JP7738323B2

JP7738323B2 - オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法

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Publication number: JP7738323B2
Application number: JP2021548460A
Authority: JP
Inventors: 将虎福田
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Current assignee: Fukuoka University
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2025-09-12
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Description

本発明は、オリゴヌクレオチド及び標的ＲＮＡの部位特異的編集方法に関する。

ゲノム編集技術の開発をきっかけに、生物の設計図である遺伝情報、つまりは細胞内のＤＮＡ情報を改変することで生命現象をコントロールする方法が、疾患治療アプローチとして医療や創薬分野で用いられ始めている。ＤＮＡは細胞内で恒常的且つ不変的な分子であるため、ＤＮＡ改変効果は対象細胞又は対象生物に永続的に残り続ける。一方、ＲＮＡは一過的な遺伝情報分子である。従ってＲＮＡ情報の改変は対象生物に永続的ではない一時的な遺伝情報改変効果を与えることができる。

ＲＮＡ改変技術として、例えば、国際公開第２０１６／０９７２１２号には、標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含む標的指向性部分と、細胞に存在し、ヌクレオチドの編集を行うことができるＲＮＡ編集実体に結合してリクルートすることができるリクルート部分とを含む、標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチド構築物が記載されている。また例えば、国際公開第２０１７／０１０５５６号には、標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとの複合体に二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を作用させる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法が記載されている。

ＲＮＡ編集活性を有するアデノシンデアミナーゼとして、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２のアイソフォームが知られており、これらは生体内において細胞種特異的に発現していると考えられている。例えば、ＡＤＡＲ１は、ヒトの骨格筋細胞においてほとんど発現していないとされている。一方、ＡＤＡＲ２は、ヒトの骨髄細胞においてほとんど発現していないとされている。また、一般にヒト細胞内ではＡＤＡＲ１の方がより多く発現していると考えられている。

アイソフォーム特異的にＡＤＡＲ１の編集活性を誘導することできれば、細胞種特異的なＲＮＡ編集が可能になると考えられる。また、ヒトの細胞においてより効率的なＲＮＡ編集が可能になると考えられる。従って本発明は、ＡＤＡＲ１特異的に編集活性を誘導することができるオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一の態様は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである。第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、標的ＲＮＡと相補鎖を形成する。第二オリゴヌクレオチドが形成する相補鎖は、少なくとも１個のミスマッチ塩基を含んでなる。

第二の態様は、前記オリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼ１の存在下に、接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法である。

本発明によれば、ＡＤＡＲ１特異的に編集活性を誘導することができるオリゴヌクレオチドを提供することができる。

標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。培養細胞内での標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。培養細胞内での標的ＲＮＡ編集による発光強度変化を示す図である。培養細胞内での標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。培養細胞内での標的ＲＮＡ編集による発光強度変化を示す図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。インビトロでの各種の標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとからなる複合体を示す模式図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。インビトロでの標的ＲＮＡの編集解析結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、オリゴヌクレオチドを例示するものであって、本発明は、以下に示すオリゴヌクレオチドに限定されない。

標的編集ガイドＲＮＡ
標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド（以下、標的編集ガイドＲＮＡともいう）は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含む。第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、標的ＲＮＡと相補鎖を形成し、相補鎖は、少なくとも１個のミスマッチ塩基を含む。

標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドの５’側に、少なくとも１個のミスマッチ塩基を含む相補鎖を標的ＲＮＡと形成可能な短鎖の第二オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ＡＤＡＲ１の編集活性を特異的に誘導することができる。これは例えば、ミスマッチ塩基の存在がＡＤＡＲ１のリクルートに対しては有利に働くが、ＡＤＡＲ２のリクルートに対しては阻害的に働くためと考えることができる。

本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡにおいては、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと比較して長さが短い分、単純に製造コストが削減される。また、化学合成が容易になることから、遺伝子発現により標的編集ガイドＲＮＡを細胞に導入する方法に加えて、化学的に合成した標的編集ガイドＲＮＡを直接細胞導入する方法が容易になる。またそれに付随して、核酸医薬品開発等で用いられる既存の人工核酸等を標的編集ガイドＲＮＡに適用できる。これにより、細胞内分解耐性の向上、細胞導入効率の向上等により、更なる高機能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することが可能になる。さらに標的編集ガイドＲＮＡが編集誘導に必要な最小限残基数で構成されることで、標的ＲＮＡに対する特異性を維持しつつ、編集標的であるアデノシン残基以外の位置におけるオフターゲット編集を抑制することができる。

標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲのうちＡＤＡＲ１を特異的に標的ＲＮＡにリクルートすることで、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導する。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン残基に変換する酵素であり、哺乳動物の細胞に広く存在する。イノシン残基は構造がグアノシン残基と類似しているため、ＲＮＡ情報の翻訳時にはグアノシン残基として翻訳され、その結果としてＲＮＡ情報が編集される。アミノ酸をコードしている部分にこのようなＲＮＡ編集が生じると、ゲノム上にＤＮＡ変異がないにも関わらずアミノ酸置換等が生じ、標的遺伝子の機能を制御できる。

