JP7743246B2 - 標的ｒｎａ検出方法及びプローブキット - Google Patents

Description

本発明は、標的ＲＮＡ検出方法及びプローブキットに関し、より詳しくは、標的ＲＮＡ検出方法、及びこれに好適に用いることができるプローブキットに関する。

細胞内には、タンパク質へと翻訳されない短鎖ＲＮＡが多量に存在している。これらの短鎖ＲＮＡには、機能がないと考えられていた時期もあったが、１９９０年代以降の研究により、生体において重要な役割があることが明らかとなってきている。例えば、かかる短鎖ＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）と称される１９～２５塩基長程度の一本鎖ＲＮＡは、遺伝子の発現を調節することによって細胞機能において重要な役割を果たすことが明らかになっている。

ｍｉＲＮＡの産生プロセスは、典型的には次のとおりである。すなわち、先ず、ゲノム上のｍｉＲＮＡ遺伝子がＲＮＡポリメラーゼで転写されることによって、ヘアピン構造を含むｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ）が産生され、次いで、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが核内ＲＮａｓｅであるＤｒｏｓｈａに切断さることによって、６０～７０塩基のヘアピン構造であるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ）が産生される。次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、核内から細胞質に輸送され、細胞質内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒに切断されることによって、２１～２４塩基の二本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）となる。次いで、ｍｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘは、Ａｇｏタンパク質に取り込まれ、二本鎖の片側のＲＮＡ鎖のみが最終的に成熟型ｍｉＲＮＡとなる。

成熟型ｍｉＲＮＡは、Ａｇｏタンパク質と結合してＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）を形成する。ＲＩＳＣは、これに含まれる成熟型ｍｉＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を部分的に有する標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することで、多数の遺伝子の発現を調節することが知られている。

また、ｍｉＲＮＡは、様々な疾患との関連性が深いことも明らかになってきている。近年では、例えば、癌等の様々な疾患において発現異常を示すｍｉＲＮＡが報告されていることから、かかるｍｉＲＮＡをこれら疾患の診断ツールとして検出する技術の開発が期待されている。

ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡを検出する方法としては、予め、標的ＲＮＡと特異的に結合するプローブを搭載したマイクロアレイを使用するマイクロアレイ法が多く用いられている（例えば、特許文献１等）。

また、ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡを検出する方法としては、他に、核酸増幅法も用いられており、例えば、標的ｍｉＲＮＡをポリアデニル化してポリＡ配列を付加した上で、ポリＴ配列と標的ｍｉＲＮＡの塩基配列に相補的な配列とを含むプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行い、このｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行うことで、標的ｍｉＲＮＡを検出する方法が開発されている（特許文献２）。

さらに、例えば、標的ｍｉＲＮＡの塩基配列に相補的な３’領域とステムループとを有するプライマーに標的ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせて、前記プライマーの伸長反応を行い、伸長反応させたプライマーを鋳型として核酸増幅を行うことで、標的ｍｉＲＮＡを検出する方法も開発されている（特許文献３）。

また、核酸増幅法によって核酸を検出する方法としては、例えば、ＲＮＡを一部に含むキメラプローブを標的ＤＮＡにハイブリダイズさせ、それにより生じたＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド鎖をリボヌクレアーゼで切断して遊離させたキメラプローブの断片をプライマーとして伸長反応を行うことにより、標的ＤＮＡを検出する方法も開発されている（特許文献４）。

さらに、特定のポリヌクレオチドを検出する方法としては、例えば、非検出ポリヌクレオチド配列と、これと相補的な塩基配列を含む標識核酸プローブとをハイブリダイズさせ、これにより生じたＤＮＡ・ＲＮＡハイブリット鎖を、抗ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体を用いて検出する方法も開発されており（特許文献５）、標的ｍｉＲＮＡに、これと相補的な塩基配列を含むビオチン化ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、これにより生じたＤＮＡ－ＲＮＡ－ビオチン複合体を、抗ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で検出するためのキットがＢｉｏＶｅｎｄｏｒ社によって開発されている（非特許文献１）。

特開２００７－０７５０９５号公報 米国特許出願公開第２００９／０２２０９６９号明細書 米国特許第７５７５８６３号 特開２００８－３０７０２９号公報 特開昭６０－１７９６５７号公報

ＤＥＮＩＳファーマ株式会社、"ｍｉＲＥＩＡ－ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ"、［ｏｎｌｉｎｅ］、［２０２１年８月５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｓｃｅｔｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｍａｇｅｓ／ｕｐｌｏａｄ／ｆｌｙｅｒ／１６／１６．ｐｄｆ＞

しかしながら、マイクロアレイ法は、操作が複雑である、高価であるといった課題を有している。また、一般的に用いられているマイクロアレイ法や核酸増幅法においては、標的となる核酸を一旦増幅反応させた後に検出するため増幅反応の精度に結果が左右されることが多く、また逆転写反応によって検出精度にバラツキが生じる場合もあり、試料中の標的核酸の量を厳密に反映できないという課題があった。さらに、本発明者らは、従来の抗ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体を用いてＤＮＡ－ＲＮＡ複合体をＥＬＩＳＡ法で検出する方法では、標的ＲＮＡの種類によっては感度が不十分であり、ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡの検出においては特に、適用できる標的ＲＮＡが限定されてしまうという課題を有していることも新たに見出した。

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡであっても、高感度かつ簡便に検出することができる標的ＲＮＡ検出方法、並びに、これに好適に用いることができるプローブキットを提供することを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、標的ＲＮＡとＤＮＡプローブとをハイブリダイズさせた複合体を、抗ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体で捕捉して検出する方法において、前記ＤＮＡプローブを、標識物質を結合させるＤＮＡプローブと、ステムループ構造を形成し、かつ、そのステム領域がＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドとなるキメラプローブと、の２種類に分割して設計したところ、これらのプローブを組み合わせて用いることにより、標的ＲＮＡがｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡであっても、検出感度を著しく向上できることを見出した。さらに、この方法においては、核酸増幅反応を含む必要がないため、増幅反応の精度に拠らず、試料中の標的ＲＮＡ量を反映した高精度の定量も可能となる。

また、かかる方法によれば、加熱等の温度管理をしなくとも、ハイブリッドから検出までの工程を等温で行ない、標的ＲＮＡ量を高精度で検出することが可能であり、上記の核酸増幅反応が不要であることにも合わせて、従来よりも飛躍的に簡便に標的ＲＮＡを検出できることも本発明者らは見出し、本発明を完成するに至った。

かかる知見により得られた本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
標的ＲＮＡを検出する方法であり、
（Ｉ）一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域、及び第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域に対して、
前記標的ＲＮＡの第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブ、及び
前記標的ＲＮＡの第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブ
をハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
（ＩＩ）非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体で、前記標的ＲＮＡ、前記ＤＮＡプローブ、及び前記キメラプローブの複合体を捕捉する捕捉工程と、
（ＩＩＩ）前記捕捉体に捕捉された前記複合体を検出する検出工程と、
を含む、標的ＲＮＡ検出方法。
［２］
前記検出工程が、領域ＳＧに結合させた標識物質に由来するシグナルを指標として前記複合体を検出する工程である、［１］に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［３］
前記標的ＲＮＡが、長さが１９～２５塩基長の一本鎖ＲＮＡ分子である、［１］又は［２］に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［４］
前記リンカーが、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列である、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［５］
前記リンカーの長さが３～５０塩基長である、［４］に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［６］
塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さがそれぞれ３～３０塩基長である、［１］～［５］のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［７］
前記ハイブリダイズ工程の温度が１５～６０℃である、［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［８］
前記非水溶性担体が粒子担体である、［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
［９］
一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブと、
前記標的ＲＮＡの第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブと、
を含む、プローブキット。
［１０］
前記ＤＮＡプローブの領域ＳＧに結合可能な標識物質をさらに含む、［９］に記載のプローブキット。
［１１］
塩基配列Ｄ１の長さ及び塩基配列Ｄ２の長さの合計が１０～１００塩基長である、［９］又は［１０］に記載のプローブキット。
［１２］
前記リンカーが、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列である、［９］～［１１］のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
［１３］
前記リンカーの長さが３～５０塩基長である、［１２］に記載のプローブキット。
［１４］
塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さがそれぞれ３～３０塩基長である、［９］～［１３］のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
［１５］
非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体をさらに含む、［９］～［１４］のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
［１６］
前記非水溶性担体が粒子担体である、［１５］に記載のプローブキット。
［１７］
［１］～［８］のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法に用いるためのキットである、［９］～［１６］のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。

