JP7765971B2 - 哺乳動物発現ベクター - Google Patents

哺乳動物発現ベクター

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Description

本開示の分野
本開示は、哺乳類動物発現ベクターおよびそれらの使用に関する。本発明はまた、ポリペプチドを生産する方法を提供する。
配列表への参照
本出願は、配列表を含む。
背景
背景への以下の導入は、単に本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の先行技術を説明または構成することを認めるものではない。
哺乳動物細胞は、モノクローナル抗体などの治療的または診断的使用のためのタンパク質のバイオプロセシングにおけるワークホースとなってきている。今日、上流のプロセシングにおいて、哺乳動物細胞発現システムは、最も有力な生産ツールである。血清フリーおよびタンパク質フリーの培養培地の開発と組み合わせた所望のグリコシル化パターンは、好適な細胞株および発現ベクターによって特徴付けられるこの発現プラットフォームへの道を開いた。世界的に使用されている、最も一般的に使用されている細胞株は、ＣＨＯである。哺乳動物細胞の栄養要件の改善された理解と組み合わされた大規模での生産は、増大した効率および収量という点で実質的な最適化を導いた。
治療的な使用における治療用タンパク質の用量は、典型的には、数マイクログラムからミリグラムのタンパク質の範囲であるため、効率および収量のさらなる増大が望まれている。さらにまた、製造コストは、達成される発現レベルに部分的に依存する。哺乳動物発現プラットフォームの重要な構成要素は、採用される発現ベクターである。
本開示の概要
本開示は、一般に、哺乳動物ポリペプチドなどのポリペプチドの生産に関するものととらえることができる。提供されるのは、夫々のポリペプチドを発現させるのに好適なベクターである。
第１の側面において、発現ベクターが提供される。発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。発現ベクターは、真核生物の選択マーカーを含む選択カセット、細菌の選択マーカーを含む選択カセット、標的ポリペプチドのための発現カセット、および細菌の複製起点を含む。真核生物の選択マーカーを含む選択カセットは、真核生物の選択マーカーとしてグルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。グルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている。細菌の選択マーカーを含む選択カセットは、細菌の選択マーカーとして、抗生物質に対する耐性を細菌宿主に付与する酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、それは好適なプロモーターに作動可能に連結されている。標的ポリペプチドのための発現カセットは、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位を含む。挿入部位は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている。
いくつかの態様に従って、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの態様に従って、発現ベクターは、ＣＨＯ細胞株またはＮＳ０（非分泌性）骨髄腫細胞株などのマウスまたはハムスター細胞株のためのベクターである。いくつかの態様に従って、発現ベクターは、ＣＨＯ細胞のための発現ベクターである。
ＣＭＶプロモーターは、一般にヒトサイトメガロウイルス前初期である。それは、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐＣＭＶベクターに見出される。
上述のとおり、発現ベクターは、抗生物質に対する耐性を細菌宿主に付与する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、選択カセットを含む。夫々の抗生物質は、いくつかの態様において、アンピシリンである。アンピシリンに対する耐性を細菌宿主に付与する細菌の選択マーカーとしてコードされ得る好適な酵素は、ベータ－ラクタマーゼである。
発現ベクターのいくつかの態様に従って、発現ベクターに含まれる配列によってコードされるグルタミン合成酵素は、配列番号５と９８％以上同一である配列を有し、かつグルタマートおよびアンモニアのグルタミンへのＡＴＰ依存性の変換を触媒することができる。
いくつかの態様に従って、真核生物の選択マーカーを含む選択カセットは、真核生物の選択マーカーとして哺乳動物グルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、グルタミン合成酵素は、配列番号３の配列と少なくとも９０％同一性の核酸配列を有する。
いくつかの態様において、グルタミン合成酵素は、真核生物の選択マーカーとして、ＣＨＯグルタミン合成酵素を含む。いくつかの態様において、グルタミン合成酵素は、配列番号３の配列と少なくとも９６％同一性の核酸配列を有する。
いくつかの態様において、発現ベクターは、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）をさらに含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、真核生物の選択マーカーとして、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、選択カセットをさらに含む。抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素は、いくつかの態様において、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）である。
発現ベクターのいくつかの態様に従って、細菌の複製起点は、ｐＵＣ複製起点である。
いくつかの態様に従って、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２と少なくとも９８％同一性の配列を有し、かつ機能的プロモーターである。いくつかの態様に従って、グルタミン合成酵素は、配列番号３の配列を有するＣＨＯグルタミン合成酵素である。いくつかの態様に従って、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２の配列を含む。いくつかの態様に従って、グルタミン合成酵素は、配列番号３の配列を含むＣＨＯグルタミン合成酵素である。いくつかの態様に従って、夫々のＣＨＯグルタミン合成酵素の、およびそれに作動可能に連結されている３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの配列を含む配列は、配列番号１の配列を有する。いくつかの態様に従って、ＣＭＶプロモーターは、配列番号４の配列を有する。
いくつかの態様に従って、ｐＡシグナルは、シミアンウイルス４０ｐＡシグナルである。シミアンウイルス４０ｐＡシグナルは、いくつかの態様において、初期ｐＡおよび後期ｐＡシグナルであってもよい。
いくつかの態様に従って、アンピシリンに対する耐性を細菌宿主に付与する細菌の選択マーカーは、配列番号６の配列と９５％の同一性を有するベータ－ラクタマーゼである。
第２の側面において、組換え宿主細胞が提供される。宿主細胞は、第１の側面による発現ベクターを含む。
いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ＮＳ０細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、３Ｔ３細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ヒト胚性腎臓２９３細胞である。
第３の側面において、ポリペプチドを生産する方法が提供される。方法は、異種の標的ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で第２の側面による組換え宿主細胞を培養することを含む。第２の側面による組換え宿主細胞は、異種の標的ポリペプチドとしてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位において含まれる、発現ベクターを含む。
第３の側面による方法の典型的な態様において、異種の標的ポリペプチドとしてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターにおよびｐＡシグナルに作動可能に連結されている。
いくつかの態様において、第３の側面による方法は、好適な培地中で、懸濁液として宿主細胞、例としてＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞を維持することを含む。いくつかの態様において、第３の側面による方法は、３３～３８℃の範囲の温度で宿主細胞、例としてＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞を維持することを含む。温度は、実例として、約３７℃が選択されてもよい。
第４の側面において、高レベルでポリペプチドを発現するための、第１の側面による発現ベクターの使用が提供される。
第５の側面において、高レベルでポリペプチドを発現するための、第２の側面による宿主細胞の使用が提供される。
図面の簡単な説明
図１Ａは、ＧＡフラグメント１の親ベクターである、既知のベクターｐｃＤＮＡ ３．１（＋）のベクターマップである。図１Ｂは、ｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳのベクターマップである。 図１Ｃは、ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳのベクターマップである。図１Ｄは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳの線状表示である。
図２Ａは、真核生物の選択マーカーとして、ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されている、ＣＨＯグルタミン合成酵素の配列を含む、配列番号１の配列を表す。図２Ｂは、ＰＧＫプロモーターである配列番号２の配列を表す。 図２Ｃは、真核生物の選択マーカーとしてグルタミン合成酵素をコードするオープンリーディングフレームである、配列番号３の配列を表す。図２Ｄは、ＣＭＶプロモーターの配列である、配列番号４の配列を表す。図２Ｅは、発現増強配列エレメントの配列である、配列番号１４の配列を表す。 図２Ｅは、発現増強配列エレメントの配列である、配列番号１４の配列を表す。
図３は、ｐＭＢＬ ＣＥ－Ｐｕｒｏのベクターマップである。 図４は、ｐＭＢＬ Ｃ－Ｐｕｒｏのベクターマップである。 図５Ａは、ベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳのゲル電気泳動制限分析を表す。 図５Ｂは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳのゲル電気泳動制限分析を表す。図５Ｃは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－Ｐｕｒｏのゲル電気泳動制限分析を表す。 図５Ｄは、ベクターｐＭＢＬ Ｃ－Ｐｕｒｏのゲル電気泳動制限分析を表す。
