JP7753207B2 - ラクツロースからガラクトオリゴ糖を調製するための方法 - Google Patents

ラクツロースからガラクトオリゴ糖を調製するための方法

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Description

NPMD NITE BP-02177 NPMD NITE BP-02178
本発明は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）に関連するアレルギーに罹患している対象、及び乳糖不耐症を有する対象に容認可能なＧＯＳの調製に関する。
従来のＧＯＳは、ガラクトース単位の鎖及び末端のグルコース単位を含み、β－ガラクトシダーゼによって触媒される連続的なトランスガラクトシル化反応によって発生する。ＧＯＳ構成成分のいくつかは、ヒトの母乳及びウシの初乳中に天然に存在するものである。典型的なＧＯＳ調製物は、二糖から六糖を主に含んでいる。
腸内のビフィズス菌の増殖を刺激し、通常の腸通過をサポートし、自然の生体防御に寄与し、ミネラルの吸収を亢進し、免疫機能を刺激し、炎症を低下させる能力を含む、ＧＯＳの様々な生理機能が報告されている。ＧＯＳは、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及び他の腸内細菌の増殖を促進するプレバイオティクス効果のため、特別な注目を集めてきた。それにより、ＧＯＳは、調製粉乳、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）で発酵させた飲料、ヨーグルト、ジュース及びドリンクに一般的に使用されている。これらのＧＯＳ含有食品のいくつかは、日本の消費者庁によって特定保健用食品として承認されており、ＧＯＳは米国食品医薬品局によって一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ：Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）物質として承認されている（ＧＲＡＳ通知；ＧＲＮ ２３３、２３６、２８５、２８６、３３４、４８４、４８９、４９５、５１８、及び５６９）。
ＧＯＳは、従来、ラクトース含有飼料にβ－ガラクトシダーゼを接触させることによって製造する。得られたＧＯＳは、ラクトースを含む、重合（ＤＰ）の程度が異なるガラクトオリゴ糖の混合物である。世界中の３歳以上の人口の大部分が乳糖不耐症に悩まされており、ラクトース含有組成物を摂取したときに、腹痛、腹部膨満感、下痢、ガス、及び悪心が生じる可能性がある。従来のＧＯＳにはラクトースが含有されており、これによってこれらの症状が引き起こされる可能性がある。従って、ラクトースを含有しないＧＯＳを産生する必要がある。従来のＧＯＳからラクトースを除去することによってこの問題を解決することは、実行可能な選択肢ではない。なぜならば、ラクトースの除去には、ラクトース加水分解酵素（ラクターゼ）を使用することが必要であり、このことは、ラクトースを加水分解するだけでなく、他のＧＯＳ構成成分も加水分解してしまい、これによってＧＯＳの機能が失われるためである。
従来のＧＯＳを産生するために使用されるβ－ガラクトシダーゼ酵素は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、スポロボロマイセス・シングラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、及びラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などの多くの微生物中で産生されるものである。β－ガラクトシダーゼは、それらの三次元構造に差異があり、これによってグリコシド結合の立体選択的及び位置選択的構成が生じる。例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来する真菌性β－ガラクトシダーゼは、主にβ１－６結合を生じさせる（従って、主にβ１－６結合を含むＧＯＳ調製物が得られ、これを「６’－ＧＯＳ」と称し得る）が、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に由来する細菌性β－ガラクトシダーゼは、主にβ１－４結合を生じさせる（主にβ１－４結合を含むＧＯＳ調製物が得られ、これを「４’－ＧＯＳ」とも称し得る）。更に、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）によって産生されるβ－ガラクトシダーゼは、特に強力なトランスガラクトシル化活性を有する。その結果、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）によって調製されたＧＯＳが世界中で販売されている。このＧＯＳが市場に導入されて以降（１９９９）、約１億人以上の乳児が、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）によって調製されたＧＯＳを含有する調製粉乳を摂取している。ＧＲＡＳの現状がＦＤＡに認知されているため、このＧＯＳは安全な成分であることが証明されている。しかしながら、過去数年間に、ＧＯＳに関連するアレルギーの少数のごく稀なケース（百万人に約２人）が東南アジアで報告されている。研究では、ＧＯＳに存在する特定のオリゴ糖構造が、極めて感受性のある対象にアレルギー反応を及ぼす可能性があることが示されている。
