JP7763192B2 - Ｉｌ－２タンパク質およびｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質を含む、放射線療法を増強するための医薬組成物 - Google Patents

Ｉｌ－２タンパク質およびｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質を含む、放射線療法を増強するための医薬組成物

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Description

技術分野
本発明は、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質を含む、放射線療法を増強するための医薬組成物、およびそれを用いた癌の放射線療法に関する。
背景技術
癌の処置法は、手術、放射線療法、抗癌剤化学療法に大きく分けられる。韓国で放射線療法を受けている癌患者の数は年々増加しており、癌処置における放射線療法の重要性も高まっている。
放射線療法は現在、種々のタイプの癌に必須の治療法として知られている。しかしながら、癌細胞の放射線耐性の獲得および高線量放射線療法による正常組織の損傷などが、放射線療法の効率を低下させる問題として指摘されている。そのため、放射線療法の効果を高める放射線療法増感剤および放射線増感化合物の研究が試みられている（Oncogene, 23 (8): 1599-1607, 2004）。しかしながら、これまでに報告されている放射線療法増感剤は主に抗癌剤、例えばタキソール、シスプラチンなどである。
上記のような放射線療法の効果を高めるために用いられる抗癌剤を放射線療法と併用するとき、抗癌剤の毒性が放射線療法中に発生する副作用、すなわち放射線療法部位の炎症、胃腸障害、吐き気、嘔吐、下痢等と合わせて現れることがあり、使用が制限されるという欠点がある。
故に、癌細胞に対する放射線感受性を高めながら、副作用を最小限に抑えることによって放射線療法を最適化できる放射線療法エンハンサーを開発する緊急の必要性がある。
発明の詳細な説明
技術的問題
従って、本発明者らは、癌に対する放射線療法の増強効果を有しながら、副作用なく放射線療法と併用できる放射線療法増強剤の開発を検討した。その結果、本発明者らは、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を１分子中に含む融合タンパク質二量体を放射線と組み合わせて処置したとき、癌の処置に相乗効果を示すことを確認した。上記に基づき、本発明者らは本発明を完成した。
課題の解決手段
上記目的を達成するために、本発明の一面では、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む、癌の放射線療法を増強するための医薬組成物を提供する。
本発明の別の面では、癌に罹患している非ヒト哺乳動物の癌部位に放射線を照射し、該哺乳動物に医薬組成物を投与することを含む、癌の放射線療法を提供する。
発明の効果
本発明のＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む組成物は、放射線療法の効果を増強するために放射線療法と組み合わせて用いられ得る。従って、放射線に抵抗性の癌に対しても放射線療法の効果が高まる可能性がある。
また、このような放射線療法の増強作用により、放射線療法の線量を低くしながら、治療効果の点で高線量の放射線療法を行ったときに得られる優れた抗癌効果を得ることができる。このため、放射線療法中に高線量の放射線を照射することによる副作用を軽減できるという利点がある。
さらに、放射線療法による腫瘍抗原の拡散により、全身の免疫細胞を刺激することができる。これに関して、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体は全身免疫細胞の活性をさらに増幅するため、放射線療法の抗癌効果は融合タンパク質二量体によって増強され得る。
したがって、本発明のＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む組成物は、併用療法を目的として商品化される放射線療法アジュバントとして使用できることが予期される。特に、放射線を照射し、かつ本発明の医薬組成物を投与すると、放射線が照射されていない部位においても優れた抗癌効果が得られることから、商業的有用性が高いと期待される。
図１ａ～１ｃは、黒色腫細胞株B16F10の移植後に形成された腫瘍を有するマウスに本発明のｍＧＩ－１０１を投与したとき、および／または放射線を照射したとき、放射線を照射した腫瘍部位での抗癌効果および放射線を照射していない部位での治療効果を示すアブスコパル(abscopal)効果を確認した結果を示す。具体的には、（ａ）放射線を照射した右側の腫瘍の体積、（ｂ）放射線を照射していない左側の腫瘍の体積、および（ｃ)両腫瘍の平均体積を示すグラフであり、腫瘍を有するマウスに本発明のｍＧＩ－１０１を投与した、および／または放射線を照射したとき、ノギスを用いて測定したものである。 図２ａ～２ｅは、腫瘍を有するマウスに本発明のｍＧＩ－１０１を投与した、および／または放射線を照射したとき、放射線が照射された腫瘍部位における抗癌効果を確認した結果を示す。具体的には、放射線を照射した右側の腫瘍に本発明のｍＧＩ－１０１を投与した、および／または放射線を照射したときの各マウス対象の腫瘍増殖を示す。 図３ａ～３ｅは、腫瘍を有するマウスに本発明のｍＧＩ－１０１を投与した、および／または放射線を照射したとき、放射線が照射されていない遠位部位で治療効果を示すアブスコパル効果を確認した結果を示す。具体的には、放射線を照射していない左側の腫瘍に本発明のｍＧＩ－１０１を投与した、および／または放射線を照射したときの各マウス対象の腫瘍増殖を示す。 図４ａ～図４ｃは、本発明のｍＧＩ－１０１および／または放射線照射による腫瘍増殖阻害を示すグラフである。具体的には、（ａ）放射線を照射した右側の腫瘍の腫瘍増殖阻害、（ｂ）放射線を照射していない左側の腫瘍の腫瘍増殖阻害、および（ｃ）両腫瘍の平均腫瘍増殖抑制を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
放射線療法増強剤
本発明の一面では、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む、癌の放射線療法を増強するための医薬組成物を提供する。
また、本発明の別の局面において、該融合タンパク質二量体を有効成分として含有する抗癌補助剤が提供される。
本明細書中で用いる用語“癌”は、生体の生体現象または周囲の組織状態に関わらず、正常な組織細胞が何らかの理由で際限なく増殖し、急速に発達し続ける疾患に分類される。本発明における癌としては、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌およびリンパ腫などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明においては、放射線に抵抗性の癌が対象であるが、これに限定されない。
本明細書中で用いる用語“放射線療法を増強する”とは、放射線を用いた疾患の処置において、放射線に対する細胞の感受性を増強し、最終的に疾患に対する治療効果を増強することを意味する。特に、癌処置と並行して処置したとき、癌細胞の放射線感受性が高まる可能性があり、癌細胞を死滅させる効果および癌細胞の増殖阻害効果を示し得る。
癌の放射線療法には、深部Ｘ線治療、ラジウム治療、コバルト６０質量照射、超高圧放射線療法、放射性同位元素内服治療など、公知の各種放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。
一態様において、黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０の移植後に腫瘍が形成されたマウスを、本発明のＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体および放射線療法の組合せで処置した結果、融合タンパク質は、腫瘍増殖をより効果的に減少させることにより、抗癌処置の組合せまたはアジュバント（補助剤）として用い得ることが確認された（図１ａ～４ｃ）。
ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質の融合タンパク質を含む本発明の放射線療法を増強するための医薬組成物は、放射線療法が適用される可能性のある細胞であれば何れの細胞にも適用でき、特に、癌細胞の放射線感受性を高めるための使用が好ましい。
放射線療法を増強するための医薬組成物は、放射線療法と組み合わせた癌処置において相乗効果を示すため、抗癌治療アジュバント、放射線療法アジュバント、放射線療法増強剤または放射線増感剤と同様に使用できる。
本明細書で用いる用語“アジュバント”とは、治療効果を有する薬剤、物質、方法等の効果を増強する役割を果たし、本発明による放射線療法を増強するための医薬組成物が投与されたとき、治療効果を有する有効成分の抗癌活性を増強することにより抗癌活性を増強し、または副作用を減少させることを意味する。具体的には、従来の癌処置法である抗癌剤または放射線照射と併用するとき、癌治療効果に相乗効果を発揮し、抗癌剤または放射線照射に対する癌細胞の感受性を高め得る。
