JP7737667B2 - 核酸複合体 - Google Patents

核酸複合体

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Description

本発明は、神経系、例えば中枢神経系においてアンチセンス効果をもたらし得る核酸複合体又はその塩、及びそれを含む組成物等に関する。
近年、核酸医薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性及び低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸医薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法とは、標的遺伝子より転写されたmRNAやmiRNAの部分配列を標的センス鎖として、それに相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書ではしばしば「ASO（AntiSense Oligonucleotide）」と表記する）を細胞に導入することによって、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現やmiRNAの活性を選択的に改変又は阻害することを含む方法である。
特許文献１では、第1オリゴマー化合物、及びコレステロール等の共役基を含む第2オリゴマー化合物からなり、肝外組織若しくは肝外細胞、又は肝組織若しくは肝細胞における標的核酸の量や活性を調節することのできる二本鎖核酸分子や、該二本鎖核酸分子からなるアンチセンス化合物が開示されている。
ところで、脳を含む中枢神経系においてアンチセンス効果を発揮させるためには前記ASO等の核酸剤を中枢神経系に送達させる必要がある。しかし、脳には、血液又は脳脊髄液を介して脳へ移行される物質を選択し、制限する血液脳関門（Blood Brain Barrier：以下、本明細書ではしばしば「BBB」と表記する）、血液脳脊髄液関門（Blood-cerebrospinal fluid barrier、以下、本明細書ではしばしば「BCSFB」と表記する）、脳脊髄液関門（cerebrospinal fluid-brain barrier、以下、本明細書ではしばしば「CSFBB」と表記する）等と呼ばれる機構が存在する。このBBB機構、BCSFB機構及び／又はCSFBB機構等は、有害物質から脳を保護する一方で、脳への薬剤送達の障壁にもなっている。それ故に脳を含む中枢神経系へASO等の核酸剤を送達する方法が求められている。
国際公開第2017/053999号
本発明は、神経系、例えばBBB機構、BCSFB機構及び／又はCSFBB機構等（本明細書では、これらをまとめてしばしば「BBB等」と略記する場合がある）により薬剤送達が阻まれる中枢神経系へ効率的に送達され、かつ送達場所で標的転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす核酸剤、及びそれを含む組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ASOと、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体を結合させたASOの相補鎖とをアニールさせた核酸複合体が中枢神経系に効率的に送達され、そこで高いアンチセンス効果を示すことを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の態様を包含する。
（１）第１核酸鎖と第２核酸鎖とを含む核酸複合体又はその塩であって、
該第１核酸鎖は標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第２核酸鎖は該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合しており、
該第１核酸鎖は該第２核酸鎖にアニールしている前記核酸複合体又はその塩（本明細書では、これらをまとめてしばしば「本発明の核酸複合体」と略記する場合がある）。
（２）ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している第１核酸鎖であって、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する、前記核酸鎖又はその塩。
（３）第２核酸鎖、又は第１核酸鎖が、一般式Iで表されるリンカーを介して、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している、（１）又は（２）に記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（４）ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が、置換されていない直鎖Ｃ２２～２４又は直鎖Ｃ２６アルキル基である、（１）～（３）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（５）前記第１核酸鎖が少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、（１）～（４）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（６）前記第１核酸鎖がギャップマーである、（１）～（５）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（７）前記第２核酸鎖が前記第１核酸鎖中の少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドを含む、（１）～（６）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（８）前記第１核酸鎖がミックスマーである、（１）～（４）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（９）前記第１核酸鎖が１３～２０塩基長である、（１）～（８）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（１０）前記第２核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、（１）～（９）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（１１）前記第２核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び／又は糖修飾ヌクレオシドから成る、（１）～（１０）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩。
（１２）（１）～（１１）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩を含む、中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
（１３）中枢神経系疾患治療用である、（１２）に記載の組成物。
（１４）（１）～（１１）のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖又はその塩を含む、中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
（１５）前記中枢神経系が大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、及び脊髄からなる群から選択される、（１２）～（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）前記中枢神経系が前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄及び腰髄からなる群から選択される、（１２）～（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１７）静脈内投与用又は皮下投与用である、（１２）～（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）１回の投与量中に5mg/kg以上の前記核酸複合体、核酸鎖又はその塩を含む、（１２）～（１７）のいずれかに記載の組成物。
（１９）前記核酸複合体、核酸鎖又はその塩が、血中から脳（脳実質）へ移行する、（１２）～（１８）のいずれかに記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-168930号の開示内容を包含する。
本発明により、中枢神経系へ効率的に送達し、かつ送達場所でアンチセンス効果をもたらす核酸剤、及びそれを含む組成物を提供することができる。
図1は、本発明で用いる核酸複合体の特定の実施形態の例を示す模式図である。この図では、第2核酸鎖におけるヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体（図中では単に「アルキル基」と記載する）の結合位置による2つの様式を示している。図1aは、第2核酸鎖の5'末端にヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が結合している核酸複合体を示す。図1bは、第2核酸鎖の3'末端にヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が結合している核酸複合体を示す。 図2は、アンチセンス法の一般的な機構の一例を示す図である。図中、「X」は遺伝子の発現から翻訳までの工程で抑制又は阻害する箇所を示す。破線内の図は、ヘテロ二本鎖部分がRNase Hによって認識され、標的遺伝子のmRNAが分解される模式図である。 図3は、様々な架橋核酸の構造を示す図である。 図4は、様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す図である。
＜核酸複合体＞
本発明の第１態様は、核酸複合体である。本核酸複合体は、血中から脳（脳実質）へ移行すること、例えばBBB等通過することが可能であってもよい。本核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。核酸複合体において、第1核酸鎖は、第2核酸鎖にアニールしている。一実施形態では、第2核酸鎖は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している。
前記核酸複合体の代表的な模式図を図1に示す。図1aは、第2核酸鎖の5'末端にヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が結合している核酸複合体を示す。図1bは、第2核酸鎖の3'末端にヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が結合している核酸複合体を示す。しかし、後述のように、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、第2核酸鎖の5'末端、3'末端又は両端に結合していてもよく、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに結合していてもよい。
一実施形態において、第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。特定の実施形態において、第1核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物又は標的転写産物に対してアンチセンス効果を有するヌクレオチド鎖である。
一実施形態において、本発明は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している一本鎖核酸鎖に関する。本核酸鎖は、血中から脳（脳実質）へ移行すること、例えばBBB等を通過することが可能であってもよい。該核酸鎖は、前記核酸複合体の第1核酸鎖に相当するもので、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。特定の実施形態において、該核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物又は標的転写産物に対してアンチセンス効果を有するヌクレオチド鎖である。
（用語の定義）
本明細書において「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の標的となり得、かつDNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。一般的には標的遺伝子の転写産物が該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)を含み得る。
本明細書において「標的遺伝子」は特に限定されないが、例えば、本発明に係る核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。また、標的転写産物には、標的遺伝子をコードするゲノムDNAから転写されるmRNAであり、さらにまた、塩基修飾を受けていないmRNA、プロセシングされていないmRNA前駆体等を含む。「標的転写産物」は、mRNAだけでなく、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)も含み得る。さらに一般的に「転写産物」は、DNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAであってよい。一実施形態では、「標的転写産物」は、例えば、転移関連肺腺癌転写産物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本明細書ではしばしば「Malat1」と表記する）、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：本明細書ではしばしば「SR-B1 mRNA」と表記する)、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ(myotonic dystrophy protein kinase、本明細書ではしばしば「DMPK」と表記する)、トランスサイレチン (transthyretin：本明細書ではしばしば「TTR」と表記する)、又はアポリポ蛋白Ｂ(Apolipoprotein B：本明細書ではしばしば「ApoB」と表記する)の遺伝子、例えばこれらのノンコーディングRNA又はmRNAであってもよい。配列番号3にマウスMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を、配列番号4にヒトMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を示す。また、配列番号5にマウスSR-B1 mRNAの塩基配列を、配列番号6にヒトSR-B1 mRNAの塩基配列を示す。そして、配列番号7にマウスDMPK mRNAの塩基配列を、配列番号8にヒトDMPK mRNAの塩基配列を示す。なお、配列番号3～8は、いずれもmRNAの塩基配列をDNAの塩基配列に置き換えている。これらの遺伝子及び転写産物の塩基配列情報は、例えばNCBI(米国国立生物工学情報センター)データベース等の公知のデータベースから入手できる。