従って、本発明の目的は、乳糖不耐症に罹患している対象、及びバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のβ－ガラクトシダーゼ、又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のβ－ガラクトシダーゼによって得られる従来のＧＯＳに対するアレルギー反応に罹患している対象に、忍容性が良好なＧＯＳ調製物を提供することである。
この目的は、ラクツロース含有飼料を微生物パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に由来するβ－ガラクトシダーゼに接触させることによってＧＯＳ調製物を産生することを含む本発明によって達成される。
前述した「パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）」という微生物の名称は、「クリプトコッカス・パピリオトレマ・テレストリス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）」である。従って、「クリプトコッカス・テレストリス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（Ｃ．テレストリス）（Ｃ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）」及び「パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（Ｐ．テレストリス）（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）」という名称は、同一の生物を指す。
「Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に由来するβ－ガラクトシダーゼ」とは、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に分類される微生物（野生型株又は変異菌株のいずれか）によって産生されるβ－ガラクトシダーゼ酵素、又はパピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に分類される微生物（野生型株又は変異菌株のいずれか）由来のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を使用する遺伝子工学的手順によって得られるβ－ガラクトシダーゼ酵素を意味する。従って、「パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に由来するβ－ガラクトシダーゼ」という用語はまた、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）から得られるβ－ガラクトシダーゼ遺伝子（又はその改変遺伝子）が導入されている宿主微生物によって産生される組み換え酵素を包含する。
得られたＧＯＳ調製物は、還元末端にグルコース残基ではなくフルクトースを有するという点で、ラクトースから製造される従来のＧＯＳとは異なるものである。従って、このラクツロース由来のＧＯＳをｆＧＯＳとも称する。このｆＧＯＳは、臨床的にラクトースを含まず、ラクトース以外のオリゴ糖とラクトースの割合が少なくとも１０であることを意味する。好ましくは、本発明のプロセスによって得られるｆＧＯＳは、ラクトースを実質的に含まず、微量以上のものを含有しない、即ち、乾燥物を基準としてラクトースが１重量％以下、より好ましくは０．５重量％、及び最も好ましくは０．１重量％以下であることを意味する。最も好ましい実施形態では、本発明によって得られるｆＧＯＳは、ラクトースをいずれも含有しない。更に、本発明によるプロセスにより、乾燥物を基準として、ガラクトオリゴ糖を３０～６０重量％、好ましくは４０～６０重量％含有する、ラクツロース又は単糖を除去する任意の精製工程又は濃縮工程のないｆＧＯＳ調製物を得ることができる。このオリゴ糖の含有量には、ラクツロースが含まれないが、ラクツロース以外のＤＰ２オリゴ糖が含まれる。このｆＧＯＳ調製物の他の成分は、主にラクツロース及び単糖（フルクトース、ガラクトース、グルコース）からなる。
ラクツロースからＧＯＳを産生することは、先行技術から公知である。例えば、Ｃ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３８（２０１３）２２２５－２２３２には、３種の異なる供給源に由来するβ－ガラクトシダーゼを使用して、ラクトース及びラクツロースからＧＯＳを産生することが記載されている。ラクツロースからのＧＯＳの収率は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼで最大となり、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ－ガラクトシダーゼで最小となったことが判明した。ラクトースから出発したときは逆であることが判明し、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ－ガラクトシダーゼで最大の収率が得られ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼで最小の収率が得られた。