標的編集ガイドＲＮＡは、哺乳動物の細胞に導入されると、細胞中に存在するＡＤＡＲ１を特異的に標的ＲＮＡにリクルートして、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導することができる。

本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ１特異的に編集活性を誘導することができる。ＡＤＡＲ１特異的とは、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏにおいては、ＡＤＡＲ１に対する編集誘導活性のＡＤＡＲ２に対する編集誘導活性に対する比が１を超えることを意味し、好ましくは１．５以上、２以上または５以上であることを意味する。なお、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２に対する編集誘導活性は、アデノシンデアミナーゼによって編集されることが知られているＨＴＲ２ＣＲＮＡ（セロトニン２Ｃ型受容体ｍＲＮＡ前駆体）に対してそれぞれ編集反応を行った場合に、ＡＤＡＲ１についてはＡ部位が約３０％、ＡＤＡＲ２についてはＤ部位が約９０％の編集割合を示すようにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の濃度を調整した条件下で評価される。また、Ｉｎｃｅｌｌにおいては、同一の発現ベクターを用いて構築したＡＤＡＲ１発現プラスミドとＡＤＡＲ２発現プラスミドとを用いて、細胞内に同一条件でトランスフェクションして発現させた場合に、同一の標的編集部位に対する編集誘導効率がＡＤＡＲ１の方が高い場合を言う。

標的編集ガイドＲＮＡが含む第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する。標的ＲＮＡは、編集対象となるアデノシン残基を含むものであれば、特に制限はなく、細胞性ＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡのいずれもよく、通常はタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡである。標的ＲＮＡにおける編集部位は、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン、イントロン、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響するいずれの領域に存在してもよい。また標的ＲＮＡは、修正又は変更すべき変異を含むものであってもよい。あるいは標的ＲＮＡはその配列が、天然型とは異なる表現型をコードするように変異されたものであってもよい。

標的ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであることが好ましく、コードされるタンパク質として具体的には、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存型カリウムチャネル、ＳＴＡＴ３、ＮＦｋＢＩＡ、ＭＡＰＫ１４等のシグナル伝達に関わるリン酸化タンパク質などを挙げることができる。

標的編集ガイドＲＮＡは、例えば遺伝性疾患の治療に適用することができる。遺伝性疾患としては、嚢胞性線維症、白皮症、α－１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー表皮水疱症、Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連する障害、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、血友病、遺伝性ヘマクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュニャン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張型ジストロフィー型Ｉ及びＩＩ、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ、Ｂ及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連膵臓癌、パーキンソン病、ポイツ－ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異のようなプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホッフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、癌の様々な形態（例えばＢＲＣＡ１及び２関連乳癌、卵巣癌等）などが挙げられる。

第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の編集標的となるアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１０から２４残基の３’側オリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する３から６残基の３’側オリゴヌクレオチドとからなる。標的対応ヌクレオチド残基の５’側と３’側にそれぞれ連結するオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡと二本鎖を形成して、全体として相補鎖（以下、第一相補鎖ともいう）を形成することで、標的ＲＮＡ、及び標的ＲＮＡにおける編集標的部位が特定される。ここで相補的な塩基配列には、ワトソン－クリック型の塩基対を形成する塩基配列に加えて、例えば、Ｇ－Ｕ塩基対等の熱力学的に安定な非ワトソン－クリック型のゆらぎ塩基対を形成する塩基配列が含まれる。

標的対応ヌクレオチド残基は、編集標的となるアデノシン残基に対応するヌクレオチド残基であり、例えばシチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である。標的対応ヌクレオチド残基は、好ましくは編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基であり、より好ましくはシチジン残基又はその誘導体であり、さらに好ましくはシチジン残基である。

第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの残基数は、１０以上２４以下であり、好ましくは１１以上、１２以上または１３以上であり、また好ましくは２２以下、２０以下、１８以下、１６以下または１５以下である。残基数が前記範囲であると、ＡＤＡＲ１に対する特異性がより向上する傾向がある。

第１オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対してミスマッチ塩基を含まない相補的な塩基配列を有していてよい。その場合、標的ＲＮＡは編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結していないことが好ましい。すなわち、標的ＲＮＡの編集標的であるアデノシン残基の５’側に連結する塩基が、アデノシン残基、シチジン残基又はウリジン残基である場合、第１オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対してミスマッチ塩基を含まない相補的な塩基配列を有することが好ましい。

第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの塩基配列に対して非相補的な塩基を含んでいてもよい。例えば、編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結する標的ＲＮＡでは、編集誘導活性が低下する場合がある。その場合であっても、第１オリゴヌクレオチドが、そのグアノシン残基に対して非相補的な塩基を含む塩基配列を有することで編集誘導活性を向上させることができる。そのグアノシン残基に対する非相補的な塩基は、例えばグアノシン残基であってよい。すなわち、編集標的となるアデノシン残基の５’側にグアノシン残基が連結する標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡは、標的対応ヌクレオチド残基の３’側にグアノシン残基が連結していてよい。

