JP7765081B2 - Sericin-containing powder and method for producing sericin-containing powder - Google Patents
Sericin-containing powder and method for producing sericin-containing powderInfo
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Description
本発明は、セリシン含有粉末、及びセリシン含有粉末の製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、高分子量のセリシンを含有する、分散性に優れたセリシン含有粉末、及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a sericin-containing powder and a method for producing a sericin-containing powder. More specifically, the present invention relates to a sericin-containing powder that contains high-molecular-weight sericin and has excellent dispersibility, and a method for producing the same.
蚕等が吐糸する繭糸は、セリシンとフィブロインという２種類のタンパク質から主に構成されている。このうち、フィブロインは繭の繊維を構成するタンパク質であり、セリシンはフィブロインが形成する繊維の外側を層状に覆い、その接着等に関わるタンパク質である。 The cocoon threads spun by silkworms and other animals are primarily composed of two types of proteins: sericin and fibroin. Of these, fibroin is the protein that makes up the fibers of the cocoon, and sericin is a protein that coats the outer layer of the fibers formed by fibroin and is involved in their adhesion, etc.
繭に含まれるセリシンは、例えば、絹糸の精練工程において繭をアルカリ性の熱水で煮てフィブロインを取り出す際に可溶化する。従って、通常、セリシンは、この精練工程の廃液から得られるが、加水分解によって低分子量化している。 The sericin contained in cocoons is solubilized, for example, during the silk refining process, when the cocoons are boiled in alkaline hot water to extract the fibroin. Therefore, sericin is usually obtained from the waste liquid of this refining process, but its molecular weight has been reduced by hydrolysis.
一方、低分子量化されたセリシンよりも高分子量のセリシンの方が、優れた特性を有することが知られている（引用文献１等）。そして、高分子量のセリシンを得る方法としては、抽出溶媒として特に臭化リチウム水溶液を用いて、穏和な条件で抽出する方法が知られている（引用文献２）。 On the other hand, it is known that high-molecular-weight sericin has superior properties compared to low-molecular-weight sericin (e.g., Reference 1). Furthermore, a method for obtaining high-molecular-weight sericin is known to be extraction under mild conditions using an aqueous solution of lithium bromide as an extraction solvent (Reference 2).
しかし一般的に、高分子量のセリシンは溶解性や分散性が悪いため、特に高分子量のセリシンが粉末状である場合には、化粧品剤型等への配合が困難という課題があった。また、高分子量のセリシンを水溶液で取得した場合も、経時的にゲル化してしまうため、安定な状態での取得や化粧品剤型等への配合が困難という課題があった。 However, high-molecular-weight sericin generally has poor solubility and dispersibility, making it difficult to incorporate into cosmetic formulations, especially when it is in powder form. Furthermore, even when high-molecular-weight sericin is obtained in aqueous solution, it gels over time, making it difficult to obtain in a stable state or to incorporate into cosmetic formulations.
本発明は、上記のような事情に着目してなされたものであって、その目的は、高分子量であることと分散性が良好であることとを両立し得るセリシン含有粉末、及びその製造方法を提供することにある。 The present invention was made in light of the above-mentioned circumstances, and its purpose is to provide a sericin-containing powder that is both high molecular weight and has good dispersibility, as well as a method for producing the same.
本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］ セリシン及び酸を含むセリシン含有粉末であり、
前記セリシンは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に少なくとも１本のバンドが検出されるセリシンであり、
１．０質量％水分散液とした際のｐＨが５．０以下であることを特徴とするセリシン含有粉末。
［２］ 下記方法で測定した分散度が、３３％以上である［１］に記載のセリシン含有粉末。
［分散度測定方法］
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、ワトソン社製、１３９２－２００－ＳＳ－ＣＳ番の２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中、温度６０℃で３０分間加熱する。加熱処理後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離して上澄み０．２０ｍＬを除去し、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間）後、０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射する。超音波処理後、チューブを垂直に立ててチューブ内の液部の高さＨと高濃度部の高さｈとを求め、下記式に従って分散度（％）を算出する。
分散度（％）＝ｈ／Ｈ×１００
［３］ 前記酸が、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸、及び無機酸からなる群から選ばれる少なくとも１種である［１］又は［２］に記載のセリシン含有粉末。
［４］ 繭から有機溶媒を用いてセリシンを得る抽出工程と、
セリシン抽出液にｐＨ５．０以下の酸性水溶液を混合するセリシン含有ゲルの取得工程と、
前記で得られたゲルを粉末化する乾燥工程と、を含むことを特徴とするセリシン含有粉末の製造方法。
［５］ 前記有機溶媒が、スルホキシド系溶媒及びアミド系溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１種である［４］に記載の製造方法。
［６］ 前記有機溶媒が、アルカリ金属ハロゲン化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］ 前記酸性水溶液が、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸、及び無機酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸を含む［４］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］ 前記セリシン含有ゲル取得工程の後であって、前記乾燥工程の前に、得られたゲルを酸性水溶液で洗浄する洗浄工程をさらに含む［４］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］ 前記洗浄工程で使用する酸性水溶液が、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸、及び無機酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸を含む［８］に記載の製造方法。
［１０］ 前記セリシン含有粉末に含有されるセリシンが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に少なくとも１本のバンドが検出されるセリシンである、［４］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
The gist of the present invention is as follows.
[1] A sericin-containing powder containing sericin and an acid,
The sericin is sericin in which at least one band is detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more by SDS-PAGE,
A sericin-containing powder characterized in that the pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion is 5.0 or less.
[2] The sericin-containing powder according to [1], having a degree of dispersion of 33% or more as measured by the following method.
[Dispersion measurement method]
10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes in a 2.0 mL screw-cap tube (Watson, No. 1392-200-SS-CS). After heat treatment, the mixture was centrifuged at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes, 0.20 mL of supernatant was removed, and the mixture was mixed in a vortex mixer (approximately 2700 rpm for 5 seconds) and then sonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonicator (Sonic Tech, ST805, 42 kHz, 35 W) containing 0.5 L of water. After sonication, the tube was placed vertically to determine the height H of the liquid portion and the height h of the high-concentration portion in the tube. The degree of dispersion (%) was calculated according to the following formula:
Dispersity (%) = h/H x 100
[3] The sericin-containing powder according to [1] or [2], wherein the acid is at least one selected from the group consisting of an aliphatic monocarboxylic acid, an aliphatic polycarboxylic acid, and an inorganic acid.
[4] an extraction step of obtaining sericin from the cocoons using an organic solvent;
a step of obtaining a sericin-containing gel by mixing the sericin extract with an acidic aqueous solution having a pH of 5.0 or less;
and a drying step of powdering the gel obtained as described above.
[5] The method according to [4], wherein the organic solvent is at least one selected from the group consisting of sulfoxide solvents and amide solvents.
[6] The method according to [4] or [5], wherein the organic solvent contains at least one selected from the group consisting of alkali metal halides and alkaline earth metal halides.
[7] The production method according to any one of [4] to [6], wherein the acidic aqueous solution contains at least one acid selected from the group consisting of an aliphatic monocarboxylic acid, an aliphatic polycarboxylic acid, and an inorganic acid.
[8] The method according to any one of [4] to [7], further comprising a washing step of washing the obtained gel with an acidic aqueous solution after the sericin-containing gel obtaining step and before the drying step.
[9] The production method according to [8], wherein the acidic aqueous solution used in the washing step contains at least one acid selected from the group consisting of an aliphatic monocarboxylic acid, an aliphatic polycarboxylic acid, and an inorganic acid.
[10] The method according to any one of [4] to [9], wherein the sericin contained in the sericin-containing powder is sericin for which at least one band is detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more by SDS-PAGE.
本発明によれば、高分子量のセリシンを含有しながらも、分散性（特に、水に対する分散性）も良好なセリシン含有粉末、及びその製造方法を提供することができる。本発明のセリシン含有粉末は分散性が良好であるため、化粧品剤型等への配合が容易であり扱い易い。また、セリシンを溶液の状態で保存すると、保存時等にセリシンの加水分解や、特に高分子量の場合は望まないゲル化が起きる恐れがあるが、本発明ではセリシンを粉末状としているため、保存時の安定性が高い。 The present invention provides a sericin-containing powder that contains high-molecular-weight sericin yet has good dispersibility (particularly in water), as well as a method for producing the same. Because the sericin-containing powder of the present invention has good dispersibility, it is easy to incorporate into cosmetic formulations and is easy to handle. Furthermore, if sericin is stored in solution, hydrolysis of the sericin may occur during storage, and undesired gelation may occur, particularly in the case of sericin with a high molecular weight. However, the sericin of the present invention is in powder form, which provides high storage stability.
１． セリシン含有粉末
本発明のセリシン含有粉末は、高分子量のセリシン及び酸を含有し、１．０質量％水分散液とした際のｐＨが５．０以下であることに特徴を有する。該構成を有する本発明のセリシン含有粉末は、高分子量のセリシンを含有しながらも、分散性（特に水に対する分散性）に優れる。
1. Sericin-Containing Powder The sericin-containing powder of the present invention contains high-molecular-weight sericin and an acid, and is characterized in that the pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion of the sericin-containing powder of the present invention is 5.0 or less. The sericin-containing powder of the present invention having such a constitution has excellent dispersibility (particularly dispersibility in water) despite containing high-molecular-weight sericin.