本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）」又は「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物の少なくとも一部、例えば、任意の標的領域にハイブリダイズ可能な相補的塩基配列を含み、アンチセンス効果によってその標的遺伝子の転写産物の発現又は標的転写産物のレベルを抑制制御し得る一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本発明の核酸複合体では、第１核酸鎖がASOとして機能し、その標的領域は、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他のいずれの核酸領域を含んでいてもよい。標的転写産物の標的領域は、少なくとも8塩基長、例えば、10～35塩基長、12～25塩基長、13～20塩基長、14～19塩基長、又は15～18塩基長とすることができる。
「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物（例えばRNAセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、その標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、スプライシング機能改変効果（例えばエクソンスキッピング等）、又は転写産物の分解をいう。例えば、図２で示すように、翻訳の阻害では、オリゴヌクレオチド(例、RNA)がASOとして細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNA等に結合して部分的二本鎖が形成される。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（図２破線外×印）。一方、DNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される(図２破線内)。これは、「RNase H依存性経路」と称される。さらに、特定の例において、アンチセンス効果は、mRNA前駆体のイントロンを標的化することによってもたらされ得る。アンチセンス効果はまた、miRNAを標的化することによってもたらされてもよく、この場合、当該miRNAの機能は阻害され、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現は増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」とは、モノマーであればヌクレオシド又はヌクレオチドを、オリゴマーであればオリゴヌクレオチドを、またポリマーであればポリヌクレオチド意味する。
「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
本明細書中で使用される用語「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、それぞれ「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称することもある。同様に、「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性により、天然型よりも好ましい。
本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。
本明細書において「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドをいう。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。本明細書において、二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」と称することもある。図３に架橋核酸を一部例示する。
二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)の1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-O CH2O-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNAに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)、例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA(例、R=H、Me) (2',4'-BNANC(例、R=Hは2',4'-BNANC[N-H]、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me])としても知られている)、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミド架橋型核酸(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(例、R=H、Me)(AmNA(例、R=HはAmNA[N-H]、R=MeはAmNA [N-Me])としても知られている)、グアニジン架橋型核酸(GuNA(例、図3のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me])としても知られている)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)、アミン架橋型核酸(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。本明細書において、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを「LNAヌクレオシド」と称することもある。
本明細書において、「カチオン性ヌクレオシド」は、あるpH（たとえば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（たとえば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、中性形態（リボヌクレオシドの中性形態等）と比較して、カチオン形態として存在する修飾ヌクレオシドである。カチオン性ヌクレオシドはヌクレオシドの任意の位置に１つ以上のカチオン性修飾基を含んでもよい。一実施形態では、カチオン性ヌクレオシドは、アミン架橋型核酸(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)、アミノアルキル修飾核酸（例、2'-O-メチル及び4'-CH2CH2CH2NH2置換体)、グアニジン架橋型核酸(GuNA(例、図3のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me])等である。
本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。
「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸(-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ)が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。モルホリノ核酸の構造の一例を図４に示す。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性を有する。したがって、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステル結合）からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合をいう。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むリン含有ヌクレオシド間結合とリン原子を含まない非リン含有ヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合(米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合)、アルキルホスホネート結合(例、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合)、アルキルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、以下の構造：
）、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合及びホスホロアミデート結合等が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合である。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
ヌクレオシド間結合がキラル中心を有する場合、ヌクレオシド間結合はキラル制御されたものであってもよい。「キラル制御された」とは、キラル中心、例えばキラル結合リンに関して単一のジアステレオマーで存在することを意図する。キラル制御されたヌクレオシド間結合は、完全にキラル純粋なものであってもよいし、キラル純度が高いもの、例えば90%de、95%de、98%de、99%de、99.5%de、99.8%de、99.9%de、又はそれ以上のキラル純度を有するものであってよい。本明細書において「キラル純度」は、ジアステレオマーの混合物中の1つのジアステレオマーの割合を指し、ジアステレオマー過剰率(%de)として表され、(対象のジアステレオマー－その他のジアステレオマー)／(総ジアステレオマー)×100(%)として定義される。
例えば、ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合、環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、以下の構造：
）等）であってよい。キラル制御されたヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばRp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48(3), 496-9、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317、Natsuhisa Oka et al.,J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2016, 81, 2753-2762、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7913-7922に記載の方法に従って合成することができる。Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合も公知であり、例えばNaoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol,. 2017, 35(9), 845-851、Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(3), 238-248に記載されるような効果を奏することが知られている。
本明細書において「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。修飾核酸塩基の例としては、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン、N4-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、8-ブロモアデニン、N2-メチルグアニン、又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」とは、天然核酸塩基と同義であり、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、並びにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を意味する。
本明細書において「修飾糖」とは、天然糖部分（すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分）からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指す。本明細書において核酸鎖は、場合により修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含んでいてもよい。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA、LNA、ENA、AmNA(AmNA[N-H]、AmNA[N-Me])、GuNA(GuNA[N-H]、GuNA[N-Me])、scpBNA、2',4'-BNANC(2',4'-BNANC[N-H]、2',4'-BNANC[N-Me])、2',4'-BNAcoc等)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書において、修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-OMe基若しくは2'-O-メチル基)、及び2'-O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及びO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。本明細書において「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。
