JP7736329B2 - Ｄｕｘ４遺伝子を標的とした顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの治療方法 - Google Patents
Ｄｕｘ４遺伝子を標的とした顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの治療方法Info
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Description
本発明は、ヒトダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子を標的とした顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の治療方法等に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＤＵＸ４遺伝子の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写抑制因子とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いてヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制することにより、ＦＳＨＤを治療又は予防するための方法及び剤等に関する。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、最も一般的なミオパチーの１種で、あらゆる年齢の男女で発症する。
ＦＳＨＤのタイプには２種類ある。「ＦＳＨＤ１」は第４番染色体のテロメア（４ｑ３５）のゲノム配列（Ｄ４Ｚ４）の反復の短縮（１０反復以下）を起因とし、「ＦＳＨＤ２」はＦＳＨＤ１以外の複合因子を起因とする。健常のＤ４Ｚ４反復配列ではＤＮＡは高度にメチル化されている。ＦＳＨＤ１やＦＳＨＤ２ではそれぞれのゲノム異常によってＤＮＡ低メチル化を伴うクロマチン構造の変化が起こり、本来筋（前駆）細胞では発現していない遺伝子（ＤＵＸ４転写因子）が活性化される。ＤＵＸ４タンパク質は発生段階には重要であるが、通常成熟細胞には存在せず、ＦＳＨＤ骨格筋でのＤＵＸ４活性化は細胞死を引き起こすことが知られている。ＤＵＸ４の活性化を阻止することができれば、ＦＳＨＤの治療につながることが期待され、その一環として、遺伝子編集技術を用いＤＵＸ４のｍＲＮＡの量を減らす試みが為されている（非特許文献１）。
一方、近年、不活性化ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９（ｄＣａｓ９）と転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインとの組み合わせを用い、ガイドＲＮＡを用いて、遺伝子のＤＮＡ配列を切断せずに、タンパク質を遺伝子にターゲティングすることにより、標的遺伝子の発現を制御するシステムが開発されている（特許文献１、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。その臨床応用が期待されている（非特許文献２、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。しかしながら、ｄＣａｓ９、ガイドＲＮＡ及び共役転写抑制因子の複合体をコードする配列が、インビボでの遺伝子送達に最も有望視されている最も一般的なウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）の許容量を超えるという問題がある（非特許文献３参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
Mol Ther. 2016 Mar; 24(3): 527-535
Dominguez A. et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan; 17(1): 5-15
Liao H. et al., Cell. 2017 Dec 14; 171(7): 1495-507
従って、本発明の目的の一つは、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の新規治療手段を提供することにある。
以下の詳細な説明の中で明らかになるであろう、この目的及びその他の目的は、本発明者らが、ヒトＤＵＸ４遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１００２８８６８７）の特定の配列を標的としたガイドＲＮＡ及び転写抑制因子とヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質を用いることにより、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を強力に抑制できることを見出したことによって達成された。また、本発明者らは、コンパクトなヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とコンパクトな転写抑制因子とを用いて、融合タンパク質をコードする塩基配列とガイドＲＮＡをコードする塩基配列を有する単一のＡＡＶベクターにより、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を強く抑制できることを見出した。
すなわち本発明は、以下を提供する：
［１］以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される連続する領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
［２］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列、又は配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列において１～３塩基欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］少なくとも２種類のガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む、［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、［１］～［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［５］転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［７］ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、［６］に記載のポリヌクレオチド。
［８］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［９］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、［９］に記載のポリヌクレオチド。
［１］以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される連続する領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
［２］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列、又は配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列において１～３塩基欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を含む、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］少なくとも２種類のガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む、［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチド。
［４］転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、［１］～［３］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［５］転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｄＣａｓ９である、［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［７］ｄＣａｓ９が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、［６］に記載のポリヌクレオチド。
［８］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、［１］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［９］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、［８］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、［９］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は神経特異的プロモーターである、［８］～［１０］のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
［１２］ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、［１１］に記載のポリヌクレオチド。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、［１３］に記載のベクター。
［１５］ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、［１４］に記載のベクター。
［１６］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される、［１５］に記載のベクター。
［１７］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、［１６］に記載のベクター。
［１８］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は［１３］～［１７］のいずれかに記載のベクターを含む、医薬組成物。
［１９］ＦＳＨＤを治療又は予防するための、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は［１３］～［１７］のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法。
［１２］ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、［１１］に記載のポリヌクレオチド。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、［１３］に記載のベクター。
［１５］ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、［１４］に記載のベクター。
［１６］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される、［１５］に記載のベクター。
［１７］ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、［１６］に記載のベクター。
［１８］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は［１３］～［１７］のいずれかに記載のベクターを含む、医薬組成物。
［１９］ＦＳＨＤを治療又は予防するための、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］［１］～［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は［１３］～［１７］のいずれかに記載のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法。
本発明とそれに付随する多くの利点は、以下の詳細な説明を参照し、添付の図面と併せて理解することで、より完全に理解することができるであろう。
本発明によると、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制することができ、結果として本発明はＦＳＨＤを治療することができると期待される。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
１．ポリヌクレオチド
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される連続する領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
本発明は、以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称することがある）を提供する：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される連続する領域を標的とするガイドＲＮＡをコードする塩基配列。
本発明のポリヌクレオチドは、所望の細胞内に導入され、転写されることにより、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質及びヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域中の特定の領域を標的とするガイドＲＮＡを生じる。これら融合タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体（以下、該複合体を「リボヌクレオプロテイン（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）」と称することがある）となって協同的に前記特定の領域に作用することにより、ヒトＤＵＸ４遺伝子の転写を抑制する。本発明の一態様において、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を、例えば、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、又は約１００％、抑制することができる。
