JP7737672B2 - 下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法 - Google Patents

下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離法

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Description

本発明は、インビトロにおいて、多能性幹細胞から分化誘導した下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離・精製方法に関する。
下垂体は、間脳の下部に接して存在する小さな内分泌器官であり、多様なホルモンの制御中枢として大きな役割を果たす。例えば、生命維持に必須の副腎皮質ホルモンの産生を促す副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、子どもの成長を促す成長ホルモンなどをはじめとする多様な下垂体ホルモンを産生する。そのため、下垂体の機能不全は全身性の重篤な疾患を引き起こす。
近年、ヒトES/iPS細胞から機能的な下垂体ホルモン産生細胞を含む腺性下垂体を分化誘導する方法が開発され、下垂体再生医療への応用が期待されている（特許文献1、非特許文献1及び2）。これらの方法では、三次元培養により視床下部-下垂体の複合組織が1つの細胞塊の中に形成される。当該複合組織において、腺性下垂体及びその前駆組織は、主に細胞塊の表層に位置し、これを剥離して下垂体摘出マウスの腎被膜下に移植することで、活動性・生存・体重減少の改善などの治療効果が確認されている（特許文献1、非特許文献1）。しかしながら、上記複合組織から腺性下垂体及びその前駆組織を分離するための細胞表面マーカーは全く知られておらず、剥離する腺性下垂体及びその前駆組織の識別は、形態に基づく実験者の主観的判断に依存していた。
国際公開第2016/013669号
Nature Communications, 7:10351, 2016 Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020
本発明者らは、客観的で信頼性のある下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の分離を行うための、細胞表面抗原を利用した目的細胞の分離方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、まず、腺性下垂体の細胞系譜に特異的な表面抗原を取得するために、332種類のヒトの細胞表面抗原パネルからスクリーニングを行った。その結果、epithelial cell adhesion molecule（以下、EpCAMと略記する）を含め数種類の下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞に特異性の高い表面抗原を同定した。鋭意検討の結果、該同定した表面抗原であるEpCAMが、多能性幹細胞の細胞塊を分散させる際の酵素等による処理に耐え得るものであり、尚且つ、抗EpCAM抗体を用いたソーティングにより、多能性幹細胞の細胞塊から下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞を効果的に分離・精製し得ることを見出した。また、当該分離・精製した細胞は再凝集して維持培養が可能であり、さらに該維持培養を経ても、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示し、機能的に生体の下垂体ホルモン産生細胞と同等の機能を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
［1］腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を分離する方法。
［2］細胞凝集塊が、視床下部神経上皮組織を含む、［1］に記載の方法。
［3］EpCAMを発現する細胞を分離する工程の前に、細胞凝集塊を分散し、単一細胞の集団を得る工程を含む、［1］又は［2］に記載の方法。
［4］EpCAMを発現する細胞を分離する工程の前に、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を細断するか、又は腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含む、［1］～［3］のいずれか１つ記載の方法。
［5］腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞凝集塊である、［1］～［4］のいずれか1つに記載の方法。
［6］前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［5］に記載の方法。
［7］前記前駆組織が、下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢である、［1］～［6］のいずれか1つに記載の方法。
［8］腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞の製造方法。
［9］以下の工程：
（A）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散し、単一細胞の集団を得る工程、
（B）前記集団から、EpCAMを発現する細胞の集団を分離する工程、及び
（C）前記（B）で得られる集団を、再凝集させる工程
を含む、［8］に記載の製造方法。
［10］下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞が、細胞凝集塊又は細胞シートである、［8］又は［9］に記載の製造方法。
［11］EpCAMを発現する細胞を分離する工程（B）の前に、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を細断するか、又は腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含む、［9］又は［10］に記載の方法。
［12］前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種である、［8］～［11］のいずれか1つに記載の方法。
本発明によれば、EpCAMを利用することで、多能性幹細胞由来の分化組織から機能的な下垂体ホルモン産生細胞及び／又はその前駆細胞を効率的に分離・精製することができる。また、分離・精製した下垂体ホルモン産生細胞は、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示すため、該細胞を用いて下垂体に関する疾患の治療等を行うことができる。
図1は、ヒトiPS細胞由来の下垂体前駆細胞におけるEpCAMの発現を示す。左図は、分化誘導44日目のヒトiPS細胞塊を分散後、Cytokeratin（下垂体前駆細胞マーカー）及びEpCAMで蛍光免疫染色した例である（A）。右図は、分化誘導44～51日目において、全細胞に占めるCytokeratin（CK）とEpCAMの発現率を定量した結果を示す（B）。結果において、数値は4例の実験の平均値を示す（B）。 図2は、ヒトiPS細胞由来の分化組織におけるEpCAMの免疫組織化学的解析を示す。上図は、分化誘導48日目のヒトiPS細胞塊の免疫組織染色を示す（A）。図中、Cytokeratin陽性の下垂体前駆細胞においてEpCAMが発現している（A）。中央図は、分化誘導51日目のヒトiPS細胞塊の免疫組織染色を示す（B）。図中、Pitx1陽性の下垂体前駆細胞においてEpCAMが発現している（B）。下図は、分化誘導147日目のヒトiPS細胞塊の免疫組織染色を示す（C）。図中、ACTH陽性のACTH産生細胞及びLhx3陽性の下垂体前駆細胞においてEpCAMが発現している（C）。 図3は、EpCAMをマーカーとしたMACSによるACTH産生細胞及び下垂体前駆細胞の精製を示す。上図は、MACSの手順を示す（A）。下左図は、MACS後に再凝集した細胞塊の明視野画像（左）、及びACTH/Lhx3の免疫染色画像（右）である（B）。下右図は、MACS後に再凝集した細胞塊のACTH分泌量を示す（C）。実験においては、CRH添加前後の培養上清中のACTH濃度を測定した（C）。
（1）多能性幹細胞
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。
分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。本発明においては、ES細胞又はiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)が好適に用いられる。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)、Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)）。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al., (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら（蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999)）、Baguisi et al., (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayama et al., (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、Rideout III et al., (Nature Genetics, 24, 109 (2000))、Tachibana et al., (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press))。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al.,（Science, 315, 482-486 (2007)）、Nakajima et al.,（Stem Cells, 25,983-985 (2007)）、Kim et al.,（Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)）、Revazova et al.,（Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)）、Revazova et al.,（Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008))）。
ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられるES細胞に含まれる。
ES細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF, bFGF, SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992)、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998)、Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)）。
iPS細胞とは、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞、リンパ球等）へ核初期化因子を接触させることにより、人為的に分化多能性及び自己複製能を獲得した細胞をいう。iPS細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycからなる核初期化因子を導入する方法で初めて見出された（Cell, 126: p. 663-676, 2006）。その後、多くの研究者により、リプログラム因子の組み合わせや因子の導入法について様々な改良が進められており、多様なiPS細胞の製造法が報告されている。