修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分(天然、修飾、又はそれらの組み合わせ)は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されてよい。
一般的には、修飾は、同一鎖中のヌクレオチドが独立して異なる修飾を受けることができるように実施することができる。また、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同一のヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合(例えば、ホスホロチオエート結合)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。同一のヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。
核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、本発明の核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70％以上、80％以上又は90％以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対（天然型塩基対）又は非ワトソン-クリック塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成し得る関係を意味する。本発明において、第1核酸鎖は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。同様に、第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。
本明細書において「アルキル基」は、直鎖状又は分岐状の、非環状飽和脂肪族炭化水素を意味する。例えば、炭素数1～35の直鎖状又は分枝状のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1-エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、オクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、1-ヘキサデシルヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル、ヘントリアコンチル、ドトリアコンチル、トリトリアコンチル、テトラトリアコンチル、ペンタトリアコンチル等があげられる。
本明細書中で使用される用語「血液脳関門（BBB）」は、前述のように、脳へ移行する物質を選択及び制限する機構であり、脳を有害物質から保護する役割を担っている。
本明細書中で使用される用語「血液脳脊髄関門（BCSFB）」は、脈絡叢に存在し、BBBと同様に脳へ移行される物質を選択し、制限する機構である。
本明細書中で使用される用語「脳脊髄液関門（CSFBB）」は、BBBと同様に脳へ移行される物質を選択し、制限する機構である。
本明細書中で使用される用語「中枢神経系」とは、脳及び脊髄からなり、末梢神経系と共に神経系を構成する組織である。脳は、大脳(大脳皮質、大脳白質、大脳基底核)、間脳(視床、視床下核)、小脳(小脳皮質、小脳核)及び脳幹(中脳、黒質、橋、延髄)を含む。また、脊髄は、頸髄、胸髄、腰髄、仙髄及び尾髄を含む。本明細書における中枢神経系は、これらのいずれの領域であってもよいが、大脳皮質(前頭葉、側頭葉、頭頂葉、後頭葉)、小脳、線条体、淡蒼球、前障、海馬、海馬傍回、脳幹、頸髄、胸髄又は腰髄が好ましい。
本明細書中で使用される用語「脳実質」とは、神経細胞及び／又はグリア細胞(例、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア)からなる脳組織であり、大脳、間脳、小脳及び脳幹(中脳、後脳、延髄)の脳組織を含む。
本明細書において、「その塩」とは、本発明の核酸複合体の塩であって、本発明の核酸複合体の生理学的に及び製薬上許容される塩、すなわち、当該核酸複合体の所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、ジオラミン塩、メグルミン塩 のようなアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体は、核酸複合体の任意の薬学的に許容される塩、核酸複合体のエステル、又は当該エステルの塩を包含する。好適な薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩、カリウム塩及びメグルミン塩が挙げられるが、これらに限定されない。
（第1核酸鎖と第2核酸鎖の構成）
一態様において、本発明は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体に関する。
第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、標的転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす一本鎖オリゴヌクレオチド鎖である。
第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド鎖である。第2核酸鎖は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している。核酸複合体において、第2核酸鎖は、相補的塩基対の水素結合を介して第1核酸鎖にアニールしている。
一実施形態において、本発明は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している一本鎖核酸鎖に関する。該一本鎖核酸の構成は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と連結している以外は、第1核酸鎖と同一である。また、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体の構成、及びその核酸鎖との連結の形態は、本明細書において核酸複合体において記載する通りである。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、通常、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよいが、特に限定されない。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、約100塩基長であってもよいし、又は、10～35塩基長、12～25塩基長、13～20塩基長、14～19塩基長、若しくは15～18塩基長であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1～3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるために好ましい。一実施形態で、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の全てのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、あるpH（たとえば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（たとえば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、当該修飾ヌクレオシド間結合が、アニオン形態（たとえば、-O-P(O)(O-)-O-（天然リン酸結合のアニオン形態）、-O-P(O)(S-)-O-（（ホスホロチオエート結合のアニオン形態）等）と比較して、中性形態又はカチオン形態として存在する非負荷電（それぞれ中性又はカチオン性の）ヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、中性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、カチオン性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合（たとえば、中性のヌクレオシド間結合）は、その中性形態をとるとき、pKaが8未満、9未満、10未満、11未満、12未満、13未満、又は14未満の部分を有さない。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、たとえば、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合等である。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、トリアゾール部分又はアルキン部分を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、環状グアニジン部分を含む。一実施形態では、環状グアニジン部分を含む修飾ヌクレオシド間結合は、
の構造を有する。一実施形態では、環状グアニジン部分を含む中性のヌクレオシド間結合は、キラル制御される。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つの中性のヌクレオシド間結合及び少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、少なくともいくつかの場合では、中性のヌクレオチド間結合は、中性のヌクレオチド間結合を含まない同等の核酸と比較して特性及び／又は活性を改善することができ、たとえば、送達を改善し、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する耐性を改善し、細胞取り込みを改善し、エンドソーム脱出を改善し、及び／又は核取り込みを改善する等する。
一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合（好ましくは、中性のヌクレオシド間結合）を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシド間結合は、RNase耐性の高いホスホロチオエート結合のような修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端にホスホロチオエート修飾等の修飾ヌクレオシド間結合を含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が向上するので好ましい。
第2核酸鎖の5’末端及び3’末端において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と未結合の末端の2～6個の塩基のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合（例えばホスホロチオエート結合)であってもよい。
第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシドは、例えば、RNase耐性の高い2'F-RNA、2'-OMe等の修飾ヌクレオシドであってもよい。第2核酸鎖の3'末端に2'F-RNA、2'-OMe等の修飾ヌクレオシドを含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が高まるために好ましい。
第2核酸鎖の5’末端及び3’末端において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と未結合の末端の1～5個のヌクレオシドは、例えば、RNase耐性の高い2'F-RNA等の修飾ヌクレオシドであってもよい。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシドは、天然ヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、若しくは両者)及び／又は非天然ヌクレオシドであってよい。
一実施形態では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、カチオン性ヌクレオシドを含む。
本明細書では、第1核酸鎖の塩基配列が標的転写産物の少なくとも一部の塩基配列に相補的であることから標的転写産物にハイブリダイズ（又はアニール）することができる。塩基配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がハイブリダイズし得る条件（温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。さらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することもできる。
ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、30℃、2×SSC、0.1％SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1％SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
第1核酸鎖は、標的転写産物にハイブリダイズしている場合に、RNase Hによって認識される少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、又は少なくとも7個の連続するヌクレオシドを含むことができる。通常、4～20塩基、5～16塩基、又は6～12塩基の連続するヌクレオシドを含む領域であればよい。RNase Hによって認識されるヌクレオシドとして、例えば天然型デオキシリボヌクレオシドを用いることができる。修飾されたデオキシリボヌクレオシド、及び他の塩基を含む好適なヌクレオシドは、当該分野において周知である。また、リボヌクレオシド等の、2'位にヒドロキシ基を有するヌクレオシドが、前記ヌクレオシドとして不適当であることも知られている。「少なくとも4個の連続するヌクレオシド」を含むこの領域への利用に関し、ヌクレオシドの適合性を容易に決定することができる。一実施形態で、第1核酸鎖は、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み得る。