第一オリゴヌクレオチドにおいて、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの残基数は、３以上６以下であり、好ましくは３以上５以下、３以上４以下または３である。残基数が前記範囲であると、ＡＤＡＲ１に対する特異性がより向上する傾向がある。

第二オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡと１個以上のミスマッチ塩基を含む相補鎖（以下、第二相補鎖ともいう）を形成する。第二オリゴヌクレオチドの残基数は、２以上１０以下または４以上８以下である。第二オリゴヌクレオチドの残基数は、例えば３以上であり、好ましくは４以上または５以上であり、また例えば１０以下であり、好ましくは９以下、８以下または７以下である。残基数が前記範囲内であると、編集誘導がより増進する傾向がある。第二相補鎖におけるミスマッチ塩基数は、例えば３以下であり、好ましくは１個である。

第二相補鎖におけるミスマッチ塩基は、ミスマッチ塩基対を形成するものであってよく、完全相補鎖を形成する標的ＲＮＡまたは第二オリゴヌクレオチドの少なくとも一方に挿入されるヌクレオチド残基に由来するものであってもよい。ミスマッチ塩基は、完全相補鎖に挿入されるヌクレオチド残基に由来するものであることが好ましく、完全相補鎖の標的ＲＮＡ側に挿入されるヌクレオチド残基に由来するものであることがより好ましい。これにより編集誘導がより増進される傾向がある。ここでミスマッチ塩基対とは、標的ＲＮＡ及び第二オリゴヌクレオチドにおける対応する２つの塩基が、安定な塩基対を形成しない組み合わせであることを意味する。

第二相補鎖におけるミスマッチ塩基の位置は、標的ＲＮＡと第一オリゴヌクレオチドからなる第一相補鎖の標的ＲＮＡの３’側または第一オリゴヌクレオチドの５’側の１残基目から３残基目のいずれであることが好ましく、１残基目であることがより好ましい。

第二相補鎖におけるミスマッチ塩基は、例えば、第一相補鎖を形成する標的ＲＮＡの３’側に連結する１残基目に挿入されたヌクレオチド残基に由来するものであってよく、第一相補鎖を形成する第一オリゴヌクレオチドの５’側の１残基目に形成されるミスマッチ塩基対であってよい。

標的編集ガイドＲＮＡの一態様は、標的ＲＮＡと第一相補鎖を形成する第一オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基としてのシチジン残基と、標的ＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結する残基数が１２から１６のオリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結する残基数が３のオリゴヌクレオチドとを含み、第二オリゴヌクレオチドが、第一相補鎖を形成する標的ＲＮＡの３’側の２残基目以降に相補的な塩基配列を有し、残基数が４から８のオリゴヌクレオチドを含む。

標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチド残基は、天然型のリボヌクレオチド残基であっても、非天然型の修飾ヌクレオチド残基であってもよい。修飾ヌクレオチド残基には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を修飾したもの、リボースの２’水酸基を修飾したもの、分子内架橋されたリボースを含むもの、プリン塩基及びピリミジン塩基の少なくとも一方を修飾したもの等が含まれる。ホスホジエステル結合部分の修飾の例としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ペプチド結合置換等が挙げられる。リボースの２’水酸基の修飾の例としては、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化、２’－Ｏ－メチルカルバモイルエチル化、３，３－ジメチルアリル化、デオキシリボヌクレオチド化等が挙げられる。リボースの分子内架橋体の例としては、２’位と４’位が架橋したヌクレオチド（２’，４’－ＢＮＡ）が挙げられる。２’，４’－ＢＮＡには、例えば、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ_３）、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’－アミノ－２’，４’－ＢＮＡ、５’－メチルＢＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミド型ＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ_３）等が挙げられる。塩基部分の修飾の例としては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、ｎ－プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ｎ－ブチル化、イソブチル化、ｓ－ブチル化、ｔ－ブチル化、シクロブチル化等のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化等が挙げられる。

標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼ１の存在下に、接触させることを含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡとミスマッチ塩基を含む二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼ１を特異的にリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで行われてもよく、ｉｎｖｉｖｏで行われてもよい。

標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、例えば、標的ＲＮＡを有する真核細胞に、上述した標的編集ガイドＲＮＡを導入又は発現させることで行うことができる。標的編集ガイドＲＮＡの真核細胞への導入方法には、核酸医薬で用いられる種々の手法から適宜選択して適用することができる。また標的編集ガイドＲＮＡを発現可能なプラスミド等を真核細胞に導入することで、真核細胞中に標的編集ガイドＲＮＡを発現させることができる。

標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法を、糖鎖修飾部位、リン酸化部位、金属配位部位等の細胞内タンパク質の機能発現に関わるアミノ酸の変異に適用することで、細胞内タンパク質機能を一時的に制御するという新たな方法論を提供することが可能になる。また標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法による生体内タンパク質の機能制御方法を一般化することで、生命科学分野の研究の発展に貢献できる分子技術となる。

従来、ｓｉＲＮＡによる標的タンパク質発現の抑制、又はアプタマーと呼ばれる機能性ＲＮＡによる標的タンパク質の機能制御を利用した核酸医薬が開発されている。しかしながら、ｍＲＮＡの情報を変換し、ｍＲＮＡがコードする標的タンパク質の機能を改変する医薬は未だ例を見ない。従って、標的編集ガイドＲＮＡは、これまでない薬効を示す新規核酸医薬品を生み出す可能性を秘めている。