１．１ セリシン
本発明のセリシン含有粉末に含有されるセリシンは、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法において、バンドが確認できなかったり、スメアになったりするのではなく、明確なバンドが検出されるものである。具体的には、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲において、少なくとも１本のバンドが検出されるものである。前記バンドとしては、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に検出されればよいが、１６０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に検出されることが好ましい。前記の範囲に検出されるバンド数は、１本以上であればよく、上限は特に制限されないが、前記の範囲に検出されるバンド数としては、１～５本が好ましく、２～５本がより好ましい。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により２５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に、明確なバンドが１本以上検出されるセリシンを含有するセリシン含有粉末も好ましい。このようなバンドが検出されるセリシンを含有するセリシン含有粉末であれば、含有されるセリシンは低分子量化されておらず、高分子量のセリシン特有の性状を示す。
なお、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法において検出されるバンドに対応する分子量は、マーカータンパク質（例えば、プレシジョン Ｐｌｕｓ プロテインTM２色スタンダード；ＢＩＯ－ＲＡＤ製等）の分子量画分のバンドとの対比により決定することができる。また、バンドの濃さからバンドの構成比率を算出することができるが、本発明のセリシン含有粉末に含有されるセリシンは、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲において、少なくとも１本のバンドが検出されるような高分子量のセリシンであればよく、検出されるバンドの構成比率は特に制限されない。
1.1 Sericin The sericin contained in the sericin-containing powder of the present invention is one in which clear bands are detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), rather than bands that are not visible or smeared. Specifically, at least one band is detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more. The band may be detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more, preferably in a range corresponding to a molecular weight of 160 kDa or more. The number of bands detected in the range may be one or more, and there is no upper limit. However, the number of bands detected in the range is preferably 1 to 5, and more preferably 2 to 5. Also preferred is a sericin-containing powder containing sericin in which one or more clear bands are detected by SDS-PAGE in a range corresponding to a molecular weight of 250 kDa or more. A sericin-containing powder containing sericin in which such bands are detected indicates that the sericin has not been reduced in molecular weight and exhibits the properties characteristic of high-molecular-weight sericin.
The molecular weight corresponding to a band detected in SDS-PAGE can be determined by comparison with the band of the molecular weight fraction of a marker protein (e.g., Precision Plus Protein ™ two-color standard; manufactured by BIO-RAD). The constituent ratio of the band can be calculated from the intensity of the band. However, the sericin contained in the sericin-containing powder of the present invention may be a high-molecular-weight sericin in which at least one band is detected within a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more, and the constituent ratio of the detected band is not particularly limited.
本発明のセリシン含有粉末におけるセリシンの含有量は、セリシンが有する抗酸化作用やチロシナーゼ阻害作用、成膜性等の機能を十分に発揮する観点から、５０質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましく、７０質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以上がよりさらに好ましく、またセリシン含有粉末の分散性の観点から、９９．９質量％以下が好ましく、９９．５質量％以下がより好ましい。 The sericin content in the sericin-containing powder of the present invention is preferably 50% by mass or more, more preferably 60% by mass or more, even more preferably 70% by mass or more, and even more preferably 80% by mass or more, from the viewpoint of fully exhibiting the functions of sericin, such as antioxidant activity, tyrosinase inhibitory activity, and film-forming ability. Furthermore, from the viewpoint of the dispersibility of the sericin-containing powder, the content is preferably 99.9% by mass or less, and more preferably 99.5% by mass or less.
１．２ 酸
本発明のセリシン含有粉末に含有される酸は、有機酸であっても、無機酸であってもよい。
有機酸としては、カルボン酸系化合物が好ましく、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸がより好ましい。脂肪族モノカルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等の脂肪族飽和モノカルボン酸、ソルビン酸等の脂肪族不飽和モノカルボン酸が挙げられ、脂肪族飽和モノカルボン酸が好ましく、炭素数１～８の脂肪族飽和モノカルボン酸がより好ましい。脂肪族多価カルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、グルタル酸、アジピン酸、クエン酸等の脂肪族飽和多価カルボン酸、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等の脂肪族不飽和多価カルボン酸が挙げられる。脂肪族多価カルボン酸としては、脂肪族飽和多価カルボン酸が好ましく、炭素数２～１０の脂肪族飽和多価カルボン酸がより好ましく、炭素数２～８の脂肪族飽和多価カルボン酸がさらに好ましく、炭素数２～８の脂肪族飽和オキシ多価カルボン酸がよりさらに好ましく、クエン酸が特に好ましい。
無機酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、臭素酸等が挙げられ、塩酸が好ましい。
酸としては、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸、無機酸が好ましく、脂肪族多価カルボン酸、無機酸がより好ましく、クエン酸、塩酸がさらに好ましい。
これらの酸は、単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
1.2 Acid The acid contained in the sericin-containing powder of the present invention may be an organic acid or an inorganic acid.
As the organic acid, a carboxylic acid compound is preferred, and an aliphatic monocarboxylic acid or an aliphatic polycarboxylic acid is more preferred. Examples of the aliphatic monocarboxylic acid include saturated aliphatic monocarboxylic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, and valeric acid, and unsaturated aliphatic monocarboxylic acids such as sorbic acid. Aliphatic saturated monocarboxylic acids are preferred, and saturated aliphatic monocarboxylic acids having 1 to 8 carbon atoms are more preferred. Examples of the aliphatic polycarboxylic acids include saturated aliphatic polycarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, glutaric acid, adipic acid, and citric acid, and unsaturated aliphatic polycarboxylic acids such as maleic acid, fumaric acid, citraconic acid, and mesaconic acid. As the aliphatic polycarboxylic acid, saturated aliphatic polycarboxylic acids are preferred, saturated aliphatic polycarboxylic acids having 2 to 10 carbon atoms are more preferred, saturated aliphatic polycarboxylic acids having 2 to 8 carbon atoms are even more preferred, and saturated aliphatic oxypolycarboxylic acids having 2 to 8 carbon atoms are even more preferred, and citric acid is particularly preferred.
Examples of inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, boric acid, and bromic acid, with hydrochloric acid being preferred.
The acid is preferably an aliphatic monocarboxylic acid, an aliphatic polycarboxylic acid, or an inorganic acid, more preferably an aliphatic polycarboxylic acid or an inorganic acid, and even more preferably citric acid or hydrochloric acid.
These acids may be used alone or in combination of two or more.
セリシン含有粉末における酸の含有量は、例えば、０．１質量％以上が好ましく、０．３質量％以上がより好ましく、０．５質量％以上がさらに好ましく、また３５質量％以下が好ましく、２５質量％以下がより好ましく、２０質量％以下がさらに好ましい。セリシン含有粉末における酸の含有量が前記範囲内であれば、より分散性に優れる。 The acid content in the sericin-containing powder is, for example, preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.3% by mass or more, even more preferably 0.5% by mass or more, and preferably 35% by mass or less, more preferably 25% by mass or less, and even more preferably 20% by mass or less. If the acid content in the sericin-containing powder is within the above range, the dispersibility will be even better.
セリシン含有粉末における酸の含有量は、例えば、ＨＰＬＣ等の公知の化合物の分析手法により求めることができる。 The acid content in the sericin-containing powder can be determined, for example, by known analytical methods for compounds such as HPLC.
なお、酸は必要に応じて、その酸の塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩、アンモニウム塩等）と併用してもよいが、上記の酸の含有量にはその塩の含有量は含めない。 If necessary, the acid may be used in combination with its salt (alkali metal salt, alkaline earth metal salt, amine salt, ammonium salt, etc.), but the above acid content does not include the content of the salt.
１．３ 特性
本発明のセリシン含有粉末は、１．０質量％水分散液とした際のｐＨが５．０以下である。該ｐＨは、４．０以下が好ましく、３．０以下がより好ましく、２．７以下がさらに好ましく、下限値としては、例えば、１．５であってもよい。本発明のセリシン含有粉末は、酸を含み、前記水分散液のｐＨが前記範囲内であることにより、分散性に優れる。
水分散液のｐＨ測定は、十分な分散処理をしてから行う。例えば、６０℃で、３０分間以上加熱した後に、超音波処理装置を用いて室温下、５分間以上分散処理を行うのが好ましい。また、分散処理後に遠心分離をして、得られる上澄みを用いてｐＨ測定をしてもよい。
1.3 Properties The sericin-containing powder of the present invention has a pH of 5.0 or less when dispersed in a 1.0% by mass aqueous solution. The pH is preferably 4.0 or less, more preferably 3.0 or less, and even more preferably 2.7 or less, and the lower limit may be, for example, 1.5. The sericin-containing powder of the present invention contains an acid, and the pH of the aqueous dispersion is within the above range, resulting in excellent dispersibility.
The pH of the aqueous dispersion is measured after sufficient dispersion treatment. For example, it is preferable to heat the dispersion at 60°C for 30 minutes or more, and then disperse the dispersion at room temperature for 5 minutes or more using an ultrasonic treatment device. Alternatively, the dispersion may be centrifuged, and the resulting supernatant may be used to measure the pH.
本発明のセリシン含有粉末は、例えば、下記方法で測定した分散度が３３％以上であることが好ましく、４５％以上がより好ましく、５０％以上がさらに好ましく、６０％以上がよりさらに好ましく、７０％以上がいっそう好ましく、７５％以上が特に好ましく、また１００％であってもよい。 The sericin-containing powder of the present invention preferably has a degree of dispersion, measured by the method described below, of 33% or more, more preferably 45% or more, even more preferably 50% or more, even more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, particularly preferably 75% or more, or may even be 100%.
［分散度測定方法］
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、ワトソン社製、１３９２－２００－ＳＳ－ＣＳ番の２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中、温度６０℃で３０分間加熱する。加熱処理後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離して上澄み０．２０ｍＬを除去し、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間）後、０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射する。超音波処理後、チューブを垂直に立ててチューブ内の液部の高さＨと高濃度部の高さｈとを求め、下記式に従って分散度（％）を算出する。
分散度（％）＝ｈ／Ｈ×１００
なお、高濃度部とは、上清み部分に比べて濃く白濁している部分であり、上清み部分と高濃度部分との間に界面が形成されるため、その高さを求めることができる。液部が全体的に一様であって界面が観察されないときは、分散度１００％である。界面が水平でない場合、例えば部分的に盛り上がるなどして不均一になる場合は、最も低い箇所でｈを決定する。
[Dispersion measurement method]
10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes in a 2.0 mL screw-cap tube (Watson, No. 1392-200-SS-CS). After heat treatment, the mixture was centrifuged at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes, 0.20 mL of supernatant was removed, and the mixture was mixed in a vortex mixer (approximately 2700 rpm for 5 seconds). Then, the mixture was sonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonicator (Sonic Tech, ST805, 42 kHz, 35 W) containing 0.5 L of water. After sonication, the tube was placed vertically to determine the height H of the liquid portion and the height h of the high-concentration portion in the tube. The degree of dispersion (%) was calculated according to the following formula:
Dispersity (%) = h/H x 100
The high-concentration portion is a portion that is thicker and cloudier than the supernatant portion, and an interface is formed between the supernatant portion and the high-concentration portion, so its height can be determined. When the liquid portion is uniform overall and no interface is observed, the degree of dispersion is 100%. When the interface is not horizontal, for example, when it is uneven due to partial swelling, h is determined at the lowest point.