図６は、本開示によるベクターを使用して発現したモノクローナル抗体の概略を提供する表である。
図７Ａは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳ（ａ）およびベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳ（ｂ）を使用して発現した抗ＣＴＬＡ４抗体Ｂｍａｂ７００の力価を、２つの個別のｐＣＨＯ １．０ベクターにおいて同じ抗ＣＴＬＡ４抗体のＨＣおよびＬＣの共トランスフェクション後の発現（ｃ）、およびＨＣおよびＬＣの両方がクローニングされている単一のｐＣＨＯ １．０ベクターを使用した発現（ｄ）と比較して表す。図７Ｂは、ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳを使用して発現した、５、７、９、１２および１４日目における、４つの異なる抗ＣＤ２０融合抗体の力価を表す。ＨＣおよびＬＣの両方は、ＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ部位においてベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳにクローニングされている。日は、バーの上に示される。一過性トランスフェクションを、共トランスフェクションモードで行った。すべてのトランスフェクションは、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システム（カタログ番号A29133、Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA社製）を使用することにより行い、これは、懸濁適応（suspension adapted）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づく高収量の一過性発現システムである。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システムのマニュアルに従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を解凍した。解凍後最低２回の継代後、トランスフェクションの１日前に３．５×１０６細胞／ｍｌでトランスフェクションのために細胞を播種した。播種後１日目に、細胞カウントを推定し、各トランスフェクションについて新鮮な予め温めておいた培地で希釈することにより、６．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システムのマニュアルに従ってトランスフェクションを行った。ＤＮＡを培養物中１μｇ／ｍｌの最終濃度でトランスフェクトした。Expifectamineおよびフィードを、製造業者のプロトコルに従って添加した。すべてのトランスフェクションについて、最大力価プロトコルに従った。トランスフェクションフラスコを、オービタルシェーカー上で空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃のインキュベーターで培養した。ＶＣＤおよびバイアビリティを０、２、５、７、９、および１２日目に推定した。バイアビリティが５０％を下回ったとき、またはＤ－１２で培養物を収穫した。
図８Ａは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳを使用して一過性に発現させた、抗ＣＤ２０ ＨＣ－Ｃ－ＴＧＦ□ＲＩＩ融合抗体（Ｆｍａｂ２５／１およびＦｍａｂ２５／２）、抗ＣＤ２０ ＬＣ－Ｃ－ＴＧＦ□ＲＩＩ融合抗体（Ｆｍａｂ２６／１およびＦｍａｂ２６／２）、抗ＣＤ２０ ＨＣ－Ｎ－ＴＧＦ□ＲＩＩ融合抗体（Ｆｍａｂ２７／１およびＦｍａｂ２７／２）、およびさらに抗ＣＤ２０ ＬＣ－Ｎ－ＴＧＦ□ＲＩＩ融合抗体（Ｆｍａｂ２８／１およびＦｍａｂ２８／２）を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を、図８Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。図８Ｃは、生産された生成物の力価の時間経過を表す。測定は０日目、２日目、５日目、７日目、９日目、１２日目および１４日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す、ａ＝１２日目、ｂ＝１４日目。 図８Ｄは、１４日目の生産された生成物の収穫力価を示す。収穫力価分析を、１４日目の試料について、ＨＰＬＣ法に基づいて行った。一過性発現の研究を、段落［００３２］に記載されるように行った。
図９Ａは、抗ＣＤ－２０野生型抗体、抗ＣＤ２０ ＨＣ－Ｃ－ＴＧＦβＲＩＩ融合抗体（Ｆｍａｂ２５）、および抗ＣＤ２０ ＴＩＭ３ ＬＣ－Ｃ末端融合抗体（Ｆｍａｂ３０）を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図９Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。成長プロファイルを０日目、２日目、５日目、７日目および９日目にモニタリングした。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。 図９Ｃは、生産された生成物の力価の時間経過を表す。測定を５日目、７日目および９日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。図９Ｄは、９日目の生産された生成物の収穫力価を示す。バーの上の数字は、得られた力価を示す。分析は、ＨＰＬＣに基づいた。
図１０Ａは、抗ＰＤＬ－１抗体を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１０Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。測定は０日目、２日目、５日目、７日目、９日目および１２日目に行った。バーの上の文字は、発現した夫々の抗体鎖を示す：ａ～ｃ：アテゾリズマブ、ｄ～ｆ：抗ＰＤＬ－１抗体。 図１０Ａは、抗ＰＤＬ－１抗体を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１０Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。測定は０日目、２日目、５日目、７日目、９日目および１２日目に行った。バーの上の文字は、発現した夫々の抗体鎖を示す：ａ～ｃ：アテゾリズマブ、ｄ～ｆ：抗ＰＤＬ－１抗体。図１０Ｃは、１４日目の生産された生成物の収穫力価を示す。バーの上の数字は、得られた力価を示す。分析は、ＨＰＬＣに基づいた。
図１１Ａは、さらなる抗ＰＤＬ－１抗体を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１１Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。測定は０日目、５日目、９日目および１２日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。 図１１Ａは、さらなる抗ＰＤＬ－１抗体を発現するＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１１Ｂは、その％での細胞バイアビリティの時間経過を表す。測定は０日目、５日目、９日目および１２日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。図１１Ｃは、生産された生成品の力価の時間経過を表す。測定は９日目および１２日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。図１１Ｄは、１２日目の生産された生成品の収穫力価を示す。バーの上の数字は、得られた力価を示す。分析は、ＨＰＬＣに基づいた。
図１２Ａは、グルタミンの不在における選択相間の、６つのフラスコ中の％でのバイアビリティを示し、図１２Ｂは、その生存細胞密度を表す。フラスコ２Ａ、２Ｂ、３Ａおよび３Ｂは、エレクトロポレーションによりｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳで安定的にトランスフェクトされた種々のＣＨＯ－Ｓ ＧＳノックアウト宿主のＣＨＯ細胞を含有し、フラスコ５および６は、夫々Ｃ１２－１およびＣ＃２６－２についてＤＮＡなしでエレクトロポレーションされたＣＨＯ細胞を含有するモック細胞対照を表す。フラスコ２Ａおよび２Ｂおよびフラスコ３Ａおよび３Ｂは、夫々同じ細胞株の複製フラスコであった。ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳは、ｐ７５ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合ドメインおよびＩｇＧ１のヒトＦｃ部分の融合タンパク質であるエタナセプトをコードした。各０日目は播種する日であった。７／６日目、６日目、３日目、４日目は夫々選択における日であった。
図１３Ａは、エタナセプトを安定的に発現する、図１２ＡおよびＢにおいてと、同じフラスコのＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１３Ｂは、その％での細胞バイアビリティを表す。グルコースを単純なフェドバッチ培養下でフィードとして使用し、データを継代Ｎｏ．５において回収した。図１３Ｃは、生産された生成物の力価の時間経過を表す。測定は５日目、７日目、１０日目および１４日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を示す。 図１３Ｄは、１４日目の生産された生成物の収穫力価を表す。測定は５日目、７日目、１０日目および１４日に行った。力価を、ＨＰＬＣを使用して推計した。
図１４Ａは、エタナセプトを安定的に発現する、図１２Ａ、Ｂおよび図１３においてと、同じプールのＣＨＯ細胞の生存細胞密度の時間経過を表し、図１４Ｂは、その％での細胞バイアビリティを表す。ＣＢ４（Cell Boost-4、Hyclone., GE Healthcare Life Sciences社製）およびＥＦＣ（Efficient feed C、Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA社製）をフェドバッチ培養下でフィードとして使用し、データを継代Ｎｏ．７において回収した。 図１４Ｃは、生産された生成物の力価の時間経過を表す。測定は７日目、および１２日目に行った。バーの上の数字は、培養の夫々の日を表す。図１４Ｄは、１２日目の生産された生成物の収穫力価を表す。
図１５は、データが図１３および図１４に提供される収穫試料のウェスタンブロット分析を表す。フェドバッチ（図１４を参照のこと）および単純なフェドバッチ（図１３を参照のこと）からの精製されていない収穫上清を分析した。
本発明の詳細な説明
本明細書に開示の核酸分子、ベクター、宿主細胞、方法および使用に関する説明がより容易に理解されるために、まず、ある用語を定義する。
定義
別様に述べられない限り、記載および特許請求の範囲を含むこの文書で使用される以下の用語は、以下の所与の定義を有する。