なお、本発明の構成によって上記目的が達成される理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、本発明では、上記のように、標的ＲＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡプローブを、標識物質を結合させるＤＮＡプローブと、ステムループ構造を形成し、かつ、ステム領域がＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドとなるキメラプローブと、の２種類に分割している。これらのプローブの塩基配列は、標的ＲＮＡの塩基配列に基づいて設計され、当該標的ＲＮＡ上の互いに重複しない領域（第一の領域、第二の領域）にハイブリダイズする。このとき、前記キメラプローブのステムループ構造により、前記標的ＲＮＡの塩基長に加えて、ステム領域分の塩基長のＲＮＡが付加されるため、抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体による認識部位が増加したことが同標的ＲＮＡの検出の高感度化につながったと推察される。

さらに、標的ＲＮＡの全長にＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる従来の方法では、その塩基長に応じて、当該ＤＮＡプローブのＴｍ値が高くなる傾向にある。ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリダイズは低温でも可能であるが、十分なハイブリダイズの精度を維持するためには、通常、Ｔｍ値よりも５℃程度低い温度（例えば５５℃以上）であることが必要であり、これよりも低い温度でハイブリダイズさせると非特異性が上がって精度が低下してしまう。これに対して、本発明では、上記のように標的ＲＮＡにハイブリダイズさせるプローブを２つに分割しているため、各プローブのＴｍ値を低くすることができ、ハイブリッドから検出までの工程を常温（例えば３７℃程度以下）かつ、等温（全工程を同じ温度）で行なっても十分なハイブリダイズの精度を維持することが可能となったと推察される。そのため、上記の核酸増幅反応が不要であることも合わせて、従来よりも飛躍的に簡便に標的ＲＮＡを高感度で検出できることが可能となったと本発明者らは推察する。

本発明によれば、ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡであっても、高感度かつ簡便に検出することができる標的ＲＮＡ検出方法、並びに、これに好適に用いることができるプローブキットを提供することが可能となる。

本発明に係る標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、キメラプローブ、及びこれらの複合体の一形態を示す模式概念図である。 本発明に係る標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、キメラプローブ、及びこれらの複合体の他の一形態を示す模式概念図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜標的ＲＮＡ検出方法＞
本発明の標的ＲＮＡ検出方法は、
（Ｉ）一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域、及び第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域に対して、
前記標的ＲＮＡの第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブ、及び
前記標的ＲＮＡの第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブ
をハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
（ＩＩ）非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体で、前記標的ＲＮＡ、前記ＤＮＡプローブ、及び前記キメラプローブの複合体を捕捉する捕捉工程と、
（ＩＩＩ）前記捕捉体に捕捉された前記複合体を検出する検出工程と、
を含む、方法である。

以下、本発明の標的ＲＮＡ検出方法の好ましい形態について、場合により図１及び図２を参照しながら例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。図１及び図２は、それぞれ、本発明に係る標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、キメラプローブ、及びこれらの複合体の一形態を示す模式概念図である。以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

なお、本発明において、「ＤＮＡからなる塩基配列」とは、デオキシリボヌクレオチドからなる塩基配列（オリゴＤＮＡ）であることを示し、「ＲＮＡからなる塩基配列」とは、リボヌクレオチドからなる塩基配列（オリゴＲＮＡ）であることを示し、「ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列」とは、デオキシリボヌクレオチドからなる塩基配列、リボヌクレオチドからなる塩基配列、又は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなる塩基配列（オリゴヌクレオチド）であることを示す。

また、本発明に係る標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、及びキメラプローブを構成するヌクレオチドとしては、それぞれ独立に、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、また例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。さらに、本発明に係るＤＮＡプローブ及びキメラプローブを構成する塩基配列を得る方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、市販の合成機によって化学的に合成し、合成オリゴヌクレオチドとして製造することができる。

さらに、本発明において、ある塩基配列（又は領域）に対して「相補的な塩基配列」とは、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成可能な塩基配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、「塩基配列（又は領域、以下同じ）Ｘと塩基配列（又は領域、以下同じ）Ｙとが相補的である」という場合、かかるハイブリダイズの条件としては、塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとの配列相補性として、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。なお、前記配列相補性は、当業者であれば公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いて適宜計算することができる。また、前記ハイブリダイズの条件としては、塩基配列Ｘが、塩基配列Ｙの全長に対して完全に相補的な塩基配列の１～複数個所において、連続して１～５塩基長（好ましくは１～３塩基長、例えば、３塩基長、２塩基長、１塩基長）の塩基が挿入、欠失、又は置換されたものであってもよい。

（標的ＲＮＡ）
本発明において、「標的ＲＮＡ」とは、本発明の標的ＲＮＡ検出方法によって検出する目的のＲＮＡである。本発明において、前記標的ＲＮＡとしては、下記のＤＮＡプローブ及びキメラプローブがハイブリダイズしうるものであれば特に制限されず、下記のＤＮＡプローブ及びキメラプローブがハイブリダイズする領域が一本鎖であればよく、かかる一本鎖を部分的に含む二本鎖であっても、ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造等の３次元構造を有するものであってもよい。

これらの中でも、本発明に係る標的ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、断片ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等が挙げられる。本発明の標的ＲＮＡ検出方法を特に有効に適用することができる観点からは、長さが１０～１０００００塩基長であるＲＮＡ分子であることが好ましく、長さが１５～３０塩基長である一本鎖ＲＮＡ分子であることがより好ましく、ｍｉＲＮＡであることがさらに好ましい。なお、「ｍｉＲＮＡ」とは、通常、１９～２５塩基長の一本鎖ＲＮＡ分子を示し、タンパク質には翻訳されず、真核生物において、主に、遺伝子の転写後の発現調節に関与するといわれている。

ｍｉＲＮＡは、各種疾患のマーカーとしても知られており、このようなｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ２１－５ｐ、Ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ１１８５－３ｐ、ｍｉＲ６８７５－５ｐ、ｍｉＲ１７－３ｐ、ｍｉＲ４２１、ｍｉＲ２７－ａ－３ｐ、ｍｉＲ１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－１３０６－５ｐ等が知られている。これらの中でも、特に、ｍｉＲ２１－５ｐ、Ｌｅｔ７ａ、ｍｉＲ１１８５－３ｐ、ｍｉＲ６８７５－５ｐ、ｍｉＲ１７－３ｐ、ｍｉＲ４２１、ｍｉＲ２７－ａ－３ｐ、ｍｉＲ１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ等については、本発明の標的ＲＮＡ検出方法によって従来の検出方法よりも特に高感度で検出することが可能である。