特に、放射線療法中に融合タンパク質二量体を投与すると、放射線が照射された部位以外の遠位部位の癌を効果的に取り除くアブスコパル効果が高まることが確認された。したがって、融合タンパク質二量体は、放射線が照射された部位だけでなく、放射線が照射されていない遠位部位においても放射線療法の抗癌作用を高める効果があることが確認された。故に、放射線療法の効果を高める併用療法として用い得る。
放射線療法を増強するための医薬組成物に含まれるＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質は、以下に記載されるとおりである。
ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質
本明細書で用いる用語“ＩＬ－２”または“インターロイキン－２”は、他の記載がない限り、哺乳動物、例えば霊長動物（ヒトなど）およびげっ歯動物（マウスおよびラットなど）を含む何れかの脊椎動物源から得られる何れかの野生型ＩＬ－２を意味する。ＩＬ－２は、動物細胞から得られたものであってもよく、またＩＬ－２を産生できる組換え細胞から得られたものも含まれる。さらに、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２またはその変異体であってもよい。
本明細書において、ＩＬ－２またはその変異体を“ＩＬ－２タンパク質”または“ＩＬ－２ポリペプチド”と総称して表現し得る。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチドおよびＩＬ－２変異体は、例えばＩＬ－２受容体に特異的に結合する。この特異的結合は、当業者に知られている方法によって同定できる。
ＩＬ－２の態様は、配列番号３５または配列番号３６のアミノ酸配列を有し得る。ここで、ＩＬ－２はまた成熟型であってもよい。具体的には、成熟型ＩＬ－２はシグナル配列を含まなくてもよく、配列番号１０のアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２のＮ末端またはＣ末端の一部が切断された野生型ＩＬ－２のフラグメントを包含する概念で用いられ得る。
さらに、ＩＬ－２のフラグメントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の連続するアミノ酸が、配列番号３５または配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から切断されている形態であり得る。さらに、ＩＬ－２のフラグメントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の連続するアミノ酸が、配列番号３５または配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から切断されている形態であり得る。
本明細書で用いる用語“ＩＬ－２変異体”とは、全長ＩＬ－２または上記ＩＬ－２フラグメントのアミノ酸の一部が置換されている形態を意味する。すなわち、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２またはそのフラグメントとは異なるアミノ酸配列を有し得る。しかしながら、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と同等または類似の活性を有し得る。ここで、“ＩＬ－２活性”とは、例えば、ＩＬ－２受容体への特異的結合を意味していてよく、その特異的結合は、当業者に公知の方法によって測定できる。
具体的には、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部を置換することによって得ることができる。アミノ酸置換によって得られるＩＬ－２変異体の一態様は、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の少なくとも１つを置換することによって得られ得る。
具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目、６１番目または７２番目のアミノ酸の少なくとも１つを別のアミノ酸に置換することにより得られる。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列においてＮ末端の一部が切断されている形態であるとき、配列番号１０のアミノ酸配列において相補的に対応する位置のアミノ酸は、別のアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有するとき、そのＩＬ－２変異体は、配列番号３５のアミノ酸配列における５８番目、６２番目、６５番目、８１番目または９２番目のアミノ酸の少なくとも１つを別のアミノ酸に置換することにより得られる。これらのアミノ酸残基は、それぞれ配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸残基に対応する。一態様によれば、そのようなＩＬ－２変異体がＩＬ－２活性を維持する限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が置換されてもよい。別の態様によれば、１個から５個のアミノ酸が置換され得る。
一態様において、ＩＬ－２変異体は、２つのアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目および４２番目のアミノ酸の置換により得ることができる。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目および４５番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４２番目および４５番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４２番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４２番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４５番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４５番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。
さらに、ＩＬ－２変異体は、３つのアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目および４５番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４２番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４２番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４５番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４５番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４２番目、４５番目および６１番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４２番目、４５番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。
加えて、ＩＬ－２変異体は、４個のアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目および６１番目のアミノ酸を置換することにより得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４２番目、４５番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目、４２番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。また、一態様において、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸の置換によって得られ得る。
さらに、ＩＬ－２変異体は、５個のアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸をそれぞれ別のアミノ酸に置換することにより得ることができる。
ここで、置換により導入される“別のアミノ酸”とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される何れか１つであり得る。しかしながら、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目のアミノ酸がアルギニンに置換できず、４２番目のアミノ酸がフェニルアラニンに置換できず、４５番目のアミノ酸がチロシンに置換できず、６１番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換できず、そして７２番目のアミノ酸がロイシンに置換できない。
ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目のアミノ酸であるアルギニンがアルギニン以外のアミノ酸に置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換について、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目のアミノ酸であるアルギニンはアラニンに置換されていてもよい（Ｒ３８Ａ）。
ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸に置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換は、配列番号１０のアミノ酸配列において、４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがアラニンに置換されていてもよい（Ｆ４２Ａ）。
ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、４５番目のアミノ酸であるチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換は、配列番号１０のアミノ酸配列において、４５番目のアミノ酸であるチロシンがアラニンに置換されていてもよい（Ｙ４５Ａ）。
ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換は、配列番号１０のアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアルギニンに置換されていてもよい（Ｅ６１Ｒ）。
ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換については、配列番号１０のアミノ酸配列において、７２番目のアミノ酸であるロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換されていてもよい。好ましくは、ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換は、配列番号１０のアミノ酸配列において、７２番目のアミノ酸であるロイシンがグリシンに置換されていてもよい（Ｌ７２Ｇ）。
具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの置換によって得られ得る。
具体的には、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇからなる群より選択される位置のうち、２箇所、３箇所、４箇所または５箇所でのアミノ酸置換によって得られ得る。
また、ＩＬ－２変異体は、２個のアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ａの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８ＡおよびＹ４５Ａの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２ＡおよびＹ４５Ａの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得られ得る。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得られ得る。
さらに、ＩＬ－２変異体は、３個のアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＡおよびＹ４５Ａの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。
また、ＩＬ－２変異体は、４個のアミノ酸が置換された形態であってもよい。具体的には、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＥ６１Ｒの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。さらに、一態様では、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。
さらに、ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換によって得ることができる。
好ましくは、ＩＬ－２変異体の態様は、配列番号１０のアミノ酸配列において、以下の置換の組合せ（ａ）～（ｄ）から選択されるいずれか１つを含み得る：
（ａ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ；
（ｂ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ；
（ｃ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ；または
（ｄ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ。
ここで、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有するとき、配列番号１０のアミノ酸配列と相補的に対応する位置にアミノ酸置換が存在していてもよい。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列のフラグメントであっても、配列番号１０のアミノ酸配列と相補的に対応する位置にアミノ酸置換が存在していてもよい。
具体的には、ＩＬ－２変異体は、配列番号６、２２、２３または２４のアミノ酸配列を有し得る。
また、ＩＬ－２変異体は、インビボ毒性が低いことを特徴とし得る。ここで、インビボ毒性は、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体α鎖（ＩＬ－２ Ｒα）に結合することによる副作用であり得る。ＩＬ－２がＩＬ－２ Ｒαに結合することによって引き起こされる副作用を改善するために、種々のＩＬ－２変異体が開発されており、そのようなＩＬ－２変異体は、米国特許第５，２２９，１０９号および韓国特許第１６６７０９６号に記載されているものであり得る。特に、本明細書に記載のＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２受容体α鎖（ＩＬ－２ Ｒα）に対する結合能が低く、故に野生型ＩＬ－２よりもインビボ毒性が低い。
本明細書で用いる用語“ＣＤ８０”は、“Ｂ７－１”とも呼ばれ、樹状細胞、活性化Ｂ細胞および単球に存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の活性化および生存に不可欠な共刺激シグナルを供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞表面に存在する２つの異なるタンパク質ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４のリガンドとして知られている。ＣＤ８０は、２８８個のアミノ酸から構成され、具体的には配列番号１１のアミノ酸配列を有し得る。さらに、本明細書で用いる用語“ＣＤ８０タンパク質”とは、全長ＣＤ８０またはＣＤ８０フラグメントを意味する。
本明細書で用いる用語“ＣＤ８０フラグメント”とは、切断された形態のＣＤ８０を意味する。さらに、ＣＤ８０フラグメントは、ＣＤ８０の細胞外ドメインであり得る。ＣＤ８０フラグメントの一態様は、ＣＤ８０のシグナル配列であるＮ末端から１番目～３４番目のアミノ酸を除去することによって得ることができる。具体的には、ＣＤ８０フラグメントの一態様は、配列番号１１の３５番目から２８８番目のアミノ酸から構成されるタンパク質であり得る。また、ＣＤ８０フラグメントの一態様は、配列番号１１の３５番目から２４２番目のアミノ酸から構成されるタンパク質であり得る。また、ＣＤ８０フラグメントの一態様は、配列番号１１の３５番目から２３２番目のアミノ酸から構成されるタンパク質であり得る。また、ＣＤ８０フラグメントの一態様は、配列番号１１の３５番目から１３９番目のアミノ酸から構成されるタンパク質であり得る。また、ＣＤ８０フラグメントの一態様は、配列番号１１の１４２番目から２４２番目のアミノ酸から構成されるタンパク質であり得る。一態様では、ＣＤ８０フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。
また、ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質はリンカーまたは担体を介して結合していてもよい。具体的には、ＩＬ－２またはその変異体およびＣＤ８０（Ｂ７－１）またはそのフラグメントは、リンカーまたは担体を介して互いに結合していてもよい。本明細書において、リンカーおよび担体は互換的に用いられ得る。