核初期化因子は、線維芽細胞等の体細胞から分化多能性および自己複製能を有する細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化因子がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
これらの組み合わせの中で、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせが好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、Oct3/4, Klf4, Sox2及びc-Mycの4因子か、それにLin28またはNanogを加えた5因子が好ましい。
自家移植用途にはiPS細胞が好適に用いられる。
染色体上の遺伝子を公知の遺伝子工学の手法を用いて改変した多能性幹細胞も、本発明において使用できる。多能性幹細胞は、公知の方法を用いて、分化マーカーをコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばGFP等の蛍光タンパク質）をインフレームにノックインすることにより、標識遺伝子の発現を指標として対応する分化段階に達したことを識別可能とした細胞であってもよい。
多能性幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。多能性幹細胞は、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒト多能性幹細胞である。
多能性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、臨床応用の観点では、多能性幹細胞は、KnockoutTM Serum Replacement（KSR）などの血清代替物を用いた無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。
本発明において使用される多能性幹細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする細胞や成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたヒト多能性幹細胞」の純度（総細胞数に占めるヒト多能性幹細胞数の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
（2）多能性幹細胞の凝集塊の形成
多能性幹細胞の凝集塊を調製する方法に特に限定はなく、分散させた多能性幹細胞を、培養容器に対して、非接着性の条件で培養（即ち浮遊培養）してもよいし、接着性の条件下で培養（即ち、接着培養）してもよい。
好ましい一態様において、多能性幹細胞の凝集塊は、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し（即ち、浮遊培養し）、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成させることにより、得ることができる。
この凝集塊形成に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
凝集塊の形成時に用いられる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham’s F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。
凝集塊の形成時に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
凝集塊の形成に用いられる培地は、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、凝集塊の形成に用いられる培地は、後述する、第1の培養工程において用いられる培地であってもよい。
多能性幹細胞の凝集塊の形成に際しては、まず、多能性幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。多能性幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)又はアキュターゼ(MILLIPORE)等の市販品が入手可能である。分散された多能性幹細胞は、上記培地中に懸濁される。
分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開2008-99662）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（(+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。浮遊培養に用いられるROCK阻害剤の濃度は、分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0．1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。
分散された多能性幹細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成する。この際、分散された多能性幹細胞を、10cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養コンパートメント中に複数の多能性幹細胞の凝集塊を同時に形成させてもよいが、こうすると凝集塊ごとの大きさや、中に含まれる多能性幹細胞の数に大きなばらつきが生じ、このばらつきが原因で、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化の程度に、凝集塊間で差が生じ、結果として分化誘導の効率が低下してしまう。そこで、分散した多能性幹細胞を迅速に凝集させて、1つの培養コンパートメント中に1つの凝集塊を形成することが好ましい。このような分散した多能性幹細胞を迅速に凝集させる方法としては、例えば、以下の方法を挙げることができる：
1）比較的小さな体積（例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下）の培養コンパートメント中に、分散した多能性幹細胞を閉じ込め、該コンパートメント中に1個の凝集塊を形成する方法。好ましくは分散した多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート（384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等）、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。該コンパートメントに閉じ込められた分散した多能性幹細胞が、重力にうながされて1箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、1つの培養コンパートメントにつき、1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散した多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるように、U底又はV底とすることが好ましい。
2）遠心チューブに分散した多能性幹細胞を入れ、これを遠心し、1箇所に多能性幹細胞を沈殿させることにより、該チューブ中に1個の凝集塊を形成する方法。
1つの培養コンパートメント中に播く多能性幹細胞の数は、1つの培養コンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導が可能であれば、特に限定されないが、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104 個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1．2×104個の多能性幹細胞を播く。そして、多能性幹細胞を迅速に凝集させることにより、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1．2×104個の多能性幹細胞からなる細胞凝集塊が1個形成される。
凝集塊形成までの時間は、1つのコンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導が可能な範囲で適宜決定可能であるが、この時間を短くすることにより、目的とする下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への効率よい分化誘導が期待できるため、この時間は短いほうが好ましい。好ましくは、24時間以内、より好ましくは12時間以内、さらに好ましくは6時間以内、最も好ましくは、2～3時間で、多能性幹細胞の凝集塊を形成する。この凝集塊形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
また凝集塊形成時の培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
更に、同一培養条件の培養コンパートメントを複数用意し、各培養コンパートメントにおいて、1個の多能性幹細胞の凝集塊を形成させることにより、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を得ることができる。多能性幹細胞の凝集塊が質的に均一であることは、凝集塊のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集塊間の再現性などに基づき、評価することが可能である。一態様において、本発明の方法に用いる、多能性幹細胞の凝集塊の集団は、凝集塊中に含まれる多能性幹細胞の数が均一である。特定のパラメーターについて、多能性幹細胞の凝集塊の集団が「均一」とは、凝集塊の集団全体のうちの90％以上の凝集塊が、当該凝集塊の集団における当該パラメーターの平均値±10％の範囲内、好ましくは、平均値±5％の範囲内であることを意味する。
（3）腺性下垂体及び/又はその前駆組織の誘導
本発明において、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊は、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びソニック・ヘッジホッグ（Shh）シグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することを含む方法にて取得することができる。
本発明において、腺性下垂体とは、少なくとも1種の下垂体前葉又は中葉の下垂体ホルモン産生細胞を含む組織をいう。下垂体ホルモン産生細胞としては、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞等の前葉を構成する細胞；メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の中葉を構成する細胞が挙げられる。これらの下垂体ホルモン産生細胞は、各細胞種に特異的な下垂体ホルモンの発現に加えて、EpCAMをマーカーとして発現し得る。一態様において、腺性下垂体は、GH産生細胞、PRL産生細胞、ACTH産生細胞、TSH産生細胞、FSH産生細胞、及びLH産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種以上（2、3、4、5又は6種）の下垂体ホルモン産生細胞を含む。更なる態様において、腺性下垂体は、GH産生細胞、PRL産生細胞、及びACTH産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞を含む。
本発明において、組織とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をいう。