本発明のセリシン含有粉末は、良好な溶解性を有さなくてもよいが、通常の高分子セリシンよりも、溶解性に優れることが好ましい。溶解性に優れるとは、具体的には、水に対する溶解度が高いことが好ましく、例えば、下記方法で測定した溶解度が０．０２０ｇ／水溶液１００ｇ以上であることが好ましい。該溶解度は、０．０３５ｇ／水溶液１００ｇ以上がより好ましく、０．０４０ｇ／水溶液１００ｇ以上がさらに好ましく、０．０５０ｇ／水溶液１００ｇ以上がよりさらに好ましく、０．０７０ｇ／水溶液１００ｇ以上がいっそう好ましく、０．０８０ｇ／水溶液１００ｇ以上が特に好ましく、０．３ｇ／水溶液１００ｇ以下であってもよい。また、該溶解度としては、０．００１ｇ／水溶液１００ｇ以上であればよい。 The sericin-containing powder of the present invention does not necessarily have good solubility, but it preferably has better solubility than ordinary polymeric sericin. Specifically, "good solubility" preferably means high solubility in water. For example, the solubility measured by the method described below is preferably 0.020 g/100 g of aqueous solution or greater. The solubility is more preferably 0.035 g/100 g of aqueous solution or greater, even more preferably 0.040 g/100 g of aqueous solution or greater, even more preferably 0.050 g/100 g of aqueous solution or greater, even more preferably 0.070 g/100 g of aqueous solution or greater, and particularly preferably 0.080 g/100 g of aqueous solution or greater, and may be 0.3 g/100 g of aqueous solution or less. The solubility may be 0.001 g/100 g of aqueous solution or greater.
［溶解度測定方法］
セリシン濃度が１．０質量％となるように、イオン交換水にセリシン含有粉末を添加し、６０℃で３０分間溶解する。溶解後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離し、上澄みを回収して得られた水溶液におけるセリシン濃度を、２８０ｎｍの吸光度から算出する。該算出したセリシン濃度から溶解したセリシンの質量を求める。なお、セリシン濃度算出は検量線を作成することにより行う。そして、溶解したセリシンの質量と、はじめに添加したセリシンの質量から、下記式にて溶解率を算出し、該溶解率を用いて溶解度を求める。
セリシンの溶解率（ｗｔ％）＝（溶解したセリシンの質量／添加したセリシンの質量）×１００
セリシンの溶解度（ｇ／水溶液１００ｇ）＝１００（ｇ）×１（ｗｔ％）×セリシンの溶解率（ｗｔ％）
[Solubility measurement method]
A sericin-containing powder was added to ion-exchanged water to a sericin concentration of 1.0% by mass, and dissolved at 60°C for 30 minutes. After dissolution, the solution was centrifuged at an acceleration of 9,500 × g for 5 minutes, and the supernatant was collected. The sericin concentration in the resulting aqueous solution was calculated from the absorbance at 280 nm. The mass of dissolved sericin was determined from the calculated sericin concentration. The sericin concentration was calculated by creating a calibration curve. The dissolution rate was then calculated using the following formula from the mass of dissolved sericin and the mass of sericin initially added, and the solubility was calculated using the dissolution rate.
Dissolution rate of sericin (wt%)=(mass of dissolved sericin/mass of added sericin)×100
Solubility of sericin (g/100 g of aqueous solution) = 100 (g) × 1 (wt%) × solubility of sericin (wt%)
１．４ その他の成分
本発明のセリシン含有粉末は、上記特性を損なわない限りは、セリシン及び酸以外のその他の成分を含んでいてもよい。その他の成分の含有量はセリシン含有粉末の総量中、３０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、また０．１質量％以上であってもよいが、セリシン含有粉末はその他の成分を含んでいないことが特に好ましい。
1.4 Other Components The sericin-containing powder of the present invention may contain other components in addition to sericin and acid, as long as the above-mentioned properties are not impaired. The content of the other components is preferably 30% by mass or less, more preferably 10% by mass or less, and may be 0.1% by mass or more, based on the total amount of the sericin-containing powder. However, it is particularly preferred that the sericin-containing powder does not contain any other components.
２． セリシン含有粉末の製造方法
従来、セリシンは、繭、該繭を構成する繭糸や生糸に対して、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素分解等の加水分解法により加水分解し、溶出して得られていた。しかしながら、本発明のセリシン含有粉末の製造方法では、加水分解法を経ずに、有機溶媒を用いて、繭、繭糸、生糸等からセリシンを抽出する。そして、抽出液にｐＨ５．０以下の酸性水溶液を添加してセリシン含有ゲルを形成し、得られたゲルを乾燥することにより、セリシン含有粉末を得る。よって、本発明の製造方法により得られるセリシン含有粉末は、加水分解されていないセリシンを含有する。なお、セリシン含有粉末には、高分子量のセリシン（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲にバンドを有するセリシン）が含有されるならば、前記抽出の際に加水分解されたセリシンが含まれることになってもよい。また、セリシン含有粉末は、フィブロインを含んでいてもよい。本発明の製造方法により得られるセリシン含有粉末は、酸を含有し、分散性に優れる。
2. Method for Producing Sericin-Containing Powder Conventionally, sericin has been obtained by hydrolyzing and eluting cocoons, cocoon filaments, and raw silk from the cocoons using hydrolysis methods such as acid hydrolysis, alkaline hydrolysis, and enzymatic degradation. However, in the method for producing a sericin-containing powder of the present invention, sericin is extracted from cocoons, cocoon filaments, raw silk, etc. using an organic solvent without hydrolysis. An acidic aqueous solution having a pH of 5.0 or less is then added to the extract to form a sericin-containing gel, and the resulting gel is dried to obtain a sericin-containing powder. Therefore, the sericin-containing powder obtained by the method for producing a sericin-containing powder of the present invention contains unhydrolyzed sericin. Note that, as long as the sericin-containing powder contains high-molecular-weight sericin (sericin having a band in the range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more by SDS-PAGE), it may also contain sericin hydrolyzed during the extraction. Furthermore, the sericin-containing powder may also contain fibroin. The sericin-containing powder obtained by the method for producing a sericin-containing powder of the present invention contains an acid and has excellent dispersibility.
２．１ 抽出工程
本発明の製造方法は、繭、繭糸又は生糸から、抽出溶媒として有機溶媒を用いてセリシンを抽出する工程を含む。
2.1 Extraction Step The production method of the present invention includes a step of extracting sericin from cocoons, cocoon filaments, or raw silk using an organic solvent as an extraction solvent.
セリシン抽出に用いる繭、繭糸及び生糸は、蚕等の絹糸虫類から産生されたものであれば特に限定されず、クワコ、ウスバクワコといったカイコガ科の野蚕、テンサン（天蚕）、サクサン（柞蚕）、タサールサンといったヤママユガ科の野蚕、ミツバチ、スズメバチ、クモ、トビケラ等の昆虫から産生された絹糸を用いてもよく、産地も特に限定されない。また、蚕としては、天然のものであっても、突然変異や品種改良、遺伝子操作を行ったものであってもよい。例えば、高分子量のセリシンを効率よく抽出できる傾向にあることから、フィブロインの産生能が劣る蚕を用いることができ、具体的には、突然変異や品種改良によりフィブロインの産生能が低下した蚕（例えば、セリシンホープ（セリシンＣ）、セリシンＮ、Ｎｄ蚕、Ｎｄ－ｓ蚕、ＭＮＳ３００、ＭＣＳ３００等）を用いることができる。 The cocoons, cocoon filaments, and raw silk used for sericin extraction are not particularly limited as long as they are produced by silkworms or other silkworms. These include wild silkworms of the Bombyx mori family, such as the mulberry silkworm and the mulberry silkworm; wild silkworms of the Saturniidae family, such as the wild silkworm, the tussah silkworm, and the tasar silkworm; and silk produced by insects such as honeybees, hornets, spiders, and caddisflies, and there are no particular limitations on the place of origin. Silkworms may be natural or may be those that have undergone mutation, selective breeding, or genetic manipulation. For example, because high-molecular-weight sericin tends to be extracted efficiently, silkworms with poor fibroin production ability can be used; specifically, silkworms with reduced fibroin production ability due to mutation or breeding (e.g., Sericin Hope (sericin C), sericin N, Nd silkworms, Nd-s silkworms, MNS300, MCS300, etc.) can be used.
蚕の繭は、蚕の幼虫が蛹化の際に絹糸腺内の絹タンパクを分泌して作る構造体であり、繭から蛹を分離することにより得られる。また、蚕の生糸とは、前記繭から取り出した繭糸（絹繊維）を何本か合一させて糸状にすることにより得られる。 Silkworm cocoons are structures created by silkworm larvae secreting silk proteins from their silk glands during pupation, and are obtained by separating the pupae from the cocoons. Raw silk from silkworms is obtained by combining several silk threads (silk fibers) extracted from the cocoons to form a thread.
繭はそのままの状態で用いてもよく、裁断や破砕、乾燥等の加工した繭を用いてもよい。 Cocoons may be used as they are, or they may be processed by cutting, crushing, drying, etc.
有機溶媒としては、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、炭化水素系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、ハロゲン系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒が挙げられ、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒が好ましく、スルホキシド系溶媒がより好ましく、ジメチルスルホキシドがさらに好ましい。
これらの有機溶媒は、単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
Examples of the organic solvent include ether-based solvents, ester-based solvents, hydrocarbon-based solvents, ketone-based solvents, nitrile-based solvents, halogen-based solvents, amide-based solvents, and sulfoxide-based solvents. Amide-based solvents such as dimethylformamide and dimethylacetamide, and sulfoxide-based solvents such as dimethyl sulfoxide and diethyl sulfoxide are preferred, sulfoxide-based solvents are more preferred, and dimethyl sulfoxide is even more preferred.