一実施形態では、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の全長は、天然リボヌクレオシドのみで構成されてはいない。第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の天然リボヌクレオシドは、全長の半数以下であるか、又は含まないことが好ましい。
一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖中の上記の少なくとも4個の連続するヌクレオシド(例えばデオキシリボヌクレオシド）に相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含んでいてもよい。第2核酸鎖が、第1核酸鎖と部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖を形成し、RNaseHによって認識され切断されるようにするためである。第2核酸鎖中の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドは、好ましくは、天然に存在するヌクレオシド間結合、すなわちホスホジエステル結合によって連結される。
第2核酸鎖は、全てのヌクレオシドがリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよい。第2核酸鎖の全てのヌクレオシドが、デオキシリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよく、リボヌクレオシドを含まなくてもよい。
本発明の核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、ギャップマー（gapmer)であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、中央領域（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端の両側に配置された5'ウイング領域及び3'ウイング領域からなる一本鎖核酸をいう。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、前記5'ウイング領域及び3'ウイング領域は非天然ヌクレオシドを含む。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2～10塩基長、2～7塩基長、又は3～5塩基長であればよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、非天然ヌクレオシドを少なくとも1種含んでいればよく、天然ヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。
前記ギャップマーを構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長の架橋ヌクレオシド、4～15塩基長若しくは8～12塩基長のリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長の架橋ヌクレオシドから構成されていてもよい。
本発明の核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端、又は両末端）から少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、又は少なくとも4個のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドであってもよい。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び／又は修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖は、2'-修飾糖（例えば、2'-O-メチル基を含む糖）であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンとすることもできる。
第2核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド）、4～15塩基長若しくは8～12塩基長の(場合により、修飾ヌクレオシド間結合で連結された)リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド)から構成されていてもよい。この場合、第1核酸鎖は、ギャップマーであってもよい。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。第1核酸鎖は、修飾ヌクレオシドを少なくとも1つ含んでもいてもよい。修飾ヌクレオシドは、2'-修飾糖を含んでいてもよい。この2'-修飾糖は、2'-O-メチル基を含む糖であってもよい。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、全部又は一部にカチオン性ヌクレオシドを含んでもよい。一実施形態では、カチオン性ヌクレオシドは、アミン架橋型核酸(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)、アミノアルキル修飾核酸（例、2'-O-メチル及び4'-CH2CH2CH2NH2置換体)、GuNA(例、図3のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me])等を含むヌクレオシドである。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、上記の修飾ヌクレオシド間結合及び修飾ヌクレオシドの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
第2核酸鎖は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合している。ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、当業者であれば自体公知の方法により、製造することができる。
本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物等を含む。ある化合物が別の化合物の類縁体であるかどうかは、当業者であれば判定できる。
一実施形態において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル、1-ヘキサデシルヘプタデシル）は、例えば、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～２６又はＣ２８アルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、オクタコシル）、例えばヒドロキシル基で置換されていてもよいＣ２２アルキル基（例、ドコシル）である。一実施形態において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基は、置換されていないＣ２２～２６又はＣ２８アルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、オクタコシル）、例えば置換されていないＣ２２～２４、又はＣ２６アルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ヘキサコシル）、例えば置換されていないＣ２２アルキル基（例、ドコシル）である。アルキル基は、直鎖アルキル基及び分岐アルキル基のいずれであってもよい。一実施形態において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基は、置換されていない直鎖Ｃ２２～２６又は直鎖Ｃ２８アルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、オクタコシル）、例えば置換されていない直鎖Ｃ２２～２４、又は直鎖Ｃ２６アルキル基（例、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ヘキサコシル）、例えば置換されていない直鎖Ｃ２２アルキル基（例、ドコシル）である。一実施形態において、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基は、置換されていない分岐鎖Ｃ３３アルキル基（例、1-ヘキサデシルヘプタデシル）である。
ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、あるいは両端に連結されていてもよい。あるいは、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに連結されていてもよい。例えば、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、第2核酸鎖の5'末端に結合されうる。他の実施形態において、第2核酸鎖は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体を2つ以上含み、これらは第2核酸鎖の複数の位置に連結されていてもよく、及び/又は第2核酸鎖の1つの位置に一群として連結されていてもよい。ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体は、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
第2核酸鎖とヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体との結合は、直接結合及び間接結合を問わない。直接結合とは2つの分子が直接的に結合することをいう。間接結合とは、結合すべき2つの分子が別の物質を介在して結合することをいう。
一実施形態において、第2核酸鎖とトヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体との結合は、第2核酸鎖の5'末端、3'末端、又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合していてもよい。
一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合している。
一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合を介して結合している。
第2核酸鎖とヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が間接結合をする場合、連結基（本明細書では、しばしば「リンカー」と表記する）を介して結合していてもよい。リンカーは、第2核酸鎖の5'末端、3'末端、又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合していてもよい。
一実施形態では、リンカーは、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合又はホスホロチオエート結合を介して結合している。
一実施形態では、リンカーは、第2核酸鎖の5'末端に、リン酸エステル結合を介して結合している。
第2核酸鎖とヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が間接結合をする場合、両者は切断可能なリンカーを介して結合していてもよい。「切断可能なリンカー」とは、生理学的条件下、例えば細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で切断され得る連結基をいう。切断可能なリンカーは、ヌクレアーゼ、ぺプチダーゼ等の内在性酵素、酸性条件、還元的環境下等によって選択的に切断されてもよい。そのような具体例として、例えば、アミド結合、エステル結合、リン酸エステル結合、ホスホジエステル結合の一方若しくは両方のエステル結合、カルバメート結合、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカー等のヌクレオチドリンカーが挙げられる。
第2核酸鎖とヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が間接結合をする場合、両者は非切断性（uncleavable）リンカーを介して結合していてもよい。「非切断性リンカー」は、生理学的条件下では切断されない連結基をいう。そのような非切断性リンカーとして、例えば、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾又は非修飾のデオキシリボヌクレオシド、又は修飾又は非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。
切断可能なリンカー又は非切断性リンカーの鎖長は、DNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、特に限定はされないが、通常は1～20塩基長、1～10塩基長又は1～6塩基長でよい。
前記リンカーの一具体例として、以下の一般式（II）で表されるリンカーが挙げられる：
（式中、
Ｌ２は、置換された若しくは置換されていないＣ１～１２のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないＣ３～８シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、又はＣＨ（ＣＨ２－ＯＨ）－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－を表し、Ｌ３は、－ＮＨ－又は結合を表し、Ｌ４は、置換された若しくは置換されていないＣ１～１２のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないＣ３～８のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、－（ＣＨ２）２－［Ｏ－（ＣＨ２）２］ｍ－、又は結合を表し、ここで、ｍは１～２５の整数を表し、Ｌ５は、－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）－、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。