腺性下垂体の前駆組織としては、下垂体プラコード、ラトケ嚢等が挙げられる。下垂体プラコードとは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域（口腔外胚葉）に形成される肥厚した構造であって、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得るものをいう。ラトケ嚢とは、下垂体プラコードの陥入により形成される、袋状構造をいう。ラトケ嚢も下垂体プラコード同様、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得る。また、下垂体前駆細胞マーカーとしては、上記以外にIsl1/2、Cytokeratin等の発現を更に確認してもよい。本明細書において、下垂体前駆細胞マーカーであるEpCAM、及びLhx3又はPitx1を少なくとも発現し得る細胞を下垂体前駆細胞といい、当該前駆細胞は、好ましくはEpCAM、Lhx3、及びPitx1の全てを発現し得る。また、本明細書において、下垂体前駆細胞を、下垂体ホルモン産生細胞の前駆細胞ともいう。
本明細書における「腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊」として、例えば、LHX3、NKX2.1、PITX1及びACTHから選択される少なくとも一つのマーカーが陽性である細胞凝集体が挙げられる。
また、「腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊」として、例えば、LHX3、NKX2.1、PITX1及びACTH陽性である細胞凝集塊が挙げられる。
本発明の分離方法及び製造方法において用いる腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊は、以下のような方法により作製することができる。具体的には、該方法は、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）（以下、単に表皮外胚葉と略記する場合がある）を含む細胞凝集塊を得ること（第1の培養工程）、及び得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得ること（第2の培養工程）を含む。第1の培養工程により、多能性幹細胞から、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）への分化が誘導され、得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を第2の培養工程に付すことにより、表皮外胚葉の領域（口腔外胚葉）から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への更なる分化が誘導される。
本発明の分離方法及び製造方法において、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊とは、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
（3．1）第1の培養工程
第1の培養工程においては、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
多能性幹細胞の凝集塊を「浮遊培養する」とは、多能性幹細胞の凝集塊を、培地中において、培養器に対して非接着性の条件下で培養することをいう。これにより、従来困難であった腺性下垂体又はその前駆組織の効率的な誘導が可能になる。
浮遊培養に用いられる培地は、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化が誘導される。
本発明において、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、骨形成因子と受容体との結合によってシグナルが伝達される経路を活性化する任意の物質を意味する。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の例としてはBMP2、BMP4、BMP7、GDF5などが挙げられる。好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質はBMP4である。以下、主にBMP4について記載するが、本発明において使用される骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質はBMP4に限定されない。BMP4は、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるBMP4は、哺乳動物のBMP4である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。BMP4は、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のBMP4であり、最も好ましくはヒトBMP4である。ヒトBMP4とは、BMP4が、ヒトが生体内で天然に発現するBMP4のアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトBMP4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001193.2（2013年6月15日更新）、NP_570911.2（2013年6月15日更新）、NP_570912.2（2013年6月15日更新）、これらのアミノ酸配列のそれぞれからN末端シグナル配列（1-24）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトBMP4アミノ酸配列）等を例示することができる。
本発明において、Shhシグナル経路作用物質としては、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Shhシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白又はそのフラグメント（例えば、Shh、Ihh、Shh(C24II) N-Terminus、Shh(C25II) N-Terminus）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、Smoothened Agonist (SAG)（3-Chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[[3-(4-pyridinyl)phenyl]methyl]- benzo[b]thiophene-2-carboxamide）などが挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、SAGが好ましい。
好ましい骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の組み合わせは、BMP4及びSAGである。
培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、細胞凝集塊において、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、通常0.01 nM以上、好ましくは、0.1 nM以上、より好ましくは1 nM以上である。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 nM以下、好ましくは、100 nM以下、より好ましくは10 nM以下である。一態様において、培地中のBMP4濃度は、通常0.01～1000 nM、好ましくは0.1～100 nM、より好ましくは1～10 nM（例、5 nM）である。外因性の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、特に、1）表皮外胚葉を積極的に形成させること、及び2）大脳ではなく視床下部の神経上皮組織を細胞凝集塊内に分化誘導すること、に寄与するので、これらの効果を達成し得る濃度で培地に含まれる。
骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、第1の培養工程の全ての期間に亘り培地に含まれていなくてもよい。例えば、多能性幹細胞の凝集塊の浮遊培養の開始から2～4日間（例、3日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を培地へ添加してもよい。
培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。外因性のShhシグナル経路作用物質は、特に、神経網膜ではなく視床下部（好ましくは腹側視床下部）の神経上皮組織を細胞凝集塊内に分化誘導する役割を果たすので、この効果を達成し得る濃度で培地に含まれる。
Shhシグナル経路作用物質は、第1の培養工程の全ての期間に亘り培地に含まれていなくてもよい。例えば、多能性幹細胞の凝集塊の浮遊培養の開始から5～7日間（例、6日間）は培地にShhシグナル経路作用物質を添加せず、その後、Shhシグナル経路作用物質を培地へ添加してもよい。
一態様において、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含まない培地中で2～4日間浮遊培養し、次に得られた凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含みShhシグナル経路作用物質を含まない培地中で2～4日間浮遊培養し、更に得られた凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉が誘導されるまで培養する。
本発明において使用されるBMP4等の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生された内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。浮遊培養に用いられる培地に含まれる単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第1の培養工程に用いる培地中へ、単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を外因的に添加する工程を含む。
第1の培養工程に用いる培地は、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開2008-99662）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（（+）-（R）-trans-4-（1-aminoethyl）-N-（4-pyridyl）cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。浮遊培養に用いられるROCK阻害剤の濃度は、分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0．1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、多能性幹細胞から、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に、開示されたgfCDMを挙げることができる。
細胞凝集塊の浮遊培養における培養温度、CO2濃度、O2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。O2濃度は、例えば約20％である。
好ましい態様において、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を用いることにより、腺性下垂体又はその前駆組織への分化の程度についての凝集塊間での差を最小限に抑制し、目的とする分化誘導の効率を向上することができる。質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団の浮遊培養には、以下の態様が包含される。
