JP7743980B2 - ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞 - Google Patents

ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞

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Description

本発明は、他家投与可能なヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞及びその製造法に関する。
抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その細胞表面上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原（ＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡクラスＩ）と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である当該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮し、攻撃する。また、ＣＴＬの一部は、長期生存型メモリーＴ細胞となって、異物に対する細胞傷害性を維持したまま宿主内に記憶され、次いで異物に曝露された場合に対応できるようになっている。従って、ＣＴＬは、ウイルス感染患者、がん疾患における免疫細胞療法の細胞として期待されている。
慢性ウイルス感染患者やがん患者においては、慢性的に抗原に曝露されるためＴ細胞が疲弊、老化して、効果を発揮できないため、多くの場合Ｔ細胞療法の効果が得られない。そのためｉＰＳ技術を用いて疲弊したＴ細胞を機能的に若返らせ、得られた若返りＴ細胞を患者に投与するｉＰＳ細胞由来若返りＴ細胞療法は、がん治療効果向上の有効な手段となることが期待されている。この若返りＴ細胞療法に用いるＣＴＬを得る手段として、抗原特異性を有するＴ細胞からＴ細胞由来ｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）を樹立して、もとのＴ細胞のＴＣＲ遺伝子の組み換え構造を保ったまま、再びＣＴＬやキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）などに分化誘導する方法が開発された（特許文献１）。
しかし、これらの方法では、作成に５ヶ月かかり、作成コストも高額になるという課題がある。これに対し、予め他家ＣＴＬ由来ｉＰＳ細胞をストックしておき、若返りＴ細胞（ｒｅｊＴ）を作成すれば、より迅速に患者に投与することができ、患者一人当たりのコストも削減できるが、ＨＬＡが一致しなければ拒絶され、抗腫瘍効果減弱の問題が生じる。
この問題を解決するために、ＨＬＡクラスＩ発現を消失させ、患者ＣＤ８+Ｔ細胞に拒絶されない他家ｒｅｊＴを作製すれば、抗原特異的ＣＴＬの強力な抗腫瘍効果を維持しながら、多くの重症患者に迅速に投与が可能となる。健常人ドナー由来同種細胞を、バリデーションストックしたｉＰＳ細胞が多くの患者に投与可能となるために、ＨＬＡゲノム編集によりＢ２ＭをノックアウトしてＨＬＡクラスＩ抗原を消失させる方法が有望であるが、その場合ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答を抑える必要がある。この手段として、ｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩを消失させてＨＬＡ－Ｅのみを発現させた細胞を分化誘導し、ＮＫ細胞からの攻撃を回避する手段（非特許文献１）、ＨＬＡクラスＩとクラスIIを消失させた上でＰＤ－Ｌ１，ＨＬＡ－Ｇと‘‘ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ ｍｅ’’ｓｉｇｎａｌ ＣＤ４７を発現させる手段（非特許文献２）、ＨＬＡ－ＡとＢを消失させ、ＨＬＡ－Ｃは保持する手段（非特許文献３）など、ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答を回避するためのいくつかの編集方法が既に報告されている。
特許第６１６４７４６号公報
Gornalusse GG, Hirata RK, Funk SE, Riolobos L, Lopes VS, Manske G, et al. HLA-E-expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells. Nature biotechnology. 2017;35(8):765-72. Han X, Wang M, Duan S, Franco PJ, Kenty JH, Hedrick P, et al. Generation of hypoimmunogenic human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2019;116(21):10441-6. Xu H, Wang B, Ono M, Kagita A, Fujii K, Sasakawa N, et al. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility. Cell stem cell. 2019;24(4):566-78 e7.
