JP7764366B2 - 光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置 - Google Patents

Description

本発明は，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置に関する。

ヒト皮膚の老化現象は大きく「自然老化」と「光老化」に分けられる。光老化は露光する部位特異的に認められる現象で，皮膚特異的である。光老化では，ＵＶなどの影響で活性酸素の産生や，細胞のＤＮＡの損傷などが誘発され，皮膚線維組織が損傷し，しわやたるみといった表現型が現れる原因と考えられている。例えば，皮膚光老化によりコラーゲンからなる膠原線維の減少やエラスチンからなる弾性線維の変性といった現象がみられる。また，メラノサイトもダメージを受け，メラニン色素が多く作られてしまい，しみ等を引き起こす原因となる。

また，しみやくすみをはじめとする色素沈着は，表皮の基底層にあるメラノサイトで作り出されるメラニンが蓄積することにより起こる。メラニンは通常表皮や基底層に存在するが，表皮は比較的早いサイクルでターンオーバーするため，このようなメラニンは排出されやすい。一方，メラニンが基底膜の隙間から真皮に落ちこんでしまう等の理由によりメラニンが真皮層に存在する場合がある。真皮細胞のターンオーバーのサイクルは表皮に比べて非常に遅いため，このようなメラニンは排出されずに蓄積されてしまうことが多い。このような理由により，真皮の色素沈着の改善は非常に困難である。

抗光老化美容法として，例えば，特許文献１では，白血球エラスターゼの阻害を予防することによる皮膚光老化の予防又は抑制剤を開示する。特許文献２では，コラーゲン合成促進作用を有するヒユ科パフィア属の植物抽出物と動物由来コラーゲンペプチドとを含有することを特徴とする光老化抑制剤組成物を開示する。

真皮における色素沈着を改善するための美容法として，非特許文献１３では，基底膜を強化することによりメラニンの真皮への落ちこみを防止することを提案する。

また，皮膚の光老化現象において炎症が一因となることも示唆されており，抗炎症剤も多く開発されている。特許文献３では，アディポネクチン発現増加とともにオートファジー活性化を誘導する化合物を含む抗老化用化粧料組成物を開示する。真皮の色素沈着を改善するにはマクロファージによる貪食作用を利用することも示唆されており，特許文献８では，真皮へ落ち込んだメラニンを取り込んだ線維芽細胞にマクロファージを誘引し貪食させることによる真皮シミ予防・改善剤を開示する。

特許第５６５７７２３号公報 特開２０１７－２０３００４号公報 特開２０１８－１７７８０５号公報 特表２０１４－５０４６２９号公報 特開２０１５－１４０３３４号公報 特許第６１７８０８８号公報 特許第６２７３３０４号公報 特開２０１８－０７２０９８号公報 特許第４７８１８４２号公報 国際公開第２０１２／０５７１２３号

Journal of the American College of Cardiology, Vol. 62, No. 20, 2013, November 12, 2013:1890-901 Experimental & Molecular Medicine (2014) 46, e70; doi:10.1038/emm.2013.135 NATURE, VOL495, 28 MARCH 2013, pp524-530, doi:10.1038/nature11930 Journal of Investigative Dermatology, 2009 April; 129(4):1016-25. Epub 2008 Oct 9. Stem Cell Research & Therapy (2018) 9:88，https://doi.org/10.1186/s13287-018-0821-5 Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2011 European Academy of Dermatology and Venereology，2012, 26, 1577-1580 British Journal of Dermatology, 2005, 153, pp733-739 Pigment Cell Melanoma Research, Vol. 27, Issue 3, pp502-504 Ann Dermatol Vol. 28, No. 3, pp279-289, 2016 Endocrinology, 2011. 152(10): pp3779-90 British Journal of Dermatology, 2005. 153 Suppl 2: pp37-46 Experimental Dermatology, 2011. 20(11): pp953-5 Fujifilm Research & Development (No.55-2010):pp33-37 Nat Immunol, 2014. 15(9): pp846-855 Cell Metab. 2017 Feb 7;25(2):412-427 Theranostics. 2018 Sep 9;8(17):4620-4632

本発明の課題は，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置の提供にある。

本発明者らは，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための剤を鋭意探索した結果，ハクシニン抽出物がマクロファージのＭ１／Ｍ２バランスを調節し，それによって光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する効果を発揮することを見出した。かかる発見に基づき，本発明を開発するに至った。すなわち，本発明は，以下の態様を含む。

［１］ ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤。
［２］ Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する，項目１に記載の剤。
［３］ Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することは，Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させることである，項目２に記載の剤。

［４］ 対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
（ａ）対象の皮膚に，項目１～３のいずれか一項に記載の剤を適用する工程，
を含む，美容方法。
［５］ 前記美容方法は，さらに，前記皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで前記物理刺激を適用する工程は，例えば，
（ｂ－１）前記対象の皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展することであって，ここで，伸展率は，
（式中，定点ＡおよびＢは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点ＡとＢを通る直線が伸展方向と平行である）
で算出される；及び
（ｃ－１）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
（ｂ－２）前記対象の皮膚を，１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
（ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復すること；
を含み，ここで前記（ｂ－１）及び（ｃ－１）並びに／又は前記（ｂ－２）及び（ｃ－２）のサイクルが６０Ｈｚ以下の振動数で実施される，
を含む，項目４に記載の美容方法。

［６］ 項目５に記載の美容方法に適用するための美容装置であって，
前記装置は，
物理刺激を生ずる刺激発生部と，
刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，例えば，
（ｉ－１）前記皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び
（ｉｉ－１）前記皮膚を伸展状態から回復すること；
並びに／又は，
（ｉ－２）前記皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
（ｉｉ－２）前記皮膚を押圧状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
ここで，伸展率は，上記式１により算出される，
前記美容装置。

本発明を適用することにより，それによってマクロファージのＭ１／Ｍ２バランスを調節し，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善することができる。