このような標的ＲＮＡとしては、特に制限されず、当該標的ＲＮＡを含みうる試料から抽出されたものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記標的ＲＮＡを含みうる試料としても特に制限されず、例えば、化学合成したＲＮＡを含む溶液の他、各種生物（細胞、組織、器官、個体を含む）及びその抽出液；ヒト及び動物の体液（唾液、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、鼻汁、涙、汗、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液、精液、羊水等）や糞便；植物生体液；生物培養液；環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）；固形物（土壌、燃え殻等）の懸濁液等を目的に応じて適宜用いることができる。また、前記試料としては、希釈液で適宜希釈又は懸濁したものであっても、適宜ｐＨ調整したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、ナトリウムリン酸バッファー、ＴｒｉＳ緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等の生化学緩衝液が挙げられる。さらに、前記試料から標的ＲＮＡを抽出する方法としては、適宜公知の方法を採用することができる。

下記のＤＮＡプローブ及びキメラプローブとの対応を示すために、以下場合により、便宜的に、標的ＲＮＡの一本鎖部分を、互いに重複しない第一の領域及び第二の領域を含むものとする。図１の（ａ１）に示すように、第一の領域（１１１）を標的ＲＮＡ（１１０）の５’末端側に設定する場合には、第二の領域（１１２）は、第一の領域の側の他方の末端、すなわち、同標的ＲＮＡ上の３’末端側に設定され、図２の（ａ２）に示すように、第一の領域（１２１）を標的ＲＮＡ（１２０）の３’末端側に設定する場合には、第二の領域（１２２）は、第一の領域の側の他方の末端、すなわち、同標的ＲＮＡ上の５’末端側に設定されるものとする。

ただし、第一の領域及び第二の領域の態様は、図１及び図２に示した態様に限られるものではなく、例えば、第一の領域（１１１、１２１）は、標的ＲＮＡの一本鎖部分（１１０、１２０）の末端部分を含んでいなくともよく、この場合、第一の領域は、標的ＲＮＡ上の５’末端又は３’末端から１塩基長以上の領域分を空けて配置されていてもよい。他方、第二の領域（１１２、１２２）は、標的ＲＮＡ（１１０、１２０）の末端部分を含んでいる（すなわち、標的ＲＮＡ上の５’末端又は３’末端から１塩基目より配置される）ことが好ましい。また、第一の領域と第二の領域とは、互いに隣接していなくともよく、１塩基長以上（例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合、好ましくは、１～１５塩基長）の領域（スペーサー）を介して配置されていてもよいが、互いに隣接していることがより好ましい。

本発明に係る第一の領域の長さ及び第二の領域の長さの好ましい範囲は、下記の塩基配列Ｄ１の長さ及び塩基配列Ｄ２の長さの好ましい範囲とそれぞれ対応する。

（ＤＮＡプローブ）
本発明に係る「ＤＮＡプローブ」は、前記標的ＲＮＡの第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むオリゴヌクレオチドプローブである。

本発明に係るＤＮＡプローブの全長としては、前記標的ＲＮＡの長さに応じて調整可能であるが、例えば、５～１００塩基長であることが好ましく、１０～６０塩基長であることがより好ましく、１５～４０塩基長であることがさらに好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、１５～３０塩基長であることが好ましい。

〔塩基配列Ｄ１〕
本発明に係る塩基配列Ｄ１は、前記標的ＲＮＡの第一の領域と相補的であって、ＤＮＡからなる塩基配列である。このような塩基配列Ｄ１は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、目的の標的ＲＮＡの第一の領域の塩基配列に合わせて、より好ましくは、下記のキメラプローブや他の領域にハイブリダイズすることがないように、適宜設計及び調製することができる。

本発明に係る塩基配列Ｄ１の長さとしては、５塩基長以上であることが好ましく、５～５０塩基長であることがより好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、５～２０塩基長であることが好ましい。塩基配列Ｄ１の長さが前記下限未満であると、標的ＲＮＡの第一の領域とハイブリダイズしにくくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、非特異反応が生じやすくなる傾向にある。

〔領域ＳＧ〕
本発明に係る領域ＳＧは、標識物質を結合可能な部位からなる領域である。領域ＳＧ（標識物質を結合可能な部位）としては、複数のヌクレオチドからなる領域であっても、特定のヌクレオチドの一部の箇所のみからなる領域であってもよい。なお、領域ＳＧが複数のヌクレオチドからなる領域である場合、領域ＳＧに含まれるヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。

かかる領域ＳＧの態様としては、特に制限されず、図１及び図２において、塩基配列Ｄ１（２１１、２２１）と領域ＳＧ（２１２、２２２）とは互いに別の領域として、領域ＳＧが塩基配列Ｄ１（２１１）の３’末端側（２１２）又は塩基配列Ｄ１（２２１）の５’末端側（２２２）に隣接して１つずつ配置されているが、領域ＳＧは、塩基配列Ｄ１に含まれていても、複数あってもよい。また、塩基配列Ｄ１と領域ＳＧとが別の領域である場合には、塩基配列Ｄ１と領域ＳＧとは、１～５０塩基長（好ましくは、１～２０塩基長）の領域（スペーサー）を介して配置されていてもよい。前記スペーサーとしては、例えば、ポリＡ配列が挙げられる。これらの中でも、領域ＳＧの態様としては、ＤＮＡプローブが標的ＲＮＡ及びキメラプローブと複合体（４１０、４２０）を形成したときに、塩基配列Ｄ１の、下記の塩基配列Ｄ２が配置される側とは他方の末端側に、必要に応じてスペーサーを介して、配置されることが好ましい。

前記標識物質を結合可能な部位としては、特に制限されず、下記の標識物質との結合方法によって適宜選択することができる。例えば、下記の標識物質とＤＮＡプローブとをビオチンとストレプトアビジン（又はアビジン）との結合を介して結合させる場合、前記標識物質を結合可能な部位としては、ビオチンにより修飾された部位が挙げられる。このようなビオチンによる修飾（ビオチン化）の方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、塩基配列Ｄ１の合成中にビオチンホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を用いてその５’末端にビオチンを導入して前記ＤＮＡプローブとする方法；５’－Ａｍｉｎｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏを合成して、ｂｉｏｔｉｎ－Ｘ－ＮＨＳエステル試薬を用いてｏｌｉｇｏのアミノ基にビオチン残基を付加する方法等が挙げられるが、特に制限されるものではない。

〔標識物質〕
本発明の標的ＲＮＡ検出方法においては、ＤＮＡプローブに、領域ＳＧを介して標識物質を結合させ、かかる標識物質に由来するシグナルを指標として標的ＲＮＡを検出する。前記標識物質は、下記のハイブリダイズ工程（Ｉ）の前に前記ＤＮＡプローブに予め結合させておいても、同ハイブリダイズ工程（Ｉ）の後又は下記の捕捉工程（ＩＩ）の後に前記ＤＮＡプローブに結合させてもよい。

前記標識物質としては、公知の免疫学的測定方法やそれに準じた方法において標識物質として用いられているものを特に制限なく用いることができる。例えば、酵素；ラテックス粒子、金コロイド粒子等の粒子；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の低分子量標識物質；アクリジニウム誘導体等の発光物質；ユーロピウム等の蛍光物質；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光タンパク質；^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ等の放射性物質が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。

例えば、前記標識物質として酵素を用いる場合には、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光基質、発色基質、蛍光基質等を基質として添加することにより、当該基質に応じて種々の検出を行うことができる。前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、グルコースオキシダーゼ、β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼを挙げることができる。これらの中でも、感度が特に高い観点からは、ルシフェラーゼ等の生物発光酵素が好ましい。