（１）定義
本明細書において「ヒトダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＤＵＸ４遺伝子の発現が抑制され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＤＵＸ４遺伝子の発現が抑制される限り、ヒトＤＵＸ４遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。
本明細書において「ヒトダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現制御領域」とは、ＲＮＰがその領域へ結合することによりヒトＤＵＸ４遺伝子の発現が抑制され得る、あらゆる領域を意味する。即ち、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域とは、ＲＮＰの結合によりヒトＤＵＸ４遺伝子の発現が抑制される限り、ヒトＤＵＸ４遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、エクソン等のいずれの領域に存在してもよい。本明細書中、ある特定の配列により発現制御領域を表す場合、発現制御領域とは、そのセンス鎖配列及びアンチセンス鎖配列の両方を含む概念である。
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによりヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域中の特定の領域へリクルートされる。本明細書において、「～を標的とするガイドＲＮＡ」とは、「～へ融合タンパク質をリクルートするガイドＲＮＡ」を意味する。
本明細書において、「ガイドＲＮＡ（『ｇＲＮＡ』とも称することがある）」とは、ゲノム特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」と称する）を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列（後述）の相補配列に結合するＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその５’末端に付した特定の配列（例えばＦｎＣｐｆ１の場合、配列番号８０で表されるＲＮＡ配列）からなるＲＮＡを含むＲＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合には、「ガイドＲＮＡ」とは、ｃｒＲＮＡとその３’末端に連結されたｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称する）を含むキメラＲＮＡ（「ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と称する）を指す（例えば、Zhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
本明細書において、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域中で、ｃｒＲＮＡが結合する配列に対する相補配列を「ターゲティング配列（targeting sequence）」と称する。すなわち、本明細書において、「ターゲティング配列」とは、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域中に存在し、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif））が隣接するＤＮＡ配列である。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣｐｆ１を用いる場合にはターゲティング配列の５’側に隣接する。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてＣａｓ９を用いる場合にはターゲティング配列の３’側に隣接する。ターゲティング配列は、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域のセンス鎖配列側及びアンチセンス鎖配列側のいずれに存在してもよい（例えば、上述のZhang F. et al., Hum Mol Genet. 2014 Sep 15;23(R1):R40-6及びZetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22; 163(3): 759-71を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
（２）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写抑制因子をヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」と称する）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。
本発明では、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いて、それに融合させた転写抑制因子をヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートさせる。本発明に用いられるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（以下では単に「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」と称する）としては、ｇＲＮＡと複合体を形成して、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートされる限り特に制限はないが、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（以下「ｄＣａｓ９」とも称することがある）又はヌクレアーゼ欠損Ｃｐｆ１（以下「ｄＣｐｆ１」とも称することがある）が挙げられる。
上記ｄＣａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ又はＣ。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ。以下同じ））、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、又は黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））由来のＣａｓ９(ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ。以下同じ））のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、これらに限定されない（例えばNishimasu et al., Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49、Esvelt KM et al., Nat Methods. 2013 Nov;10(11):1116-21、Zhang Y. Mol Cell. 2015 Oct 15;60(2):242-55、及びFriedland AE et al., Genome Biol. 2015 Nov 24;16:257を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に変換し、且つ、８４０番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体（「ｄＳｐＣａｓ９」と称することがある）を用いることができる（例えば上述のNishimasu et al., Cell. 2014を参照）。或いは、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基へ変換した二重変異体（配列番号８１）、又は、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５５７番目のＨｉｓ残基をＡｌａ残基へ変換した二重変異体（配列番号８２）（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９」と称することがある）を使用することができる（例えば上述のFriedland AE et al., Genome Biol. 2015を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
また、本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、前記ｄＣａｓ９のアミノ酸配列の一部を改変させた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体をもまた用いてもよい。かかる改変体としては、例えば、アミノ酸配列の一部を欠失させた短縮型の改変体が挙げられる。本発明の一態様において、ｄＣａｓ９として、ＷＯ２０１９／２３５６２７及びＷＯ２０２０／０８５４４１（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）において開示された改変体を用いることができる。具体的には、１０番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基へ変換し、且つ、５８０番目のＡｓｎ残基をＡｌａ残基へ変換した二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の７２１番目～７４５番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号８３）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（例えば、該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカー（配列番号８４）で置換したものを配列番号８５で示す、及び該欠失部分をＳＧＧＧＳリンカー（配列番号８６）で置換したものを配列番号８７で示す、等（以下、いずれの二重変異体についても「ｄＳａＣａｓ９[－２５]」と称することがある））、又は前記二重変異体であるｄＳａＣａｓ９の４８２番目～６４８番目のアミノ酸を欠失したｄＳａＣａｓ９（配列番号８８）、若しくは該欠失部分をペプチドリンカーで置換したｄＳａＣａｓ９（該欠失部分をＧＧＳＧＧＳリンカーで置換したものを配列番号８９で示す）を用いてもよい。
上記ｄＣｐｆ１としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴ）、アシダミノコッカス ｓｐ．（Acidaminococcus sp.）由来のＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）、又はラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１；ＰＡＭ配列：ＮＴＴＴ）のヌクレアーゼ欠損改変体等が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Zetsche B. et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71、Yamano T et al., Cell. 2016 May 5;165(4):949-62、及びYamano T et al., Mol Cell. 2017 Aug 17;67(4):633-45を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基をＡｌａ残基に、且つ、１００６番目のＧｌｕ残基をＡｌａ残基に変換した二重変異体を用いることができる（例えば、上述のZetsche B et al., Cell. 2015を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。本発明の一態様において、ｄＣｐｆ１として、前記ｄＣｐｆ１のアミノ酸配列の一部を改変して得られた改変体であって、ｇＲＮＡと複合体を形成してヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域にリクルートされる改変体を用いてもよい。
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としては、ｄＣａｓ９が使用される。一態様において、ｄＣａｓ９はｄＳａＣａ９であり、特定の態様において、ｄＳａＣａｓ９はｄＳａＣａｓ９[－２５]である。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＰＣＲ法によって該ポリヌクレオチドを増幅することにより、クローニングすることができる。また、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、クローン化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基、５５７番目のＨｉｓ残基、及び５８０番目のＡｓｎ残基；ＦｎＣｐｆ１の場合、９１７番目のＡｓｐ残基や１００６番目のＧｌｕ残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいはヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）法との組み合わせにより取得することができ、さらに、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行った塩基配列として構築することもできる。
（３）転写抑制因子
