JP7768971B2

JP7768971B2 - Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株、その構築方法及び使用

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Publication number: JP7768971B2
Application number: JP2023507248A
Authority: JP
Inventors: 孟剛; 趙春光; 魏愛英; 周暁群; 馬風勇; 楊立鵬; 蘇厚波; 賈慧萍; 田斌; 郭小▲うぃ▼
Original assignee: 寧夏伊品生物科技股▲ふん▼有限公司
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2025-11-12
Anticipated expiration: 2041-01-04
Also published as: EP4194545A1; EP4194545A4; WO2022027924A1; US20230323412A1; JP2023536298A; KR20230045051A

Description

本願は２０２０年０８月０７日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号が２０２０１０７９０８６８１の先願の優先権、２０２０年１０月１５日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号が２０２０１１１０５０３５３の先願の優先権、及び２０２０年１０月１３日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号が２０２０１１０９３０８０１の先願の優先権を主張しており、上記先願の全文は引用により本願に組み込まれている。

本発明は遺伝子工学及び微生物の技術分野に属し、具体的には、増強されたＬ－アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属の菌株、その構築方法及び使用である。

Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌などの微生物を用いて発酵することによって、Ｌ－アミノ酸を工業的に生産する。このような微生物として、例えば、自然界から分離された菌株、及びその変異体菌株を使用することができる。

発酵法によるＬ－アミノ酸の生産についての改良は、発酵技術例えば撹拌や酸素供給、栄養培地の組成例えば発酵中の糖濃度、発酵液の適切な形態への加工例えば発酵液の乾燥及び造粒やイオン交換クロマトグラフィー、又は関連微生物自体に固有の性能や性質に関し得る。これらの微生物の性能や性質を改善する方法には、変異誘発、変異体の選択及びスクリーニングが含まれる。このように得られた菌株は代謝拮抗物質に対して耐性を有するか、又は調整的に重要な代謝物に対して栄養要求性であってＬ－アミノ酸を生産する。現在、また、高収率でより経済的なＬ－アミノ酸生産方法の開発が期待される。

本発明はＬ－アミノ酸を生産する組換え菌株、その組換え構築方法、及びアミノ酸の発酵生産におけるその使用を提供する。

本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカムＹＰ９７１５８を出発菌として、そのＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域、及び／又はＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域、及び／又はｐｔｓＳ遺伝子コード領域に部位特異的突然変異及び／又は改善した発現を導入することによって得られる変異遺伝子及び前記遺伝子を含む組換え菌株は、高いＬ－アミノ酸生産能を有し、Ｌ－アミノ酸の生産量を大幅に向上させ、菌株安定性に優れ、Ｌ－アミノ酸生産菌株として生産コストが削減される。

したがって、本発明は以下の技術的解決手段を提供する。

本発明は、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属に属する微生物を提供し、この微生物はＳＥＱＩＤＮＯ：３、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：３５、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善した発現を有する。本発明によれば、前記改善した発現とは、前記ポリヌクレオチドの発現増強、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有すること、又は前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するとともに発現が増強されたことである。

本発明の第１態様によれば、
前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列は遺伝子ＮＣｇｌ１０８９によってコードされるタンパク質である。

前記ポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性のアミノ酸配列をコードしてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明の一実施形態では、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは点突然変異を有することによって、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列の１７０番目のグルタミン酸が異なるアミノ酸で置換される。

本発明によれば、好ましくは１７０番目のグルタミン酸がリジンで置換される。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列において１７０番目のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４に示される。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基が変異したものである。

本発明によれば、前記変異はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基の、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、本発明の前記ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾してもよい。発現調節配列はそれに作動可能に連結された前記ポリヌクレオチドの発現を制御する。前記調節配列は例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどであってもよい。

本発明の一実施形態では、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＮＣｇｌ１０８９遺伝子）のプロモーターである。

本発明はまた、ポリヌクレオチド配列、このポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含有する組換え菌株を提供する。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、１７０番目のグルタミン酸が異なるアミノ酸で置換されたポリヌクレオチドを含む。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列において、１７０番目のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４に示される。

本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列を含有する。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基が変異したものである。

本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基の、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明によれば、前記組換えベクターは前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入することにより構築される。

本発明の一実施形態では、前記プラスミドはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。

本発明の他の実施形態では、前記プラスミドはｐＸＭＪ１９プラスミドである。

具体的には、前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドからＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムにより組換えベクターを構築してもよい。

本発明によれば、前記組換え菌株は前記ポリヌクレオチド配列を含有する。

本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌はＹＰ９７１５８である。

本発明はまた、コリネバクテリウム組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株中のＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される野生型ＮＣｇｌ１０８９のポリヌクレオチド配列を改変し、その５０８番目の塩基を変異させ、変異ＮＣｇｌ１０８９コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップを含む。

本発明の構築方法によれば、前記改変は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。

本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１における５０８番目の塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変異することを意味し、具体的には、前記変異ＮＣｇｌ１０８９コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２に示される。

さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される野生型ＮＣｇｌ１０８９遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、その５０８番目の塩基を変異させ、変異したＮＣｇｌ１０８９遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異したポリヌクレオチド配列とプラスミドからＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムにより組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＮＣｇｌ１０８９コード遺伝子を含むコリネバクテリウム組換え菌株を得るステップ（３）と、を含む。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は点突然変異したＮＣｇｌ１０８９遺伝子の構築であって、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列に基づいて、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子断片を増幅する２対のプライマーであるＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法によって、野生型ＮＣｇｌ１０８９遺伝子ＳＥＱＩＤＮＯ：１に点突然変異を導入し、点突然変異したＮＣｇｌ１０８９遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２を得て、ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}とすることを含む。

本発明の一実施形態では、前記コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムはＡＴＣＣ１３０３２菌株に由来してもよく、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから得られてもよい。

本発明の一実施形態では、前記ステップ（１）において、前記プライマーは以下のとおりである：
Ｐ１：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＣＧＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＧＣＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）。

本発明の一実施形態では、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で４０ｓ伸長する（３０サイクル）ように行われる。

本発明の一実施形態では、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長する（３０サイクル）ように行われる。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築であって、分離精製後のＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}とｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって組み立て、組換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を得ることを含む。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築であって、組換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得ることを含む。

本発明の一実施形態では、前記ステップ（３）の形質転換は電気形質転換法である。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。

本発明の一実施形態では、前記組換えは相同組換えによって実現される。

本発明の第４態様はまた、コリネバクテリウム組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ１０８９遺伝子の上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域、ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子コード領域、及び前記遺伝子のプロモーター領域配列を増幅して、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を導入することで、前記菌株においてＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を過剰発現させるステップを含む。

本発明の一実施形態では、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ７：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ＣＡＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）。

本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１３：５’ＣＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）。

本発明の一実施形態では、前記遺伝子のプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）。

本発明の一実施形態では、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子コード領域を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１１：５’ＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）。

本発明の一実施形態では、前述Ｐ９／Ｐ１２をプライマー、増幅により得られたＮＣｇｌ１０８９遺伝子プロモーター断片とＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}をテンプレートとして増幅し、自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}断片を得る。

本発明の一実施形態では、前述Ｐ７／Ｐ１４をプライマー、増幅により得られた上流相同断片、下流相同断片及び自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}の３つの断片を混合してテンプレートとして増幅し、組み込み相同アーム断片を得る。