リンカーは２つのタンパク質を結合する。リンカーの態様としては、１から５０個のアミノ酸、アルブミンまたはそのフラグメント、免疫グロブリンのＦｃドメインなどが挙げられ得る。ここで、免疫グロブリンのＦｃドメインとは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域および軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を意味する。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭであってよく、好ましくはＩｇＧ４であり得る。ここで、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有し得る。
さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと同様にＦｃドメイン変異体であってもよい。さらに、本明細書で用いる用語“Ｆｃドメイン変異体”とは、グリコシル化パターンに関して野生型Ｆｃドメインとは異なる形態、野生型Ｆｃドメインと比較して高いグリコシル化を有する形態、または野生型Ｆｃドメインと比較してグリコシル化が低い形態、あるいは脱グリコシル化型である。さらに、非グリコシル化型Ｆｃドメインが包含される。Ｆｃドメインまたはその変異体は、培養条件または宿主の遺伝子操作によって、調整された数のシアル酸、フコシル化またはグリコシル化を有するように適合され得る。
また、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化は、微生物を用いた化学的方法、酵素的方法、遺伝子工学的方法などの常套法により改変されてもよい。また、Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭのそれぞれのＦｃ領域の混合形態であってもよい。また、Ｆｃドメイン変異体は、Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された形態であってもよい。Ｆｃドメイン変異体の態様は、配列番号１２のアミノ酸配列を有し得る。
融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（または担体）として用いて、ＣＤ８０タンパク質およびＩＬ－２タンパク質、またはＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を、それぞれリンカーまたは担体のＮ末端およびＣ末端に連結させた構造を有していてもよい。ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端と、ＣＤ－８０またはＩＬ－２との間の結合は、要すれば、リンカーペプチドによって達成され得る。
具体的には、融合タンパク質は、以下の構造式（Ｉ）または（ＩＩ）から構成され得る：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
ここで、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）において、
Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
ＸはＣＤ８０タンパク質であり、
ＹはＩＬ－２タンパク質であり、
リンカー（１）および（２）はペプチドリンカーであり、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して０または１である。
好ましくは、融合タンパク質は構造式（Ｉ）からなり得る。ＩＬ－２タンパク質は上記の通りである。また、ＣＤ８０タンパク質は上記の通りである。一態様によれば、ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、１～５個のアミノ酸置換を有するＩＬ－２変異体であり得る。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ末端またはＣ末端から最大約３４個の連続アミノ酸残基を切断することによって得られるフラグメントであり得る。あるいは、ＣＤタンパク質は、Ｔ細胞表面受容体ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２８に結合する活性を有する細胞外免疫グロブリン様ドメインであり得る。
具体的には、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８または３０のアミノ酸配列を有し得る。別の態様によれば、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８または３０のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ここで、同一性は、例えば、相同性パーセントであり、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；the National Center of Biotechnology Information）のＢｌａｓｔＮソフトウェアなどの相同性比較ソフトウェアによって決定できる。
ペプチドリンカー（１）は、ＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間に含まれ得る。ペプチドリンカー（１）は、５個から８０個の連続アミノ酸、２０個から６０個の連続アミノ酸、２５個から５０個の連続アミノ酸、または３０個から４０個の連続アミノ酸からなり得る。一態様において、ペプチドリンカー（１）は、３０個のアミノ酸からなり得る。また、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも１つのシステインを含み得る。具体的には、ペプチドリンカー（１）は、１つ、２つまたは３つのシステインを含み得る。また、ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来し得る。一態様において、ペプチドリンカー（１）は、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカー（２）は、１個から５０個の連続アミノ酸、３個から３０個の連続アミノ酸、または５個から１５個の連続アミノ酸からなり得る。一態様では、ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１～１０の整数である）であってもよい。ここで、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であってよい。一態様において、ペプチドリンカー（２）は、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。
本発明の別の面において、各々がＩＬ－２タンパク質またはその変異体およびＣＤ８０タンパク質またはそのフラグメントを含む、２つの融合タンパク質の結合によって得られる二量体を提供する。ＩＬ－２またはその変異体、およびＣＤ８０またはそのフラグメントを含む融合タンパク質は、上記のとおりである。
ここで、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、リンカーに存在するシステインによって形成されるジスルフィド結合によって達成され得るが、これに限定されない。二量体を構成する融合タンパク質は、互いに同一の融合タンパク質であっても、異なる融合タンパク質であってもよい。好ましくは、二量体はホモ二量体であり得る。二量体を構成する融合タンパク質の一態様は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質の融合タンパク質を含む本発明の放射線療法を増強するための医薬組成物は、他の抗癌剤と組み合わせて追加投与されてよく、それによって癌に対する放射線療法の効果をさらに増強できる。
抗癌剤は、化学療法抗癌剤、標的抗癌剤または免疫抗癌剤であり得る。
具体的には、“化学療法抗癌剤”は、アルキル化剤、微小管阻害剤、代謝拮抗剤またはトポイソメラーゼ阻害剤であり得るが、これらに限定されない。
アルキル化剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ、アルトレタミン、プロカルバジン、ブスルファン、ストレプトゾシン、カルムスチン、イオムスチン、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンであってもよいが、これらに限定されない。微小管阻害剤は、ドセタキセル、ビンブラスチン、オンコビンまたはビノレルビンであってもよいが、これらに限定されない。代謝拮抗剤は、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン、メトトレキセート、ペメトレキセ、またはメルカプトプリンであり得るが、これらに限定されない。トポイソメラーゼ阻害剤は、ハイカムチン、カンプトサール、ベペシド、タキソール、ブレオマイシン、アドリアマイシン、またはセルビジンであり得るが、これらに限定されない。