本発明において、ヒトＤＵＸ４遺伝子発現は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写抑制因子の作用によって抑制される。本明細書において、「転写抑制因子」とは、ヒトＤＵＸ４遺伝子の遺伝子転写を抑制する能力を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写抑制因子としては、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制し得るものである限り特に限定されない。例えば、クルッペル関連ボックス（Kruppel-associated box：ＫＲＡＢ）、ＭＢＤ２Ｂ、ｖ－ＥｒｂＡ、ＳＩＤ（ＳＩＤの鎖状態（ＳＩＤ４Ｘ）を含む）、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ２、ＲＯＭ２、ＬＳＤ１、ＡｔＨＤ２Ａ、ＳＥＴ１、ＨＤＡＣ１１、ＳＥＴＤ８、ＥＺＨ２、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＰＨＦ１９、ＳＡＬＩ、ＮＵＥ、ＳＵＶＲ４、ＫＹＰ、ＤＩＭ５、ＨＤＡＣ８、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、ＭＥＳＯＬＯ４、ＳＥＴ８、ＨＳＴ２、ＣＯＢＢ、ＳＥＴ－ＴＡＦ１Ｂ、ＮＣＯＲ、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＮＩＰＰ１、ＨＰ１Ａ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、及び転写抑制能を有するそれらの改変体、並びにそれらの融合体等が含まれる。本発明の一態様において、転写抑制因子としては、ＫＲＡＢが使用される。
本発明において、ヒトＤＵＸ４遺伝子発現は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に融合された転写抑制因子の作用によって抑制される。本明細書において、「転写抑制因子」とは、ヒトＤＵＸ４遺伝子の遺伝子転写を抑制する能力を有するタンパク質又はその機能を保持するペプチド断片を意味する。本発明に用いられる転写抑制因子としては、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制し得るものである限り特に限定されない。例えば、クルッペル関連ボックス（Kruppel-associated box：ＫＲＡＢ）、ＭＢＤ２Ｂ、ｖ－ＥｒｂＡ、ＳＩＤ（ＳＩＤの鎖状態（ＳＩＤ４Ｘ）を含む）、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ２、ＲＯＭ２、ＬＳＤ１、ＡｔＨＤ２Ａ、ＳＥＴ１、ＨＤＡＣ１１、ＳＥＴＤ８、ＥＺＨ２、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＰＨＦ１９、ＳＡＬＩ、ＮＵＥ、ＳＵＶＲ４、ＫＹＰ、ＤＩＭ５、ＨＤＡＣ８、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、ＭＥＳＯＬＯ４、ＳＥＴ８、ＨＳＴ２、ＣＯＢＢ、ＳＥＴ－ＴＡＦ１Ｂ、ＮＣＯＲ、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＮＩＰＰ１、ＨＰ１Ａ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、及び転写抑制能を有するそれらの改変体、並びにそれらの融合体等が含まれる。本発明の一態様において、転写抑制因子としては、ＫＲＡＢが使用される。
転写抑制因子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、化学合成により、又は化学合成とＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせにより構築することができる。さらに、転写抑制因子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトでの発現に適したコドンとなるようコドン最適化を行ったＤＮＡ配列として構築することもできる。
転写抑制因子をコードする塩基配列に、直接又はリンカー、ＮＬＳ（核移行シグナル）（例えば、配列番号９０又は配列番号９１で表される塩基配列）、タグ、及び／又はその他等をコードする塩基配列を付加した後に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする塩基配列にライゲーションすることで、転写抑制因子とヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを調製することができる。本発明において、転写抑制因子はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれに融合させてもよい。リンカーとしては、アミノ酸数が２から５０個程度のリンカーを用いることができ、具体的には、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）が交互に連結したＧ－Ｓ－Ｇ－Ｓリンカー等が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、融合タンパク質としてＳＶ４０ ＮＬＳ、ｄＳａＣａｓ９（例、Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａ変異体）、ＮＬＳ及びＫＲＡＢをコードする配列番号９２に記載の塩基配列を含む。所望により、他の塩基配列（下記「（６）他の塩基配列」参照）および選択マーカー（例、Ｐｕｒｏ）を含有してもよい。
（４）ガイドＲＮＡ
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質のヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲティング配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
本発明において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質のヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域へのリクルートは、ガイドＲＮＡにより達成される。前記「（１）定義」の項に記載の通り、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、該ｃｒＲＮＡはターゲティング配列の相補配列に結合する。ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ｃｒＲＮＡは、ターゲティング配列の相補配列と完全に相補的でなくてもよく、少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
ターゲティング配列は、例えば、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、公開されているｇＲＮＡ設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPR direct等）を用いて設定することが出来る。具体的には、目的遺伝子（即ち、ヒトＤＵＸ４遺伝子）の配列の中から、ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合、ＮＮＧＲＲＴ）が３’側に隣接している約２０ヌクレオチド長の候補ターゲティング配列をリストアップし、これらの候補ターゲティング配列の中から、ヒトのゲノム中のオフターゲットサイト数が少ないものをターゲティング配列として使用することができる。ターゲティング配列の塩基長は、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長である。オフターゲットサイト数の予測をする一次スクリーニングとして、多数のバイオインフォマティクスツールが公知且つ公衆に利用可能であり、最もオフターゲット効果が小さいターゲット配列を予測するために使用することができる。Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）やＣＯＳＭＩＤ（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions）（インターネット上のhttps://crispr.bme.gatech.eduで利用可能）等のバイオインフォマティクスツールが例示され、これらによりｇＲＮＡが標的とする塩基配列に対する類似性をまとめることができる。使用するｇＲＮＡ設計ソフトウェアに対象ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補ターゲット配列の３’側の８～１２ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いシード（ｓｅｅｄ）配列）について、対象のゲノムに対してＢｌａｓｔ検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
本発明の一態様において、ヒト４番染色体（Ｃｈｒ４）のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に存在する領域中、“１９０，０６５，５００－１９０，０６８，５００”の領域、及び“１９０，０４７，０００－１９０，０５２，０００”の領域が、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域となり得る。よって、本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト４番染色体（Ｃｈｒ４）のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に存在する“１９０，０６５，５００－１９０，０６８，５００”及び“１９０，０４７，０００－１９０，０５２，０００”の領域中、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
本発明の一態様において、ターゲティング配列は、ヒト４番染色体（Ｃｈｒ４）のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に存在する“１９０，０６５，０００－１９０，０９３，０００”（Ｄ４Ｚ４反復領域）および“１９０，１７３，０００－１９０，１７６，０００”（ＤＵＸ４遺伝子）の領域中、１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列は、ターゲティング配列と同じ塩基配列であり得る。例えば、配列番号４で表されるターゲティング配列（ＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣ）を、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として細胞に導入した場合、係る配列から転写されるｃｒＲＮＡはＣＣＣＵＣＣＡＣＣＧＧＧＣＵＧＡＣＣＧＧＣＣ（配列番号９３）となり、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域中に存在する、配列番号４で表される塩基配列の相補配列であるＧＧＣＣＧＧＴＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧ（配列番号９４）に結合する。さらに別の態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、ガイドＲＮＡが融合タンパク質を標的とする領域へリクルートすることができる限り、ターゲティング配列に対して少なくとも１～３個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を使用することができる。よって、本発明の一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される塩基配列、又は配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。
本発明の好ましい一態様において、ｃｒＲＮＡをコードする塩基配列として、配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列、又は配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された塩基配列を使用し得る。
ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣｐｆ１を用いる場合、５’末端に特定のＲＮＡを付したｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として設計することができる。このようなｃｒＲＮＡの５’末端に付するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣｐｆ１に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＦｎＣｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列としては、ターゲティング配列の５’側に配列番号９５；ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴを付した塩基配列を用いることができる（ＲＮＡに転写されると、下線部分の配列同士が塩基対を形成しステム－ループ構造をとる）。このような５’末端に付する配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣｐｆ１タンパク質に対して一般的に使用される配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