本発明の一実施形態では、使用されるＰＣＲシステムは、１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬであり、総体積を５０μＬとする。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ（分）予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓ（秒）アニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いて、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと組み込み相同アーム断片を組み立て、組み込みプラスミドを得る。

本発明の一実施形態では、組み込みプラスミドを宿主菌株にトランスフェクションし、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を導入する。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む菌株である。

本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅して、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を過剰発現させるステップを含む。

本発明の一実施形態では、ＮＣｇｌ１０８９プロモーター断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１９：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）。

本発明の一実施形態では、得られたＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ２１：５’ＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）。

本発明の一実施形態では、前述Ｐ１９／Ｐ２２をプライマー、以増幅により得られたＮＣｇｌ１０８９遺伝子プロモーター断片及びＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}をテンプレートとし、オーバーラップＰＣＲ増幅を行って、自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}断片を得る。

本発明の一実施形態では、前記ＰＣＲシステムは１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬであり、総体積を５０μＬとする。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いて、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}断片とを組み立て、過剰発現プラスミドを得る。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。

本発明で得られた組換え菌株は、単独してＬ－リジンの発酵生産に使用してもよく、Ｌ－リジンを生産する他の細菌と混合して発酵してＬ－リジンを生産してもよい。

本発明はまた、Ｌ－リジンを生産する方法を提供し、この方法は微生物を培養し、培養物からＬ－リジンを得ることを含む。

本発明の第２態様では、
本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されたＬ－アミノ酸を生産する細菌を提供する。本発明はまた、前記微生物を用いてＬ－アミノ酸を生産する方法を提供する。

前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列は遺伝子ＮＣｇｌ０７６１によってコードされるタンパク質である。

前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。

前記細菌は未修飾菌株と比べて増強されたＬ－アミノ酸生産能を有する。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：３３のヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明の一実施形態では、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異により、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列の３１番目のロイシンが異なるアミノ酸で置換される。

本発明によれば、好ましくは３１番目のロイシンがアルギニンで置換される。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５で示されるアミノ酸配列において、３１番目のロイシンがアルギニンで置換されたアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３６に示される。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示されるポリヌクレオチド配列の９２番目の塩基が変異したものである。

本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示されるポリヌクレオチド配列の９２番目の塩基の、チミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）への変異を含む。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３４で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾してもよい。発現調節配列はこれに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは開始コドンの変化を有してもよい。

本発明の一実施形態では、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：３５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＮＣｇｌ０７６１遺伝子）のプロモーターである。

本発明の一実施形態では、前記コリネバクテリウム属の微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９である。

本発明はまた、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含有する組換え菌株を提供する。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、３１番目のロイシンが異なるアミノ酸で置換されたポリヌクレオチドを含む。

本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３５で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示されるポリヌクレオチド配列を含有する。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示されるポリヌクレオチド配列の９２番目の塩基が変異したものである。

本発明の一実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３４で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列を含む。

具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって、前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドを組換えベクターに構築してもよい。

本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌はＡＴＣＣ１３８６９である。

本発明はまた、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株中のＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示される野生型ＮＣｇｌ０７６１のポリヌクレオチド配列を改変し、その９２番目の塩基を変異させ、変異ＮＣｇｌ０７６１コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。

本発明の構築方法によれば、前記変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３の９２番目の塩基がチミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）に変異することを意味し、具体的には、変異ＮＣｇｌ０７６１コード遺伝子を含む前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される。

さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３３で示される野生型ＮＣｇｌ０７６１遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、その９２番目の塩基を変異させ、変異したＮＣｇｌ０７６１遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
前記変異したポリヌクレオチド配列をプラスミドに連結し、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、変異ＮＣｇｌ０７６１コード遺伝子を含む前記組換え菌株を得るステップ（３）と、を含む。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点突然変異したＮＣｇｌ０７６１遺伝子の構築であって、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子断片を増幅する２対のプライマーであるＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を合成し、ＰＣＲ部位特異的変異法によって野生型ＮＣｇｌ０７６１遺伝子ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に点突然変異を導入し、点突然変異したＮＣｇｌ０７６１遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３４を得て、ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒとすることを含む。

本発明の一実施形態では、前記未修飾菌株ゲノムはＡＴＣＣ１３０３２菌株又はＡＴＣＣ１３８６９に由来してもよく、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから得られ得る。

本発明の一実施形態では、前記ステップ（１）において、前記プライマーは以下のとおりである：
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
Ｐ２：５’ＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＣＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）
Ｐ３：５’ＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）。

本発明の一実施形態では、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で４０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の一実施形態では、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で６０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築であって、分離精製後のＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１ＲとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築であって、組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得ることを含む。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＡＴＣＣ１３８６９である。

本発明の第４態様はまた、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ０７６１遺伝子の上下流相同アーム断片、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列、又は、ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅して、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ０７６１及びＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を導入することで、前記菌株においてＮＣｇｌ０７６１及びＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を過剰発現させるステップを含む。

本発明の一実施形態では、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
Ｐ８：５’ＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＣＣＡＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）。

本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１１：５’ＣＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）。

本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するは以下のとおりである：
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
Ｐ１０：５’ＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）。

本発明の一実施形態では、使用されるＰＣＲシステムは、１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬであり、総体積を５０μＬとする。ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で６０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いて、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと上下相同アーム断片、遺伝子コード領域及びプロモーター領域断片とを組み立て、組み込みプラスミドを得る。

本発明の一実施形態では、組み込みプラスミドを宿主菌株にトランスフェクションし、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を導入する。

本発明によれば、前記構築方法は、
ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅して、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入することで、前記菌株でＮＣｇｌ０７６１及びＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を過剰発現させるステップを含む。

本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）。

本発明の一実施形態では、前記ＰＣＲシステムは、１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬであり、総体積を５０μＬとする。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で６０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いて、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自体のプロモータを備えるＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ断片とを組み立て、過剰発現プラスミドを得る。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱＩＤＮＯ：３４で示されるポリヌクレオチド配列を含む菌株である。

本発明で得られた組換え菌株は、単独してＬ－アミノ酸の発酵生産に使用してもよく、Ｌ－アミノ酸を生産する他の細菌と混合して発酵してＬ－アミノ酸を生産してもよい。

本発明はまた、Ｌ－アミノ酸を生産する方法を提供し、この方法は前記細菌を培養し、培養物からＬ－アミノ酸を得ることを含む。

本発明の第３態様では、
本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されたＬ－アミノ酸を生産する細菌を提供する。本発明によれば、前記改善した発現は、前記ポリヌクレオチドの発現増強、又はＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するか、又はＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有するとともに発現が増強されたことである。

前記ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列は遺伝子ｐｔｓＳによってコードされるタンパク質である。

前記細菌は増強されたＬ－アミノ酸生産能を有する。

Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、培地において好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で目的のＬ－アミノ酸を蓄積できる細菌である。

前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。

本発明のいくつかの特定実施形態では、使用されるベクターはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。

本発明の一特定実施形態では、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードする前記ポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６１のヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明の一実施形態では、前記発現改善とは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有することによって、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列の１６２番目のメチオニンが異なるアミノ酸で置換されることを意味する。