例えば、ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異によって形成された終止コドンにより、本来のタンパク質が合成されなくことに起因する疾患である。ナンセンス変異型遺伝性疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルツハイマー病、神経組織変性、パーキンソン病などの神経疾患、癌などが挙げられる。例えば、標的編集ガイドＲＮＡによって、ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ等の終止コドンを編集することにより、上記疾患に対するこれまでにないメカニズムを有する核酸医薬としての用途が考えられる。具体的には例えば、終止コドンであるＵＡＧをトリプトファンコドンであるＵＩＧへと編集することで、タンパク質合成を制御することが考えられる。

また例えば、細胞内で重要な働きを持つタンパク質の多くは、リン酸化・脱リン酸化によって機能のＯＮ／ＯＦＦが精密に制御されており、リン酸化・脱リン酸化の異常が癌を含む様々な疾患に深く関与していることが示唆されている。タンパク質のリン酸化部位としてはＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ等を挙げることができる。標的編集ガイドＲＮＡによってこれらのアミノ酸をコードするコドンを他のアミノ酸をコードするコドンへと編集することにより、タンパク質のリン酸化を抑制することが可能になる。具体的には例えば、ＴｙｒコドンであるＵＡＣを、ＣｙｓコドンであるＵＩＣへと編集することで細胞内タンパク質のリン酸化を制御することができる。

本発明は、別の態様として、遺伝性疾患の処置に用いられる医薬組成物の製造における標的編集ガイドＲＮＡの使用、遺伝性疾患の処置における標的編集ガイドＲＮＡの使用、遺伝性疾患の処置に使用される標的編集ガイドＲＮＡをも包含する。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、処置の対象は、非ヒト動物であってもよい。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

アデノシンデアミナーゼの調製
アデノシンデアミナーゼとして、組換えｈＡＤＡＲ２及びｈＡＤＡＲ１ｐ１１０を、文献（Macbeth, MR. and Bass, BL. Methods Enzymol. 424, 319-331 (2007)、 Fukuda, M. et al. Sci. Rep. srep41478 (2017)）の記載に準じて、酵母発現系を用いて合成・精製して調製した。また、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０及びｈＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現するプラスミド（ｐＹＥＳ_Ａ_ｈＡＤＡＲ２ｐ１１０、ｐＹＥＳ_Ａ_ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０、ｐＹＥＳ_Ａ_ｈＡＤＡＲ１ｐ１５０）を常法により調製した。

モデル標的ＲＮＡの調製：Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡの合成
ｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ－２Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）から、常法により転写して調製したＲｌｕｃ＿ＷＴＲＮＡ（配列番号１）を０．２ｎＭになるように調製した。組み換えｈＡＤＡＲ２を終濃度１μＭとなるように加え、ｅｄｉｔｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭＭｇＣｌ_２，１００ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＤＴＴ，０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中において３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｉｎｖｉｔｒｏ編集反応を行なった。

編集反応後のＲｌｕｃ＿ＷＴＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。次いで、ＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号２）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＥｃｏＦ０１プライマー（配列番号３）及びＲｌｕｃ＿ＷＴ＿ＢａｍＲ０１プライマー（配列番号２）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）によりｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたｃＤＮＡをインサートＤＮＡとして、以下のようにしてｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。インサートＤＮＡ及びｐＵＣ１９プラスミドをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）及びＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のｐＵＣ１９プラスミドとインサートＤＮＡが１：３のモル比となるように混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を行い、Ｒｌｕｃ＿ＷＴのＡ１２２がＧに変異した配列（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）及びＲｌｕｃ＿Ｋ４１ＲがクローニングされたプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ）を得た。

ｐＵＣ１９－Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒを鋳型にして、５’側断片をＲｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー（配列番号４）とＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＲＶプライマー（配列番号５）、３’側断片をＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマー（配列番号６）とＲＬ＿Ｗ１０４Ｘ＿ＦＷプライマー（配列番号７）を用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により１ｓｔＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，４０秒）を行なった。次に、それぞれのＰＣＲ産物を１００倍希釈し、Ｒｌｕｃ＿ＮｈｅＦ０１プライマー及びＲｌｕｃ＿ＸｈｏＲ０１プライマーを用いてＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により２ｎｄＰＣＲ（３０サイクル、変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒）を行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１ＲのＧ３１１をＡに変異させた配列を有するＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）（配列番号１０）を得た。

得られたＤＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ）及びｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ－２Ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ）について、ＮｈｅＩ（ＴａＫａＲａ）及びＸｈｏＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて３７℃で１時間の制限酵素消化を行なった後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、それぞれのＤＮＡを精製した。制限酵素消化後のＲｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４ＸとｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ－２Ｖｅｃｔｏｒを３：１のモル比となるように混合し、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴａＫａＲａ）を用いてライゲーション反応を行なった。得られたライゲーションサンプルをＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ寒天プレートを用いて３７℃で一晩培養した。選別したコロニーをＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出した。その後、塩基配列解析により得られたプラスミドの配列を確認した。