図１ａは，実験１で使用したマクロファージのマーカーの種類，並びに被験者の年齢，スキンタイプ，及び性別を示す。 図１ｂは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，マクロファージ（ＣＤ１１ｂ：赤）及びＭ１マクロファージ（ＣＤ８６：緑）を示す顕微鏡写真である。 図１ｃは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，マクロファージ（ＣＤ１１ｂ：赤）及びＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：緑）を示す顕微鏡写真である。 図１ｄは，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数及び全マクロファージの総数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ²）。 図１ｅ左図は，若齢者及び高齢者の皮膚組織における，Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６：赤）又はＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：赤）及びプロコラーゲン（緑）の共染色を示す顕微鏡写真である。左図の４つの各パネル内に存在する長方形は，特徴的な部位を拡大したものである。図１ｅ右図は，Ｍ１，Ｍ２，線維芽細胞，コラーゲン産生／破壊の関係を模式化した図である。 図２ａは，実験２の方法の概略を示す。 図２ｂは，実験２により誘導されたＭ０，Ｍ１及びＭ２マクロファージの顕微鏡写真である。 図２ｃの上図は，実験２により誘導されたＭ０，Ｍ１及びＭ２マクロファージが産出するサイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＩＬ－１０）の遺伝子発現量を示すグラフである。図２ｃの下図は，Ｍ１及びＭ２マクロファージの細胞表面マーカー（Ｍ１：ＣＤ８６，Ｍ２：ＣＤ２０６）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正し，Ｍ０の場合を１００％とした相対値（％）として示す。 図３ａは，実験３の方法の概略を示す。 図３ｂは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるプロコラーゲン量（μｇ／ｗｅｌｌ）を示す。 図３ｃは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるコラーゲン（赤）及びヒアルロン酸（緑）を示す顕微鏡写真である。 図３ｄは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞におけるβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）を示す顕微鏡写真である。 図３ｅは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における，老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ β－Ｇａｌ）アッセイの結果（左図：ＤＡＰＩ陽性細胞の総数に対するＳＡ β－ｇａｌ陽性細胞の割合（％）），及びウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数（右図）を示すグラフである。 図３ｆは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における，各メラノジェネシス亢進因子（ＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１ａｌｐｈａ，ＳＣＦ）並びにメラノジェネシス抑制因子（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ，ＤＫＫ１）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 図４ａは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるβ－Ｇａｌを示す顕微鏡写真である。 図４ｂは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢（上）及び老齢線維芽細胞（下）における，ＳＡ β－Ｇａｌアッセイの結果（ＤＡＰＩ陽性細胞の総数に対するＳＡ β－ｇａｌ陽性細胞の割合（％））及びウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数を示すグラフである。 図４ｃは，実験４に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるプロコラーゲン量（μｇ／ｗｅｌｌ）を示す。 図４ｄは，実験３に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した若齢及び老齢線維芽細胞におけるコラーゲン（赤）及びＤＡＰＩにより染色した核（青）を示す顕微鏡写真である。 図５は，実験５に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した新生児包皮由来線維芽細胞における，Ｉ型コラーゲン（赤）及びマクロファージ（ＣＤ６８：緑）を示す顕微鏡写真である。左上の写真はマクロファージの上清を添加せず培養した線維芽細胞を示す。 図６は，実験６に従い作成した３Ｄモデルにおけるマクロファージ（ＣＤ６８：赤）およびＭ１マクロファージ（ＣＤ８６：緑）又はＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６：緑）を示す顕微鏡写真である。三角で示す部分は，ＣＤ６８およびＣＤ８６，又はＣＤ６８およびＣＤ２０６が二重染色されている部分を示す。 図７は，実験６に従い作成した３Ｄモデルにおけるｐ２１（赤）及びＤＡＰＩにより染色した核（青）を示す顕微鏡写真である。 図８は，実験６に従い作成した３Ｄモデルの各層（左：上層＝表皮細胞層，右：下層＝線維芽細胞層）における全細胞数に対するｐ２１陽性細胞数の割合（％）を示すグラフである。 図９は，実験７に従いソーラーシュミレーターを照射したｅｘ ｖｉｖｏ皮膚モデルにおけるマクロファージ全体，Ｍ１及びＭ２マクロファージの数を示すグラフである。照射を行わない場合の各マクロファージの細胞数を１００％とし（左側のバー：照射（－）），それに対する照射を行った各マクロファージの細胞数の相対値（％）を右側のバー（照射（＋））に示す。 図１０は，実験８で行った伸展刺激の設定を示す。 図１１は，実験８で使用した装置および皮膚試料を示す。 図１２は，実験８に従いｅｘ ｖｉｖｏ皮膚モデルに伸展刺激を与えた場合（ｓｔｒｅｔｃｈ）と与えない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数及び全マクロファージの総数の比較を示す。左図は，皮膚試料１ｍｍ²あたりのマクロファージ数（ｃｅｌｌｓ／１ｍｍ²）を示すグラフである。右図は，全マクロファージの総数に対する各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の割合（％）を示すグラフである。 図１３は，本発明の装置の一例を示す。 図１４ａは，実験９に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における各コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ－１，ＭＭＰ－２）および炎症性サイトカイン(ＩＬ－１β）のｍＲＮＡ発現量を，Ｍ１での結果を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１４ｂは，実験９に従いＭ１及びＭ２マクロファージの上清を添加した線維芽細胞における各コラーゲン産生・成熟化因子（ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＨＳＰ４７，およびＡＤＡＭＴＳ－２）のｍＲＮＡ発現量を，Ｍ１での結果を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１５ａは，実験１０におけるサンプルを取得した各被験者の年齢を若齢者及び高齢者群ごとに示す。 図１５ｂは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織（基底膜直下から５０μｍ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ²）。 図１５ｃは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織（基底膜直下から２００μｍ）における，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ²）。 図１５ｄは，実験１０における若齢者及び高齢者の皮膚組織における３／４コラーゲン陽性を示すＣＤ６８陰性細胞，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ数を示すグラフである（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ²）。 図１６ａは，実験１１において，メラニン添加から２４時間後の線維芽細胞，Ｍ１マクロファージ，およびＭ２マクロファージの様子を示す。メラニンを貪食している細胞は右図で示すような円状の形態をとる。 図１６ｂは，実験１１において，メラニン添加から２４時間後の線維芽細胞，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージが取り込んだ細胞あたりのメラニン量（ｍｅｌａｎｉｎ／ａｌｍａｒ ｂｌｕｅ）を示す。 図１６ｃは，実験１１において，メラニン添加から５日後のＭ１マクロファージとＭ２マクロファージの様子を示す。 図１７上は，実験１２に従いカウントした真皮層におけるメラニン貪食Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージの数を各年齢ごとに示すグラフである。図１７下は，メラニン貪食Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージの数を全被験者における平均として示す。 図１８は，実験１３で行ったスクリーニングの結果を示す。バーはそれぞれ各濃度のハクシニン抽出物（０．３ｐｐｍ，１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍ）を添加した場合のＭ１とＭ２の各マーカーの発現量（マーカー／ＧＡＰＤＨ値）を，対照（ハクシニン加水分解無：ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたとき相対値（％）で示すグラフである。 図１９ａは，実験１４において，加水分解をしていないハクシニン（ｃｏｎｔｒｏｌ）３ｐｐｍ又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍ添加した未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞にメラニン添加をしてから３０分後の様子を示す。 図１９ｂは，図１９ａの拡大図である。黒矢印はメラニンを取り込んでいるマクロファージを示す。 図２０は，実験１５において、Ｍ０マクロファージ，Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの細胞内活性について、フラックスアナライザーを用いて解析した、（Ａ）酸素消費速度（ＯＣＲ）、（Ｂ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）及び、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲの結果を示す。 図２１は，実験１６において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）Ｂａｓａｌ ＯＣＲ(A計測3点目のOCRの値)。 図２２は，実験１６において、ハクシニン抽出物を添加した場合のＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）正規化したＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ(A計測3点目と12点目の差の値)。 図２３は，実験１７において、ハクシニン抽出物に含まれる代表的な不飽和脂肪酸単独によるＭ０マクロファージの添加４８時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図２４は，実験１８において、ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ０マクロファージの添加２４時間後の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ。 図２５は，実験１９の方法の概略を示す。 図２６は，実験１９において、ハクシニン抽出物、又はハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１マクロファージ分化時の細胞内活性への影響をフラックスアナライザーを用いて解析した結果を示す。（Ａ）Ｂａｓａｌ ＯＣＲ、（Ｂ）ミトコンドリア呼吸のＯＣＲ、（Ｃ）ＯＣＲ／ＥＣＡＲ。 図２７は，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清に含まれるＳＤＦ－１αの発現量を示す。（Ａ）実験２０の実験の概要、（Ｂ）Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージの培養上清におけるＳＤＦ－１αの量。 図２８は，実験２１において、Ｍ１又はＭ２マクロファージ上清を添加して培養した皮膚線維芽細胞のＳＤＦ－１αの発現への影響を示す。（Ａ）実験２１の実験の概要、（Ｂ）Ｍ１マクロファージ又はＭ２マクロファージの培養上清を加えて培養した添加3日後における線維芽細胞のＳＤＦ－１αの量。

マクロファージは，体内の様々な組織に局在し，異物や病原体に対する免疫応答を惹起する細胞であり，炎症にも関与することが知られている。マクロファージは，未分化状態のＭ０マクロファージ（以下Ｍ０とする略記することがある）からＭ１タイプとＭ２タイプに分化する。Ｍ１マクロファージ（以下Ｍ１と略記することがある）は炎症型として，Ｍ２マクロファージ（以下Ｍ２とする略記することがある）はリペア型（抗炎症型）として知られている。Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランスの不均衡は，肥満，２型糖尿病，動脈硬化といった疾患と関連することが報告されている（特許文献４～６，非特許文献１～５）。しかしながら，皮膚光老化や色素沈着とＭ１／Ｍ２バランスとの関係については不明であった。

本発明者らは，光のあたった皮膚や色素沈着が起こる部位では特異的にこれらＭ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランス（Ｍ１／Ｍ２バランス）が乱れることを発見し，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することが，真皮における光老化や色素沈着の予防・改善においてとりわけ重要であることを発見した。そこで，本発明者らは，Ｍ１／Ｍ２バランスを指標とし，光老化及び／又は真皮色素沈着の予防・改善し得る物質を探索したところ，ハクシニンがＭ１／Ｍ２バランスを調整することを見出し，これによって皮膚，特に真皮における光老化及び／又色素沈着を予防・改善し得る本発明を開発するに至った。ハクシニンには，線維芽細胞に作用して線維芽細胞を増殖させたり，コラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させる効果や，メラニン生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献９及び１０）。しかしながら，ハクシニンが，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整／改善作用を有することは，本発明者らによって今回初めて見出された。

また，本発明者らは，特定の物理刺激を対象の皮膚に与えることによってもＭ１／Ｍ２バランスを調整し得ることも見出した。より具体的には，光老化した皮膚や色素沈着が起こっている皮膚であっても，特定の伸展率で，例えば１Ｈｚ以下，１０Ｈｚ以下といった６０Ｈｚ以下の振動数で行う微弱な物理刺激を与えると，Ｍ１／Ｍ２バランスが調整／改善されることがわかった。

よって，本発明は，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整することにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤，それを用いた美容方法，及びその方法に適用するための美容装置を提供する。本発明の方法は，美容を目的とする方法であり，医師や医療従事者による治療ではない場合がある。

本明細書において，色素沈着は，真皮および表皮における色素の沈着を指し，例えば，光老化によるメラニン等の色素沈着の他，人為的に注入された色素（例えば，入れ墨やタトゥー）も含まれる。本発明は，真皮および表皮のいずれにも有効であるが，とりわけ，メラノファージによる貪食以外に改善方法が限られているという意味で真皮の色素沈着に対する対策として大きく期待される。本発明の適用により，色素沈着によるしみ，くすみ，くま等が改善され。また，真皮層に色素を注入するため一旦色素を入れてしまうと消すのが困難である入れ墨やタトゥーなどの色消しにも有効である。

Ｍ１マクロファージは，ＣＤ８６，ＣＤ８０，ｉＮＯＳ等のマーカーで測定できる。Ｍ２マクロファージは，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，Ａｇｒ１，等のマーカーで測定できる。Ｍ１とＭ２を含むマクロファージ全体のマーカーとしては，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ６８などが挙げられる。追加的又は代替的に，ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａといったＭ１特異的なサイトカインやＩＬ－１０といったＭ２特異的なサイトカインを定量することによって測定してもよい。しかしながら，Ｍ１／Ｍ２バランスを測定可能なマーカーであれば，上記マーカーに限定されない。

本明細書において，Ｍ１／Ｍ２バランスとは，Ｍ１マクロファージの数とＭ２マクロファージの数の比率を指すものであってもよく，Ｍ１マクロファージのマーカー（例えば，ＣＤ８６，ＣＤ８０，ｉＮＯＳ等）のｍＲＮＡ量とＭ２マクロファージのマーカー（例えば，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，Ａｇｒ１等）のｍＲＮＡ量の比率を指すものであってもよい。光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり，またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数，及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を上昇させることであってもよい。上昇は，例えば，有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇であってもよく，及び／又は，例えば１％以上，５％以上，１０％以上，２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，１００％以上の上昇であってもよい。あるいは，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数，及び／又はＭ２マーカーのｍＲＮＡ量／Ｍ１マーカーのｍＲＮＡ量）を一定の範囲内，例えば，約４／６～約９／１，約５／５～約８／２，約５／５～約７／３等にすることであってもよく，上記範囲に近づけることであってもよく，上記範囲内に維持することであってもよく，上記範囲を中心に恒常性を保つことであってもよい。

