態データが得られたため、平均パラメータが報告されている。ＮＣＡ及び要約統計計算は、Ｗａｔｓｏｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＬＩＭＳを使用して実行する。表１１及び表１２に示すように、抗体抗体Ｉ及びＩＩは、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて拡張された薬物動態プロファイルを示した。


実施例１１：カニクイザルにおける抗体の薬物動態
カニクイザルに、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の抗体Ｉ又は抗体ＩＩの０．１、１、若しくは１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ用量又は１０ｍｇ／ｋｇ ＳＱ用量を、１ｍＬ／ｋｇ（ＩＶ）又は０．２ｍＬ／ｋｇ（ＳＣ）の量で単回投与する。薬物動態学的特性評価のために、投薬の０．５、３、６、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０、３３６、４３２、５０４及び６７２時間後に３匹の動物／群／時点から血液を採取し、血清に処理する。
抗体Ｉ及びＩＩの血漿濃度を、プレートベースのＧＩＴＲ抗原捕捉酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法によって測定する。組換えヒトＧＩＴＲ Ｆｃキメラ（ｒｈ ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８ Ｆｃ）を捕捉試薬として１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレート上にコーティングする。血漿標準、対照及び試料とインキュベートした後、検出抗体を使用して抗体の安定性を決定する。１つの方法では、ヤギ抗ヒトＩｇ Ｆａｂホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、プレート結合抗体Ｉ又は抗体ＩＩのＦａｂ部分を検出する。２番目の方法では、プレート結合抗体Ｉ又は抗体ＩＩの無傷のリンカーを有する代謝的に安定した抗体を検出するために、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ、ＶＨＨドメインを二次抗体として添加する。このインキュベーションの後、プレート結合抗体Ｉ又は抗体ＩＩを検出するための試薬として、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加する。各動物についてＮＣＡを使用して薬物動態パラメータを計算し、パラメータを必要に応じて平均及び標準偏差（ＳＤ）によって要約する。ＮＣＡ及び要約統計計算は、Ｗａｔｓｏｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＬＩＭＳを使用して実行する。表１３及び表１４に示すように、抗体Ｉ及び抗体ＩＩは、カニクイザルにおいて拡張された薬物動態プロファイルを示す。両方のＥＬＩＳＡ法で測定した抗体Ｉ又はＩＩの濃度を比較すると、同様の曝露及び薬物動態が観察され、ＩＶ又はＳＱ投与後のインビボでのこれらの抗体の代謝安定性が示された。