本発明によれば、好ましくは１６２番目のメチオニンがスレオニンで置換される。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３で示されるアミノ酸配列において、１６２番目のメチオニンがスレオニンで置換されたアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６４に示される。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基が変異したものである。

本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基の、チミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変異を含む。

本発明の一実施形態では、点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は調節配列に作動可能に連結される。

本発明の一特定実施形態では、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ｐｔｓＳ遺伝子）のプロモーターである。

本発明の一実施形態では、前記コリネバクテリウム属に属する微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９である。本発明によれば、前記細菌は、Ｌ－アミノ酸の生産量の向上に関する他の改良を有してもよい。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は改善した発現を有し、前記改善は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが点突然変異することによって、前記アミノ酸配列の１６２番目のメチオニンが異なるアミノ酸で置換されることを含む。

本発明によれば、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：６３で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列を含有する。

本発明の一実施形態では、本発明による変異後のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基が変異したものである。

本発明の一実施形態では、前記変異後のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記置換後のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６４で示されるアミノ酸配列を含む。

具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって、前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドから組換えベクターを構築してもよい。

本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株中のＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示される野生型ｐｔｓＳのポリヌクレオチド配列を改変し、その４８５番目の塩基を変異させ、変異ｐｔｓＳコード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。

本発明の構築方法によれば、前記改変は変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。

本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６１の４８５番目の塩基がチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）に変異することを意味し、具体的には、変異ｐｔｓＳコード遺伝子を含む前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６２に示される。

さらに、前記構築方法は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示される野生型ｐｔｓＳ遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、その４８５番目の塩基を変異させ、変異したｐｔｓＳ遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
将前記変異したポリヌクレオチド配列とプラスミドを連結し、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
将前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、変異ｐｔｓＳコード遺伝子を含む前記組換え菌株を得るステップ（３）と、を含む。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点突然変異したｐｔｓＳ遺伝子の構築であって、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ｐｔｓＳ遺伝子断片を増幅する２対のプライマーであるＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を合成し、ＰＣＲ部位特異的変異法によって、野生型ｐｔｓＳ遺伝子ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に点突然変異を導入し、点突然変異したｐｔｓＳ遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：６２を得て、ｐｔｓＳ^{Ｔ４８５Ｃ}とすることを含む。

本発明の一実施形態では、前記未修飾菌株ゲノムはＡＴＣＣ１３０３２菌株に由来してもよく、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから得られ得る。

本発明の一実施形態では、前記ステップ（１）において、前記プライマーは以下のとおりである：
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
Ｐ２：５’ＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）
Ｐ３：５’ＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）。

本発明の一実施形態では、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われる。

本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築であって、分離精製後のｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}とｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。

本発明によれば、前記構築方法は、
ｐｔｓＳ遺伝子の上下流相同アーム断片、ｐｔｓＳ遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列、又は、ＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を導入することで、前記菌株においてＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させるステップを含む。

本発明の一実施形態では、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである。
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）
Ｐ８：５’ＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）。

本発明の一実施形態では、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１１：５’ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）。

本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）
Ｐ１０：５’ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）。

本発明の一実施形態では、前述Ｐ７－Ｐ１２をプライマー、増幅により得られた上流相同断片、下流相同断片及び自体のプロモーターを備えるＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}の３つの断片を混合してテンプレートとして増幅し、組み込み相同アーム断片を得る。

本発明の一実施形態では、組み込みプラスミドを宿主菌株にトランスフェクションし、相同組換えによって宿主菌株のゲノムにＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を導入する。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＹＰ９７１５８である。本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含む菌株である。

本発明によれば、前記構築方法は、
ＰｔｓＳ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入することで、前記菌株においてＰｔｓＳ及びＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させるステップをさらに含む。

本発明の一実施形態では、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは以下のとおりである：
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）。

本発明の一実施形態では、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いて、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自体のプロモーターを備えるＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}断片とを組み立て、過剰発現プラスミドを得る。

本発明の一実施形態では、前記宿主菌株はＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含む菌株である。

本発明はまた、Ｌ－アミノ酸を生産する方法を提供し、該方法は、前記細菌を培養し、培養物からＬ－アミノ酸を得ることを含む。

以下、本発明について詳細に説明する。

用語「Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地及び／又は細菌の細胞において、細菌を培地にて培養するときにＬ－アミノ酸を収集できるほど目的のＬ－アミノ酸を生産して蓄積する能力を有する細菌を指す。Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、未修飾菌株で得られる量よりも大量で培地及び／又は細菌の細胞において目的のＬ－アミノ酸を蓄積できる細菌である。

用語「未修飾菌株」とは、特定の特徴を持たせるように修飾していない対照菌株を指す。すなわち、未修飾菌株の例として野生型菌株と親菌株が含まれる。

Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地にて好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で目的のＬ－アミノ酸を蓄積できる細菌であってもよい。

Ｌ－アミノ酸の例としては、塩基性アミノ酸、例えばＬ－リジン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－シトルリン；脂肪族アミノ酸、例えばＬ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン及びグリシン；ヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、例えばＬ－スレオニン及びＬ－セリン；環状アミノ酸、例えばＬ－プロリン；芳香族アミノ酸、例えばＬ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン及びＬ－トリプトファン；硫黄含有アミノ酸、例えばＬ－システイン、Ｌ－シスチン及びＬ－メチオニン；酸性アミノ酸、例えばＬ－グルタミン酸及びＬ－アスパラギン酸；及び側鎖にアミド基を有するアミノ酸、例えばＬ－グルタミン及びＬ－アスパラギンが含まれる。

Ｌ－アミノ酸の具体例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－システインが含まれる。

Ｌ－アミノ酸のより具体的な例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リジン、Ｌ－スレオニン及びＬ－トリプトファンが含まれる。Ｌ－アミノ酸のより具体的な例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リジンが含まれる。

本発明では、特に断らない限り、用語「アミノ酸」とはＬ－アミノ酸を指す。本発明では、特に断らない限り、用語「Ｌ－アミノ酸」とは、遊離形態のＬ－アミノ酸、その塩又はこれらの混合物である。

用語「相同性」とは、２種のポリヌクレオチド又は２種のポリペプチドモジュールの間の百分率同一性を指す。１種のモジュールと他のモジュールとの間の配列相同性は本分野に公知の方法によって測定されてもよい。例えば、このような配列相同性はＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定されてもよい。

本発明では、前記ポリヌクレオチドの発現増強とは、発現調節配列の置換又は変異によってポリヌクレオチド配列に変異を導入すること、染色体を介して挿入又はベクターを介して導入されたポリヌクレオチドコピー数の増加、又はこれらの組み合わせなどを意味する。

本発明によれば、前記変異とは、前記部位での塩基／ヌクレオチドが変化したことを意味し、前記変異方法は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から選ばれる少なくとも１種であってもよい。本発明では、好ましくはＰＣＲ部位特異的変異法及び／又は相同組換えが使用される。

本発明は、ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾することができる。発現調節配列はこれに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドを染色体の特定部位に組み込むことによって、コピー数を増加してもよい。本明細書では、特定の部位は、例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加してもよい。

本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定部位に組み込むことによって、コピー数を増加する。

本発明の一実施形態では、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド又はプロモータ配列ーを有する、点突然変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定部位に組み込むことによって、前記核酸配列を過剰発現させる。

