JP7774006B2

JP7774006B2 - 癌治療における使用のための組換えポリペプチド及び組合せ

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Publication number: JP7774006B2
Application number: JP2022579018A
Authority: JP
Inventors: ヤー－フェイチェン; ティン－ロンリン
Original assignee: イミュナミラボラトリーズプライベートリミティド
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2025-11-20
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Description

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、及びこれによりその全体が引用により組み込まれている。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年６月１８日に作製され、ファイル名は「ＩＭＨＣ－００３＿Ｆ０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、サイズは４１ＫＢである。

発明の背景
免疫原性細胞死は、細胞死又はアポトーシスの形である。大部分は非免疫原性である古典的アポトーシスとは異なり、癌細胞における免疫原性細胞死は、樹状細胞の活性化を通じて、効果的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。プレアポトーシス状態は、カスパーゼ３／７の活性化、細胞アポトーシスの顕在化の前の状態として定義される。免疫原性細胞死は、死滅しつつある細胞の表面上のプレアポトーシス性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の発現により特徴付けられる。免疫原性細胞死の際に細胞表面に露出される３種の重要なプレアポトーシス性ＤＡＭＰが存在する：カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０。これら３種のプレアポトーシス性ＤＡＭＰシグナルは、ＣＲＴによる樹状細胞動員及び細胞貪食、並びにＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０による樹状細胞成熟／活性化において重要な役割を果たし、結果的に効果的な抗腫瘍免疫応答を生じる。化学療法及び放射線治療の選択された形は、副次的な免疫原性細胞死を誘導することができる。これらの療法は、先の３種のプレアポトーシス性ＤＡＭＰシグナルの１又は２種を誘導することができるが、これらは、プレアポトーシス性ＤＡＭＰシグナル３種全ての発現は誘導しない。更に化学療法及び放射線治療は、免疫抑制的療法であり、これらはリンパ球の数を減少し且つまた周囲の非腫瘍細胞にも副次的なダメージを引き起こし、それぞれ結果的に、抗腫瘍免疫応答の不良及び有害事象を生じる。

有害作用を最小化する一方で、３種全てのプレアポトーシス性ＤＡＭＰシグナルの発現を誘導することにより、効率及び効力が増した免疫原性細胞死を誘導する組成物及び方法が必要とされている。樹状細胞が媒介した長期の適応免疫応答を誘導することによる、個別化され及び普遍的な癌免疫療法の組成物及び方法が必要とされている。癌型もしくは腫瘍表現型に関わらず、癌発生を予防するための、新抗原の広がりによりＴ細胞ポリクローナル多様性を誘導する組成物及び方法が必要とされている。本開示は、これらの必要性に対処している。

腫瘍浸潤性（腫瘍内）のＣＤ１１ｃ^＋骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）、ヒトＣＤ１４１^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣ、又はマウスＣＤ１０３^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣ(Robertsら、Cancer Cell, 324-336, 2016)は、腫瘍微小環境においては希少である(Brozら、Cancer Cell, 638-652, 2014)。これらのＸＣＲ１^＋ＤＣは、腫瘍抗原の捕獲、ＣＣＲ７アップレギュレーションを介したリンパ節への遊走、及びＴ細胞活性化／増殖のためのリンパ節におけるＴ細胞への抗原の交差提示に係わっている。マウスＣＤ１０３^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣは、ＣＤ４０及びＴＬＲ４の両方を高度に発現する。Ｔ細胞免疫療法において、ＨＭＧＢ１は、典型的にはマウスモデルにおいてＴＬＲ４によりＣＤ１０３^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣを活性化／成熟するために使用される(Tesniereら、Oncogene, 482-491, 2010)。しかしヒトＣＤ１４１^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣは、ＣＤ４０及びＴＬＲ３を高度に発現し、ＴＬＲ４発現を伴わない(Jongbloedら、J. Exp. Med., 1247-1260, 2010)。「ヒト」Ｔ細胞免疫療法において、ＨＭＧＢ１は、ＣＤ１４１^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣを成熟、活性化及び増殖することに失敗している。更に効果的な癌免疫療法のためにＤＣのＩＬ１２を誘導するためには、ＣＤ４０は、Ｔｏｌｌ－様受容体（ＴＬＲ）よりもより重要である(Changら、Cancer Research, 10047-10057, 2007；Pinzon-Charryら、Br. J. Cancer, 1251-1259, 2007)。従って樹状細胞の活性化及び増殖の現時点の制限を克服するために、樹状細胞を活性化し、成熟させ、且つ増殖するための代替アプローチの必要性が存在する。本発明は、当該技術分野においてこの満たされていない必要性に対処している。

特異抗原を認識するナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の前駆体頻度（確率）は、１００万個細胞につき約１～１０個である(Lammermannら、Immunological Reviews, 26-43, 2008)。ヒトにおける総ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は、約４×１０^１０個細胞である(Boonら、Annu. Rev. Immunol., 175-208, 2006)。従ってヒト腫瘍－特異抗原を認識するヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の前駆体頻度は、１００万個細胞につき約～５個であると仮定すると、腫瘍－特異抗原を認識するヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の数は、約２×１０^５個細胞となる（４×１０^１０×５／１０^６）。１個のＣＤ８^＋Ｔ細胞は、２～３個の標的腫瘍細胞を死滅させる能力を有する(Wiedemannら、PNAS, 10985-10990, 2006、McGavernら、Nature Immunol, 918-925, 2002)。

上皮の腫瘍サイズは、細胞直径を１０μｍと仮定すると、約１×１０^９個細胞／１ｃｍ^３である(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。平均細胞直径は、約５～１０μｍである(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。しかし腫瘍細胞直径は、約２０μｍに達し得る(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009、Backmanら、Nature, 35-36, 2000)。従って上皮の腫瘍サイズは、細胞直径を２０μｍと仮定し、約１．２５×１０^８個細胞／１ｃｍ^３である(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。1個のＣＤ８^＋Ｔ細胞は、わずかに標的腫瘍細胞２～３個を死滅させる能力を有し(Wiedemannら、PNAS,10985-10990, 2006、McGavernら、Nature Immunol, 918-925, 2002)、並びに特異的腫瘍抗原を認識することができるＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は低いので、腫瘍を効率的に標的化し且つ死滅させるためには、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数及び特異的腫瘍抗原を認識する頻度の両方を増大する必要性が存在する。本発明は、当該技術分野においてこの満たされていない必要性に対処している。

Ｔ細胞プライミングは、プライミングが約１００００倍（又は約５００００×：ＬＣＭＶ／ＬＭ感染症）になった後に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖を生じる (Blattmanら、J. Exp. Med., 657-664, 2002、Haringら、Immunity,19-29, 2006、Butlerら、Cellular Microbiology, 925-933, 2011、Arensら、Immunol. Rev., 190-205, 2010)。しかしヒトは、Ｔ細胞「プライミング」後に、更なる増殖のためにメモリーＴ細胞を最適に「ブースト」するためには、通常は９０日のインターバルを必要とする(Sallusto、Immunity, 451-463, 2010、Epstein、Science, 475-80, 2011、Walsh、J. Infect. Dis., 541-550, 2016)。限定された余命及び／又は大きい腫瘍サイズを伴う癌患者について、抗原特異的Ｔ細胞の数を効率的にプライムし且つブーストし、これにより免疫応答及び癌治療を改善するための代替アプローチの必要性が存在する。本発明は、当該技術分野におけるこの満たされていない必要性に対処する組成物及び方法を提供する。

発明の概要
本開示は、癌の治療方法において使用するための、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を提供し、ここで該方法は：ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を含有する第３の組成物；及び、ｉｖ）該組換えポリペプチド又は核酸を含有する第４の組成物：を投与することを含む。

本開示は、癌の治療方法における使用のための免疫細胞増殖因子を提供し、ここで該方法は：ｉ）免疫細胞増殖因子、及び任意に少なくとも１種の追加の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を含有する第３の組成物；並びに、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物：を投与することを含む。

本開示は、癌の治療方法における使用のためのＩＬ－１０阻害薬を提供し、ここで該方法は：ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）ＩＬ－１０阻害薬、及び任意に少なくとも１種の追加のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を含有する第３の組成物；並びに、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物：を投与することを含む。

本開示は、癌の治療方法において使用するための腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を提供し、ここで該方法は：ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）ＴＮＦα阻害薬；及び、任意に少なくとも１種の追加のＴＮＦα阻害薬を含有する第３の組成物；並びに、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物：を投与することを含む。

本開示は、癌の治療方法における使用のための免疫療法薬を提供し、ここで該方法は：ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を含有する第３の組成物；ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物；並びに、ｖ）免疫療法薬を含有する第５の組成物：を投与することを含む。

一部の態様において、癌の治療方法における使用のための組換えポリペプチド、核酸、免疫細胞増殖因子、ＩＬ－１０阻害薬、又はＴＮＦα阻害薬は、免疫療法薬を含有する第５の組成物を投与することを更に含む。

一部の態様において、この第１の組成物は、第２の組成物又は第３の組成物の少なくとも約２４時間前に投与される。

一部の態様において、この第１の組成物は、（ａ）１日１回、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間もしくは少なくとも２３日間；又は、（ｂ）１日１回、約７日～約１２日間；又は、（ｃ）１日１回、約７日間：投与される。

一部の態様において、（ａ）第２の組成物及び第３の組成物は、同時にもしくは連続して投与されるか；又は、（ｂ）第２の組成物は、第３の組成物の前に投与されるか；又は、（ｃ）第２の組成物は、第３の組成物の後に投与される。

一部の態様において、この第４の組成物は、反復注入として投与され、ここで、ｉ）二回目注入は、一回目注入の少なくとも１日後に投与され；ｉｉ）三回目注入は、一回目注入の少なくとも４日後に投与され；ｉｉｉ）四回目注入は、一回目注入の少なくとも５日後に投与され；ｉｖ）五回目注入は、一回目注入の少なくとも８日後に投与され；及び／又は、ｖ）六回目注入は、一回目注入の少なくとも９日後に投与される。

一部の態様において、この第３の組成物及び及び第４の組成物の一回目注入は、同時に又は連続して投与される。

一部の態様において、この第４の組成物の一回目注入は、（ａ）第２の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、もしくは少なくとも２８時間；又は、（ｂ）第２の組成物の投与後、約３時間もしくは約４時間：に投与される。

一部の態様において、癌の治療方法における使用のための組換えポリペプチド、核酸、免疫細胞増殖因子、ＩＬ－１０阻害薬、ＴＮＦα阻害薬、又は免疫療法薬は、ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第６の組成物；ｉｉ）対象における少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第７の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種のＴＮＦα阻害薬を含有する第８の組成物；並びに、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物：を含む治療サイクルを投与することを更に含む。

一部の態様において、この治療サイクルは、（ａ）少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、もしくは少なくとも５回；任意にここで治療サイクルは５回以下投与され；及び／又は、（ｂ）第４の組成物の六回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日もしくは少なくとも１４日；任意にここで第１の治療サイクルは、第４の組成物の六回目注入後約１日で投与される。

一部の態様において、この第６の組成物は：（ａ）第７の組成物もしくは第８の組成物の、少なくとも約２４時間前に；及び／又は、（ｂ）１日１回、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、もしくは少なくとも２３日間；又は、１日１回、合計約５日間～約１４日間もしくは約７日間～約１２日間：投与される。

一部の態様において、（ａ）第７の組成物及び第８の組成物は、同時にもしくは連続して投与されるか；又は、（ｂ）第７の組成物は、第８の組成物の前に投与されるか；又は、（ｃ）第７の組成物は、第８の組成物の後に投与される。