配列表
配列番号１ ＨＣＤＲ１
ＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨ
配列番号２ ＨＣＤＲ２．１
ＶＴＳＹＤＧＴＨＥＹ
配列番号３ ＨＣＤＲ３
ＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹ
配列番号４ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＩＳＮＳＬＡ
配列番号５ ＬＣＤＲ２
ＹＡＡＦＳＬＱＳ
配列番号６ ＬＣＤＲ３
ＹＱＹＹＮＹＰＳＡ
配列番号７ ＨＣＤＲ２．２
ＶＴＳＹＤＧＴＨＥＬ
配列番号８ ＨＣ可変領域（ＶＨ１）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９ ＨＣ可変領域（ＶＨ２）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０ ＬＣ可変領域（ＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＦＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＹＱＹＹＮＹＰＳＡＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１１ リンカー１
ＤＫＴＨＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱ
配列番号１２ リンカー２
ＤＫＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱ
配列番号１３ アルブミン結合ＶＨＨ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＹＩＤＥＴＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＧＩＧＧＧＶＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＧＲＰＬＩＴＳＫＶＡＤＬＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＰＰ
配列番号１４ ＨＣ抗Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体１
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＹＩＤＥＴＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＧＩＧＧＧＶＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＧＲＰＬＩＴＳＫＶＡＤＬＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＰＰ
配列番号１５ ＨＣ抗ＧＩＴＲ Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体２
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＴＳＹＤＧＴＨＥＬＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＮＮＷＡＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＹＩＤＥＴＡＶＡＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＧＩＧＧＧＶＤＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＧＲＰＬＩＴＳＫＶＡＤＬＹＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＰＰ
配列番号１６ ＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＦＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＹＱＹＹＮＹＰＳＡＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１７ ＤＮＡコードＨＣ抗－ＧＩＴＲ Ｆａｂ－アルブミン結合ＶＨＨ融合体１ＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣ
配列番号１８ ＤＮＡコードＨＣ ＧＩＴＲ及びアルブミン結合ＶＨＨ融合体２
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＡＴＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣ
配列番号１９ ＤＮＡコードＬＣ
ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
配列番号２０ ヒトＧＩＴＲ全長（シグナルペプチドなし）
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣＩＤＣＡＳＧＴＦＳＧＧＨＥＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥＰＬＧＷＬＴＶＶＬＬＡＶＡＡＣＶＬＬＬＴＳＡＱＬＧＬＨＩＷＱＬＲＳＱＣＭＷＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＲＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＳＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ
配列番号２１ ヒトＧＩＴＲ ＥＣＤ（シグナルペプチドなし）
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣＩＤＣＡＳＧＴＦＳＧＧＨＥＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥ
配列番号２２：シグナルペプチドアミノ酸配列
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ヒトＧＩＴＲ（配列番号２０）に結合し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合フラグメントＸを含む化合物であって、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｉ．前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１を含み、
ｉｉ．前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は配列番号７を含み、
ｉｉｉ．前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３を含み、
ｉｖ．前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４を含み、
ｖ．前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５を含み、
ｖｉ．前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６を含む、化合物。
［２］
式：
Ｘ－Ｌ－Ｍ 又は Ｍ－Ｌ－Ｘ
（式中、Ｍは、ヒト血清アルブミンに結合するＶＨＨ部分であり、
Ｌ（存在する場合）は、リンカーである）を有する、［１］に記載の化合物。
［３］
前記ＶＨＨ部分が、配列番号１３、又はそれと少なくとも約９０％～約９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含む、［２］に記載の化合物。
［４］
前記ＶＨＨ部分が、Ｌを介してＦａｂフラグメントの重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）のＣ末端に融合されている、［２］又は［３］に記載の化合物。
［５］
Ｘが、配列番号１０を有するＶＬを含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の化合物。
［６］
Ｘが、配列番号８を有するＶＨ又は配列番号９を有するＶＨを含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物。
［７］
Ｌが、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号２３からなる群から選択されるペプチドリンカーを含む、［２］～［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［８］
Ｘが、配列番号１６に示される軽鎖（ＬＣ）を含む、［１］～［７］のいずれか一項に記載の化合物。
［９］
Ｘが、配列番号１４に示されるＨＣ又は配列番号１５に示されるＨＣを含む、［１］～［８］のいずれか一項に記載の化合物。
［１０］
配列番号１７を含む、核酸。
［１１］
配列番号１８を含む、核酸。
［１２］
配列番号１９を含む、核酸。
［１３］
配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９に示される核酸を含む、ベクター。
［１４］
［１２］に記載のベクターを含む、細胞。
［１５］
化合物を生成するプロセスであって、前記抗体が発現するような条件下で、［１３］に記載の細胞を培養することと、培養培地から発現した抗体を回収することとを含む、プロセス。
［１６］
［１４］に記載のプロセスによって生成される、化合物。
［１７］
［１］～［９］のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む、医薬組成物。
［１８］
ＧＩＴＲ細胞関連疾患の治療を必要とする対象においてＧＩＴＲ活性を阻害することによりそれを治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の［１］～［９］のいずれか一項に記載の化合物又は［１７］に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［１９］
前記ＧＩＴＲ関連疾患が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎（ＡｔＤ）、炎症性障害、関節炎症、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、［１８］に記載の方法。
［２０］
療法における使用のための、［１］～［９］のいずれか一項に記載の化合物。
［２１］
自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、ＡｔＤ、炎症性障害、関節炎症、関節炎、ＲＡ、ＩＢＤ、ＣＤ又はＵＣの治療における使用のための、［１］～［９］のいずれか一項に記載の化合物。
［２２］
自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、ＡｔＤ、炎症性障害、関節炎、関節炎、関節リウマチ、ＩＢＤ、ＣＤ又はＵＣの前記治療のための医薬の製造における、［２０］又は［２１］に記載の化合物の使用。

Claims (20)

  1. ヒトＧＩＴＲ（配列番号２０）に結合し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗原結合フラグメントＸを含む抗体であって、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
    ｉ．前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
    ｉｉ．前記ＨＣＤＲ２が、配列番号２又は配列番号７のアミノ酸配列を含み、
    ｉｉｉ．前記ＨＣＤＲ３が、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
    ｉｖ．前記ＬＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    ｖ．前記ＬＣＤＲ２が、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
    ｖｉ．前記ＬＣＤＲ３が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、抗体。
  2. 式：
    Ｘ－Ｌ－Ｍ 又は Ｍ－Ｌ－Ｘ
    （式中、Ｍは、ヒト血清アルブミンに結合するＶＨＨ部分であり、
    Ｌは、リンカーである）を有する、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ＶＨＨ部分が、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと９０％～９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記ＶＨＨ部分が、Ｌを介してＦａｂフラグメントの重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）のＣ末端に融合されている、請求項２又は３に記載の抗体。
  5. Ｘが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. Ｘが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨ又は配列番号９を有するＶＨを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. Ｌが、配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドリンカーを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の抗体。
  8. Ｘが、配列番号１６のアミノ酸配列で示される軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. Ｘが、配列番号１４のアミノ酸配列で示されるＨＣ又は配列番号１５のアミノ酸配列で示されるＨＣを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 配列番号１７のＤＮＡ配列を含む、核酸。
  11. 配列番号１８のＤＮＡ配列を含む、核酸。
  12. 配列番号１９のＤＮＡ配列を含む、核酸。
  13. 配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９に示される核酸を含む、ベクター。
  14. 請求項１３に記載のベクターを含む、細胞。
  15. 抗体を生成するプロセスであって、前記抗体が発現するような条件下で、請求項１４に記載の細胞を培養することと、培養培地から発現した抗体を回収することとを含む、プロセス。
  16. 請求項１５に記載の方法によって生成される、抗体。
  17. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む、医薬組成物。
  18. 療法における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
  19. 自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、炎症性障害、関節炎症、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病又は潰瘍性大腸炎の治療における使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
  20. 自己免疫疾患、アレルギー疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、炎症性障害、関節炎症、関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病又は潰瘍性大腸炎の治療のための医薬の製造における、請求項１～９又は１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
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