一実施形態において、式(II)で表されるリンカーは、L2が、置換されていないC3～C6のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又は-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-であり、L3が、-NH-であり、L4及びL5が、結合である。
前記リンカーの一具体例として、以下の一般式（I）で表されるリンカーが挙げられる：
特定の実施形態において、リンカーは、アルキル基、アミノ基、オキソ基、アミド基、ジスルフィド基、ポリエチレングリコール基、エーテル基、チオエーテル基及びヒドロキシルアミノ基から選択される１つ以上の基を含む。このような特定の実施形態において、リンカーは、アルキル基、アミノ基、オキソ基、アミド基及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、リンカーは、アルキル基及びアミド基から選択される基を含む。特定の実施形態において、リンカーは、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。特定の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つのリン酸基を含む。特定の実施形態において、リンカーは、少なくとも１つの中性コンジュゲート基を含む。
特定の実施形態において、リンカーは、二官能性結合部分を含む。一般に、二官能性結合部分は、少なくとも２つの官能基を含む。官能基の一方は、第2核酸鎖上の特定の部位に結合するように選択され、他方は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体に結合するように選択される。二官能性結合部分に使用される官能基の例には、求核性基と反応する求電子剤及び求電子性基と反応する求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル及びアルキニルから選択される１つ以上の基を含む。
リンカーの例には、ピロリジン、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(ADO)、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジル(SMCC)及び6-アミノヘキサン酸(AHEX又はAHA)が挙げられるが、これらに限定されない。他のリンカーには、限定するものではないが、置換されていてもよいＣ１-１０アルキル、置換されていてもよいＣ２-１０アルケニル、又は置換されていてもよいＣ２-１０アルキニルが含まれ、ここで、好ましい置換基の非限定的なリストには、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれる。
特定の実施形態において、リンカーは、１～１０個のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、２～５個のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、リンカーは、正確に３個のリンカーヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、リンカーは、TCAモチーフを含む。特定の実施形態において、当該リンカーヌクレオシドは、非天然ヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該リンカーヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。特定の実施形態において、リンカーヌクレオシドは、天然ヌクレオシドである。特定の実施形態において、リンカーヌクレオシドは、プリン塩基、修飾プリン塩基、ピリミジン塩基又は修飾ピリミジン塩基から選択される、任意に保護された複素環式塩基を含む。本明細書中、リンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの一部とはみなされない。したがって、オリゴマー化合物が、指定数若しくは指定範囲の結合されたヌクレオシド及び／又は参照核酸に対する指定の相補性パーセントからなるオリゴヌクレオチドを含み、また、オリゴマー化合物が、リンカーヌクレオシドを含むリンカーを含む、実施形態において、これらのリンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの長さには算入されず、参照核酸に対するオリゴヌクレオチドの相補性パーセントを決定する際には使用されない。
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体が、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体を含有する場合には、これらも本発明の核酸複合体として含有されるとともに、自体公知の合成手法、分離手法によりそれぞれを単品として得ることができる。例えば、本発明の核酸複合体に光学異性体が存在する場合には、該化合物から分割された光学異性体も本発明の核酸複合体に包含される。
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体は、プロドラッグ及び当該プロドラッグの薬学的に許容される塩を含む。本発明の核酸複合体のプロドラッグ及び当該プロドラッグの薬学的に許容される塩は、生体内における生理条件下で酵素、胃酸等による反応により本発明の核酸複合体に変換する化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明の核酸複合体に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明の核酸複合体に変化する化合物をいう。特定の実施形態において、核酸複合体のプロドラッグは、第1核酸鎖又は第2核酸鎖に結合された、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体を１つ以上含む。
本発明の核酸複合体において、第1核酸鎖が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、核酸複合体を細胞等に導入した後、ノーザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定できる。具体的には、細胞内の標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)がアンチセンス効果によって低下することを前述の公知技術を用いて検証すればよい。
本発明の核酸複合体の中枢神経系におけるアンチセンス効果の測定、及びBBB等の通過の判定も当該分野で公知の方法で測定できる。限定はしないが、例えば、本発明の核酸複合体を被験体（例えばマウス）に投与し、数日後～数ヶ月後（例えば2～7日後又は1ヶ月後）に中枢神経系における標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが抑制されるか否かを測定することで前記判定が可能となる。前記判定の基準は、標的遺伝子の発現量又は標的転写産物の測定値が、陰性対照(例えばビヒクル投与)の測定値と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、本発明の核酸複合体がBBB等を通過し、中枢神経系にアンチセンス効果をもたらしたと判定できる。また、BBB等の通過の判定は、本発明の核酸複合体を被験体(例えばマウス)に投与し、数日後～数ヶ月後（例えば2～7日後又は1ヶ月後）に、中枢神経系における本発明の核酸複合体の存在量(濃度)を測定することによって判定することができる。
上記のように、本発明の核酸複合体の例示的実施形態について説明したが、本発明の核酸複合体は上記の例示的実施形態に限定されない。さらに、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって、本発明の様々な実施形態による核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖を製造することができる。例えば、本発明の核酸分子は、標的転写産物の塩基配列（例えば、標的遺伝子の塩基配列）情報に基づいて各核酸分子を設計し、例えば、GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等の市販の自動核酸合成装置を使用して核酸を合成し、その後、得られたオリゴヌクレオチドに逆相カラム等を使用して精製することにより製造することができる。
第2核酸鎖は、ポリヌクレオチドに結合された少なくとも1つの機能性部分をさらに含んでいてもよい。機能性部分が、核酸複合体及び／又は機能性部分が結合している鎖に所望の機能を与える限り、特定の実施形態による「機能性部分」の構造について特定の限定はない。所望の機能としては、標識機能及び精製機能が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。また、第1核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第2核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二重鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。標的への送達機能を与える部分の例としては、脂質、抗体、アプタマー、特定のレセプターに対するリガンド等が挙げられる。機能性部分の第2核酸鎖における結合位置及び結合の種類は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と第2核酸鎖との結合について上に記載されるとおりである。
一実施形態において、第2核酸鎖は、脂質と結合している。脂質としては、トコフェロール、コレステロール、脂肪酸、リン脂質及びそれらの類縁体；葉酸、ビタミンC、ビタミンB1、ビタミンB2；エストラジオール、アンドロスタン及びそれらの類縁体；ステロイド及びその類縁体；LDLR、SRBI又はLRP1/2のリガンド；FK-506、及びシクロスポリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、機能性部分が結合している核酸複合体は、機能性部分が予め結合した核酸種を用いて、上記の合成、精製及びアニーリングを実施することによって製造することができる。例えば、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体が予め結合された核酸種を用いて、上記の合成及び精製を実施することによって第2核酸鎖を製造することができる。
一実施形態では、上記の合成及び精製を実施することによって製造された第2核酸鎖に、自体公知の方法によりヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体を結合させることができる。機能性部分を核酸に連結するための方法は当該技術分野において周知である。この方法で製造した核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃～98℃で数分間（例えば5分間）変性させ、その後核酸を約30℃～70℃で約1～8時間アニールして、本発明の核酸複合体の一つを製造することができるまた、核酸鎖は、塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、各種メーカー(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。上記アニール工程は、室温（約10℃～約35℃）に約5～60分間静置することで、行うことができる。
第1核酸鎖及び第2核酸鎖をそれぞれ、約70℃～98℃の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解し、得られた2つの溶液を混合し、混合液を約70℃～98℃で数分間（例えば5分間)保持し、その後、混合液を約30℃～70℃（又は30℃～50℃）で約1～8時間保持して、本発明の一部の実施形態の核酸複合体を調製してもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖はそれぞれ、室温（約10℃～約35℃）で緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解することもできる。
ただし、核酸複合体の作製時におけるアニーリングの条件（時間及び温度）は、上記条件に限定されない。また、核酸鎖のアニーリングを促進するのに適した条件は、当該技術分野において周知である。
（核酸複合体の効果）
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的miRNAの効果を阻害することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的miRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、その標的miRNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖に互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。この核酸複合体によって標的miRNAの効果を阻害することにより、当該標的miRNAが通常ダウンレギュレートしている遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的RNAの発現又は編集を調節することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖は互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。ここで、「標的RNAの発現調節」とは、例えば、発現量の上方制御及び下方制御を含む。また「標的RNAの編集調節」とは、RNA編集によるスプライシングの調節、例えば、エクソンスキッピングやエクソンインクルージョンを含む。標的RNAは、ウイルス若しくは細菌のRNA、又は毒性のRNA(Toxic RNA)であってもよい。