また、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質としてｄＣａｓ９を用いる場合、ｇＲＮＡをコードする塩基配列は、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の３’末端に既知のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を連結したＤＮＡ配列として設計することが出来る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡ及び該ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、使用するｄＣａｓ９に応じて当業者に適宜選択され得、例えば、ｄＳａＣａｓ９を用いる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列として、配列番号９６で表される塩基配列が使用される。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写後にｇＲＮＡが融合タンパク質を発現制御領域へリクルートすることができる限り、各種のＣａｓ９タンパク質に対して一般的に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡをコードする塩基配列に対して少なくとも１～６個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された配列であってもよい。
このように設計されたｇＲＮＡをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成方法を用いて、化学的に合成することができる。
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは少なくとも２種類のｇＲＮＡをコードする塩基配列を含んでいてもよい。例えば、該ポリヌクレオチドは少なくとも２種類のガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含み得、ここで少なくとも２種類の塩基配列は、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択され、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される。
（５）プロモーター配列
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を示すものであれば特に限定されない。例えば、ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列の為のプロモーター配列として、Ｕ６プロモーターが使用される。本発明の一態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列の上流に１つのプロモーター配列が作動可能に連結していてもよい。本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列のそれぞれの上流にプロモーター配列が作動可能に連結していてもよく、それぞれの塩基配列に作動可能に連結しているプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。
本発明の一態様において、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列及び／又はｇＲＮＡをコードする塩基配列のそれぞれの上流部分に、プロモーター配列が作動可能に連結されていてもよい。連結され得るプロモーターとしては、対象の細胞内においてプロモーター活性を示すものであれば特に限定されない。例えば、ｇＲＮＡをコードする塩基配列の上流に連結され得るプロモーター配列としては、ｐｏｌ ＩＩＩ系のプロモーターである、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｈ１プロモーター、及びｔＲＮＡプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列の為のプロモーター配列として、Ｕ６プロモーターが使用される。本発明の一態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列の上流に１つのプロモーター配列が作動可能に連結していてもよい。本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドがそれぞれガイドＲＮＡをコードする２以上の塩基配列を含む場合、２以上の塩基配列のそれぞれの上流にプロモーター配列が作動可能に連結していてもよく、それぞれの塩基配列に作動可能に連結しているプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。
融合タンパク質をコードする塩基配列の上流に連結され得る前記プロモーター配列としては、ユビキタスなプロモーター又は神経特異的プロモーターを使用してもよい。例えば、ユビキタスなプロモーターとしては、ＥＦ－１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター又はＣＡＧプロモーターがユビキタスなプロモーターとして使用され得る。神経特異的プロモーターとしては、例えば、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ヒトニューロフィラメント軽鎖（ＮＥＦＬ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。上述のプロモーターは、対象の細胞内においてプロモーター活性を有する限り、あらゆる修飾及び／又は改変が加えられていてもよい。
本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーターとしてＵ６が使用され、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーターとしてＣＭＶプロモーターが使用される。
本発明の一態様において、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーターとしてＵ６が使用され、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーターとしてＣＭＶプロモーターが使用される。
（６）その他の塩基配列
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化（ポリＡ（ｐｏｌｙＡ））シグナル、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。例えば、本発明におけるポリアデニル化シグナルとしては、ｈＧＨポリＡ、ｂＧＨポリＡ、２ｘｓＮＲＰ－１ポリＡ（ＵＳ７５５７１９７Ｂ２を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を挙げることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、介在配列を含んでいてもよい。介在配列の好ましい例としては、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位：Internal ribosome entry site）、２Ａペプチドをコードする配列が挙げられる。２Ａペプチドは、ウイルスに由来する約２０アミノ酸残基のペプチド配列で、細胞内に存在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）に認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断されるものである。２Ａペプチドによって１つのユニットとしてつながった複数の遺伝子が、１つのユニットとして転写・翻訳され、２Ａペプチダーゼによって切断される。２Ａペプチダーゼの例としては、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス由来）、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス由来）、Ｔ２Ａ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来）、Ｐ２Ａ（豚テシオウイルス－１由来）等が挙げられる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列が転写されて生じるｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる目的で、ポリアデニル化（ポリＡ（ｐｏｌｙＡ））シグナル、コザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列等の公知の配列をさらに含んでもよい。例えば、本発明におけるポリアデニル化シグナルとしては、ｈＧＨポリＡ、ｂＧＨポリＡ、２ｘｓＮＲＰ－１ポリＡ（ＵＳ７５５７１９７Ｂ２を参照、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等を挙げることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードする塩基配列、ＮＬＳをコードする塩基配列、及び／又はタグをコードする塩基配列を含んでもよい。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、介在配列を含んでいてもよい。介在配列の好ましい例としては、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位：Internal ribosome entry site）、２Ａペプチドをコードする配列が挙げられる。２Ａペプチドは、ウイルスに由来する約２０アミノ酸残基のペプチド配列で、細胞内に存在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）に認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断されるものである。２Ａペプチドによって１つのユニットとしてつながった複数の遺伝子が、１つのユニットとして転写・翻訳され、２Ａペプチダーゼによって切断される。２Ａペプチダーゼの例としては、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス由来）、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス由来）、Ｔ２Ａ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来）、Ｐ２Ａ（豚テシオウイルス－１由来）等が挙げられる。
（７）本発明の例示的な態様
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列を含む塩基配列から選択され、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される；又は配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９又はｄＳａＣａｓ９［－２５］であり、
ここで、転写抑制因子は、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａから選択され、
ここで、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択され、そして、
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される。
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列を含む塩基配列から選択され、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される；又は配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９又はｄＳａＣａｓ９［－２５］であり、
ここで、転写抑制因子は、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａから選択され、
ここで、融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択され、そして、
ｇＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列は、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される。
本発明の一態様では、以下を含むポリヌクレオチドが提供される：
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＭＶプロモーター、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列を含む塩基配列から選択され、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される；又は配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、
ここで、転写抑制因子はＫＲＡＢである。
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、
ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するＣＭＶプロモーター、
１又は２の、それぞれガイドＲＮＡをコードする塩基配列（ここで、１又は２の塩基配列は、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列を含む塩基配列から選択され、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される；又は配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、若しくは１７１で表される配列、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、若しくは１６１で表される塩基配列において１～３塩基が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加された配列を含む塩基配列から選択される）、及び
ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するＵ６プロモーター、