本明細書において，Ｍ１／Ｍ２バランスとは，Ｍ１マクロファージの細胞内活性とＭ２マクロファージの細胞内活性のバランスを指すものであってもよく，例えば、Ｍ１マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、解凍系の状態）の指標及び／又は、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内活性（例えば、好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）の状態）の指標を用いて表されるものであってもよい。細胞内活性は、例えば、細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ値）、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）、又はＯＣＲ／ＥＣＡＲ値を測定することによって評価することができる。本明細書において、「Ｍ１に対するＭ２の比率を上昇させる」とは、Ｍ２マクロファージが主に使う細胞内ミトコンドリア活性が上昇することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が上昇する（例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において好気呼吸（ミトコンドリア呼吸）が優位になる）、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団において嫌気呼吸である解糖系の活性が低下することを指すものであってもよく、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ値が上昇する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＥＣＡＲ値が低下する、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団においてＯＣＲ／ＥＣＡＲ値が上昇することを意味するものであってもよい。細胞内活性は、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）を用いることによって細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖系、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を行うことができるが、当該装置は例示であり、細胞内活性の測定には任意の装置、方法を用いて評価することができるため、当該装置の利用に限定されない。

光老化状態の皮膚ではＭ１の比率が高くＭ２の比率が低くなり，またメラニン貪食作用が高いのはＭ２であることから，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，Ｍ１に対するＭ２の細胞内活性の比率、例えば、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＯＣＲ値を上昇させる、及び／又は、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージを含む集団におけるＥＣＡＲ値を低下させることであってもよい。本明細書において、「上昇又は低下」とは，例えば，有意水準を５％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）を有する上昇又は低下であってもよく，及び／又は，例えば１％以上，５％以上，１０％以上，２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，１００％以上の上昇又は低下であってもよい。

ハクシニン（柏子仁，ハクシジン）は，ヒノキ科（Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ）のコノテガシワ（Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｆｒａｎｃｏ， Ｔｈｕｊａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｌ．， Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｅｎｄｌ．）の種子を乾燥させた生薬である。本発明に用いられるハクシニンとしては，種仁（胚乳部分）を使用することが好ましいが，種子全体にも有効成分が含まれているので，種子全体を使用することもできる。ハクシニンは，常法により製造してもよく市販品を用いることもできる。

本発明に用いられ得るハクシニン抽出物を調製する方法は，公知の方法（例えば，特許文献９及び１０）を参考に製造することができるが，これらに限定される訳ではない。例えば，本発明に用いられ得るハクシニン抽出物の調製方法としては，植物の種子を抽出して得られた植物抽出物にアルカリ処理を施す方法（以下，第１の方法と称する。），および植物の種子を粉砕し，温度１０～３５℃，相対湿度 ２０～９０％で１週間以上熟成した後に抽出する方法（以下，第２の方法と称する。）がある。

上記第１の方法および第２の方法に用いられる抽出溶媒は，通常抽出に用いられる揮発性溶媒であれば何でもよく，特にメタノール，エタノール等のアルコール類，含水アルコール類，アセトン，酢酸エチルエステル，ヘキサン，エーテル等の極性・非極性有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができるが，アセトン，酢酸エチル，ヘキサンは低価格であり，減圧濃縮が容易な点で特に好ましい。その他，超臨界炭酸ガスによる抽出を用いることもできる。これに対し，水を多量に含む抽出溶媒は，活性成分の抽出が抑制されるので好ましくない。

抽出にあたっては，種子の質量に対し，１～１００倍，好ましくは１～３０倍程度の質量の溶媒で一定期間抽出を行う。用いる種子は必要に応じて適度に粉砕することも可能であるが，ろ過時に目詰まりが問題となる場合等では未粉砕のまま用いても良い。また，少量の溶媒で繰り返し抽出することも可能であり，ソックスレーのような還流装置を用いても良い。超臨界炭酸ガスで抽出する場合は４０℃付近で２０～４０ＭＰａの一般的な条件にて抽出できる。

第１の方法においては，これらの抽出物から抽出溶媒を除去した後，アルカリ処理することにより，抽出物を加水分解する。アルカリ処理は溶媒除去後の抽出物に対し，０．２～２倍容量の濃アルカリ水溶液を添加した後，充分撹拌混合し，３０分～数日程度熟成をおこなう。混合の際の温度としては，室温～７０℃の範囲が好ましく，３０～６０℃の範囲がさらに好ましい。熟成時には成分親水性成分と親油性成分が分離しないように，適宜撹拌を行うことが望ましい。濃アルカリ水溶液としては，１～１０Ｎの濃度のＮａＯＨ，ＫＯＨなどからなる水溶液が挙げられる。

上述のようにアルカリ処理して加水分解した抽出物をさらに酸で中性付近まで中和すると油状物質が分離してくる。この油状物質はきわめて高い抗真皮色素沈着作用を奏しながらも，肌に対して高い安全性を示す。油状物質回収促進のために，アルコール，アセトン類などをアルカリ処理後に適宜加えても良く，さらにその後必要に応じて脱色，脱臭，脱塩，蒸留などの操作を加えても良い。

ハクシニン抽出物を調製する第２の方法によれば，抽出の前段階で種子を適度に粉砕あるいは圧ぺんし，そのまま室温付近で一定期間熟成する。熟成期間については，目的とする効果が得られる範囲であれば特に問わないが，熟成期間が一週間以内と短いと十分な美白効果を得ることが難しく，反対に数年にも及ぶと腐敗や酸化変臭の問題が起こり，好ましくない。また熟成中には必要に応じて，酸化防止剤添加や窒素置換等を行うことにより，変臭を抑制することも可能である。

このように熟成した種子より，前述した抽出溶媒・抽出法を用いて抽出を行う。抽出後は必要に応じて，溶媒除去・脱色・脱臭・蒸留等の操作を行う。このような特定の種子を粉砕して熟成した後に抽出することにより得られた抽出物は，前述のアルカリ処理した抽出物と同様に抗真皮色素沈着作用を奏しながらも，肌に対して高い安全性を示す。

本発明においては，上に示したような植物の種子より第１の方法または第２の方法で調製した抽出物よりなる安全で抗真皮色素沈着効果の優れた植物性の，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を提供することができ，さらには本剤を配合した皮膚外用剤を提供できる。

本発明の剤は，任意の物質，例えば，特許文献４～７等に記載の物質といったＭ１／Ｍ２バランス調整／改善することが知られている公知の物質と組合せて使用してもよい。その投与経路も例えば，経皮投与，経口投与，皮下投与，経粘膜投与，筋肉内投与等任意に選択できるが，真皮の色素沈着を予防及び／又は改善するために皮膚の特定箇所に投与できる経皮投与が好ましい場合もある。また，表皮や真皮に起こる色素沈着は，皮膚から表皮や真皮に到達できるよう経皮投与が好ましい場合もある。また，Ｍ１／Ｍ２バランスの調整／改善は，例えば，Ｍ２マクロファージに分化誘導することであってもよく，その他任意のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善法によるものであってもよい。

例えば，本発明に用いられ得る剤又は組成物は，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整／改善し，その結果，光老化及び／又は真皮色素沈着を抑制する。本発明のＭ１／Ｍ２バランス調整／改善剤，抗光老化剤，色素沈着抑制剤，抗真皮色素沈着剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。）は，上記の有効成分の何れか１種を単独で含有してもよく，２種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。

本発明の剤は，上記の有効成分を，１種又は２種以上の他の成分，例えば賦形剤，担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり，有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は，その剤形に応じ，賦形剤，担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で，常法を用いて製造することができる。

本発明の剤は，化粧品等に配合してヒト及び動物に使用し，或いは医薬製剤としてヒト及び動物に投与することができる。また，各種の飲食品，飼料に配合してヒト及び動物に摂取させてもよい。

本発明を化粧品，医薬品，医薬部外品等の皮膚外用剤に適用する場合，植物体又はその抽出物の配合量（乾燥質量）は，それらの種類，目的，形態，利用方法などに応じて，適宜決めることができる。例えば，化粧料全量中に，ハクシニンを０．００００１％～５０％（抽出物又は生薬の場合，乾燥質量換算）配合できる。

上記成分に加えて，さらに必要により，本発明の効果を損なわない範囲内で，通常化粧品，医薬品，医薬部外品等の皮膚外用剤に用いられる成分，例えば酸化防止剤，油分，紫外線防御剤，界面活性剤，増粘剤，アルコール類，粉末成分，色材，水性成分，水，各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

本発明の皮膚外用剤は，外皮に適用される化粧料，医薬部外品等，特に好適には化粧料として適用可能であり，その剤型も皮膚に適用できるものであれば限定されず，溶液系，可溶化系，乳化系，粉末分散系，水－油二層系，水－油－粉末三層系，軟膏，化粧水，ゲル，エアゾール等，任意の剤型が適用される。

本発明の剤を化粧品として用いる場合は，化粧水，乳液，ファンデーション，口紅，リップクリーム，クレンジングクリーム，マッサージクリーム，パック，ハンドクリーム，ハンドパウダー，ボディシャンプー，ボディローション，ボディクリーム，浴用化粧品等の形態として用いてもよい。

しかしながら，本発明の剤および組成物の採り得る形態は，上述の剤型や形態に限定されるものではない。また，本発明の剤又は組成物は，本発明の装置又は方法あるいはその他の装置又は方法等と併用してもよい。

本発明の方法，装置，剤及び組成物を適用する対象は，皮膚光老化及び／又は色素沈着（例えば，真皮色素沈着）が客観的又は主観的に認められる対象であっても，色素沈着を予防したいと希望する対象であってもよい。例えば，Ｍ１／Ｍ２バランスが崩れていると判断された対象であってもよい。１実施形態では，皮膚におけるＭ１／Ｍ２バランスを指標として色素沈着度（例えば，真皮色素沈着度）が高いと判断された対象であってもよい。あるいは，皮膚の光老化に特異的な表現型，例えば，しみ，しわ，たるみ等が気になる対象であってもよいし，表皮や色素沈着，例えば，しみ，くすみ，アザ，入れ墨の跡等が気になる対象であってもよい。しみ，しわ，たるみ，くすみ，アザ，入れ墨の跡等は，視感判定や公知の指標を用いることにより決定することができる。