一部の態様において、この第９の組成物は、反復注入として投与され、ここで：ｉ）二回目注入は、一回目注入の少なくとも１日後に投与され；ｉｉ）三回目注入は、一回目注入の少なくとも４日後に投与され；並びに、ｉｉｉ）四回目注入は、一回目注入の少なくとも５日後に投与される。

一部の態様において、この第８の組成物及び第９の組成物の一回目注入は、同時に投与される。

一部の態様において、第９の組成物の一回目注入は：（ａ）第７の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、もしくは少なくとも２８時間；又は、（ｂ）第７の組成物の投与後、約３時間もしくは約４時間；又は、（ｃ）第７の組成物の投与後約４時間：に投与される。

一部の態様において、この第５の組成物は、反復注入として投与され、並びにここで第５の組成物は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、又は少なくとも１４回投与される。

一部の態様において、この第５の組成物の一回目注入は、第４の組成物の六回目注入後及び第９の組成物の一回目注入前に投与される。

一部の態様において、この第５の組成物は：（ａ）第４の組成物の一回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日に；又は、（ｂ）第４の組成物の一回目注入後約１０日～約１４日に；又は、（ｃ）第４の組成物の一回目注入後約１２日に：投与される。

一部の態様において、（ａ）第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物又は第９の組成物は、静脈内もしくは皮下に投与され；及び／又は、（ｂ）第１の組成物、第２の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物及び第９の組成物は、静脈内に投与され；及び／又は、（ｃ）第３の組成物及び第８の組成物は、皮下に投与される。

一部の態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）又は顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。一部の態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＬＴ３Ｌであり；任意にここでＦＬＴ３Ｌは：（ａ）約１μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約６μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、約１１μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ、約１３μｇ／ｋｇ、約１４μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約１６μｇ／ｋｇ、約１７μｇ／ｋｇ、約１８μｇ／ｋｇ、約１９μｇ／ｋｇ、もしくは約２０μｇ／ｋｇ；又は、（ｂ）約４μｇ／ｋｇ～約１３μｇ／ｋｇ；又は、（ｃ）約７μｇ／ｋｇ：の量である。

一部の態様において、少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬は、対象においてＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化し、ここで再プログラム化は、表面マーカー発現の変化を含み、ここでＭＡＲＣＯ及びＣＤ１６３は、Ｍ２ＴＡＭ上に発現された表面マーカーであり、並びにＣＤ８０は、Ｍ１ＴＡＭ上に発現された表面マーカーである。

一部の態様において、少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＦＮγ模倣薬、ＩＦＮ拮抗薬又はそれらの組合せであり；任意にここで少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬は、ＩＦＮγであり、及びここでＩＦＮγは、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、もしくは約１００μｇ；又は約５０μｇ～約１００μｇ；又は約７０μｇの投与量で投与される。

一部の態様において、このＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦα受容体（ＴＮＦαＲ）、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、又はエタネルセプトであり；任意にここで、ＴＮＦαＲは：（ａ）約１ｍｇ、約２ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇもしくは約１０ｍｇの投与量；又は、（ｂ）約４ｍｇ～約６ｍｇの投与量；又は、（ｃ）約５ｍｇの投与量：で投与される。

一部の態様において、（ａ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び／又は四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇもしくは約３５ｍｇ／ｋｇを含有するか：又は、（ｂ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇを含有するか；又は、（ｃ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの約２０ｍｇ／ｋｇを含有する。

一部の態様において、この免疫療法薬は、チェックポイント阻害薬であり；任意にここでチェックポイント阻害薬は、抗－ＰＤ１抗体であり；任意にここで抗－ＰＤ１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ又はセミプリマブである。一部の態様において、この抗－ＰＤ１抗体は、（ａ）約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇもしくは約１０ｍｇ／ｋｇ；又は、（ｂ）約０．１ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ；又は、（ｃ）約３ｍｇ／ｋｇ：の投与量で投与される。

一部の態様において、この癌は：（ａ）固形癌であり；任意にここで固形癌は、直径少なくとも約０．２ｃｍ、少なくとも約０．５ｃｍ、少なくとも約１ｃｍ、少なくとも約２ｃｍ、少なくとも約３ｃｍ、少なくとも約４ｃｍ、少なくとも約５ｃｍ、少なくとも約６ｃｍ、少なくとも約７ｃｍ、少なくとも約８ｃｍ、少なくとも約９ｃｍもしくは少なくとも約１０ｃｍであるか；及び／又は、（ｂ）癌の早期症状の再発であるか、もしくは癌の早期症状の転移である。

本開示は、ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第１の組成物；ｉｉ）対象における少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第２の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬を含有する第３の組成物；及び、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物：を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象における癌の治療方法を提供する。一部の態様において、本方法は、免疫療法薬を含有する第５の組成物を投与することを更に含む。

一部の態様において、この第１の組成物は、１日１回、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間又は少なくとも２３日間投与される。一部の態様において、第１の組成物は、１日１回、約７日間～約１２日間投与される。好ましい態様において、第１の組成物は、１日１回約７日間投与される。

一部の態様において、この第２の組成物及び第３の組成物は、同時に又は連続して投与される。一部の態様において、第２の組成物は、第３の組成物の前に投与される。一部の態様において、第２の組成物は、第３の組成物の後に投与される。

一部の態様において、この第３の組成物及び第４の組成物の一回目注入は、同時に又は連続して投与される。

一部の態様において、この第４の組成物の一回目注入は、第２の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、もしくは少なくとも２８時間に投与される。一部の態様において、第４の組成物の一回目注入は、第２の組成物の投与後、約３時間もしくは約４時間に投与される。好ましい態様において、第４の組成物の一回目注入は、第２の組成物の投与後約４時間で投与される。

一部の態様において、この開示の方法は、ｉ）少なくとも１種の免疫細胞増殖因子を含有する第６の組成物；ｉｉ）対象における少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬を含有する第７の組成物；ｉｉｉ）少なくとも１種のＴＮＦα阻害薬を含有する第８の組成物；並びに、ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物：を含む治療サイクルを投与することを更に含む。

一部の態様において、この治療サイクルは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、もしくは少なくとも５回投与される。好ましい態様において、治療サイクルは、５回以下投与される。

一部の態様において、この第１の治療サイクルは、第４の組成物の六回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日もしくは少なくとも１４日に投与される。好ましい態様において、第１の治療サイクルは、第４の組成物の六回目注入後、約１日で投与される。

一部の態様において、この第６の組成物は、第７の組成物又は第８の組成物の少なくとも約２４時間前に投与される。

一部の態様において、この第６の組成物は、１日１回、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、もしくは少なくとも２３日間投与される。一部の態様において、第６の組成物は、１日１回、合計約５日間～約１４日間投与される。好ましい態様において、第６の組成物は、１日１回、合計約７日間～約１２日間投与される。

一部の態様において、この第７の組成物及び第８の組成物は、同時に又は連続して投与される。一部の態様において、第７の組成物は、第８の組成物の前に投与される。一部の態様において、第７の組成物は、第８の組成物の後に投与される。

一部の態様において、第９の組成物は、反復注入として投与され、ここで：ｉ）二回目注入は、一回目注入の少なくとも１日後に投与され；ｉｉ）三回目注入は、一回目注入の少なくとも４日後に投与され；並びに、ｉｉｉ）四回目注入は、一回目注入の少なくとも５日後に投与される。

一部の態様において、第９の組成物の一回目注入は、第７の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、又は少なくとも２８時間に投与される。

一部の態様において、第９の組成物の一回目注入は、第７の組成物の投与後約３時間又は約４時間に投与される。一部の態様において、第９の組成物の一回目注入は、第７の組成物の投与後約４時間に投与される。

一部の態様において、第５の組成物の一回目注入は、第４の組成物の六回目注入後及び第９の組成物の一回目注入前に投与される。

一部の態様において、この第５の組成物は、第４の組成物の一回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日に投与される。一部の態様において、第５の組成物は、第４の組成物の一回目注入後、約１０日～約１４日に投与される。

好ましい態様において、この第５の組成物は、第４の組成物の一回目注入後、約１２日に投与される。

一部の態様において、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物又は第９の組成物は、静脈内もしくは皮下に投与される。好ましい態様において、第１の組成物、第２の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物及び第９の組成物は、静脈内に投与される。好ましい態様において、第３の組成物及び第８の組成物は、皮下に投与される。

一部の態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）又は顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。好ましい態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＬＴ３Ｌである。

一部の態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約１μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約６μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、約１１μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ、約１３μｇ／ｋｇ、約１４μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約１６μｇ／ｋｇ、約１７μｇ／ｋｇ、約１８μｇ／ｋｇ、約１９μｇ／ｋｇ、もしくは約２０μｇ／ｋｇの量である。一部の態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約４μｇ／ｋｇ～約１３μｇ／ｋｇの量である。好ましい態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約７μｇ／ｋｇの量である。

一部の態様において、少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＦＮγ模倣薬、ＩＦＮ拮抗薬又はそれらの組合せである。好ましい態様において、少なくとも１種のＩＬ－１０阻害薬は、ＩＦＮγである。

一部の態様において、ＩＦＮγは、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、又は約１００μｇの投与量で投与される。一部の態様において、ＩＦＮガンマは、約５０μｇ～約１００μｇの投与量で投与される。好ましい態様において、ＩＦＮガンマは、約７０μｇの投与量で投与される。

一部の態様において、このＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦα受容体（ＴＮＦαＲ）、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、又はゴリムマブである。好ましい態様において、ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦαＲである。好ましい態様において、ＴＮＦαＲは、エタネルセプトである。

一部の態様において、このＴＮＦαＲは、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇもしくは約１０ｍｇの投与量で投与される。一部の態様において、ＴＮＦαＲは、約４ｍｇ～約６ｍｇの投与量で投与される。好ましい態様において、ＴＮＦαＲは、約５ｍｇの投与量で投与される。

一部の態様において、第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び／又は四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇもしくは約３５ｍｇ／ｋｇを含有する。一部の態様において、第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇを含有する。好ましい態様において、第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入は、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド約２０ｍｇ／ｋｇを含有する。

一部の態様において、この免疫療法薬は、チェックポイント阻害薬である。好ましい態様において、免疫療法薬は、抗－ＰＤ１抗体である。一部の態様において、抗－ＰＤ１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ又はセミプリマブである。一部の態様において、抗－ＰＤ１抗体は、ニボルマブである。

一部の態様において、この抗－ＰＤ１抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇもしくは約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一部の態様において、抗－ＰＤ１抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。好ましい態様において、抗－ＰＤ１抗体は、約３ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。

一部の態様において、この癌は、固形癌である。一部の態様において、固形癌は、直径少なくとも約０．２ｃｍ、少なくとも約０．５ｃｍ、少なくとも約１ｃｍ、少なくとも約２ｃｍ、少なくとも約３ｃｍ、少なくとも約４ｃｍ、少なくとも約５ｃｍ、少なくとも約６ｃｍ、少なくとも約７ｃｍ、少なくとも約８ｃｍ、少なくとも約９ｃｍ又は少なくとも約１０ｃｍである。

一部の態様において、この癌は、癌の早期症状の再発であるか、又は癌の早期症状の転移である。

任意の先の態様は、任意の他の態様と組合せることができる。

別に規定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書において使用されるように、語句の単数形はまた、文脈が別に明確に指示しない限りは、その語句の複数形も含み；例として、用語「ある(a、an)及びその(the)」は、単数又は複数であると理解され、並びに用語「又は」は、包括的であると理解される。例として「ある要素」は、1又は複数の要素を意味する。