ここで、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はｄＳａＣａｓ９であり、
ここで、転写抑制因子はＫＲＡＢである。
２．ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター（以下、「本発明のベクター」と称することがある）を提供する。本発明のベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本発明のベクターがプラスミドベクターである場合、使用されるプラスミドベクターとしては、特に限定されず、クローニングプラスミドベクターや発現プラスミドベクター等のあらゆるプラスミドベクターであってよい。当該プラスミドベクターは、公知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドをプラスミドベクターに挿入することにより調製される。
本発明のベクターがウイルスベクターである場合、使用されるウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「ウイルスベクター（virus vector）」又は「ウイルスベクター（viral vector）」には、その派生物も含まれる。遺伝子治療における利用を考慮すれば、導入遺伝子を長期にわたり発現させられる点や非病原性ウイルス由来で安全性が高い等の理由から、ＡＡＶベクターが好適に用いられる。
本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、公知の方法により調製することができる。簡潔には、本発明のポリヌクレオチドを挿入したウイルス発現用プラスミドベクターを調製し、これを適切な宿主細胞にトランスフェクトし、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを一過性に産生させ、該ウイルスベクターを回収する。
本発明の一態様において、ＡＡＶベクターを用いる場合、ＡＡＶベクターの血清型としては、対象においてヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制できる限り特に限定されず、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ．１０等のいずれを用いてもよい（ＡＡＶの多様な血清型に関しては、例えばＷＯ２００５／０３３３２１及びＥＰ２３４１０６８（Ａ１）を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。ＡＡＶの改変体としては、例えば、キャプシド改変した新規血清型（例えば、ＷＯ２０１２／０５７３６３、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）等が挙げられるが、これに限定されない。例えば、本発明の一態様では、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶＳ１＿Ｐ１、及びＡＡＶＳ１０＿Ｐ１等、筋肉細胞への感染性が向上しているキャプシド改変された新規血清型を用いることができる（Yu et al., Gene Ther. 2009 Aug;16(8):953-62, Choudhury et al., Mol Ther. 2016 Aug;24(7):1247-57, Yang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 10;106(10):3946-51、及びＷＯ２０１９／２０７１３２を参照、それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる)。
ＡＡＶベクターを調製する場合、（１）プラスミドを用いる方法、（２）バキュロウイルスを用いる方法、（３）単純ヘルペスウイルスを用いる方法、（４）アデノウイルスを用いる方法、（５）酵母を用いる方法など、公知の方法を用いることができる（例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054等、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、プラスミドを用いる方法によりＡＡＶベクターを調製する場合、まず、野生型のＡＡＶのゲノム配列のうち両端の末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ(ＩＴＲ)）と、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡの代わりに挿入された、本発明のポリヌクレオチドとを含むベクタープラスミドを作製する。一方で、ウイルス粒子の形成に必要とされるＲｅｐタンパク質及びキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡは、別のプラスミドに挿入する。さらに、ＡＡＶの増殖に必要なアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、及びＥ４ｏｒｆ６）を含むプラスミドを、アデノウイルスヘルパープラスミドとして作製する。これら３種のプラスミドを、宿主細胞にコトランスフェクションすることにより、該細胞内において組換えＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生されるようになる。宿主細胞としては、前記ヘルパー作用を担う遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）のうちの一部を供給し得る細胞（例えば、２９３細胞等）を用いることが好ましく、そのような細胞を用いる場合には、該宿主細胞より供給され得るタンパク質をコードする遺伝子を、前記アデノウイルスヘルパープラスミドに搭載する必要がない。産生されたＡＡＶベクターは核内に存在する。よって、宿主細胞を凍結融解などで破壊し、ウイルスを回収し、次いでウイルス画分を、塩化セシウムを用いた密度勾配超遠心法やカラム法等で分離精製を行うことにより、所望のＡＡＶベクターを調製する。
ＡＡＶベクターは、安全性や遺伝子導入効率等の点から大きな利点があり、遺伝子治療に利用されている。しかしながら、ＡＡＶベクターに搭載可能なポリヌクレオチドのサイズに制限があることが知られている。例えば、本発明の一態様である、ｄＳａＣａｓ９とｍｉｎｉＶＲまたはｍｉｃｒｏＶＲとの融合タンパク質をコードする塩基配列、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域を標的とするｇＲＮＡをコードする塩基配列、並びにプロモーター配列としてＥＦＳプロモーター配列又はＣＫ８プロモーター配列、及びＵ６プロモーター配列を含むポリヌクレオチドの塩基長と、ＩＴＲ部とを含む全長は、約４.８５ｋｂであるので、単一のＡＡＶベクターに搭載することが出来る。
３．医薬組成物
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称することがある）を提供する。本発明の医薬組成物は、ＦＳＨＤの治療や予防に用いることができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む、医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称することがある）を提供する。本発明の医薬組成物は、ＦＳＨＤの治療や予防に用いることができる。
本発明の医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを有効成分として含み、かかる有効成分（即ち、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクター）と、通常、医薬的に許容される担体を含む製剤として調製され得る。
本発明の医薬組成物は、非経口に投与され、また局所的又は全身的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、又は筋肉内投与することができる。
本発明の医薬組成物の対象への投与量は、治療及び／又は予防有効量である限り特に限定されない。有効成分、剤形、対象の年齢及び体重、投与スケジュール、並びに投与方法等に応じて適宜最適化すればよい。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、ＦＳＨＤに罹患している対象だけでなく、遺伝的バックグラウンド解析等に基づき、将来的にＦＳＨＤを発症する可能性のある対象に対して予防的に投与することもできる。本明細書における「治療」との用語には、疾患の治癒に加えて、疾患の寛解も含まれる。また、「予防」との用語には、疾患の発症を防ぐことに加えて、疾患の発症を遅らせることも含まれ得る。また、本発明の医薬組成物は、「本発明の剤」等とも言い換えることができる。
４．ＦＳＨＤの治療又は予防方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＦＳＨＤの治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＦＳＨＤの治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。また、本発明には、ＦＳＨＤの治療又は予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターが含まれる。さらに、本発明には、ＦＳＨＤの治療又は予防用医薬組成物の製造における、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターの使用が含まれる。
本発明の方法は、上述した本発明の医薬組成物を、ＦＳＨＤを罹患する対象に投与することにより実施することができ、その投与量、投与経路、対象等は上記したものと同一である。
症状の測定は本発明の方法を用いた治療の開始前に行ってよく、また、治療に対する対象の応答を判定するための治療後の任意のタイミングでおこなってよい。
５．リボヌクレオプロテイン
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ。
本発明は、以下を含む、リボヌクレオプロテイン（以下、「本発明のＲＮＰ」と称することがある。）を提供する：
（ｃ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、及び
（ｄ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ。
本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、及びガイドＲＮＡとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」の項目において詳細に説明される、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、及びガイドＲＮＡを使用することができる。本発明のＲＮＰに含まれるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞や細菌、その他の生物体に導入して発現させることにより、あるいは該ポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムにより作製することができる。また、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、例えば、化学的に合成するか、あるいはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて、インビトロ翻訳システムを用いて作製することができる。このようにして作製された融合タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合することで、本発明のＲＮＰを調製することができる。必要に応じて、金粒子などの他の物質を混合してもよい。本発明のＲＮＰを標的細胞や組織等に直接送達するために、公知の方法により、該ＲＮＰは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル化してもよい。本発明のＲＮＰは、公知の方法により、標的細胞や組織等に導入することができる。ＬＮＰへのカプセル化や導入方法については、例えばLee K., et al., Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901, ＷＯ２０１６／１５３０１２等（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる）を参酌することができる。
本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト４番染色体（Ｃｈｒ４）のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に存在する以下の領域“１９０，０６５，５００－１９０，０６８，５００”及び“１９０，０４７，０００－１９０，０５２，０００”にある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長を標的とする。
本発明の一態様において、本発明のＲＮＰに含まれるガイドＲＮＡは、ヒト４番染色体（Ｃｈｒ４）のＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に存在する以下の領域“１９０，０６５，０００－１９０，０９３，０００”および“１９０，１７３，０００－１９０，１７６，０００”にある連続する１８～２４ヌクレオチド長、好ましくは２０～２３ヌクレオチド長、より好ましくは２１～２３ヌクレオチド長を標的とする。
６．その他
本発明はまた、以下を含む、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、ＦＳＨＤの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下を含む、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制するための組成物又はキットを提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、以下の（ｅ）及び（ｆ）を投与することを含む、ＦＳＨＤの治療又は予防方法を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