一実施態様において，本発明は，対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
（ａ）対象の皮膚に，ハクシニン抽出物を有効成分として含む，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤を適用する工程，を含む，美容方法を提供する。

一実施態様における本発明の美容方法は，上記工程（ａ）に加え，さらに，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程，例えば，伸展刺激，押下刺激，又はマッサージ等の微弱な物理刺激を皮膚に与えることによって達成されてもよい。例えば，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程は，（ｂ－１）皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び（ｃ－１）伸展状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。

伸展率は，上記式１により算出される。物理刺激は，０．００１％以上８０．０以下，０．０１％以上６０．０％以下，０．１％以上５０．０％以下，好ましくは，０．１％以上５０．０％以下の伸展率で行ってもよい。例えば，０．１％以上１．０％以下，０．１％以上５．０％以下，０．１％以上１０．０％以下，０．１％以上２０．０％以下，０．１％以上３０．０％以下，１．０％以上５．０％以下，１．０％以上１０．０％以下，１．０％以上２０．０％以下，１．０％以上３０．０％以下，１．０％以上５０．０％以下，１０．０％以上２０．０％以下，１０．０％以上３０．０％以下，等任意の範囲の伸展率が採用できる。

伸展速度は，１サイクル中で最大伸展率（％）に達するまでの速度（％／ｓ）を指す。回復速度は，最大伸展率から非伸展状態に戻る速度（％／ｓ）を指す。伸展速度・回復速度は，０．０１０％／ｓ～４０％／ｓ，０．０５％／ｓ～３０％／ｓ，０．１０％／ｓ～２０％／ｓ，０．２％／ｓ～１５％／ｓ，０．３％／ｓ～１０％／ｓなど任意の速度で行ってもよい。伸展速度と回復速度は同じでも異なっていてもよい。

例えば，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程は，（ｂ－２）前記対象の皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び（ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復させること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであってもよい。

「皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧する」とは，皮膚の最表面から１μｍ～１０００μｍの深度まで皮膚を押圧することを指す。押圧の深度は，皮膚の最表面から１μｍ～１０００μｍ，１０μｍ～１０００μｍ，１０μｍ～３００μｍ，１０μｍ～１００μｍ等任意に設定可能である。

振動数は，伸展又は押圧開始から非伸展又は非押圧状態まで回復するサイクルを１サイクルとした場合の１秒あたりのサイクル数を指す。１サイクルには，一定の時間，伸展又は押圧状態を維持すること及び／又は非伸展又は非押圧状態で休止することを含めてもよい。例えば，１サイクル中に，（ｂ－１）の後かつ（ｃ－１）の前に，あるいは（ｂ－２）の後かつ（ｃ－２）の前に，０秒～３０分間，１秒～２０分間，５秒～１０分間，又は１０秒～５分間伸展又は押圧状態を保持すること；及び／又は（ｃ－１）の後かつ次のサイクルの（ｂ－１）の前に，あるいは（ｂ－２）の後かつ（ｃ－２）の前に，０秒～３０秒間，０秒～２０秒間，０秒～１０秒間，１秒～１０秒間，１秒～２０秒間，１秒～１０秒間非伸展又は非押圧状態で休止すること，を更に含んでもよい。振動数は，例えば，０．００００００１Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下，０．０００００１Ｈｚ以上１ｋＨｚ以下，０．００００１Ｈｚ以上１００Ｈｚ以下，好ましくは，０．０００１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．０００１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下であってもよい。例えば，０．００１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上５０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上５Ｈｚ以下，０．５Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上０．０１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上０．１Ｈｚ以下，０．００１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．０１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，０．１Ｈｚ以上１Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上６０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上１０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以上５Ｈｚ以下，等任意の範囲の振動数が採用できる。

市販の美顔器，マッサージ機器等には，ＲＦ波といった０．３～３００ＭＨｚ程度の周波数を有する電磁波を用いるものや，１ＭＨｚから７ＭＨｚ程度の周波数を有する超音波を用いるものなどがある。これらの周波数／振動数と比べ，本発明の方法／装置が採用する振動数は極めて低い。従来の美顔器等のように皮膚に強い振動数を与えると皮膚に赤み，圧力痕，傷，痛み，炎症といった悪影響を与えるリスクがあるが，本発明のような振動数を採用すると上述のリスクが低く非侵襲的な物理刺激が可能になる。本発明者らにより，伸展率および振動数が高すぎると刺激が強すぎるため，これらの値を適正値に調節することにより皮膚を優しく刺激するほうが好ましいことが発見されたためである。

また，従来，当該分野において一般的に利用されているモーター等の機構を利用する美容機器類ではそのモーターの機械的機構から６０Ｈｚを超える振動数しか選択できないことが当業者の技術常識であった。従来技術における美容機器類の限界である「６０Ｈｚ」以下の振動数，例えば，６０Ｈｚ以下，１０Ｈｚ以下，１Ｈｚ以下といった本発明のような振動数を採用するには，特別な機械を作成する必要性が求められていた。更には，このような低い振動数では，本発明の効果を奏するには「弱すぎる」という固定概念もあり，これまで検討がほとんどされていなかった。しかしながら，本発明者らは，従来の技術常識から考えると非常に低い振動数を用いて実際に皮膚に物理刺激を与えてみたところ，驚くべきことに，このような低い振動数の優しい刺激でも良好な効果が奏された。

ＥＭＳ機器等では低中周波の装置も市販されているものの，これらは特に筋肉や皮下脂肪等の深い層で作用させるように設計されており，本願発明のような皮膚表層に対する影響は不明である。また，このような装置は周波数が低くても電流を流す際にビリビリとした刺激を伴うこともあり，皮膚に優しい刺激を与える本願発明とは異なる。一方，本発明は，超音波や電流，磁場といったエネルギーを加えず，直接皮膚に伸展刺激を与えるという簡便な方法による美容法が可能である。更に，このような振動数を有する伸展刺激は，優しい刺激でありながら，実施例に記載のようにＭ１／Ｍ２バランスの調整／改善作用を奏する。よって，本発明の方法／装置を使用すると，皮膚に悪影響を与えず，光老化及び／又は真皮色素沈着の予防及び／又は改善効果が期待される。

物理刺激は，美顔器などの器具，実験的な装置，ヒトの手や器具を用いたマッサージ，顔面のエクササイズによるものであってもよく，接触又は非接触により達成されるものであってもよい。一態様では，物理刺激を生ずる刺激発生部と，物理刺激を接触又は非接触により付与する刺激付与部を備えた機器を用いて，皮膚に対して機械的に発生された物理刺激を付与することができる。物理刺激は，例えば，皮膚を引張，押圧，叩く，揉む，吸引するといった接触によって達成されてもよく，及び／又は，例えば，超音波や空気圧または水圧のようなもので皮膚に衝撃波をあたえることで変位させるといった非接触により達成されてもよい。顔面のエクササイズとしては，頬を膨らませることや，目を見開くことなどが行うことができる。マッサージとしては，施術を受ける対象自身又は美容部員などの施術者による手やローラー等の器具を用いたマッサージが挙げられる。しかしながら，本発明の物理刺激の範囲内であれば限定されない。

本発明に用いられ得る装置として，例えば，使用者の皮膚に接触し本発明の微弱な物理刺激を付与する皮膚接触部を備える美容装置が挙げられる。例えば，把持部及び皮膚伸展部又は皮膚押圧部から構成されるものであってもよい。例えば，図１３左に記載の装置は，皮膚接触部が皮膚に触れることにより，皮膚を特定の振動数および伸展率にて伸展するように設計されている。

また，例えば，本発明の装置は，電源と，刺激発生部と，皮膚刺激部を備え，電源は電気信号を発生し，刺激発生部は，電源からの電気信号を物理的な刺激に変換して物理刺激を発生し，皮膚刺激部は，刺激発生部で発生された物理刺激を受け取り使用者の皮膚に物理刺激を与えるものであってもよい。

例えば，図１３左に示す装置は，把持部と，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，皮膚刺激部と皮膚固定部を含む皮膚接触部とを備える。使用者が把持部を持って皮膚接触部を皮膚に当て，皮膚固定部により皮膚を固定するようにし，制御部を操作することにより電源からの電気的な信号が刺激発生部により物理的な刺激に変換され，物理刺激が皮膚刺激部に伝わり，皮膚が皮膚固定部に固定されつつ皮膚刺激部により特定の振動数および伸展率にて伸展されるように設計されている。例えば，刺激発生部はモーターなどにより駆動され電気信号を物理刺激に変換するものであってもよい。また，図１３左に記載の皮膚刺激部は，皮膚に伸展刺激を与えるものであるが，例えば，皮膚に押圧刺激を与えるものであってもよい。

あるいは，本発明の装置は，電源と，物理的な刺激を制御する制御部と，刺激発生部と，シート状の材料からなる皮膚接触面を含む皮膚接触部とを備える美容装置であってもよい。例として，図１３右にこのような美容装置の皮膚接触部を示す。シート状の材料は，電流を流すことが可能で，電源からの電気的な信号を物理的な刺激に変換するものであってもよい。そのようなシート状の材料としては，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ａｃｔｕａｔｏｒ（ＤＥＡ），導電ポリマー，ＩＰＭＣ，ＰＶＣゲル，Ｍｃｋｉｎｎｅｎ型などが挙げられる。

本発明の装置の電源は，内部電源又は外部電源であってもよく，充電式であってもよい。また，本発明の装置は，例えば，携帯電話やクラウドなどに保存されているデータを用いるものであっても，ワイヤレスでリモート操作されるものであってもよい。