本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加する。

本発明の一実施形態では、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド又はプロモーター配列を有する、点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。

用語「作動可能に連結される」とは、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能性連結を指し、これによって、調節配列はポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発現レベルを向上させ得る強力なプロモーターであってもよい。調節配列はコリネバクテリウム属に属する微生物に由来するプロモーター又は他の微生物に由来するプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターはｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。

用語「ベクター」とは、遺伝子の調節配列と遺伝子配列を含有し、適切な宿主細胞において標的遺伝子を発現させるポリヌクレオチド構築体を指す。又は、ベクターは、相同組換えに利用可能な配列を含有することによって、宿主細胞に導入されることで、宿主細胞のゲノム中の内因性遺伝子の調節配列を変えるか、又は発現させ得る標的遺伝子を宿主のゲノムの特定部位に挿入することができるポリヌクレオチド構築体を指してもよい。この点では、本発明に使用されるベクターは、宿主細胞へのベクターの導入又は宿主細胞の染色体へのベクターの挿入を確認するために、選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を与えるマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理する環境では、選択マーカーを発現させる細胞しか生存せず、又は異なる表現型性状が示されるため、形質転換を受けた細胞を選択することが可能になる。

用語「形質転換」とは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを指し、これによって、ポリヌクレオチドはゲノム外エレメントとなる、又は宿主細胞のゲノムに挿入されて複製することを可能にする。本発明に使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術で開示されるように、宿主細胞によっては電気パルス方法を実施してもよい。

本発明では、コリネバクテリウム属に属する微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）であってもよい。

本発明の一実施形態では、寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託機関：中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５の前記コリネバクテリウム属に属する微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムＹＰ９７１５８であり、該菌株は中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）に記載されている。

本発明では、前記細菌は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、メチルクエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ、アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ｍ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼなどの酵素の活性、遺伝子の発現の増強又は低下、又は外来遺伝子による遺伝子の置換など、Ｌ－アミノ酸の生産量の向上に関する他の改良を有してもよい。

さらに、前記微生物は、例えば、ＮＡＤＰＨ生成に関する遺伝子（例えばグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、グルコノキナーゼをコードする遺伝子、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、又は６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）及び／又はＬ－リジンの生合成又は分泌に関連する他の遺伝子（例えばアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子、ジヒドロジピコリン酸レダクターをコードする遺伝子、ｍ－ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、ｌｙｓＥ）の発現の増強又は低下、又は外来遺伝子による遺伝子の置換など、Ｌ－リジンの生産量の向上に関する他の改良を有してもよい。

本発明では、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化したことを意味し、前記変異方法は変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から選択される少なくとも１種であってもよい。本発明では、好ましくはＰＣＲ部位特異的変異法及び／又は相同組換えが使用される。

本発明では、本分野に公知の培養の条件で、適切な培地にて細菌を培養してもよい。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。培養においては、培養物のｐＨを調節してもよい。さらに、培養するときには、例えば消泡剤を使用して気泡の生成を防止するなど、気泡の生成を防止してもよい。さらに、培養するときには、ガスを培養物に注射することを含んでもよい。ガスは培養物の有酸素条件を維持し得る任意のガスを含んでもよい。培養においては、培養物の温度は２０～４５℃であってもよい。培養物から生成したＬ－アミノ酸を回収し、すなわち、硫酸や塩酸などで培養物を処理し、次に、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、結晶化や等電点沈殿の方法の組み合わせを行ってもよい。

［発明の効果］
有利な効果
本発明では、コリネバクテリウム・グルタミカムＹＰ９７１５８を出発菌とし、その背景におけるＮＣｇｌ１０８９遺伝子、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子、ｐｔｓＳ遺伝子を弱化又はノックアウトした結果、該遺伝子コードの産物はＬ－アミノ酸生産能に影響することを見出し、コード配列に点突然変異を導入するか又は該遺伝子のコピー数を増加させるか、又は過剰発現させることにより組換え菌株が得られ、得られた菌株は明らかなＬ－アミノ酸生産能を有し、高濃度Ｌ－アミノ酸の生産に有利である。

以下、本発明の実施例を説明することによって、本発明の上記及び他の特徴や利点をさらに解説、説明する。なお、以下の実施例は、本発明の技術的解決手段を例示的に説明することを目的とし、特許請求の範囲及びその等価手段による本発明の特許範囲を何ら限定するものではない。

特に断らない限り、以下の実施例に使用される原料及び試薬はすべて市販品であるか、又は既知の方法によって調製することができ、行われる操作はすべて分野に公知であるか、又は市販品のユーザーマニュアルに従って行われる。

以下の実施例において前記菌株を培養するために使用される基礎培地は組成が同じであり、この基礎培地の組成に加えて必要に応じてスクロース、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどを添加し、基礎培地の組成は以下に示すとおりである。

以下の実施例において前記ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの製造及び条件は以下に示すとおりである。

実施例１
（１）点突然変異したＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８（寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託機関：中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）に記載）背景におけるＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に点突然変異を導入し、この場合、コードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３であり、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子のヌクレオチド配列の５０８番目のＧはＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２：ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}）に変化し、この場合、コードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列の１７０番目のグルタミン酸はリジン（ＳＥＱＩＤＮＯ：４：ＮＣｇｌ１０８９Ｅ１７０Ｋ）に変化する。

プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ１：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＣＧＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＧＣＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４をそれぞれ用いて、ＰＣＲ増幅を行った。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。

前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で４０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われ、サイズがそれぞれ７２４ｂｐと８３９ｂｐで、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域を含有する２本のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ１０８９ＵｐとＮＣｇｌ１０８９Ｄｏｗｎ）が得られた。

上記２本のＤＮＡ断片についてアガロースゲル電気泳動により分離精製後、上記２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲによって長さが約１５３５ｂｐの断片を増幅した。

前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

このＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}）によって、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域の５０８番目のグアニン（Ｇ）はアデニン（Ａ）に変化し、その結果として、タンパク質をコードする１７０番目のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）からリジン（Ｋ）に変化する。

ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入）をＸｂａＩ酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動により線状化ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドとＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を分離精製し、次に、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって組み立て、ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれている。ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}をシークエンシング会社に送ってシークエンシングして同定し、正しい点突然変異（Ｇ－Ａ）を含有するベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を使用時まで保存した。

（２）点突然変異したＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を含む遺伝子工学菌株の構築
構築方法：アレル交換プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を電気ショックによりＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８（構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照。シークエンシングの結果、該菌株染色体には野生型のＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域が保持されている）に形質転換入し、培養した単一コロニーについてプライマーＰ１とユニバーサルプライマーＭ１３Ｒによってそれぞれ同定した結果、サイズ１５４２ｂｐのバンドを増幅し得る菌株は陽性菌株であった。１５％スクロースを含む培地にて陽性菌株を培養し、カナマイシン含有及びカナマイシン不含の培地にて培養した単一コロニーをそれぞれ培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株について以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）を用いて、さらにＰＣＲ同定を行った：
Ｐ５：５’ＧＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＡＴＧＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
Ｐ６：５’ＣＣＴＡＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）。