These organic solvents may be used alone or in combination of two or more.
有機溶媒の使用量は、繭、繭糸や生糸等に対して、５質量倍以上５０質量倍以下が好ましく、１０質量倍以上４０質量倍以下がより好ましい。 The amount of organic solvent used is preferably 5 to 50 times by weight, and more preferably 10 to 40 times by weight, relative to the amount of cocoons, cocoon filaments, raw silk, etc.
有機溶媒は、無機塩を含むことが好ましく、アルカリ金属ハロゲン化物及び／又はアルカリ土類金属ハロゲン化物を含むことがより好ましい。アルカリ金属ハロゲン化物としては、ハロゲン化リチウム、ハロゲン化ナトリウム、ハロゲン化カリウム等が挙げられ、アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、ハロゲン化カルシウム、ハロゲン化ストロンチウム、ハロゲン化バリウムが挙げられる。無機塩としては、塩化リチウム、臭化リチウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、塩化カルシウム、臭化カルシウムが好ましく、塩化カルシウムがより好ましい。
これらの無機塩は、単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。
The organic solvent preferably contains an inorganic salt, more preferably an alkali metal halide and/or an alkaline earth metal halide. Examples of the alkali metal halide include lithium halide, sodium halide, and potassium halide, and examples of the alkaline earth metal halide include calcium halide, strontium halide, and barium halide. Examples of the inorganic salt include lithium chloride, lithium bromide, sodium chloride, sodium bromide, potassium chloride, potassium bromide, calcium chloride, and calcium bromide, and calcium chloride is more preferred.
These inorganic salts may be used alone or in combination of two or more.
有機溶媒中における無機塩の合計濃度は、０．３ｍｏｌ／Ｌ以上３．０ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上２．０ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、０．８ｍｏｌ／Ｌ以上１．５ｍｏｌ／Ｌ以下がさらに好ましい。 The total concentration of inorganic salts in the organic solvent is preferably 0.3 mol/L or more and 3.0 mol/L or less, more preferably 0.5 mol/L or more and 2.0 mol/L or less, and even more preferably 0.8 mol/L or more and 1.5 mol/L or less.
抽出温度は、セリシンの加水分解を抑制する観点から、１００℃以下が好ましく、８０℃以下がより好ましく、また抽出効率の観点から、０℃以上が好ましい。 The extraction temperature is preferably 100°C or below, more preferably 80°C or below, from the viewpoint of suppressing hydrolysis of sericin, and is preferably 0°C or above from the viewpoint of extraction efficiency.
抽出時間は、抽出に供する原料等の使用量や装置に応じて適宜設定可能であるが、例えば、４８時間以下が好ましく、２４時間以下がより好ましく、１２時間以下がさらに好ましく、６時間以下がよりさらに好ましく、また抽出効率の観点から、０．５時間以上が好ましい。 The extraction time can be set appropriately depending on the amount of raw materials used and the equipment used for extraction, but is preferably 48 hours or less, more preferably 24 hours or less, even more preferably 12 hours or less, and even more preferably 6 hours or less, and from the standpoint of extraction efficiency, preferably 0.5 hours or more.
抽出液におけるセリシンの濃度は、抽出条件に応じて適宜設定できるが、例えば、０．１質量％以上２０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上１８質量％以下がより好ましく、１．０質量％以上１５質量％以下がさらに好ましい。 The concentration of sericin in the extract can be set appropriately depending on the extraction conditions, but is preferably 0.1% by mass or more and 20% by mass or less, more preferably 0.5% by mass or more and 18% by mass or less, and even more preferably 1.0% by mass or more and 15% by mass or less.
２．２ ゲル取得工程
本発明の製造方法は、抽出工程において得られたセリシン抽出液に、ｐＨ５．０以下の酸性水溶液を混合して、セリシン含有ゲルを形成する工程を含む。
2.2 Gel Obtaining Step The production method of the present invention includes a step of mixing the sericin extract obtained in the extraction step with an acidic aqueous solution having a pH of 5.0 or less to form a sericin-containing gel.
酸性水溶液のｐＨが、５．０以下であることにより、分散性に優れるセリシン含有粉末を製造できる。酸性水溶液のｐＨは、４．０以下が好ましく、３．０以下がより好ましく、２．８以下がさらに好ましく、２．５以下がよりさらに好ましく、下限は特になく、１．０以上であってもよい。 By ensuring that the pH of the acidic aqueous solution is 5.0 or less, a sericin-containing powder with excellent dispersibility can be produced. The pH of the acidic aqueous solution is preferably 4.0 or less, more preferably 3.0 or less, even more preferably 2.8 or less, and even more preferably 2.5 or less. There is no particular lower limit, and the pH may be 1.0 or more.
酸性水溶液は、酸を含み、該酸は有機酸であっても無機酸であってもよい。
有機酸としてはカルボン酸系化合物が好ましく、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸がより好ましい。脂肪族モノカルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等の脂肪族飽和モノカルボン酸、ソルビン酸等の脂肪族不飽和モノカルボン酸が挙げられ、脂肪族飽和モノカルボン酸が好ましく、炭素数１～８の脂肪族飽和モノカルボン酸がより好ましい。脂肪族多価カルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、グルタル酸、アジピン酸、クエン酸等の脂肪族飽和多価カルボン酸、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等の脂肪族不飽和多価カルボン酸が挙げられる。脂肪族多価カルボン酸としては、脂肪族飽和多価カルボン酸が好ましく、炭素数２～１０の脂肪族飽和多価カルボン酸がより好ましく、炭素数２～８の脂肪族飽和多価カルボン酸がさらに好ましく、炭素数２～８の脂肪族飽和オキシ多価カルボン酸がよりさらに好ましく、クエン酸が特に好ましい。
無機酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、臭素酸等が挙げられ、塩酸が好ましい。
酸性水溶液は、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族多価カルボン酸、及び無機酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の酸を含むのが好ましく、脂肪族多価カルボン酸及び／又は無機酸を含むのがより好ましく、クエン酸及び／又は塩酸を含むのがさらに好ましい。
これらの酸は、単独で含まれていてもよく、２種以上が組合されて含まれていてもよい。
The acidic aqueous solution contains an acid, which may be an organic acid or an inorganic acid.
As the organic acid, a carboxylic acid compound is preferred, and an aliphatic monocarboxylic acid or an aliphatic polycarboxylic acid is more preferred. Examples of the aliphatic monocarboxylic acid include saturated aliphatic monocarboxylic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, and valeric acid, and unsaturated aliphatic monocarboxylic acids such as sorbic acid. Aliphatic saturated monocarboxylic acids are preferred, and saturated aliphatic monocarboxylic acids having 1 to 8 carbon atoms are more preferred. Examples of the aliphatic polycarboxylic acids include saturated aliphatic polycarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, glutaric acid, adipic acid, and citric acid, and unsaturated aliphatic polycarboxylic acids such as maleic acid, fumaric acid, citraconic acid, and mesaconic acid. As the aliphatic polycarboxylic acid, saturated aliphatic polycarboxylic acids are preferred, saturated aliphatic polycarboxylic acids having 2 to 10 carbon atoms are more preferred, saturated aliphatic polycarboxylic acids having 2 to 8 carbon atoms are even more preferred, and saturated aliphatic oxypolycarboxylic acids having 2 to 8 carbon atoms are even more preferred, and citric acid is particularly preferred.
Examples of inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, boric acid, and bromic acid, with hydrochloric acid being preferred.
The acidic aqueous solution preferably contains at least one acid selected from the group consisting of aliphatic monocarboxylic acids, aliphatic polycarboxylic acids, and inorganic acids, more preferably contains an aliphatic polycarboxylic acid and/or an inorganic acid, and even more preferably contains citric acid and/or hydrochloric acid.
These acids may be contained alone or in combination of two or more.
酸性水溶液の酸濃度は、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、上限は特にないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。なお、前記酸濃度に酸の塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩、アンモニウム塩等）の濃度は含めない。 The acid concentration of the acidic aqueous solution is preferably 2.0 mmol/L or more, more preferably 5.0 mmol/L or more, and although there is no particular upper limit, it is preferably 1 mol/L or less. Note that the acid concentration does not include the concentration of acid salts (alkali metal salts, alkaline earth metal salts, amine salts, ammonium salts, etc.).
酸性水溶液の使用量は、セリシン抽出液に対して、０．５容量倍以上５０容量倍以下が好ましく、１．０容量倍以上２０容量倍以下がより好ましく、２．０容量倍以上１０容量倍以下がさらに好ましい。酸性水溶液の使用量が前記範囲内であることにより、過度な凝集が生じずに性状が良好なセリシン含有ゲルを得られる。 The amount of the acidic aqueous solution used is preferably 0.5 to 50 times by volume, more preferably 1.0 to 20 times by volume, and even more preferably 2.0 to 10 times by volume, relative to the sericin extract. By using an amount of the acidic aqueous solution within this range, a sericin-containing gel with good properties can be obtained without excessive aggregation.
セリシン抽出液に酸性水溶液を添加した後、ボルテックスミキサーを用いる等の公知の方法で混合し、混合液を得る。該混合液を、室温又は冷却下(例えば、１～１０℃)で、例えば１時間～３日間、静置することによりゲル形成を進める。 After adding the acidic aqueous solution to the sericin extract, the mixture is mixed using a known method, such as a vortex mixer, to obtain a mixture. Gel formation is allowed to proceed by leaving the mixture at room temperature or under cooling (e.g., 1 to 10°C) for, for example, 1 hour to 3 days.
得られるセリシン含有ゲルは、セリシンが過度に凝集することなく、良好な軟性を有するゲルであることが好ましい。 The resulting sericin-containing gel preferably has good softness and does not cause excessive aggregation of sericin.