前記標識物質を領域ＳＧに結合させる方法としては、前記標識物質と前記ＤＮＡプローブとを直接的に結合させても、間接的に結合させてもよい。

直接的に結合させる場合には、下記のハイブリダイズ工程（Ｉ）の前に前記ＤＮＡプローブに予め結合させておくことが好ましく、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法により直接結合させることができる。

間接的に結合させる場合には、例えば、前記ＤＮＡプローブに結合する介在分子等を介して結合させることにより、前記標識物質を前記ＤＮＡプローブに間接的に結合させることができる。前記介在分子としては、特に制限されず、従来公知のものを適宜用いることができる。また、前記ＤＮＡプローブの領域ＳＧとして、何らかの修飾を行い、その修飾部分を捕捉する物質を前記標識物質に結合させて、前記標識物質を前記ＤＮＡプローブに間接的に結合させてもよい。例えば、前記修飾部分の代表例としてはビオチンが、その修飾部分を捕捉する物質の代表例としてはストレプトアビジン又はアビジンが、それぞれ挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（キメラプローブ）
本発明に係る「キメラプローブ」は、前記標的ＲＮＡの第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチドプローブである。

本発明に係るキメラプローブの全長としては、前記標的ＲＮＡの長さに応じて調整可能であるが、例えば、１０～２００塩基長であることが好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、１５～５０塩基長であることが好ましい。

〔塩基配列Ｄ２〕
本発明に係る塩基配列Ｄ２は、前記標的ＲＮＡの第二の領域と相補的であって、ＤＮＡからなる塩基配列である。このような塩基配列Ｄ２は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、目的の標的ＲＮＡの第二の領域の塩基配列に合わせて、より好ましくは、前記ＤＮＡプローブや他の領域にハイブリダイズすることがないように、適宜設計及び調製することができる。

本発明に係る塩基配列Ｄ２の長さとしては、５塩基長以上であることが好ましく、５～５０塩基長であることがより好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、５～２０塩基長であることが好ましい。塩基配列Ｄ２の長さが前記下限未満であると、標的ＲＮＡの第二の領域とハイブリダイズしにくくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、非特異反応が生じやすくなったり、前記標的ＲＮＡが短鎖ＲＮＡの場合に塩基配列Ｄ１が結合しにくくなる傾向にある。

また、本発明において、塩基配列Ｄ２の長さと、塩基配列Ｄ１の長さとの合計長さとしては、１０～１００塩基長であることが好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、１０～２５塩基長であることが好ましい。前記合計長さが前記下限未満であると、標的ＲＮＡとハイブリダイズしにくくなったり、抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体が認識しにくくなる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、非特異反応が生じやすくとなる傾向にある。

さらに、本発明において、塩基配列Ｄ２の長さと、塩基配列Ｄ１の長さとの比としては、標的ＲＮＡの塩基配列に応じて、標的ＲＮＡの長さ、塩基配列Ｄ１と第一の領域との間の配列相補性、塩基配列Ｄ２と第二の領域との間の配列相補性、塩基配列Ｄ１から求められるＴｍ値と塩基配列Ｄ２から求められるＴｍ値とのバランス等を考慮して設定されるものであるため一概にはいえないが、例えば、塩基配列Ｄ２の塩基長：塩基配列Ｄ１の塩基長で、１：９～９：１であることが好ましく、例えば前記標的ＲＮＡが前記ｍｉＲＮＡである場合には、１：４～４：１であることが好ましく、１：３～４：１であることがより好ましい。

〔塩基配列ＳＤ、リンカー、塩基配列ＳＲ〕
本発明に係る塩基配列ＳＤはＤＮＡからなる塩基配列であり、塩基配列ＳＲはＲＮＡからなる塩基配列であり、リンカーは、これら塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとを繋ぐ領域である。

本発明に係るキメラプローブは、標的ＲＮＡ及びＤＮＡプローブと複合体（４１０、４２０）を形成したときに、塩基配列Ｄ２の、塩基配列Ｄ１が配置される側とは他方の末端側に、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する。このようなステムループ構造を形成するキメラプローブの態様としては、前記標的ＲＮＡ上に設定する第一の領域及び第二の領域の位置、並びに、組み合わせるＤＮＡプローブに応じて、図１に示すように、３’末端側から、塩基配列Ｄ１（３１１）－塩基配列ＳＤ（３１２）－リンカー（３１３）－塩基配列ＳＲ（３１４）－５’となる態様（３１０）であっても、図２に示すように、５’末端側から、塩基配列Ｄ１（３２１）－塩基配列ＳＤ（３２２）－リンカー（３２３）－塩基配列ＳＲ（３２４）－３’となる態様（３２０）であってもよい。

塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは、互いに相補的な塩基配列からなり、前記ステムループ構造において、ＤＮＡ・ＲＮＡキメラであるステム領域を形成する。このような塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さとしては、特に制限されないが、それぞれ独立して、３～３０塩基長であることが好ましい。また、互いに同じ長さであることが好ましい。塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さが前記下限未満であると、互いにハイブリダイズすることが困難となる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、非特異反応が生じやすくなったり、抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体が標的となる複合体と競合してしまい、反応性が低下する傾向にある。

リンカーは、前記ステムループ構造において、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとをヘアピンループ状に繋げるループ領域を形成する。このようなリンカーとしては、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとを結合できる線状分子であれば特に制限されない。例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、その他一般的にリンカーと呼ばれる周知の線状分子を用いることができる。これらの中でも、本発明に係るリンカーとしては、前記キメラプローブを製造する際に、オリゴヌクレオチドである塩基配列ＳＤ及び塩基配列ＳＲの化学合成と共に一貫して容易に製造可能であるという観点から、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチドからなる塩基配列、リボヌクレオチドからなる塩基配列、及び、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなる塩基配列が挙げられる。リンカーによって塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとが繋がれているため、容易に上記のステム構造を形成して標的ＲＮＡに塩基配列ＳＲからなるＲＮＡを付加することができる。

本発明に係るリンカーの長さとしては、オリゴヌクレオチドである場合、３～５０塩基長であることが好ましく、５～２０塩基長であることがより好ましい。リンカーの長さが前記下限未満であると、ヘアピンループ状に折れ曲がることが困難となる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、自己アニールが優先的に行われなくなってステム構造を形成することが困難となる傾向にある。

塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲの配列は、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとが上記ハイブリダイズの条件を満たすように、より好ましくはＤＮＡプローブや他の領域にハイブリダイズすることがないように、適宜設計及び調製することができる。

（捕捉体）
本発明に係る捕捉体は、非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む複合体であって、前記非水溶性担体と前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とが直接的又は間接的に結合してなる。

〔非水溶性担体〕
本発明において、「非水溶性担体」としては、抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を固定させて担持できるものであり、かつ、常温常圧下において水に不溶である限り特に制限はなく、免疫学的測定法等において従来公知の非水溶性担体が挙げられる。

より具体的には、例えば、ポリスチレンラテックス粒子やポリエチレンラテックス粒子といったラテックス粒子、金コロイド粒子といった金属コロイド粒子、ゼラチン粒子、磁性体粒子等の粒子担体；ポリスチレン製のウェルプレート等のプレート担体；ニトロセルロース、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースなどの繊維からなるメンブレン担体等が挙げられ、一般的に用いられる素材のものであれば人工素材、天然素材、及びこれらの混合素材のいずれでもよい。これらの中でも、本発明に係る非水溶性担体としては、自動化が容易である観点から、粒子担体であることが好ましく、磁性体粒子であることがより好ましい。