配列を確認したプラスミドを鋳型に、Ｔ７＿Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号８）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号９）、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒））により、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応用の鋳型ＤＮＡを増幅し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅＴ７Ｋｉｔ（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｉｎｖｉｔｒｏ転写を行なってＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ（配列番号１１）を得た。合成後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡについて、８Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いて切り出し精製を行ない、以降の試験に用いた。

以下に、Ｒｌｕｃ＿ＷＴ＿ＲＮＡ、Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘ及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡの配列、並びに上記で用いたプライマーの配列を示す。なお、表中の下線は、編集標的のアデノシン残基を示す。

（実施例１）
モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（以下、ｇＲＮＡと表記することがある）として、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１－ｇＲＮＡ０１（配列番号１２）、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３（配列番号１３）及びＡＤ１－ｇＲＮＡ０４（配列番号１４）を常法により調製した。

（参考例１）
モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示す５’ＡＳＡＤ－ｇＲＮＡ（配列番号１５；以下、５’ＡＳと略記することがある）及び３’ＡＳＡＤ－ｇＲＮＡ（配列番号１６；以下、３’ＡＳと略記することがある）を、国際公開第２０１７／０１０５５６号の記載に準じて調製した。併せて、５’ＡＳ及び３’ＡＳにおけるアンチセンス領域（ＡＳＲ）の配列を有するオリゴリボヌクレオチド（以下、５’ＡＳＲ：配列番号１７；３’ＡＳＲ：配列番号１８）を常法により調製した。

モデル標的ＲＮＡとＡＤ１－ｇＲＮＡ０１等とから形成される複合体を示す概念図を図１に示す。図１に示すように、複合体では、編集標的のアデニン残基（Ａ）に対応するｇＲＮＡの残基がシチジン残基（Ｃ）になっており、ミスマッチ塩基対を形成している。また、モデル標的ＲＮＡの編集標的のアデニン残基から３’側の４残基目のシチジン残基に対応するｇＲＮＡ側の残基がなく、モデル標的ＲＮＡにミスマッチ塩基が挿入された状態になっている。

編集誘導活性の評価
上記で調製した標的編集ガイドＲＮＡを用いて、以下のようにして編集誘導活性を評価した。

アニーリング反応
０．３μＭのＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡと、０．９μＭの実施例１及び参考例１のｇＲＮＡとをアニーリングｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭＮａＣｌ）中で、８０℃，３ｍｉｎ加熱し、１５ｍｉｎかけて２５℃まで冷却した。

ｉｎｖｉｔｒｏ編集反応
アニーリング反応によりＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡがｇＲＮＡと完全に複合体を形成したと仮定し、以下のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体濃度を計算した。編集反応は、ｅｄｉｔｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），２ｍＭＭｇＣｌ２，１００ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＤＴＴ，０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）中、５ｎＭＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ－ｇＲＮＡ複合体に対して、組み換えｈＡＤＡＲ２を１２．５ｎＭ又は組み換えｈＡＤＡＲ１を２５０ｎＭ加え、３７℃で１時間インキュベートすることで行なった。なお、ｈＡＤＡＲ２及びｈＡＤＡＲ１の濃度は、これらによって編集されることが知られているＨＴＲ２ＣＲＮＡ（セロトニン２Ｃ型受容体ｍＲＮＡ前駆体）に対してそれぞれ編集反応を行った場合に、それぞれが同程度の編集割合を示すように調整した。

編集解析
編集反応後のＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製し、ＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号９）によりｃＤＮＡを合成した。その後、Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１９）及びＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマー（配列番号９）、並びにＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲ（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，２０秒）により、ｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡの配列解析はＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１９）、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＫｉｔを用いてシーケンシング反応を行ない、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３５００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。結果を図２に示す。また、得られた編集割合から、ｈＡＤＡＲ２による編集割合に対するｈＡＤＡＲ１による編集割合の比を算出した。結果を表７に示す。

ＡＤ１－ｇＲＮＡは、従来の標的編集ガイドＲＮＡ（５’ＡＳ，３’ＡＳ）と比べてｈＡＤＡＲ１に対して同程度の編集誘導活性を示した。また、ＡＤ１－ｇＲＮＡはｈＡＤＡＲ１に対して特異的に編集誘導活性を示した。

（実施例２）
モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１－ｇＲＮＡ０３．１（配列番号２０）、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３．２（配列番号２１）、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０３．３（配列番号２２）及びＡＤ１－ｇＲＮＡ０３．４（配列番号２３）を常法により調製した。

モデル標的ＲＮＡとＡＤ１－ｇＲＮＡ０３等とから形成される複合体を示す概念図を図３に示す。

編集誘導活性の評価
得られたオリゴリボヌクレオチドについて、上記と同様にして編集誘導活性を評価した。結果を図４及び表９に示す。なお、ｈＡＤＡＲ１として上記で用いたものとは異なるロットのものを用いたため、編集反応に用いたｈＡＤＡＲ１及びｈＡＤＡＲ２の濃度が実施例１とは異なっている。