本明細書を通じて、語句「含んでいる」又は「含む」などの変形は、言及された要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示しているが、いずれか他の要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の排除を暗示しないことは理解されるであろう。本明細書を通じて、語句「からなっている」又は「からなる」などの変形は、言及された要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示しているが、いずれか他の要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の排除を暗示しないことは理解されるであろう。本明細書を通じて、語句「本質的になっている」又は「本質的になる」などの変形は、言及された要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群、並びに請求された本発明の特徴及び新規特徴には実質的には影響を及ぼさないいずれか他の要素、整数もしくは工程、又は要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示することは理解されるであろう。

約は、言及された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内として理解することができる。文脈から別に明らかでない限りは、本明細書に提供される全ての数値は、用語「約」により修飾される。

本明細書記載の方法及び材料に類似した又は同等の方法及び材料は、本開示の実践又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に説明される。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。本明細書に引用された参考文献は、請求された開示の先行技術であることを認めるものではない。矛盾した場合においては、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単に例証であり、且つ限定を意図しない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明らかであろう。

図面の簡単な説明
図１は、免疫原性細胞死の一部の特徴の模式図である。細胞死に関してマークされた腫瘍細胞は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０などの、プレアポトーシス性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）シグナルの細胞表面発現を有する。樹状細胞は、ＤＡＭＰシグナルの認識時に活性化される。成熟樹状細胞は、リンパ節へ遊走し、次に免疫原性細胞死を媒介するのに重要である、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライムすることができる。

図２は、質量分析により決定された、約２０ｋＤａのＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）の分子量を描くグラフを示す。

図３Ａは、Ｈ４４１ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７４、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後、ＣＲＴ（カルレティキュリン）を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌに希釈し、且つＨ４４１細胞は、３７℃で１時間インキュベーションした。ＣＲＴ－発現しているＨ４４１細胞は、ＣＲＴｍＡｂ(Abcam)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図３Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図４Ａは、Ｈ４６０ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７７、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＣＲＴを発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度０．１、１、１０、２５、３５、５０μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４６０細胞は、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＣＲＴ－発現しているＨ４６０細胞は、ＣＲＴｍＡｂ(Abcam)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図４Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図５Ａは、ＨＣＴ１５ヒト結腸癌細胞株（ＣＣＬ－２２５、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＣＲＴを発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨＣＴ１５細胞は、３７℃で５５分間インキュベーションした。ＣＲＴ－発現しているＨＣＴ１５細胞は、ＣＲＴｍＡｂ(Abcam)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図５Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図６Ａは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株（ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＣＲＴを発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＭＣＦ７細胞は、３７℃で１時間１０分インキュベーションした。ＣＲＴ－発現しているＭＣＦ７細胞は、ＣＲＴｍＡｂ(Abcam)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図６Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図７Ａは、Ｈ４４１ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７４、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ７０（７０ｋＤａヒートショックタンパク質）を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４４１細胞は、３７℃で１時間５０分インキュベーションした。Ｈｓｐ７０－発現しているＨ４４１細胞は、Ｈｓｐ７０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図７Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図８Ａは、Ｈ４６０ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７７、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ７０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度０．１、１、１０、２５、３５、５０μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４６０細胞は、３７℃で１時間１５分インキュベーションした。Ｈｓｐ７０－発現しているＨ４６０細胞は、Ｈｓｐ７０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図８Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図９Ａは、ＨＣＴ１５ヒト結腸癌細胞株（ＣＣＬ－２２５、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ７０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨＣＴ１５細胞は、３７℃で１時間５０分インキュベーションした。Ｈｓｐ７０－発現しているＨＣＴ１５細胞は、Ｈｓｐ７０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図９Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１０は、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株（ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ７０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＭＣＦ７細胞は、３７℃で１時間４０分インキュベーションした。Ｈｓｐ７０－発現しているＭＣＦ７細胞は、Ｈｓｐ７０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１０Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１１Ａは、Ｈ４４１ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７４、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ９０（９０ｋＤａヒートショックタンパク質）を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４４１細胞は、３７℃で１時間４０分インキュベーションした。Ｈｓｐ９０－発現しているＨ４４１細胞は、Ｈｓｐ９０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１１Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１２Ａは、Ｈ４６０ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７７、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ９０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度０．１、１、１０、２５、３５、５０μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４６０細胞は、３７℃で１時間５分インキュベーションした。Ｈｓｐ９０－発現しているＨ４６０細胞は、Ｈｓｐ９０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１２Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１３Ａは、ＨＣＴ１５ヒト結腸癌細胞株（ＣＣＬ－２２５、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ９０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨＣＴ１５細胞は、３７℃で１時間３０分インキュベーションした。Ｈｓｐ９０－発現しているＨＣＴ１５細胞は、Ｈｓｐ９０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１３Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１４Ａは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株（ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、ＨＳＰ９０を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＭＣＦ７細胞は、３７℃で１時間４５分インキュベーションした。Ｈｓｐ９０－発現しているＭＣＦ７細胞は、Ｈｓｐ９０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)を使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１４Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１５Ａは、Ｈ４４１ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７４、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、カスパーゼ３／７を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４４１細胞は、３７℃で２時間４５分インキュベーションした。Ｈ４４１細胞は、カスパーゼ３／７(Invitrogen)アッセイを使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１５Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１６Ａは、Ｈ４６０ヒト肺癌細胞株（ＨＴＢ－１７７、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、カスパーゼ３／７を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度０．１、１、１０、２５、３５及び５０μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨ４６０細胞は、３７℃で２時間４５分インキュベーションした。Ｈ４６０細胞は、カスパーゼ３／７(Invitrogen)アッセイを使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１６Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１７Ａは、ＨＣＴ１５ヒト結腸癌細胞株（ＣＣＬ－２２５、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、カスパーゼ３／７を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＨＣＴ１５細胞は、３７℃で２時間３０分インキュベーションした。ＨＣＴ１５細胞は、カスパーゼ３／７(Invitrogen)アッセイを使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１７Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１８Ａは、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株（ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）の、様々な濃度のＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）による処理後に、カスパーゼ３／７を発現する細胞の割合を定量する棒グラフを示す。ストックＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）は、最終濃度３５、５０、７５μｇ／ｍｌへ希釈し、且つＭＣＦ７細胞は、３７℃で２時間４５分インキュベーションした。ＭＣＦ７細胞は、カスパーゼ３／７(Invitrogen)アッセイを使用する、FACSCalibur(BD Biosciences)フローサイトメトリーにより決定した。

図１８Ｂは、定量に使用したフローサイトメトリープロファイルを示している。

図１９は、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ１に対するＩＬ－６、ＩＬ－１０及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の作用の模式図を示す。ヒトＳＴＡＴ１は、半減期～２４時間を有する。マウスＳＴＡＴ１は、半減期～７．８時間を有する。ＳＴＡＴ３とＳＴＡＴ１のバランスは、各々、発癌及び腫瘍抑制に影響を及ぼす。

図２０は、ＩＬ－１０及びＩＬ－６経路の模式図を示す。ＩＬ－１０は、ＳＴＡＴ３活性化を維持する。ＩＬ－６は、自己－阻害するＳＯＣＳ３により、ＳＴＡＴ３を一過性に活性化する。

図２１は、測定された血清ＩＬ－１０％、対、ＩＦＮガンマ投与量の棒グラフである。変動する投与量でのＩＦＮγの静脈内注射が、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスへ与えられた（各ＩＦＮγ投与量についてｎ＝２）。血液を、ＩＦＮγ注射後３．５時間で採取し、且つ血清ＩＬ－１０を、Luminexアッセイにより決定した。

図２２は、ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）に関するマウスの投薬レジメンの模式図を示す。Ｃ５７ＢＬ／６は、ＭＣ３８、Ｅ０７７１及びＢ１６Ｆ１０細胞の、各々、１ｘ１０^６個細胞の接種によりチャレンジした。水平斜線付矢印は、この組換えポリペプチドの腹腔内又は静脈内注射の時点を示している。斜斜線付矢印は、ＩＦＮγ注射の腹腔内又は静脈内注射の時点を示している。初回治療レジメン後に完全奏効を伴うマウスは、初回治療レジメンに先行する同じ細胞型の２×１０^５個細胞の接種を用いる再チャレンジに供した。

図２３Ａ－２３Ｄは、組換えペプチド及びＩＦＮγで処置後の、ＭＣ３８及びＥ０７７１腫瘍マウスの腫瘍容積を描く一連の折れ線グラフを示す。図２３Ａは、ＭＣ３８腫瘍チャレンジ（０日目に１×１０^６個細胞／マウス）後の、組換えポリペプチド及びＩＦＮγ処置レジメン（７日目に開始、ｎ＝１０マウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）後の、ＭＣ３８腫瘍容積（ｍｍ^３）及び完全奏効（ＣＲ）率を示す。図２３Ｂは、ＭＣ３８腫瘍再チャレンジ（０日目に２×１０^５個細胞／マウス：ＣＲから６ヶ月）後の、ＭＣ３８腫瘍容積及び無再発生存（ＲＦＳ）率（２種の腫瘍チャレンジ実験からプールしたｎ＝１２のＣＲマウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）を示す。図２３Ｃは、Ｅ０７７１腫瘍チャレンジ（０日目の１×１０^６個細胞／マウス）後の、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ／ＩＦＮγ処置（１０日目に開始、ｎ＝１０マウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）後の、Ｅ０７７１腫瘍容積及びＣＲ率を示す。図２３Ｄは、Ｅ０７７１腫瘍再チャレンジ（０日目の２×１０^５個細胞／マウス：ＣＲから６ヶ月）後の、Ｅ０７７１腫瘍容積及びＲＦＳ率（２種の腫瘍チャレンジ実験からプールしたｎ＝１０のＣＲマウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）を示す。４回の独立した実験を、図２３Ａ及び２３Ｃに示している。２回の独立した実験を、図２３Ｃ及び２３Ｄに示している。

図２４Ａ－２４Ｂは、Ｂ６マウスにおけるＢ１６１０腫瘍チャレンジ及び再チャレンジのモデルである。図２４Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍チャレンジ（０日目に１×１０^６個細胞／マウス）後の、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ／ＩＦＮγ処理（７日目に開始、ｎ＝１０マウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍容積及び完全奏効（ＣＲ）率である。図２４Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍再チャレンジ（０日目に２×１０^５個細胞／マウス：ＣＲから６ヶ月）後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍容積及び無再発生存（ＲＦＳ）率（２つの腫瘍チャレンジ実験からプールされたｎ＝８のＣＲマウス）又はビヒクル（ｎ＝５マウス）である。４回の独立した実験を、図２４Ａに示している。２回の独立した実験を、図２４Ｂに示している。

図２５は、ＰＢＭＣ生存能である。ＰＢＭＣは、様々な濃度の組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの非存在下又は存在下で、３時間４５分インキュベーションした。その後、これらの細胞を、CellEvent（商標）カスパーゼ３／７で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＰＢＭＣ生存能は、アポトーシスの逆である。結果は、３回の独立した実験からの１つの代表的データである。