以下の実施例に示すように、Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）由来のβ－ガラクトシダーゼは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼよりも、ラクツロースからＧＯＳを産生するのに更により適していることが判明した。更に、本発明のプロセスによって得られるｆＧＯＳ調製物は、対象の（ＩｇＥ媒介性）アレルギー反応を減少させる。換言すれば、このｆＧＯＳ調製物は、ＧＯＳに関連するアレルギーのうちの少なくとも１種類、即ち、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ－ガラクトシダーゼによって産生されたＧＯＳ、及び／又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼによって産生されたＧＯＳによって引き起こされるアレルギーに罹患している対象に投与したときに、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼによって産生されたＧＯＳ調製物と比較すると、アレルギー反応の減少が誘発される。より詳細には、本発明によるｆＧＯＳ調製物により、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼによって得られたＧＯＳ調製物と比較したときに、対象のプリックテスト及び／又は対象から単離した血液試料で実施する好塩基球活性化試験のスコアが減少する。また、ｆＧＯＳ調製物はラクトースを臨床的に含まないため、乳糖不耐症に罹患している対象でも忍容性が良好である。
従って、本発明はまた、本発明によるｆＧＯＳ調製物又は前記ｆＧＯＳ調製物を含む栄養組成物を対象に投与することを含む、前記対象のＧＯＳ調製物に対する過敏症を少なくとも部分的に防止する方法に関する。対象は哺乳動物であり、特にヒトである。対象は、あらゆる年齢であってよいが、好ましくは少なくとも１８ヵ月、好ましくは少なくとも２４ヵ月、更により好ましくは少なくとも３歳（３６ヵ月）、及び最も好ましくは少なくとも１３歳である。希少なＧＯＳに関連するアレルギーは、１８ヵ月以下の年齢の対象では報告されておらず、一般に２歳未満では乳糖不耐症が発生しない。４’－ＧＯＳ及び／又は６’－ＧＯＳに関連するアレルギーが東南アジア（例えばシンガポール、日本）で局地的に発生し、アジア人の集団内に乳糖不耐症が多い点から、対象は（東南）アジア出身であることが好ましい。
ｆＧＯＳ調製物の製造に使用されるβ－ガラクトシダーゼ酵素は、それ自体が米国特許出願公開第２０１９－１１９６６２号明細書により公知である（ＰＣＴ特開２０１６／０８９００１号公報に由来する）。国際公開第２０１９／００２３０４号パンフレットでは、この低アレルギー性ＧＯＳを産生するための酵素の使用が開示されている。この低アレルギー性ＧＯＳは、従来のラクトース飼料から得られるものであるため、ラクトース不耐症の対象に健康上の問題を引き起こす可能性がある。
ｆＧＯＳ調製物は、栄養組成物の形態で対象に投与することができる。そのような栄養組成物は、（ｉ）本発明のプロセスによって得られるｆＧＯＳ調製物、及び（ｉｉ）タンパク質源、プロバイオティクス、脂質源、及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１つの更なる成分を含む。本明細書で使用する場合、栄養組成物は、固体、液体、又は気体のどのような状態であっても栄養上の目的で消化管に入ってくる、あらゆる組成物又は製剤を指す。従って、栄養組成物は、食料品又は飲料品であってよい。本発明による栄養組成物の例には、調製粉乳、成長ミルク（Ｇｒｏｗｉｎｇ Ｕｐ Ｍｉｌｋ：ＧＵＭ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）で発酵させた飲料、ヨーグルト、栄養補助食品、及び栄養強化剤がある。
栄養組成物中に存在してもよいタンパク質源の例としては、乳清タンパク質（例えば、乳清タンパク質濃縮物若しくは乳清タンパク質分離物）、カゼイン（例えば、ミセルカゼイン分離物）、乳タンパク質濃縮物若しくは乳タンパク質分離物、及び／又は大豆タンパク質などの植物性タンパク質が挙げられる。好ましい一実施形態では、タンパク質源は、低アレルギー性又は非アレルギー性タンパク質源である。タンパク質源には、アレルギー反応を誘導しない食物タンパク質、より詳細には牛乳タンパク質に不耐性の対象に投与することができるタンパク質加水分解物が含まれる。そのようなタンパク質加水分解物の例には、１０，０００Ｄａ未満の分子量を有する加水分解残基を含有する加水分解乳清タンパク質、及び最大で３０００Ｄａのペプチドを含むカゼイン加水分解産物がある。栄養組成物中に存在してもよい炭水化物源の例には、ショ糖などの二糖、グルコースなどの単糖、及びマルトデキストリン、デンプン、並びにプレバイオティクス効果を有する炭水化物源がある。ラクトースの存在が好ましくないことは明らかである。栄養組成物中に存在してもよい脂質源の例には、トリ、ジ、及びモノグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、脂肪酸及びエステル又はそれらの塩がある。脂質は、動物由来、植物由来、微生物由来又は合成由来であってよい。