しかし、いずれの手段でも、ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答の回避と、本来有する抗原特異的ＣＴＬ活性の保持のバランスという面で十分満足できるものではなかった。
従って、本発明の課題は、抗原特異的ＣＴＬの強力な抗腫瘍効果を維持しながら、ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答を回避でき、他家投与可能なヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞及びその製造法を提供することにある。
そこで、本発明者は、ヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞に対して、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性のＣＴＬであればＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ０２拘束性のＣＴＬであればＨＬＡ－Ａ０２）とＨＬＡ－Ｅとを発現させることでより強力にＮＫ細胞の活性を抑えることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の［１］～［４］を提供するものである。
［１］ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩを発現する、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞。
［２］ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ２４又はＨＬＡ－Ａ０２である［１］記載のヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞。
［３］ヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩをすべてノックアウトする工程、ＨＬＡクラスＩがすべてノックアウトされたＴ細胞にＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－Ｅの遺伝子を導入する工程、並びに前記遺伝子導入されたＴ－ｉＰＳ細胞をＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に再分化する工程、を含むことを特徴とする、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－Ｅの２種のＨＬＡクラスＩを発現する、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞の製造法。
［４］ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ２４又はＨＬＡ－Ａ０２である［３］記載の製造法。
本発明によれば、抗原特異的ＣＴＬの強力な抗腫瘍効果を維持しながら、ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答を回避でき、他家投与可能なヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞及びその製造法が安定して提供できる。
ゲノム編集後のＨＰＶ－ｒｅｊＴのＨＬＡクラスＩ発現を示す図である。Ｐｏｓｔ－ｅｄｉｔ ＨＰＶ－ｒｅｊＴは、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－Ａ２４のみノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴ（上段）、ＨＬＡ－Ａ２４とＨＬＡ－Ｅの両方を発現するＨＰＶ－ｒｅｊＴ（下段）を示す。それぞれのＨＬＡクラス１（ＡＢＣ、Ａ２４、ＢＣ、Ｅ）に対する抗体を用いてＨＰＶ－ｒｅｊＴを染色しフローサイトメトリーで解析した。Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｉｓｏｔｙｐｅ）は、ｉｓｏｔｙｐｅコントロールでＨＰＶ－ｒｅｊＴを染色した陰性コントロールを示す。 ＨＬＡ－Ａ２４とＨＬＡ－Ｅを共に発現させたＨＰＶ－ｒｅｊＴは、ＮＫ細胞の傷害活性を有意に抑制することを示す図である。Ｋ５６２細胞株は、クラスＩを発現しないため、ＮＫ細胞に傷害される陽性コントロールである。ＫＩ－Ａ２４は、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－Ａ２４のみノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。ＫＩ－Ｅは、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－ＥのみノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。ＫＩ－Ａ２４＆Ｅは、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－Ａ２４とＨＬＡ－Ｅの両方をノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。ＷＴは、ＨＬＡを編集していない、つまりＨＬＡを発現するワイルドタイプを示す。ａｕｔｏ ＣＴＬは、この解析に用いたＮＫ細胞のドナー由来ＣＴＬを示す。自己細胞であるのでＮＫ細胞はａｕｔｏ ＣＴＬを攻撃しないため、陰性コントロールとして用いている。 １０７ａアッセイでもＨＬＡ－Ａ２４＋ＨＬＡ－Ｅ発現ＨＰＶ－ｒｅｊＴのＮＫ細胞傷害活性抑制効果が強いことを示す図である。Ｋ５６２細胞株は、クラスＩを発現しないため、ＮＫ細胞は共培養によりＫ５６２を攻撃して１０７ａを高発現する。陽性コントロールとして用いている。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｔｒｌは、ＮＫ細胞にＣｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えて刺激したため、ＮＫ細胞は１０７ａを高発現する。同じく陽性コントロールを示す。ＨＬＡ－Ｅ ＫＩは、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－ＥのみノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。ＨＬＡ－Ａ２４ ＫＩはＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－Ａ２４のみノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。ＨＬ－Ａ２４＋Ｅ ＫＩは、ＨＬＡクラスＩ消失後、ＨＬＡ－Ａ２４とＨＬＡ－Ｅの両方をノックインしたＨＰＶ－ｒｅｊＴを示す。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｔｒｌは、ＮＫ細胞のみで培養した陰性コントロールを示す。 子宮頸がん担癌マウスに対するＨＬＡ編集ＨＰＶ－ｒｅｊＴの生存期間延長効果を示す。ｎо ｔｒｅａｔｍｅｎｔは非処置群、оｒｉｇｉｎａｌ ＣＴＬは、オリジナルＣＴＬ処置群、ＷＴｒｅｊＴは、ｒｅｊＴ処置群、ＥＸｒｅｊＴは、本発明ＨＰＶ－ｒｅｊＴ処置群を示す。 ＨＬＡ編集ＨＰＶ－ｒｅｊＴのＮＫ細胞同時投与時の生体内での耐久性を示す。ＨＰＶ－ｒｅｊＴ中のカッコ内は、ＨＬＡクラスＩ編集を示す。