物理刺激は，上術のような接触又は非接触による物理的な刺激を与えることにより皮膚の伸展を達成するものであってもよい。物理刺激は，皮膚表面に対し平行方向，すなわち横方向に加えてもよいし，皮膚表面に対し垂直方向，すなわち縦方向に加えてもよいし，あるいは斜め方向，ねじれ方向等任意の方向が採用できる。

物理刺激を行うサイクル数は限定されない。例えば，１０～５００サイクル，２０～４００サイクル，３０～３００サイクル，４０～２００サイクル，５０～１００サイクルといった任意の数のサイクル行なってもよい。例えば，実施例に記載のように，２７サイクル行えば十分な場合もある。

さらに，これらの任意の数のサイクルを１セットとし，このセットを任意の数のセット，例えば，１～１００セット，２～５０セット，又は３～１０セット行ってもよい。

物理刺激を行う時間も限定されない。例えば，休止時間を設けて又は設けずにサイクルを繰り返し５分～３時間，１０分～２時間，３０分～１時間といった一定時間行ってもよい。

サイクル間又はセット間の時間間隔も限定されない。例えば，伸展又は押圧刺激は，１セット又は複数セットを単独で行うものであってもよく，１又は複数のセットを毎日，２日，３日，４日，５日，６日，７日に１回，１，２，３，４週間に１回等，連続的又は断続的に定期的又は不定期的に行うものであってもよい。

しかしながら，皮膚抗光老化及び／又は色素沈着抑制作用を発揮するのに十分な刺激が達成されれば上記のような振動数，伸展率，サイクル数，頻度に限定されない。物理刺激を行う波形も，矩形波，正弦波，三角波，のこぎり波等任意に設定できる。

美容処置としては，特に限定されないが，例えば本発明の剤又はその他の成分を含む化粧料の塗布などの光老化及び／又は色素沈着抑制に有効と考えられている任意の処置が含まれる。化粧料とは，皮膚に適用される化粧料をいい，例えば化粧水，乳液，美容液，クリーム，ファンデーションなどをいうが，これらに限定されず，皮膚状態の改善を直接の目的とするものではないが，皮膚に塗布されるもの全てを含むことを意図し，例えば，日焼け止め剤なども包含するものとする。あるいは，美容処置は，例えば，伸展刺激，押下刺激，マッサージ等の物理刺激を皮膚に与えることであってもよい。美容処置は，一回の処置であってもよいし，数日から数週間にわたって行われる継続的な処置であってもよい。美容処置は個人的に行われてもよいし，美容室や，化粧品の販売店，エステサロンなどで行われてもよい。

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお，本発明はこれにより限定されるものではない。

実験１：組織染色
図１ａに示す年齢の若齢者（２０代～３０代）及び光老化が起こっている高齢者（６０代～７０代）の白人由来の目尻の皮膚を凍結切片にし，薄切後，以下に示すマクロファージのマーカーで染色した。
（１）Ｍ１マクロファージの染色：ヤギ由来の抗ヒトＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った（図１ｂ）。
（２）Ｍ２マクロファージの染色：マウス由来の抗ヒトＣＤ２０６抗体（ＢＤ）又はマウス由来抗ヒトＣＤ１６３抗体（Ｌｅｉｃａ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った（図１ｃ）。
（３）総マクロファージの染色：マウス由来の抗ヒトＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ）とウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）で二重染色を行った。

表皮直下２００μｍまでの（１）～（３）の抗体二重に陽性の細胞を各マクロファージとして計数した（図１ｄ）。また，Ｍ１，Ｍ２マクロファージとコラーゲン産生との関わりを検討する目的で，ヤギ由来の抗ヒトＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ）とラット由来の抗プロコラーゲン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），又はマウス由来抗ヒトＣＤ２０６抗体（ＢＤ）とラット由来の抗プロコラーゲン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で二重染色した（図１ｅ左）。

（１）～（３）の組織染色を図１ｂ，ｃに，計数結果のグラフを図１ｄに，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ抗体と抗プロコラーゲン抗体で二重染色した結果を図１ｅ左に示す。図１ｂ，ｃ，ｄに示すように，光老化が起こっている高齢者では，Ｍ１マクロファージが多く見られる一方，Ｍ２マクロファージは減少していた。より具体的には，図１ｂに示すように，若齢者では血管周辺のみにＭ１マクロファージが存在する一方，高齢者では組織全体的に散在していた。また，図１ｃに示すように，若齢者ではＭ２マクロファージが組織全体に存在する一方，高齢者ではその数が減少していた。更に，図１ｄに示すように，若齢者と高齢者間で，マクロファージの総数（Ｍ１の数＋Ｍ２の数）は変化せず，Ｍ１／Ｍ２バランスのみが変化していた。若齢者では，Ｍ１に対するＭ２の比率（Ｍ２の数／Ｍ１の数）が約５／５～約７／３の範囲内にある一方，高齢者ではＭ１に対するＭ２の比率が激しく減少しＭ１／Ｍ２バランスが大きく崩れ，若齢者のものとは著しく異なっていた。

更には，図１ｅ左上の２枚の写真のように，若齢者・高齢者にかかわらず，Ｍ１マクロファージとプロコラーゲンとの位置はずれている一方，左下の２枚の写真のようにＭ２マクロファージとプロコラーゲンでは位置の一致が見られた。このことから，図１ｅ右図の模式図で示すような，Ｍ１がコラーゲンの破壊を促進し，Ｍ２がコラーゲン生成を促進するように線維芽細胞に作用している可能性が示唆される。

実験２：ＴＨＰ－１のＭ１，Ｍ２分化刺激実験
非特許文献１に記載の方法に従い，ヒト由来の株化細胞であるＴＨＰ－１を用いて，Ｍ１，Ｍ２マクロファージへ分化誘導した。具体的には，図２ａに示す方法で，ＴＨＰ－１をＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）に１ｍＭ Ｎａ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｎａｋａｌａｉ），２ｍＭ Ｌ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ），１０％ ＦＢＳを添加して培養した。その後，１００ｎＭ ＰＭＡ（ａｂｃａｍ）をさらに加えて２４時間刺激しマクロファージに分化させた。Ｍ１に分化させる際はさらに１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（ｓｉｇｍａ）と２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激し，Ｍ２に分化させる際はさらに２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ）と２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ）を加えて２４時間刺激した。顕微鏡で観察し，図２ｂに示すように形態が変化したことを確認した。

また，それぞれの分化後又は未分化の状態のままの細胞のｍＲＮＡを抽出し，ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＩＬ－１０のプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙによるｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲを行い，発現量を定量した（図２ｃ上図）。更に，実験１と同じＣＤ８６抗体（Ｒ＆Ｄ），ＣＤ２０６抗体（ＢＤ）を用い，同様にＰＣＲを行い発現量を定量した（図２ｃ下図）。それぞれの値はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した。

図２ｃに示すように，実験２に記載の方法により分化させたマクロファージがそれぞれ，Ｍ１に特徴的な炎症性サイトカイン（ＩＬ－１ｂｅｔａ，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）及びＭ２に特徴的な抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）を産生することが示された。更に，これらの分化誘導マクロファージがそれぞれＭ１，Ｍ２マクロファージの表面マーカーであるＣＤ８６，ＣＤ２０６発現の増加を示した。これらの結果より，分化誘導が成功したことが確認された。よって，実験２の方法で分化させたＭ１，Ｍ２マクロファージ及び未分化のＭ０マクロファージを以下の実験３，４で用いた。

実験３：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の線維芽細胞への添加実験（１）
図３ａに示すように，実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後又はＭ０の未分化の状態のまま，上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，培地を加えて４８時間培養した。炎症性・抗炎症性サイトカインといったＭ１，Ｍ２の分泌物を含むそれらの上清を新生児由来線維芽細胞に添加した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）を添加した細胞を用いた。上清の添加後，線維芽細胞を７２時間培養し，上清中のプロコラーゲン量をＰＩＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で定量した（図３ｂ）。細胞画分はウサギ由来の抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）とビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク（ＨＯＫＵＤＯ）で染色した（図３ｃ）。さらに，β－ｇａｌを老化指標として用い，細胞の核をＤＡＰＩで染めた後，細胞内のβ－ｇａｌをＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ）を用いて染色し（図３ｄ），β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数した（図３ｅ）。

更に，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのメラニン産生への寄与度を検討するために，上記と同様にそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養した。その後，線維芽細胞を回収してｍＲＮＡを回収し，ＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＩＬ－１ａｌｐｈａ，ＳＣＦ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎのプローブを用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図３ｆ）。

結果を図３ｂ～３ｆに示す。図３ｂは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を線維芽細胞に添加して７２時間培養した後のプロコラーゲン量を示す。図３ｃは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を添加して７２時間培養した後の線維芽細胞におけるコラーゲン及びヒアルロン酸の局在を示す。図３ｂ，ｃより，Ｍ１は顕著にコラーゲン産生を抑制することがわかる。図３ｄは，各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の上清を添加して７２時間培養した後の線維芽細胞における細胞内β－ｇａｌを示す。図３ｄより，Ｍ１ではβ－ｇａｌ陽性細胞が増え老化を促進する一方，Ｍ２は老化を抑制することが示唆される。図３ｅは，β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数したグラフを示す。右図はウェルあたりのＤＡＰＩ陽性細胞の総数を示す。図３ｅ右図より，Ｍ２は細胞の老化を抑制するのみならず，細胞の増殖を促進することが示唆される。図３ｅ左図は，ＤＡＰＩ陽性細胞総数あたりのβ－ｇａｌ陽性細胞の数の割合（％）を示し，Ｍ１は老化及び細胞死促進作用がある一方，Ｍ２は老化抑制及び細胞増殖作用があることが示唆される。更に，図３ｆに示すように，メラノジェネシス関連因子のｍＲＮＡ発現はＭ１によりメラニン産生を増加する方向に作用する一方，Ｍ２によりメラニン産生を抑制する方向に作用したこともわかった。非特許文献６に報告されるように，線維芽細胞は，ＵＶ等の光刺激によりＳＣＦ，ＨＧＦ等の因子を分泌し細胞死を引き起こすことが知られている。また，非特許文献７～９に報告されるように，線維芽細胞は，光刺激によりＨＧＦ，ＥＴ１，ｂＦＧＦ，ＳＣＦ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ等の因子を分泌することによりメラノサイトに直接的又は間接的に作用してメラニンを産生する。よって，光刺激による細胞死やメラニン産生は，Ｍ１／Ｍ２のバランスの崩れによるものであることが示唆される。