上記ＰＣＲ増幅産物を高温で変性して、氷浴で処理した後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}増幅断片は陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片は陰性対照、水は空白対照）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片位置と一致せず、陽性対照断片位置と一致する菌株はアレル交換に成功した菌株である。プライマーＰ５とＰ６によってＰＣＲによってアレル交換に成功した菌株の目的断片をさらに増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンシングを行い、配列アラインメントによれば塩基配列が突然変異した配列検証菌株はアレル交換に成功しており、ＹＰＬ－４－０１７と命名した。

（３）ゲノムにおいてＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片及びＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域、ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子コード領域、及び前記遺伝子プロモーター領域配列を増幅する４対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を導入した。

プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ７：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ＣＡＴＧＡＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）
Ｐ１３：５’ＣＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１３／Ｐ１４をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片８０５ｂｐ、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子プロモーター断片３１８ｂｐ、及び下流相同アーム断片６２８ｂｐを得た。次に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２とＹＰＬ－４－０１７菌をそれぞれテンプレート、Ｐ１１／Ｐ１２をプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、ＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子断片６９４ｂｐを得た。その後、Ｐ９／Ｐ１２をプライマー、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子プロモーター断片とＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}をテンプレートとして、自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}断片９７２ｂｐを得た。さらに、Ｐ７／Ｐ１４をプライマー、上流相同断片、下流相同断片及び自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}の３つの断片を混合したものをテンプレートとして増幅し、組み込み相同アーム断片を得た。

ＰＣＲ反応終了後、増幅した産物に対して電気泳動により回収し、カラムＤＮＡゲル抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて、必要な２３６５ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いてＸｂａＩ酵素で消化して回収したシャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと組み立て、組み込みプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ１０８９又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を得た。プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれており、カナマイシンスクリーニングによってプラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られた。

２つの組み込みプラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換入し、培養した単一コロニーをＰ１５／Ｐ１６プライマーによってＰＣＲ同定し、ＰＣＲ増幅によりサイズ１３３２ｂｐの断片を含むものは陽性菌株、増幅により断片が得られないものは原菌であった。陽性菌株を１５％スクロース培地にてスクリーニングした後、カナマイシン含有とカナマイシン不含の培地にてそれぞれ培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株をＰ１７／Ｐ１８プライマーによってさらにＰＣＲ同定し、サイズ１１８７ｂｐが増幅された菌は遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに組み込まれた菌株であり、それぞれＹＰＬ－４－０１８（点突然変異不含）及びＹＰＬ－４－０１９（点突然変異含有）と命名した：
Ｐ１５：５’ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ＣＴＧＣＧＡＴＴＣＣＣＡＡＣＧＣＡＴＣＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）
Ｐ１７：５’ＧＡＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）。

（４）プラスミドにおいてＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成）：
Ｐ１９：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ＧＡＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）。

構築方法：ＹＰＬ－４－０１８をテンプレートとして、プライマーＰ１９／Ｐ２０ＰＣＲによってＮＣｇｌ１０８９プロモーター断片３７８ｂｐを得た。次に、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２とＹＰＬ－４－０１７をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ２１／Ｐ２２ＰＣＲによってＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子断片７０８ｂｐを得た。さらに、上記プロモーターと遺伝子断片をテンプレートとして、プライマーＰ１９／Ｐ２２によってオーバーラップＰＣＲを行い、自体のプロモーターを備えるＮＣｇｌ１０８９又はＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}遺伝子断片１０６６ｂｐを得た。増幅産物を電気泳動により回収し、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって必要な１０６６ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用いてＥｃｏＲＩ酵素で消化して回収したシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と組み立て、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１０８９又はｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}を得た。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含まれており、クロラムフェニコールによってプラスミドが菌株に形質転換されたものをスクリーニングすることができる。

前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長９０ｓ（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

ｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１０８９又はｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}をそれぞれＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気的に形質転換し、培養した単一コロニーをＭ１３（－４８）及びＰ２２プライマーによってＰＣＲ同定し、ＰＣＲ増幅によりサイズ１１０４ｂｐの断片を含むものは導入菌株であり、それぞれＹＰＬ－４－０２０（点突然変異を含まない）又はＹＰＬ－４－０２１（点突然変異含有）と命名した。

（５）ゲノムにおいてＮＣｇｌ１０８９遺伝子が欠損した遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域の両端の断片を増幅する２対のプライマーを合成して、上下流相同アーム断片とした。プライマー設計は以下のとおりである（上海英俊社により合成）：
Ｐ２３：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）
Ｐ２４：５’ＡＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）
Ｐ２５：５’ＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＴＡＧＧＣＧＣＧＧＡＴＴＣＧＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）
Ｐ２６：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）。

コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ２３／Ｐ２４及びＰ２５／Ｐ２６のそれぞれによってＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７７９ｂｐ及び下流相同アーム断片８００ｂｐを得て、次に、プライマーＰ２３／Ｐ２６によってオーバーラップＰＣＲを行い、完全な相同アーム断片１５３９ｂｐを得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって必要な１５３９ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムによって、ＸｂａＩ酵素で消化して回収したシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドに連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれている。

ノックアウトプラスミドをリジン生産特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーについて以下のプライマー（上海英俊社により合成）によってそれぞれＰＣＲ同定を行った：
Ｐ２７：５’ＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）
Ｐ２８：５’ＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）。

上記ＰＣＲ増幅によりサイズ１４２９ｂｐ及び２４０１ｂｐのバンドが得られた菌株は陽性菌株、２４０１ｂｐのバンドが増幅された菌株は原菌であった。陽性菌株を１５％スクロース培地にてスクリーニングした後、カナマイシン含有とカナマイシン不含の培地にてそれぞれ培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株をＰ２７／Ｐ２８プライマーによってさらにＰＣＲ同定し、サイズ１４２９ｂｐのバンドが増幅により得られた菌株はＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学菌株であり、ＹＰＬ－４－０２２と命名した。

（６）Ｌ－リジン発酵実験
実施例で構築した菌株と原菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司より購入）において、表１で示される培地と表２で示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返し、その結果を表３に示す。

表３に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＮＣｇｌ１０８９遺伝子を過剰発現させ、又はＮＣｇｌ１０８９遺伝子コード領域について点突然変異ＮＣｇｌ１０８９^{Ｇ５０８Ａ}及び過剰発現を行うと、Ｌ－リジン生産量の向上に寄与し、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、Ｌ－リジンの蓄積に不利である。

実施例２
（１）点突然変異したＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒの構築
ＮＣＢＩが公開したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換によって菌株ＹＰ９７１５８（寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託機関：中国科学院微生物研究所、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）に記載）背景におけるＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）に点突然変異を導入し、この場合、コードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３５であり、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子のヌクレオチド配列の９２番目のＴはＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）に変化し、この場合、コードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列の３１番目のロイシンはアルギニン（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６：ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ）に変化する。プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
Ｐ２：５’ＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＣＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）
Ｐ３：５’ＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４をそれぞれ用いて、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長４０ｓ、３０サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われ、サイズがそれぞれ６３６ｂｐと６８１ｂｐで、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域を含有するＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ０７６１ＵｐとＮＣｇｌ０７６１Ｄｏｗｎ）が得られた。上記２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製後、上記の２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲによって長さ１２８３ｂｐの断片を増幅した。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長６０ｓ、３０サイクル、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