特に興味深いのは、γリノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモγリノレン酸（ＤＨＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ステアリドン酸（ＳＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）及び共役リノール酸（ＣＬＡ）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）である。ＣＬＡは、小児の湿疹及び呼吸器疾患からの保護に重要なものである。このことは、特にＣＬＡのシス－９、トランス－１１、及びシス－１２異性体に関係している。好適な植物性脂質源としては、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、ココナッツ油、パーム油、パーム核油、大豆油等が挙げられる。好適な動物由来の脂質源の例としては、乳脂、例えば、無水乳脂（ＡＭＦ）、クリーム等が挙げられる。好ましい実施形態では、乳脂と植物由来の脂質との組み合わせが使用される。栄養組成物は、プロバイオティクスを更に含んでもよい。本発明の文脈では、「プロバイオティクス」という用語は、プロバイオティクス細菌株を指す。プロバイオティクス細菌は、当技術分野において公知である。適切には、プロバイオティクス細菌は遺伝子改変されていない。好適なプロバイオティクス細菌としては、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ））、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））の細菌が挙げられる。Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）及びＢ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）は、特に好ましいプロバイオティクスである。好適なＢ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）株は、例えば、健康なヒトの乳児の糞便から単離してもよい。プレバイオティクスとプロバイオティクスとの組み合わせは、「シンバイオティクス」とも称される。プロバイオティクスは、任意の好適な濃度、適切には、本発明の文脈における治療的有効量、即ち「治療するのに有効な量」で組成物中に存在してもよい。適切には、プロバイオティクスは、組成物の乾燥重量ｇ当たり１０２～１０ｅ１３ｃｆｕ、適切には１０５～１０１２ｃｆｕ／ｇ、最も適切には１０７～１０１０ｃｆｕ／ｇの量で本組成物中に含まれる。更に、栄養組成物は、ビタミン、酸化防止剤、ミネラル、遊離アミノ酸、ヌクレオチド、タウリン、カルニチン及びポリアミンなどの１種以上の従来の微量の成分が含有されていてもよい。好適な酸化防止剤の例には、ＢＨＴ、パルミチン酸アスコルビル、ビタミンＥ、α及びβカロチン、ルテイン、ゼアキサンチン、リコピン並びにリン脂質がある。
本発明のプロセスに使用されるβ－ガラクトシダーゼは、国際公開第２０１９／００２３０４号パンフレットに広範に開示されている。このβ－ガラクトシダーゼは、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１、又はその変異株Ｍ２及びＭ６から得ることができる。変異株（Ｍ２及びＭ６）は、紫外線処理による変異誘発によってパピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１から得ることができる。パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１及びＭ２は、下記に記載するような寄託所に寄託されており、容易に入手することができる。
＜パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１＞
寄託所：特許微生物寄託センター、製品評価技術基盤機構（〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、部屋番号１２２）。識別参照：クリプトコッカス・テレストリス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＭＭ１３－Ｆ２１７１。寄託日：２０１５年１２月１０日。アクセッション番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２１７７；
＜パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株Ｍ２＞
寄託所：特許微生物寄託センター、製品評価技術基盤機構（〒２９２－０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、部屋番号１２２）。識別参照：クリプトコッカス・テレストリス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＡＰＣ－６４３１。寄託日：２０１５年１２月１０日。アクセッション番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２１７８