図２６は、腫瘍内ＸＣＲ１^＋樹状細胞（ＤＣ）動員に関して提唱されたカルレティキュリン（ＣＲＴ）－媒介型経路の模式図である。（１）ＦＬＴ３Ｌは、血液中ＸＣＲ１^＋ＤＣを増やす。（２）ＩＦＮγは、ＩＬ－１０を減少し、より良いＤＣ機能性のために腫瘍微小環境を再プログラム化する。（３）ＩＦＮγは同時に、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を、Ｍ１ＴＡＭとなるよう再プログラム化する。（４）ＣＲＴ－インデューサーは、腫瘍からＣＲＴを誘導し、ＣＤ９１を介してＭ１ＴＡＭを活性化する。（５）活性化されたＭ１ＴＡＭは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮアルファ（ＩＦＮα）、及びＩＦＮベータ（ＩＦＮβ）を生成する。（６）ＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＦＮα／ＩＦＮβ－活性化されたＮＫは、豊富なＸＣＬ１を生成する。（７）ＸＣＬ１は、走化性因子として働き、血管から腫瘍部位へＸＣＲ１^＋ＤＣを動員する。（８）ＨＳＰ７０／９０－ペプチド複合体は、Ｔ細胞プライミング／活性化／増殖のために、リンパ節内のＴ細胞へと抗原及び交差提示抗原と共にリンパ節へ遊走するよう、ＣＤ４０を介して腫瘍内ＸＣＲ１^＋ＤＣを成熟／活性化する。

図２７は、癌患者におけるＦＬＴ３ＬとＩＬ１０／ＩｇＧ比の相関関係を描くグラフである。処置前血清ＦＬＴ３Ｌ比：０．６～０．８×（健常者に比して）である２０名の進行した病期の肺癌及び膵臓癌の患者を、以下の判定基準に合致するように、治験投与量（μｇ／ｋｇ）のＦＬＴ３Ｌの静脈内注射で、連続１２日間、毎日処置した。癌患者由来のＰＢＭＣ中のＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣ増加比の判定基準は、必要なＦＬＴ３Ｌ投与量を決定するために、ＦＬＴ３Ｌ処置後、少なくとも１２倍（健常ヒトのそれに類似している）と設定した。回帰直線は、ｙ＝３．４ｘ＋０．７８であった。

図２８は、ＩＦＮガンマによる単球の処理は、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージへ再プログラム化することができることを示す棒グラフである。健常ヒトＣＤ１４^＋単球を、Ｍ２－様マクロファージ細胞へ分化するように、Ｍ－ＣＳＦ（１μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１μｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－１０（１μｇ／ｍＬ）の存在下で培養した。分化したＭ２マクロファージ細胞を、ＩＦＮγ（１ｎｇ／ｍＬ）で１時間パルス処理した。４時間後、これらの細胞を、ＦＡＣＳにより分析し、Ｍ２マクロファージ細胞及びＭ１マクロファージ細胞の割合を決定した。Ｍ２マクロファージは、ＭＡＲＣＯ及びＣＤ１６３を高度に発現するのに対し、Ｍ１マクロファージは、ＣＤ８０を高度に発現する。左側の３本のバーは、ＩＦＮガンマによる処理前の、Ｍ２マクロファージ集団を表す。右側の３本のバーは、ＩＦＮガンマ処理後の、Ｍ１マクロファージ集団への再プログラム化を表す。Ｍ２マクロファージではなく、活性化されたＭ１マクロファージのみが、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５などの、炎症促進性サイトカインを生成することができる。

図２９は、メラノーマの治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下接種した。対照（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＦＬＴ３Ｌ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、及びＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）。腫瘍は、４日間（４日目）で、およそ４０～５０ｍｍ^３に達した。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日に４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、概略図に示された日に連続６日間、静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇ静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置した。ＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１３．５ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。

図３０は、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ及びＣＲＹＡ＿１Ｂ（ＣＲＴ－インデューサー）を使用する併用療法で処置したマウスの生存曲線である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスには、各群について、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞を、皮下接種した：対照（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＦＬＴ３Ｌ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、及びＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）。マウスは、図３２に示した投薬レジメンに従い処置した。ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ及びＣＲＹＡ＿１Ｂで処置した全てのマウスは、生存した。

図３１は、メラノーマ治療のための、単回抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボにおける投薬レジメンを示す模式図である。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、以下の８群の各々に、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞を皮下接種した：ＩｇＧ２ａ群：１８日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、２２日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、３０日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、及び３７日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）；抗－ＰＤ１群：１８日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、２２日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、３０日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、及び３７日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）。抗－ＰＤ１／ＩｇＧ２ａ処置に関して、これらのマウスは、抗－ＰＤ１群についてマウスの抗－ＰＤ１（ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ）を、又は対照群についてラットＩｇＧ２ａを、指定された日に全て３ｍｇ／ｋｇで静脈内に１回投与した。腫瘍は、５日間（５日目）で、およそ５５ｍｍ^３に達した。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、マウスへ、ＦＬＴ３Ｌを１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスへ、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、その４時間後ＴＮＦαＲ注射（２０μｇ、皮下注射により）、その直後にＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、１２日目に開始し、３サイクル繰り返した。Ｔ細胞をブーストするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３１日目に開始し、２サイクル繰り返した。１９、２３、３１及び３８日目に、Ｔ細胞分析のために、抗－ＰＤ１及びＩｇＧ２ａの両群からマウスのＰＢＭＣを採取した。

図３２は、メラノーマ治療のための、反復抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、以下の７群の各々に、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞を皮下接種した：ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２日目に抗－ＰＤ１×１（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２及び２５日目に抗－ＰＤ１×２（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２、２５、２８日目に抗－ＰＤ１×３（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２、２５、２８、３１日目に抗－ＰＤ１×４（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２、２５、２８、３１、３４日目に抗－ＰＤ１×５（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２、２５、２８、３１、３４、３７日目に抗－ＰＤ１×６（ｎ＝５）、及びＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０日目に抗－ＰＤ１×７（ｎ＝５）。抗－ＰＤ１処置に関して、これらのマウスには、マウス抗－ＰＤ１（ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ）を、指定された日に全て３ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した。腫瘍は、５日間（５日目）で、およそ５５ｍｍ^３に達した。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、マウスへ、ＦＬＴ３Ｌを１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、その４時間後ＴＮＦαＲ注射（２０μｇ、皮下注射により）、その直後にＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、１２日目に開始し、３サイクル繰り返した。２３、２６、２９、３２、３５、３８及び４１日目に、Ｔ細胞分析のために、全ての抗－ＰＤ１群からマウスのＰＢＭＣを採取した。

図３３は、メラノーマの治療のための、ＩｇＧ２ａ対照を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。Ｔ細胞プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（×１）（対照）プロトコール。

図３４は、メラノーマの治療のための、単回抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断対照を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。３００ｍｍ^３に関するＴ細胞プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×１）プロトコール。

図３５は、メラノーマの治療のための、単回抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断対照を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。４００ｍｍ^３に関するＴ細胞プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×１）プロトコール。

図３６は、メラノーマの治療のための、単回抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断対照を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。４００ｍｍ^３に関するＴ細胞プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×３）プロトコール。

図３７は、メラノーマの治療のための、単回抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断対照を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。５００ｍｍ^３に関するＴ細胞プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×５）プロトコール。

図３８は、図３７に示されたＴ細胞プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×５）プロトコールによる治療後の、抗原曝露歴のあるＣＤ４４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の計算を描く概略図である。

図３９は、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、治療サイクルの第１日目；第２日目に異なる投与量のＣＲＹＡ＿１Ｂを使用するＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関して、１×１０^６個Ｂ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した。（投与量_１日目；投与量_２日目）：２５ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２５ｍｇ／ｋｇ；１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１９ｍｇ／ｋｇ；１９ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１８ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）及び１８ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、マウスへ、ＦＬＴ３Ｌを１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、静脈内に連続７日間投与された。ＩＦＮγ処置に関して、マウスに、１３日目に、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、４時間後に初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置した。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により、投与量_１日目；投与量_２日目(ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３０日目に、全てのマウスのＰＢＭＣを、Ｔ細胞分析のために採取した。

図４０は、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂによる処置による、自然免疫の活性化の下流作用を示す、概略的フローチャートである。

図４１は、メラノーマの治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。ＦＬＴ３／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関する体温測定。

図４２は、メラノーマの治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。ＦＬＴ３／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関する体温測定。

図４３は、メラノーマ治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。ＴＮＦαＲによるＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量の最適化。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、治療サイクルの第１日目；第２日目に異なる投与量のＣＲＹＡ＿１Ｂを使用するＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαＲ、及びＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関して、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞を皮下接種した。（投与量_１日目；投与量_２日目）：２５ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２５ｍｇ／ｋｇ；１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１９ｍｇ／ｋｇ；１９ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１８ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）及び１８ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリーパーを用い二次元で測定し、且つ容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２（式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である）。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、マウスへ、ＦＬＴ３Ｌを、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内投与した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、１３日目に、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、４時間後にＴＮＦαＲ注射（２０μｇ、皮下注射による）し、直後に初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により、投与量_１日目；投与量_２日目（ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３０日目に、全てのマウスのＰＢＭＣを、Ｔ細胞分析のために採取した。

図４４は、メラノーマ治療のための、抗－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断を伴う、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの併用療法に関する、インビボ投薬レジメンを示す模式図である。転移性大型腫瘍に関するプライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）レジメン。この模式図は、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ及びＣＲＹＡ＿１Ｂに関するタイムライン及び投与量を示している。抗－ＰＤ１は、プライミングサイクルにおけるＣＲＹＡ＿１Ｂの最終注入と、ブースティングサイクルにおけるＦＬＴ３Ｌの最初の注入の間に、少なくとも１回投与される。任意に、抗－ＰＤ１は、２回以上投与されてよい。

発明の詳細な説明
本開示は、組換えポリペプチド、ＩＬ－１０阻害薬、ＴＮＦα阻害薬、及び免疫細胞増殖因子を投与することにより、対象において癌を予防するか、進行を遅延するか、症状を治療するかもしくは緩和するか、又はそうでなければ改善する方法を提供する。本方法は、免疫療法薬を投与することを含む。

本開示は、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチドを提供する。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチドも提供する。

本開示はまた、組換えポリペプチド変種が、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる酸性組換えポリペプチド変種も提供する。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる酸性組換えポリペプチドも提供する。

「酸性変種」は、関心対象の親又は当初のポリペプチドよりも、より酸性である（例えば、ｐＩの計算により決定される）関心対象のポリペプチドの変種である。ポリペプチドの「ｐＩ」又は「等電点」は、ポリペプチドの正帯電が、その負帯電と釣り合っているｐＨを指す。ｐＩは、例えば、ポリペプチドのアミノ酸残基の正味の電荷から、当該技術分野において公知の任意の手段により計算することができるか、又は等電点電気泳動法により決定することができる。