本発明において、「担持」は固相化（固定化ともいう）と同義であり、前記担持の方法としては、物理吸着法や化学結合法等、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができる。

〔抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体〕
本発明において、「抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体」とは、リボヌクレオチドからなるオリゴＲＮＡとこれに相補的なデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴＤＮＡとの二本鎖ヌクレオチド（本明細書中、場合により「ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ」という）と特異的に結合する抗体を示す。

本発明において、「抗体」には、完全な抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー等）や抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含まれる。また、本発明に係る抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体としては、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることがより好ましい。本発明に係る抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体は、従来公知の産生方法を適宜採用、改良することによって産生することができ、また、一般に流通されているものを適宜用いてもよい。

本発明に係る捕捉体は、前記非水溶性担体に前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を結合させることによって製造することができる。かかる製造方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、前記非水溶性担体に前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を直接的に結合させてもよく、間接的に結合させてもよい。

直接的に結合させる場合には、例えば、前記非水溶性担体及び／又は前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体として活性基を有するものを用い、又は必要に応じて前記活性基を付与することにより、当該活性基によって前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を前記非水溶性担体に直接結合させることができる。また、前記非水溶性担体がプレートである場合には、プレート上に前記被抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を塗布し、必要に応じてブロッキングした後、これを乾燥させることにより、前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を前記非水溶性担体に直接結合させることができる。

間接的に結合させる場合には、例えば、前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体に結合する介在分子等を介して結合させることにより、前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を前記非水溶性担体に間接的に結合させることができる。前記介在分子としては、特に制限されず、例えば、前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体に結合可能な二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、前記活性基を有する分子等が挙げられる。また、前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体に何らかの修飾を行い、その修飾部分を捕捉する物質を前記非水溶性担体に固定化して、前記非水溶性担体上に前記抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体を固定してもよい。例えば、前記修飾部分の代表例としてはビオチンが、その修飾部分を捕捉する物質の代表例としてはストレプトアビジン又はアビジンが、それぞれ挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような捕捉体としては、市販のものを適宜用いてもよい。

（複合体）
上記のように、前記ＤＮＡプローブの塩基配列Ｄ１及び前記キメラプローブの塩基配列Ｄ２は、それぞれ、前記標的ＲＮＡの第一の領域及び第二の領域の塩基配列に基づいて設計されるため、これらをハイブリダイズさせることにより、標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、及びキメラプローブからなる複合体（標的ＲＮＡ－ＤＮＡプローブ－キメラプローブ複合体（本明細書中、場合により単に「複合体」という））が形成される。標的ＲＮＡの５’末端側に第一の領域を設定した場合には、図１の（ｂ１）に示すように、その第一の領域（１１１）に相補的な塩基配列Ｄ１（２１１）がハイブリダイズし、かつ、第二の領域（１１２）に相補的な塩基配列Ｄ２（３１１）がハイブリダイズするため、標的ＲＮＡ（１１０）、ＤＮＡプローブ（２１０）、及びキメラプローブ（３１０）からなる複合体（４１０）が形成される。このとき、キメラプローブ（３１０）の５’末端側には塩基配列ＳＤ（３１２）、リンカー（３１３）、及び塩基配列ＲＤ（３１４）によってステムループ構造が形成され、標的ＲＮＡ（１１０）の３’末端側に塩基配列ＲＤ（３１４）分のＲＮＡが配置される。標的ＲＮＡの３’末端側に第一の領域を設定した場合には、図２の（ｂ２）に示すように、５’末端と３’末端とが図１と逆の態様となる。

（ハイブリダイズ工程（Ｉ））
本発明の標的ＲＮＡ検出方法は、第一の工程として、前記標的ＲＮＡに対して、前記ＤＮＡプローブ、及び前記キメラプローブをハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程を含む。

前記ハイブリダイズ工程においては、前記標的ＲＮＡと、前記ＤＮＡプローブと、前記キメラプローブとを接触させることにより、前記複合体（標的ＲＮＡ－ＤＮＡプローブ－キメラプローブ複合体）を形成させることができる。前記接触方法としては特に制限されず、３者を同時に接触させても、前記標的ＲＮＡに前記ＤＮＡプローブ及び前記キメラプローブを同時又は別々に添加しても、前記ＤＮＡプローブ又は前記キメラプローブに他を同時又は別々に添加してもよい。

前記ハイブリダイズ工程の反応系には、適宜反応バッファーを添加してもよい。前記反応バッファーとしては、ｐＨ５～９の公知の緩衝液（例えば、ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、界面活性剤、塩、防腐剤、安定化剤（Ｍｇなど）、タンパク質等が適宜添加されたものであってもよい。

前記ハイブリダイズ工程において、前記ＤＮＡプローブ及び前記キメラプローブの使用量としては、それぞれ独立に、前記反応系において、例えば、１０ｆＭ～１０ｍＭであることが好ましく、１０ｐＭ～１０μＭであることがより好ましい。

本発明において、前記ハイブリダイズ工程の温度としては、例えば、１５～６０℃の範囲が挙げられるが、本発明に係るハイブリダイズ工程は、加温が不要な比較的低温で行なうことが可能であり、このような温度としては、例えば、２５～４０℃の範囲が挙げられる。反応時間としては、特に制限されないが、例えば、５～６０分間の範囲が挙げられる。

（捕捉工程（ＩＩ））
本発明の標的ＲＮＡ検出方法は、第二の工程として、前記捕捉体で、前記複合体（標的ＲＮＡ－ＤＮＡプローブ－キメラプローブ複合体）を捕捉する捕捉工程を含む。

前記捕捉工程においては、前記複合体と、前記捕捉体とを接触させることにより、前記複合体のＤＮＡ・ＲＮＡキメラと抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体との結合を介して、前記複合体を前記非水溶性担体に捕捉させ、同複合体を固相化させることができる。前記接触方法としては特に制限されず、前記捕捉体に前記ハイブリダイズ後の複合体（例えば反応液）を添加しても、前記捕捉体（例えば粒子懸濁液）を前記複合体に添加してもよい。また、下記のようにハイブリダイズ工程と捕捉工程とは同時並行で行なうことが可能であるため、前記捕捉体の存在下で前記ハイブリダイズ工程を行ってもよい。前記捕捉工程の反応系には、適宜反応バッファーを添加してもよい。前記反応バッファーとしては、前記ハイブリダイズ工程において挙げたものと同じものが挙げられる。

本発明において、前記捕捉工程の温度としては、特に制限されず、例えば、２５～４０℃の範囲が挙げられる。反応時間としても特に制限されず、例えば、５～６０分間の範囲が挙げられる。本発明の標的ＲＮＡ検出方法では、上記のハイブリダイズ工程の温度と捕捉工程の温度とを等温にすることが可能であり、簡便性の観点から好ましい。また、そのため、前記ハイブリダイズ工程と前記捕捉工程とは、同条件で同時に行なうことが可能である。

（洗浄工程）
本発明の標的ＲＮＡ検出方法には、前記捕捉工程の後に、前記捕捉体に捕捉された複合体と、それ以外の前記捕捉体に結合していない（捕捉されていない）夾雑物とを分離し、前記夾雑物を除去する洗浄工程をさらに含むことが好ましい。前記夾雑物を除去する方法としては、特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記捕捉体が抗体固相化プレートである場合にはプレート上から液相（上清）を除去する方法や、抗体固相化粒子である場合には前記粒子を遠心や集磁によって回収して液相（上清）を除去する方法が挙げられる。また、前記洗浄工程においては、必要に応じて、洗浄液の注入及び除去を繰り返してもよい。