標的編集ガイドＲＮＡにおける第二オリゴヌクレオチドの残基数によって、編集誘導活性及び特異性が変化することがわかる。

（実施例３）
モデル標的ＲＮＡにおけるミスマッチ塩基をＣの代わりにＡ、Ｕ、及びＧに変更したモデル標的ＲＮＡを上記と同様にして調製した。また、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１－ｇＲＮＡ０３Ｇｍ（配列番号２４）を常法により調製した。

ミスマッチ塩基を変更したモデル標的ＲＮＡとＡＤ１－ｇＲＮＡ０３から形成される複合体、及びモデル標的ＲＮＡとＡＤ１－ｇＲＮＡ０３Ｇｍから形成される複合体の概念図を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ｂに示すようにモデル標的ＲＮＡとＡＤ１－ｇＲＮＡ０３Ｇｍから形成される複合体では、編集標的以外のミスマッチ塩基は存在していない。

編集誘導活性の評価
ミスマッチ塩基を変更したモデル標的ＲＮＡに対するＡＤ１－ｇＲＮＡ０３の編集誘導活性、及びモデル標的ＲＮＡに対するＡＤ１－ｇＲＮＡ０３Ｇｍの編集誘導活性を、上記と同様にして評価した。結果を図６及び表１１に示す。

ｈＡＤＡＲ１に対する特異的な編集誘導活性にミスマッチ塩基の種類がある程度影響した。またミスマッチ塩基が存在しないＡＤ１－ｇＲＮＡ０３Ｇｍでは、ｈＡＤＡＲ１に対する特異性が低下した。

（実施例４）培養細胞内での編集誘導活性の評価１
ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０を以下のようにして構築した。また同様にしてＡＤＡＲ２を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２を構築した。

ｐＹＥＳ／ＮＴ＿Ａ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０を鋳型とし、０．３μＭＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＸｂａＦ０１プライマー（配列番号２５）、０．３μＭＡＤＡＲ１－ｃＭｙｃ－１ｓｔＲ０１プライマー（配列番号２６）を用いて伸長反応３分の条件で１ｓｔＰＣＲを行った。１００倍希釈した１ｓｔＰＣＲ産物を鋳型とし、０．３μＭＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＸｂａＦ０１プライマー（配列番号２５）と、０．３μＭｃＭｙｃ＿２ｎｄ＿ＨｉｎｄＲ０１プライマー（配列番号２７）とを用いて伸長反応３分の条件で２ｎｄＰＣＲを行い、インサートＤＮＡを増幅した。インサートＤＮＡとｐｃＤＮＡ３．１（－）ＨｙｇｒｏをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で１時間酵素反応を行った。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した後、２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ）に加えて形質転換を行い、ＬＢアンピシリン寒天培地で一晩培養した。生じたコロニーを鋳型とし、０．３μＭＴ７ｐｒｏＧＧＧプライマー（配列番号２８）、０．３μＭＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅプライマー（配列弁号２９）を用いて、伸長反応２分の条件でＰＣＲをし、インサートチェックを行い、目的断片長の増幅産物を生じたクローンを液培した。抽出したプラスミドの配列を０．１６５μＭＴ７ｐｒｏＧＧＧプライマー、０．１６５μＭＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．１６５μＭＡＤＡＲ１＿ｓｅｑＦ０１プライマー（配列番号３０）、０．１６５μＭＡＤＡＲ１＿ｓｅｑＦ０２プライマー（配列番号３１）、０．１６５μＭＡＤＡＲ１＿ｓｅｑＦ０３プライマー（配列番号３２）を用いてＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡＢＩ）を用いてシークエンシング反応し、塩基配列解析を行った。

（Ａ）細胞培養
ＨｅＬａ細胞を２４－ｗｅｌｌＰｌａｔｅに５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、４８時間培養した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ^ＴＭＨＰＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて５０ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２^ＴＭ＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘと、２５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ１ｐ１１０又はｐｃＤＮＡ３．１（－）Ｈｙｇｒｏ＿ＡＤＡＲ２と、２５０ｎｇのｇＲＮＡを発現するプラスミドとをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。ｇＲＮＡを発現するプラスミドとしては、５’ＡＳＡＤ－ｇＲＮＡ、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０１又はＡＤ１－ｇＲＮＡ０３を発現するプラスミドを、国際公開第２０１９／１１１９５７号の参考例２と同様にして構築して用いた。