従って、一実施形態では、本発明で使用される酵素は、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１（アクセッション番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２１７７）又はＡＰＣ－６４３１（アクセッション番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２１７８）に由来するものである。更なる実施形態では、酵素は、配列番号１、２、３若しくは４のいずれかによるアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３若しくは４のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、なお更により好ましくは少なくとも９７％、及び最も好ましくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。
米国特許出願公開第２０１９－１１９６６２号明細書には、パピリオトレマ属（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ）微生物に由来する変異株から産生される３種類のβ－ガラクトシダーゼ（変異株酵素１、２、及び３）と、決定されたそれらのアミノ酸配列とが記載されている。これら３つのβ－ガラクトシダーゼ酵素は、その遺伝子配列から推定される、野生型株酵素の全長アミノ酸配列の部分的な配列を有していることが判明した（野生型株酵素を配列番号１に示す）。具体的には、これらの変異酵素は、説明のために「変異株酵素１」と称する、野生型株酵素の全長アミノ酸配列のＮ末端の１３０個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する変異酵素（配列番号２を参照されたい）であり、説明のために「変異株酵素２」と称する、野生型株酵素の全長アミノ酸配列のＮ末端の１３６個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する変異酵素（配列番号３を参照されたい）であり、及び「変異株酵素３」と称する、野生型株酵素の全長アミノ酸配列のＮ末端の１４１個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列を有する変異酵素（配列番号４を参照されたい）である。「同等のアミノ酸配列」という用語は、この場合、参照アミノ酸配列（即ち、配列番号１～４のいずれか１つのアミノ酸配列）と部分的に異なるが、この差異がタンパク質の機能（β－ガラクトシダーゼ活性）に実質的に影響を及ぼすことがないアミノ酸配列を意味する。従って、同等のアミノ酸配列のポリペプチド鎖を有する酵素は、β－ガラクトシダーゼ活性を示す。「アミノ酸配列が部分的に異なる」という用語は、典型的に、アミノ酸配列を含む１個～数個（例えば、最大で３、５、７、若しくは１０個）のアミノ酸の欠失若しくは置換、又は１個～数個（例えば、最大で３、５、７、若しくは１０個）のアミノ酸の付加、挿入、若しくはそれらの組み合わせによって引き起こされるアミノ酸配列の変異（改変）を意味する。アミノ酸配列の差異は、β－ガラクトシダーゼ活性が維持される限り許容可能である（活性はある程度変動し得る）。この条件が満たされる限り、アミノ酸配列の差異の位置は特に制限されるものでなく、差異は複数の位置に生じ得る。「複数の」という用語は、例えば、全アミノ酸の約２０％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満、更により好ましくは約５％未満、及び最も好ましくは約１％未満に相当する数を意味する。より具体的には、同等のタンパク質は、例えば、参照アミノ酸配列と、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、いっそうより好ましくは約９５％以上、更により好ましくは約９７％以上、及び最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する。アミノ酸配列の差異は、複数の位置に生じ得る。同等のタンパク質は、β－ガラクトシダーゼ活性に必須でないアミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を生じさせることによって得られることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基を特性の類似した側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換することを意味する。アミノ酸残基は、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、及びイソロイシン）、並びに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン）などのそれらの側鎖に従って、いくつかのファミリーに分類される。保存的アミノ酸置換は、１つのファミリー内のアミノ酸残基間の置換であることが好ましい。２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列（以下、「２つの配列」という用語は、２つの配列のいずれかを表すために使用する）間の同一性（％）は、次の手順によって判断することができる。まず、２つの配列を最適に比較するために、２つの配列をアライメントする（例えば、第２の配列に対して最適にアライメントするように、第１の配列にギャップを導入してもよい）。第１の配列内の特定の位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）と、第２の配列内の対応する位置の分子が互いに同一である場合、その位置の分子は同一であると定義される。２つの配列間の同一性は、２つの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（即ち、同一性（％）＝１００×同一の位置の数／全体の位置の数）。２つの配列のアライメントを最適化するのに必要なギャップの数及び大きさを考慮に入れることが好ましい。２つの配列間における同一性の判断についての更なる情報は、国際公開第２０１９／００２３０４号パンフレットの１７頁１１行目から１８頁７行目にわたって言及されている。