また、“標的抗癌剤”としては、トラスツズマブ、ペルツズマブ、パニツムマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、アフリベルセプト、リツキシマブ、オビヌツズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、イブルチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、イマチニブ、ボスチニブ、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ニンテダニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、カボザンチニブ、トラメチニブ、ダブラフェニブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、レナリドマイド、ルキソリチニブ、アレクチニブ、クリゾチニブ、オラパリブまたはベネトクラクスが挙げられるが、これらに限定されない。
また、“免疫抗癌剤”としては、免疫チェックポイント阻害剤、免疫細胞治療剤（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、二重特異性抗体、抗癌ウイルス、または抗癌ワクチンが挙げられるが、それらに限定されない。
“免疫チェックポイント阻害剤”は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、または抗ＬＡＧ３抗体であり得る。抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、またはセミプリマブであり得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブであり得るが、これらに限定されない。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブであってもよい。抗ＴＩＭ３抗体はＭＢＧ４５２であってもよい。そして、抗ＬＡＧ３抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６またはＬＡＧ５２５であり得るが、これらに限定されない。免疫細胞治療剤は、チサゲンレクルセルまたはアキシカブタゲンシロロイセルであり得るが、これらに限定されない。ＡＤＣは、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、またはエリブリンメシル酸塩であり得るが、これらに限定されない。二重特異性抗体はブリナツモマブであり、抗癌ウイルスはタリモジンラヘルパレプベクであり、抗癌ワクチンはシプロイセル－Ｔであり得るが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は、患者への送達に適した何れかの非毒性物質であり得る。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体を担体として含め得る。また、薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）が医薬組成物に含まれていてもよい。
具体的には、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む、当技術分野で知られている従来法による投与経路に従って、非経腸製剤として調製できる。ここで、“薬学的に許容される”とは、有効成分の活性を阻害せず、適用（処方）対象が適応し得る以上の毒性を有しないことを意味する。
医薬組成物が非経腸製剤として調製されるとき、当技術分野で公知の方法に従って、適切な担体と共に、注射剤、経皮製剤、鼻吸入剤、および坐剤の形態で製剤化され得る。注射剤として製剤化するとき、滅菌水、エタノール、グリセロールまたはプロピレングリコールなどのポリオール、あるいはそれらの混合物を適切な担体として使用でき、好ましくは、リンゲル液、トリエタノールアミンを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、または滅菌注射用水、５％デキストロースなどの等張液などを使用できる。医薬組成物の製剤は当技術分野で公知であり、具体的には、文献［Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)］などを参照してもよい。文献は本明細書の一部とみなされる。
一方、本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本明細書で用いる用語“投与”とは、所定の物質を適当な方法で対象に導入することを意味し、組成物の投与経路は、標的組織に到達し得る限り、何れかの一般的な経路であってよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、または直腸内投与であってもよいが、これらに限定されない。
用語“対象”とは、ヒト、ラット、マウス、家畜などを含むすべての動物を意味する。好ましくは、ヒトを含む哺乳動物であり得る。
用語“薬学的に有効な量”とは、医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で疾患を処置するのに十分であり、副作用を引き起こさない量を意味し、有効用量レベルは、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾患の種類および重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路、排泄率、処置期間、組合せまたは併用薬、ならびに医療分野でよく知られているその他の要因を含む複数の要因に応じて当業者によって容易に決定され得る。１日量は、０．０１μｇ／ｋｇから１０ｇ／ｋｇの範囲、または０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、１日１回または１日に数回行うことができる。そのような投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
放射線療法
本発明の別の面では、癌に罹患した非ヒト哺乳動物の癌部位に放射線を照射すること、および本発明による放射線治増法を増強するための医薬組成物を該哺乳動物に投与することを含む、癌の放射線治療方法が提供される。
本明細書で用いる用語“放射線照射”とは、放射線を照射することにより悪性細胞のＤＮＡに損傷を与える局所的処置法を意味する。正常細胞は、腫瘍細胞よりもこの損傷を修復する能力が優れている。放射線照射とは、このような違いを利用した処置を意味し、従来の意味での放射線を用いた処置法を包含する。
放射線照射は、放射線療法の種類によって、根治的放射線療法、補助的放射線療法、緩和的放射線療法に分けられる。根治的放射線療法とは、腫瘍が比較的局所に限られ、遠隔転移がない場合に完治を目指す放射線療法を意味する。補助的放射線療法とは、手術後の局所再発を防ぐために行う放射線療法を意味する。放射線療法と併用することで、再発を抑えるだけでなく、手術範囲を狭めて組織の機能を維持できる。緩和的放射線療法とは、癌による症状を緩和するために行われる放射線療法を意味する。放射線は、高エネルギー放射線を用いて癌細胞を死滅させる治療法である。しかしながら、癌細胞だけでなく、その周囲の正常な組織にも影響を与えるため、治療による副作用が生じることがある。例としては、皮膚の変化、脱毛、悪心および嘔吐、下痢、粘膜炎／食道炎、口渇、生殖機能の変化などが挙げられる。
放射線は、０．１Ｇｙから１００Ｇｙの照射量で全身的または部分的に照射できる。具体的には、放射線の照射量は、０．１Ｇｙ～１００Ｇｙ、０．５Ｇｙ～９０Ｇｙ、０．７Ｇｙ～８０Ｇｙ、および０．９Ｇｙ～７０Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ～６０Ｇｙであるが、これらに限定されない。また、放射線は１～２６週間照射できるが、これに限定されない。
本発明の放射線療法を増強するための医薬組成物は、癌の放射線療法増強効果を得るために、癌の処置中に放射線照射と併用して投与でき、“併用投与”とは、さまざまな種類の癌細胞の処置の抗癌療法中に併せて放射線を照射することを意味する。
本明細書で用いる用語“処置”は、治療的処置および予防的処置の両方を含むという意味で使用できる。これに関して、予防は、対象の病理学的状態または疾患を緩和または軽減するという意味で使用され得る。また、“処置”には、ヒトを含む哺乳動物における疾患を処置するための投与または適用の何れかの形態が含まれる。この用語には、疾患または疾患の進行を阻害または遅延させる；損傷した機能または失われた機能を回復または修復させ、それによって部分的または完全に疾患を緩和する；あるいは、不十分なプロセスを刺激する；あるいは、深刻な疾患を緩和するという意味が含まれる。
一態様では、用語“処置”とは、放射線を照射することによって癌の症状を改善するまたは癌の症状に利益をもたらす何れかの作用を含み得るが、これに限定されない。
一態様において、用語“予防”とは、本発明の医薬組成物を用いて、癌の症状を阻止するか、または癌の症状を阻害もしくは遅延させる何れかの作用を含むが、これらに限定されない。