前記洗浄液としては、例えば、ｐＨ５～９の公知の緩衝液（例えば、ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、界面活性剤、塩、防腐剤、安定化剤（Ｍｇなど）、タンパク質等が適宜添加されたものであってもよい。

（検出工程（ＩＩＩ））
本発明の標的ＲＮＡ検出方法は、第三の工程として、前記捕捉体に捕捉された前記複合体を検出する検出工程を含む。

前記検出工程においては、前記標識物質に由来するシグナルを検出する。例えば、前記標識物質が酵素である場合には、当該酵素に対応する発色基質や発光基質を添加して反応させることによって生じるシグナルを検出する。前記ＤＮＡプローブとして前記標識物質を予め結合させていないものを用いた場合には、前記ＤＮＡプローブの領域ＳＧに結合可能な標識物質をこの検出工程で添加してもよい。このような標識物質としては、例えば、領域ＳＧがビオチン化された部位である場合には、ストレプトアビジン（又はアビジン）化された標識物質が挙げられる。

これにより、前記標識物質に応じたシグナルを検出し、前記複合体の有無、すなわち試料中の標的ＲＮＡの有無を、前記シグナルの有無により検出することができる。本発明において、「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、消光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。例えば、前記標識物質としてルシフェラーゼ等の生物発光酵素を用いた場合には、ルシフェリン等の基質の添加によって生じる発光を前記シグナルとして検出することができる。

さらに、試料中に標的ＲＮＡが存在する場合には、当該試料中の標的ＲＮＡ量をシグナル量（例えば発光強度）として得ることができ、また、必要に応じて標準試料におけるシグナル量との比較をすることによって試料中の標的ＲＮＡ量を定量することができる。

＜プローブキット＞
本発明は、上記の本発明の標的ＲＮＡ検出方法に好適に用いることが可能なプローブキットも提供する。本発明のプローブキットは、
一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブと、
前記標的ＲＮＡの第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブと、
を含む、キットである。

本発明のプローブキットとしては、前記ＤＮＡプローブの領域ＳＧに結合可能な標識物質、並びに、非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体からなる群から選択される少なくとも１種をさらに含んでいることが好ましい。

本発明のプローブキットにおいて、標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、キメラプローブ、標識物質、及び捕捉体としては、その好ましい態様も含めて、それぞれ、本発明の標的ＲＮＡ検出方法において述べたとおりである。

本発明のプローブキットにおいて、標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、キメラプローブ、標識物質、及び捕捉体（例えば抗体固相化粒子）としては、緩衝液、ブロッキング剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。

また、本発明のプローブキットとしては、前記希釈液、前記反応バッファー、前記洗浄液、標的ＲＮＡを抽出・精製するための試薬、各標識物質の検出に必要な試薬（例えば、各酵素反応に必要な基質）、他の緩衝液、ｐＨ調整剤等の試薬、標準ＲＮＡ、対照試薬、使用説明書等をさらに備えていてもよい。

以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各実施例及び比較例に用いた標的ＲＮＡ、ＤＮＡプローブ、及びキメラプローブは、それぞれ以下のものを用いた。

＜ｍｉＲ６８７５－５ｐ＞
（１）標的ＲＮＡ１として、下記の表１に示すｍｉＲ６８７５－５ｐ（２１塩基長、配列番号１）を常法で合成したものを用いた。

（２）ＤＮＡプローブとしては、標的ＲＮＡ１の塩基配列に基づいて、その全長にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ６８７５－５ｐ－全長、配列番号２）、標的ＲＮＡ１の３’末端の１４塩基にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１４ｎｔ）、配列番号３）、標的ＲＮＡ１の３’末端の１３塩基にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１３ｎｔ）、配列番号４）、標的ＲＮＡの３’末端の１２塩基にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１２ｎｔ）、配列番号５）をそれぞれ常法で合成したものを用いた。これらＤＮＡプローブとしては、５’末端にポリＡを付加し、かつ、その５’末端にビオチンを付加したものをそれぞれ用いた。

（３）キメラプローブとしては、標的ＲＮＡ１の塩基配列に基づいて、その５’末端の７塩基にハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡ・ＲＮＡキメラのステム領域を含むステムループを形成する（すなわち、図２（ａ２）の３２０の構造を形成する）キメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）Ａ ＬＯＯＰ５ｎｔ及びｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）ｓｔｅｍ８ｎｔを兼ねる）、配列番号６）を常法で合成したものを用いた。さらに、キメラプローブとして、ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）の、標的ＲＮＡ１の５’末端の塩基配列とハイブリダイズする塩基長を８塩基にしたキメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（８ｎｔ）、配列番号７）、及び９塩基にしたキメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（９ｎｔ）、配列番号８）をそれぞれ常法で合成したものも用いた。

（４）また、キメラプローブとして、ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）のループ部分（Ａ×５）のＡの数を１０塩基としたキメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）Ａ ＬＯＯＰ１０ｎｔ、配列番号９）、及び２０塩基としたキメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）Ａ ＬＯＯＰ２０ｎｔ、配列番号１０）をそれぞれ常法で合成したものも用いた。

（５）さらに、キメラプローブとして、ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）のステム部分（Ｇ×８、Ｃ×８）のＧ、Ｃの数をそれぞれ１０塩基としたキメラプローブ（ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）ｓｔｅｍ１０ｎｔ、配列番号１９）を常法で合成したものも用いた。

＜ｍｉＲ１４９－３ｐ＞
（１）標的ＲＮＡ２として、下記の表１に示すｍｉＲ１４９－３ｐ（ｍｉＲ１４９、２１塩基長、配列番号１１）を常法で合成したものを用いた。

（２）ＤＮＡプローブとしては、標的ＲＮＡ２の塩基配列に基づいて、その全長にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ１４９－全長、配列番号１２）、標的ＲＮＡ２の３’末端の１４塩基にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ１４９－ｓｈｏｒｔ、配列番号１３）を常法で合成したものを用いた。これらＤＮＡプローブとしては、５’末端にポリＡを付加し、かつ、その５’末端にビオチンを付加したものをそれぞれ用いた。

（３）キメラプローブとしては、標的ＲＮＡ２の塩基配列に基づいて、その５’末端の７塩基にハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡ・ＲＮＡキメラのステム領域を含むステムループを形成する（すなわち、図２（ａ２）の３２０の構造を形成する）キメラプローブ（ｍｉＲ１４９－Ｃｈｉｍｅｒａ、配列番号１４）を常法で合成したものを用いた。

＜ｍｉＲ１２６８ｂ＞
（１）標的ＲＮＡ３として、下記の表１に示すｍｉＲ１２６８ｂ（２０塩基長、配列番号１５）を常法で合成したものを用いた。

（２）ＤＮＡプローブとしては、標的ＲＮＡ３の塩基配列に基づいて、その全長にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ１２６８ｂ－全長、配列番号１６）、標的ＲＮＡ３の３’末端の１３塩基にハイブリダイズするＤＮＡプローブ（ｍｉＲ１２６８ｂ－ｓｈｏｒｔ、配列番号１７）を常法で合成したものを用いた。これらＤＮＡプローブとしては、５’末端にポリＡを付加し、かつ、その５’末端にビオチンを付加したものをそれぞれ用いた。

（３）キメラプローブとしては、標的ＲＮＡ３の塩基配列に基づいて、その５’末端の７塩基にハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡ・ＲＮＡキメラのステム領域を含むステムループを形成する（すなわち、図２（ａ２）の３２０の構造を形成する）キメラプローブ（ｍｉＲ１２６８ｂ－Ｃｈｉｍｅｒａ、配列番号１８）を常法で合成したものを用いた。