本発明はまた、ＦＳＨＤの治療又は予防用医薬組成物の製造における、以下（ｅ）及び（ｆ）の使用を提供する：
（ｅ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｆ）ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現制御領域における、配列番号２、３、４、８、１５、１７、１８、２０、２５、３１、３２、３３、３５、３９、４０、４２、４４、５０、５１、５２、５５、５７、５８、５９、６５、６７、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される連続する領域、好ましくは配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１１３、１１６、１３５、１３８、１４２、１４４、１４６、１５６、１５８、１６１、又は１７１で表される配列を含む塩基配列から選択される領域を標的とするガイドＲＮＡ、又は該ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
これらの発明で使用されるヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、転写抑制因子、ガイドＲＮＡ、並びにこれらをコードするポリヌクレオチド及びそれらが搭載されるベクターとしては、上記「１．ポリヌクレオチド」、「２．ベクター」や「５．リボヌクレオプロテイン」の項目において詳細に説明されるものが使用できる。上記（ｅ）及び（ｆ）の投与量、投与経路、対象、製剤等は「３．医薬組成物」の項目において説明したものと同様である。
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために与えられた以下の例示的な態様の記載によって明らかになるであろうが、それらに限定されることを意図するものではない。
本実施例では、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現調節領域において、遺伝子発現を抑制する転写抑制因子とｄＣａｓ９の融合タンパク質を使用し、ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を選択的に抑制することを述べる。また、本実施例では、他の遺伝子の発現に最小限の影響を与えることなく、ヒトＤＵＸ４遺伝子の選択的抑制を与える特定のゲノム領域の定義も記述されている。ヒトＤＵＸ４遺伝子の発現を抑制する本発明の方法は、本明細書に記載および例示されるように、ＦＳＨＤの新規な治療的または予防的戦略を表す。
（１）実験方法
ＤＵＸ４ターゲティング配列の選択－１
ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、ヒトＤＵＸ４遺伝子の推定プロモーター領域付近の約８ｋｂの配列をスキャンし、触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）とｇＲＮＡ（ここではターゲティング配列として定義）を複合化することによって標的となり得る配列を探した。ＤＵＸ４遺伝子に対する標的となったゲノム領域の位置を図１に示し、それらの座標を以下に示す：
ＤＵＸ４ターゲティング配列の選択－１
ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、ヒトＤＵＸ４遺伝子の推定プロモーター領域付近の約８ｋｂの配列をスキャンし、触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）とｇＲＮＡ（ここではターゲティング配列として定義）を複合化することによって標的となり得る配列を探した。ＤＵＸ４遺伝子に対する標的となったゲノム領域の位置を図１に示し、それらの座標を以下に示す：
1. Chr4: GRCh38/hg38; 190,065,500-190,068,500 -> ～３ｋｂ（プロモーターＡ）
2. Chr4: GRCh38/hg38; 190,047,000-190,052,000 -> ～５ｋｂ（プロモーターＢ）。
2. Chr4: GRCh38/hg38; 190,047,000-190,052,000 -> ～５ｋｂ（プロモーターＢ）。
ターゲティング配列は、ＮＮＧＲＲＴ（５’－２１ｎｔターゲティング配列－ＮＮＧＲＲＴ－３’）の配列を持つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する２１ヌクレオチドのセグメントで示した（表１－１～表１－３）。
ＤＵＸ４ターゲティング配列の選択－２
先の選択（ＤＵＸ４ターゲティング配列の選択－１）において、我々は、ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、ヒトＤＵＸ４遺伝子の推定プロモーター領域付近の約８ｋｂの配列中のターゲティング配列を調べた。今回、我々はＤ４Ｚ４反復領域とＤＵＸ４コード遺伝子の全体を含む、より広い領域に焦点を当てた。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）とｇＲＮＡを複合化することによって標的となり得る配列についてその領域をスキャンし、本明細書ではターゲティング配列として定義した。ＤＵＸ４遺伝子に対する標的となったゲノム領域の位置を図５に示し、それらの座標を以下に示す：
先の選択（ＤＵＸ４ターゲティング配列の選択－１）において、我々は、ヒト骨格筋細胞におけるゲノムのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃパターンに基づき、ヒトＤＵＸ４遺伝子の推定プロモーター領域付近の約８ｋｂの配列中のターゲティング配列を調べた。今回、我々はＤ４Ｚ４反復領域とＤＵＸ４コード遺伝子の全体を含む、より広い領域に焦点を当てた。触媒的に不活性なＳａＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異体；ｄＳａＣａｓ９）とｇＲＮＡを複合化することによって標的となり得る配列についてその領域をスキャンし、本明細書ではターゲティング配列として定義した。ＤＵＸ４遺伝子に対する標的となったゲノム領域の位置を図５に示し、それらの座標を以下に示す：
1. Chr4: GRCh38/hg38; 190,065,000-190,093,000 → ～２８ｋｂ（Ｄ４Ｚ４反復領域）
2. Chr4: GRCh38/hg38; chr4:190,173,000-190,176,000 → ～３ｋｂ（ＤＵＸ４遺伝子）。
2. Chr4: GRCh38/hg38; chr4:190,173,000-190,176,000 → ～３ｋｂ（ＤＵＸ４遺伝子）。
ターゲティング配列は、ＮＮＧＲＲＴ（５’－２１ｎｔターゲティング配列－ＮＮＧＲＲＴ－３’）の配列を持つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する２１ヌクレオチドのセグメントで示した（表２－１～表２－４）。
レンチウイルス導入プラスミド（ｐＥＤ３１６）の構築
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社(https://www.genscript.com)から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列に置き換え；ＳｐＣａｓ９－ＦＬＡＧをクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインに融合したｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａ変異体）に置き換えた。ＫＲＡＢ転写抑制ドメインは、プロモーターに局在すると、抑制エレメントをリクルートすることで遺伝子発現を抑制することができる。ＫＲＡＢはｄＳａＣａｓ９のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと称する）、そして、ターゲティング配列によって指示されるように、ヒトＤＵＸ４遺伝子の制御領域にターゲティングされる（表１及び２）。調製したバックボーンプラスミドはｐＥＤ３１６と名付けた。
ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社(https://www.genscript.com)から購入し、以下の変更を加えた：ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列をＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡスキャフォールド配列に置き換え；ＳｐＣａｓ９－ＦＬＡＧをクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインに融合したｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａ変異体）に置き換えた。ＫＲＡＢ転写抑制ドメインは、プロモーターに局在すると、抑制エレメントをリクルートすることで遺伝子発現を抑制することができる。ＫＲＡＢはｄＳａＣａｓ９のＣ末端に結合され（以下、ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと称する）、そして、ターゲティング配列によって指示されるように、ヒトＤＵＸ４遺伝子の制御領域にターゲティングされる（表１及び２）。調製したバックボーンプラスミドはｐＥＤ３１６と名付けた。
ｇＲＮＡクローニング
３つのネガティブコントロールノンターゲティング配列、３つのポジティブコントロールターゲティング配列、７６のターゲティング配列（表１）、及び８５のターゲティング配列（表２）をｐＥＤ３１６にクローニングした。フォワードおよびリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－２１塩基対ターゲティング配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－１９～２１塩基対の逆相補ターゲティング配列－（Ｃ）－３’（ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された）。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（New England Biolabs）で１０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。この反応液を９５℃まで加熱し、サーモサイクラーで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ３１６へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで消化してゲル精製したレンチウイルス導入プラスミドｐＥＤ３１６とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号：Ｍ０２０２Ｓ）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、１０μｌのＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＥＢカタログ番号：Ｃ３０４０Ｉ）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（gttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagatttttt;配列番号９７）と融合した個々のターゲティング配列によってコードされているｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの発現をＵ６プロモーターによって駆動する。
３つのネガティブコントロールノンターゲティング配列、３つのポジティブコントロールターゲティング配列、７６のターゲティング配列（表１）、及び８５のターゲティング配列（表２）をｐＥＤ３１６にクローニングした。フォワードおよびリバースオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により以下のフォーマットで合成された；フォワード；５’ＣＡＣＣ（Ｇ）－２１塩基対ターゲティング配列－３’、及びリバース；５’ＡＡＡＣ－１９～２１塩基対の逆相補ターゲティング配列－（Ｃ）－３’（ターゲットがＧで始まらない場合は括弧内の塩基が追加された）。オリゴはトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に１００μＭで再懸濁した。各相補オリゴ１μｌをＮＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３．１（New England Biolabs）で１０μｌの反応液（reaction）に添加した（combined）。この反応液を９５℃まで加熱し、サーモサイクラーで２５℃まで冷却することで、ｐＥＤ３１６へのクローニングに適合する粘着末端オーバーハングを持つオリゴをアニーリングした。アニーリングしたオリゴを、ＢｓｍＢＩで消化してゲル精製したレンチウイルス導入プラスミドｐＥＤ３１６とあわせ、製造元のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢカタログ番号：Ｍ０２０２Ｓ）でライゲーションした。２μｌのライゲーション反応液で、製造元のプロトコールに従って、１０μｌのＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＥＢカタログ番号：Ｃ３０４０Ｉ）を形質転換した。このようにして得られたコンストラクトは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（gttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagatttttt;配列番号９７）と融合した個々のターゲティング配列によってコードされているｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡの発現をＵ６プロモーターによって駆動する。