一態様において、本発明の放射線療法を増強するための医薬組成物の投与前後に放射線を照射すると、相乗効果により放射線療法の効果が顕著に増強され得る。さらに、抗癌剤への耐性、または癌の転移もしくは再発を予防し得る。
本発明の医薬組成物および放射線照射の効果が相互作用する範囲内であれば、放射線照射の前後に時間を空けて投与してもよい。
医薬組成物の投与期間は、癌の種類、癌の進行度、投与経路、性別、年齢、体重等に応じて適宜増減できる。また、放射線照射の前後に、１日量を定期的に投与し、または大量の用量を短期間に集中的に投与してもよい。具体的には、医薬組成物は、週に１回から２０回、１回から１８回、１回から１５回、１回から１０回、１回から８回、１回から５回、または２回から３回投与できるが、これらに限定されない。
一方、医薬組成物は、放射線照射の時間に基づいて、６～４８時間前後、１０～４２時間前後、１４～３６時間前後、または１８～３０時間前後に、好ましくは２０～２８時間前後に投与され得るが、これに限定されない。
本発明の組成物の投与経路は、標的組織に到達し得る限り、経口または非経腸の種々の経路によるものであってよい。具体的には、経口、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼内または皮内経路を介して従来の方法で投与できる。
本発明の癌の放射線療法は、本発明による放射線療法を増強するための医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む。治療的有効量とは、放射線に対する癌細胞における腫瘍の感受性を効果的に増強する量を意味する。当業者には、適切な総一日量が、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定され得ることが明らかである。特定の患者に特異的な治療的有効量を、達成される応答のタイプおよび程度、要すれば他の薬剤が使用されるかどうかを含む特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、ならびに組成物の分泌速度、処置期間、および照射される放射線量、ならびに製薬分野でよく知られている同様の要因を含む様々な要因に応じて異なる方法で適用することが好ましい。したがって、上記を考慮して、本発明の目的に適した放射線療法を増強するための医薬組成物の有効量を決定することが好ましい。また、場合によっては、本発明の放射線療法を増強するための医薬組成物と共に公知の抗癌剤を投与することにより、放射線療法の効果を含めた抗癌効果を増強できる。
加えて、本発明の放射線療法は、放射線抵抗性を高めることができる何れかの動物に適用可能である。動物には、ヒト、霊長動物、ならびにウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコなどの家畜動物が含まれる。さらに、本発明の放射線療法は、放射線抵抗性が増加したすべての癌を処置するために使用できる。好ましくは、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌およびリンパ腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の放射線療法は、本発明の組成物を、癌細胞を有する対象または癌に罹患している対象に投与することを含み、ここで、放射線照射は、電離放射線、特に、一般的に用いられる線形加速器または放射性核種によって放出されるガンマ線を意味する。放射線が照射されると、生体内でイオン化現象が起こり、細胞の増殖および生存に不可欠な核酸、細胞膜などを化学的に変性させ、癌細胞に細胞死をもたらす。放射性核種による放射線照射は、体外から行う場合と体内から行う場合があり、抗癌剤の投与量、放射線照射量、放射線照射量の断続性は、腫瘍の種類および部位、ならびに化学療法または放射線療法に対する患者の応答などの一連の要因によって変化し得る。
また、本発明の放射線療法は、近接照射療法、放射性核種療法、外部ビーム放射線療法、温熱療法（凍結切除療法および温熱療法を含む）、放射線外科手術、荷電粒子放射線療法、中性子線療法、光線力学療法などを含み得る。
発明を実施するための形態
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明する目的のものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されると解釈されるべきでないことは、当業者には明らかである。
製造例１．試験物質の製造
製造例１．１．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ＧＩ－１０１
ヒトＣＤ８０フラグメント、ＦｃドメインおよびＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を製造するために、ＣＤ８０フラグメント（配列番号２）、Ｉｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）、および２つのアミノ酸置換を有するＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端側からこの順で含む、配列番号９の融合タンパク質を含む二量体を製造した。具体的な製造方法は、韓国特許出願公開第１０－２０２０－００３２００９Ａ号に記載の方法で行った。さらに、融合タンパク質二量体を“ＧＩ－１０１”と名付けた。
製造例１．２．ｍＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ｍＧＩ－１０１
マウスＣＤ８０、ＦｃドメインおよびＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を製造するために、ｍＣＤ８０フラグメント（配列番号１３）、Ｉｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）、および２つのアミノ酸置換を有するＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端側から順に含む融合タンパク質を含む二量体を製造した。融合タンパク質二量体を“ｍＧＩ－１０１”と名付けた。
製造例１．３．試験物質の製造:ｍＧＩ－１０１
凍結状態の試験物質を室温で完全に解凍し、溶媒としてＰＢＳを用いて投与量および容量に従って製造した。試験物質およびＰＢＳを混合した後、ボルテックスまたはピペッティングを行わずに、手で穏やかに撹拌した後、投与した。解凍した試験物質は、投与まで冷蔵保存した。
調製例１．マウス腫瘍モデルの作製
調製例１．１．腫瘍細胞株の調製
マウス黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞株を韓国細胞株バンクから購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。
調製例１．２．試験対象としてのマウスの検疫および馴化
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをOrient Bioから購入した。検査および検疫を、実験動物の入手時に供給者から提供された試験システムの微生物学的モニタリング報告書を参照し、実験動物の外観を観察して行った。外観に異常のない動物を飼育エリアに運び、試験を行う動物室で７日間馴化させた。７日間の隔離および順化期間中に健康状態を評価し、実験に適しているかどうかをチェックして健康なマウスを選択した。
調製例１．３．マウス対象および繁殖箱の同定
実験動物を入手する際は、マウスの尻尾に赤色の油性ペンで対象をマーキングし（テールマーキング）、検疫および順応期間中、仮の対象識別カード（試験名、対象番号、飼育時期）を飼育箱に貼り付けた。群分けの際、マウスの尻尾に黒色の油性ペンで対象をマーキングし、対象識別カード（試験名、群情報、対象番号、性別、飼育時間および投与期間）を各ケージへ貼り付けた。
調製例１．４．腫瘍細胞株の移植
検疫および順化期間の終了後、選択された健康なＣ５７ＢＬ／６マウスについて、５×１０６細胞／ｍＬの濃度にＰＢＳで希釈された、１００μｌ（５×１０５細胞）のＢ１６Ｆ１０細胞を対象ごとに両脇腹に皮下移植した。ただし、右の場合は後ろ足の脇腹に細胞を移植し、左の場合は前足の脇腹に細胞を移植した。
調製例１．５．マウス腫瘍モデルの群分け
調製例１．４のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞株移植約７日前および移植後に、上記のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍サイズを電子キャリパーを用いて測定し、１群当たり１０匹のマウスを合計５群に分けた。具体的には、腫瘍細胞株を移植した大部分の対象の腫瘍体積が約５０～１２０ ｍｍ３に達した時点で、１匹の対象の両側に移植された腫瘍を測定し、その腫瘍サイズ平均値に基づいてＺアレイ法に従って群分けを行った。
調製例１．６．実験対象としてのマウスの飼育