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）のＨＬＡを、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩを発現するようにした細胞傷害性Ｔ細胞である。
また、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞には、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－Ｅ以外に、さらにＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＣなどのＨＬＡクラスＩを発現させてもよく、さらにＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ｉＣａｓｐａｓｅ９などを発現させてもよい。ただし、ＮＫ細胞活性の抑制の観点、及びＨＬＡの多型によりドナーとＨＬＡ合わせる観点を考慮すれば、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－Ｅの２種のＨＬＡクラスＩを発現する、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞であるのが好ましい。
原料として用いるヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞は、ヒトＴ細胞をｉＰＳ細胞（Ｔ－ｉＰＳ細胞）に誘導することにより得ることができる。このＴ－ｉＰＳ細胞の製造法は、前記特許文献１記載の方法により行うのが好ましい。
まず、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞への誘導手段について説明する。
用いられるＴ細胞は、ヒトＴ細胞が好ましい。このＴ細胞の起源であるヒトとしては、ウイルス感染症、悪性腫瘍等を患っているヒトであってもよいが、治療用同種抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を製造するうえで、ゲノム編集後バンク化して多くの人に投与するという点から健常人であるのが好ましい。また、Ｔ細胞の起源として好ましいヒトは、本発明によって製造されたＴ－ｉＰＳ細胞を用いて製造される再生ＣＴＬやＣＡＲＴ細胞を投与されるべき患者とＨＬＡの型が完全に一致している必要はない。
本発明においてＴ－ｉＰＳ細胞に誘導されるＴ細胞は、抗原特異性を有するＴ細胞が好ましい。例えば、ＣＤ３及びＣＤ８が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ８陽性細胞であるＣＴＬが挙げられる。また、例えばＣＤ３及びＣＤ４が発現しているＴ細胞であり、具体的にはＣＤ４陽性細胞であるＴ細胞が挙げられる。なお、Ｔ細胞における抗原特異性は、抗原特異的な、再構成されたＴＣＲ遺伝子によりもたらされる。なお、製造効率の観点からは、特にこれに限定されないが、抗原特異的ＣＤ８陽性細胞を得るためには、Ｔ－ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いることが好ましく、抗原特異的ＣＤ４陽性細胞を得るためには、Ｔ－ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞としては、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いることが好ましい。また、免疫療法を実施する場合、ｉＰＳ細胞から分化させるヒトＴ細胞は、ｉＰＳ細胞へ誘導されるヒトＴ細胞と抗原特異性が同一または実質的に同一であることが好ましい。また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を誘導するＴ細胞として、抗原特異性のないＴ細胞も含まれる。具体的にはＣＡＲＴ細胞もしくはＴＣＲ－Ｔ細胞など遺伝子改変Ｔ細胞が挙げられる。
このようなＴ細胞は、例えばヒトの組織から公知の手法により単離することができる。
ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血が好ましい。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分離する際には腫瘍組織もしくは末梢血から分離することができる。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、細胞分離用磁気ビーズなどを用いる磁気セレクション、ＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリー、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いる活性化Ｔ細胞誘導法などが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現、もしくはＰＤ－１などのシグナル分子を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離することが出来る。さらに、抗原特異性を有するＴ細胞を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣ クラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するＴ細胞を精製することができる。
本発明において、Ｔ細胞をｉＰＳ細胞にするために導入される遺伝子は、（ａ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（ｂ）ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、（ｃ）Ｓｏｘ２遺伝子、（ｄ）Ｋｌｆ４遺伝子、（ｅ）ＮＡＮＯＧ遺伝子、及び(ｆ)ＬＩＮ２８遺伝子などのうち少なくとも４種類の遺伝子の組み合わせが好ましい。
本発明において、Ｔ細胞に前記遺伝子群を導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記遺伝子群をコードする核酸の形態にて前記Ｔ細胞に導入する場合においては、前記遺伝子群をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法にて細胞に導入することができる。
このような発現ベクターのうち、前記遺伝子群を含むステルス型ＲＮＡ発現ベクターを用いるのが、がん化の危険性の低減、導入効率の点から、より好ましい。
ステルス型ＲＮＡ発現ベクターとは、ベクターが染色体に入ることを回避し、核内ではなく細胞質内で、持続的で安定して遺伝子が発現するように設計されたベクターである。１万３０００塩基対以上の大きな遺伝子の導入や、１０個の遺伝子の同時導入もでき、細胞に傷害を与えず、導入遺伝子が不要な時には除去が可能で、細胞がベクターを異物として認識できないステルス性を持っている。
このようなステルス型ＲＮＡ発現ベクターとしては、下記（１）～（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素からなり、自然免疫構造を活性化させない複合体が挙げられる。