レンチウイルス調製
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞を６ウェル細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９２）に０．７５ｘ１０６細胞／ウェル（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）、又は１ｘ１０６細胞／ウェル（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）で播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地）中で、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ｄｅｌｔａ Ｒ８．２； ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６３を参照）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ； ａｄｄｇｅｎｅ ＃８４５４を参照）］、およびｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む１μｇの導入プラスミドｐＥＤ３１６を用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）後又は７２時間（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）後に、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（ＶＷＲ カタログ番号：１０２１８－４８８）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。
ＨＥＫ２９３ＴＡ細胞を６ウェル細胞培養皿（ＶＷＲカタログ番号：１００６２－８９２）に０．７５ｘ１０６細胞／ウェル（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）、又は１ｘ１０６細胞／ウェル（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）で播種し、２ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳと２ｍＭの新鮮なＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地）中で、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間培養した。翌日、１．５μｇのパッケージングプラスミドミックス［１μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ｄｅｌｔａ Ｒ８．２； ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６３を参照）と０．５μｇのエンベロープ発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ； ａｄｄｇｅｎｅ ＃８４５４を参照）］、およびｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと示されたｓｇＲＮＡをコードする配列を含む１μｇの導入プラスミドｐＥＤ３１６を用いて、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮトランスフェクション反応を製造元のプロトコールに従ってセットアップした。トランスフェクションから４８時間（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）後又は７２時間（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）後に、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（ＶＷＲ カタログ番号：１０２１８－４８８）に培地の上清を通すことにより、レンチウイルスを回収した。精製して分注したレンチウイルスは、使用するまで－８０℃の冷凍庫で保存した。
ＦＳＨＤ患者由来のリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）のトランスダクション
表１にリストアップされたターゲティング配列を用いた場合：
ＦＳＨＤ患者由来の２つのＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）ＧＭ１６３４３とＧＭ１６４１４はＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。細胞は、１５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。トランスダクションにあたっては、１００，０００個の細胞を８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＴＲ－１００３－Ｇ）と混合し、各ｓｇＲＮＡ（表１）に対応する２００μｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェル（９６ウェルプレート）に添加した。細胞およびウイルスの混合物を１２００ｘｇ、３７℃で１時間スピンダウンした後、０．２５－０．５×１０６細胞／ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３－１００ＭＧ）を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１５日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
表１にリストアップされたターゲティング配列を用いた場合：
ＦＳＨＤ患者由来の２つのＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）ＧＭ１６３４３とＧＭ１６４１４はＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。細胞は、１５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。トランスダクションにあたっては、１００，０００個の細胞を８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＴＲ－１００３－Ｇ）と混合し、各ｓｇＲＮＡ（表１）に対応する２００μｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェル（９６ウェルプレート）に添加した。細胞およびウイルスの混合物を１２００ｘｇ、３７℃で１時間スピンダウンした後、０．２５－０．５×１０６細胞／ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３－１００ＭＧ）を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから７－１５日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
表２にリストアップされたターゲティング配列を用いた場合：
ＦＳＨＤ患者由来のＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）ＧＭ１６３４３はＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。細胞は、１５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。トランスダクションにあたっては、５００，０００個の細胞を６．６６μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＴＲ－１００３－Ｇ）と混合し、各ｓｇＲＮＡ（表２）に対応する５００μｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェル（２４ウェルプレート）に添加した。細胞およびウイルスの混合物を１２００ｘｇ、３７℃で１時間スピンダウンした後、０．５×１０６細胞／ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３－１００ＭＧ）を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから１４－１７日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
ＦＳＨＤ患者由来のＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）ＧＭ１６３４３はＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。細胞は、１５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。トランスダクションにあたっては、５００，０００個の細胞を６．６６μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＴＲ－１００３－Ｇ）と混合し、各ｓｇＲＮＡ（表２）に対応する５００μｌのレンチウイルス上清（上記参照）を各ウェル（２４ウェルプレート）に添加した。細胞およびウイルスの混合物を１２００ｘｇ、３７℃で１時間スピンダウンした後、０．５×１０６細胞／ｍｌの新鮮な培地に再懸濁した。トランスダクションから７２時間後、細胞に選択培地［０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：Ｐ８８３３－１００ＭＧ）を添加した増殖培地］を与えた。細胞には２－３日ごとに新鮮な選択培地を与えた。細胞を選択培地に入れてから１４－１７日後、細胞を回収し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：７４１８２）でＲＮＡを抽出した。
遺伝子発現解析
遺伝子発現解析のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：４３６８８１３）のプロトコールに従って、約０．５～０．８μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＤＵＸ４：カスタム設計された； ＭＢＤ３Ｌ２： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００５４４７４３＿ｍ１； ＴＲＩＭ４３： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００２９９１７４＿ｍ１； ＺＳＣＡＮ４： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００５３７５４９＿ｍ１； ＨＰＲＴ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１ ＶＩＣ＿ＰＬ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘのプロトコールに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を進め解析した。
遺伝子発現解析のために、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号：４３６８８１３）のプロトコールに従って、約０．５～０．８μｇの全ＲＮＡから１０μｌの容量でｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを１０倍に希釈し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて製造元のプロトコールに従って解析した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＤＵＸ４：カスタム設計された； ＭＢＤ３Ｌ２： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００５４４７４３＿ｍ１； ＴＲＩＭ４３： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００２９９１７４＿ｍ１； ＺＳＣＡＮ４： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ００５３７５４９＿ｍ１； ＨＰＲＴ： Ａｓｓａｙ Ｉｄ Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１ ＶＩＣ＿ＰＬ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘのプロトコールに従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を進め解析した。
データ解析
各サンプルとコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られた標的遺伝子（ＤＵＸ４、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３及びＺＳＣＡＮ４）プローブのＣｔ値の平均値をＨＰＲＴプローブの平均値から差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ｃｔ ＤＵＸ４ －平均Ｃｔ ＨＰＲＴ）。次いで、３つのコントロールｓｇＲＮＡの平均ｄｅｌｔａＣｔを算出した。次に、各サンプルとコントロールのｄｅｌｔａＣｔをコントロールの平均ｄｅｌｔａＣｔから差し引き、各サンプルとコントロールのｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ値を得た。次いで、正規化した発現値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を、各サンプル及びコントロールについて、２－（ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ）の式を用いて求めた。この場合、各コントロールの個々の発現値は、３つのコントロールサンプル全ての平均発現値に対して正規化される。コントロールサンプルを示すグラフの棒は、３つの別々の実験における３つのコントロールの平均である。