実験４：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の若齢及び老齢線維芽細胞への添加実験
次に，Ｍ２マクロファージの抗老化効果が老化した線維芽細胞にも有用か，つまり，若返り効果があるか，を確認する目的で，Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清を若齢及び老齢細胞に添加し，線維芽細胞の年齢の違いによるマクロファージ上清の効果の違いを検討した。

具体的には，実験３と同じ方法で収集したそれぞれのマクロファージ上清を，新生児ヒト包皮由来線維芽細胞（若齢由来線維芽細胞）と６８歳ヒト由来線維芽細胞（老齢由来線維芽細胞）に添加し，７２時間培養した。その後，実験３と同様の方法でβ－ｇａｌ及びＤＡＰＩ染色を行い，β－ｇａｌ陽性細胞及びＤＡＰＩ陽性細胞の数を計数した（図４ａ，４ｂ）。更に，実験３と同様にＭ１，Ｍ２の上清を若齢および老齢由来線維芽細胞に添加し，線維芽細胞を７２時間培養し，上清中のプロコラーゲン量をＰＩＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）で定量し（図４ｃ），ウサギ由来抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）とＤＡＰＩで染色した（図４ｄ）。

図４ａは，β－ｇａｌの染色図を示す。図４ｂは若齢由来線維芽細胞および老齢由来線維芽細胞のβ－ｇａｌ陽性細胞数及びウェルあたりの細胞総数の結果をグラフ化したものを示す。図４ａ下図より，老齢細胞であっても，Ｍ２上清を添加することによりβ－ｇａｌ陽性細胞が著しく減少し老化が抑制されたことがわかった。また，図４ｂより，年齢にかかわらず，Ｍ１により老化が促進され，Ｍ２により老化が抑制されることもわかった。このことは，図４ｃ，ｄに示されるように，年齢にかかわらず，Ｍ１上清を添加した細胞では，Ｍ２上清に比べて顕著にコラーゲン産生量が低いという結果によっても支持される。

実験５：Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージと新生児包皮由来線維芽細胞との共培養実験
新生児包皮由来芽細胞と同数のＭ１又はＭ２マクロファージ（実験２の方法で作成）をＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｋａｌａｉ）で培養した時と新生児包皮由来線維芽細胞とその半分の数のＭ１又はＭ２マクロファージをＲＰＭＩで培養した時に産生されるコラーゲン量をウサギ由来抗ヒトコラーゲン抗体（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）で染色し比較した。同時にマウス由来抗ヒトＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ）でも染色し，マクロファージを可視化した。

結果を図５に示す。新生児包皮由来芽細胞でも，Ｍ１上清を添加するとコラーゲンが減少される一方，Ｍ２を添加するとコラーゲンが多く見られた。つまり，若齢細胞であっても，Ｍ１／Ｍ２バランスが崩れるとコラーゲンに影響を及ぼすことがわかった。

実験６：３Ｄ皮膚モデルを用いたＭ１／Ｍ２バランスの崩れによる影響
Ｍ１／Ｍ２マクロファージが表皮細胞や線維芽細胞へ及ぼす影響を検討するために，以下の表に記載のような３層構造からなる三種類の３Ｄ皮膚モデルを作成した。

３Ｄ皮膚モデルの作成は次のように行った。セルカルチャーインサート（φ１２ｍｍ，多孔膜の平均孔径：０．４μｍ）にヒト真皮線維芽細胞（０．２×１０⁶個）を播種し，２００μＭ アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム（ＡＰＭ），１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを用いて２日に１回培地交換して１週間培養した。その上に，対照モデルにはヒト真皮線維芽細胞を含んだ０．５％Ｉ型コラーゲン－１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液，Ｍ１モデル，Ｍ２モデルにはさらに実験２の方法で分化させたＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージをそれぞれ３０，０００細胞添加したものをそれぞれ分注して，ヒト真皮線維芽細胞の上にコラーゲンゲルを作製し，１～５日間培養した。

さらにＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）培地中に分散した表皮角化細胞を５×１０⁵個／ウェルとなるようにコラーゲンゲルの上に播種し，インサート外にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２と１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを１：１で混合し２００μＭ ＡＰＭを添加した培地を内側と同じ液面高さまで添加して３日間培養した。

その後，インサートまたはガラスリング内の培地を取り除き，外側に皮膚モデル用培地（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭとＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２ ＥＧＦ（－）を１：１で混合してＣａ １．８ｍＭに調製）に２００μＭ ＡＰＭ，１０μＭ Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩（ＣＧＳ２７０２３Ａ（ＭＭＰ阻害剤）），１０μＭ ＢＩＰＢＩＰＵ（ヘパラナーゼ阻害剤）をインサートの底面の高さまで添加して，インサート内部を空気に曝した状態で気液境界培養を行った。２～３日に１回培地交換して２週間培養した。

培養を終えた皮膚モデルを４％ ＰＦＡ／ＰＢＳ（Ｎａｋａｒａｉ）で固定後，実験１と同様の方法で抗ＣＤ２０６抗体（ａｂｃａｍ），抗ＣＤ６８抗体（ａｂｃａｍ），抗ＣＤ８６抗体（ａｂｃａｍ）で染色し，Ｍ１，Ｍ２マクロファージの存在を確認した（図６）。その後，抗ｐ２１抗体（ａｂｃａｍ），ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ）で染色し，表皮細胞層および線維芽細胞層それぞれにおいてＤＡＰＩで染色された細胞の数を全細胞数とし，そのうち抗ｐ２１抗体にも染色された細胞の数をｐ２１陽性細胞数として計数した。全細胞数に対するｐ２１陽性細胞数の割合を以下の式により求めた。

結果を図７，８に示す。これらの図に示すように，中間層に接している上層の表皮細胞層および下層の線維芽細胞層のいずれでも対照モデル（ｃｏｎｔ）に対し，Ｍ１モデル（Ｍ１）ではｐ２１陽性細胞が増加し，一方Ｍ２モデル（Ｍ２）では減少していた。この傾向は，単層培養物を用いた実験３と一致していた。従って，ヒト皮膚により近い３Ｄ皮膚モデルにおいても，Ｍ１マクロファージは老化及び細胞死促進作用がある一方，Ｍ２マクロファージは老化及び細胞死抑制作用があることが示唆される。

実験７：ヒト皮膚を用いたｅｘ ｖｉｖｏモデルへの太陽光照射実験
Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社製ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（３８歳女性から採取後の皮膚）を到着後付属の培養液で１日培養した。翌日にＯｒｉｅｌ社製１０００Ｗソーラーシミュレーターに光学フィルターを入れて，ＵＶＡとＵＶＢのみを１１．５ Ｊ／ｃｍ²照射し，付属の培養液で培養を続けた（照射（＋））。対照として照射を行わない試料を用いた（照射（－））。照射５日後サンプルを回収し，実験１と同様にＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，総マクロファージを染色し，その数を数えてグラフとした。

結果を図９に示す。ソーラーシミュレーターを照射すると，Ｍ１数は最も増加した。一方，Ｍ２数の増加はＭ１の場合に比べて非常に小さかった。つまり，光刺激により，Ｍ１／Ｍ２のバランスが崩れＭ１の比率が増加することがわかった。

実験８：ヒト皮膚を用いたｅｘ ｖｉｖｏモデルへの伸展刺激実験
次に，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整又は改善する方法について検討した。
試料：Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社製ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（３８歳女性から採取後の皮膚）（６ｗｅｌｌ ｓｉｚｅ，直径約２～２．５ｃｍ）を使用した。
伸展条件：図１１に示すようなウェル内の皮膚の両端を把持する把持部を有し，把持部を引っ張ることにより皮膚を伸展させる伸展器具を作成した。上記組織片が入ったウェルを水平に設置し，把持部を操作して両端から皮膚を伸展させ図１０に示すように１０％の伸展率となる伸展を１０％／ｓの速度で行い，１０％／ｓの回復速度にて試料を元の非伸展状態に戻した。これを１サイクルとし，合計９０サイクルを３０分間かけて行った。この９０サイクルを１セットとし，セット間に３０分～１時間の休止時間を設けて合計３セット（合計２７０サイクル）を３時間かけて行った。対照として伸展刺激を行わない試料を用いた（ｃｏｎｔｒｏｌ）。

観察方法：伸展刺激を与えた又は与えない皮膚試料について，総マクロファージの染色をウサギ由来の抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ａｂｃａｍ）のみで染色した以外は実験１と同様の方法で，にＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，総マクロファージを染色し，その数を計数した。全マクロファージの総数に対する各マクロファージ（Ｍ１，Ｍ２）の割合（％）を求めてグラフとした。

結果を図１２に示す。対照に比べ，伸展刺激を与えた試料では，マクロファージの総数とＭ１の数はあまり変化がなかったが，Ｍ２の数は非常に増加した。つまり，伸展刺激により，Ｍ１／Ｍ２のバランスが改善することがわかった。

実験９：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清のコラーゲンに対する影響
実験３に加えて，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのコラーゲン分解への寄与度を検討するために，実験３と同様の方法でそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養し，７２時間後ｍＲＮＡを回収した。コラーゲン分解の指標としてＭＭＰ－１，ＭＭＰ－２，およびＩＬ－１βのプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ）を用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図１４ａ）。