1）複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つの多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。（例えば、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ、多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、各培養コンパートメントにおいて、1つの多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
2）1つの培養コンパートメントに複数の多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。（例えば、10cmディッシュに、複数の多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、該コンパートメントにおいて、複数の多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
本発明の方法を通じて、上記1）及び2）のいずれの態様を採用してもよく、また、培養の途中で態様を変更してもよい＜1）の態様から2）の態様へ、或いは2）の態様から1）の態様へ＞。一態様において、第1の培養工程においては1）の態様を採用し、第2の培養工程において2）の態様を採用する。
第1の培養工程は、多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化は、例えば、RT-PCRや、視床下部神経上皮組織や表皮外胚葉のマーカー特異的抗体を用いた免疫組織化学により検出することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含むまで実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第1の培養工程は、通常15～20日（例、18日）である。
第1の培養工程を行うことにより、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を得ることができる。
視床下部神経上皮組織とは、視床下部マーカーを発現する神経上皮組織であって、視床下部を構成する細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞など）に分化可能であり、かつ自己複製能を有する視床下部前駆細胞、および分化によって自己複製能を失ったニューロン、グリア細胞などを含む組織をいう。視床下部神経上皮組織における視床下部前駆細胞とその分化細胞の割合は分化の程度によって変わるが、多能性幹細胞を腺性下垂体が分化するまで長期培養した細胞塊では、視床下部前駆細胞の多くは視床下部ニューロンへと分化していることが確認されている（Cell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020）。視床下部には、腹側視床下部及び背側視床下部が包含される。視床下部マーカーとしては、NKx2.1（腹側視床下部マーカー）、Pax6（背側視床下部マーカー）等が挙げられる。一態様において、腹側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、Pax6陰性、且つNkx2．1陽性の神経上皮組織である。一態様において、背側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、Nkx2.1陰性、且つPax6陽性の神経上皮組織である。第1の培養工程において得られる細胞凝集塊に含まれる視床下部神経上皮組織は、好ましくは、腹側視床下部神経上皮組織である。上記いずれの視床下部神経上皮組織においても、EpCAMは発現しておらず、このことは、視床下部神経上皮組織を構成する全ての細胞（視床下部前駆細胞のみならず、分化し、自己複製能を失ったニューロン、グリア細胞などにおいても）においてEpCAMは発現していないことを示す。
表皮外胚葉とは、胚発生において、胚の表層に形成される外胚葉細胞層である。表皮外胚葉マーカーとしては、pan-cytokeratinが挙げられる。表皮外胚葉は、一般的には、下垂体前葉、皮膚、口腔上皮、歯のエナメル質、皮膚腺等へ分化し得る。一態様において、表皮外胚葉は、E-cadherin陽性且つpan-cytokeratin陽性の細胞層である。
好適には、第1の培養工程において得られる細胞凝集塊においては、視床下部神経上皮組織がその細胞凝集塊の内部を占めており、単層の表皮外胚葉の細胞がその細胞凝集塊の表面を構成する。表皮外胚葉は、その一部に肥厚した表皮プラコードを含んでいてもよい。
（3．2）第2の培養工程
第2の培養工程においては、第1の培養工程で得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉（口腔外胚葉を含む）を含む細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得る。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化が誘導される。
骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の定義は、第1の培養工程の説明において述べた通りである。
好適には、第2の培養工程において用いる骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、第1の培養工程と同様にBMP4である。好適には、第2の培養工程において用いるShhシグナル経路作用物質は、第1の培養工程と同様にSAGである。
好ましい骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の組み合わせは、BMP4及びSAGである。
培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、細胞凝集塊において、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、通常0.01 nM以上、好ましくは、0.1 nM以上、より好ましくは1 nM以上である。表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 nM以下、好ましくは、100 nM以下、より好ましくは10 nM以下である。一態様において、培地中のBMP4濃度は、通常0.01～1000 nM、好ましくは0.1～100 nM、より好ましくは1～10 nM（例、5 nM）である。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば第2の培養工程開始時に上述の濃度とし、2～4日間毎に半分の割合で、段階的に濃度を低下させることができる。
培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。
好ましい態様において、第2の培養工程に用いる培地は、FGF2を含む。FGF2は、表皮外胚葉から下垂体プラコードへの分化を促進する。
FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるFGF2は、通常哺乳動物のFGF2である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。FGF2は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF2を用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のFGF2が用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF2が用いられる。ここで、マウスFGF2とは、FGF2が、マウスが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。マウスFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_032032.1（2014年2月18日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-9）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF2アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。
培地中における、FGF2の濃度は、表皮外胚葉から下垂体プラコードへの分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上である。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化に悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1～1000 ng/ml、好ましくは10～100 ng/mlである。
本発明において使用されるBMP4等の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びFGF2は、好ましくは単離されている。第2の培養工程に用いられる培地に含まれる単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び単離されたFGF2は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第2の培養工程に用いる培地中へ、単離された骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質（及び、任意に単離されたFGF2）を外因的に添加する工程を含む。
第2の培養工程に用いられる培地は、第1の培養工程に用いられる培地と同様に、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、或いはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に、開示されたgfCDMを挙げることができる。
第2の培養工程における浮遊培養は、好適には高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含む細胞凝集塊を更に浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への効率的な分化誘導が可能となる。
高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20％）を上回る酸素分圧条件を意味する。第2の培養工程における酸素分圧は、例えば、30～60％、好ましくは35～60％、より好ましくは38～60％である。
第2の培養工程における培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
第2の培養工程は、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。第2の培養工程を実施することにより、表皮外胚葉中（より具体的には、口腔外胚葉中）に下垂体プラコードが形成される。また、一部又は全部の下垂体プラコードは、細胞凝集塊の内部（即ち、隣接する視床下部神経上皮）へ向かって陥入し、ラトケ嚢を形成し得る。表皮外胚葉から下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化には、表皮外胚葉と、視床下部神経上皮組織（好ましくは、腹側視床下部神経上皮組織）との相互作用が必須であるところ、本発明においては、第1の培養工程により、細胞凝集塊内に、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉が同時に形成され、好ましい態様において、視床下部神経上皮組織が細胞凝集塊の内部を占め、単層の表皮外胚葉の細胞がその細胞凝集塊の表面を構成する。その結果、細胞凝集塊内において、互いに隣接する表皮外胚葉と視床下部神経上皮組織との良好な相互作用が可能となり、表皮外胚葉における下垂体プラコード形成、下垂体プラコードの陥入、ラトケ嚢の形成等の胚発生における下垂体の自己組織化の過程を、インビトロにおいて再現することができる。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢への分化は、例えば、下垂体前駆細胞マーカー（例、EpCAM、Pitx1、Lhx3等）に対する特異的抗体を用いた免疫組織化学により、下垂体前駆細胞マーカー陽性のプラコードや袋状構造の形成を検出することにより、確認することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含むまで、第2の培養工程が実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第2の培養工程は、通常6日以上、例えば6～12日である。