このＤＮＡ断片によって、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域の９２番目のチミン（Ｔ）はグアニン（Ｇ）に変化し、その結果として、コードされたタンパク質の３１番目のアミノ酸はロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）に変化する。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後に精製し、二重酵素消化を経て精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩとの二つの酵素でそれぞれ消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換した後に成長した単一クローンについてＰＣＲ同定により陽性ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒが得られ、該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれている。酵素消化の結果正しいベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒをシークエンシング会社に送ってシークエンシングして同定し、正しい点突然変異（Ｔ－Ｇ）を含むベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを使用時まで保存した。

（２）点突然変異したｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを含む遺伝子工学菌株の構築
構築方法
アレル交換プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを電気ショックによりＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８（構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照。シークエンシングの結果、該菌株染色体には野生型のＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域が保持されている）に形質転換し、培養した単一コロニーについてプライマーＰ１とユニバーサルプライマーＭ１３Ｒによってそれぞれ同定した結果、サイズ１３６９ｂｐのバンドを増幅し得る菌株は陽性菌株であった。１５％スクロースを含む培地にて陽性菌株を培養し、培養した単一コロニーを、カナマイシン含有及びカナマイシン不含の培地にて培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株について以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）を用いて、さらにＰＣＲ同定を行った：
Ｐ５：５’ＧＡＡＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
Ｐ６：５’ＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）。

上記ＰＣＲ増幅産物２６７ｂｐを９５℃の高温で１０ｍｉｎ変性して、氷浴で５ｍｉｎ処理した後、ＳＳＣＰ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ増幅断片は陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片は陰性対照、水は空白対照）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片電気泳動位置が陰性対照断片位置と一致せず、陽性対照断片位置と一致する菌株はアレル交換に成功した菌株である。プライマーＰ５／Ｐ６ＰＣＲによって陽性菌株ＮＣｇｌ０７６１断片をさらに増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンシングを行い、配列アラインメントによれば塩基配列が突然変異（Ｔ－Ｇ）した菌株はアレル交換に成功した陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０２９と命名した。

（３）ゲノムにおいてＮＣｇｌ０７６１とＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片及びＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を導入した。

プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
Ｐ８：５’ＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＣＣＡＣＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
Ｐ１０：５’ＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）
Ｐ１１：５’ＣＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０２９をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２のそれぞれによって用ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片８０２ｂｐ、ＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子及びそのプロモーター断片７３７ｂｐ及び下流相同アーム断片６４７ｂｐを得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅した３つの断片をカラムＤＮＡゲル抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）によりそれぞれ電気泳動して回収した。回収した３つの断片を、二重酵素で消化して精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩの二重酵素でそれぞれ消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンをＭ１３プライマーによりＰＣＲ同定し、陽性組み込みプラスミド、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ０７６１及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを得た。プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれており、カナマイシンスクリーニングによってプラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られた。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長６０ｓ（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

シークエンシングの結果正しい２つの組み込みプラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーについてＰ１３／Ｐ１４プライマーによりＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲによりサイズ１３２５ｂｐの断片を含むものが増幅されたのは陽性菌株であり、増幅により断片が得られないものは原菌である。１５％スクロース含有培地にて陽性菌株を培養し、培養した単一コロニーをＰ１５／Ｐ１６プライマーによりさらにＰＣＲ同定し、サイズ１００２ｂｐが増幅された菌はＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに組み込まれた陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０３０（突然変異点不含）及びＹＰＬ－４－０３１（突然変異点含有）と命名した：
Ｐ１３：５’ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
Ｐ１４：５’ＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）
Ｐ１５：５’ＧＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）
Ｐ１６：５’ＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）。

（４）プラスミドにおいてＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成し、プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＣＴＣＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２及びＹＰＬ－４－０２９をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ１７／Ｐ１８によってＰＣＲ増幅を行い、ＮＣｇｌ０７６１又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ遺伝子及びそのプロモーター断片７３７ｂｐを得て、増幅産物を電気泳動により回収し、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって精製し、回収したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ酵素で消化して回収したシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンをＭ１３プライマーによりＰＣＲ同定し、陽性過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０７６１及びｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを得て、該プラスミドをシークエンシングに供した。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含まれているので、クロラムフェニコールによってプラスミドが菌株に形質転換されているか否かを判断できる。

前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長６０ｓ（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

シークエンシングの結果正しいｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０７６１及びｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１ＲプラスミドをそれぞれＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーをプライマーＭ１３／Ｐ１８によってＰＣＲ同定し、ＰＣＲによりサイズ７４５ｂｐの断片を含むものが増幅されたのは陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０３２（突然変異点不含）及びＹＰＬ－４－０３３（突然変異点含有）と命名した。

（５）ゲノムにおいてＮＣｇｌ０７６１遺伝子が欠損した遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域の両末端の断片を増幅する２対のプライマーを合成し、上下流相同アーム断片とした。プライマー設計は以下のとおりである（上海英俊社により合成）：
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）
Ｐ２０：５’ＧＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＡＣＡＴＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）
Ｐ２１：５’ＧＡＧＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２のそれぞれによってＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片６５８ｂｐ及び下流相同アーム断片７１６ｂｐを得た。次に、プライマーＰ１９／Ｐ２２によってオーバーラップＰＣＲを行い、完全な相同アーム断片１３３５ｂｐを得た。増幅産物を電気泳動して、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって精製し、回収したＤＮＡ断片を、二重酵素で消化して精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、それぞれＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩとの二つの酵素で消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンをＭ１３プライマーによりＰＣＲ同定し、陽性ノックアウトベクターｐＫ１８－ΔＮＣｇｌ０７６１を得て、該プラスミドをシークエンシングに供した。該プラスミドにはカナマイシン耐性がスクリーニングマーカーとして含まれている。

シークエンシングの結果正しいノックアウトプラスミドｐＫ１８－ΔＮＣｇｌ０７６１をリジン生産特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーを以下のプライマー（上海英俊社により合成）によってＰＣＲ同定した：
Ｐ２３：５’ＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
Ｐ２４：５’ＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）。

上記ＰＣＲによってサイズ１３７４ｂｐ及び１５２０ｂｐのバンドの両方が増幅された菌株は陽性菌株であり、１５２０ｂｐバンドしか増幅されていない菌株は原菌である。陽性菌株を１５％スクロース培地にてスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有及びカナマイシン不含の培地にて培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株をＰ２３／Ｐ２４プライマーによってさらにＰＣＲ同定し、サイズ１３７４ｂｐのバンドが増幅された菌株はＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域がノックアウトされた陽性菌株であった。さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーによって陽性菌株ＮＣｇｌ０７６１断片にＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果正しい菌株をＹＰＬ－４－０３４と命名した。

（６）Ｌ－リジン発酵実験
実施例で構築した菌株と原菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司より購入）において、表４で示される培地と表５で示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返し、その結果を表６に示す。

表６に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＮＣｇｌ０７６１遺伝子を過剰発現させ、又はＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域について点突然変異ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ及び過剰発現を行うと、Ｌ－リジンの生産量及び転化率の向上に寄与し、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、Ｌ－リジンの蓄積に不利であり、転化率も低下させる。

（７）グルタミン酸生産菌株にＮＣｇｌ０７６１遺伝子を導入して過剰発現させ、又はＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域について点突然変異ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ及び過剰発現を行い、かつ発酵実験を行った。