（試験例１）生物発光酵素免疫測定法によるキメラプローブの効果の確認
（１）先ず、公知の方法により、抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体を抗体固相化用磁性粒子に固相化させた。これをアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの抗体固相化磁性粒子懸濁液を調製した。

（２）次いで、各標的ＲＮＡを１×１０^６又は１×１０^７ｃｐ／μＬ、及び各プローブを１０ｎＭ含むハイブリダイズ液を常温（約２５℃）で混合し、調製した。各標的ＲＮＡ及びプローブは、下記の表２に示す組み合わせで用い、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせた場合には、それぞれの濃度が１０ｎＭとなるように前記ハイブリダイズ液を調製した。次いで、前記ハイブリダイズ液２００μＬ、前記抗体固相化磁性粒子懸濁液２０μＬ、及び緩衝液（塩及び界面活性剤を含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液）４０μＬを混合し、３７℃で１５分間反応させた。

（３）以下、「ＢＬＥＩＡ（登録商標）‘栄研’Ｈ．ピロリ抗原（栄研化学株式会社製）」付属のプロトコールに準じ、全自動生物化学発光免疫測定装置「ＢＬＥＩＡ（登録商標）－１２００（栄研化学株式会社製、以下同じ）」を用いて、標的ＲＮＡを検出した。

すなわち、先ず、上記（２）の反応後、ＢＬＥＩＡ（登録商標）－１２００用の洗浄液で磁性粒子を含む固相を５回洗浄し、洗浄液を除去後、ＢＬＥＩＡ（登録商標）－１２００用の標識ストレプトアビジンを８０μＬ添加して攪拌し、３７℃で１５分間反応させた。

次いで、前記洗浄液で磁性粒子を含む固相を５回洗浄した後、洗浄液を除去した。これに、ＢＬＥＩＡ（登録商標）－１２００用のＢＬ発光試薬１を５０μＬ加えて攪拌した後、ＢＬＥＩＡ（登録商標）－１２００用のＢＬ発光基質を５０μＬ加えて攪拌し、ルシフェラーゼによる波長４８０～６５０ｎｍ（λｍａｘ：５６０ｎｍ）における発光強度（ＰＣ）を測定した。また、各標的ＲＮＡ及びプローブの組み合わせについて、標的ＲＮＡを添加しないこと以外は上記と同様にして発光強度を測定し、コントロール（ＮＣ）とした。

（４）各標的ＲＮＡ及びプローブの組み合わせ（実施例１～５、比較例１～３）について、次式：Ｓ／Ｎ比＝ＰＣ／ＮＣにより、それぞれＳ／Ｎ比を算出した。また、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例）に対する、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例）のＳ／Ｎ比（対比較例）をそれぞれ算出した。結果を下記の表２に示す。

表２に示したように、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例１～３）に比べて、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例１～５）には、検出強度を示すＳ／Ｎ比が、標的ＲＮＡ１（ｍｉＲ６８７５－５ｐ）では約１２倍、標的ＲＮＡ２（ｍｉＲ１４９－３ｐ）では約９６倍、標的ＲＮＡ３（ｍｉＲ１２６８ｂ）では約２３倍と、いずれの標的ＲＮＡでも著しく高くなった。これより、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いることにより、ｍｉＲＮＡを高感度で検出可能となることが確認された。

（試験例２）キメラプローブによる定量性確認
試験例１と同様の方法により、キメラプローブを用いたときの定量性を確認した。具体的には、標的ＲＮＡ１（ｍｉＲ６８７５－５ｐ）を１×１０^４～１×１０^９ｃｐ／μＬとなるように調整してそれぞれ用いたこと以外は、試験例１の比較例１及び実施例３と同様にして各発光強度（ＰＣ及びＮＣ）を測定し、Ｓ／Ｎ比を算出した。結果を下記の表３に示す。

表３に示したように、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例３）にも、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例１）と同様に、標的ＲＮＡ１の濃度に応じてＳ／Ｎ比が増加した。

（試験例３）生物発光酵素免疫測定法によるキメラプローブのループ領域の長さ検討
試験例１と同様の方法により、キメラプローブのループ領域（Ａ ＬＯＯＰ）の長さを検討した。具体的には、標的ＲＮＡ１（ｍｉＲ６８７５－５ｐ）を１×１０^６ｃｐ／μＬ、及び各プローブを１０ｎＭ含むハイブリダイズ液を調製し、各プローブを下記の表４に示す組み合わせとしたこと以外は、試験例１と同様にして各発光強度（ＰＣ及びＮＣ）を測定し、Ｓ／Ｎ比を算出した。また、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例４）に対する、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例６～８）のＳ／Ｎ比（対比較例）をそれぞれ算出した。結果を下記の表４に示す。

表４に示したように、試験例１と同様に、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例４）に比べて、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例６～８）には、いずれの場合にもＳ／Ｎ比が高くなった。中でも、キメラプローブのループ領域（Ａ ＬＯＯＰ）の塩基数が５塩基長である場合（実施例６）が最も高くなった。これは、ループ領域がより短い方がステム領域をより形成しやすいためと推察される。

（試験例４）生物発光酵素免疫測定法によるステム長さ検討
試験例１と同様の方法により、キメラプローブのステム領域（ｓｔｅｍ）の長さを検討した。具体的には、標的ＲＮＡ１（ｍｉＲ６８７５－５ｐ）を１×１０^６ｃｐ／μＬ、及び各プローブを１０ｎＭ含むハイブリダイズ液を調製し、各プローブを下記の表５に示す組み合わせとしたこと以外は、試験例１と同様にして各発光強度（ＰＣ及びＮＣ）を測定し、Ｓ／Ｎ比を算出した。また、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例４）に対する、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例９～１０）のＳ／Ｎ比（対比較例）をそれぞれ算出した。結果を下記の表５に示す。

表５に示したように、試験例１と同様に、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例４）に比べて、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例９～１０）には、いずれの場合にもＳ／Ｎ比が高く、ステム領域（ｓｔｅｍ）の長さ（塩基数）には影響を受けなかった。

（試験例５）酵素免疫測定法によるキメラプローブの効果の確認
「ｍｉＲＥＩＡ－ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ社製）」付属のプロトコールに準じ、標的ＲＮＡを検出した。すなわち、前記キットのｍｉＲＮＡとして標的ＲＮＡ３（ｍｉＲ１２６８ｂ）を用い、ビオチン化ＤＮＡプローブとして下記の表６に記載の組み合わせでＤＮＡプローブ及びキメラプローブを用いたこと以外は、前記キットにより、同キットに付属のプロトコールにしたがって測定を行った。具体的には、先ず、サーマルサイクラーにより、８５℃で３分、４℃で２分、３７℃で５分にてプローブのプレヒートを行なった後、抗体固相化プレートにおいてインキュベーションした。その後、抗体固相化プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＰＲ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）コンジュケートを添加してインキュベーションした後、再度洗浄し、ＴＭＢ基質を添加して生じた発光強度を測定した。なお、各プローブは、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｓｉｏｎ作製時に０．１７μＭになるように添加した。

発光強度は、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定し、これらの差（波長４５０ｎｍにおける発光強度－波長６３０ｎｍｎｍにおける発光強度）をＰＣとした。また、標的ＲＮＡを添加しないこと以外は上記と同様にしてコントロール（ＮＣ）値を得た。さらに、次式：Ｓ／Ｎ比＝ＰＣ／ＮＣにより、それぞれＳ／Ｎ比を算出し、また、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例５）に対する、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例１１）のＳ／Ｎ比（対比較例）も算出した。結果を下記の表６に示す。