第2の培養工程を行うことにより、1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得ることができる。本発明の分離方法及び製造方法において、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊とは、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
（3．3）第3の培養工程
第2の培養工程で得られた1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、腺性下垂体を含む細胞凝集塊を得ることができる（第3の培養工程）。第3の培養工程により、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢中に下垂体ホルモン産生細胞が生じ、腺性下垂体が形成される。
本発明の分離方法及び製造方法において、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊とは、第3の培養工程により得られる細胞凝集塊であってもよい。
Shhシグナル経路作用物質の定義は、第1の培養工程の説明において述べた通りである。
好適には、第3の培養工程において用いるShhシグナル経路作用物質は、第1及び第2の培養工程と同様にSAGである。
培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、細胞凝集塊において、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、通常1 nM以上、好ましくは、10 nM以上、より好ましくは100 nM以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限り、上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下、より好ましくは10 μM以下である。一態様において、培地中のSAG濃度は、通常1 nM～1000 μM、好ましくは10 nM～100 μM、より好ましくは100 nM～10 μM（例、2 μM）である。
好ましい態様において、第3の培養工程に用いる培地は、FGF2を含む。FGF2は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を促進する。
FGF2の定義は、第2の培養工程の説明において述べた通りである。
培地中における、FGF2の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1～1000 ng/ml、好ましくは10～100 ng/mlである。
好ましい態様において、第3の培養工程に用いる培地は、Notchシグナル阻害剤を含む。Notchシグナル阻害剤は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進する。Notchシグナル阻害剤により、ACTH産生の上流制御をする転写因子Tbx19の発現が上昇する。
Notchシグナル阻害剤は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル阻害剤としては、例えば、DAPT（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）、DBZ、MDL28170などの、ガンマセクレターゼ阻害剤が挙げられるが、なかでも、DAPTが好ましい。
培地中における、Notchシグナル阻害剤の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、例えばDAPTの場合、通常0.1 μM以上、好ましくは、1μM以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限りDAPT濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μM以下、好ましくは、100 μM以下である。一態様において、培地中のDAPT濃度は、通常0.1～1000 μM、好ましくは1～100 μM（例、10 μM）である。
第3の培養工程においては、培地への骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の添加は不要である。一態様において、第3の培養工程に用いられる培地は、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含まない。
本発明において使用されるFGF2は、好ましくは単離されている。第3の培養工程に用いられる培地に含まれる単離されたFGF2は、培地中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、第2の培養工程に用いる培地中へ、単離されたFGF2を外因的に添加する工程を含む。
第3の培養工程において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加することにより、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類により処理してもよい。副腎皮質ホルモン類処理により、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢からACTH産生細胞以外の下垂体ホルモン産生細胞（即ち、GH産生細胞、PRL産生細胞、TSH産生細胞、LH産生細胞、FSH産生細胞等）への分化が促進される。副腎皮質ホルモン類としては、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン等の天然糖質コルチコイド；デキサメサゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン等の人工的に合成された糖質コルチコイド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
培地中における、副腎皮質ホルモン類の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、また、副腎皮質ホルモン類の種類により適宜設定することができ、例えば、ハイドロコルチゾンの場合、通常100 ng/ml以上、好ましくは、1 μg/ml以上である。下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化に悪影響がない限りハイドロコルチゾン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μg/ml以下、好ましくは100 μg/ml以下である。一態様において、培地中のハイドロコルチゾン濃度は、通常100 ng/ml～1000 μg/ml、好ましくは1～100 μg/mlである。副腎皮質ホルモン類として、デキサメサゾンを使用する場合、その培地中の濃度は、ハイドロコルチゾンの1/25程度とすることができる。
第3の培養工程において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する時期は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、第3の培養工程開始時から培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよいし、第3の培養工程開始後、副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で一定期間培養後、培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよい。好適には、第3の培養工程を開始後、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認された段階で、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。即ち、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認されるまでは、細胞凝集塊を、副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で培養し、ACTH産生細胞の出現が確認された後に、副腎皮質ホルモン類を含む培地中で第3の培養工程を継続する。ACTH産生細胞の出現は、ACTHに対する抗体を用いて免疫組織学的染色により確認することが出来る。ヒト多能性幹細胞を用いた場合、一般的に、第3の培養工程開始から37日以降であれば、ACTH産生細胞の出現が期待できるので、一態様において、第3の培養工程開始から37日以降に、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。
細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する期間は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されないが、通常、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認されるまで、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する。処理期間は、通常、７日以上、好ましくは12日以上である。処理期間の上限値は、特に限定されないが、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認された段階で、培地から副腎皮質ホルモン類を除去してもよい。
尚、培地への副腎皮質ホルモン類の添加は、ACTH産生細胞の分化誘導に対しては、フィードバック阻害により、抑制的に作用する。
第3の培養工程に用いられる培地は、第1及び第2の培養工程に用いられる培地と同様に、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8である。
培養に用いる培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、好ましくは、無血清培地である。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KSR（knockout serum replacement）（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、多能性幹細胞から、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢、そして下垂体ホルモン産生細胞への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、下垂体ホルモン産生細胞への分化誘導に悪影響を与えない観点から、本明細書において培地に含まれることが特に記載されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここにいう「成長因子」には、Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等のパターン形成因子；インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008に、開示されたgfCDMを挙げることができる。