（Ｂ）編集解析方法
２４－ｗｅｌｌＰｌａｔｅで培養した細胞から、セパゾールＲＮＡＩＳｕｐｅｒＧ（ナカライ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてＤＮａｓｅ処理を行った後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＴｏｔａｌＲＮＡ０．５μｇ、０．２５μＭＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１７（配列番号３３）を用いた逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを増幅した。ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号３４）、３’－Ａｄｐプライマー（配列番号３５）を用いて１ｓｔＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃，６０秒））を行った。１ｓｔＰＣＲ産物を２００倍希釈したｃＤＮＡを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｒｌｕｃ＿Ｆ０１プライマー（配列番号３４）、Ｒｌｕｃ＿Ｒ０１プライマー（配列番号３６）を用いて２ｎｄＰＣＲ（３０サイクル（変性：９８℃，１０秒、アニーリング：５５℃，１５秒、伸長：６８℃ ６０秒））を行い、Ｒｌｕｃフラグメントを増幅した。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１６５μＭＲｌｕｃ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー（配列番号１９）を用いてシーケンシング反応を行ない、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３５００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析した。シーケンシングにより得られたクロマトチャートより、標的部位（Ａ３１１）のピーク高比（Ｇ／（Ｇ＋Ａ））から編集割合（％）を算出した。結果を図７及び表１４に示す。

（Ｃ）ルシフェラーゼレポーターアッセイ方法
Ｄｕａｌ－ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２４－ｗｅｌｌＰｌａｔｅで培養した細胞に１００μＬのＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩ１００μＬを添加し、６０秒後、ＧｌｏＭａｘ^（Ｒ）２０／２０Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＦｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｆｌｕｃ）の発光強度を測定した。その後すぐに、Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＲｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）の発光強度を測定した。発光強度は、Ｆｌｕｃによりノーマライズした。結果を図８及び表１４に示す。

標的編集ガイドＲＮＡは、細胞内においてもＡＤＡＲ１特異的にＲＮＡ編集活性を誘導することがわかる。

（実施例５）培養細胞内での編集誘導活性の評価２
ｇＲＮＡを発現するプラスミドとして、以下に配列を示すＡＤ１－ｇＲＮＡ０５（配列番号３７）又はＡＤ１－ｇＲＮＡ０６（配列番号３８）を発現するプラスミドを上記と同様に構築して用いたこと以外は実施例４と同様にして、培養細胞内での編集誘導活性を評価した。結果を図９及び図１０に示す。また、モデル標的ＲＮＡと、ＡＤ１－ｇＲＮＡ０５又はＡＤ１－ｇＲＮＡ０６とから形成される複合体を示す概念図を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。

第一オリゴヌクレオチドを伸長することで、ＡＤＡＲ１への選択性を損なうことなく細胞内での編集誘導活性が改善されることがわかる。

（実施例６）
モデル標的ＲＮＡとして以下に配列を示すＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２（配列番号３９）を、上記と同様にして調製した。モデル標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ２００（配列番号４０）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと、並びにｈＡＤＡＲ１及びｈＡＤＡＲ２の濃度を実施例２と同様に変更したこと以外は実施例１と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＡｃＧＦＰ）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ２００）の編集誘導活性を評価した。結果を図１２及び表２１に示す。なお、モデル標的ＲＮＡの配列中、下線付き太文字は、編集標的のアデノシン残基を示し、下線はミスマッチ塩基を示す。また、編集割合の比は、ｈＡＤＡＲ１又はｈＡＤＡＲ２の存在下、標的編集ガイドＲＮＡの存在下における編集誘導活性から標的編集ガイドＲＮＡの非存在下における編集誘導活性を差し引いた値から算出した。

（実施例７）
モデル標的ＲＮＡとして以下に配列を示すＰＩＮＫ１＿ｓ０２（配列番号４１）を、上記と同様にして調製した。モデル標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１３１０（配列番号４２）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＰＩＮＫ１＿ｓ０２）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１３１０）の編集誘導活性を評価した。結果を図１２及び表２１に示す。

（実施例８）
モデル標的ＲＮＡとして以下に配列を示すＳＭＡＤ＿ｓＲＮＡ（配列番号４３）を、上記と同様にして調製した。モデル標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４（配列番号４４）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＳＭＡＤ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４）の編集誘導活性を評価した。結果を図１２及び表２１に示す。

（実施例９）
モデル標的ＲＮＡとして以下に配列を示すＡＣＴＢ＿ｓ０１（配列番号４５）を、上記と同様にして調製した。モデル標的ＲＮＡに対する標的編集ガイドＲＮＡとして、以下に配列を示すオリゴリボヌクレオチドＡＤ１ｇ＿０３＿ＡＣＴＢ（配列番号４６）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＡＣＴＢ＿ｓ０１）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＡＣＴＢ）の編集誘導活性を評価した。結果を図１２及び表２１に示す。

実施例６から９の評価結果に示されるように、標的ＲＮＡを変更した場合でも、ミスマッチ塩基を有する第２オリゴヌクレオチドを有する標的編集ガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ１特異的に編集活性を誘導することができる。

（実施例１０）
実施例１におけるモデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、実施例１における編集標的とは異なる位置のアデノシン残基に対する標的編集ガイドＲＮＡであるＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７（配列番号４７）及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧ（配列番号４８）を常法により調製した。

モデル標的ＲＮＡにおける編集標的となるアデノシン残基の５’側にはグアノシン残基が結合していて、そのグアノシン残基に対して、ＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７は相補的な塩基であるシチジン残基を有し、ＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧは非相補的な塩基であるグアノシン残基を有している。モデル標的ＲＮＡにおける編集標的となるアデノシン残基を太文字で、標的編集ガイドＲＮＡと相補鎖を形成する塩基配列に下線を付して以下に示す。図１３Ａには、モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）とＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７とから形成される複合体の概念図、図１３Ｂには、モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）とＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧとから形成される複合体の概念図を示す。

モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧ）の編集誘導活性を評価した。結果を図１４から図１６及び表２６に示す。図１４にはＡＤＡＲ１を用いた編集誘導活性を示し、図１５にはＡＤＡＲ２を用いた編集誘導活性を示す。図１６及び表２６には標的編集ガイドＲＮＡとしてＡＤ１ｇ＿０３＿ＲＬ＿Ａ２８７＿ＧＧを用いた場合の、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２による編集誘導活性及び編集割合の比を示す。

（実施例１１）
実施例６におけるモデル標的ＲＮＡ（ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、実施例６における編集標的とは異なる位置のアデノシン残基に対する標的編集ガイドＲＮＡであるＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ１９６（配列番号４９）及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ１９６＿ＧＧ（配列番号５０を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ１９６及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＧＦＰ＿Ａ１９６＿ＧＧ）の編集誘導活性を評価した。結果を図１４から図１６及び表２６に示す。

（実施例１２）
実施例７におけるモデル標的ＲＮＡ（ＰＩＮＫ１＿ｓ０２）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、実施例７における編集標的とは異なる位置のアデノシン残基に対する標的編集ガイドＲＮＡであるＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１４１１（配列番号５１）及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１４１１＿ＧＧ（配列番号５２）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＰＩＮＫ１＿ｓ０２）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１４１１及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＰＩＮＫ１＿Ａ１４１１＿ＧＧ）の編集誘導活性を評価した。結果を図１４から図１６及び表２６に示す。

（実施例１３）
実施例８におけるモデル標的ＲＮＡ（ＳＭＡＤ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡとして、実施例８における編集標的とは異なる位置のアデノシン残基に対する標的編集ガイドＲＮＡであるＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４＿Ａ２１５１（配列番号５３）及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４＿Ａ２１５１＿ＧＧ（配列番号５４）を常法により調製した。モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡを変更したこと以外は実施例６と同様にして、モデル標的ＲＮＡ（ＳＭＡＤ＿ｓＲＮＡ）に対する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４＿Ａ２１５１及びＡＤ１ｇ＿０３＿ＳＭＡＤ４＿Ａ２１５１＿ＧＧ）の編集誘導活性を評価した。結果を図１４から図１６及び表２６に示す。

図１６及び表２６に示されるように、ミスマッチ塩基を有する第２オリゴヌクレオチドを有する標的編集ガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ１特異的に編集活性を誘導することができる。また、図１４及び図１５に示されるように、標的ＲＮＡが編集標的塩基の５’側にグアノシン残基を有する場合、グアノシン残基に対して標的編集ガイドＲＮＡにミスマッチ塩基Ｇを導入することで、ＡＤＡＲ１による編集誘導活性が特に向上する。

日本国特許出願２０１９－１７７１１８号（出願日：２０１９年９月２７日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims

標的ＲＮＡが関与する遺伝性疾患を処置するためにアデノシンデアミナーゼ１の存在下で、編集標的となるアデノシン残基を含む前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するための医薬組成物であって、
標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記標的ＲＮＡと第一相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、前記標的ＲＮＡと相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは、前記第一相補鎖を構成する標的ＲＮＡ部分の３’側の１残基目に挿入される１つのミスマッチ塩基に対応するヌクレオチド残基が欠損しており、
前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基が、編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基である、
前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド
を含む、医薬組成物。
前記第二オリゴヌクレオチドの残基数が４から８である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数が１３以上１８以下である請求項１に記載の医薬組成物。
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの残基数が３である請求項１に記載の医薬組成物。
前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼ１による酵素反応に起因する請求項１に記載の医薬組成物。
前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼ１特異的である請求項１に記載の医薬組成物。
標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記標的ＲＮＡと第一相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、前記標的ＲＮＡと相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは、前記第一相補鎖を構成する標的ＲＮＡ部分の３’側の１残基目に挿入される１つのミスマッチ塩基に対応するヌクレオチド残基が欠損しており、
前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基が、編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基である、
前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼ１の存在下に、ｉｎｖｉｔｒｏで接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法。
真核細胞中で行われる請求項７に記載の編集方法。
標的ＲＮＡが関与する遺伝性疾患を処置するためにアデノシンデアミナーゼ１の存在下で、編集標的となるアデノシン残基を含む前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するための医薬組成物の製造における、
標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、
前記第一オリゴヌクレオチドの５’側に連結する第二オリゴヌクレオチドと、を含み、
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１０から２４残基のオリゴヌクレオチドと、
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から６残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記標的ＲＮＡと第一相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは残基数が２から１０であり、前記標的ＲＮＡと相補鎖を形成する塩基配列を有し、
前記第二オリゴヌクレオチドは、前記第一相補鎖を構成する標的ＲＮＡ部分の３’側の１残基目に挿入される１つのミスマッチ塩基に対応するヌクレオチド残基が欠損しており、
前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基が、編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基である、
前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドの使用。