セリシン含有ゲルは、ろ過や遠心分離処理をすることにより混合液から取り出してもよい。遠心分離の条件は、遠心によりゲルが沈殿し、デカンテーションによりゲルと液体を分離できる限り特に限定されないが、例えば、５～４０℃、２，０００～２０，０００×ｇ、１～３０分間の範囲内が好ましい。 The sericin-containing gel may be extracted from the mixture by filtration or centrifugation. The centrifugation conditions are not particularly limited as long as the gel precipitates and the gel can be separated from the liquid by decantation. However, preferable conditions are, for example, 5 to 40°C, 2,000 to 20,000 x g, and 1 to 30 minutes.
２．３ 洗浄工程
本発明の製造方法は、ゲル取得工程の後であって、乾燥工程の前に、得られたゲルを酸性水溶液（以下、洗浄液とも称する）で洗浄する工程を含むのが好ましい。
セリシン含有ゲルを洗浄することにより、抽出工程において用いた有機溶媒、及び必要により用いた無機塩を除去することができる。
2.3 Washing Step The production method of the present invention preferably includes a step of washing the obtained gel with an acidic aqueous solution (hereinafter also referred to as a washing liquid) after the gel obtaining step and before the drying step.
By washing the sericin-containing gel, the organic solvent used in the extraction step and, if necessary, the inorganic salt used can be removed.
洗浄液は酸を含み、該酸としては前記ゲル取得工程に用いる酸性水溶液が含む酸と同様の酸が挙げられ、その好ましい態様も同様である。 The cleaning solution contains an acid, and examples of the acid include the same acids as those contained in the acidic aqueous solution used in the gel obtaining step, and the preferred embodiments are also the same.
洗浄液のｐＨは、５．０以下が好ましく、４．０以下がより好ましく、３．０以下がさらに好ましく、２．８以下がよりさらに好ましく、２．５以下が特に好ましく、下限は特になく、１．０以上であってもよい。 The pH of the cleaning solution is preferably 5.0 or less, more preferably 4.0 or less, even more preferably 3.0 or less, even more preferably 2.8 or less, and particularly preferably 2.5 or less; there is no lower limit, and it may be 1.0 or more.
洗浄液の酸濃度は、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましく、上限は特にないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。なお、前記酸濃度に酸の塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩、アンモニウム塩等）の濃度は含めない。 The acid concentration of the cleaning solution is preferably 1.0 mmol/L or more, more preferably 2.0 mmol/L or more, and even more preferably 5.0 mmol/L or more. There is no particular upper limit, but it is preferably 1 mol/L or less. Note that the acid concentration does not include the concentration of acid salts (alkali metal salts, alkaline earth metal salts, amine salts, ammonium salts, etc.).
洗浄液は、ゲル取得工程に用いる酸性水溶液と同じ酸を含んでいてもよく、またｐＨ及び酸濃度もゲル取得工程に用いる酸性水溶液と同じであってもよい。洗浄液は、ゲル取得工程に用いる酸性水溶液と同じ酸を含んでいることが好ましい。 The cleaning solution may contain the same acid as the acidic aqueous solution used in the gel obtaining process, and may also have the same pH and acid concentration as the acidic aqueous solution used in the gel obtaining process. It is preferable that the cleaning solution contain the same acid as the acidic aqueous solution used in the gel obtaining process.
洗浄液の使用量は、ゲル取得工程で用いたセリシン抽出液に対して、０．５容量倍以上５０容量倍以下が好ましく、１．０容量倍以上２０容量倍以下がより好ましく、２．０容量倍以上１０容量倍以下がさらに好ましい。 The amount of washing solution used is preferably 0.5 to 50 times by volume, more preferably 1.0 to 20 times by volume, and even more preferably 2.0 to 10 times by volume, relative to the sericin extract used in the gel extraction process.
洗浄処理は、セリシン含有ゲルに洗浄液を添加後、ボルテックスミキサーを用いる等の公知の方法で混合し、遠心分離後デカンテーションすることにより行う。遠心分離の条件としては、遠心によりゲルが沈殿し、デカンテーションによりゲルと液体を分離できる限り特に限定されないが、例えば、５～４０℃、２，０００～２０，０００×ｇ、１～３０分間の範囲内が好ましい。 The washing process is carried out by adding the washing solution to the sericin-containing gel, mixing using a known method such as a vortex mixer, and then centrifuging and decanting. The centrifugation conditions are not particularly limited as long as the gel is precipitated by centrifugation and the gel can be separated from the liquid by decantation. However, preferable conditions are, for example, 5 to 40°C, 2,000 to 20,000 x g, and 1 to 30 minutes.
洗浄回数は、不要物（特に、必要により用いる無機塩）を除去できれば特に限定されないが、例えば、１～１０回が好ましく、３～６回がより好ましい。洗浄を複数回行う場合、１種の洗浄液で洗浄してもよく、２種以上の洗浄液を組合せて洗浄してもよい。 The number of washings is not particularly limited as long as it is possible to remove unnecessary substances (especially inorganic salts used as needed), but for example, 1 to 10 times is preferred, and 3 to 6 times is more preferred. When washing is performed multiple times, washing may be performed with one type of washing solution, or two or more types of washing solutions may be combined.
２．４ 乾燥工程
本発明の製造方法は、セリシン含有ゲルを乾燥して粉末化する工程を含む。
2.4 Drying Step The production method of the present invention includes a step of drying the sericin-containing gel to powder.
乾燥方法としては、乾燥により粉末が得られる方法であれば特に限定されないが、例えば、凍結乾燥法、減圧（真空、低真空）乾燥法、噴霧乾燥法等が挙げられ、凍結乾燥法、噴霧乾燥法が好ましく、凍結乾燥法がより好ましい。これらの乾燥方法は、いずれも公知の乾燥装置を用いて行えばよく、乾燥温度や乾燥時間等の乾燥条件は、各乾燥方法に応じて適宜設定すればよい。 The drying method is not particularly limited as long as it can produce a powder by drying, but examples include freeze-drying, reduced pressure (vacuum, low vacuum) drying, and spray-drying. Freeze-drying and spray-drying are preferred, with freeze-drying being more preferred. All of these drying methods can be performed using known drying equipment, and drying conditions such as drying temperature and drying time can be set appropriately for each drying method.
乾燥処理後に得られるセリシン含有粉末は、高分子量のセリシンを含有しながらも、分散性（特に水に対する分散性）に優れる。また好ましくは、上記セリシン含有粉末の特性と同様の特性を有する。 The sericin-containing powder obtained after the drying process contains high-molecular-weight sericin and yet has excellent dispersibility (particularly in water). It also preferably has properties similar to those of the sericin-containing powder described above.
セリシンの収率としては、２０質量％以上が好ましく、２５質量％以上がより好ましく、３０質量％以上がさらに好ましく、また上限は特に限定されずに１００質量％であってもよいが、８５質量％以下であってもよい。なお、セリシンの収率は下記方法で求めることができる。 The yield of sericin is preferably 20% by mass or more, more preferably 25% by mass or more, and even more preferably 30% by mass or more. The upper limit is not particularly limited and may be 100% by mass or 85% by mass or less. The yield of sericin can be determined by the following method.
［セリシン収率測定方法］
まず、セリシン抽出液におけるセリシン濃度を、２８０ｎｍの吸光度から算出し、算出したセリシン濃度からセリシン含有粉末におけるセリシンの質量（抽出により得られたセリシンの質量）を求める。なお、セリシン濃度算出は検量線を作成することにより行う。そして、抽出により得られたセリシンの質量と、セリシンの抽出に使用した繭（又は繭糸或いは生糸）の質量から、下記式にて収率を算出する。
収率（ｗｔ％）＝（抽出により得られたセリシンの質量／セリシンの抽出に使用した繭の質量）×１００
[Method for measuring sericin yield]
First, the sericin concentration in the sericin extract is calculated from the absorbance at 280 nm, and the mass of sericin in the sericin-containing powder (the mass of sericin obtained by extraction) is determined from the calculated sericin concentration. The sericin concentration is calculated by creating a calibration curve. The yield is then calculated using the following formula from the mass of sericin obtained by extraction and the mass of the cocoons (or cocoon filaments or raw silk) used to extract the sericin.
Yield (wt %)=(mass of sericin obtained by extraction/mass of cocoons used for sericin extraction)×100
セリシン含有粉末中の無機塩の合計含有量は、５００ｐｐｍ以下が好ましく、３００ｐｐｍ以下がより好ましく、１００ｐｐｍ以下がさらに好ましく、５０ｐｐｍ以下がよりさらに好ましく、また０ｐｐｍであってもよい。抽出工程において無機塩を用いても、洗浄工程を含むことにより、無機塩の合計含有量を、前記範囲内とすることができる。該含有量が前記範囲内であれば、セリシン含有粉末の保存安定性がさらに向上する。また、セリシン含有粉末を皮膚剤等に適用した際の安全性にも優れる。なお、本発明において特に記載がない限り、「ｐｐｍ」は質量換算で求められる値を意味する。 The total content of inorganic salts in the sericin-containing powder is preferably 500 ppm or less, more preferably 300 ppm or less, even more preferably 100 ppm or less, even more preferably 50 ppm or less, and may even be 0 ppm. Even if inorganic salts are used in the extraction process, the total content of inorganic salts can be kept within the above range by including a washing process. If the content is within the above range, the storage stability of the sericin-containing powder is further improved. In addition, the sericin-containing powder is also highly safe when applied to skin preparations and the like. Unless otherwise specified in this specification, "ppm" refers to a value calculated by mass conversion.
本発明の製造方法は、好ましくは界面活性剤等のタンパク質変性剤を用いる工程を有しないため、得られるセリシン含有粉末は該タンパク質変性剤を含有せず、セリシンの高次構造が変化する恐れがない。 The manufacturing method of the present invention preferably does not include a step using a protein denaturant such as a surfactant, so the resulting sericin-containing powder does not contain such a protein denaturant and there is no risk of the higher-order structure of sericin being altered.