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的mRNAの翻訳を阻害することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的mRNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖が互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。この核酸複合体によって第1核酸鎖が標的mRNAに結合することにより、ステリックブロックが生じ、mRNAの翻訳が阻害される。
なお、本発明の核酸複合体は、それに限定されるものではないが、中枢神経系のミクログリア（小膠細胞）における標的転写産物の発現又は編集の調節において有効に使用することができる。
＜組成物＞
本発明の第２態様は組成物である。本発明の組成物は、前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖を有効成分として、及び／又は薬剤送達分子として包含する。前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖は、BBB等を通過し、中枢神経系にて標的転写産物の発現量をアンチセンス効果によって調節する(例えば、発現量を減少させる)ことができる。一実施形態では、前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖は、血中から脳(脳実質)へ移行し、脳実質にて標的転写産物の発現量をアンチセンス効果によって調節する(例えば、発現量を減少させる)ことができる。したがって、本発明の組成物は、被験体に投与することで、核酸複合体を送達し、被験体を治療する組成物であってもよく、また医薬組成物であってもよい。一実施形態において、本発明の組成物は、中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための、及び／又は中枢神経系に薬剤を送達するための組成物である。なお、本発明の組成物は、それに限定されるものではないが、中枢神経系のミクログリア（小膠細胞）における標的転写産物の発現又は編集の調節において有効に使用することができる。
また、本発明の一実施形態では、核酸複合体を含む組成物を投与することで各中枢神経系疾患を治療する治療方法に関する。
（製剤化）
本明細書において、組成物は自体公知の方法により製剤化することができる。例えば、本組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、微粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、注射剤及び坐剤の形態で、経口的に又は非経口的に使用することができる。
これらの製剤の製剤化に関して、薬学的に許容可能な担体若しくは溶媒又は食品及び飲料品として許容可能な担体若しくは溶媒を適切に組み込むことができる。そのような担体又は溶媒として、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
（投与形態・投与量）
本明細書において、組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。非経口投与の具体例として、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気管／気管支投与、直腸投与、髄腔内投与、脳室内投与、経鼻投与、及び筋肉内投与、並びに輸血による投与が挙げられる。筋肉内注射投与、静脈内点滴投与、又は埋め込み型持続皮下投与で投与することもできる。皮下投与は、患者自身による自己注射が可能であるので好適である。また、静脈内投与の場合、組成物1回の投与量中に含まれる核酸複合体の量、すなわち核酸複合体の単回投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、0.025mg/kg以上、0.1mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができる。例えば、0.001mg/kg～500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
（被検体・適用対象）
本明細書で「被検体」とは、本発明の組成物を適用する対象をいう。被検体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被検体が個体の場合、本発明の組成物は、ヒトを含むあらゆる動物に適用することができる。ヒト以外の対象としては、例えば、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が適用対象となり得る。被験体は、中枢神経系で標的転写産物の発現量を減少させることが必要な個体や、中枢神経系疾患の治療が必要な個体であってもよい。
本発明の組成物は、包含する第１態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖の血中から脳への移行作用(例えば、BBB等の通過作用)及びアンチセンス効果により、中枢神経系における標的転写産物の発現量を減少させることができる。
本発明の組成物を中枢神経系疾患の治療用として適用する場合、適用対象疾患は、遺伝子発現の増加又は減少に関連する中枢神経系疾患、特に標的転写産物又は標的遺伝子の発現の増加に関連する疾患(腫瘍等)が好ましい。限定されないが、例えば、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病等が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、免疫性中枢神経系疾患の治療用として適用される。免疫性中枢神経系疾患の例としては、例えばミクログリア関連疾患が挙げられ、ミクログリア関連疾患としては例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、ALS、神経障害性疼痛等が挙げられる。
本発明の組成物の送達部位、より具体的には組成物中に含まれる有効成分の送達部位は、特に限定はしないが、各疾患に応じて適切な部位に送達されることで、より効果的な結果が得られ得る。具体例を挙げると、アルツハイマー病の治療では、海馬及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。また、前頭側頭型認知症（FTD）（前頭側頭葉変性症（FTLD）、意味性認知症（SD）、進行性非流暢性失語（PNFA）等を含む）、及びピック病の治療では、前頭葉、側頭葉及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。さらに、パーキンソン病認知症の治療では、後頭葉、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。また、パーキンソン病の治療では、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。皮質基底核変性症（CBD）の治療では、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。進行性核上性麻痺（PSP）の治療では、前頭葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。筋萎縮性側索硬化症の治療では、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。脊髄小脳変性症（SCD）SCA1型～SCA34型までの治療では、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。歯状核赤核淡蒼球ルイ体変性症（DRPLA）の治療では、大脳基底核、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。球脊髄性萎縮症（SBMA）の治療においては、脳幹及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。フリードライヒ失調症（FA）の治療では、脳幹及び/又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。ハンチントン病の治療では、線条体、前頭葉、頭頂葉及び／又は大脳基底核への薬剤送達が有効となり得る。プリオン病(狂牛病、GSSを含む)の治療では、大脳皮質、大脳白質、大脳基底核及び/又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳炎（ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性を含む）、髄膜炎（ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性を含む）の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。代謝性脳症、中毒性脳症、栄養障害性脳症の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、もやもや病、無酸素脳症の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。びまん性軸索損傷（Diffuse axonal injury）の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。頭部外傷の治療では、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。多発性硬化症（MS）、視神経脊髄炎（NMO）の治療では、大脳白質、大脳皮質、視神経及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。筋緊張型ジストロフィー症（DM1, DM2）の治療では、骨格筋、心筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。家族性痙性対麻痺（HSP）の治療では、頭頂葉及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。福山型筋ジストロフィーの治療では、骨格筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。レビー小体型認知症（DLB）の治療では、黒質、線条体、後頭葉、前頭葉及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。多系統萎縮症（MSA）の治療では、線条体、大脳基底核、小脳、黒質、前頭葉及び／又は側頭葉への薬剤送達が有効となり得る。アレキサンダー病の治療では、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。CADASIL、CARASILの治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。
組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、被験体の年齢（月齢、週齢を含む）、体重、症状及び健康状態、組成物の種類（医薬品、食品及び飲料品等）等に従って適切に選択すればよい。本発明の組成物の被検体への摂取有効量は、例えば、包含する核酸複合体が0.00001mg/kg/日～10000mg/kg/日、又は0.001mg/kg/日～100mg/kg/日となるようにすればよい。組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2～20回等投与することもできる。上記の核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、0.025mg/kg以上、0.1mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1.0mg/kg以上、2.0mg/kg以上、3.0mg/kg以上、4.0mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001mg/kg～500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
本発明の核酸複合体は、0.01～10mg/kg（例えば約6.25mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、核酸複合体は、0.05～30mg/kg（例えば約25mg/kg）の用量で週1～2回の頻度で2～4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性を下げ、被検体への負荷を低減することができる。
核酸複合体の単回投与によるBBB通過量、BCSFB通過量、CSFBB通過量、血液神経関門(BNB)通過量等には制限（上限）があるが、反復投与でも抑制効果は細胞内において相加的に働くと考えられる。すなわち、BBB通過、BCSFB通過量、CSFBB通過量、BNB通過等の制限以上の高用量（例えば25mg/kg以上）では1回の投与量の増量では有効性の増強は低減するが、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた反復投与により有効性を向上させることができると考えられる。
特定の実施形態において、本発明の核酸複合体は、水、日本薬局方溶出試験第２液、又は日本薬局方崩壊試験第２液に対する溶解性に優れ、体内動態（例、血中薬物半減期、脳内移行性、代謝安定性、CYP阻害）に優れ、毒性が低く（例えば、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、薬物相互作用、癌原性、光毒性等の点から医薬として、より優れている）、かつ副作用も少ない（例えば、過沈静（sedation）の抑制、層状壊死の回避）等の医薬品として優れた性質も有する。
（薬剤送達）