本明細書に使用されるとき、語「約」は、当業者によって決定される具体的な値に対して許容し得る誤差範囲内にある値を指し、これは、値が測定または決定される方法、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣例に従って、１以上の標準偏差内を意味し得る。用語「約」はまた、問題になっている量または値が指定された値またはおよそ同じであるいくつかの他の値であってよいことを示すために使用される。句は、同様の値が本発明に従う同等の結果または効果を促進することを伝えることを意図する。この文脈において、「約」は、１０％までの上および／または下の範囲を指してもよい。語「約」は、いくつかの態様において、５％まで、例えば２％まで、１％まで、または０．５％までである、ある値の上または下にある範囲を指す。一態様において、「約」は、所与の値の０．１％までの上および下の範囲を指す。
用語「本質的に～からなる」は、試料または組成物の特性に影響を与えない、試料または組成物中の追加の構成要素の存在を許容するものと理解される。説明に役立つ例として、医薬組成物は、それが本質的に活性成分からなる場合、賦形剤を含んでいてもよい。
ポリペプチドに関する用語「発現する」および「発現」は、当該技術分野において使用される通常の意味において理解されることが意図される。ポリペプチドは、核酸のｍＲＮＡへの転写、これに続くポリペプチドへの翻訳を介して細胞により発現され、それは折り畳まれ、場合によってはさらにプロセシングされる。夫々の生物学的プロセス自体に関して、用語「発現」、「遺伝子発現」または「発現する」は、遺伝子の核酸配列にコードされた情報を、まずメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に、および次いでタンパク質に変換する調節経路の全体を指す。結果的に、遺伝子の発現は、一次ｈｎＲＮＡへのその転写、このｈｎＲＮＡの成熟ＲＮＡへのプロセシング、およびｍＲＮＡ配列のポリペプチドの対応するアミノ酸配列への翻訳が含まれる。これに関連して、用語「遺伝子産物」は、例として、その遺伝子によってコードされる最終ポリペプチド（そのスプライスバリアントを含む）および夫々の前駆体ポリペプチドを含むポリペプチドのみならず、適用可能であれば遺伝子発現の過程における「第１の遺伝子産物」とみなされ得る夫々のｍＲＮＡも指すことにも留意されたい。
用語「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、プラスミドなどの核酸ビヒクルを指し、これによって、宿主細胞の転写および翻訳機構を使用して、所望の標的ポリペプチドを宿主細胞中で発現させることができる。核酸分子は、夫々の宿主細胞に導入することができ、標的ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されている１以上の調節配列を含む。
免疫グロブリンまたはタンパク質性結合分子などのポリペプチドに関連して「フラグメント」とは、完全長配列よりも短い限り、およびポリペプチドの関心のある機能を発揮することができる限り－免疫グロブリンの場合、所望の標的、例としてＰＤＬ－１などの抗原に特異的に結合できる限り、対応するポリペプチド中存在する任意のアミノ酸配列を意味する。用語「免疫グロブリンフラグメント」は、具体的な分子に対して特異的な結合親和性を示す免疫グロブリンの一部、しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を指す。超可変領域は、ポリペプチド標的に物理的に結合する免疫グロブリンの一部である。
本明細書に使用されるとき、用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖またはそれらの組み合わせなどの、任意の可能な立体配置における任意の核酸を指す。核酸の例は、実例として、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体を使用したまたは核酸化学を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ロックされた核酸分子（ＬＮＡ）、タンパク質核酸分子（ＰＮＡ）、アルキルホスホナートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子、テクトＲＮＡ分子（例として、Liu, B., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077）を含む。ＬＮＡは、Ｃ４’およびＯ２’の間にメチレンブリッジを有する改変ＲＮＡ主鎖を有し、夫々の分子に高い二重鎖安定性およびヌクレアーゼ耐性を提供する。アルキルホスホナートおよびアルキルホスホトリエステル核酸分子は、核酸主鎖のリン酸基のＰ－ＯＨ基を夫々アルキル基およびアルコキシ基に交換することにより、核酸主鎖のリン酸基が中和されているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子と見ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノム由来であっても合成由来であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸は、例として、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのコポリマー、オリゴヌクレオチド等であり得る。夫々の核酸は、非天然のヌクレオチド類似体をさらに含有してもよく、および／またはアフィニティタグまたは標識に連結されていてもよい。
多くのヌクレオチド類似体が知られており、本発明の方法で使用される核酸に使用することができる。ヌクレオチド類似体は、実例として塩基、糖、またはリン酸部分に改変を含有するヌクレオチドである。説明に役立つ例として、ｓｉＲＮＡの２’－ＯＨ残基の２’Ｆ、２’Ｏ－Ｍｅまたは２’Ｈ残基での置換は、夫々のＲＮＡのin vivo安定性を向上させることが知られている。塩基部分の改変は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル、および２－アミノアデニン－９－イルなどの種々のプリンまたはピリミジン塩基、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド塩基の天然または合成の改変であってもよい。他のヌクレオチド類似体は、ユニバーサル塩基として機能する。ユニバーサル塩基の例は、３－ニトロピロール、５－ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は、いずれかの他の塩基と塩基対を形成することが可能である。塩基改変は、しばしば、実例として、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの糖改変と組み合わせて、例えば、増大した二重鎖安定性などのユニークな特性を達成することができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生成物のある最小の長さに限定されない。両方の用語が同時に使用される場合、この二重の命名は、当該技術分野において両方の用語が並んで使用されることを説明するものである。
本明細書に使用されるとき、用語「ポリアデニル化部位」、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、新生ＲＮＡ転写産物の終止およびポリアデニル化の両方を指示することができるＤＮＡ配列などの核酸配列を指す。ポリＡテールを欠く転写産物は大抵不安定で迅速に分解されるため、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化は有利である。本明細書に開示のベクターにおいて利用されるポリＡシグナルは、任意の起源のものであってもよく、また「内在性」であってもよい。内在性ポリＡシグナルは、ゲノム中の所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見いだされるものである。一般的に使用される異種のポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。好適なポリアデニル化配列の例はまた、これらに限定されないが、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ベータ－グロビンポリＡ部位、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼポリＡ部位も含む。
用語「精製された」は、細胞の元の環境と比較した相対的な表示であると理解され、それによって、その細胞が自然環境よりも相対的に純粋であるという表示を表す。したがって、それは、他の細胞（均一な細胞集団など）からの絶対的な純度という意味での絶対値を含むが、それのみを指すものではない。自然のレベルと比較して、細胞を精製した後のレベルは、一般に少なくとも２～５倍大きい（例として、細胞／ｍｌの点で）。例えば、約４または５桁の程度を含む約２または３倍桁などの、少なくとも１桁の程度の精製が明確に企図される。少なくとも本質的に汚染のない、とりわけ他の細胞を含まない、機能的に有意なレベル、例えば約９０％、約９５％、または９９％の純度で細胞を得ることが所望されてもよい。核酸、ペプチドまたはタンパク質に関して、上記が必要な変更を加えて適用される。この場合において、核酸、ペプチドまたはタンパク質の精製は、実例として、一般に少なくとも２～５倍大きい（例として、ｍｇ／ｍｌの点で）。
語「組換え」は、この文書において、その起源、操作、またはその両方によって、自然に関連している核酸分子のすべてまたは一部と関連していない核酸分子を説明するために使用される。一般に、組換え核酸分子は、夫々の野生型生物または細胞において天然に存在しない配列を含む。典型的には、組換え核酸分子は、遺伝子工学によって得られ、大抵、細胞の外で構築される。一般に、組換え核酸分子は、自然に存在する対応する核酸分子の少なくとも一部と実質的に同一および／または実質的に相補的である。組換え核酸分子は、ゲノム、ｃＤＮＡ、哺乳動物、細菌、ウイルス、半合成または合成起源などの、いずれかの起源のものであってもよい。タンパク質／ポリペプチドに関して使用される用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」、「有する」等は、拡大的にまたはオープンエンドでかつ限定せずに読むものとする。「a」、「an」または「the」などの単数形は、文脈において別様に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。よって、例えば、「ベクター」への参照は、単一のベクター、および同じ－例として、同じオペロン－または異なる、いずれかの複数のベクターを含む。同様に、「細胞」への参照は、単一の細胞および複数の細胞を含む。別様に指示されない限り、一連の要素の前にある用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すものと理解される。用語「少なくとも１つ」および「～の少なくとも１つ」は、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の要素を含む。さらにまた、述べられた範囲の上および下のわずかなバリエーションは、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用することができることが理解される。また、別様に指示されない限り、本開示の範囲は、最小値および最大値との間のすべての値を含む連続的な範囲として意図される。