第3の培養工程における浮遊培養は、好適には高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で1）視床下部神経上皮組織、及び2）下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を更に浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、下垂体ホルモン産生細胞への効率的な分化誘導が可能となる。
高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20％）を上回る酸素分圧条件を意味する。第3の培養工程における酸素分圧は、例えば、30～60％、好ましくは35～60％、より好ましくは38～60％である。
第3の培養工程における培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10％、好ましくは約5％である。
第3の培養工程は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。第3の培養工程を実施することにより、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢中に下垂体ホルモン産生細胞が生じることにより、腺性下垂体が形成される。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から誘導される下垂体ホルモン産生細胞としては、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞が挙げられる。好ましい態様において、当該副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞は、CRH刺激に応答してACTHを分泌し、当該ACTH分泌は、糖質コルチコイドによりフィードバック抑制される。一態様において、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞を含む腺性下垂体が形成される。下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢からは、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞以外に、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の他の下垂体ホルモン産生細胞が誘導され得る。即ち、第3の培養工程により形成される腺性下垂体は、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種に加えて、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の他の下垂体ホルモン産生細胞を含み得る。下垂体ホルモン産生細胞への分化は、例えば、下垂体ホルモンに対する特異的抗体を用いた免疫組織化学により、下垂体ホルモン陽性細胞を検出することにより、確認することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは50％以上の細胞凝集塊が下垂体ホルモン産生細胞を含むまで実施される。培養期間は、多能性幹細胞の動物種や、Shhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るので、一概に特定することはできないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、第3の培養工程は、通常37日以上、例えば37～70日である。
第3の培養工程を行うことにより、腺性下垂体を含む細胞凝集塊を得ることができる。
本発明の製造方法を通じ、多能性幹細胞から腺性下垂体又はその前駆組織への分化誘導が可能な限り、フィーダー細胞の存在下／非存在下いずれの条件で凝集塊の浮遊培養を行ってもよいが、未決定因子の混入を回避する観点から、フィーダー細胞の非存在下で細胞凝集塊の浮遊培養を行うのが好ましい。
本発明の製造方法において、細胞凝集塊の浮遊培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
細胞凝集塊の浮遊培養に用いる培養器として、酸素透過性のものを用いても良い。酸素透過性の培養器を用いることにより、細胞凝集塊への酸素の供給が向上し、細胞凝集塊の長期間の維持培養に寄与しうる。
凝集塊の浮遊培養に際しては、凝集塊の培養器に対する非接着状態を維持できる限り、凝集塊を静置培養してもよいし、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かしてもよいが、本発明においては、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かす必要はない。即ち、一態様において、本発明の製造方法における浮遊培養は、静置培養により行われる。静置培養とは、凝集塊を意識的に移動させない状態で培養する培養法のことをいう。すなわち、例えば、局所的な培地温度の変化に伴って、培地が対流し、その流れによって、凝集塊が移動することがあるが、意識的に凝集塊を移動させていないことから、この様な場合も含めて、本発明では静置培養というものとする。浮遊培養の全期間を通じて静置培養を実施してもよいし、一部の期間のみ静置培養を実施してもよい。好ましい態様において、浮遊培養の全期間を通じて、静置培養を行う。静置培養は装置が不要であり、細胞塊のダメージも少ないことが期待され、培養液の量も少なくできる点で有利である。
（4）本発明の細胞表面マーカーによる下垂体ホルモン産生細胞等の分離方法
本発明は、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を分離する方法を提供する。下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の表面にはEpCAMが発現し得るが、視床下部神経上皮組織の表面には、EpCAMが発現し得ない。従って、EpCAMをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞と、視床下部神経上皮組織とを分離することができる。
本発明の分離方法において用いる腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊は、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊、及び第3の培養工程により得られる細胞凝集塊のいずれの細胞凝集塊を用いてもよい。上述の多能性幹細胞から、下垂体若しくはその部分組織、又はその前駆組織への分化誘導開始後の具体的な日数としては、例えば、30日～600日、好ましくは、90日～500日、より好ましくは、150日～400日、さらに好ましくは、200日～350日である。本発明の分離方法は、以下の工程を含むものである。
・本発明の分離工程の概要
本発明の腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を分離する方法は、（B）EpCAMを発現する細胞（集団）を分離する工程の前に、（A）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程を含み得る。
当該細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程（A）は、具体的には、（a1）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を、酵素処理により分散させる工程を含み得る（後述する（4.2））。該酵素処理により分散させる工程の前に、（a2）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を細断するか、又は腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含んでもよい（後述する（4.2））。
当該細胞凝集塊を分散させて、単一細胞の集団を得る工程（A）は、任意により、（a-1）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊をROCK阻害剤で処理する工程を含んでもよい。該工程を行う場合、単一細胞の集団を得る工程の最初に行なうことが好ましい（後述する（4.1））。
酵素処理により分散させる工程（a2）後、（B）EpCAMを発現する細胞（集団）を分離する工程（EpCAMを発現する細胞（集団）と、EpCAMを発現しない細胞（集団）を分離する工程）を行う（後述する（4.3））。
上記細胞（集団）の分離工程（B）後、任意により、（C）得られた細胞（集団）を、再凝集させる工程を行ってもよい（後述する（4.4））当該再凝集工程（C）は、具体的には、（c1）得られた細胞（集団）を、培養器に播種して接着培養すること、及び／又は（c2）得られた細胞（集団）を、培養器に播種し浮遊培養することにより行い得る。
（4.1）ROCK阻害剤による前処理工程
本発明の分離方法では、まず得られた細胞凝集塊のROCK阻害剤による前処理を行い得る。当該前処理は、以降の細胞凝集塊の分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、ROCK阻害剤を、当該前処理開始前から添加することが好ましい。ROCK阻害剤は、例えば、当該処理開始の少なくとも24時間前、少なくとも12時間前、少なくとも6時間前、少なくとも3時間前、少なくとも2時間前、少なくとも1時間前に添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（(+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。当該処理に際して用いられるROCK阻害剤の濃度は、以降の細胞凝集塊の分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、Y-27632について、このような濃度は、通常約0.1～200μM、好ましくは約2～50μMである。ROCK阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。後述の（4.2）～（4.4）のいずれの工程においても、細胞と接触させる溶液については、ROCK阻害剤を同様の濃度で含む溶液を用いることが好ましい。
当該前処理を行うための培地は、第2の培養工程により得られる細胞凝集塊を用いる場合、第2の培養工程において用いる培地を、第3の培養工程により得られる細胞凝集塊を用いる場合、第3の培養工程において用いる培地を用いることができる。なお、上記培地中に既に所望する濃度でROCK阻害剤が添加されている場合は、当該前処理工程を行う必要はない。
（4.2）細胞凝集塊の分散工程
次に、上記前処理を行った細胞凝集塊を、酵素処理により分散させる。具体的には、まず、上記前処理を行った細胞凝集塊を、第2あるいは第3の培養工程に記載の培地（例：DMEM/F-12培地（DMEM培地：Ham's F-12培地＝1:1の混合培地）等）を含む培養器（例：チューブ等）に移し、同培地で洗浄する。分散のための酵素としては、細胞を分散し得る限り特に限定されないが、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼ（コラゲナーゼ タイプI～VII）、メタロプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等の酵素やこれらの混合物が挙げらる。好ましい酵素としては、コラゲナーゼが挙げられ、より好ましくはコラゲナーゼ タイプIである。酵素処理の条件（温度、時間等）は、用いる酵素等により適宜設定し得る。また、当該酵素処理を促進させるために、当該処理前に、細胞凝集塊を物理的（例：メス、ハサミ等）に細断するか、或いは細胞凝集塊に物理的（例：メス、ハサミ等）に切れ込みを入れる工程を行ってもよい。