更に，Ｍ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージのコラーゲン産生・成熟化への寄与度を検討するために，実験３と同様の方法でそれぞれのマクロファージの上清を線維芽細胞に添加して培養し，７２時間後ｍＲＮＡを回収した。コラーゲン産生・成熟化の指標としてＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＨＳＰ４７，およびＡＤＡＭＴＳ－２のプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ）を用いてｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行いそれぞれのｍＲＮＡ発現量を定量した（図１４ｂ）。

図１４ａ，ｂより，Ｍ１はコラーゲン分解に寄与する一方，Ｍ２はコラーゲン産生・成熟化に寄与することが確認された。

実験１０：若年及び高齢者のヒト皮膚を用いたｅｘ ｖｉｖｏモデルにおけるコラーゲンの分解及び産生
図１５ａに示す年齢の若齢者（２０代～３０代）と高齢者（６０代～８０代）の白人由来のこめかみの皮膚を実験１と同様に凍結切片にし，薄切後，３／４側のコラーゲン切断断片を染色する抗プロコラーゲン抗体（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），抗断片化コラーゲン（ＡｄｉｐｏＧｅｎ），並びに実験１と同じＣＤ６８，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ２０６，ＣＤ８６抗体を用い，実験１と同様の方法で陽性細胞をカウントした。

結果を図１５ｂ，ｃ，ｄに示す。若年群に比べて高齢群ではＭ１マクロファージの割合が高くＭ２マクロファージの割合が低くなっていた。しかしながら，年齢にかかわらず，３／４コラーゲン陽性を示す線維芽細胞に比べて３／４コラーゲン陽性を示すマクロファージの数が多く，さらに３／４コラーゲン陽性を示すＭ１マクロファージよりも３／４コラーゲン陽性を示すＭ２マクロファージ数が多い傾向にあった。

実験１１：真皮におけるメラニンの取り込み能力を示すｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
実験３と同様の方法でＴＨＰ－１細胞をＭ１マクロファージとＭ２マクロファージに分化させた。分化したそれぞれのＭ１マクロファージ，Ｍ２マクロファージ，および線維芽細胞（クラボウ社製）に，メラニン溶液（Ｓｉｇｍａ社，Ｍｅｌａｎｉｎ－ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ， ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）をＰＢＳに溶解し０．０２％ Ｗ／Ｖに調整し添加した。２４時間後に細胞をＰＢＳで洗浄後，顕微鏡で撮影し，細胞を回収した。回収した細胞の細胞数をアラマーブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で，メラニン量を下記のように計測し，定量した。

メラニンの定量：
それぞれの細胞の培地（マクロファージ：ＲＰＭＩ１６４０， 線維芽細胞：１ＤＭＥＭ）で１：１０に調整したアラマーブルーを添加後，３７℃で３０分間培養した。その後，その上清を１００ｕｌ／ｗｅｌｌ回収し，ｅｘｃｉｔｅｍｅｎｔ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５４４ｎｍ／５９０ｎｍで蛍光をＡｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）で計測した。計測後，ＰＢＳで洗浄し，１Ｍ ＮａＯＨを添加後室温で３時間インキュベートし，完全に融解した。この細胞溶液をＯＤ４７５にてＰＯＷＥＲＳＣＡＮ ＨＴ（ＤＳ ＰＨＡＲＭＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ）を用いて計測した。

結果を図１６ａ～ｃに示す。図中の単位「ｍｅｌａｎｉｎ／ａｌｍａｒ ｂｌｕｅ」は，培養細胞をアラマーブルーで染色し上清を蛍光を５４４ｎｍ／５９０ｎｍで計測した強度（（１））と，その後細胞を溶解しメラニンも溶解させたものを吸光度４７５ｎｍで計測した強度（（２））の相対値（（２）／（１））であり，細胞あたりのメラニン含有量を示す。これらの図より，Ｍ２が非常に多くのメラニンを貪食していることがわかった。この傾向は２４時間後でも既に見られたが，５日後まで細胞の培養を続けて観察したところ，その差はより明確となった（図１６ｃ）。

実験１２：真皮におけるメラニンの取り込み能力を示すＥｘ ｖｉｖｏの実験
実験１１によってＭ２マクロファージが線維芽細胞やＭ１マクロファージよりも多くのメラニンを貪食することがわかったため，実験１１でカウントしたヒト皮膚の真皮層を，ＬＳＭ８８０（カールツァイス社製）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで観察した。高齢でも若齢でも，明視野で観察した時にＭ２マクロファージはメラニンが黒く一緒に染まるのに対し，Ｍ１マクロファージの近くにはメラニンが存在しないことがわかった。これにより，真皮においてＭ２マクロファージが線維芽細胞やＭ１マクロファージより多くのメラニンをとりこんでいることがｅｘ ｖｉｖｏでわかり，その数をカウントしグラフ化した（図１７）。

図１７より，老齢でも若年でもメラニンを取り込んでいるＭ２マクロファージの数がＭ１マクロファージの数より多く，この傾向には年齢差があまりみられなかった。この結果より，真皮のメラニンを取り込むのはＭ２マクロファージであるため，Ｍ２マクロファージの割合を増やしてＭ１／Ｍ２バランスを整えれば光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善できることが示唆される。

実験１３：Ｍ１抑制／Ｍ２誘導剤の探索
図１８に記載の各種マーカーを用いて，Ｍ１／Ｍ２バランスを調整又は改善することにより，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善し得る剤を探索したところハクシニンに強力なＭ２誘導効果が見いだされた。なお，ここで用いたハクシニン抽出物（加水分解無し，又は加水分解あり）は，特許第４７８１８４２号公報（特許文献９）や，国際公開第２０１２／０５７１２４３号（特許文献１０）を参照して調製されたものであり，以下の手順によって調製された。なお，本発明に置いて用いられ得るハクシニン抽出物を調製する手順は以下に記載の手順に限定されないことに留意されたい。

＜ハクシニン抽出物の調製＞
ハクシニンの種子（未粉砕，必要に応じて外殻を除去）を５倍量（ｖ／ｗ）のアセトンまたは酢酸エチル（酢エチ）またはヘキサンに浸漬し，室温にて１０日間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き，さらにろ紙にてろ過した。ロータリーエバポレータでろ液から溶媒を除去した後，撹拌羽根で撹拌しながら０．５～１５ＮのＮａＯＨをＮａＯＨとして１００～３００ ｇ/ｌ 抽出物の範囲内で添加した（温度５０℃）。２００ ｒｐｍで撹拌しながら，５時間処理を行った。その後，５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を徐々に添加し，撹拌しながらｐＨを１付近まで下げ，分離してくる油状物質を回収した。回収した油状物質に等容量の水を加えて水洗し，不純物・塩・過剰の酸を除去した。油状物質を減圧乾燥し，アルカリ処理物とした（加水分解ありのハクシニン抽出物）。比較対照としては，アルカリ処理前の抽出物を用いた（加水分解なしのハクシニン抽出物）。

ＴＨＰ－１細胞をＭ０の未分化の状態のまま用い，３７℃で一晩培養した。その後，溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ，又はハクシニン加水分解物を０．３ｐｐｍ，１ｐｐｍ，もしくは３ｐｐｍとなるように添加し，３７℃で二晩培養した。細胞を回収してＲＮＡを抽出し，ＣＤ８６，ＣＣＲ７，ＴＮＦ－ａｌｐｈａ，ＣＤ２０６，ＣＤ１６３，ＩＬ－１０及びＧＡＰＤＨの発現量をｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲで定量し，各遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨの発現量で除した。その結果，ハクシニン加水分解物は，濃度依存的に，ＣＤ８６遺伝子，ＴＮＦ－α遺伝子発現量を低下させ，ＣＤ２０６遺伝子，ＩＬ－１０遺伝子を増加させた。このことからハクシニン加水分解物にＭ１誘導抑制かつＭ２誘導促進効果があることがわかった（図１８）。

実験１４：ハクシニンによるメラニン貪食能増加効果
未成熟（Ｍ０）の状態のＴＨＰ－１細胞に，溶媒（ＤＭＳＯ）で溶解した加水分解無し（アルカリ処理無し）のハクシニン（コントロール）を３ｐｐｍ，又はハクシニン加水分解物を１．０ｐｐｍ，３．０ｐｐｍとなるように添加した。３７℃にて培養し，４８時間後にメラニン溶液（Ｓｉｇｍａ社）を添加し，顕微鏡（Ｂｉｏ Ｓｔａｔｉｏｎ ＣＴ（Ｎｉｋｏｎ））にて観察した。

結果を図１９ａ～ｂに示す。メラニン添加３０分後ハクシニン添加したマクロファージはメラニンを取り込み始めていた（図１９ｂの黒矢印）。さらに３時間後，コントロールはメラニンを取り込んでいない細胞がまだ多く存在するが，ハクシニン加水分解物添加サンプルでは全ての細胞がメラニンを取り込んでいた。

光老化によりＭ１の割合が増加することが示され（実験７），Ｍ２の割合が高いほうが皮膚コラーゲン量が多くなり（実験９，１０）色素貪食作用も高くなる（実験１１，１２）傾向が示されたため，Ｍ２誘導剤としてスクリーニングされたハクシニン，並びにＭ１／Ｍ２バランス改善作用のある本発明の微弱な物理刺激は，真皮において色素沈着抑制効果が高いことが示唆される。

実験１５：マクロファージの細胞内活性
実験２と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０マクロファージ，Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージについて、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（旧Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製の細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ２４（２４ｗｅｌｌ用）（以下、「フラックスアナライザー」という。）を用いて、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１４． １５（９）： ｐｐ８４６－８５５（非特許文献１４）を参考に細胞内活性を計測した。なお、フラックスアナライザーは、細胞の主要なエネルギー代謝経路である解糖、及びミトコンドリアによる好気呼吸の状態を、細胞に対して無侵襲・高感度に経時的計測を可能とする装置である。