用語のいずれかの使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかになる。この文書を通して使用される選択された用語の特定のさらなる定義は、適用可能である場合、詳細な説明の適切な文脈で与えられる。別様に定義されない限り、説明、図および特許請求の範囲で使用されるすべての他の科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されるそれらの通常の意味を有する。
哺乳動物細胞、とりわけＣＨＯ細胞において高レベルの異種のタンパク質発現を駆動することができるベクター、すなわち環状核酸分子、ならびにそれに基づく方法および使用が提供される。ベクターは、細菌細胞内で複製可能である。
発現ベクターである、本開示によるベクターは、一般に、プロモーター、転写ターミネーター配列、複製起点、選択可能マーカー、ヌクレオチド配列のための挿入部位、および調節エレメントを含む。
プロモーターは、具体的な遺伝子の転写を開始させるＤＮＡの領域である。サイトメガロウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスに由来する哺乳動物発現プロモーターの例である。ＣＭＶプロモーターは、強力なプロモーターであり、その制御下で遺伝子の構成的な発現を駆動するので、それは、哺乳動物細胞で行われる遺伝子操作作業において使用されるベクターにおいて一般的に使用される。プロモーターは、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位に作動可能に連結されている。
転写ターミネーターは、転写プロセスのためにゲノムＤＮＡ中の遺伝子またはオペロンの末端をマークする核酸配列の部分である。このような配列は、転写複合体からｍＲＮＡを放出するプロセスを誘発する新たに合成されたｍＲＮＡ中にシグナル提供することにより、転写終結を媒介する。
転写ターミネーター配列は、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位に作動可能に連結されていてもよい。
複製起点（replication origin）とも称される複製起点（origin of replication）は、複製が開始されるゲノム中の具体的な配列である。ＤＮＡ複製は、典型的には、単一の複製起点から始まる。E. coliにおいて、複製起点はｏｒｉＣと称される。この領域は、E. coliの中で自己複製することができる発現ベクターに含まれ、複数のコピーを形成する。
選択マーカーは、人工的な選択に好適な形質を付与する、細菌などの細胞に導入される遺伝子である。
真核生物の遺伝子の転写は、様々なシスおよびトランスで作用する調節エレメントによって調節されている。最良の特徴的なシスエレメントの２つは、プロモーターおよびエンハンサーである。プロモーター（上記を参照のこと）は、遺伝子のコード配列のすぐ５’の核酸配列であり；それはトランスで作用する転写因子のための複数の結合部位を含み、基礎的な転写装置を形成している。エンハンサーは、一般には、トランス作用する転写因子のための複数の結合部位を含むが、それらは、コード配列のはるか上流または下流、またはイントロン内にさえ見出される。本明細書に開示のベクターのいくつかの態様に含まれるシスエレメントは、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）である。ＥＡＳＥエレメントは、安定した細胞株開発に重要であるベクターの安定性に寄与する。
本明細書に開示のとおり発現ベクターは、３つの別個の発現カセットを含む。第１のカセットは、ベクターを含む真核細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現させるための発現カセットである。この発現カセットは、本明細書において、選択カセットとも称される。第２のカセットは、発現ベクターを含む細菌細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現させるための発現カセットである。この発現カセットは、本明細書において、同様に選択カセットとも称される。第３のカセットは、標的ポリペプチドを発現させるための発現カセットである。この発現カセットは、一般に、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を下流に、かつ発現カセットのプロモーターに作動可能に連結して挿入するための部位を含む。
第３のカセット挿入部位は、典型的には、少なくとも１の制限酵素認識配列を含有する。それは、２以上の制限酵素認識配列を含み、マルチクローニング部位を定義してもよい。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｎｏｔ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｘｈｏ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、ＢａｍＨ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｎｈｅ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、ＥｃｏＲ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、ＥｃｏＲ Ｖ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｐｍｅ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ａｆｌ ＩＩ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｋｐｎ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｘｂａ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、ＢｓｔＸ Ｉ酵素の認識配列を含む。いくつかの態様において、挿入部位は、Ｐｍｅ Ｉ酵素の認識配列を含む。制限酵素認識配列が存在する酵素の１または２のいずれかの酵素を使用する環状ベクターの切断は、適切な末端を有する標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が付着し得る線形ベクターを作成する。
３つの発現カセットは、互いに対して任意の順序でベクター中に配置されていてもよい。いくつかの態様において、真核細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現するための第１の発現カセット、および細菌細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現するための第２の発現カセットは、ベクター中で反対の方向に配置されている。いくつかの態様において、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、ベクター中で同じ方向に配置されている。いくつかの態様において、真核細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現するための第１の発現カセット、および標的ポリペプチドを発現するための第３の発現カセットは、ベクター中で同じ方向に配置されている。いくつかの態様において、第１および第３の発現カセットは、ベクター中で反対の方向に配置されている。いくつかの態様において、細菌細胞の選択を可能にする選択マーカータンパク質を発現するための第２の発現カセットおよび標的ポリペプチドを発現するための第３の発現カセットは、ベクター中で反対の方向に配置されている。いくつかの態様において、第２および第３の発現カセットは、ベクター中に同じ方向に配置されている。
３つの発現カセットの順序および方向の説明に役立つ例を図１Ｂ、１Ｃ、３および４に示す。
本開示によるベクターに存在する真核生物の選択マーカーは、グルタミン合成酵素をコードする核酸配列である。酵素グルタミン合成酵素は、グルタマートおよびアンモニアからのグルタミンの生合成を担当する酵素である。この酵素反応は、哺乳動物細胞におけるグルタミンの唯一の合成の経路を提供する。成長培地中のグルタミンの不在において、ＧＳ酵素は培養中の哺乳動物細胞の生存に不可欠である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株などの哺乳動物細胞株は、外来性グルタミンがなくても生存できるように充分なＧＳを発現する。ＧＳは、安定した細胞株を作成しながら、トランスフェクタントを選択するための最も一般的に使用される選択マーカーである。宿主の内在性ＧＳが不活性化突然変異または欠失により機能しない細胞株では、ベクターを通した外来性ＧＳの補充は、目的のベクターを含有するトランスフェクトされた集団の選択を可能にする。結果として生じる組換え細胞株はグルタミンフリー培地でスクリーニングすることができ、それによって時間を短縮し、高力価クローンを得る確率を高めることができる。
本明細書に開示のベクター上では、酵素グルタミン合成酵素は、ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されている核酸配列によってコードされている。ＰＧＫは、いくつかの態様において、ＰＧＫ－１である。ＰＧＫ－１遺伝子は、解糖系経路の酵素、ハウスキーピング酵素である３－ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする。したがって、それは遍在的に発現される。この遺伝子は、哺乳動物ではＸ染色体上に位置付けられる。雌性の哺乳動物の体細胞では、活性型Ｘ染色体上のＰＧＫ－１対立遺伝子のみが転写され、不活性型Ｘ上の他のＰＧＫ－１対立遺伝子は不活性である。ゆえに、ＰＧＫ－１は、雌性の体細胞または雄性の生殖細胞の不活性型Ｘ染色体上のほとんどの他の遺伝子とともにサイレンシングされている状況を除き、常に発現している。ＰＧＫ－１プロモーターは、よって、ほぼすべての体細胞および生殖細胞タイプにおいて活性であるため、高い構成的レベルで遺伝子発現に使用されている。
いくつかの態様において、ＰＧＫ－１プロモーターは、配列番号２の配列を有する。配列番号２のＰＧＫ－１プロモーターは、例えば、ＷＯ２０１４／２００５５７の表２に表されるベクターに含まれる。それはまた、GenBank受託番号KJ796485.1、２０１４年の８月１６日付のversion 1のクローニングベクターＰＧＫ１ｐ－Ｃｓｙ４－ｐＡ、またはGenBank受託番号KU179219.1、２０１７年１月１７日付のversion 1のクローニングベクターＰＢＤＧＴＶに含まれる。