各サンプルとコントロールについて、３回の技術的反復実験から得られた標的遺伝子（ＤＵＸ４、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３及びＺＳＣＡＮ４）プローブのＣｔ値の平均値をＨＰＲＴプローブの平均値から差し引くことにより、ｄｅｌｔａＣｔ値を算出した（平均Ｃｔ ＤＵＸ４ －平均Ｃｔ ＨＰＲＴ）。次いで、３つのコントロールｓｇＲＮＡの平均ｄｅｌｔａＣｔを算出した。次に、各サンプルとコントロールのｄｅｌｔａＣｔをコントロールの平均ｄｅｌｔａＣｔから差し引き、各サンプルとコントロールのｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ値を得た。次いで、正規化した発現値（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を、各サンプル及びコントロールについて、２－（ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ）の式を用いて求めた。この場合、各コントロールの個々の発現値は、３つのコントロールサンプル全ての平均発現値に対して正規化される。コントロールサンプルを示すグラフの棒は、３つの別々の実験における３つのコントロールの平均である。
（２）結果
ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢ：ｓｇＲＮＡによるＤＵＸ４遺伝子の発現抑制について
最初のｓｇＲＮＡスクリーニング実験では、ＦＳＨＤ患者由来のＬＣＬにｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと各ターゲティング配列のｓｇＲＮＡの発現カセットを送達するレンチウイルスを作製した。形質転換された細胞を、７日間（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）または１４日間（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）、ピューロマイシンに対する耐性について選択し、ＤＵＸ４発現をＴａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いて定量化した。各サンプルの発現値は、コントロールｓｇＲＮＡを導入した細胞におけるＤＵＸ４発現の平均値で正規化した。
ｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢ：ｓｇＲＮＡによるＤＵＸ４遺伝子の発現抑制について
最初のｓｇＲＮＡスクリーニング実験では、ＦＳＨＤ患者由来のＬＣＬにｄＳａＣａｓ９－ＫＲＡＢと各ターゲティング配列のｓｇＲＮＡの発現カセットを送達するレンチウイルスを作製した。形質転換された細胞を、７日間（表１にリストアップされたターゲティング配列の場合）または１４日間（表２にリストアップされたターゲティング配列の場合）、ピューロマイシンに対する耐性について選択し、ＤＵＸ４発現をＴａｑｍａｎ Ａｓｓａｙを用いて定量化した。各サンプルの発現値は、コントロールｓｇＲＮＡを導入した細胞におけるＤＵＸ４発現の平均値で正規化した。
表１にリストアップされたターゲティング配列を用いた場合：
図２に示すように、調べた７６の配列のうち、２７のターゲティング配列が２つのＬＣＬのいずれかでＤＵＸ４ ｍＲＮＡの発現を少なくとも５０％ダウンさせた（図２および表３）。
図２に示すように、調べた７６の配列のうち、２７のターゲティング配列が２つのＬＣＬのいずれかでＤＵＸ４ ｍＲＮＡの発現を少なくとも５０％ダウンさせた（図２および表３）。
次に、最初のスクリーニングで同定されたこれら２７個の最も強力な候補ｓｇＲＮＡを用いた検証スクリーニングを実施した。今回は、より長く処理することでより優れた抑制効果が得られる可能性を探るため、導入細胞を１５日間ピューロマイシンに対する耐性で選択した。図３に示すように、７つのｓｇＲＮＡターゲティング配列が、２つのＬＣＬの両方でＤＵＸ４ ｍＲＮＡの発現を少なくとも５０％ダウンさせ、ｓｇＲＮＡ－＃２は約９９％の抑制を示した。この結果は、ある種のｓｇＲＮＡでは、より長く処理することで抑制力が大きく向上することも示唆した。
ＤＵＸ４の発現は、生殖細胞系列や発生初期に発現する遺伝子を含む多くの下流標的の異常なアップレギュレーションを引き起こす。ＴＲＩＭ４３、ＺＳＣＡＮ４及びＭＢＤ３Ｌ２はＤＵＸ４の下流の標的であり、本研究で用いたＦＳＨＤ患者由来ＬＣＬ培養物でも発現がアップレギュレートされていることがわかった。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを介したＤＵＸ４の抑制が、これらのＤＵＸ４標的遺伝子の抑制にもつながるかどうかを調べるため、検証実験で同定した最も強力なｓｇＲＮＡで処理したサンプルからＴＲＩＭ４３、ＺＳＣＡＮ４及びＭＢＤ３Ｌ２のレベルを測定した。予想通り、これらのｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ：ｓｇＲＮＡはすべて、３つのＤＵＸ４標的の発現を内因性レベルの～５０－９９％まで有意に低下させ（図４）、抑制効力はＤＵＸ４抑制効力と強く相関している（表４）。
表２にリストアップされたターゲティング配列を用いた場合：
８５の新しいターゲティング配列に加えて、比較する為に、ＤＵＸ４発現を抑制することが以前に知られている３つの追加のターゲティング配列（ｓｇＤＵＸ４－２、２０、５１）を調べた。
調べた８５の新しいターゲティング配列のうち、１１のターゲティング配列が、３つのスクリーニング実験から少なくとも５０％のＤＵＸ４ ｍＲＮＡ発現の平均ダウンレギュレーションを示した（図６）。これらの１１のターゲティング配列のうち、６つのターゲティング配列は、３つの個々のスクリーニング実験すべてにおいて、コントロールの非ターゲティング配列と比較して６０％未満のＤＵＸ４発現をもたらした［グループ１］。１１個のターゲティング配列のうち他の５個は、３つの個々のスクリーニング実験のうちの２つで６０％未満のＤＵＸ４発現をもたらした［グループ２］（図６、表５）。
８５の新しいターゲティング配列に加えて、比較する為に、ＤＵＸ４発現を抑制することが以前に知られている３つの追加のターゲティング配列（ｓｇＤＵＸ４－２、２０、５１）を調べた。
調べた８５の新しいターゲティング配列のうち、１１のターゲティング配列が、３つのスクリーニング実験から少なくとも５０％のＤＵＸ４ ｍＲＮＡ発現の平均ダウンレギュレーションを示した（図６）。これらの１１のターゲティング配列のうち、６つのターゲティング配列は、３つの個々のスクリーニング実験すべてにおいて、コントロールの非ターゲティング配列と比較して６０％未満のＤＵＸ４発現をもたらした［グループ１］。１１個のターゲティング配列のうち他の５個は、３つの個々のスクリーニング実験のうちの２つで６０％未満のＤＵＸ４発現をもたらした［グループ２］（図６、表５）。
次に、最初のスクリーニングで同定された６種類の最も強力な候補ｓｇＲＮＡを用いた検証スクリーニングを実施した［グループ１］。今回は、より長く処理することでより優れた抑制効果が得られる可能性を探るため、導入細胞を、１７日間ピューロマイシンに対する耐性で選択した（図７）。
ＤＵＸ４の発現は、生殖細胞系列や発生初期に発現する遺伝子を含む多くの下流標的の異常なアップレギュレーションを引き起こす。ＴＲＩＭ４３、ＺＳＣＡＮ４及びＭＢＤ３Ｌ２はＤＵＸ４の下流の標的であり、本研究で用いたＦＳＨＤ患者由来ＬＣＬ培養物でも発現がアップレギュレートされていることがわかった。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを介したＤＵＸ４の抑制が、これらのＤＵＸ４標的遺伝子の抑制にもつながるかどうかを調べるため、検証実験で同定した最も強力なｓｇＲＮＡで処理したサンプルからＴＲＩＭ４３、ＺＳＣＡＮ４及びＭＢＤ３Ｌ２のレベルを測定した。予想通り、これらのｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ：ｓｇＲＮＡはすべて、３つのＤＵＸ４標的の発現を有意に低下させ（図７）、抑制効力はＤＵＸ４抑制効力と強い相関があった（表６）。
本発明によれば、ヒト細胞内でＤＵＸ４遺伝子の発現が抑制され得る。即ち、本発明は、ＦＳＨＤの治療及び／又は予防に極めて有用であると期待される。
数字的な限界又は範囲が記載されている場合には、その両端も含まれる。さらに、数字的な限界又は範囲の中にあるすべての数値及びサブレンジもまた、あたかも明示的に記述されたかのように、明確に含まれる。
本明細書では、「ａ」や「ａｎ」等の単語は、「１以上」という意味を有する。
明らかに、上記の教示に照らして、本発明の多くの改変と変更が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施することができることが理解される。
上述のすべての特許及びその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。
本出願は、米国で出願された米国仮出願（Ｎｏ．６３／０７２，３２７、出願日：２０２０年８月３１日）及び米国仮出願（Ｎｏ．６３／２３５，３５９、出願日：２０２１年８月２０日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
数字的な限界又は範囲が記載されている場合には、その両端も含まれる。さらに、数字的な限界又は範囲の中にあるすべての数値及びサブレンジもまた、あたかも明示的に記述されたかのように、明確に含まれる。
本明細書では、「ａ」や「ａｎ」等の単語は、「１以上」という意味を有する。
明らかに、上記の教示に照らして、本発明の多くの改変と変更が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施することができることが理解される。
上述のすべての特許及びその他の文献は、この参照により、詳細に記載されている場合と同じように、ここに完全に組み入れられる。
本出願は、米国で出願された米国仮出願（Ｎｏ．６３／０７２，３２７、出願日：２０２０年８月３１日）及び米国仮出願（Ｎｏ．６３／２３５，３５９、出願日：２０２１年８月２０日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (16)
- 以下の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ａ）ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列、及び
（ｂ）配列番号２、３、４、２０、５１、６８、１３８、１４２、１４６、１５６、１５８、又は１６１で表される塩基配列を含む、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列、ここでヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のｄＣａｓ９である。 - 少なくとも２種類のガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
- 転写抑制因子が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＳＩＮ３Ａ、ＨＤＴ１、ＭＢＤ２Ｂ、ＮＩＰＰ１、及びＨＰ１Ａからなる群より選択される、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
- 転写抑制因子が、ＫＲＡＢである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列及び／又はヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーター、ＳＮＲ６プロモーター、ＳＮＲ５２プロモーター、ＳＣＲ１プロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、Ｕ３プロモーター、及びＨ１プロモーターからなる群より選択される、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
- ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、Ｕ６プロモーターである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
- ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と転写抑制因子との融合タンパク質をコードする塩基配列に対するプロモーター配列が、ユビキタスなプロモーター又は神経特異的プロモーターである、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- ユビキタスなプロモーターが、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
- ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５８７ＭＴＰ、ＡＡＶ５８８ＭＴＰ、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶＭ４１、及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される、請求項１２に記載のベクター。
- ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９である、請求項１３に記載のベクター。
- 請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１０～１４のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
- ＦＳＨＤを治療又は予防するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
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