フラックスアナライザーを用いて、オリゴマイシン（ＡＴＰ合成酵素阻害剤）（「Ｏｌｉｇｏ」）、ＦＣＣＰ（脱共役剤）、及びロテノン（ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤）＋アンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤）（「Ｒｏｔ＋Ａｎｔ」）を所定の時間に添加し、酸素消費速度（ＯＣＲ）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）とを計測した。ＥＣＡＲ，ＯＣＲの値は計測後１８．３分後のｂａｓａｌ ＯＣＲの値、ｂａｓａｌ ＥＣＡＲの値を用いた。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。

その結果、Ｍ２マクロファージ、Ｍ０マクロファージ、Ｍ１マクロファージの順番で、ミトコンドリアによる呼吸活性が高いことが示された（図２０）。

実験１６：ハクシニン抽出物によるマクロファージの細胞内活性への影響

実験２と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ１、Ｍ２を準備し、Ｍ０に実験１３と同様の方法で調整したハクシニン抽出物（ハクシニン加水分解物）（０．３ｐｐｍ、１ｐｐｍ又は３ｐｐｍ）を添加した。４８時間インキュベートした後に、酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した（図２１）。

その結果、ハクシニン抽出物を添加することによって、計測開始１８．３分後（３点目の計測値）のＢａｓａｌ ＯＣＲの値（図２１）、及びミトコンドリア呼吸の値（計測開始１８．３分後のＢａｓａｌ ＯＣＲの値から、計測開始９５．１分後のｎｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ（ミトコンドリアとは関連のない酸素消費量）を引いた値）（図２２）が有意に増加することが明らかとなった。

実験１７：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（１）

ハクシニン抽出物には、ω３脂肪酸であるリノレン酸やジュニペロン酸、ω６脂肪酸であるリノール酸等の不飽和脂肪酸が含まれていることが知られている。不飽和脂肪酸（ＥＰＡ、ＤＨＡ）がＭ１の炎症関連遺伝子に作用し、炎症を抑制することが報告されている（非特許文献１５（Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１７ Ｆｅｂ ７；２５（２）：４１２－４２７）)。そこで、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸がマクロファージの細胞内活性へ与える影響について調べた。

実験２と同様の方法で、ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０、Ｍ２を準備し、Ｍ０にリノール酸、リノレン酸又はジュニペロン酸（３ｐｐｍ）を添加し、４８時間後に、実験１５と同様の方法で酸素消費速度（ＯＣＲ）をフラックスアナライザーで計測した。それぞれの計測値は、Ｈｏｅｃｈｓｔを添加して染色された細胞核をカウントして得られた細胞数で補正した。

その結果、ハクシニン抽出物に含まれるリノール酸、リノレン酸、ジュニペロン酸の添加によるＭ０マクロファージへのＢａｓａｌ ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値は、溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を添加したコントロールとの有意差が認められなかった（図２３）。

実験１８：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるマクロファージの細胞内活性への影響（２）

ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加した後のインキュベート時間を２４時間に変更した場合のＭ０のＢａｓａｌ ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値を調べた。実験方法は、ハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸を添加後のインキュベート時間を２４時間に変更した以外は、実験１７に記載の方法と同じ方法を実施した。

その結果、ハクシニン抽出物及び各不飽和脂肪酸を添加後２４時間では、Ｂａｓａｌ ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸の値の増加は観察されなかった（図２４）。

実験１９：ハクシニン抽出物に含まれる各成分によるＭ１分化中のマクロファージの細胞内活性への影響

実験２と同様の方法でＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０を、さらにＭ１に分化誘導する工程においてハクシニン抽出物又は不飽和脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、又はジュニペロン酸）を添加した場合の細胞内活性の変化をフラックスアナライザーを用いて解析した（図２５）。

ＴＨＰ－１から分化誘導したＭ０をさらにＭ１に分化誘導する時に、ハクシニン抽出物、又は不飽和脂肪酸を添加して２４時間後にフラックスアナライザーを用いて、図１５の方法と同様に酸素消費速度（ＯＣＲ値）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）とを計測した。

その結果、Ｂａｓａｌ ＯＣＲ及びミトコンドリア呼吸は、ハクシニン抽出物を添加した場合のみ、有意な上昇が認められた（図２６（Ａ）及び（Ｂ））。強い抗炎症作用が報告されているリノレン酸のみ、ＥＣＡＲ値の強い抑制効果が観察され、その結果、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ値の上昇が認められた。

Ｍ１分化中のマクロファージのミトコンドリア呼吸はハクシニン抽出物によって有意に上昇したが、ハクシニン抽出物に含まれる不飽和脂肪酸単独では有意な上昇は認められず、ミトコンドリア呼吸の上昇という効果は、ハクシニン抽出物に含まれる各種成分の混合による特異的な効果である可能性が示唆された。

実験２０：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清に含まれるＳＤＦ－１αの確認

皮膚のシミ部位の下部に存在する線維芽細胞においてＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量が低下することから、ＳＤＦ－１量の低下が皮膚のシミ生成に関連する可能性が報告されている（非特許文献１６（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１８ Ｓｅｐ ９；８（１７）：４６２０－４６３２））。そこで、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ自身のＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量について調べた。

実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後、上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，ＲＰＭＩ（０．５％ＦＢＳ）を加えて２４時間培養し、上清中のＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の量をサイトカインアレイイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）によって調べた（図２７（Ａ））。

その結果、Ｍ２上清は、Ｍ１上清に比べて多くのＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）が含まれていることが明らかとなった（図２７（Ｂ））。

実験２１：Ｍ１，Ｍ２マクロファージ上清の線維芽細胞への添加実験（２）

Ｍ１，Ｍ２マクロファージが生成する因子が、線維芽細胞のおけるＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現に与える影響を調べた（図２８（Ａ））。

実験２と同様の方法でＴＨＰ－１をＭ１，Ｍ２に分化後、上清を除き，ＰＢＳで１度洗浄した後，ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ， ５００μＭアスコルビン酸含有）を加えて４８時間培養した。炎症性・抗炎症性サイトカインといったＭ１，Ｍ２の分泌物を含むそれらの上清を皮膚線維芽細胞に添加した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ， ５００μＭアスコルビン酸含有）を添加した細胞を用いた。上清の添加後，線維芽細胞を７２時間培養した。その後、線維芽細胞を回収してｍＲＮＡを回収し，ＲＮＡ－ｓｅｑにてＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２）の発現量を解析した（図２８（Ａ））。

ＲＮＡ－ｓｅｑのリードをＳＴＡＲを使用してヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。得られたカウントデータについて，低発現遺伝子のフィルタリング後にそれぞれのサンプル間のサイズ補正およびｌｏｇ２変換を行なった。以上の方法でサンプル毎に算出したｌｏｇ２（ＣＰＭ）について，ＲパッケージのｅｄｇｅＲの機能であるｇｌｍＱＬＦｉｔとｇｌｍＱＬＦＴｅｓｔを用いて、ｑｕａｓｉ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｆ－ｔｅｓｔで２群間比較を行った後、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で多重比較検定補正を行なってｑ－ｖａｌｕｅを算出した。

その結果、Ｍ１上清を添加した線維芽細胞は、ＳＤＦ－１ａ発現量が顕著に減少することが明らかとなった（図２８（Ｂ））。

以上の結果により，Ｍ１／Ｍ２のバランスを調整又は改善することにより，光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善できることが示唆される。Ｍ１／Ｍ２のバランスの調整又は改善は，伸展刺激や押圧刺激を与えることや，ハクシニン等を適用することにより達成され，ひいては光老化及び／又は真皮色素沈着の予防及び／又は改善が期待される。

Claims (4)

1. ハクシニン抽出物を有効成分として含む，Ｍ１マクロファージに対するＭ２マクロファージの比率を上昇させることにより光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善する剤。
2. Ｍ１マクロファージに対するＭ２マクロファージの比率を上昇させることにより、対象の光老化及び／又は真皮色素沈着を予防及び／又は改善するための美容方法であって，
   （ａ）対象の皮膚に，請求項１に記載の剤を適用する工程，
   を含む，医療行為を除く美容方法。
3. 前記美容方法は，さらに，前記皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を含み，ここで前記物理刺激を適用する工程は，
   （ｂ－１）前記対象の皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展することであって，ここで，伸展率は，
   （式中，定点ＡおよびＢは，表皮または表皮が接着しているマトリックス上の任意の位置であり，ここで定点ＡとＢを通る直線が伸展方向と平行である）
   で算出される；及び
   （ｃ－１）前記対象の皮膚を伸展状態から回復すること；
   並びに／又は，
   （ｂ－２）前記対象の皮膚を，１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
   （ｃ－２）前記対象の皮膚を押圧状態から回復すること；
   を含み，
   ここで前記（ｂ－１）及び（ｃ－１）並びに／又は前記（ｂ－２）及び（ｃ－２）のサイクルが６０Ｈｚ以下の振動数で実施される，
   を含む，請求項２に記載の美容方法。
4. 請求項３に記載の美容方法に適用するための美容装置であって，
   前記装置は，
   物理刺激を生ずる刺激発生部と，
   刺激発生部で発生した物理刺激を皮膚に付与する刺激付与部とを備え，
   ここで，当該装置は，皮膚に対して微弱な物理刺激を適用する工程を行うための装置であり，ここで当該工程は，
   （ｉ－１）前記皮膚を０．１％以上５０．０％以下の伸展率まで伸展すること；及び
   （ｉｉ－１）前記皮膚を伸展状態から回復すること；
   並びに／又は，
   （ｉ－２）前記皮膚を１μｍ～１０００μｍ押圧すること；及び
   （ｉｉ－２）前記皮膚を押圧状態から回復すること；を含むサイクルを６０Ｈｚ以下の振動数で行うことであり，
   ここで，伸展率は，上記式１により算出される，
   前記美容装置。