上記酵素処理後、浮遊細胞を回収し、再度、上記酵素処理を行う。当該酵素処理も、上述の酵素等で行うことができ、好ましい酵素としては、EDTA；トリプシンが挙げられ、より好ましくは、EDTA；トリプシンとデオキシリボヌクレアーゼである。また、EDTA；トリプシンの代わりに、TrypLE (Invitrogen)等の市販品を用いてもよい。酵素処理の条件（温度、時間等）は、用いる酵素等により適宜設定し得る。上記一連の酵素処理により単細胞懸濁液を調製し得る。また、単細胞懸濁液を調製する際に、自体公知の方法により、死細胞を除去してもよい。
（4.3）EpCAM陽性細胞の分離工程
上記調製した単細胞懸濁液に含まれる細胞集団から、EpCAMを発現する所望の細胞を分離する方法としては、フローサイトメトリーやマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法などが挙げられ、これらの方法は、自体公知の方法を用いて行うことができる。例えば、EpCAMを発現する細胞は、当該細胞とEpCAM分子に特異的に結合する物質（例：抗体等）とを接触させる工程を含む方法により分離することができる。上記物質には、それ自体に検出可能な標識（例：GFP、PE）が付加されているもの、およびそれ自体には標識が付加されていないものも含まれる。上記物質が、それ自体に標識が付加されていないものである場合、当該物質を直接または間接的に認識する検出可能な標識が付加された物質をさらに使用することで前記分離が可能となる。例えば、前記物質が抗体である場合には、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）を当該抗体に直接的又は間接的に担持させ、それにより細胞表面のマーカーを標識することが可能であり、当該標識に基づいて細胞を分離することが可能である。この際用いる抗体は、1種類のみ、又は2種類以上の抗体であってもよい。
（4.4）分離した細胞集団の再凝集培養工程
分離した細胞集団は、培養器に播種して接着培養して、例えば、細胞シートとしてもよく、培養器に播種し浮遊培養することで、再凝集させて、細胞凝集塊としてもよい。該細胞集団は、そのまま使用まで維持培養してもよく、分離した細胞の分化状態に合わせて、所望する細胞へと更に分化誘導させてもよい。該維持培養や更なる分化誘導を行う場合、上述の第3の培養工程に記載の方法をそのまま行ってもよく、必要に応じて、適宜、自体公知の方法により修正して行ってもよい。また、該接着培養を行う場合も、接着培養自体は、自体公知の方法により行うことができ、適宜、上述の第3の培養工程に記載の内容（例：培地組成等）を用いてもよい。また、接着培養に際しては、培養器を細胞外マトリックス等（例：ラミニン、コラーゲン等）でコーティングすることが好ましい。
（5）分離された下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の用途
本発明の分離方法又は製造方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞は、移植医療のために使用することができる。例えば、腺性下垂体（前葉又は中葉、好ましくは前葉）の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは腺性下垂体（前葉又は中葉、好ましくは前葉）の損傷状態において、該当する損傷部分を補充するために、本発明の方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を用いることができる。腺性下垂体の障害に基づく疾患、又は腺性下垂体の損傷状態の患者に、本発明により得られた下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を移植することにより、腺性下垂体の障害に基づく疾患、又は腺性下垂体の損傷状態を治療することができる。移植部位は、移植した下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞が、障害された腺性下垂体の代替として機能し得る限り特に限定されないが、例えば、腎被膜下等を挙げることができる。腺性下垂体の障害に基づく疾患としては、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症などが挙げられる。さらに、これら腺性下垂体の損傷状態としては、腺性下垂体摘出後の患者、下垂体腫瘍への放射線照射後の患者、外傷が挙げられる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、iPS細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、iPS細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の腺性下垂体又はその前駆組織、或いは下垂体ホルモン産生細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される。
さらに、本発明の方法により得られた下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞は、薬物のスクリーニングや評価のために使用することができる。具体的には、例えば、下垂体ホルモンの産生を抑制又は促進するような物質のスクリーニングや、医薬品の副作用・毒性試験などに適用することができる。上記スクリーニングや試験等は、例えば、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を含む細胞集団を被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する工程と、被検物質で処理した細胞集団における目的のホルモンの産生量をネガティブコントロールのものと比較する工程、及び下垂体ホルモンの産生を抑制又は促進した被検物質を、候補物質として、選択する工程を含んでもよい。
（6）本発明の下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞の製造方法
本発明は、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を製造する方法を提供する。本発明において、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞とは、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞でもよく、下垂体ホルモン産生細胞の集団（細胞集団）及び/又はその前駆細胞の集団（細胞集団）でもよく、あるいは、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を高い純度で含む細胞集団であってもよい。下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の表面にはEpCAMが発現し得るが、視床下部神経上皮組織の表面には、EpCAMが発現し得ない。従って、EpCAMをマーカーとして、下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞と、視床下部神経上皮組織とを分離することができる。該分離工程を用いることで、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞、あるいは下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を高い純度で含む細胞集団（例：細胞集団の80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％、更に好ましくは95％以上、なお一層好ましくは99％以上、最も好ましくは100％）を製造することができる。
本発明の製造方法に含まれる、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程は、上述の「・本発明の分離工程の概要」に記載の工程等の内容を全て援用することができる。また、各工程に関しても、上述の（4,1）～（4.4）の内容を全て援用することができる。
本発明の方法により製造した下垂体ホルモン産生細胞（集団）及び/又はその前駆細胞（集団）等は、上記（4.1）に記載したように、そのまま使用まで維持培養してもよく、分離した細胞の分化状態に合わせて、適宜、培養（例：第3の培養工程）を行い、所望する細胞へと更に分化誘導させてもよい。具体的には、例えば、本発明の方法により製造した下垂体ホルモン産生細胞（集団）及び/又はその前駆細胞（集団）等を、そのまま該細胞集団による治療等を必要とする対象に移植してもよく、さらに自体公知の方法によりさらに純度を高めた（精製した）上で、該対象に移植してもよい。また、該精製した細胞（集団）を、上記（4.4）にて記載したように、培養器に播種して接着培養し、例えば、細胞シートのような形状にしてもよく、培養器に播種し浮遊培養することで、再凝集させてもよい。該接着培養又は浮遊培養を経て得られる細胞シートや細胞凝集塊を上記対象に移植してもよい。また、該接着培養又は浮遊培養は、短期間（例：3～6日間）行ってもよく、長期間（例：7～30日間）行ってもよい。本発明の製造方法においては、上述の「（1）多能性幹細胞」から「（5）分離された下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞の用途」に関する内容の全てを援用し得る。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例1：細胞表面抗原のスクリーニング
ヒトiPS細胞（201B7株）を、国際公開第2016/013669又はCell Reports, 30, 18-24, January 7, 2020に記載の自体公知の方法により、腺性下垂体又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に分化誘導した。
ヒトiPS細胞（201B7株）から分化誘導して47日目の細胞塊をAccumax (Innovative Cell Technologies, #AM105)で37℃、5～10分処理して分散し、単細胞懸濁液を調製した。BioLegend社製のヒト表面抗原用PE標識抗体パネル（LEGENDScreen Human PE Kit, #700007）で細胞を染色後、IntraStain (Dako, #K2311)を用いて細胞の固定および膜透過処理を行った。続いてFITC標識抗Cytokeratin抗体（Miltenyi, #130-080-101）による細胞内Cytokeratinの染色、Hoechst 33342による核染色、HCS CellMask Deep Red Stain (Invitrogen, #H32721)による細胞質の染色を行った。染色後の細胞について、ParkinElmer社製のイメージングアナライザー（Opera Phenix）で画像取得・解析を行い、Cytokeratin陽性細胞に共存率の高い表面抗原を探索した。その結果、EpCAMで下垂体前駆細胞を識別できる可能性が示唆された。
実施例2：EpCAMとCytokeratinの発現率の定量化
細胞表面抗原のスクリーニングと同様に単細胞懸濁液を調製後、PE標識抗EpCAM抗体（Miltenyi, #130-098-115）、FITC標識抗Cytokeratin抗体、Hoechst 33342で染色を行い、蛍光顕微鏡（Leica DMI6000B）で画像を取得した。画像解析ソフトImage JのCell counterツールを用いて、EpCAM+/Cytokeratin+細胞、EpCAM+/Cytokeratin-細胞、EpCAM-/Cytokeratin+細胞、EpCAM-/Cytokeratin-細胞をカウントし、全細胞におけるそれぞれの割合を計算した。その結果、Cytokeratin陽性細胞に特異性の高い表面抗原として、Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; 別名CD326)を同定した（図1A）。該EpCAMはCytokeratin陽性細胞の約80％で発現し、EpCAM陽性細胞の約95％がCytokeratin陽性であった（図1B）。