（１）前記遺伝子群に対するＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするＲＮＡ配列、
（７）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列。
また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立する際には、前記Ｔ細胞は、前記遺伝子群の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）若しくはインターロイキン－７（ＩＬ－７）及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。また、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
さらに、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前記Ｔ細胞に与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましい。
また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記Ｔ細胞に対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記４遺伝子の導入に必要な細胞数までＴ細胞を増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２～７日間であるが、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは３～５日間である。１５ｍＬチューブ内でＴ細胞とベクターを混合することにより感染させる、もしくは遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
前記Ｔ細胞を培養し、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地（より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＡＩＭ ＶTM ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ２を用いることができる。培地には、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＩＬ－２のかわりに培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することも好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
また、前記Ｔ細胞に前記４遺伝子を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記４遺伝子を導入した前記Ｔ細胞は、フィーダーフリー条件下で培養するのが好ましい。例えば、ラミニン５１１Ｅ８断片であるｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液もしくはビトロネクチンでコーティングされたウェルが挙げられる。フィーダー細胞条件下での培養でも樹立可能であり、フィーダー細胞としては例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
さらに、前記Ｔ細胞からＴ－ｉＰＳ細胞に誘導する過程において、翌日からｉＰＳ細胞の培地を添加しておくことが好ましい。その後は１日おきに半量ずつ培地交換を行い、徐々にＴ細胞培地からｉＰＳ培地に置換するのが好ましい。
また、前記Ｔ細胞からｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記Ｔ細胞の培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎもしくはビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が望ましい。
このようにしてＴ－ｉＰＳ細胞の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法が挙げられる。一方でシングルセルであるＣＴＬクローンから樹立したＴ－ｉＰＳの場合、性質が似ていることが多いため、Ｔ－ｉＰＳ細胞の各コロニーを選択せず、樹立できたコロニーを全てそのまま継代する方法もある。
このようにして選択された細胞がＴ－ｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＡＬＰ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現を免疫染色やＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法や、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記Ｔ細胞由来であることの確認は、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら、回収するのが好ましい。概ね、前記４遺伝子を含む遺伝子群を前記Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは５％ＣＯ2、３７℃の条件である。
上記のようにして得られた、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞から、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ遺伝子発現及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩを発現するＴ細胞とするには、例えば、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩをすべてノックアウトする工程（ａ）、及びＨＬＡクラスＩがすべてノックアウトされたＴ―ｉＰＳ細胞に、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ遺伝子とＨＬＡ－Ｅの遺伝子を導入する工程（ｂ）を含む方法が挙げられる。
上記のノックアウト工程（ａ）及び遺伝子導入工程（ｂ）は、種々の方法で実施することができるが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集法が一つの選択肢である。
まず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集法により、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩをすべてノックアウトするには、はじめにβ２ミクログロビン（Ｂ２Ｍ）をノックアウトする。ノックアウト用プラスミドとガイドＲＮＡを５μｇずつ細胞剥離後の２×１０５ほどのＴ－ｉＰＳＣにエレクトロポレーションを行う。その後は６ｗｅｌｌプレートの３ｗｅｌｌに播種して培養する。ノックアウトプラスミドに２回目の編集に用いるガイドＲＮＡの標的配列とＧＦＰとＣＤ８、ＣＤ１９などのセレクションマーカーが入っている。約１０日後に３ｗｅｌｌに播種した細胞がコンフレントになったタイミングでセレクションマーカーのポジティブセレクションを行う。セレクション後はＴ－ｉＰＳＣを薄く播種することによってｉＰＳ細胞をシングルセルクローニングする。ＧＦＰ強陽性細胞をピックアップ後培養し、ジェノタイピングを行う。ＰＣＲでｂｉａｌｌｅｌｉｃにマーカーが入っているクローンを同定後拡大培養し、次のステップに進む。