表６に示したように、酵素免疫測定法によっても、プレヒートを行わなかった生物発光酵素免疫測定法に比べて低下はしたものの、ＤＮＡプローブを単独で用いたとき（比較例５）、すなわち、従来の抗ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体を用いてＤＮＡ－ＲＮＡ複合体をＥＬＩＳＡ法で検出する方法に比べて、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いたとき（実施例１１）には、Ｓ／Ｎ比が高くなった。これより、酵素免疫測定法によっても、ＤＮＡプローブとキメラプローブとを組み合わせて用いることにより、ｍｉＲＮＡを高感度で検出可能となることが確認された。

以上説明したように、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡであっても、高感度かつ簡便に検出することができる標的ＲＮＡ検出方法、並びに、これに好適に用いることができるプローブキットを提供することが可能となる。

１１０、１２０…標的ＲＮＡ、１１１、１２１…第一の領域、１１２、１２２…第二の領域、２１０、２２０・・・ＤＮＡプローブ、２１１、２２１・・・塩基配列Ｄ１、２１２、２２２・・・領域ＳＧ、３１０、３２０・・・キメラプローブ、３１１、３２１・・・塩基配列Ｄ２、３１２、３２２・・・塩基配列ＳＤ、３１３、３２３・・・リンカー、３１４、３２４・・・塩基配列ＲＤ、４１０、４２０・・・標的ＲＮＡ－ＤＮＡプローブ－キメラプローブ複合体。

配列番号：２
＜２２３＞ ｍｉＲ６８７５－５ｐ－全長
配列番号：３
＜２２３＞ ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１４ｎｔ）
配列番号：４
＜２２３＞ ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１３ｎｔ）
配列番号：５
＜２２３＞ ｍｉＲ６８７５－５ｐ－ｓｈｏｒｔ（１２ｎｔ）
配列番号：６
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）
＜２２３＞ ２１～２８はＲＮＡを示す
配列番号：７
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（８ｎｔ）
＜２２３＞ ２２～２９はＲＮＡを示す
配列番号：８
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（９ｎｔ）
＜２２３＞ ２３～３０はＲＮＡを示す
配列番号：９
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）Ａ ＬＯＯＰ１０ｎｔ
＜２２３＞ ２６～３３はＲＮＡを示す
配列番号：１０
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）Ａ ＬＯＯＰ２０ｎｔ
＜２２３＞ ３６～４３はＲＮＡを示す
配列番号：１２
＜２２３＞ ｍｉＲ１４９－全長
配列番号：１３
＜２２３＞ ｍｉＲ１４９－ｓｈｏｒｔ
配列番号：１４
＜２２３＞ ｍｉＲ１４９－Ｃｈｉｍｅｒａ
＜２２３＞ ２１～２８はＲＮＡを示す
配列番号：１６
＜２２３＞ ｍｉＲ１２６８ｂ－全長
配列番号：１７
＜２２３＞ ｍｉＲ１２６８ｂ－ｓｈｏｒｔ
配列番号：１８
＜２２３＞ ｍｉＲ１２６８ｂ－Ｃｈｉｍｅｒａ
＜２２３＞ ２１～２８はＲＮＡを示す
配列番号：１９
＜２２３＞ ｍｉＲ－６８７５－５ｐ－Ｃｈｉｍｅｒａ（７ｎｔ）ｓｔｅｍ１０ｎｔ
＜２２３＞ ２３～３２はＲＮＡを示す

Claims (17)

1. 標的ＲＮＡを検出する方法であり、
   （Ｉ）一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域、及び第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域に対して、
   前記標的ＲＮＡの第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブ、及び
   前記標的ＲＮＡの第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブ
   をハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
   （ＩＩ）非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体で、前記標的ＲＮＡ、前記ＤＮＡプローブ、及び前記キメラプローブの複合体を捕捉する捕捉工程と、
   （ＩＩＩ）前記捕捉体に捕捉された前記複合体を検出する検出工程と、
   を含み、
   第一の領域の長さが５～５０塩基長であり、
   第二の領域の長さが５～５０塩基長であり、
   第一の領域と第二の領域とは互いに隣接しており、
   前記ＤＮＡプローブにおいて、領域ＳＧは、前記ＤＮＡプローブが前記標的ＲＮＡ及び前記キメラプローブと複合体を形成したときに、塩基配列Ｄ１の、塩基配列Ｄ２が配置される側とは他方の末端側に配置されている、
   ことを特徴とする、標的ＲＮＡ検出方法。
2. 前記検出工程が、領域ＳＧに結合させた標識物質に由来するシグナルを指標として前記複合体を検出する工程であることを特徴とする、請求項１に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
3. 前記標的ＲＮＡが、長さが１９～２５塩基長の一本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
4. 前記リンカーが、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列であることを特徴とする、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
5. 前記リンカーの長さが３～５０塩基長であることを特徴とする、請求項４に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
6. 塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さがそれぞれ３～３０塩基長であることを特徴とする、請求項１～５のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
7. 前記ハイブリダイズ工程の温度が１５～６０℃であることを特徴とする、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
8. 前記非水溶性担体が粒子担体であることを特徴とする、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法。
9. 一本鎖の標的ＲＮＡの５’末端側又は３’末端側の第一の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ１、及び標識物質を結合可能な領域ＳＧを含むＤＮＡプローブと、
   前記標的ＲＮＡの第一の領域の側の他方の末端を含みかつ第一の領域と重複しない第二の領域と相補的なＤＮＡからなる塩基配列Ｄ２、ＤＮＡからなる塩基配列ＳＤ、リンカー、及びＲＮＡからなる塩基配列ＳＲをこの順で含み、かつ、塩基配列ＳＤと塩基配列ＳＲとは互いに相補的な塩基配列からなり、塩基配列ＳＤ、リンカー、及び塩基配列ＳＲはステムループ構造を形成する、キメラプローブと、
   を含み、
   第一の領域の長さが５～５０塩基長であり、
   第二の領域の長さが５～５０塩基長であり、
   第一の領域と第二の領域とは互いに隣接しており、
   前記ＤＮＡプローブにおいて、領域ＳＧは、前記ＤＮＡプローブが前記標的ＲＮＡ及び前記キメラプローブと複合体を形成したときに、塩基配列Ｄ１の、塩基配列Ｄ２が配置される側とは他方の末端側に配置されている、
   ことを特徴とする、プローブキット。
10. 前記ＤＮＡプローブの領域ＳＧに結合可能な標識物質をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のプローブキット。
11. 塩基配列Ｄ１の長さ及び塩基配列Ｄ２の長さの合計が１０～１００塩基長であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のプローブキット。
12. 前記リンカーが、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列であることを特徴とする、請求項９～１１のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
13. 前記リンカーの長さが３～５０塩基長であることを特徴とする、請求項１２に記載のプローブキット。
14. 塩基配列ＳＤの長さ及び塩基配列ＳＲの長さがそれぞれ３～３０塩基長であることを特徴とする、請求項９～１３のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
15. 非水溶性担体と前記非水溶性担体に固定された抗ＤＮＡ・ＲＮＡキメラ抗体とを含む捕捉体をさらに含むことを特徴とする、請求項９～１４のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。
16. 前記非水溶性担体が粒子担体であることを特徴とする、請求項１５に記載のプローブキット。
17. 請求項１～８のうちのいずれか一項に記載の標的ＲＮＡ検出方法に用いるためのキットであることを特徴とする、請求項９～１６のうちのいずれか一項に記載のプローブキット。