試験対象であるＣ５７ＢＬ／６マウスを１箱５匹ずつ、２００（幅、ｍｍ）×２６０（奥行き、ｍｍ）×１３０（高さ、ｍｍ）のポリカーボネート製飼育箱で飼育した。この時の飼育温度条件は２０℃～２５℃、湿度は５０±２０％であった。換気を１時間に１０回から１５回行い、１２時間の昼夜サイクルを維持した。この時、照度は１５０～３００Ｌｕｘであった。
飼育中は飼料と水を自由に摂取させた。このとき、水道水をろ過水流動殺菌機でろ過した後、紫外線を照射し、ポリカーボネート製飲料水ボトル（２５０ｍＬ）を用いて提供した。一方、飼育箱およびフィーダーを週１回、水筒は週２回の頻度で交換した。飼育材料は消毒液で洗浄後、ＵＶ消毒器で消毒し、再利用した。
実験例１．マウス腫瘍モデルにおける放射線照射およびｍＧＩ－１０１の併用による治療効果
実験例１．１．ｍＧＩ－１０１の腹腔内投与および放射線照射
試験物質として製造例１で調製したｍＧＩ－１０１を腹腔内注射によりマウス腫瘍モデルに投与し、投与時にマウスは８週齢であった。具体的には、実験群Ｇ２およびＧ４の場合、ｍＧＩ－１０１を群分けした日（１日目）に最初に投与し、実験群Ｇ５の場合、ｍＧＩ－１０１を４日目に最初に投与し、翌日放射線照射した。その後、実験群Ｇ２、Ｇ４およびＧ５の場合、ｍＧＩ－１０１を週１回、計２回腹腔内に追加投与した。対照群Ｇ１は、群分け当日（１日目）にＰＢＳを投与し、その後ＰＢＳを週１回、合計２回腹腔内注射により追加投与した。
放射線照射の場合、腫瘍移植部位の右側を照射できるように、注射麻酔下で右側を仰向けに寝かせた。放射線は６Ｇｙの強度で３日目に１回照射した。結果を以下の表１にまとめる。

実験例１．２．マウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積の測定および腫瘍増殖阻害の測定
ｍＧＩ－１０１の腹腔内注射および放射線照射の後、マウスの両側の側腹部に移植された腫瘍の長軸（最大長、Ｌ）および短軸（垂直幅、Ｗ）を電子キャリパーを用いて週２回測定した。これらを以下の［式１］に代入して腫瘍体積を算出した。
［式１］
腫瘍体積（ｍｍ３） ＝ ［Ｌ （ｍｍ）×Ｗ （ｍｍ）×Ｗ （ｍｍ）］×０．５
一方、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、以下の［式２］に代入して算出した。
［式２］
ＴＧＩ ＝ （１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０））×１００
Ｔｉ ＝実験群投与前の腫瘍体積
Ｔ０ ＝実験群投与後の腫瘍体積
Ｖｉ ＝対照群投与前の腫瘍体積
Ｖ０ ＝対照群投与後の腫瘍体積
各対象の投与前の腫瘍体積を群分け時の測定値とした。
実験例１．３．放射線照射およびｍＧＩ－１０１投与による腫瘍増殖阻害効果
放射線を照射した右側腫瘍の場合、Ｇ３はＧ１およびＧ２と比較して、１５日目に腫瘍増殖が有意に阻害され、Ｇ４およびＧ５は両方とも、Ｇ１およびＧ２と比較して、１１日目および１５日目に腫瘍増殖が有意に阻害された（図１ａおよび２ａから２ｅ）。
放射線を照射しなかった左側腫瘍の場合、Ｇ２はＧ１と比較して１５日目に腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｇ４は、Ｇ１およびＧ３と比較して、１５日目に腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｇ５は、Ｇ１およびＧ３と比較して、１１日目に腫瘍増殖を有意に阻害し、またＧ１、Ｇ２およびＧ３と比較して１５日目に腫瘍増殖を有意に阻害した（図１ｂおよび３ａから３ｅ）。
両腫瘍の平均では、Ｇ２はＧ１と比較して１５日目に腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｇ４およびＧ５の両方が、Ｇ１と比較して１１日目に腫瘍増殖を有意に阻害した。また、Ｇ４およびＧ５の両方が、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３と比較して１５日目に腫瘍増殖を有意に阻害した（図１ｃ）。
実験例１．４.放射線照射およびｍＧＩ－１０１投与による腫瘍増殖阻害の分析
放射線を照射した右側腫瘍の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、Ｇ１が１匹のマウスで３０％以上の阻害、１匹のマウスで５０％以上の阻害、８０％以上阻害されたマウスは０匹であった。Ｇ２は４匹のマウスで３０％以上の阻害、３匹のマウスで５０％以上の阻害、８０％以上の阻害は０匹であった。Ｇ３は５匹のマウスで３０％以上の阻害、４匹のマウスで５０％以上の阻害、２匹のマウスで８０％以上の阻害を示した。Ｇ４は７匹のマウスで３０％以上の阻害、６匹のマウスで５０％以上の阻害、２匹のマウスで８０％以上の阻害を示した。Ｇ５は１０匹のマウスで３０％以上の阻害、１０匹のマウスで５０％以上の阻害、４匹のマウスで８０％以上の阻害を示した（図４ａおよび表２）。

放射線を照射していない左側の腫瘍の腫瘍増殖阻害は、Ｇ１は、３０％以上の阻害が０匹、５０％以上の阻害が０匹、８０％以上の阻害が０匹であった。Ｇ２は５匹のマウスで３０％以上の阻害、２匹のマウスで５０％以上の阻害、２匹のマウスで８０％以上の阻害を示した。Ｇ３は０匹のマウスで３０％以上の阻害、０匹のマウスで５０％以上の阻害、０匹のマウスで８０％以上の阻害を示した。Ｇ４は６匹で３０％以上、３匹で５０％以上、０匹で８０％以上が阻害された。Ｇ５は、８匹のマウスで３０％以上の阻害、６匹のマウスで５０％以上の阻害、４匹のマウスで８０％以上の阻害を示した(図４ｂおよび表３）。

両方の腫瘍の平均腫瘍増殖阻害について、Ｇ１は１匹のマウスで３０%以上の阻害、０匹のマウスで５０%以上の阻害、および０匹のマウスで８０%以上の阻害を示した。Ｇ２は、４匹で３０％以上、２匹で５０％以上、２匹で８０％以上の阻害を示した。Ｇ３は、１匹のマウスで３０％以上の阻害、０匹のマウスで５０％以上の阻害、０匹のマウスで８０％以上の阻害を示した。Ｇ４は、３０％以上の阻害が６匹、５０％以上の阻害が４匹、８０％以上の阻害が０匹であった。Ｇ５は、１０匹のマウスで３０％以上の阻害、７匹のマウスで５０％以上の阻害、４匹のマウスで８０％以上の阻害を示した(図４ｃおよび表４）。

以上の結果より、ＧＩ－１０１および放射線の併用療法は、放射線を照射した腫瘍部位で相乗的な抗癌効果を発揮するだけでなく、放射線を照射していない遠位腫瘍部位でも相乗的な抗がん効果を発揮することが明らかとなった。
本発明のさらなる態様を、以下に記載する：
［項１］
ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む、癌の放射線療法を増強するための医薬組成物。
［項２］
ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質がリンカーを介して結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
［項３］
ＩＬ－２タンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、項１に記載の医薬組成物。
［項４］
ＩＬ－２タンパク質がＩＬ－２変異体である、項１に記載の医薬組成物。
［項５］
ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸から選択される少なくとも１つが置換された変異体である、項４に記載の医薬組成物。
［項６］
ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの置換によって得られる、項4に記載の医薬組成物。
［項７］
ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの置換の組み合わせにより得られる、項４に記載の医薬組成物：
（ａ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ
（ｂ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ
（ｃ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ
（ｄ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ。
［項８］
ＩＬ－２変異体が、配列番号６、２２、２３または２４のアミノ酸配列を有する、項４に記載の医薬組成物。
［項９］
ＣＤ８０が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、項１に記載の医薬組成物。
［項１０］
ＣＤ８０タンパク質がＣＤ８０のフラグメントである、項１に記載の医薬組成物。
［項１１］
ＣＤ８０のフラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列の３５番目から２４２番目のアミノ酸からなる、項１０に記載の医薬組成物。
［項１２］
リンカーが、アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインである、項２に記載の医薬組成物。
［項１３］