次に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集法により、ＨＬＡクラスＩがすべてノックアウトされたＴ－ｉＰＳ細胞に、ＨＬＡ拘束性のクラス１遺伝子及びＨＬＡ－Ｅの遺伝子を導入する工程（ｂ）は、ノックインプラスミド２種類をそれぞれ２．５μｇずつとガイドＲＮＡ５μｇを、最初の編集でＢ２ＭをノックアウトしたＴ－ｉＰＳＣを細胞剥離後エレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後は６ｗｅｌｌプレートの３ｗｅｌｌに播種して培養する。約７日後に３ｗｅｌｌに播種した細胞がコンフルエントになったタイミングでセレクションマーカーのネガティブセレクションを行う。セレクション後はＴ－ｉＰＳ細胞を薄く播種することによってｉＰＳ細胞をシングルセルクローニングする。ＧＦＰ陰性細胞をピックアップ後培養し、ジェノタイピングを行う。ＰＣＲでｂｉａｌｌｅｌｉｃにマーカーが入っているクローンを同定後拡大培養する。また、上記と同様の手段により、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子及びＨＬＡ－Ｅ以外に、さらにＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＣなどのＨＬＡクラスＩを発現させてもよく、さらにＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ｉＣａｓｐａｓｅ９などを発現させてもよい。
次に、ゲノム編集後のＴ－ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導する。
この再分化誘導方法としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法が好ましく、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞に分化させ、次いで当該ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞をＣＤ８＋シングルポジティブＴ細胞に分化させる方法がより好ましい。
更には、前記特許文献１記載のように、Ｔ－ｉＰＳ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させ、Ｔ細胞受容体を刺激する物質を添加してＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に刺激を与え、次いでＴ細胞受容体に刺激を与えた前記ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５のサイトカインの存在下でＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に分化させることにより得るのが好ましい。
Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるには、Ｔ－ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞（好ましくはマウスストローマ細胞）上で、サイトカイン、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、α－モノチオグリセロール、アスコルビン酸等を含有する培地中にて培養することが好ましい。
用いるストローマ細胞としては、放射線照射等の処理を施したＯＰ９細胞、１０Ｔ１／２細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）であることが好ましい。培地に添加されるサイトカイは、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌ群から選択される少なくとも１種のサイトカインであることが好ましく、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＴＰＯ、又は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌであることがより好ましい。また、培地としては、例えば、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭが挙げられるが、Ｔ－ｉＰＳサック（造血前駆細胞を含有する袋状の構造物）を形成させやすくする点から、ＩＭＤＭ培地が好ましい。このＴ－ｉＰＳ細胞の培養期間としては、Ｔ－ｉＰＳ細胞の培養を開始してから好ましくは８～１４日間、より好ましくは１０～１４日間である。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは、５％ＣＯ2、３７℃の条件である。また、低酸素濃度条件（酸素濃度：例えば、５～２０％）下にて１週間程度培養することがより好ましい。
Ｔ－ｉＰＳ細胞をＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞に分化させるために、さらに、前記のＴ－ｉＰＳサックに含まれている細胞を、サイトカインや血清（例えば、ＦＢＳ）等を含有する培地中にて、フィーダー細胞（好ましくはストローマ細胞、より好ましくはヒトストローマ細胞）上で培養することが好ましい。Ｔ－ｉＰＳサックの内部に存在する細胞は、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。この培養に用いるストローマ細胞としては、ｎｏｔｃｈシグナルを介して、Ｔリンパ球への分化誘導を行うという観点から、放射線照射等の処理を施したＯＰ９－ＤＬ１細胞、ＯＰ９－ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ４細胞、１０Ｔ１／２／ＤＬ１細胞であることが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、例えば、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５が挙げられる。培地としては、例えば、α－ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地が挙げられるが、α－ＭＥＭ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７及びＦＬＴ３Ｌ以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。
このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するまでの期間であることが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから１４～２８日間であることが好ましい。培養環境としては、特に制限はないが、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは５％ＣＯ2、３７℃の条件である。