上記に記載されるアミノ酸配列を有する本発明のプロセスに使用される酵素はまた、遺伝子工学技術によって調製されてもよい。例えば、適切な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））を、本酵素をコードするＤＮＡで形質転換し、形質転換体に発現したタンパク質を回収することによって、本酵素を調製する。回収されたタンパク質は、必要に応じて使用目的に従って処理される。こうして組み換えタンパク質として得られた酵素は、様々な改変を受けてもよい。例えば、任意のペプチド又はタンパク質に結合した組み換えタンパク質で構成される酵素は、酵素をコードするＤＮＡが他の適切なＤＮＡと共に挿入されているベクターを使用して、組み換えタンパク質を産生することによって得ることができる。加えて、糖鎖及び／又は脂質の付加、Ｎ末端又はＣ末端のプロセシングを生じさせる改変を行ってもよい。これらの改変によって、例えば、組み換えタンパク質の抽出、精製の単純化、又は生物学的機能の付加が可能となる。米国特許出願公開第２０１９－１１９６６２号明細書に記載されているように、本発明のプロセスに使用される酵素は、有利なことに、遺伝子が外来分子として存在するように、Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に由来するβ－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）をコードする組み換えＤＮＡが導入された形質転換体によって産生される。形質転換体は、前述したベクターを使用して形質移入又は形質転換によって調製されることが好ましい。宿主細胞は、発現し得る酵素が存在する限り、特に制限されるものではなく、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（例えば、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）等）、乳酸菌（例えば、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等）、他の細菌（例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等）、酵母菌（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルラ属（Ｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等）、及び糸状菌（真菌類）（例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）真菌、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）真菌、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）真菌、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）真菌等）から選択することができる。
本発明によるプロセスは、約５０～７５℃、より好ましくは約６３～７３℃、より好ましくは約６５～７０℃の好ましい温度で、ラクツロース含有飼料をβ－ガラクトシダーゼと接触させることを含む。
ラクツロース含有飼料は、４０～５８重量％のラクツロース、より好ましくは４５～５５重量％のラクツロース、最も好ましくは５０～５５重量％のラクツロースを含む水性ラクツロースシロップであることが好ましい。ラクツロース含有飼料のｐＨは、３．５～６．５、より好ましくは４．５～６．０、及び最も好ましくは５～５．５の範囲であることが好ましい。ｐＨは、クエン酸緩衝液などの食品グレードの緩衝液によって、好ましくは０．５ｍＭ～１０ｍＭの濃度で調整することができる。酵素は、１～２０ＬＵ／グラムのラクツロース、より好ましくは１～１０ＬＵ／グラムのラクツロース、更により好ましくは、２～８ＬＵ／グラムのラクツロース、及び最も好ましくは３～６ＬＵ／グラムのラクツロースの好ましい濃度で使用する。反応温度及び反応時間に応じて、それよりも低い又は高い濃度を使用することもできる。高い反応温度及び／又は長い反応時間によって、低い酵素濃度が可能となる。