実施例（１）～（５）の方法に従って、同様なプライマー及び実験条件を用いて、コリネバクテリウムＡＴＣＣ１３８６９を出発菌、ＡＴＣＣ１３８６９菌を発現菌として、点突然変異したｐＫ１８－ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒを含むグルタミン酸生産遺伝子工学菌株（ＹＰＧ－００１）、ゲノムにおいてＮＣｇｌ０７６１（ＹＰＧ－００２）又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ（ＹＰＧ－００３）遺伝子を過剰発現させたグルタミン酸生産遺伝子工学菌株、プラスミドにおいてＮＣｇｌ０７６１（ＹＰＧ－００４）又はＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ（ＹＰＧ－００５）遺伝子を過剰発現させたグルタミン酸生産遺伝子工学菌株、及びゲノムにおいてＮＣｇｌ０７６１遺伝子が欠損したグルタミン酸生産遺伝子工学菌株（ＹＰＧ－００６）を得た。

実施例で構築した菌株と原菌株ＡＴＣＣ１３８６９をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司より購入）において、表７で示される培地と表８で示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返し、その結果を表９に示す。

表９に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＮＣｇｌ０７６１遺伝子を過剰発現させ、又はＮＣｇｌ０７６１遺伝子コード領域について点突然変異ＮＣｇｌ０７６１^Ｌ３１Ｒ及び過剰発現を行うと、Ｌ－グルタミン酸生産量及び転化率の向上に寄与し、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利であり、転化率も低下させる。

実施例３
（１）点突然変異したｐｔｓＳ遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}の構築
ＮＣＢＩが公開したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ｐｔｓＳ遺伝子コード領域配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子（アレル）置換によって菌株ＹＰ９７１５８［寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託機関：中国科学院微生物研究所、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａに記載（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）］背景におけるｐｔｓＳ遺伝子コード領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）に点突然変異を導入し、この場合、コードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６３であり、ｐｔｓＳ遺伝子のヌクレオチド配列の４８５番目のチミンＴはシトシンＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）に変化し、この場合、コードタンパク質に対応するアミノ酸配列の１６２番目のメチオニンはスレオニン（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４：ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}）に変化する。プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
Ｐ２：５’ＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）
Ｐ３：５’ＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４のそれぞれによって、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、（９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長４０ｓ、３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われ、サイズがそれぞれ６６６ｂｐと７０３ｂｐで、ｐｔｓＳ遺伝子コード領域を含有する２本のＤＮＡ断片（ｐｔｓＳＵｐとｐｔｓＳＤｏｗｎ）が得られた。上記の２本のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離精製後、上記の２本のＤＮＡ断片をテンプレート、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ増幅によって長さ１３４１ｂｐの断片を得た。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、（９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し、３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

このＤＮＡ断片によって、ＹＰ９７１５８ｐｔｓＳ遺伝子コード領域の４８５番目のチミン（Ｔ）はシトシン（Ｃ）に変化し、その結果として、タンパク質をコードする１６２番目のアミノ酸はメチオニン（Ｍ）からスレオニン（Ｔ）に変化する。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後に精製し、二重酵素で消化して精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩとの二つの酵素でそれぞれ消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換した後、単一クローンについてｐｃｒ同定によりベクターｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}が得られ、該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれている。酵素消化の結果正しいベクターｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}をシークエンシング会社に送ってシークエンシングして同定し、正しい点突然変異（Ｔ－Ｃ）を含むベクターｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を使用時まで保存した。

（２）点突然変異したｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を含む遺伝子工学菌株の構築
構築方法：アレル交換プラスミドｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を電気ショックによりＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８（構築方法はＷＯ２０１４１２１６６９Ａ１を参照。シークエンシングの結果、該菌株染色体には野生型のｐｔｓＳ遺伝子コード領域）に形質転換し、培養した単一コロニーについてプライマーＰ１とユニバーサルプライマーＭ１３Ｒによってそれぞれ同定した結果、サイズ１３９３ｂｐのバンドを増幅し得る菌株は陽性菌株であった。１５％スクロースを含む培地にて陽性菌株を培養し、培養した単一コロニーを、カナマイシン含有及びカナマイシン不含の培地にて培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株について以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）を用いて、さらにＰＣＲ同定を行った。
Ｐ５：５’ＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＴＣＧＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）
Ｐ６：５’ＣＧＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡＴＣＴＴＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）

上記ＰＣＲ増幅産物３１１ｂｐを９５℃の高温で１０ｍｉｎ変性して、氷浴で５ｍｉｎ処理した後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}増幅断片は陽性対照、ＹＰ９７１５８増幅断片は陰性対照、水は空白対照）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片電気泳動位置が陰性対照断片位置と一致せず、陽性対照断片位置と一致する菌株はアレル交換に成功した菌株である。プライマーＰ５／Ｐ６ＰＣＲによって陽性菌株ｐｔｓＳ断片をさらに増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンシングを行い、配列アラインメントによれば塩基配列が突然変異（Ａ－Ｇ）した菌株はアレル交換に成功した陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０３５と命名した。

（３）ゲノムにおいてＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流相同アーム断片及びＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えによって菌株ＹＰ９７１５８にＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を導入した。

プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ７：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）
Ｐ８：５’ＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）
Ｐ９：５’ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）
Ｐ１０：５’ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）
Ｐ１１：５’ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０３５をそれぞれテンプレートとして、プライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２のそれぞれによって、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片８０２ｂｐ、ＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子及びそのプロモーター断片２３５４ｂｐ及び下流相同アーム断片６４７ｂｐを得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅した３つの断片をカラムＤＮＡゲル抽出キットによりそれぞれ電気泳動して回収した。回収した３つの断片を、二重酵素で消化して精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩとの二つの酵素でそれぞれ消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（より購入ＮＥＢ公司）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンについてｐｃｒ同定により陽性組み込みプラスミド、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を得た。該プラスミドにはカナマイシン耐性マーカーが含まれており、カナマイシンスクリーニングによってプラスミドがゲノムに組み込まれた組換え体が得られる。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃伸長６０ｓ（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

シークエンシングの結果正しい２つの組み込みプラスミドをＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーについてＰ１３／Ｐ１４プライマーによりＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲ増幅によりサイズ１２９８ｂｐの断片を含むものは陽性菌株であり、増幅により断片が得られないものは原菌である。１５％スクロース含有培地にて陽性菌株を培養し、培養した単一コロニーをＰ１５／Ｐ１６プライマーによりさらにＰＣＲ同定し、サイズ１１３３ｂｐが増幅された菌はＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに組み込まれた陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０３６（突然変異点不含）及びＹＰＬ－４－０３７（突然変異点含有）と命名した：
Ｐ１３：５’ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）
Ｐ１４：５’ＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）
Ｐ１５：５’ＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）
Ｐ１６：５’ＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）。

（４）プラスミドにおいてＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させた遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開した野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成し、プライマー設計は以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成）：
Ｐ１７：５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）
Ｐ１８：５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２）。