実施例3：磁気細胞分離法（Magnetic-Activated Cell Sorting; MACS）によるEpCAM陽性細胞の精製
分化誘導開始後90～500日の細胞塊を酵素的に分散し、MACSに使用した。以下に手順を示す。
（1）Y27632による前処理
分散処理による細胞死を抑制するために、作業開始の1時間以上前にY27632 (Wako, #034-24024)を終濃度20 μMで培地に添加して、細胞塊を前処理した。以降の操作では、細胞が曝されるすべての溶液（PBSは除く）に20 μM Y27632を添加した。
（2）細胞塊の分散
酵素処理による分散を促進するために、細胞塊をメスで細断または切込みを入れた。次に細胞塊を50 mlチューブに移して、DMEM/F12 (Wako, #042-30555)で洗浄した。次にコラゲナーゼ溶液1～3 mlを加えて、37℃で40分旋回振盪（140-150 rpm）した。コラゲナーゼ溶液の組成は、上記のDMEM/F12に0.2%コラゲナーゼtype I (Wako, #031-17601)および0.1% BSA (Sigma, #A9418)を添加したものである。
コラゲナーゼ処理終了後、浮遊細胞を含む上清を新しい15 mlチューブに移し、残りの細胞塊をPBSで洗浄した（洗浄液も上清と同じチューブに回収）。上清を回収した15 mlチューブを4℃、1000 rpm, 5分遠心して浮遊細胞をペレットにした。50 mlチューブの細胞塊に0.25% Trypsin/EDTA (Gibco, #25200072) + 0.2 mg/ml DNase I (Roche, #11284932001)を1 ml加えて、37℃で5～10分保温後、15 mlチューブのペレットと合わせてP1000マイクロピペットで約20回ピペッティングして細胞塊をほぐした。gfCDM + 20%KSR（細胞塊の分化および維持用培地）10 mlで懸濁してトリプシンを中和後、4℃、1000 rpm, 5分遠心した。遠心後の細胞ペレットにgfCDM + 20%KSR + 10 μg/ml DNase Iを1 ml加えて、P1000マイクロピペットで約30回激しくピペッティングして細胞塊を分散し、70 μmセルストレイナーを通して凝集塊を取り除いた。以上の操作により、単細胞懸濁液を調製した。
（3）死細胞の除去
分散した細胞を死細胞除去キット（Miltenyi, #130-090-101）で処理することにより、死細胞およびアポトーシスを起こした細胞を除去した。
（4）MACSによるEpCAM陽性細胞の分離
回収した生細胞をMACS buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)に懸濁し、PE標識抗EpCAM抗体で染色した（冷蔵10分）。続いて、抗PE-マイクロビーズ（Miltenyi, #130-105-639）で処理することにより、EpCAM陽性細胞を磁気ビーズで標識した。次に細胞を磁気カラム（LSカラム; Miltenyi, #130-042-401）に通すことで、磁気ビーズ標識細胞（EpCAM陽性細胞）と未標識細胞（EpCAM陰性細胞）を分離・回収した。
実施例4：精製した細胞の再凝集培養
精製したそれぞれの細胞集団（EpCAM陽性細胞、陰性細胞）を低接着V底96ウェルプレート（PrimeSurface plate 96V; Sumitomo Bakelite, #MS-9096V）に播種して再凝集させた。1ウェル当たり、15,000細胞 in 200 μl培地（gfCDM + 20% KSR + 30 μM Y27632）で播種した。以降は3日ごとにY27632を含まない培地で半量交換した。
実施例5：免疫組織化学
分化誘導開始後48日以上培養した細胞塊及びMACS精製後に再凝集させて6日以上培養した細胞塊を使用した。細胞塊を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定後、10, 20, 30%スクロース溶液に段階的に浸してスクロース置換を行った。続いてOCTコンパウンドで包埋し、クリオスタットで4～10 μm厚の凍結切片を作製して、剥離防止コートスライドグラス（PLATINUM PRO; Matsunami Glass）に貼り付けた。切片をPBSで洗浄後、ブロッキング溶液（5%正常ロバ血清＋0.1% TritonX-100 in PBS）で室温30～60分ブロッキング処理を行った。次に、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体で4℃、一晩反応を行った。続いて、蛍光標識二次抗体およびDAPI（核染色剤）で室温1時間反応を行った。染色後の切片は、Fluoromount (Diagnostic BioSystems, #K024)で封入後、共焦点レーザー顕微鏡LSM-710 (Zeiss)で蛍光観察を行った。
その結果、凝集体の表面にEpCAM陽性の肥厚した上皮組織が観察された。このEpCAM陽性の上皮式は、垂直方向に3細胞以上の厚さがあった。そしてこのEpCAM陽性がCytokeratinと共陽性であることが分かった（図2A）。さらに、このEpCAM陽性がPitx1と共陽性であることが分かった（図2B）。
実施例6：ACTH分泌試験（CRH刺激試験）
MACS精製後に再凝集させて6日以上培養した細胞塊を使用した。細胞塊6個を1.5 mlマイクロチューブに移し、HBSS(+) (Wako, # 084-08965) 250 μl中で37℃, 10分保温後、HBSSを回収した。続いて、1 μg/ml CRH (Peptide Institute, #4136-s)を含むHBSS 250 μl中で37℃, 10分保温後、HBSSを回収した。回収したHBSS中のACTH濃度を臨床検査で使われているECLIA法によって測定した（株式会社SRLへ検査委託）。
結果
腺性下垂体及びその前駆組織はCytokeratin（サイトケラチン）をマーカーとして発現する。Cytokeratinは細胞骨格タンパク質であり、免疫染色により短時間で高感度に検出することが可能である。そこでヒトiPS細胞から分化誘導した細胞塊を分散し、Cytokeratin陽性細胞をターゲットとして、市販の抗体パネルにより表面抗原スクリーニングを実施した。スクリーニングを行う分化時期としては、すでに下垂体前駆細胞が誘導され、なおかつ穏やかな酵素処理で組織分散が可能な培養50日頃を選択した。これにより、表面抗原の分解を防ぐとともに、スクリーニングに足る細胞量を確保することができた。332種類のヒト表面抗原をスクリーニングした結果、Cytokeratin陽性細胞に特異性の高い表面抗原として、Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; 別名CD326)を同定した（図1A）。EpCAMはCytokeratin陽性細胞の約80％で発現し、EpCAM陽性細胞の約95％がCytokeratin陽性であった（図1B）。
細胞塊の免疫組織化学的解析により、EpCAMはCytokeratin、Pitx1、又はLhx3陽性の下垂体前駆細胞において発現が認められた（図2A、B、C）。また、そこから分化した下垂体ホルモン産生細胞（ACTH陽性細胞）においてもEpCAMの発現が維持されていた（図2C）。
90日以上分化誘導した細胞塊を用いて、MACSによりEpCAM陽性細胞と陰性細胞を分離して再凝集を試みた（図3A）。EpCAM陽性と陰性のいずれの細胞集団も凝集塊を形成したが、EpCAM陽性の細胞塊にはACTH陽性細胞およびLhx3陽性細胞が含まれるのに対し、EpCAM陰性の細胞塊には、ACTH陽性細胞及びLhx3陽性細胞が含まれないことを確認した（図3B）。ACTH分泌試験を行った結果、EpCAM陽性の細胞塊では、生理的な分泌刺激因子であるCRHの添加によってACTH分泌量が平均で2.1倍に増加した（図3C）。一方、EpCAM陰性の細胞塊では、CRH添加によるACTH分泌の増加は認められず、CRH添加前の分泌量もEpCAM陽性の細胞塊と比べて平均で2分の1未満であった（図3C）。
以上の結果から、EpCAMをマーカーとすることで、ヒト多能性幹細胞由来の分化組織から機能的な下垂体ホルモン産生細胞及びその前駆細胞を精製することが可能であることが理解される。
本発明の分離方法及び製造方法は、EpCAMをマーカーとして利用することで、多能性幹細胞由来の分化組織から機能的な下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を効率的に分離・精製することに利用可能である。また、分離・精製した下垂体ホルモン産生細胞等は、生理的な下垂体ホルモン分泌刺激により優れた下垂体ホルモンの分泌能を示すため、該細胞を用いた下垂体に関する疾患の治療等に利用可能である。本出願は、日本で出願された特願2020-065346（出願日：令和2年3月31日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (12)

  1. 腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を分離する方法であって、
    前記細胞凝集塊が、視床下部神経上皮組織を含む、方法。
  2. 腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散し、単一細胞の集団を得る工程、および
    前記集団から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞を分離する方法。
  3. 前記細胞凝集塊が、視床下部神経上皮組織を含む、請求項2に記載の方法。
  4. EpCAMを発現する細胞を分離する工程の前に、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を細断するか、又は腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊が、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる細胞凝集塊である、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項5に記載の方法。
  7. 前記前駆組織が、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢である、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊から、EpCAMを発現する細胞を分離する工程を含む、下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞の製造方法であって、
    前記細胞凝集塊が、視床下部神経上皮組織を含む、方法。
  9. 以下の工程：
    （A）腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を分散し、単一細胞の集団を得る工程、
    （B）前記集団から、EpCAMを発現する細胞の集団を分離する工程、及び
    （C）前記（B）で得られる集団を、再凝集させる工程
    を含む、請求項8に記載の製造方法。
  10. 下垂体ホルモン産生細胞及び/又はその前駆細胞が、細胞凝集塊又は細胞シートである、請求項8又は9に記載の製造方法。
  11. EpCAMを発現する細胞を分離する工程（B）の前に、腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊を細断するか、又は腺性下垂体及び/又はその前駆組織を含む細胞凝集塊に物理的に切れ込みを入れる工程を含む、請求項9又は10に記載の方法。
  12. 前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項8～11のいずれか一項に記載の方法。
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