一部の態様において、酸性変種は、アミノ酸置換を行うことにより、当初の親配列に由来する。第１の変異置換は、当初の親配列の任意の塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ又はＨ）、中性非極性アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ又はＰ）、又は中性極性アミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ又はＱ）を、酸性アミノ酸（Ｄ又はＥ）により置換することにより作製される。第２の変異置換は、第１の変異置換の逆の変異置換を行うことにより、作製される。例えば、当初の親配列由来の全てのセリン（Ｓ）残基は、グルタミン酸（Ｅ）残基により置換される（第１の置換）。加えて当初の親配列由来の全てのグルタミン酸（Ｅ）残基は、セリン（Ｓ）残基により置換される（第２の置換）。一態様において、この逆置換は、当初の親配列の全てのセリン（Ｓ）残基のグルタミン酸（Ｅ）への変異、及び当初の親配列の全てのグルタミン酸（Ｅ）残基のセリン（Ｓ）残基への変異；当初の親配列の全てのセリン（Ｓ）残基のアスパラギン酸（Ｄ）への変異、及び当初の親配列の全てのアスパラギン酸（Ｄ）残基のセリン（Ｓ）残基への変異；当初の親配列の全てのバリン（Ｖ）残基のアスパラギン酸（Ｄ）への変異、及び当初の親配列の全てのアスパラギン酸（Ｄ）のバリン（Ｖ）残基への変異；又は、当初の親配列の全てのセリン（Ｓ）残基のロイシン（Ｌ）残基への変異、又は当初の親配列の全てのロイシン（Ｌ）残基のセリン（Ｓ）残基のへの変異を含む、から本質的になる又はからなる。好ましい態様において、アミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）が、その組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多い、又は等しい量で各々独立して存在する、組換えポリペプチドを生じる。好ましい態様において、アミノ酸置換は、酸性変種の３種の最も豊富なアミノ酸残基として、又は酸性変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さとして、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）を持つ組換えポリペプチドを生じる。一部の態様において、アミノ酸の複数の逆変異置換が作製され得る。

本開示はまた、その組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であり、組換えペプチド変種のｐＩは、その組換えペプチドが由来したペプチド配列のｐＩよりもより低く、並びにロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、その組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりもより多いもしくは等しい量で各々独立して存在する、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる又はからなる、酸性組換えポリペプチド変種も提供する。本開示はまた、その組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であり、並びにロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性変種の３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる又はからなる、酸性組換えポリペプチド変種も提供する。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列に対し少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる又はからなる、酸性組換えポリペプチド変種も提供する。

好ましい態様において、本開示は、表１Ｂに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチドを提供する。本開示はまた、表１Ｂに示された任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドも提供する。

本開示は、配列番号：１のアミノ酸配列、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # XP_013036875.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：１のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # XP_013036875.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：１のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：９のアミノ酸配列、又は配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # XP_013036875.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：９は、配列番号：１のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：９は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：９のｐＩは、配列番号：１のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：９内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する（すなわち、配列番号：９の１７３アミノ酸配列のうち、グルタミン酸（Ｅ）は、２３残基であり、ロイシン（Ｌ）は、１５残基であり、及びアスパラギン酸（Ｄ）は、１４残基であり、プロリン（Ｐ）（１４残基）は配列番号：９内で次に最も多く存在するアミノ酸残基である)。

本開示は、配列番号：２のアミノ酸配列、又は配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、アメリカレアアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # P02505.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、アメリカレアアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # P02505.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：２のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１０のアミノ酸配列、又は配列番号：１０のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、アメリカレアアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # P02505.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１０は、配列番号：２のポリペプチドに対し少なくとも７５％の配列同一性を有し、配列番号：１０は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１０のｐＩは、配列番号：２のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１０内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：３のアミノ酸配列、又は配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # O12984.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：３のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # O12984.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：３のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１１のアミノ酸配列、又は配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ)(GenBank # O12984.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１１は、配列番号：３のポリペプチドに対し少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：１１は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１１のｐＩは、配列番号：３のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１１内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：４のアミノ酸配列、又は配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # Q05557.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # Q05557.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：４のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１２のアミノ酸配列、又は配列番号：１２のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、マガモアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # Q05557.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１２は、配列番号：４のポリペプチドに対し少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：１２は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１２のｐＩは、配列番号：４のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１２内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：５のアミノ酸配列、又は配列番号：５のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、ホモ・サピエンスアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # AAH69528.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：５のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、ホモ・サピエンスアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # AAH69528.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：５のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：５のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１３のアミノ酸配列、又は配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、ホモ・サピエンスアルファ－Ａ－結晶（ＣＲＹＡＡ）(GenBank # AAH69528.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１３は、配列番号：５のポリペプチドに対し少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：１３は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１３のｐＩは、配列番号：５のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１３内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：６のアミノ酸配列、又は配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２３(GenBank # AAA28637.1)由来の、ＨＳＰ２３組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２３(GenBank # AAA28637.1)由来の、ＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性ＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種であって、ここでこのＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：６のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性ＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性ＨＳＰ２３組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１４のアミノ酸配列、又は配列番号：１４のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２３(GenBank # AAA28637.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１４は、配列番号：６のポリペプチドに対し少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：１４は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１４のｐＩは、配列番号：６のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１４内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：７のアミノ酸配列、又は配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２２(GenBank # AAA28635.1)由来の、ＨＳＰ２２組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：７のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２２(GenBank # AAA28635.1)由来の、酸性ＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性ＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種であって、ここでこのＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：７のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性ＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性ＨＳＰ２２組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１５のアミノ酸配列、又は配列番号：１５のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、キイロショウジョウバエＨＳＰ２２(GenBank # AAA28635.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１５は、配列番号：７のポリペプチドに対し少なくとも６５％の配列同一性を有し、配列番号：１５は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１５のｐＩは、配列番号：７のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１５内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、配列番号：８のアミノ酸配列、又は配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # XP_013042703.1)由来の、アルファ結晶組換えポリペプチド配列又はアミノ酸配列を提供する。

本開示は、配列番号：８のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # XP_013042703.1)由来の、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種配列又はアミノ酸配列を提供し、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であるか、又は配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種であって、ここでこのアルファ結晶組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。一部の態様において、この組換えポリペプチドのｐＩは、配列番号：８のｐＩよりも低い。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。一部の態様において、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又は酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。

好ましい態様において、本組換えポリペプチドは、配列番号：１６のアミノ酸配列、又は配列番号：１６のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、もしくはからなる組換えポリペプチドを含む、から本質的になる、又はからなる、シナガチョウアルファ－Ｂ－結晶（ＣＲＹＡＢ）(GenBank # XP_013042703.1)由来の酸性変種である。例えば、配列番号：１６は、配列番号：８のポリペプチドに対し少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号：１６は、ｐＩにより決定された酸性であり、配列番号：１６のｐＩは、配列番号：８のｐＩよりも低く、並びにアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）及びロイシン（Ｌ）は、配列番号：１６内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。

本開示は、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチドをコードしている、単離された核酸分子を提供する。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列に対し、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチドをコードしている、単離された核酸分子も提供する。

本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチド変種をコードしている、単離された核酸分子も提供し、ここでこの組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性である。本開示はまた、表１Ａに示されたアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる組換えポリペプチド変種をコードしている、単離された核酸分子も提供する。

本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる酸性組換えポリペプチド変種をコードしている、単離された核酸分子も提供し、ここでこの組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であり、ここでこの組換えペプチド変種のｐＩは、この組換えペプチドが由来したペプチド配列のｐＩよりも低く、並びにここでロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この組換えポリペプチド配列内に存在する任意の他のアミノ酸残基の量よりも、より多いか又は等しい量で各々独立して存在する。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる酸性組換えポリペプチド変種をコードしている、単離された核酸分子も提供し、ここでこの組換えポリペプチド変種は、等電点（ｐＩ）により決定された酸性であり、並びにここでロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）は、この酸性変種において３種の最も豊富なアミノ酸残基であるか、又はこの酸性アルファ結晶組換えポリペプチド変種の次に最も豊富なアミノ酸残基に対しより多いもしくは等しい豊富さである。本開示はまた、表１Ａに示された任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる酸性組換えポリペプチド変種をコードしている、単離された核酸分子も提供する。

本開示はまた、表２Ａに示された任意の核酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、単離された核酸分子も提供する。本開示はまた、表２Ａに示された任意の核酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一である核酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、核酸分子も提供する。

好ましい態様において、本開示は、表２Ｂに示された任意の核酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる単離された核酸分子を提供する。本開示はまた、表２Ｂに示された任意の核酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一である核酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる、核酸分子も提供する。

本開示の治療方法は、免疫細胞増殖因子の投与に関与している。免役細胞増殖因子は、免疫細胞の数を増加する増殖因子として機能する。一部の態様において、免疫細胞は、樹状細胞である。一部の態様において、免疫細胞増殖因子は、ＣＤ４０Ｌである。一部の態様において、免疫細胞増殖因子は、抗－ＣＤ４０抗体である。一部の態様において、免疫細胞増殖因子は、サイトカインである。一部の態様において、サイトカインは、ＦＭＳ－様チロシンキナーゼリガンド（ＦＬＴ３Ｌ）及び顆粒球－マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、免疫細胞増殖因子は、ＦＬＴ３Ｌである。

顆粒球／マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、白血球増殖因子として機能し、幹細胞を刺激し、顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）並びに単球を産生するサイトカインである。ＧＭ－ＣＳＦのポリヌクレオチド配列は、公のデータベースから、寄託番号Ml 1734(ヒト)；NM_009969(マウス)；EU520303(ニワトリ)；NM_001037660(ラットCsf2ra)；及び、NM_133555(ラットCsf2rb)として入手可能であり、それらの配列は引用により本明細書中に組み込まれている。顆粒球／マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のアミノ酸配列は、公のデータベースから、寄託番号AAA52122(ヒト)；NP_034099(マウス)；ACBl 1534(ニワトリ)；NP_001032749(ラットCsf2ra)；及び、NP 598239(Csf2rb)として入手可能であり、それらの配列は引用により本明細書中に組み込まれている。

ＦＬＴ３Ｌ：ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、免疫細胞、特に骨髄由来ＤＣ（ｍＤＣ）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む樹状細胞の数を増加する、サイトカイン及び増殖因子として機能する、内因性小型分子である。ヒトＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣは、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１２３^－骨髄系ＤＣ（ｍＤＣ）及びＣＤ１１ｃ^－ＣＤ１２３^＋形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）を含む。

樹状細胞、造血幹細胞、前駆細胞もしくはそれらの任意の組合せのための増殖因子として機能し得るＦＬＴ３Ｌのポリヌクレオチド配列は、公のデータベースから、寄託番号U04806(ヒト)；及び、NM_013520(マウス)として入手可能であり、それらの配列は引用により本明細書中に組み込まれている。ＦＬＴ３／ＦＬＫ２リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）のアミノ酸配列は、公のデータベースから、寄託番号AAAl7999(ヒト)；及び、NP_038548(マウス)として入手可能であり、それらの配列は引用により本明細書中に組み込まれている。

本明細書において使用される用語「樹状細胞」又は「ＤＣ」は、哺乳類免疫系の一部を形成する免疫細胞を指す。ＤＣの主な機能は、外来抗原をプロセッシングし、且つそれらの表面上の抗原エピトープを免疫系の他の細胞に提示することにより、「抗原提示細胞」として働くことである。ＤＣは、主に皮膚（そこにはランゲルハンス細胞と称される特定された樹状細胞型が存在する）並びに鼻、肺、胃及び腸の内層などの、外部環境と接触している組織中に、少量で存在する。ＤＣはまた、血液中に未成熟状態でも認められ得る。一旦活性化されると、これらは、リンパ系組織へ遊走し、そこでこれらはＴ細胞及びＢ細胞と相互作用し、適応免疫応答を開始する。特定の発達段階で、ＤＣは、分岐した突起（樹状）へ成長し、このことが細胞にその名称をもたらす。一部の実施態様において、ＤＣは、細胞表面マーカーＣＤ１１ｃの発現を基にふたつの亜集団へ分化され得る。一部の実施態様において、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣは、ＩＬ１２を産生し、リンパ球においてＴｈ１反応を刺激する一方で、ＣＤ１１ｃ^-ＤＣは、ＩＬ１２はほとんど合成しないが、アルファ－インターフェロンの主要給源であり、且つリンパ球を刺激し、Ｔｈ２サイトカインを産生する。