なお、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現しているか否かは、抗ＴＣＲαβ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリーにより評価することができる。
抗原特異性を有するヒトＣＤ８シングルポジティブ細胞の製造方法においては、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、該細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して刺激することにより、ＴＣＲＡ遺伝子の更なる再構成を抑制することができ、ひいては、再分化して得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞において、元のヒトＴ細胞と同じＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度を極めて高くすることができる。
Ｔ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴ細胞受容体に刺激を与える方法としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチド、前記Ｔ細胞受容体に対し拘束性を示すＨＬＡとの複合体を発現する細胞、及び該抗原ペプチドを結合させたＭＨＣ多量体からなる群から選択される少なくとも１の物質とＴ－ｉＰＳ細胞由来のＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とを接触させる方法が好ましく、生理的な刺激を与える観点からは、特異ペプチド／ＨＬＡ複合体発現細胞を接触させる方法がより好ましい。また、刺激の均一性を重視する観点からは、抗体や試薬を接触させる方法がより好ましい。
接触させる方法は、例えば、培地中に、ＰＨＡ等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては、１～１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、前記Ｔ細胞の培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞のＴＣＲを刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の濃度としては、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
このＴ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養期間としては、このようにして分化して得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が発現するのに必要な期間を含むことが好ましく、Ｔ－ｉＰＳサックに含有されている細胞の培養を開始してから７～２９日間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは５％ＣＯ2、３７℃の条件である。
本発明において、Ｔ細胞受容体に刺激を与えたＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるために、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞は、サイトカインや血清（例えば、ヒト血清）等を含有する培地中にて培養することが好ましい。培地に添加するサイトカインとしては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させることができるものであればよく、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５が挙げられる。これらの中では、ＣＤ８シングルポジティブ細胞への分化において、ＣＤ８系譜を選択させ、かつメモリー型ＣＤ８+Ｔ細胞生成が生じ易くさせるという観点では、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を組み合わせて添加することが好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては、１～２０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。培地としては、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｘ－ＶＩＶＯ培地、ＤＭＥＭ培地、α－ＭＥＭ培地が挙げられるが、ＲＰＭＩ－１６４０培地又はＸ－ＶＩＶＯ培地が好ましい。また、培地には、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等以外のサイトカインが添加してあってもよい。
かかる培養においては、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）であることが好ましい。かかるＰＢＭＣとして、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞とはアロ（同種異系）の関係にあることが好ましい。また、ＴＣＲを刺激し続け、ＴＣＲの更なる再構成を抑制し続けるという観点から、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞の元となったヒトＴ細胞が特異的に結合する抗原ペプチドを提示する末梢血単核球細胞を用いることがより好ましい。
このＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞に分化させるための培養期間としては、２～４週間であることが好ましい。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは５％ＣＯ2、３７℃の条件である。
このように分化誘導されたＣＤ８シングルポジティブ細胞が、Ｔ－ｉＰＳ細胞由来であり、また該Ｔ－ｉＰＳ細胞の元となったＴ細胞由来であることの確認は、例えば、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
また、このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、公知の手法を適宜選択して単離することができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＣＤ８の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。例えば、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の場合は、ＣＤ８シングルポジティブ細胞の元となったＴ細胞が認識する抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体（例えば、ＭＨＣテトラマー）を用いて精製する方法を採用することもできる。