いくつかの態様において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２の配列と少なくとも９８％同一である配列を有する。説明に役立つ例として、GenBank受託番号AB535097.1、２００９年１２月４日のversion 1の突然変異導入ベクターｐＭｔＫＣＮＱ２ ＤＮＡは、配列番号２の塩基３７１～３８２を欠く位置２９８４～３４９１のＰＧＫプロモーター配列を有する。別の例として、GenBank受託番号LT726831.1、２０１７年２月６日のversion １のベクターｐＲＯＳＡ２６－ＤＶ３の位置６４３５～６９２４におけるｍＰＧＫ１プロモーターは、配列番号２の配列と比べて６つの単一の塩基欠失を有する。いくつかの態様において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２の配列と少なくとも９９％同一である配列を有する。例えば、GenBank受託番号X76683.1、１９９４年２月９日のversion 1のプラスミドベクターｐＨＭ２の位置６５６６～７０５６におけるマウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターは、配列番号２の配列と比べて５つの欠失塩基および１つの置換を有する。さらなる例として、GenBank受託番号KY447298.1、２０１７年２月２２日のversion １のクローニングベクターｐＧＺ－ＤＳＢ－ＣＯの位置４３９５～４８８８におけるＰＧＫ－１プロモーターの相補的な配列は、配列番号２の配列と比べて２つの塩基の欠失を有する。
ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５の配列である。配列は、２００２年６月３日の受託番号AJHYQ下でGenPeptにおいて見出される。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５と９９％以上同一性の配列である。配列は、実例としてSwissProt/UniProt受託番号G3HG36、２０１１年１１月１６日の配列のversion 1、２０１８年５月２３日のエントリーのversion 30の配列によってコードされる配列（それは、GenBank受託番号RLQ66161.1、２０１８年１０月２１日のversion 1の配列によってコードされる配列である）であってもよい。いくつかの態様において、ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、配列番号５と９７％以上同一性の配列である。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５と９６％以上同一性の配列である。説明に役立つ例として、配列は、SwissProt/UniProt受託番号P04773、２００７年１月２３日の配列のversion 4、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 107の配列であってもよい。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５の配列を含む。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５と９９％同一性の配列を含む。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、配列番号５と９９％以上の同一性の配列を含む。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５と９７％以上同一性の配列を含む。ＣＨＯグルタミン合成酵素としてコードされる配列は、いくつかの態様において、配列番号５と９６％以上同一性の配列を含む。一態様において、配列は、SwissProt/UniProt受託番号G3IH33、２０１１年１１月１６日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 22の配列であってもよい。
ＣＨＯグルタミン合成酵素をコードする配列は、いくつかの態様において、配列番号３の配列を有する。配列番号３のＣＨＯグルタミン合成酵素をコードする配列は、例えば、GenBank受託番号X03495.1、１９９３年４月２１日付のversion 1、２０１１年２月４日付で最後にアップデートされたデータベースエントリーのチャイニーズハムスターグルタミン合成酵素をコードするｍＲＮＡの配列において位置１４７～１２６８として含まれる。さらなる例として、配列は、ＷＯ２０１３／１８６３７１において配列番号１０としてまたはＥＰ２ ８２５ ６４１において配列番号１として見出される。
グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子発現システム（Birch J.R. and Racher A. J., Advanced Drug Delivery Reviews 2006; 58:671-685）は、モノクローナル抗体産生において一般的に使用される２つの発現ベクターシステムのうちの１つである。別の一般的な発現システムは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に基づく。ＧＳシステムは、具体的に、組換え細胞の選択のためのグルタマートおよびアンモニウムのグルタミンへの代謝経路に基づいているＣＨＯおよびＮＳ０細胞に有用である。ＣＨＯ細胞は、既に内在性ＧＳを発現する。メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）などの選択的ＧＳインヒビターのグルタミンフリー培養培地への添加は、ＧＳ遺伝子を含有する統合された遺伝子コンストラクトを有する細胞クローンを選択する。
グルタミン合成酵素、例としてＣＨＯグルタミン合成酵素をコードする配列は、いくつかの態様において、配列番号３の配列と少なくとも９７％同一である配列を有する。NCBI受託番号NM_001246770.1、２０１１年１０月９日のversion 1のＣＨＯグルタミン合成酵素の配列は、配列番号３の配列から３９置換された塩基で異なる位置１～１１１６のプロモーター配列を含有する。いくつかの態様において、ＣＨＯグルタミン合成酵素をコードする配列は、配列番号３の配列と少なくとも９２％同一である配列を有する。例として、GenBank受託番号X16314.1、１９９５年４月４日のversion 1のマウスグルタミン合成酵素の配列は、配列番号３の配列と比べて９１塩基置換を有する。ＣＨＯグルタミン合成酵素をコードする配列は、いくつかの態様において、配列番号３と９０％同一性の配列を有する。例として、GenBank受託番号BC051726、２００３年５月１４日のversion 1のヒトグルタミン合成酵素は、配列番号３の配列から１０６置換で異なる位置１３０７～２４２２において配列を有する。さらなる例として、GenBank受託番号AK390323.1、２０１２年１月１１日のversion 1のブタグルタミン合成酵素は、配列番号３の配列から１１６置換で異なる位置２５２～１３６７において配列を有する。
本開示のベクターは、細菌の選択マーカーを含む。このマーカーは、抗生物質に対する耐性を細菌宿主に提供する酵素をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、酵素は、クロラムフェニコールに対するまたはカナマイシンおよびジェネテシンに対する耐性を提供する。いくつかの態様において、酵素は、アンピシリンに対する耐性を提供する。いくつかの態様において、酵素は、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性を提供する。
アンピシリンに対する耐性を細菌宿主に提供する酵素の例は、ベータ－ラクタマーゼである。いくつかの態様において、酵素ベータ－ラクタマーゼは、SwissProt/UniProt受託番号Q79DR3、２００４年７月５日の配列のversion 1、２０１８年１２月５月のエントリーのversion 116のとりわけEscherichia coliのベータ－ラクタマーゼの配列である、配列番号６のアミノ酸配列を有する。配列はまた、SwissProt/UniProt受託番号Q285M4、２００６年４月４日の配列のversion 1、２０１７年５月１０日のエントリーのversion 36の合成ベータ－ラクタマーゼコンストラクトと同一である。いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と９９％以上同一性を有するタンパク質であってもよい。それは、例えば、SwissProt/UniProt受託番号Q799Y1、２００４年７月５日の配列のversion 1、２０１７年５月１０日のエントリーのversion 42のアミノ酸配列を有するプラスミドｐＰＶによってコードされるベータ－ラクタマーゼタンパク質であってもよい。それはまた、SwissProt/UniProt受託番号A0A3A0YVF2、２０１８年１２月５日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 1のアミノ酸配列を有するBordetella aviumからのクラスＡの広域スペクトルのベータ－ラクタマーゼＴＥＭ－１であってもよい。
いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と９８％以上同一性を有するタンパク質であってもよい。それは、例えば、SwissProt/UniProt受託番号R9URM7、２０１３年９月１８日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 19のアミノ酸配列を有するEscherichia coliからのベータ－ラクタマーゼタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と９６％以上同一性を有するタンパク質であってもよい。それは、例えば、SwissProt/UniProt受託番号O33677、１９９８年１月１日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 74のアミノ酸配列を有するSerratia marcescensからのベータ－ラクタマーゼタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と９５％以上同一性を有するタンパク質であってもよい。それは、例えば、SwissProt/UniProt受託番号H9AXM0、２０１２年５月１６日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 29のアミノ酸配列を有するAcinetobacter baumanniiからのベータ－ラクタマーゼタンパク質であってもよい。
いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と４０％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。説明に役立つ例として、SwissProt/UniProt受託番号P9WKD2、２０１４年４月１６日の配列のversion １、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 23の配列を有するMycobacterium tuberculosisのＣＤＣ １５５１株からの酵素ベータ－ラクタマーゼは、３８１アミノ酸の配列を有し、その９３は、配列番号６の配列と同一である。いくつかの態様において、ベータ－ラクタマーゼは、配列番号６の配列と２％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。説明に役立つ例として、SwissProt/UniProt受託番号P05364、１９８８年１１月１日の配列のversion 1、２０１８年１２月５日のエントリーのversion 109の配列を有するEnterobacter cloacaeからの酵素ベータ－ラクタマーゼは、３８１アミノ酸の配列を有し、その５つは、配列番号６の配列と同一である。
本明細書に開示のベクターは、さらにまた、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含む。夫々の酵素は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ）であってもよい。抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素はまた、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｄ）であってもよい。夫々の酵素はまた、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）であってもよい。
いくつかの態様において、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、GenBank受託番号KF955552.1、２０１４年３月３日付のversion 1のクローニングベクターｐＬ１Ｆ－３の塩基３０９４～３９５４の配列であってもよい。この配列は配列番号７であり、例として、米国特許ＵＳ１０，１１３，１７９の配列番号８７のベクターの塩基位置６３９１～７２５１、または同じ特許の配列番号８８のベクターの位置６５６５～７４２５もしくは配列番号２２１の修復ドナーカセットの位置６９７９～７８３９としても見出される。いくつかの態様において、配列は、配列番号７と相補的な配列であり、これは、配列番号８である。いくつかの態様において、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列は、GenBank受託番号MG653169.1、２０１８年５月８日付のversion 1を有するEscherichia coli ＳＲＴ４１株の拡張スペクトルのベータラクタマーゼ（ＴＥＭ）遺伝子の配列であってもよい。両者の配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする。
アンピシリンに対する耐性を細菌宿主に提供する酵素に使用されるプロモーターは、ベータ－ラクタマーゼプロモーター、例えば配列番号９の配列のプロモーターであってもよい。相補的な配列は、配列番号１０の配列である。
ベクターは、発現される標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入部位を含む。挿入部位は、１以上の制限酵素のための制限認識部位を含む。典型的には、ベクターは、ポリリンカーとも称されるマルチクローニング部位を有する。マルチクローニング部位は、複数の制限部位を含有する核酸配列の短いセグメントである。それは、約２０までの制限部位を含んでいてもよい。マルチクローニング部位内の制限部位は、典型的には、ユニークであり、所与のプラスミド内に１回のみ生じる。マルチクローニング部位は、マルチクローニング部位の領域への目的の遺伝子の挿入を可能にする。マルチクローニング部位は、一般に、プロモーターの直後にあり、転写ターミネーターの前で終了する。
挿入部位に含まれていてもよい配列により発現される標的ポリペプチドは、いずれかの所望されるポリペプチドであってもよい。２つの説明に役立つ例は、機能的抗体フラグメントを含む抗体、および酵素である。２つのさらなる説明に役立つ例は、成長因子および血液凝固因子である。
挿入部位は、ＣＭＶプロモーターへ作動可能に連結されている。ＣＭＶプロモーターは、配列番号４の配列のものであってもよい。ＣＭＶプロモーターは、配列番号４と９９％以上同一性を有する配列を有していてもよい。ＣＭＶプロモーターは、例えば、GenBank受託番号AF105229.1、１９９８年１２月１７日時点の配列のversion 1のクローニングベクターｐＨＲ’－ＣＭＶＬａｃＺの位置８１８６～８３８９におけるｈＣＭＶ即時型初期プロモーターの配列を有しているか、または含んでいてもよい。さらなる例として、ＣＭＶプロモーターは、GenBank受託番号EU753858.1、２００９年５月３１日時点の配列のversion 1のレトロウイルスの発現ベクターＬ１４９の位置３６６～５６９におけるＣＲＵ５キメラのＣＭＶプロモーターの配列を有しているか、または含んでいてもよい。ＣＭＶプロモーターは、いくつかの態様において、配列番号４と９８％以上同一性を有する配列を有していてもよい。それは、例えば、GenBank受託番号MH107058.1、２０１８年１０月３０日時点の配列のversion 1の発現ベクターｐＤＥＳＴ１５２の位置８８０６～９００９におけるプロモーターの配列を有しているか、または含んでいてもよい。別の例として、ＣＭＶプロモーターは、GenBank受託番号LT727056.1、２０１７年２月６日時点の配列のversion 1の哺乳動物発現ベクターｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ－Ｅ－ｈＲａｃ１－ＤＮの位置１０５３～１２５６におけるｈＣＭＶ－ＩＥプロモーターの配列を有しているか、または含んでいてもよい。
ベクターは、夫々の制限部位に配列が挿入され得る所望のタンパク質を発現することができるようにするために、制限酵素のための制限認識部位に作動可能に連結されている１以上のさらなるプロモーターを含んでもよい。例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターなどのＴ７バクテリオファージのプロモーターは、ベクター中に含まれていてもよい。配列番号１６の配列は、Ｔ７プロモーターの例である。
ベクターの細菌の複製起点は、所望されるように選択されてもよい。それは、一般に、プラスミド起点である。典型的には、複製起点は、高コピー数の起点である。一態様において、起点は、ｐＭＢ１起点である。細菌の複製起点は、一態様において、高コピー数のｐＵＣ起点である。ｐＵＣ起点は、細菌ベクターにおいて使用される最も一般的な複製起点である。それは、プラスミドｐＢＲ３２２のｐＭＢ１起点に由来するが、起点内の点置換およびＲｏｐ／Ｒｏｍ遺伝子の欠失を含有する。文字「ｐ」は、起点が、環状の、二本鎖ＤＮＡ分子であるプラスミドのものであることを示す。文字「ＵＣ」は、「カリフォルニア大学」を表す。
いくつかの態様において、ベクターは、発現増強配列エレメントをさらに含有する。そのようなエレメントは、ＷＯ１９９７／０２５４２０に開示されている。ＷＯ１９９７／０２５４２０の配列番号ｌの２つの配列、つまりヌクレオチド８６７２～１２２７３、およびＷＯ１９９７／０２５４２０の配列番号１のヌクレオチド１４２９０～１４５０７をライゲーションすることにより形成されるＤＮＡ配列は、発現増強活性を有するとして記載されている、ＷＯ１９９７／０２５４２０の実施例７を参照のこと。ＷＯ１９９７／０２５４２０の配列番号１のヌクレオチド１０１００～１４２９３の配列は、発現増強活性を有するものとして同様に開示された。Aldrich, T.L., et al, Cytotechnology (1998) 28, 1-3, 9-17は、「切断されたＥＡＳＥエレメント」と名付けられたＥＡＳＥエレメントを開示する。夫々のＤＮＡ配列に対応する核酸配列は、本開示の文脈においてＥＡＳＥとして使用されてもよい。
発現増強配列エレメントは、いくつかの態様において、知られているＥＡＳＥの部分であってもよい。ＥＡＳＥは、いくつかの態様において、配列番号１３の配列を含んでいてもよい。配列番号１３の発現増強配列エレメント配列は、実例として、米国特許ＵＳ６，５９６，５１４の配列番号１の位置８６７２～１２２７３においてこの文書に見出され、１４５０７塩基の長さを有する。配列番号１３のＥＡＳＥ配列はまた、実例として、GenBank受託番号AF193761.1、１９９８年１１月８日時点のversion 1のＣＨＯ配列に含まれ、１４４６２塩基の長さを有する。この配列において、配列番号１３のＥＡＳＥ配列は、データベースエントリーの配列の位置８６２７～１２２２８を定義する。いくつかの態様において、ＥＡＳＥは、配列番号１３により定義される。いくつかの態様において、ＥＡＳＥは、配列番号１４により定義される。
ＰＧＫ１プロモーターなどのＰＧＫプロモーター－グルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列へ作動可能に連結されている－を含有するベクターにＥＡＳＥを含めることは、発現カセットの挿入部位にインフレームで挿入された標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の増加を導く。いくつかの態様において、発現は、一過性の発現である。よって、ベクターにＥＡＳＥを含めることは、いくつかの態様において、標的ポリペプチドの一過性の高発現を導く。この点に関し、本発明者らは、安定な統合を促進するＥＡＳＥの能力は、ＥＡＳＥを欠く同じベクターと比較して、ベクターの一過性の遺伝子産生期間の延長状態を導くことを見出した。プラスミドが宿主細胞内に保持され、標的ポリペプチドの発現を引き起こすより長い期間は、より多くの標的ポリペプチドの産生を導くため、産生される標的ポリペプチドの総量が増大する。
本開示による発現ベクターにより発現されてもよい標的ポリペプチドは、例えば、治療用ポリペプチドであってもよい。治療用ポリペプチドの２つの説明に役立つ例は、接着分子およびサイトカインである。治療用ポリペプチドの２つのさらなる説明に役立つ例は、酵素および受容体である。治療用ポリペプチドの別の例は、リンホカインである。抗体軽鎖および／または重鎖は、治療用ポリペプチドのなおさらなる例である。いくつかの態様において、発現ベクターは、ヘテロダイマーのタンパク質の個々のポリペプチド鎖などの２つの標的ポリペプチドを発現するのに適合する。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりベクターは、２つの標的ポリペプチド発現カセットを含有していてもよい。これらの２つの標的ポリペプチド発現カセットは、いくつかの態様において、組成において同一であってもよい。夫々の標的ポリペプチドをコードする配列がベクターに挿入されると、標的ポリペプチド発現カセットは、この場合において、標的ポリペプチドをコードする配列が異なるだけである。いくつかの態様において、２つのかかる標的ポリペプチド発現カセットは、ベクター中にタンデムに配置される。