本発明の組成物は、有効成分として含有する第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖がBBB等を通過し、中枢神経系に効率的に送達され得ることを利用して、特定の薬剤を第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に結合させることによって、その薬剤を神経系、好ましくは中枢神経系、さらに好ましくは脳(脳実質)に送達することができる。神経系に送達される薬剤は、特に限定されないが、ペプチド、タンパク質又は核酸薬剤、あるいはその他の有機化合物等、例えば抗腫瘍薬、ホルモン薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症薬等が挙げられる。薬剤は、好ましくは、小分子薬剤である。「小分子薬剤」とは、当該技術分野において十分に理解されている。小分子薬剤は、典型的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する薬剤を指す。薬剤は、親油性薬剤であってもよい。核酸薬剤としては、特に限定されないが、ASO、アンタゴmiR、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、アプタマー、一本鎖siRNA、マイクロRNA、プレ-マイクロRNA等が挙げられる。薬剤の第2核酸鎖における結合位置及び結合の種類は、ヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ２２～３５のアルキル基又はその類縁体と第2核酸鎖との結合について上に記載される通りである。
本発明の組成物は、以下の実施例で開示される通り、高効率に中枢神経系(好ましくは脳(脳実質))に送達され、標的遺伝子の発現又は標的転写産物のレベルを効果的に改変又は抑制することができる。したがって、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させる方法であって、上記の核酸複合体を含む組成物を被験体に投与することを含む、方法が提供される。当該方法は、被験体の中枢神経系疾患を治療する方法であってもよい。また、被験体の中枢神経系に薬剤を送達する方法であって、上記の核酸複合体を含む組成物を被験体に投与することを含む、薬剤送達方法も提供される。
本発明は、更に以下の参考例及び実施例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
以下の実施例中の「室温」は通常約１０℃ないし約３５℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り重量％を示す。
１Ｈ ＮＭＲの解析にはＡＣＤ／ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ（商品名）ソフトウエア等を用いた。水酸基やアミノ基等のプロトンピークが非常に緩やかなピークについては記載していないことがある。
以下に、実施例で用いた略語の意味を示す。
Ｍ：モル濃度
Ｎ：規定度
ＣＤＣｌ３：重クロロホルム
１Ｈ ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＡＴＵ：Ｏ―（７―アザベンゾトリアゾール―１―イル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’―テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩
ＮＭＰ：Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＥＡＡ：トリエチルアミンアセタート
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＯＤＳ：オクタデシル結合シリカゲル
以下の実施例で用いるオリゴヌクレオチドの構造を表１にまとめて示す。実施例で用いるオリゴヌクレオチドのうちASO(Malat1)、Y13-cRNA(Malat1)は、株式会社ジーンデザイン（大阪、日本）によって合成された。
表１に示すオリゴヌクレオチドY13-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY1-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY2-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY3-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY4-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY5-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY6-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY7-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY8-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY9-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY10-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY11-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
表１に示すオリゴヌクレオチドY12-cRNA(Malat1)の5'末端構造を以下に示す。なお、以下の化学式で「オリゴ」という表示は、オリゴヌクレオチドを示す。
その他の実施例で用いる化合物を下表に示した。それぞれ市販品をそのまま用いてもよく、また、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法により製造することもできる。
実施例1
A)5' 末端にY1-を結合させたcRNA(Y1-cRNA(Malat1))の合成
IY1の50 mM NMP溶液(1200 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(1200 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(1200 μL)をマイクロチューブ中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で15分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液(3000 nmol)、NMP(3150 μL)、蒸留水 (153 μL)、DIPEA (94 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon Ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセタートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon Ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでろ過し、凍結乾燥後、標題化合物を1446 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y1-HDOの合成
Malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー（ASO(Malat1)）は、5'末端の3個及び3'末端の3個のLNAヌクレオシド、並びにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのMalat1ノンコーディングRNA（GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号3）の1316～1331に相補的な塩基配列を有する。ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY1-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）とを等モル量で混合し、混合液を70℃で5分加熱した。その後混合液を室温に徐冷し、上記の二本鎖核酸剤であるY1結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y1-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y1-HDO）を調製した。
実施例2
A)5' 末端にY2-を結合させたcRNA(Y2-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY2を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1245 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y2-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY2-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY2結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y2-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y2-HDO）を調製した。
実施例3
A)5' 末端にY3-を結合させたcRNA(Y3-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY3を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を702 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y3-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY3-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY3結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y3-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y3-HDO）を調製した。
実施例4
A)5' 末端にY4-を結合させたcRNA(Y4-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY4を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1277 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y4-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY4-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY4結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y4-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y4-HDO）を調製した。
実施例5
A)5' 末端にY5-を結合させたcRNA(Y5-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY5を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1330 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y5-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY5-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY5結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y5-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y5-HDO）を調製した。
実施例6
A)5' 末端にY6-を結合させたcRNA(Y6-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY6を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を713 nmol得た。ただし、IY6を溶解する溶媒としてはTHFを用いた。
B)二本鎖核酸剤Y6-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY6-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY6結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y6-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y6-HDO）を調製した。
実施例7
A)NHS化脂肪酸IY7の調製
ノナコシル酸 (256 mg)と塩化チオニル溶液（1.49 mL）の混合物を、加熱還流下30分攪拌した。反応液を室温に冷却後、減圧条件下溶媒を留去し、残渣をトルエンと2回共沸した。得られた残渣をピリジン（2.0 mL）に溶解した後、1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン（77 mg）を加え、加熱還流下30分攪拌した。反応液を室温に冷却後、1 N塩酸、THF、酢酸エチルを加えたのち、得られた固体をろ取することで、標題化合物を232 mg得た。得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.88 (3H, brs), 1.11-1.85 (52H, m), 2.54-2.67 (2H, m), 2.84 (4H, brs).