本発明で得られるセリシン含有粉末は、乾燥粉末であるため保存安定性に優れる。具体的には、多様な温度条件（例えば、室温、５０℃）で、１ヶ月間保管後も、セリシンが加水分解等されることなく、高分子量のセリシンを維持している。また、溶液状態で保管する場合には、望まないゲル化が起き、取り扱い性が悪くなる恐れがあるところ、乾燥粉末であるため保管中にゲル化が起きる恐れはない。 The sericin-containing powder obtained by the present invention is a dry powder and therefore has excellent storage stability. Specifically, even after storage for one month under various temperature conditions (e.g., room temperature, 50°C), the sericin maintains its high molecular weight without undergoing hydrolysis. Furthermore, while storage in solution can lead to undesired gelation and make handling difficult, the dry powder eliminates the risk of gelation during storage.
本発明のセリシン含有粉末を用いれば、高分子量のセリシンを含有し、且つ分散性が良好であるため、皮膜形成能に優れた分散液（混合液）を得られる。よって、本発明のセリシン含有粉末は、皮膚の保護を促す保湿剤やバリア機能を補う保護剤の有効成分としても好適に利用できる。 By using the sericin-containing powder of the present invention, a dispersion (mixture) with excellent film-forming ability can be obtained because it contains high-molecular-weight sericin and has good dispersibility. Therefore, the sericin-containing powder of the present invention can be suitably used as an active ingredient in moisturizers that promote skin protection and protective agents that supplement the skin's barrier function.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。 The present invention will be explained in more detail below using examples, but the present invention is not limited to the examples below, and it is of course possible to implement the invention with appropriate modifications within the scope of the above and below-described aims, and all such modifications are within the technical scope of the present invention.
実施例及び比較例における測定、評価は、下記の方法にて行った。 Measurements and evaluations in the examples and comparative examples were performed using the following methods.
（１）セリシン含有ゲルの性状
セリシン含有ゲルの性状について、軟性を有する場合を性状良好（○）、凝集して硬い場合を性状不良（×）と判定した。
(1) Properties of sericin-containing gels The properties of sericin-containing gels were evaluated as good (◯) when they were soft, and as poor (×) when they were hard due to aggregation.
（２）セリシンの収率
まず、セリシン抽出液におけるセリシン濃度を、２８０ｎｍの吸光度から算出し、算出したセリシン濃度からセリシン含有粉末におけるセリシンの質量（抽出により得られたセリシンの質量）を求める。なお、セリシン濃度算出は検量線を作成することにより行う。そして、抽出により得られたセリシンの質量と、セリシンの抽出に使用した繭（又は繭糸或いは生糸）の質量から、下記式にて収率を算出する。３回測定を行い、その平均値をサンプルのセリシン収率とする。
収率（ｗｔ％）＝（抽出により得られたセリシンの質量／セリシンの抽出に使用した繭の質量）×１００
(2) Sericin Yield First, the sericin concentration in the sericin extract is calculated from the absorbance at 280 nm, and the mass of sericin in the sericin-containing powder (the mass of sericin obtained by extraction) is determined from the calculated sericin concentration. The sericin concentration is calculated by creating a calibration curve. The yield is then calculated using the following formula from the mass of sericin obtained by extraction and the mass of the cocoons (or cocoon filaments or raw silk) used to extract the sericin. Three measurements are taken, and the average value is used as the sericin yield of the sample.
Yield (wt %)=(mass of sericin obtained by extraction/mass of cocoons used for sericin extraction)×100
（３）セリシン含有粉末の溶解度
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、ワトソン社製、１３９２－２００－ＳＳ－ＣＳ番の２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中、温度６０℃で３０分間加熱する。加熱後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離し、上澄み０．２０ｍＬを回収して得られた水溶液におけるセリシン濃度を、２８０ｎｍの吸光度から算出する。該算出したセリシン濃度から溶解したセリシンの質量を求める。なお、セリシン濃度算出は検量線を作成することにより行う。そして、溶解したセリシンの質量と、はじめに添加したセリシンの質量から、下記式にて溶解率を算出し、該溶解率を用いて溶解度を求める。３回測定を行い、その平均値をサンプルの溶解度とする。
セリシンの溶解率（ｗｔ％）＝（溶解したセリシンの質量／添加したセリシンの質量）×１００
セリシンの溶解度（ｇ／水溶液１００ｇ）＝１００（ｇ）×１（ｗｔ％）×セリシンの溶解率（ｗｔ％）
(3) Solubility of Sericin-Containing Powder: 10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes in a 2.0 mL screw-cap tube (manufactured by Watson, No. 1392-200-SS-CS). After heating, the solution was centrifuged at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes, and 0.20 mL of the supernatant was recovered. The sericin concentration in the resulting aqueous solution was calculated from the absorbance at 280 nm. The mass of dissolved sericin was calculated from the calculated sericin concentration. The sericin concentration was calculated by creating a calibration curve. The dissolution rate was then calculated using the following formula from the mass of dissolved sericin and the mass of sericin initially added, and the solubility was determined using this dissolution rate. Three measurements were performed, and the average value was taken as the solubility of the sample.
Dissolution rate of sericin (wt%)=(mass of dissolved sericin/mass of added sericin)×100
Solubility of sericin (g/100 g of aqueous solution) = 100 (g) × 1 (wt%) × solubility of sericin (wt%)
（４）セリシン含有粉末の分散度、分散性
上記溶解度測定用に上澄み０．２０ｍＬを回収した残りをボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間）後、０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射する。超音波処理後、チューブを垂直に立ててチューブ内の液部の高さＨと高濃度部の高さｈとを求め、下記式に従って分散度（％）を算出する。２回測定を行い、その平均値をサンプルの分散度とする。分散度測定におけるＨ、ｈについて図１に示す。
分散度（％）＝ｈ／Ｈ×１００
なお、高濃度部とは、上清み部分に比べて濃く白濁している部分であり、上清み部分と高濃度部分との間に界面が形成されるため、その高さを求めることができる。液部が全体的に一様であって界面が観察されないときは、分散度１００％である。界面が水平でない場合、例えば部分的に盛り上がるなどして不均一になる場合は、最も低い箇所でｈを決定する。
(4) Dispersibility and dispersibility of sericin-containing powder: 0.20 mL of the supernatant was collected for the solubility measurement, and the remainder was mixed in a vortex mixer (approximately 2700 rpm, 5 seconds), then ultrasonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonic treatment device (Sonic Tech, ST805, 42 kHz, 35 W) containing 0.5 L of water. After ultrasonic treatment, the tube was placed vertically, and the height H of the liquid portion and the height h of the high-concentration portion in the tube were determined, and the dispersibility (%) was calculated according to the following formula. Two measurements were performed, and the average value was used as the dispersibility of the sample. H and h in the dispersibility measurement are shown in Figure 1.
Dispersity (%) = h/H x 100
The high-concentration portion is a portion that is thicker and cloudier than the supernatant portion, and an interface is formed between the supernatant portion and the high-concentration portion, so its height can be determined. When the liquid portion is uniform overall and no interface is observed, the degree of dispersion is 100%. When the interface is not horizontal, for example, when it is uneven due to partial swelling, h is determined at the lowest point.
セリシン含有粉末の分散性について、分散度が５０％以上１００％以下を非常に良好（◎）、３３％以上５０％未満を良好（○）、３３％未満を不良（×）と判定した。 Regarding the dispersibility of sericin-containing powders, a degree of dispersion of 50% or more and 100% or less was judged as very good (◎), 33% or more and less than 50% as good (○), and less than 33% as poor (×).
（５）セリシン含有粉末の１．０質量％水分散液でのｐＨ
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、温度６０℃で３０分間加熱する。０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射した後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離し、上澄み（３００μＬ）のｐＨをｐＨ計（株式会社堀場製作所製、ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｂ－７１２）で測定する。２回測定を行い、その平均値をサンプルのｐＨとする。
(5) pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion of sericin-containing powder
10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes. The mixture was sonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonicator (ST805, 42 kHz, 35 W, manufactured by Sonic Tech Co., Ltd.) containing 0.5 L of water, followed by centrifugation at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes. The pH of the supernatant (300 μL) was measured using a pH meter (LAQUAtwin B-712, manufactured by Horiba, Ltd.). Two measurements were taken, and the average value was used as the pH of the sample.
（６）セリシンの分子量
セリシン含有粉末２～３ｍｇを量り取り、粉末中のセリシン重量に対して１００倍量の８Ｍ ＬｉＢｒ水溶液を加え、温度３５℃で２時間溶解する。該溶液を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分子量を測定する。なお、ゲルにはマルチゲルＩＩミニ グラジェントゲル２－１５％ １７ウェル（コスモ・バイオ株式会社製）を用い、分子量マーカーにはプレシジョン Ｐｌｕｓ プロテインTM２色スタンダード（ＢＩＯ－ＲＡＤ製、製品番号１６１０３７４）用いた。
(6) Molecular Weight of Sericin: 2-3 mg of sericin-containing powder was weighed out, and an 8 M LiBr aqueous solution was added in an amount 100 times the weight of sericin in the powder, followed by dissolution at 35°C for 2 hours. The resulting solution was used to measure the molecular weight by SDS-PAGE. The gel used was a Multigel II Mini Gradient Gel 2-15% 17-well (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.), and the molecular weight marker was Precision Plus Protein ™ 2-color standard (manufactured by BIO-RAD, product number 1610374).
セリシンの分子量について、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に少なくとも１本のバンドが検出されれば良好（○）、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲にバンドが１本も検出されなければ不良（×）と判定した。 Regarding the molecular weight of sericin, if at least one band was detected in the range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more, it was judged as good (○); if no band was detected in the range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more, it was judged as poor (×).