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの野生型または変異体である、項１２に記載の医薬組成物。
［項１４］
Ｆｃドメインが配列番号４のアミノ酸配列を有する、項１２に記載の医薬組成物。
［項１５］
Ｆｃドメインの変異体が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、項１３に記載の医薬組成物。
［項１６］
融合タンパク質が、以下の構造式（Ｉ）または（ＩＩ）からなる、項１に記載の医薬組成物：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
ここで、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）において、
Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
ＸはＣＤ８０タンパク質であり、
ＹはＩＬ－２タンパク質であり、
リンカー（１）および（２）はペプチドリンカーであり、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して０または１である。
［項１７］
リンカー（１）が、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、項１６に記載の医薬組成物。
［項１８］
リンカー（２）が、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、項１６に記載の医薬組成物。
［項１９］
融合タンパク質が構造式（Ｉ）からなる、項１６に記載の医薬組成物。
［項２０］
融合タンパク質が、配列番号９、２６、２８または３０のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有する、項１に記載の医薬組成物。
［項２１］
癌が、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌およびリンパ腫からなる群より選択されるいずれか１つである、項１に記載の医薬組成物。
［項２２］
癌に罹患している非ヒト哺乳動物の癌部位に放射線を照射する工程と、
項１から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を該哺乳動物に投与する工程
を含む、癌の放射線療法。
［項２３］
放射線が０．１Ｇｙ～１００Ｇｙの照射量で照射される、項２２に記載の方法。
［項２４］
医薬組成物が放射線照射の前または後に投与される、項２２に記載の方法。
［項２５］
医薬組成物が、放射線照射の時間に基づいて６～４８時間前または後に投与される、項２４に記載の方法。
［項２６］
医薬組成物が週に１回から２０回投与される、項２２に記載の方法。

Claims (24)

  1. ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を含む、癌の放射線療法を増強するための医薬組成物。
  2. ＩＬ－２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質がリンカーを介して結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. ＩＬ－２タンパク質が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. ＩＬ－２タンパク質がＩＬ－２変異体であり、前記ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、３８番目、４２番目、４５番目、６１番目および７２番目のアミノ酸から選択される少なくとも１つが置換された変異体である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１ＲおよびＬ７２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの置換によって得られる、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. ＩＬ－２変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列において、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの置換の組み合わせにより得られる、請求項４に記載の医薬組成物：
    （ａ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ
    （ｂ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ
    （ｃ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ
    （ｄ） Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ。
  7. ＩＬ－２変異体が、配列番号６、２２、２３または２４のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
  8. ＣＤ８０が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. ＣＤ８０タンパク質がＣＤ８０のフラグメントである、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. ＣＤ８０のフラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列の３５番目から２４２番目のアミノ酸からなる、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. リンカーが、アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項２に記載の医薬組成物。
  12. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの野生型または変異体であり、前記Ｆｃドメインの変異体が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. Ｆｃドメインが配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 融合タンパク質が、以下の構造式（Ｉ）または（ＩＩ）からなる、請求項１に記載の医薬組成物：
    Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
    Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
    ここで、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）において、
    Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
    Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
    ＸはＣＤ８０タンパク質であり、
    ＹはＩＬ－２タンパク質であり、
    リンカー（１）および（２）はペプチドリンカーであり、
    ｎおよびｍは、それぞれ独立して０または１である。
  15. リンカー（１）が、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. リンカー（２）が、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 融合タンパク質が構造式（Ｉ）からなる、請求項１４に記載の医薬組成物。
  18. 融合タンパク質が、配列番号９、２６、２８または３０のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  19. 癌が、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、悪性黒色腫およびリンパ腫からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
  20. 癌に罹患している非ヒト哺乳動物の癌部位に放射線を照射する工程と、
    請求項１から１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を該哺乳動物に投与する工程
    を含む、癌の放射線療法。
  21. 放射線が０．１Ｇｙ～１００Ｇｙの照射量で照射される、請求項２０に記載の方法。
  22. 医薬組成物が放射線照射の前または後に投与される、請求項２０に記載の方法。
  23. 医薬組成物が、放射線照射の時間に基づいて６～４８時間前または後に投与される、請求項２２に記載の方法。
  24. 医薬組成物が週に１回から２０回投与される、請求項２０に記載の方法。
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