B)5' 末端にY7-を結合させたcRNA(Y7-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA (Malat1))の水溶液(672 μL, 4000 nmol)にIY7の50 mM NMP溶液(800 μL)、蒸留水(328 μL)、NMP(7200 μL)、×10 PBS (1000 μL)、DIPEA (125 μL)の順にマイクロチューブ中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間30分反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過（Amicon Ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセタートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過（Amicon Ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水）により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでろ過し、凍結乾燥後、標題化合物を1692 nmol得た。
C)二本鎖核酸剤Y7-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Bで得られたY7-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY7結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y7-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y7-HDO）を調製した。
実施例8
A)NHS化脂肪酸IY8の調製
メリシン酸（188 mg）を用いて、実施例7の工程Aと同様にして、表題化合物を177 mg得た。得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.88 (3H, t, J = 6.4 Hz), 1.11-1.87 (54H, m), 2.60 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.84 (4H, s).
B)5' 末端にY8-を結合させたcRNA(Y8-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（4000 nmol）及びIY8を用いて実施例7の工程Bと同様にして標題化合物を1089 nmol得た。
C)二本鎖核酸剤Y8-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Bで得られたY8-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY8結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y8-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y8-HDO）を調製した。
実施例9
A)NHS化脂肪酸IY9の調製
ヘントリアコンタン酸（100 mg）を用いて、実施例7の工程Aと同様にして、表題化合物を66 mg得た。得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.83-0.94 (3H, m), 1.20-1.80 (56H, m), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.83 (4H, s).
B) 5' 末端にY9-を結合させたcRNA(Y9-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3500 nmol）及びIY9のTHF溶液を用いて実施例7の工程Bと同様にして標題化合物を955 nmol得た。
C)二本鎖核酸剤Y9-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Bで得られたY9-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY9結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y9-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y9-HDO）を調製した。
実施例10
A)5' 末端にY10-を結合させたcRNA(Y10-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY10を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を2159 nmol得た。ただし、溶媒としてはTHF、DMSO及び水の混合物を用いた。
B)二本鎖核酸剤Y10-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY10-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY10結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y10-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y10-HDO）を調製した。
実施例11
A)5' 末端にY11-を結合させたcRNA(Y11-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY11を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を549 nmol得た。ただし、溶媒としてはTHF、DMSO及び水の混合物を用いた。
B)二本鎖核酸剤Y11-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY11-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY11結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y11-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y11-HDO）を調製した。
実施例12
A)5' 末端にY12-を結合させたcRNA(Y12-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y13-cRNA(Malat1))の水溶液（3000 nmol）及びIY12のTHF溶液を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を977 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y12-HDOの合成
ASO(Malat1)（第１核酸鎖）と前工程Aで得られたY12-cRNA(Malat1)（第２核酸鎖）を用いて、実施例１の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY12結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（Y12-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y12-HDO）を調製した。
実施例13
（Ａ）in vivo実験
実験動物には、7週齢の雄性C57BL/6Jマウス（日本チャールズリバー）を使用し、一群あたり2-4匹を実験に供した。実験群では、核酸を含む溶液をマウスの尾静脈から5mL/kgの投与量で静脈内に単回投与した。また、比較対象群では、核酸溶液の調製に用いた溶媒（5%ブドウ糖液）を実験群と同様の手順でマウスに静脈内投与した。
（Ｂ）発現解析
核酸溶液を投与して72時間後に、ペントバルビタールを50mg/kgで前記マウスに腹腔内投与によって麻酔して、採血及び屠殺し、脳(大脳皮質)を摘出した。脳組織からの全RNA抽出は、RNA抽出用試薬ISOGEN（ニッポン・ジーン社）を用いた。ISOGEN溶液中で摘出した脳組織破砕した後、クロロホルムでRNA画分として分離した。その後に、核酸分離システムQuickGene RNA tissue kit SII(倉敷紡績社)で実施した。全RNAからのcDNA合成は、ReverTra Ace qPCR RT Kit（東洋紡社）を用い、THUNDERBIRD qPCR Mix（東洋紡社）による定量PCRを実施した。定量PCRには蛍光プローブ法を採用し、蛍光プローブにはマウスMalat1（Integrated DNA Technologies社）及びマウスGapdh（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。定量PCRの遺伝子断片増幅反応条件は、上記THUNDERBIRD qPCR Mix（東洋紡社）のプロトコルに従った。マウスMalat1及びGapdh（内部標準遺伝子）の発現量を相対検量線によって算出し、相対発現レベルをMalat1/Gapdhとして計算した。一群あたり2匹のマウスの結果から、相対発現レベルの平均値を算出した。比較対象群の相対発現レベルの平均値を100%とした場合の実験群の相対発現レベルの平均値の割合を、相対的Malat1 ncRNA発現レベルとして算出した。
（Ｃ）結果
実施例13の結果を表3に示す。表中、投与量はASO(Malat1)の量を示す。
二本鎖番号1～12は、いずれも大脳皮質におけるMalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。この結果から、本発明の核酸複合体は、脳に送達され、そこでアンチセンス効果をもたらし得ることが立証された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. 第１核酸鎖と第２核酸鎖とを含む核酸複合体又はその塩を含む神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物であって、
    該第１核酸鎖は標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
    該第２核酸鎖は該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、置換されていない直鎖Ｃ ２２ ～ ２４ 又は置換されていない直鎖Ｃ ２６ アルキル基と結合しており、
    該第１核酸鎖は該第２核酸鎖にアニールしている前記組成物。
  2. 第２核酸鎖が、一般式Iで表されるリンカーを介して、置換されていない直鎖Ｃ ２２ ～ ２４ 又は直鎖Ｃ ２６ アルキル基と結合している、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記第１核酸鎖が少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記第１核酸鎖がギャップマーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記第２核酸鎖が前記第１核酸鎖中の少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記第１核酸鎖がミックスマーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記第１核酸鎖が１３～２０塩基長である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記第２核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記第２核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び／又は糖修飾ヌクレオシドから成る、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記第１核酸鎖の天然リボヌクレオシドは、全長の半数以下であるか、又は含まない、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記神経系が中枢神経系である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 中枢神経系疾患治療用である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 中枢神経系に薬剤を送達するための、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記中枢神経系が大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、及び脊髄からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記中枢神経系が前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄及び腰髄からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 静脈内投与用又は皮下投与用である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. １回の投与量中に5mg/kg以上の前記核酸複合体又はその塩を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記核酸複合体又はその塩が、血中から脳へ移行する、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
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