（７）カルシウムイオン濃度
洗浄液中のカルシウムイオン濃度は、洗浄液の上澄みをコンパクトカルシウムイオンメーター（株式会社堀場製作所製、ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｃａ－１１）を用いて計測する。セリシン含有粉末中のカルシウムイオン濃度は、セリシン含有粉末１０．０ｍｇにイオン交換水１．００ｍＬを加えて温度６０℃で３０分間加熱した分散液について、コンパクトカルシウムイオンメーター（株式会社堀場製作所製、ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｃａ－１１）を用いて計測し、該計測値から算出する。３回測定を行い、その平均値をサンプルのカルシウムイオン濃度とする。
(7) Calcium Ion Concentration The calcium ion concentration in the cleaning solution is measured by measuring the supernatant of the cleaning solution using a compact calcium ion meter (LAQUAtwin Ca-11, manufactured by Horiba, Ltd.). The calcium ion concentration in the sericin-containing powder is calculated from the measured value obtained by adding 1.00 mL of ion-exchanged water to 10.0 mg of sericin-containing powder and heating the mixture at 60°C for 30 minutes using a compact calcium ion meter (LAQUAtwin Ca-11, manufactured by Horiba, Ltd.). The calcium ion concentration is measured three times, and the average value is used as the calcium ion concentration of the sample.
（８）保存安定性
セリシン含有粉末を室温又は５０℃において、２週間又は１ヶ月間保管する。保管後のセリシン含有粉末を用いて、セリシンの分子量を上記に記載の方法で測定する。さらに、保管後のセリシン含有粉末１０ｍｇとイオン交換水１ｍＬとを２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中で混合し、温度６０℃で３０分間分散処理する。分散処理後の試料を凍結乾燥し、セリシン含有粉末を形成し、該セリシン含有粉末を用いて、セリシンの分子量を上記に記載の方法で測定する。
(8) Storage Stability: The sericin-containing powder is stored at room temperature or 50°C for two weeks or one month. The molecular weight of the sericin-containing powder after storage is measured by the method described above. Furthermore, 10 mg of the sericin-containing powder after storage is mixed with 1 mL of ion-exchanged water in a 2.0 mL screw-cap tube and dispersed at 60°C for 30 minutes. The dispersed sample is freeze-dried to form a sericin-containing powder, and the molecular weight of the sericin is measured by the method described above.
保管後においても高分子量のセリシンが保持されていれば（特に、１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲において少なくとも１本のバンドが検出されれば）、保存安定性は良好であると判定した。 If high molecular weight sericin is maintained even after storage (especially if at least one band is detected in the range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more), the storage stability is determined to be good.
（９）皮膜形成能
セリシン含有粉末２０ｍｇをイオン交換水２ｍＬに加え、温度６０℃で３０分間混合し、混合液を得る。該混合液全量を、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ，Ｎｏ．４，ＭＷＣＯ：１２，０００～１４，０００）上に均一に展開し、イオン交換水を含ませたメラミンスポンジ上に一晩静置して、混合液から電解質を除去する。該透析膜を、温度５０℃で２時間乾燥した後、透析膜全体が浸る量のイオン交換水で再膨潤させて形成された皮膜を透析膜から剥離する。
(9) Film-forming ability: 20 mg of sericin-containing powder was added to 2 mL of ion-exchanged water and mixed at 60°C for 30 minutes to obtain a mixed solution. The entire mixed solution was uniformly spread on a dialysis membrane (Spectra/Por, No. 4, MWCO: 12,000-14,000) and left overnight on a melamine sponge soaked in ion-exchanged water to remove electrolytes from the mixed solution. The dialysis membrane was dried at 50°C for 2 hours and then re-swelled in ion-exchanged water in an amount that covered the entire dialysis membrane, forming a film that was then peeled off from the dialysis membrane.
亀裂や欠損のない均一な皮膜が形成できれば、皮膜形成能は良好であると判定した。 If a uniform film without cracks or defects could be formed, the film-forming ability was judged to be good.
（実施例１）
フラスコに、品種改良によって作出された蚕から得られるセリシンホープ繭１．５ｇと、１Ｍ ＣａＣｌ2－ＤＭＳＯ溶液を３０ｍＬ仕込み、７０℃で１時間撹拌溶解した。５０ｍＬ遠心チューブに、得られた溶解液（抽出液）２ｍＬと、ｐＨ２．０の１０ｍＭ塩酸１０ｍＬとを入れ、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間×２回）後、冷蔵（４℃）下で一晩静置し、セリシン含有ゲルを形成した。得られたゲルの形状の観察結果を表１に示す。ゲル含有液を、２５℃、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ここに、セリシン含有ゲル取得に使用した酸性水溶液と同一の溶液を１０ｍＬ添加し、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間×２回）後、２５℃、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離し、上清を廃棄する洗浄処理を５回行った。洗浄後のゲルを凍結乾燥し、セリシン含有粉末を得た。
Example 1
A flask was charged with 1.5 g of "Sericin Hope" cocoons obtained from selectively bred silkworms and 30 mL of 1 M CaCl 2 -DMSO solution, which was then stirred and dissolved at 70°C for 1 hour. A 50 mL centrifuge tube was charged with 2 mL of the resulting solution (extract) and 10 mL of 10 mM hydrochloric acid (pH 2.0), mixed with a vortex mixer (approximately 2700 rpm, 5 seconds x 2), and then left to stand overnight in a refrigerator (4°C) to form a sericin-containing gel. The results of observing the shape of the resulting gel are shown in Table 1. The gel-containing solution was centrifuged at 25°C and 9,500 x g for 5 minutes, and the supernatant was discarded. To this solution, 10 mL of the same acidic aqueous solution used to obtain the sericin-containing gel was added, and the mixture was mixed using a vortex mixer (approximately 2700 rpm, 5 seconds x 2 times), followed by centrifugation at 25°C and 9,500 x g for 5 minutes, and the supernatant was discarded. This washing process was repeated five times. The washed gel was freeze-dried to obtain a sericin-containing powder.
（実施例２～１１、比較例１）
使用する酸性水溶液を表１に記載する酸性水溶液に変更する以外は、実施例１と同様にしてセリシン含有粉末を得た。
(Examples 2 to 11, Comparative Example 1)
A sericin-containing powder was obtained in the same manner as in Example 1, except that the acidic aqueous solution used was changed to the acidic aqueous solution shown in Table 1.
実施例１～１１、及び比較例１で得られたセリシン含有粉末を用いて、セリシンの収率及び分子量、セリシン含有粉末の溶解度及び分散度、並びにセリシン含有粉末の１．０質量％水分散液におけるｐＨを測定した。各測定結果を表１に示す。
分散度測定における、分散処理後の溶液の写真を図２、３に示す。図２は実施例３に、図３は比較例１に対応する。
The sericin yield and molecular weight, the solubility and dispersibility of the sericin-containing powder, and the pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion of the sericin-containing powder were measured using the sericin-containing powders obtained in Examples 1 to 11 and Comparative Example 1. The measurement results are shown in Table 1.
Photographs of the solution after dispersion treatment in the dispersion degree measurement are shown in Figures 2 and 3. Figure 2 corresponds to Example 3, and Figure 3 corresponds to Comparative Example 1.
また、実施例１～１１、及び比較例１で得られたセリシン含有粉末を用いての分散度測定における各分散液を凍結乾燥し、セリシン含有粉末を得た。該各セリシン含有粉末を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥでセリシンの分子量を確認した。分散処理後のセリシン含有粉末におけるセリシンの分子量確認結果を表１に示す。 The sericin-containing powders obtained in Examples 1 to 11 and Comparative Example 1 were freeze-dried to obtain sericin-containing powders. The molecular weight of the sericin in each sericin-containing powder was confirmed by SDS-PAGE. The results of confirming the molecular weight of sericin in the sericin-containing powders after dispersion are shown in Table 1.
表１中、クエン酸緩衝液は、具体的にはクエン酸－クエン酸三ナトリウム緩衝液である。 In Table 1, the citrate buffer is specifically a citric acid-trisodium citrate buffer.
表１に示されるように、実施例１～１１で得られたセリシン含有粉末は、高分子量のセリシンを含有し、且つ分散度が高く、分散性に優れるものであった。また、分散処理後であっても高分子量のセリシンを維持していた。 As shown in Table 1, the sericin-containing powders obtained in Examples 1 to 11 contained high-molecular-weight sericin and had high dispersibility. Furthermore, the high-molecular-weight sericin was maintained even after the dispersion treatment.
（実施例１２）
フラスコに、品種改良によって作出された蚕から得られるセリシンホープ繭１．５ｇと、１Ｍ ＣａＣｌ2－ＤＭＳＯ溶液を３０ｍＬ仕込み、７０℃で１時間撹拌溶解した。５００ｍＬ遠心チューブに、得られた溶解液（抽出液）２０ｍＬと、ｐＨ２．７の１０ｍＭクエン酸水溶液を１００ｍＬとを入れ、温度５０～６０℃で保温しながら混合後、冷蔵（４℃）下で一晩静置し、セリシン含有ゲルを形成した。ゲル含有液を、４℃、９，５００×ｇの加速度で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ここに、セリシン含有ゲル取得に使用した酸性水溶液と同一の溶液を１００ｍＬ添加し混合後、４℃、９，５００×ｇの加速度で１０分間遠心分離し、上清を廃棄する洗浄処理を５回行った。洗浄後のゲルを凍結乾燥し、セリシン含有粉末を得た。得られたセリシン含有粉末を用いて、セリシンの収率及び分子量、セリシン含有粉末の溶解度及び分散度、並びにセリシン含有粉末の１．０質量％水分散液におけるｐＨを測定した。各測定結果を表２に示す。また、得られたセリシン含有粉末中のカルシウムイオン濃度、及び洗浄処理での上清中のカルシウムイオン濃度を測定した。測定結果を表３に示す。
Example 12
A flask was charged with 1.5 g of "Sericin Hope" cocoons obtained from selectively bred silkworms and 30 mL of 1 M CaCl 2 -DMSO solution, followed by stirring and dissolution at 70°C for 1 hour. A 500 mL centrifuge tube was charged with 20 mL of the resulting solution (extract) and 100 mL of 10 mM citric acid solution (pH 2.7). The mixture was mixed while maintaining the temperature at 50-60°C, and then left overnight in a refrigerator (4°C) to form a sericin-containing gel. The gel-containing solution was centrifuged at 9,500 × g for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was discarded. 100 mL of the same acidic aqueous solution used to obtain the sericin-containing gel was added to the mixture, mixed, and then centrifuged at 9,500 × g for 10 minutes at 4°C, followed by discarding the supernatant. This washing process was repeated five times. The washed gel was then freeze-dried to obtain a sericin-containing powder. The sericin-containing powder thus obtained was used to measure the sericin yield and molecular weight, the solubility and dispersibility of the sericin-containing powder, and the pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion of the sericin-containing powder. The results are shown in Table 2. The calcium ion concentration in the sericin-containing powder thus obtained and in the supernatant after the washing treatment were also measured. The results are shown in Table 3.