構築方法：ＡＴＣＣ１３０３２及びＹＰＬ－４－０３５をテンプレートとして、プライマーＰ１７／Ｐ１８によってＰＣＲ増幅を行い、ＰｔｓＳ又はＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子及びプロモーター断片２３５４ｂｐを得て、増幅産物を電気泳動して、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって精製し、回収したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ酵素で消化して回収したシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンをＭ１３プライマーによりｐｃｒ同定し、陽性過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＰｔｓＳ及びｐＸＭＪ１９－ＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を得て、該プラスミドをシークエンシングに供した。プラスミドにはクロラムフェニコール耐性マーカーが含まれているため、クロラムフェニコールによってプラスミドが菌株に形質転換されているか否かを判断できる。

シークエンシングの結果正しいｐＸＭＪ１９－ＰｔｓＳ及びｐＸＭＪ１９－ＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}プラスミドをＬ－リジン生産菌である特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーをプライマーＭ１３／Ｐ１８によってＰＣＲ同定し、ＰＣＲ増幅によりサイズ２３６２ｂｐ断片を含むものは陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０３８（突然変異点不含）及びＹＰＬ－４－０３９（突然変異点含有）と命名した。

（５）ゲノムにおいてＰｔｓＳ遺伝子が欠損した遺伝子工学菌株の構築
ＮＣＢＩが公開したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列に従って、ＰｔｓＳ遺伝子コード領域の両末端の断片を増幅する２対のプライマーを合成し、上下流相同アーム断片とした。プライマー設計は以下のとおりである（上海英俊社により合成）：
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＣＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８３）
Ｐ２０：５’ＣＧＣＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８４）
Ｐ２１：５’ＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８５）
Ｐ２２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＡＴＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８６）。

構築方法：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとして、プライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２のそれぞれによってＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７９４ｂｐ及び下流相同アーム断片７０３ｂｐを得た。次に、プライマーＰ１９／Ｐ２２によってＯＶＥＲＬＡＰＰＣＲを行い、完全な相同アーム断片１４５９ｂｐを得た。増幅産物を電気泳動させて、カラムＤＮＡゲル抽出キットによって精製し、回収したＤＮＡ断片を、二重酵素で消化して精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入、ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩとの二つの酵素でそれぞれ消化）とＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社より購入）により５０℃で３０ｍｉｎ連結し、連結産物を形質転換して成長した単一クローンをＭ１３プライマーによりｐｃｒ同定し、陽性ノックアウトベクターｐＫ１８－ΔＰｔｓＳを得て、該プラスミドをシークエンシングに供した。該プラスミドにはカナマイシン耐性がスクリーニングマーカーとして含まれている。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸長し（３０サイクル）、７２℃で１０ｍｉｎ過剰伸長するように行われた。

シークエンシングの結果正しいノックアウトプラスミドｐＫ１８－ΔＰｔｓＳをリジン生産特許菌株ＹＰ９７１５８に電気形質転換し、培養した単一コロニーを以下のプライマー（上海英俊社により合成）によりＰＣＲ同定した：
Ｐ２３：５’ＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８７）
Ｐ２４：５’ＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８８）。

上記ＰＣＲによってサイズ７５８ｂｐ及び２２４９ｂｐのバンドの両方が増幅された菌株は陽性菌株であり、２２４９ｂｐバンドしか増幅されていない菌株は原菌である。陽性菌株を１５％スクロース培地にてスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有及びカナマイシン不含の培地にて培養し、カナマイシン不含の培地にて成長するが、カナマイシン含有の培地にて成長しない菌株をＰ２３／Ｐ２４プライマーによってさらにＰＣＲ同定し、サイズ７５８ｂｐのバンドが増幅された菌株はＰｔｓＳ遺伝子コード領域がノックアウトされた陽性菌株であった。さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーによって陽性菌株ＰｔｓＳ断片にＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果正しい菌株をＹＰＬ－４－０４０と命名した。

（６）Ｌ－リジン発酵実験
将実施例で構築した菌株と原菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司より購入）において、表１０で示される培地と表１１で示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返し、その結果を表１２に示す。

表１２に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＰｔｓＳ遺伝子コード領域に対して点突然変異ＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}及び過剰発現を行うと、Ｌ－リジン生産量及び転化率の向上に寄与し、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトはＬ－リジンの蓄積に不利であり、転化率も低下させる。

（７）グルタミン酸生産菌株にＰｔｓＳ遺伝子過剰発現を導入するか、又はＰｔｓＳ遺伝子コード領域に対して点突然変異ｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}及び過剰発現を行い、発酵実験を行った。

本実施例（１）～（５）の方法に従って、同様なプライマー及び実験条件を用いて、コリネバクテリウムＡＴＣＣ１３８６９を出発菌、ＡＴＣＣ１３８６９菌を発現菌として、点突然変異したｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}を含むグルタミン酸生産遺伝子工学菌株、ゲノムにおいてｐｔｓＳ及びｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させたグルタミン酸生産遺伝子工学菌株、プラスミドにおいてｐｔｓＳ及びｐｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}遺伝子を過剰発現させたグルタミン酸生産遺伝子工学菌株、及びゲノムにおいてｐｔｓＳ遺伝子が欠損したグルタミン酸生産遺伝子工学菌株を得た。

実施例で構築した菌株と原菌株ＡＴＣＣ１３８６９をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵タンク（上海百崙生物科技有限公司より購入）において、表１３で示される培地と表１４で示される制御プロセスによって発酵実験を行った。菌株ごとに３回繰り返し、その結果を表１５に示す。

表１５に示す結果から、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてＰｔｓＳ遺伝子コード領域に対して点突然変異ＰｔｓＳ^{Ｍ１６２Ｔ}及び／又は過剰発現を行うと、Ｌ－グルタミン酸生産量及び転化率の向上に寄与し、一方、遺伝子の弱化又はノックアウトは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利であり、転化率も低下させる。

以上は本発明の実施形態について説明した。ただし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の思想及び原則を逸脱することなく行われるすべての修正、同等置換や改良などは本発明の特許範囲に含まれるものとする。

Claims

Ｌ－アミノ酸を生産する微生物であって、
ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列の１７０番目のグルタミン酸をリジンで置換させる点突然変異を有する、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善した発現、及び／又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列の１６２番目のメチオニンをスレオニンで置換させる点突然変異を有する、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの改善した発現
を有し、
微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とする、微生物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド配列を含み、ＳＥＱＩＤＮＯ：６３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６１のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
点突然変異を有するポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基が変異したものであり、
点突然変異を有するポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基が変異したものである、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の微生物。
変異はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含むことを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
変異はＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変異を含むことを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
点突然変異を有する前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰ９７１５８又はＡＴＣＣ１３８６９であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の微生物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、１７０番目のグルタミン酸がリジンで置換されたポリヌクレオチド；
及び／又は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：６３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、１６２番目のメチオニンがスレオニンで置換されたポリヌクレオチド
を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基が変異したものである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
変異はＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の５０８番目の塩基の、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基が変異したものである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
変異はＳＥＱＩＤＮＯ：６１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５番目の塩基の、チミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変更を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：６４で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ポリペプチド。
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えベクター。
Ｌ－アミノ酸を生産する方法であって、
請求項１～８のいずれか１項に記載の微生物を培養し、培養したものからＬ－アミノ酸を回収することを含む、方法。
前記Ｌ－アミノ酸はＬ－グルタミン酸又はＬ－リジンである、請求項２０に記載の方法。