本明細書において使用される用語「サイトカイン」は、細胞間のシグナルを運搬する免疫系の特異的細胞により分泌された、タンパク質、ペプチド、又は糖タンパク質の分子の範疇を指す。サイトカインは、自然免疫及び適応免疫の両免疫応答の重要な成分であり、且つ病原体に遭遇した免疫細胞により分泌され、追加の免疫細胞を活性化及び動員し、その病原体に対する体系的反応を増大することが多い。サイトカインは典型的には、病原体に感染した細胞の領域全体に放出され、その結果反応する免疫細胞は、感染部位へ到達する。各個別のサイトカインは、マッチする細胞表面受容体を有する。サイトカインがその細胞表面受容体へ結合する際に、細胞内シグナル伝達事象のカスケードは、その細胞の機能を変更する。これは、他のサイトカインの産生、他の分子の表面受容体の発現の増加、又はフィードバック阻害によるサイトカインそれ自身の抑制に関与した遺伝子のアップレギュレーション及び／又はダウンレギュレーションを含む。特定のサイトカインの所定の細胞に対する作用は、サイトカイン、その細胞外存在量、細胞表面上の相補受容体の存在及び存在量、並びに受容体結合により活性化された下流シグナルにより左右される。一般的サイトカインは、白血球間の連絡に寄与するインターロイキン；走化性を促進するケモカイン；及び、宿主細胞におけるタンパク質合成を停止するなどの、抗－ウイルス作用を有するインターフェロンを含む。多種類のサイトカインが類似の機能を共有するように見える点で、サイトカインは、かなりの「重複性」により特徴付けられる。例えば、「顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子」（ＧＭ－ＣＳＦ）と「Ｆｍｓ－様チロシンキナーゼ３リガンド」（Ｆｌｔ３Ｌ）は両方共、樹状細胞の成長及び分化を促進するサイトカインである。

本開示の治療方法は、対象におけるＩＬ－１０阻害薬の投与に関与している。ＩＬ－１０を減少する例証的物質は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＦＮγ模倣薬、ＩＦＮγ拮抗薬又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくはＩＬ－１０阻害薬は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）である。一部の態様において、ＩＦＮγは、ＩＬ－１０を減少し、且つＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化する。

本開示の治療方法は、ＴＮＦα阻害薬の投与に関与している。一部の態様において、ＴＮＦα阻害薬は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の阻害薬である。例証的ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦα受容体（ＴＮＦαＲ）、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（レミケード）、アダリムマブ（ヒュミラ）、セルトリズマブペゴル（シムジア）、及びゴリムマブ（シンポニー）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦαＲである。好ましい態様において、ＴＮＦα阻害薬は、エタネルセプトである。

本開示の治療方法は、免疫療法薬の投与に関与している。一部の態様において、免疫療法薬は、チェックポイント阻害薬である。用語「阻害」又は「阻害薬」は、例えば免疫チェックポイント阻害薬などの、所定の分子の特定のパラメータの、例えば活性の減少を含む。例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータなどの活性などの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％もしくはそれよりも大きいなどの、活性の阻害は、この用語により含まれる。必要な阻害レベルは、１００％ではない。

一部の態様において、チェックポイント阻害薬は、ＰＤ－１阻害薬である。一部の態様において、ＰＤ－１阻害薬は、抗－ＰＤ１抗体である。一部の態様において、ＰＤ－１阻害薬は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。例証的抗－ＰＤ－１モノクローナル抗体は、セミプリマブ（リブタヨ）、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の態様において、チェックポイント阻害薬は、ＰＤ－Ｌ１阻害薬である。例証的ＰＤ－Ｌ１阻害薬は、アベルマブ（バベンチオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ）及びアテゾリズマブ（テセントリク）を含むが、これらに限定されるものではない。

用語「プログラム死１」又は「ＰＤ－１」は、全てのアイソフォーム、哺乳類の、例えばヒトＰＤ－１、ヒトＰＤ－１の種ホモログ、及びＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを含むアナログを含む。ＰＤ－１、例えばヒトＰＤ－１のアミノ酸配列は、例えばShinohara Tら、(1994) Genomics 23(3):704-6；Finger L Rら、Gene (1997) 197(1-2):177-87など、当該技術分野において公知である。

用語「ＰＤ－リガンド１」又は「ＰＤ－Ｌ」は、全てのアイソフォーム、哺乳類の、例えばヒトＰＤ－１、ヒトＰＤ－Ｌ１の種ホモログ、及びＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを含むアナログを含む。ＰＤ－Ｌ１、例えばヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、例えばDong Hら、(1999) Nat. Med. 5 (12):1365-1369；Freeman Gら、(2000) J. Exp. Med. 192 (7):1027-1034など、当該技術分野において公知である。

本開示はまた、本明細書に開示された組換えポリペプチド又は核酸を含有する医薬組成物も提供する。

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下など、経口（例えば吸入）、経真皮（局所）、及び経粘膜の投与を含む。非経口、皮内、又は皮下適用に使用される液剤又は懸濁剤は、以下の成分を含有することができる：無菌の希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩など、並びに張度を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースなどである。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの、酸又は塩基により調節され得る。非経口調製品は、ガラス又はプラスチックにより製造された、アンプル、使い捨て注射器又は反復投与量バイアル中に封入され得る。

一態様において、本医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、本明細書に開示された組換えポリペプチドのいずれか一つを含む、から本質的になる、又はからなることができる。一部の態様において、本医薬組成物は、水性製剤として製剤化される。この水性製剤は、非限定的にＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａＯＡｃから選択されてよい、塩緩衝液を含む、から本質的になる、又はからなることができる。一態様において、この塩緩衝液は、ＮａＣｌを含む。一態様において、ＮａＣｌは、約０．４Ｍ～約１．０Ｍの濃度である。一態様において、この緩衝溶液のｐＨは、約７．５～約９．０である。一態様において、緩衝溶液のｐＨは、約７．４である。

本発明の化合物又は医薬組成物は、化学療法の治療に関して現在使用されている周知の多くの方法により、対象へ投与され得る。例えば、癌の治療に関して、本発明の化合物は、腫瘍へ直接注射されるか、血流もしくは体腔へ注射されるか、経口服用されるか、又は貼付剤により皮膚を通し適用されてよい。

本明細書において使用される用語「治療的有効量」は、確定された疾患もしくは状態を治療、改善、もしくは予防するための、又は検出可能な治療作用もしくは阻害作用を発揮するための、医薬品の量を指す。この作用は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ方法により検出されることができる。対象に関する正確な有効量は、対象の体重、サイズ、及び健康；その状態の性質及び程度；並びに、投与のために選択された治療薬又は治療薬の組合せにより左右されるであろう。所定の状況のための治療的有効量は、臨床医の技術及び判断の範囲内である慣習的経験により決定することができる。一態様において、治療される疾患又は状態は、細胞増殖性障害である。好ましい態様において、治療される疾患又は状態は、癌である。

任意の化合物に関して、治療的有効量は、例えば新生物形成細胞などの、細胞培養アッセイにおいて、又は通常ラット、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタなど、動物モデルにおいて、最初に推定され得る。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用されてよい。そのような情報は、次に、ヒトにおいて有用な投与量及び投与経路を決定するために使用され得る。例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）及びＬＤ_５０（集団の５０％における致死的投与量）など、治療的／予防的有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準の医薬手法により決定されてよい。毒性効果と治療効果の間の投与量比は、治療係数であり、これはＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表されることができる。大きい治療係数を示す医薬組成物が、好ましい。用量は、利用される剤形、患者の感受性、及び投与経路に応じて、この範囲内を変動し得る。

用量及び投与は、活性物質（複数可）の十分なレベルを提供するか、又は所望の作用を維持するように、調節される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の全身の健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時刻及び頻度、併用薬（複数可）、反応の感受性、及び療法に対する耐性／反応を含む。

本発明の活性化合物を含有する医薬組成物は、一般に公知である様式において、例えば従来型の混合、溶解、造粒、糖衣錠－製造、すりつぶし(levigating)、乳化、カプセル封入、封入(entrapping)、又は凍結乾燥のプロセスにより、製造されてよい。医薬組成物は、活性化合物の医薬として使用され得る調製品への加工処理を促進する賦形剤及び／又は補助剤を含む、１又は複数の医薬として許容し得る担体を使用する、従来型の様式で製剤化されてよい。当然、好適な製剤は、選択された投与経路によって左右される。

注射用途に適している医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性である場合）又は分散液、及び無菌の注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌の散剤を含む。静脈内投与に関して、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（商標）(BASF, Parsippany, N.J.)又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、且つ容易に注射可能である程度に流体であるべきである。これは、製造及び貯蔵の条件下で、安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の夾雑作用に対し保存されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同類のもの）、並びにそれらの好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、及び同類のものなどの、様々な抗菌剤及び抗真菌剤により達成され得る。多くの場合、組成物内に、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムなどを含有することが好ましいであろう。注射用組成物の延長された吸収は、組成物内に、吸収を遅延する物質、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンを含むことによりもたらされ得る。

無菌の注射用液は、必要に応じて、先に列挙した構成成分の一つ又は組合せと共に、好適な溶媒中に、必要量の活性化合物を混入し、引き続き濾過滅菌することにより、調製され得る。一般に分散液は、基本的分散媒及び先に列挙したものから必要な他の構成成分を含む無菌のビヒクルに活性化合物を混入し、調製される。無菌注射用液の調製のための無菌散剤の場合、調製方法は、先に濾過滅菌したそれらの溶液から、活性構成成分に加え任意の追加の所望の構成成分の散剤を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。

経口組成物は一般に、不活性希釈剤又は食用の医薬として許容し得る担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか、又は錠剤へ圧縮され得る。経口治療薬投与の目的のためには、この活性化合物は、賦形剤と共に混入され、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形状で使用されることができる。経口組成物はまた、含嗽剤として使用するために液体担体を使用し調製されることができ、ここでは液体担体中の本化合物は、経口適用され、且つうがいされ、吐き出すか又は飲み込まれる。医薬として適合し得る結合剤、及び／又はアジュバント材料は、本組成物の一部として含まれることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤及び同類のものは、以下の構成成分のいずれか、又は類似の性質の化合物を含み得る：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなど；賦形剤、例えばデンプン又は乳糖など、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、又はトウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はSterotesなど；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリンなど；あるいは、香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料など。

本医薬組成物は、本明細書記載の組換えポリペプチド及び核酸のいずれかの共-製剤を含むことができる。

本医薬組成物は、投与に関する指示書と一緒に、容器、パック、又は分注器の中に含まれることができる。

本開示はまた、本明細書に開示された組換えポリペプチド及び本明細書に開示された組換えポリペプチドをコードしている核酸分子を含む、プラスミド、発現ベクター及び宿主細胞も提供する。一態様において、本開示は、核酸分子を含む、プラスミド又は発現ベクターを提供し、この分子は、配列番号：１７－３２のいずれか一つのヌクレオチド配列、又は配列番号：１７－３２の核酸配列のいずれかと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一である核酸配列、又はそれらの断片を含む。一態様において、本開示は、配列番号：１－１６のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号：１－１６のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む組換えポリペプチドを含む宿主細胞、あるいは配列番号：１７－３２のいずれか一つの核酸配列、又は配列番号：１７－３２の核酸配列のいずれかと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一である核酸配列、又はそれらの断片を含む核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