本明細書に開示のとおりの発現ベクターを採用する方法および使用は、夫々、ポリペプチドが生産される方法および使用であってもよい。かかるポリペプチドは、本明細書において「標的ポリペプチド」とも称される。方法または使用は、標的タンパク質の改善された産出を達成するための方法または使用であってもよい。かかる方法または使用は、本明細書に開示のとおりの発現ベクターを含むＣＨＯまたはＮＳ０宿主細胞などの組換え宿主細胞を培養することを含んでもよい。かかる態様において、発現ベクターは、一般に、標的ポリペプチドをコードする配列を含む。上記で説明されるように、かかる配列は、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位において含まれる。夫々の配列は、典型的には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとインフレームである。いくつかの態様において、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＰＧＫプロモーターおよび選択カセットに含まれるグルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列とインフレームである。
夫々の方法または使用は、バッチにおいてまたはフェドバッチプロセスにおいて宿主細胞を培養することを含んでもよい。夫々の方法または使用はまた、連続的なモードにおいて宿主細胞を培養することを含んでもよい。細胞は、一般に、ポリペプチドの発現を許容または促進する条件下で培養される。夫々の方法または使用は、ポリペプチドを回収することを含んでもよい。
夫々の方法または使用はまた、グルタミン合成酵素をコードする配列を含有する選択カセットの存在に基づいて宿主細胞を選択し、それによってグルタミン合成酵素の発現を導くことを含んでもよい。宿主細胞は、この点に関し、培養培地中でグルタミンの不在において培養してもよい。
全体の方法を含む本開示による方法のいくつものステップは、実例として市販のロボットを使用して、自動的な方法で－また繰り返して、行われてもよい。コンピュータ実行可能命令は、実例として、データ分析を制御してもよく、または夫々の方法において採用される動作の機械的コースを制御してもよい。
本明細書にこれまでに公開された文書の列挙または議論はその文書が技術水準の一部であること、または一般知識であることの承認として、必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）がない場合にも好適に実施することができる。加えて、本明細書で採用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、かかる用語および表現の使用には、示され説明されたおよび記載された特色またはその一部のいずれかの等価物を除外する意図はないが、請求された本発明の範囲内で種々の改変が可能であることは認識される。したがって、本発明は、例示的な態様および任意の特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されたそこに具現化された本発明の改変および変形は、当業者に頼ってもよく、そのような改変および変形は、本発明の範囲内にあるとみなされることは理解されるべきである。
本発明は、本明細書において、広くかつ一般的に説明されている。一般的な開示に該当する、各狭義の種および亜属の群もまた、本発明の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除去する但し書きまたは否定的制限を伴う本発明の一般的説明を含む。
他の態様は、添付の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特色または側面がマーカッシュ群の観点から説明される場合、当業者は、本発明がまたそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも説明されることを認識するであろう。
本発明が容易に理解され、実用化されるように、具体的な態様が、ここで以下の非限定的な例によって説明されるであろう。
例
例は、ベクターｐｃＤＮＡ ３．１（＋）に基づく発現ベクターの生成および使用を例証する。
材料
手順
４つのベクターを組み立てるために、３つのフラグメントを設計し、geneartから合成し、ＧＡフラグメント１：ｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳ、ＧＡフラグメント２：ピューロマイシン遺伝子フラグメント、およびＧＡフラグメント３：ＥＡＳＥと名付けられた。
これらの３つのフラグメントの参照／典拠は以下に与えられる：
ＧＡフラグメント１：ｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳについての典拠
ＧＡフラグメント１の親ベクターであるｐｃＤＮＡ ３．１（＋）のベクターマップを図１Ａに示す。改変は、ベクターＮＴＩ Version 11.5.1を使用して親インハウスベクターに行った。結果として得られるベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳのインハウスベクターマップを図１Ｂに示す。具体的な改変は、上の表に取り込まれる。
ピューロマイシン（ＧＡフラグメント２）の参照：
ピューロマイシン遺伝子カセットは、InvitrogenのｐＣＨＯ１．０ベクターから供給された。ピューロマイシンの遺伝子を配列の５’末端のＳａｌＩ部位および３’末端のＳｍａＩ部位を有するＧＡから合成した。
ＥＡＳＥ（ＧＡフラグメント３）の参照：
ＥＡＳＥフラグメントは、GenBank受託番号AF193761.1－８６７２ｂｐ～１２２７４ｂｐから供給された。配列は、配列の５’末端のＢｇｌＩＩ部位および３’末端のＢａｍＨＩ部位を有するGeneartから取り寄せた。
プロセスワークフロー
３つのフラグメントをgeneartから合成し、夫々の参照は上記表１に与えられる。
以下の表２は、組み立てられたベクターに関する概要を提供する。
ベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳの特徴付け
ベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳをGeneartから得て（ＧＡフラグメント１）、２５μＬの滅菌水に再懸濁し、２００ｎｇ／μＬの最終濃度を得た。
１μＬをＣＣＢ０００２４／ＣＨＥケミカルコンピテントセルに形質転換した。単一のコロニーをストリークし、プラスミド単離のために接種した。終夜培養物を次いでグリセロールストックとして保管した。プラスミドを単離した。
プラスミドストックを制限消化およびこれに続くアガロースゲル電気泳動により分析した。図５Ａは、得られたゲルを表す。
ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳの特徴付け
ＥＡＳＥフラグメントをGeneartから得た（ＧＡフラグメント３）。ＥＡＳＥエレメントをＢｇｌＩＩ部位においてＣＭＶプロモーターの上流にサブクローニングし、それによってベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳを得た。ＥＡＳＥフラグメントを５０μＬの滅菌水に再懸濁し、１００ｎｇ／μＬの最終濃度を得た。
１μＬをＣＣＢ０００２４ケミカルコンピテントセルに形質転換した。
得られた単一のコロニーをストリークし、プラスミドを単離した。ＥＡＳＥフラグメントをＢｇｌＩＩ＋ＢａｍＨＩ部位を使用することによりＧＡフラグメント３から放出させ、ＢｇｌＩＩ部位においてｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳ（ＰＬＢ００８７６）にクローニングした。その結果得られたベクターは、ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳである。
ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳの同一性を制限消化およびこれに続くアガロースゲル電気泳動により分析した。図５Ｂは、得られたゲルを表す。
ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－Ｐｕｒｏの特徴付け
ピューロマイシン遺伝子（ＧＡフラグメント２）をGeneartから得た。ＥＡＳＥエレメントをＢｇｌＩＩ部位においてＣＭＶプロモーターの上流にサブクローニングし、ＧＳ ＯＲＦは、上記のＳｍａＩ／ＳａｌＩ部位においてＣＨＯのためのピューロマイシン選択マーカーで置き換えられている。フラグメントを５０μＬの滅菌水に再懸濁し、１００ｎｇ／μＬの最終濃度を得た。
１μＬをＣＣＢ０００２４ケミカルコンピテントセルに形質転換した。単一のコロニーをストリークし、プラスミドを単離した。
ＧＡフラグメント２からのピューロマイシン遺伝子をＳｍａＩ＋ＳａｌＩ部位においてベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳにクローニングした。その結果得られたベクターは、ベクターｐＭＢＬ ＣＥ－Ｐｕｒｏである。
ベクターＰＭＢＬ ＣＥ－Ｐｕｒｏの同一性を制限消化およびこれに続くアガロースゲル電気泳動により分析した。図５Ｃは、得られたゲルを表す。
ベクターｐＭＢＬ Ｃ－Ｐｕｒｏの特徴付け
ピューロマイシン遺伝子（ＧＡフラグメント２）をGeneartから得た。ＧＳ ＯＲＦは、上記のＳｍａＩ／ＳａｌＩ部位においてＣＨＯためのピューロマイシン選択マーカーで置き換えられている。フラグメントを５０μＬの滅菌水に再懸濁し、１００ｎｇ／μＬの最終濃度を得た。
１μＬをＣＣＢ０００２４／ＣＨＥケミカルコンピテントセルに形質転換した。単一のコロニーをストリークし、プラスミドを単離した。
ピューロマイシンフラグメントをＳｍａＩ＋ＳａｌＩ部位を使用することによりＧＡフラグメント２から放出させ、ＳｍａＩ＋ＳａｌＩ部位においてベクターｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳにクローニングした。その結果得られたベクターは、ｐＭＢＬ Ｃ－Ｐｕｒｏである。
ベクターＰＭＢＬ Ｃ－Ｐｕｒｏの同一性を制限消化およびこれに続くアガロースゲル電気泳動により分析した。図５Ｄは、得られたゲルを表す。
ベクター評価
組み立てられたベクターをＣＨＯベースの細胞株における異種の遺伝子発現を駆動するそれらの能力に基づいてさらに評価した。まず、ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳを評価のために選択した。以下のコンストラクトをｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳにおいて作製した：
実験１：
ＧＦＰをＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ部位においてベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳにクローニングした。このプラスミドは、ｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳを評価するためのトランスフェクション効率対照として作用する。プラスミドを一過性の遺伝子発現により評価した。一過性トランスフェクションを共トランスフェクションモードで行った。すべてのトランスフェクションを、懸濁適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に基づく高収率一過性発現システムである、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システム（カタログ番号A29133、Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA社製）を使用することにより行った。ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を解凍した。解凍後最低２回継代した後、トランスフェクションの１日前に３．５×１０６細胞／ｍｌでトランスフェクションのために細胞を播種した。播種後１日目に細胞カウントを推計し、トランスフェクションごとに新鮮な、予め温めた培地で希釈することにより６．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。トランスフェクションを、ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って行った。ＤＮＡを１μｇ／ｍｌの最終濃度で培養中にトランスフェクトした。Expifectamineおよびフィードを、製造業者のプロトコルに従って添加した。すべてのトランスフェクションにおいて、Max titreプロトコルに従った。トランスフェクションフラスコを、空気中８％ＣＯ２の加湿された雰囲気のインキュベーター中で、オービタルシェーカー上で～３７℃で培養した。ＶＣＤおよびバイアビリティを、０、２、５、７、９、および１２日目に推計した。バイアビリティが５０％未満に低下したときに培養物を収穫した。
実験２：
抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｂｍａｂ７００）の重鎖および軽鎖をＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ部位においてベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳおよびｐＭＢＬ Ｃ－ＧＳにクローニングした。その結果得られるコンストラクトをＢｍａｂ７００－ＳＳＣ／ｐＣＨＯ１．０ Ｍ（ＨＣおよびＬＣは２つの個々のベクターにクローニングされ、共トランスフェクトされた）およびＢｍａｂ７００－ＤＧＣ／ｐＣＨＯ１．０（ＨＣおよびＬＣは単一のベクターにクローニングされた）との比較において評価した。４つのコンストラクトを一過性の遺伝子発現により比較した。
一過性トランスフェクションを共トランスフェクションモードにおいて行った。すべてのトランスフェクションを、懸濁適用ＣＨＯ細胞に基づく高収率一過性発現システムである、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システム（カタログ番号A29133、Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA社製）を使用することにより行った。ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を解凍した。解凍後最低２回継代した後、トランスフェクションの１日前に３．５×１０６細胞／ｍｌでトランスフェクションのために細胞を播種した。播種後１日目に細胞カウントを推計し、トランスフェクションごとに新鮮な、予め温めた培地で希釈することにより６．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。トランスフェクションを、ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って行った。ＤＮＡを１μｇ／ｍｌの最終濃度で培養中にトランスフェクトした。Expifectamineおよびフィードを、製造業者のプロトコルに従って添加した。すべてのトランスフェクションにおいて、Max titreプロトコルに従った。トランスフェクションフラスコを、空気中８％ＣＯ２の加湿された雰囲気のインキュベーター中で、オービタルシェーカー上で～３７℃で培養した。ＶＣＤおよびバイアビリティを、０、２、５、７、９、および１２日目に推計した。培養物を１５日目に収穫し、結果を図７Ａに表す。
培養を１２５ｍｌ容量の振とうフラスコで行い、２５ｍｌのランニング体積を使用した。
結果を図７Ａに表す。
実験３：
抗ＣＤ２０融合ｍａｂｓのＨＣおよびＬＣをＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ部位においてベクターｐＭＢＬ ＣＥ－ＧＳにクローニングした。その結果得られるコンストラクトを一過性の遺伝子発現による力価分析について評価した。一過性トランスフェクションを共トランスフェクションモードにおいて行った。すべてのトランスフェクションを、懸濁適用ＣＨＯ細胞に基づく高収率一過性の発現システムである、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システム（カタログ番号A29133、Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA USA社製）を使用することにより行った。ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞を解凍した。解凍後最低２回継代した後、トランスフェクションの１日前に３．５×１０６細胞／ｍｌでトランスフェクションのために細胞を播種した。播種後１日目に細胞カウントを推計し、トランスフェクションごとに新鮮な、予め温めた培地で希釈することにより６．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。トランスフェクションを、ｅｘｐｉＣＨＯ－Ｓ発現システム取扱説明書に従って行った。ＤＮＡを１μｇ／ｍｌの最終濃度で培養中にトランスフェクトした。Expifectamineおよびフィードを、製造業者のプロトコルに従って添加した。すべてのトランスフェクションにおいて、Max titreプロトコルに従った。トランスフェクションフラスコを、空気中８％ＣＯ２の加湿された雰囲気のインキュベーター中で、オービタルシェーカー上で～３７℃で培養した。ＶＣＤおよびバイアビリティを、０、２、５、７、９、および１２日目に推計した。培養物を１４日目に収穫し、結果を図７Ｂに表す。

Claims (14)

  1. （ａ）真核生物の選択マーカーとして、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている、グルタミン合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、選択カセット；
    （ｂ）細菌の選択マーカーとして、好適なプロモーターに作動可能に連結されている、抗生物質に対する耐性を細菌宿主に付与する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、選択カセット；
    （ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のための挿入部位を含む、標的ポリペプチドのための発現カセット；
    （ｄ）細菌の複製起点；および
    （ｅ）発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）
    を含み、ここで前記ＥＡＳＥは、配列番号１３の配列を含む、
    哺乳動物細胞のための発現ベクター。
  2. 真核生物の選択マーカーとして、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびポリアデニル化（ｐＡ）シグナルに作動可能に連結されている、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、選択カセットをさらに含む、請求項１に記載の発現ベクター。
  3. 抗生物質ピューロマイシンに対する耐性を付与する酵素が、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）である、請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 細菌の選択マーカーが耐性を付与する抗生物質が、アンピシリンであり、アンピシリンに対する耐性を細菌宿主に付与する酵素がベータ－ラクタマーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  5. 細菌の複製起点が、ｐＵＣ複製起点である、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  6. 真核生物の選択マーカーとしてのグルタミン合成酵素が、グルタマートおよびアンモニアのグルタミンへのＡＴＰ依存的な変換を触媒することができるグルタミン合成酵素をコードする配列番号３の配列と少なくとも９０％同一性の配列によってコードされるか、または真核生物の選択マーカーとしてのグルタミン合成酵素が哺乳動物のグルタミン合成酵素である、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  7. グルタミン合成酵素が、配列番号５の配列と少なくとも９６％同一性のアミノ酸配列を有し、かつグルタマートおよびアンモニアのグルタミンへのＡＴＰ依存的な変換を触媒することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  8. ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが、配列番号２の配列と少なくとも９８％同一性の配列を有し、かつ機能的プロモーターであり、および／または真核生物の選択マーカーとしてのグルタミン合成酵素が、グルタマートおよびアンモニアのグルタミンへのＡＴＰ依存的な変換を触媒することができるグルタミン合成酵素をコードする配列番号３の配列と少なくとも９７％同一性を有する配列によってコードされる、ＣＨＯグルタミン合成酵素である、請求項１～７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  9. ｐＡシグナルが、シミアンウイルス４０ｐＡシグナルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、組換えＣＨＯまたはＮＳ０宿主細胞。
  11. 異種の標的ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、請求項１０に記載の組換えＣＨＯまたはＮＳ０宿主細胞を培養することを含み、ここで、標的ポリペプチドのための発現カセットの挿入部位が、異種の標的ポリペプチドとしてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリペプチドを生産する方法。
  12. ポリペプチドが、抗体または抗原に特異的に結合できるそのフラグメントを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 産生されるポリペプチドの総量を増大するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
  14. ポリペプチドが、抗体または抗原に特異的に結合できるそのフラグメントを含む、請求項１３に記載の使用。
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