酵素は、粉末形態（例えば、凍結乾燥、真空乾燥、又は噴霧乾燥させる）又は液体形態（例えば、リン酸緩衝溶液、トリアタノールアミン緩衝溶液、トリス塩酸緩衝溶液、又はＧＯＯＤ緩衝溶液中に溶解させる）で使用することができる。ある特定の実施形態では、酵素を固定化形態で使用する。酵素を固定化する様々な方法は、当技術分野において公知である。典型的には、それらには、共有結合によって、物理吸着（電荷間相互作用若しくはファン・デル・ワールス相互作用）によって、ゲル封入によって、又はそれらの組み合わせによってβ－ガラクトシダーゼが固定化される多孔質担体が含まれる。加えて、ＣＬＥＣ（架橋化酵素結晶）又はＣＬＥＡ（架橋化酵素縮合体）などの担体を含まない固定化酵素を適用することもできる。操作が容易であり、反応混合物に漏出しないことから、酵素の直接的な共有結合を促進する担体が好ましい。固体担体の例としては、活性化アクリルポリマー、好ましくは官能化ポリメタクリレートマトリックスがある。例えば、ヘキサメチレンアミノ官能化ポリメタクリレートマトリックス（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）、又はＥｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ ２５０Ｌのような微孔性アクリル系エポキシ活性化樹脂を使用することができる。固定化酵素を使用することによって、ＧＯＳ合成のいくつかの連続的なバッチ（「サイクル」）を含む、反復バッチ操作システムが可能となる。酵素を再利用することもでき、半連続操作と酵素の複数回の再利用とが可能となる。
本発明のプロセスから得られるｆＧＯＳは、従来の方法、例えば、ナノ濾過又は連続的疑似移動床（ＳＳＭＢ）を使用して単離及び精製することができる。
実験では、以下の供給源のβ－ガラクトシダーゼを使用した。
アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ラクターゼ １４ ＤＳ、元天野エンザイム）、
アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ｔｏｌｅｒａｓｅ １００、元ＤＳＭ）
アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ｂｉｏｌａｃｔａｓｅ Ｆ、元Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（β－ガラクトシダーゼ ＰＴ、元天野エンザイム）
一般的な反応条件は次の通りであった。ラクツロース３５グラムを、０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液３５グラム（ｐＨ６．５）に添加した。続いて、酵素を１０ｍの水に溶解させて添加し、反応を初期化した。大部分の酵素で２０ラクトース単位（ＬＵ）／グラムのラクツロースを使用した。しかしながら、使用した一般的な反応条件では活性が低かったため、ラクターゼ １４ ＤＳ及びＴｏｌｅｒａｓｅ １００は、２００ラクトース単位（ＬＵ）／グラムのラクツロース濃度で使用した。オービタルシェーカーを備え、サーモスタットで５０℃に調温されたウォーターバスに反応混合物を入れた。反応の４８時間後に、１．５％の１Ｍ ＨＣｌを添加することによって反応をクエンチし、続いて９５℃で３０分間加熱した。
反応混合物のｆＧＯＳ含有量を、ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｏｎｅｘ ｔｙｐｅ ＩＣＳ ３０００）により、個々の糖のピーク面積の割合に基づいて分析した。ｆＧＯＳ含有量は、以下の式によって計算した：
ｆＧＯＳ含有量（％、ｄｓ）＝１００％－ガラクトース％－グルコース％－ラクトース％－ラクツロース％－フルクトース％。
異なる酵素によって得られたｆＧＯＳ含有量を表１にまとめた。表１は、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）から得られた酵素が、Ｃ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．によれば最良の酵素であるアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼよりもはるかに高い収率が得られたことを示している。
ラクツロースの２つの基本単位、即ちフルクトース及びガラクトース間の割合を、酵素の性能の指標として使用する。この割合が≦１である場合は、達成されるｆＧＯＳ含有量が、反応時間を延長してもそれ以上増加させることができないことを意味する。なぜならば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ－ガラクトシダーゼの場合のように、基質又は形成されたｆＧＯＳのみを加水分解することしかできないからである。Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）由来のβ－ガラクトシダーゼの場合、フルクトース／ガラクトースの割合は２を上回るが、このことは、ｆＧＯＳの収率が、反応時間を延長することによって更に最適化することができることを示唆している。
ＨＰＬＣクロマトグラムでは、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）由来の酵素によって産生されたｆＧＯＳは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来の酵素によって産生されたｆＧＯＳと比較して、はるかに多くのピークが示された。オリゴ糖の構造の多様性は、腸内の異なるビフィズス菌の栄養上のニーズ、及び病原体に結合するための囮となる機能を果たすのに非常に重要なものである。従って、本発明のプロセスに由来するｆＧＯＳは、より高い栄養価を有するものと思われる。