また、本発明により得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞は、ＰＤ－１は発現していないのに対し、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を代表するＣＤ２７及びＣＤ２８と共にＣＣＲ７が発現しており、またテロメアも元となったＴ細胞と比べ長くなっており、高い自己複製能を有している。従って、本発明によれば、元のＴ細胞と同一のＴＣＲ遺伝子の再構成パターンを有するＣＤ８シングルポジティブＴ細胞であって、ＰＤ－１を発現せず、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＣＲ７を発現する細胞を製造することができる。そして、ヒトから採取したＴ細胞は、ＰＤ－１を発現し、幼若なメモリーフェノタイプの割合は少ない点で、得られたＴ細胞とは異なる。
このようにして得られたＣＤ８シングルポジティブ細胞を維持するために、１～２週間毎に、当該細胞に刺激を与えてもよい。かかる刺激としては、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、該ＣＤ８ＳＰ細胞が認識する抗原、当該抗原を結合させたＭＨＣ多量体、該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とアロの関係にあるフィーダー細胞及び該ＣＤ８シングルポジティブ細胞とオートの関係にあるフィーダー細胞からなる群から選択される少なくとも１の物質との接触が挙げられる。
かくして得られる、本発明のＨＬＡ－Ａ２４及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩを発現する、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞は、原料として用いたヒトＴ細胞の抗原特異的細胞傷害性を維持しながら、ＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答を回避でき、他家投与可能なヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞として有用である。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞のＮＫ細胞のｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ応答性は、ＨＬＡ－Ａ２４又はＨＬＡ－Ｅのみを発現させたＴ細胞に比べて顕著に低い。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的ＣＴＬクローンよりセンダイウイルスベクターを用いたＴ－ｉＰＳ細胞の樹立。
１）健常人末梢血より末梢血単核球を分離後、抗原提示目的に樹状細胞を誘導した。７日後、誘導した樹状細胞にＨＰＶ抗原ペプチド（ＨＰＶ１６－Ｅ６，Ａ２４０２）を添加し末梢血単核球と共培養開始した。約８～１０日後にＨＰＶ特異的ＣＴＬ検出のため、ＣＴＬをＭＨＣテトラマーで染色後、フローサイトメトリーにてテトラマー陽性率を確認した。ＨＰＶ特異的ＣＴＬを確認後、シングルセルソートもしくはテトラマー／ＰＥビーズセレクション後限界希釈法を行い、５０ＧｙのＸ線照射後のＰＢＭＣとＩＬ２、ＰＨＡを加えて刺激した。
２）約３～６週間後立ち上がったコロニーのテトラマー染色を行い、フローサイトメトリーでＣＴＬクローン樹立の確認をした。樹立確認後ＣＴＬクローンをＣＤ３／２８刺激後、以下のＡ）の２種類のベクターを用い遺伝子導入した。ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＣＴＬを移動し、ＣＴＬメディウムを培地としてＣＯ2インキュベーターで培養開始した。
Ａ）ＳｅＶ４因子ベクター ＋ ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原
３）ＳｅＶ遺伝子導入翌日、ｉＰＳメディウム（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ）を等量加え、その後は１日おきに半量ずつＳｔｅｍ ＦｉｔＡＫ０３Ｎに置換した。
４）７日後にＴ－ｉＰＳ細胞のコロニーが観察でき、その後コロニーピックアップを行った。
実施例２
ＨＰＶ抗原特異的ＣＴＬ由来ｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩすべてのノックアウト。
はじめにβ２ミクログロビン（Ｂ２Ｍ）をノックアウトする。ノックアウト用プラスミドとガイドＲＮＡを５μｇずつ細胞剥離後のＴ－ｉＰＳＣにＬＯＮＺＡ ４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いエレクトロポレーションを行った。その後は６ｗｅｌｌプレートの３ｗｅｌｌに播種して培養する。ノックアウトプラスミドに２回目の編集に用いるガイドＲＮＡの標的配列とＧＦＰとＣＤ８のセレクションマーカーが入っているため、約１０日後に３ｗｅｌｌに播種した細胞がコンフレントになったタイミングでＣＤ８のＭＡＣＳビーズポジティブセレクションを行った。セレクション後はＴ－ｉＰＳＣを薄く播種することによってｉＰＳ細胞をシングルセルクローニングした。ＧＦＰ強陽性細胞をピックアップ後培養し、ジェノタイピングを行い、ＰＣＲでｂｉａｌｌｅｌｉｃにマーカーが入っているクローンを同定後拡大培養し、次のステップに進んだ。
実施例３
ＨＬＡ－Ａ２４及びＨＬＡ－Ｅの遺伝子の導入。
Ａ２４０２拘束性のエピトープであったため、Ｂ２Ｍノックアウト後のＴ－ｉＰＳＣにＨＬＡ－Ａ２４０２をノックインした。また同時にＨＬＡ－Ｅトリマー構造のノックインプラスミドも作成しＨＬＡ－Ｅをノックインした。さらにＨＬＡ－Ａ２４０２とＨＬＡ－Ｅを同時に半量ずつノックインしたプラスミドも作成した。最初の編集でＢ２ＭをノックアウトしたＴ－ｉＰＳＣを細胞剥離後ＬＯＮＺＡ ４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後は６ｗｅｌｌプレートの３ｗｅｌｌに播種して培養した。約７日後に３ｗｅｌｌに播種した細胞がコンフルエントになったタイミングでＭＡＣＳビーズを用いＣＤ８のネガティブセレクションを行った。セレクション後はＴ－ｉＰＳＣを薄く播種することによってｉＰＳ細胞をシングルセルクローニングした。ＧＦＰ陰性細胞をピックアップ後培養し、ジェノタイピングを行い、クローンを同定後拡大培養した。
実施例４
ゲノム編集後のＴ－ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞への再分化。
実施例３にて得られたゲノム編集後のＴ－ｉＰＳ細胞の小塊をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上に移し、２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ存在下、ＥＢ培地にて共培養した。培養１４日目に、ｉＰＳサックに含まれている造血細胞を回収し、それら細胞をＤＬ１／４発現Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞上の細胞上に移し、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３Ｌ及び１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７存在下、ＯＰ９培地内にて、造血細胞をＴ系譜細胞に分化させた。