表２に示されるように、実施例１２で得られたセリシン含有粉末は、高分子量のセリシンを含有し、且つ分散度が高く、分散性に優れるものであった。
また、表３に示されるように、洗浄工程を含む例では、得られるセリシン含有粉末中の無機塩に由来するアルカリ土類金属の濃度が低かった。つまり、洗浄工程により無機塩の含有量を低減できることがわかった。
As shown in Table 2, the sericin-containing powder obtained in Example 12 contained high-molecular-weight sericin and had a high degree of dispersion and excellent dispersibility.
Furthermore, as shown in Table 3, in the examples that included the washing step, the concentration of alkaline earth metals derived from inorganic salts in the resulting sericin-containing powder was low. In other words, it was found that the content of inorganic salts can be reduced by the washing step.
（実施例１３）
セリシン含有ゲル取得工程における溶解液（抽出液）の使用量を４ｍＬに、酸性水溶液の使用量を２０ｍＬに、洗浄工程における酸性水溶液の使用量を２０ｍＬに変更した以外は実施例５と同様にしてセリシン含有粉末を得た。得られたセリシン含有粉末を用いて、１．０質量％水分散液でのｐＨを測定したところ、ｐＨは２．８であった。また、得られたセリシン含有粉末を用いて、保存安定性及び皮膜形成能を確認した。保存安定性の確認結果を図４に、皮膜形成能の確認結果を図５に示す。図４中、左から順に分子量マーカー、室温で１ヶ月間保存後のセリシン含有粉末（左：分散処理前、右：分散処理後）、５０℃で２週間保存後のセリシン含有粉末（左：分散処理前、右：分散処理後）、５０℃で１ヶ月間保存後のセリシン含有粉末（左：分散処理前、右：分散処理後）、分子量マーカーに対応する。
Example 13
A sericin-containing powder was obtained in the same manner as in Example 5, except that the amount of dissolving solution (extraction solution) used in the sericin-containing gel preparation step was 4 mL, the amount of acidic aqueous solution used was 20 mL, and the amount of acidic aqueous solution used in the washing step was 20 mL. The pH of a 1.0% by mass aqueous dispersion of the resulting sericin-containing powder was measured and found to be 2.8. Furthermore, the storage stability and film-forming ability of the resulting sericin-containing powder were confirmed. The results of the storage stability confirmation are shown in Figure 4 , and the results of the film-forming ability confirmation are shown in Figure 5 . In Figure 4 , from left to right, the molecular weight marker corresponds to the sericin-containing powder after storage at room temperature for one month (left: before dispersion treatment, right: after dispersion treatment), the sericin-containing powder after storage at 50°C for two weeks (left: before dispersion treatment, right: after dispersion treatment), the sericin-containing powder after storage at 50°C for one month (left: before dispersion treatment, right: after dispersion treatment), and the molecular weight marker.
図４に示されるように、実施例１３で得られたセリシン含有粉末は、長期保存後であっても含有されるセリシンの加水分解等が起こらず、高分子量のセリシンが維持されており、保存安定性が高かった。また、長期保存後のセリシン含有粉末は、分散処理後であっても高分子量のセリシンを維持していた。
図５に示されるように、実施例１３で得られたセリシン含有粉末からは、亀裂や欠損のない均一且つ取り扱いに十分な強度を有する半透明の皮膜が得られた。よって、本発明のセリシン含有粉末は、良好な皮膜形成能を有するといえる。
As shown in Figure 4, the sericin-containing powder obtained in Example 13 did not undergo hydrolysis of the sericin even after long-term storage, and the high molecular weight sericin was maintained, demonstrating high storage stability. Furthermore, the sericin-containing powder after long-term storage maintained the high molecular weight sericin even after dispersion treatment.
As shown in Figure 5, a uniform, crack-free, and semi-transparent film with sufficient strength for easy handling was formed from the sericin-containing powder obtained in Example 13. Therefore, it can be said that the sericin-containing powder of the present invention has good film-forming ability.
１ スクリューキャップチューブ
２ 液部
３ 高濃度部
Ｈ 液部の高さ
ｈ 高濃度部の高さ
1 Screw cap tube 2 Liquid section 3 High concentration section H Height of liquid section h Height of high concentration section
Claims (2)
前記セリシン含有粉末は、前記セリシンに酸を加えて乾燥させて得られた粉末であり、
前記セリシンは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に少なくとも１本のバンドが検出されるセリシンであり、
前記酸は、クエン酸及び／又は塩酸であり、
１．０質量％水分散液とした際のｐＨが５．０以下であり、
下記方法で測定した分散度が３３％以上であることを特徴とするセリシン含有粉末。
［分散度測定方法］
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、ワトソン社製、１３９２－２００－ＳＳ－ＣＳ番の２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中、温度６０℃で３０分間加熱する。加熱処理後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離して上澄み０．２０ｍＬを除去し、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間）後、０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射する。超音波処理後、チューブを垂直に立ててチューブ内の液部の高さＨと高濃度部の高さｈとを求め、下記式に従って分散度（％）を算出する。
分散度（％）＝ｈ／Ｈ×１００ A sericin- containing powder containing sericin,
The sericin-containing powder is a powder obtained by adding an acid to the sericin and drying it,
The sericin is sericin in which at least one band is detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more by SDS-PAGE,
the acid is citric acid and/or hydrochloric acid;
The pH of a 1.0 mass% aqueous dispersion is 5.0 or less,
A sericin-containing powder characterized by having a degree of dispersion of 33% or more as measured by the following method .
[Dispersion measurement method]
10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes in a 2.0 mL screw-cap tube (Watson, No. 1392-200-SS-CS). After heat treatment, the mixture was centrifuged at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes, 0.20 mL of supernatant was removed, and the mixture was mixed in a vortex mixer (approximately 2700 rpm for 5 seconds) and then sonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonicator (Sonic Tech, ST805, 42 kHz, 35 W) containing 0.5 L of water. After sonication, the tube was placed vertically to determine the height H of the liquid portion and the height h of the high-concentration portion in the tube. The degree of dispersion (%) was calculated according to the following formula:
Dispersity (%) = h/H x 100
セリシン抽出液にｐＨ５．０以下の酸性水溶液を混合するセリシン含有ゲルの取得工程と、
前記で得られたゲルを粉末化する乾燥工程と、を含むセリシン含有粉末の製造方法であって、
さらに、前記セリシン含有ゲル取得工程の後であって、前記乾燥工程の前に、得られたゲルを酸性水溶液で洗浄する洗浄工程を含み、
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシドであり、
前記有機溶媒が、無機塩を含み、
前記無機塩が、塩化カルシウムであり、
前記セリシン含有ゲル取得工程及び前記洗浄工程における酸性水溶液が、それぞれ、クエン酸及び／又は塩酸を含み、
前記セリシン含有粉末に含有されるセリシンが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により１５０ｋＤａ以上の分子量に対応する範囲に少なくとも１本のバンドが検出されるセリシンであり、
前記セリシン含有粉末が、下記方法で測定した分散度が３３％以上であることを特徴とするセリシン含有粉末の製造方法。
［分散度測定方法］
セリシン含有粉末１０．０ｍｇをメスピペットで正確に計り取られたイオン交換水１．００ｍＬに加え、ワトソン社製、１３９２－２００－ＳＳ－ＣＳ番の２．０ｍＬスクリューキャップチューブ中、温度６０℃で３０分間加熱する。加熱処理後、９，５００×ｇの加速度で５分間遠心分離して上澄み０．２０ｍＬを除去し、ボルテックスミキサーで混合（約２７００ｒｐｍ、５秒間）後、０．５Ｌの水をはった超音波処理装置（ソニックテック社製、ＳＴ８０５、４２ｋＨｚ、３５Ｗ）で室温下、５分間超音波を照射する。超音波処理後、チューブを垂直に立ててチューブ内の液部の高さＨと高濃度部の高さｈとを求め、下記式に従って分散度（％）を算出する。
分散度（％）＝ｈ／Ｈ×１００ an extraction step of obtaining sericin from the cocoons using an organic solvent;
a step of obtaining a sericin-containing gel by mixing the sericin extract with an acidic aqueous solution having a pH of 5.0 or less;
a drying step of powdering the gel obtained as described above,
The method further includes a washing step of washing the obtained gel with an acidic aqueous solution after the sericin-containing gel obtaining step and before the drying step,
the organic solvent is dimethyl sulfoxide,
the organic solvent contains an inorganic salt,
the inorganic salt is calcium chloride,
the acidic aqueous solutions in the sericin-containing gel obtaining step and the washing step each contain citric acid and/or hydrochloric acid;
the sericin contained in the sericin-containing powder is sericin in which at least one band is detected in a range corresponding to a molecular weight of 150 kDa or more by SDS-PAGE;
A method for producing a sericin -containing powder, wherein the sericin-containing powder has a degree of dispersion of 33% or more as measured by the following method .
[Dispersion measurement method]
10.0 mg of sericin-containing powder was added to 1.00 mL of ion-exchanged water accurately measured with a measuring pipette and heated at 60°C for 30 minutes in a 2.0 mL screw-cap tube (Watson, No. 1392-200-SS-CS). After heat treatment, the mixture was centrifuged at an acceleration rate of 9,500 × g for 5 minutes, 0.20 mL of supernatant was removed, and the mixture was mixed in a vortex mixer (approximately 2700 rpm for 5 seconds) and then sonicated for 5 minutes at room temperature using an ultrasonicator (Sonic Tech, ST805, 42 kHz, 35 W) containing 0.5 L of water. After sonication, the tube was placed vertically to determine the height H of the liquid portion and the height h of the high-concentration portion in the tube. The degree of dispersion (%) was calculated according to the following formula:
Dispersity (%) = h/H x 100
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