異なる酵素によって形成されたｆＧＯＳの重合度（ＤＰ）を表２にまとめた。ラクツロースと、ラクツロースによって形成された他のＤＰ２ ｆＧＯＳ構成成分を区別することができないため、各酵素毎にｆＧＯＳとラクツロースとを足した含有量の合計を示している。ラクツロース自体が消化されない（プレバイオティクス）糖であるため、ラクツロースとｆＧＯＳを分ける必要がない。Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）酵素による実験では、ｆＧＯＳ＋ラクツロース含有量は約８５％である。対照的に、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）酵素から得られるｆＧＯＳ＋ラクツロースは、３５％未満であるが、これは、おそらく高い単糖含有量によって示されるそれら固有の高い加水分解活性によるものである。
Ｐ．テレストリス（Ｐ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）による実験を、基質としてラクトースを用いて繰り返した。結果を表３に示す。（ラクツロースから得られた）ｆＧＯＳのＤＰ２含有量は、ラクトースから得られたＧＯＳのＤＰ２含有量よりも著しく高いことを示している。乳児の結腸内でＢ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）などの乳児型ビフィズス菌の増殖を選択的に促進することができるため、このＤＰ２のｆＧＯＳ構成成分の高さは、乳児の腸内細菌叢に有利となり得る。

Claims (9)

  1. ガラクトオリゴ糖調製物を調製するためのプロセスであって、ラクツロース含有飼料を、パピリオトレマ・テレストリス（Ｐａｐｉｌｉｏｔｒｅｍａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）株ＭＭ１３－Ｆ２１７１（アクセッション番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２１７７）に由来するβ－ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）と接触させる工程を含む、プロセス。
  2. 前記ラクツロース含有飼料が、４０～５８重量％のラクツロースを含む、請求項１に記載のプロセス。
  3. 前記ラクツロース含有飼料が、５０～５５重量％のラクツロースを含む、請求項２に記載のプロセス。
  4. 前記ラクツロース含有飼料のｐＨが、３．５～６．５の範囲である、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. 前記ラクツロース含有飼料のｐＨが、５～５．５の範囲である、請求項４に記載のプロセス。
  6. 前記β－ガラクトシダーゼが、１～２０ＬＵ／グラムのラクツロースの濃度で使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。
  7. 前記β－ガラクトシダーゼが、３～６ＬＵ／グラムのラクツロースの濃度で使用される、請求項６に記載のプロセス。
  8. ５０～７５℃の範囲の温度で、前記ラクツロースを前記β－ガラクトシダーゼと反応させる、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
  9. ６５～７０℃の範囲の温度で、前記ラクツロースを前記β－ガラクトシダーゼと反応させる、請求項８に記載のプロセス。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017115826A1 (ja) 2015-12-29 2017-07-06 天野エンザイム株式会社 新規β－ガラクトシダーゼ
WO2019002304A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Frieslandcampina Nederland B.V. PROCESS FOR PREPARING GOS WITH REDUCED ALLERGENICITY

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017788B (zh) * 2014-05-08 2017-04-12 江南大学 一种通过改变反应压力调节β‑半乳糖苷酶转糖苷活力的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017115826A1 (ja) 2015-12-29 2017-07-06 天野エンザイム株式会社 新規β－ガラクトシダーゼ
WO2019002304A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Frieslandcampina Nederland B.V. PROCESS FOR PREPARING GOS WITH REDUCED ALLERGENICITY

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Frontiers in Microbiology，2016年，Vol.7，Article 624，doi:10.3389/fmicb.2016.00624
Journal of Biotechnology，2011年，Vol.153，p.116-124，doi:10.1016/j.jbiotec.2011.03.012

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