そして、培養４２日目にα－ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又は５μｇ／ｍｌ ＰＨＡを前記ＯＰ９培地に添加することにより刺激した。
次いで、当該Ｔ系譜細胞を回収し、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の存在下、放射線照射済みのＰＭＢＣｓと共にＣＴＬ培地にて培養した。
そして、培養５６日目に、ＣＤ８／テトラマー陽性細胞を認めた。それら細胞のＨＬＡをＦＡＣＳ解析で調べたところ、ノックインしたＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ｅ、もしくは両方）が発現していた。
実施例５
本発明のＣＤ８シングルポジティブ細胞の抗原特異性。
実施例４において得られた再分化細胞は、ゲノム編集後も元となったＴ細胞と同じ抗原特異性を有するかどうかを調べた。その結果、得られた再分化ＣＤ８シングルポジティブ細胞は、元となったＨＰＶ―Ｔ細胞クローンの抗原特異性と一致していることが明らかになった（図１）。
ＨＬＡ－Ａ２４のみ発現、もしくはＨＬＡ－Ｅのみ発現、または両方を発現する若返りＣＴＬ（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ＣＴＬ；ｒｅｊＴ）の分化誘導に成功したのちにＮＫ細胞のミッシングセルフ反応から回避できるか調べるためにクロムアッセイとＣＤ１０７ａアッセイを行なった。ＨＬＡ－Ａ２４のみ発現、ＨＬＡ－Ｅのみ発現のＨＰＶ－ｒｅｊＴではＮＫ活性を抑制はするものの不十分であったが、両方を発現させたＨＰＶ－ｒｅｊＴでは有意にＮＫ細胞の傷害活性を抑制できた。ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性ＨＬＡクラスＩ分子とＨＬＡ－Ｅの両方を発現させることがＮＫ活性を抑制するために重要であることが証明された（図２、図３）。
実施例６
子宮頸がん担癌マウスに対するＨＬＡ編集したＨＰＶ－ｒｅｊＴの生存期間延長効果。
（方法）
免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に子宮頸がん細胞株ＳｉＨａを腹腔内に移植後、無治療コントロール群と３つの治療群（もとのＨＰＶ－ＣＴＬクローン、Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）ＨＰＶ－ｒｅｊＴ、又はＨＬＡ編集後ＨＰＶ－ｒｅｊＴ）にわけて週１回、２．５ｘ１０６個のＴ細胞を腹腔内注射で３回投与した。無治療コントロール群と各治療群のマウスの治療効果を確認目的に生存期間を比較した。
（結果）
子宮頸がん担癌マウスの生存期間を、図４に示す。
図４に示すように、子宮頸がん担癌マウスの生存期間は、オリジナルＣＴＬ投与群に比べて、ＷＴ ｒｅｊＴ投与群とＨＬＡ編集したＨＰＶ－ｒｅｊＴ（ＥＸｒｅｊＴ）投与群において、顕著に延長した。
また、６カ月以上生存した治療後マウスの病理所見で、肺、肝臓、腸管、脾臓、子宮に腫瘍残存は認められなかった。
実施例７
ＨＬＡ編集ＨＰＶ－ｒeｊＴのＮＫ細胞同時投与時の生体内での耐久性。
（方法）
免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に子宮頸がん細胞株ＳｉＨａをＤａｙ－４に腹腔内に移植後、３つのグループにわけた。
１．ＨＬＡ編集ＦＦｌｕｃ－ｒｅｊＴ＋ＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２４＋）
２．ＨＬＡ編集ＦＦｌｕｃ－ｒｅｊＴ＋ＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２４－）
３．ＨＬＡ編集ＦＦｌｕｃ－ｒｅｊＴ
にわけてＤａｙ ０にグループ１と２に２．５ｘ１０６個のｒｅｊＴ細胞＋２．５×１０６個のＮＫ細胞を、グループ３に２．５ｘ１０６個のｒｅｊＴ細胞を腹腔内注射で投与した。各群のｒｅｊＴの体内での増殖、残存をＩＶＩＳでモニターして比較した。
（結果）
結果を、図５に示す。Ｄａｙ７にＮＫ細胞を投与しないグループ３では蛍光標識ＨＰＶ－ｒｅｊＴは生体内で効率よく増殖して残存するのに対し、グループ２ではＨＬＡ－Ａ２４を持たないＮＫ細胞に排除されてＤａｙ７ではｒｅｊＴを検出できない。一方で、グループ１では蛍光標識ＨＰＶ－ｒｅｊＴはＨＬＡ－Ａ２４を持つＮＫ細胞には排除されず、生体内で効率よく増殖して残存することが確認できた（左図）。Ｄａｙ７の蛍光標識ＨＰＶ－ｒｅｊＴのマウス生体内での残存をシグナルで確認したところ、グループ１はグループ２に比較して有意にシグナルが高かった。一方グループ３とは有意差がなかった（右図）。

Claims (3)

  1. ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩを発現し、それら以外のＨＬＡクラスＩがノックアウトされている、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞であって、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ２４又はＨＬＡ－Ａ０２である、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞。
  2. ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ及びＨＬＡ－ＥのＨＬＡクラスＩが外因性であり、内因性のＨＬＡクラスＩがすべてノックアウトされている、請求項１に記載の、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞。
  3. ヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞のＨＬＡクラスＩをすべてノックアウトする工程、ＨＬＡクラスＩがすべてノックアウトされたＴ－ｉＰＳ細胞にＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡ－Ｅの遺伝子を導入する工程、並びに前記遺伝子導入されたＴ－ｉＰＳ細胞をＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に再分化する工程、を含むことを特徴とする、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ及びＨＬＡ－Ｅの２種のＨＬＡクラスＩを発現する、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞の製造法であって、ＣＴＬの抗原エピトープのＨＬＡ拘束性のクラスＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ２４又はＨＬＡ－Ａ０２である、ヒトＴ細胞由来ｉＰＳ細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞の製造法。
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