本明細書において使用される用語「形質転換」、「トランスフェクション」、及び「形質導入」は、核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の細胞への移動を指す。本明細書において使用される用語「遺伝子形質転換」は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの、細胞への移動及び組込みを指す。移動された核酸は、発現ベクターを介して、細胞へ導入され得る。

所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクター内にその分子を配置することにより、増殖される。プラスミドを含む、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターが、使用され得る。プラスミドの選択は、その中での増殖が望まれる細胞の種類及び増殖の目的によって左右されるであろう。特定のベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列の増幅及び作出に有用である。他のベクターは、培養における細胞内の発現に適している。更に他のベクターは、動物もしくはヒト全体の細胞における移動及び発現に適している。好適なベクターの選択は、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。多くのそのようなベクターは、市販されている。部分的又は完全長のポリヌクレオチドが、典型的にはベクター内の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合により、ベクターへ挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、インビボにおける相同組換えにより挿入され得る。典型的には、これは、所望のヌクレオチド配列に隣接するベクターと相同の領域の結合により、達成される。相同の領域は、オリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は例えば相同領域と所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により、追加される。

発現に関して、発現カセット又は発現系が使用されてよい。本明細書に開示されたポリペプチドをコードしている核酸を発現するために、このポリペプチドをコードしている核酸分子は、発現ベクターにおける転写発現を制御する調節配列へ機能的に連結され、宿主細胞へ導入される。発現ベクターは、プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列に加え、翻訳調節配列及びその発現ベクターを保持する細胞の選択に適しているマーカー遺伝子を含むことができる。本開示のポリヌクレオチドによりコードされた遺伝子産物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類及び哺乳類の系を含む、いずれか都合の良い発現系において発現される。発現ベクターにおいて、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、所望の発現特性を得るために適している調節配列へ連結される。これらは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、及びインデューサーを含むことができる。これらのプロモーターは、調節されるか（例えば、ステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター(Invitrogen)由来のプロモーター）又は構成的である（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、又はＬＴＲ配列由来のプロモーター）ことができる。これらは、ベクターへの連結に関して先に説明された技術を使用し、所望のヌクレオチド配列へ連結される。当該技術分野において公知の任意の技術が、使用され得る。従って発現ベクターは一般に、そこでコード領域が、転写開始領域の転写制御下で機能的に連結される、誘導性又は構成的であることができる、転写及び翻訳の開始領域、並びに転写及び翻訳の終結領域を提供するであろう。

発現カセット（「発現ユニット」）は、様々なベクター、例えばプラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ラムダ、Ｐ１、Ｍ１３などのバクテリオファージ、植物又は動物のウイルスベクター（例えば、レトロウイルス－ベースのベクター、アデノウイルスベクター）、及び同類のものなどに導入されることができ、ここでこれらのベクターは、発現ベクターを含む細胞の選択を提供する能力により、通常特徴付けられる。これらのベクターは、特にプラスミドもしくはウイルスとしての染色体外維持を、又は宿主染色体への組込みを提供することができる。染色体外維持が望ましい場合、当初の配列は、プラスミドの複製のために提供され、これは低又は高コピー数であることができる。多種多様なマーカー、特に毒素に対し保護するもの、より特定すると抗生物質が、選択に利用可能である。選択される特定のマーカーは、宿主の性質に従い選択され、ここで場合によっては、相補性(complementation)が、栄養要求性宿主と共に利用され得る。ＤＮＡ構築物の導入は、例えば、接合、細菌形質転換、カルシウム－沈降ＤＮＡ、電気穿孔法、融合、トランスフェクション、ウイルスベクターの感染、遺伝子銃、及び同類のものを含む、都合の良い方法を使用することができる。

従って本開示内で使用するためのポリペプチドは、従来型の技術に従い遺伝子操作された宿主細胞において作出され得る。好適な宿主細胞は、外来ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクションされ、並びに培養において成長される細胞の種類であり、且つ細菌細胞、真菌細胞、及び培養されたより高等な真核細胞（多細胞生物の培養された細胞を含む）、特に培養された哺乳類細胞を含む。クローニングされたＤＮＡ分子を操作し、外来性ＤＮＡを様々な宿主細胞へ導入する技術は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)、及びAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology (第4版、John Wiley & Sons, 1999)に明らかにされている。例えば、本開示の組換えポリペプチドは、細菌大腸菌細胞から発現され得る。

組換えポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列としても公知）を、発現ベクター内に提供することができる。分泌シグナル配列は、組換えタンパク質の未変性型のものであることができるか、又は別の分泌されたタンパク質に由来するかもしくは新たに合成されることができる。分泌シグナル配列は、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列へ機能的に連結され、すなわちこれら２つの配列は、正確なリーディングフレーム内で連結され、新規に合成されたポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路へ方向付けるように配置される。分泌シグナル配列は、通常関心対象のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の５’側に位置するが、特定のシグナル配列は、関心対象のＤＮＡ配列のどこかに配置され得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号参照)。

培養された哺乳類細胞は、本開示内で使用するための組換えポリペプチドの作出に適した宿主であることができる。外因性ＤＮＡを哺乳類宿主細胞へ導入する方法は、リン酸カルシウム－媒介型トランスフェクション(Wiglerら、Cell 14:725, 1978；Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7:603, 1981；Graham及びVan der Eb、Virology 52:456, 1973)、電気穿孔法(Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982)、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型トランスフェクション(Ausubelら、前掲)、及びリポソーム－媒介型トランスフェクション(Hawley-Nelsonら、Focus 15:73, 1993；Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993)を含む。培養した哺乳類細胞における組換えポリペプチドの作出は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号、及びRingold、米国特許第4,656,134号により開示されている。好適な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣＣＲＬ１５８７）、ヒト胎児腎細胞（２９３－ＨＥＫ；ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１、ＢＨＫ－５７０；ＡＴＣＣＣＲＬ８５４４、ＡＴＣＣＣＲＬ１０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－Ｋ１；ＡＴＣＣＣＣＬ６１；ＣＨＯＤＧ４４；ＣＨＯＤＸＢ１１(Hyclone, Logan, UT)；同じく、例えばChasinら、Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)参照)；ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣＣＣＬ８２）、ＨｅＬａＳ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２．２）、ラットヘパトーマ細胞（Ｈ－４－ＩＩ－Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ１５４８）、ＳＶ４０－形質転換されたサル腎細胞（ＣＯＳ－１；ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、及びマウス胚細胞（ＮＩＨ－３Ｔ３；ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）を含む。追加の好適な細胞株は、当該技術分野において公知であり、且つアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）(Manassas, Virginia)などの、公の寄託機関から入手可能である。ＳＶ－４０又はサイトメガロウイルス由来のプロモーターなど、強力な転写プロモーターを、使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい。他の好適なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のもの(米国特許第4,579,821号及び第4,601,978号)及びアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。

薬物選択は一般に、それに外来ＤＮＡが挿入されている培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は一般に、「トランスフェクタント」と称される。選択性物質の存在下で培養され且つそれらの子孫に関心対象の遺伝子を受け渡すことができる細胞は、「安定したトランスフェクタント」と称される。例証的選択マーカーは、Ｇ－４１８などの、選択がネオマイシン型薬物の存在下において実行される、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞増殖を可能にする、キサンチン－グアニンホスホリボシル転移酵素に対するｇｐｔ遺伝子；並びに、ゼオシン、ブレオマイシン、ブラストサイジン、及びヒグロマイシンに対する耐性を提供するマーカー（例えば、Gatignolら、Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987；Drocourtら、Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990参照)を含む。選択システムはまた、「増幅」と称されるプロセスである、関心対象の遺伝子の発現レベルを増加するために使用することができる。増幅は、低レベルの選択性物質の存在下で、トランスフェクタントを培養し、その後導入された遺伝子の産物を高レベルで生成する細胞を選択するために、選択性物質の量を増加することにより、実行される。例証的増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与する、ジヒドロ葉酸還元酵素である。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチル転移酵素）も、使用することができる。

昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞を含む、他のより高等な真核細胞も、宿主として使用することができる。植物細胞における遺伝子発現のためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネスの使用は、Sinkarら、J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987により検証されている。昆虫細胞の形質転換及びそこでの外来ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号及びWO 94/06463により明らかにされている。

昆虫細胞は、通常オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、組換えバキュロウイルスにより感染され得る。King及びPossee、The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London)；O’Reillyら、Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994)；並びに、Baculovirus Expression Protocol Methods in Molecular Biology (Richardson編集, Humana Press, Totowa, NJ, 1995)参照。組換えバキュロウイルスはまた、Luckowら(J. Virol. 67:4566-4579, 1993)により説明された、トランスポゾン－ベースのシステムの使用により作出され得る。遺伝子導入ベクターを利用するこのシステムは、キットの形(BAC-TO-BACキット；Life Technologies, Gaithersburg, MD)で市販されている。遺伝子導入ベクター(例えば、PFASTBAC1；Life Technologies)は、関心対象のタンパク質をコードしているＤＮＡを、「バクミド」と称される大型プラスミドとして、大腸菌において維持されたバキュロウイルスゲノムへ移動するために、Ｔｎ７トランスポゾンを含む。Hill-Perkins及びPossee、J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990；Bonningら、J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994；並びに、Chazenbalk及びRapoport、J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995参照。加えて遺伝子導入ベクターは、先に説明したような、ポリペプチド伸長又は親和性タグをコードしているＤＮＡとの、インフレーム融合を含むことができる。当該技術分野において公知の技術を使用し、タンパク質－コードしているＤＮＡ配列を含む遺伝子導入ベクターは、大腸菌宿主細胞へ形質転換され、且つこれらの細胞は、組換えバキュロウイルスの指標である断続性のｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドについてスクリーニングされる。この組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡは、通常の技術を使用し単離され、且つＳｆ９細胞などの、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用される。引き続きこのタンパク質又は関心対象のタンパク質を発現する組換えウイルスが作製される。組換えウイルスストックは、当該技術分野において通常使用される方法により作出される。

タンパク質生成に関して、組換えウイルスを使用し、宿主細胞、典型的にはツマジロクサヨトウ(fall armyworm)スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞株（例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞）又はイラクサギンウワバ由来の細胞株（例えば、ＨＩＧＨＦＩＶＥ細胞；Invitrogen, Carlsbad, CA)を感染することができる)。一般に、Glick及びPasternak、Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)参照。同じく米国特許第5,300,435も参照。無血清培地を使用し、これらの細胞を成長及び維持する。好適な培地処方は、当該技術分野において公知であり、且つ商業的供給業者から入手することができる。これらの細胞は、接種密度およそ２～５×１０^５個細胞から、１～２×１０^６個細胞の密度まで成長させられ、この時点で組換えウイルスストックが、感染多重度（ＭＯＩ）０．１～１０で、より典型的にはほぼ３で添加される。使用される手順は、一般に、利用可能な実験室マニュアルにおいて説明されている（例えば、King及びPossee、前掲；O’Reillyら、前掲；Richardson、前掲参照）。

酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本開示内で使用される。これに関する酵母種は、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ、ピキア・パストリス、及びピキア・メタノリカを含む。Ｓ．セレビシアエ細胞を外因性ＤＮＡにより形質転換し、且つそれから組換えポリペプチドを作出する方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；及び、Murrayら、米国特許第4,845,075号により明らかにされている。形質転換された細胞は、通常薬物耐性又は特定の栄養素(例えばロイシン)の非存在下での成長能力の、選択マーカーにより決定された表現型により、選択される。サッカロミセス・セレビシアエにおいて使用するための例証的ベクターシステムは、Kawasakiら(米国特許第4,931,373号)により明らかにされたＰＯＴ１ベクターシステムであり、これは形質転換された細胞が、グルコース-含有培地における成長により選択されることを可能にする。酵母における使用に適したプロモーター及びターミネーターは、解糖系酵素遺伝子由来のもの(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；並びに、Bitter、米国特許第4,977,092号参照)、並びにアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。同じく米国特許第4,990,446号；第5,063,154号；第5,139,936号；及び、第4,661,454号も参照されたい。ハンセヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス・ラクティス、クルイベロミセス・フラギリス、ウスチラゴ・マイディス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・グレルモンジ、及びカンジダ・マルトサを含む、他の酵母に関する形質転換システムは、当該技術分野において公知である。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；Cregg、米国特許第4,882,279号；及び、Raymondら、Yeast, 14:11-23, 1998を参照されたい。アスペルギルス細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従い、利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナムを形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラを形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。ピキア・メタノリカにおける組換えタンパク質の作製は、米国特許第5,716,808号；第5,736,383号；第5,854,039号；及び、第5,888,768号に開示されている。

大腸菌、バチルス、及び他の属の細菌株を含む原核宿主細胞もまた、本開示内で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、且つそれらにクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現する技術は、当該技術分野において周知である(例えば、Sambrook及びRussell、前掲参照)。大腸菌などの細菌において組換えタンパク質を発現する場合、このタンパク質は、細胞質内に、典型的には不溶性顆粒として保持され得るか、又は細菌の分泌配列により細胞膜周辺腔へ方向付けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒が回収され、且つ例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用い変性される。変性されたタンパク質は次に、尿素の溶液並びに還元型及び酸化型グルタチオンの組合せに対する透析、それに続く緩衝食塩水に対する透析など、変性剤を希釈することにより、リフォールディング及び二量体化され得る。代りにこのタンパク質は、可溶性型で細胞質から回収され、変性剤を使用せずに単離されることができる。このタンパク質は、例えばリン酸緩衝食塩水中、水性抽出物として、細胞から回収される。関心対象のタンパク質を捕獲するために、この抽出物は、固定化された抗体又はヘパリン－セファロースカラムなど、クロマトグラフィー媒体へ直接適用される。分泌されたタンパク質は、細胞周辺腔の内容物を放出するために、これらの細胞を破壊し（例えば音波又は浸透圧ショックにより）、且つこのタンパク質を回収することにより、可溶型又は機能型で細胞周辺腔から回収され、これにより変性及びリフォールディングの必要性を回避する。

形質転換されたか又はトランスフェクションされた宿主細胞は、従来型手順に従い、選択された宿主細胞の成長に必要な栄養素及び他の成分を含有する培養培地において培養される。限定培地及び複合培地を含む、様々な好適な培地が、当該技術分野において公知であり、且つ一般に炭素給源、窒素給源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含有する。培地はまた、必要に応じ、増殖因子又は血清などの、そのような成分も含むことができる。成長培地は一般に、例えば、発現ベクター上に保持されるか又は宿主細胞へ同時トランスフェクションされた選択マーカーにより補完されている薬物選択又は必須栄養素の欠乏により、外因性に追加されたＤＮＡを含む細胞を選択するであろう。

本組換えポリペプチドは、従来型のタンパク質精製法により、典型的にはクロマトグラフィー技術の組合せにより、精製され得る。一般に、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988)；Scopes、Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994)を参照されたい。ゲル濾過などの、追加の精製工程を、所望の純度レベルを得るため、又は脱塩、緩衝液交換などを提供するためなどに、使用することができる。

本開示は、本明細書に開示された任意の組換えポリペプチド及び任意のIL-10阻害薬を投与することにより、対象における癌を予防する、進行を遅延する、症状を治療するもしくは緩和する、又はそれ以外に改善する方法を提供する。

それを必要とする対象は、細胞増殖障害を有する対象であることができる。本開示の方法に従い治療される癌は、原発性、進行性、転移性又は再発性腫瘍を含む。好ましくは、この腫瘍は、固形腫瘍である。癌は、例えば、中枢神経系の腫瘍、神経膠腫腫瘍、腎臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、膵臓癌腫瘍、胃癌腫瘍、食道癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、尿管癌腫瘍、腎盂癌腫瘍、尿路上皮細胞癌腫瘍、尿生殖器癌腫瘍、子宮頸癌腫瘍、子宮内膜癌腫瘍、陰茎癌腫瘍、甲状腺癌腫瘍、又は前立腺癌腫瘍、乳癌腫瘍、メラノーマ腫瘍、神経膠腫腫瘍、結腸癌腫瘍、肺癌腫瘍、肉腫癌腫瘍、又は扁平細胞腫瘍、又は前立腺癌腫瘍を含む。一態様において、対象は、肺癌、結腸癌又は乳癌を有する。

一態様において、それを必要とする対象において免疫応答を増強又は誘導する方法は、少なくとも１種の本開示の組換えポリペプチド、又は本開示の組換えポリペプチドをコードしている核酸を投与することを含む。一態様において、本開示の少なくとも１種の組換えポリペプチドは、配列番号：１－８の組換えポリペプチド、又は配列番号：１－８の任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列又は本明細書記載のようなそれらの酸性変種を含む。一態様において、本開示の少なくとも１種の組換えポリペプチドは、配列番号：９－１６の組換えポリペプチド、又は配列番号：９－１６の任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、本開示の少なくとも１種の組換えポリペプチドは、配列番号：９の組換えポリペプチドを含む。

一態様において、「免疫応答」の増強又は誘導は、例えば、サイトカイン放出反応又は液性（抗原－特異的）免疫応答であることができる。増強される免疫応答は、例えば、自然免疫応答、局所免疫応答、粘膜免疫応答又は全身性免疫応答であることができる。本明細書において使用される用語「増強する」又は「増強している」は、存在する免疫応答を強化する（増強する）ことを指す。用語「誘導する」は、免疫応答の開始を指す。

一態様において、「免疫応答」は、「免疫原性細胞死」又は「免疫原性アポトーシス」を指し、これは、死滅しつつある細胞により発現された抗原に対する強固な免疫応答により特徴付けられる（図１）。癌細胞などの死滅しつつある細胞は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、又はそれらの組合せを含む、プレアポトーシス性ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）シグナルの増加した発現を有することができる。好ましい態様において、これらの細胞は、ＣＲＴ、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０の増加した発現を有する。当業者に公知の技術を使用し、これらの細胞表面マーカーの発現を評価することができる。例えば、これらの細胞表面マーカーの発現は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学（例えば、組織特異性抗体又は細胞－マーカー特異性抗体による染色）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分取器（ＭＡＣＳ）などの標準技術又は当該技術分野において公知の他の類似の方法を用いて、評価することができる。蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性を基に、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である(Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165)。個々の粒子の蛍光部位のレーザー励起は、少しの電荷を生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁気による分離を可能にする。一態様において、細胞表面マーカー－特異性抗体又はリガンドは、識別できる蛍光標識により標識される。細胞は、フローサイトメーターを通じてプロセッシングされ、使用した抗体へのそれらの結合能力を基に、細胞の分離が可能になる。一態様において、本開示の方法は、癌細胞表面などの細胞表面上の、プレアポトーシス性ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０又はカルレティキュリンの発現を誘導する。

一態様において、「免疫原性細胞死」又は「免疫原性アポトーシス」は、内因性樹状細胞活性化、樹状細胞の成熟及び貪食の速度のより迅速化につながる、樹状細胞の、癌細胞などの細胞との相互作用に関与している。樹状細胞によるカルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、又はそれらの組合せを含むプレアポトーシス性ＤＡＭＰシグナルの認識は、「内因性樹状細胞活性化」の引き金をひく。これは「樹状細胞成熟」へつながり、このことは、細胞内エンドサイトーシスコンパートメントから樹状細胞表面への主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の再分布、抗原の内部移行のダウンレギュレーション、共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の表面発現の増加、細胞骨格の再構築、ケモカイン、サイトカイン及びプロテアーゼの分泌、接着分子の表面発現及びケモカイン受容体の表面発現を含む。免疫原性細胞死により死滅しつつある癌細胞に露出されている成熟樹状細胞は、リンパ節へ遊走し、且つ多くの腫瘍－特異性Ｔリンパ球（ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む）を誘導することができる。このことは、癌細胞に対する、標的化されたＴ細胞が媒介した反応の引き金を引く。「免疫原性細胞死」又は「免疫原性アポトーシス」のプロセスは、図１に示している。当業者は、細胞死を誘導することがわかっている全ての技術は、必ずしも免疫原性細胞死を誘導しないことを理解するであろう。免疫原性細胞死を誘導する薬剤のみが、効率的な内因性樹状細胞活性化を誘起するであろう。一態様において、「免疫応答」は、内因性樹状細胞活性化、樹状細胞成熟又はＴ細胞媒介性反応又はそれらの組合せを指す。

一態様において、「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死として公知の細胞シグナル伝達カスケードを説明するために使用される用語である。様々な治療指標が、アポトーシスを誘導する分子（例えば癌）について存在する。アポトーシスは、例えば、ＤＮＡの断片化、膜の非対称性の変化、アポトーシス性カスパーゼの活性化、及び／又はシトクロムＣ及びＡＩＦの放出を測定するアッセイを含む、当該技術分野において公知且つ入手可能な数多くの利用可能な技術のいずれかにより、モニタリングすることができる。一態様において、アポトーシスは、カスパーゼ３／７の活性化及び発現により測定される。

本開示はまた、それを必要とする対象における細胞増殖性障害の少なくとも１つの症状を、治療、予防又は緩和する方法を提供する。一態様において、この方法は、それを必要とする対象における細胞増殖性障害の少なくとも１つの症状を緩和する。一態様において、細胞増殖性障害は、癌である。好ましい態様において、癌は、肺癌、結腸癌又は乳癌である。

一態様において、それを必要とする対象における細胞増殖性障害の少なくとも１つの症状を、治療、予防又は緩和する方法は、少なくとも１種の本開示の組換えポリペプチド、又は本開示の組換えポリペプチドをコードしている核酸を投与することを含む。一態様において、少なくとも１種の本開示の組換えポリペプチドは、配列番号：１－８の組換えポリペプチド、又は配列番号：１－８の任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列、又は本明細書記載のそれらの酸性変種を含む。一態様において、少なくとも１種の本開示の組換えポリペプチドは、配列番号：９－１６の組換えポリペプチドを含む。好ましい態様において、少なくとも１種の本開示の組換えポリペプチドは、配列番号：９の組換えポリペプチド、又は配列番号：９－１６の任意のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書において使用される「対象」は、任意の哺乳類、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダであることができる。好ましい態様において、対象はヒトである。一態様において、「それを必要とする対象」は、細胞増殖性障害を有する対象、又は全集団に対し細胞増殖性障害を発症する増大したリスクを有する対象である。一態様において、それを必要とする対象は、前癌状態を有する。好ましい態様において、それを必要とする対象は、癌を有する。

本明細書において使用される「治療する」は、疾患、状態、又は障害を根絶することを目的とした患者の管理及び看護を説明し、且つ症状もしくは合併症を軽減もしくは緩和する、又は疾患、状態もしくは障害を取り除くことを含む。本明細書において使用される「予防する」は、この疾患、状態又は障害の症状又は合併症の発症を停止することを説明する。本明細書において使用される「緩和する」は、疾患、状態又は障害の症状又は合併症を軽減することを説明する。

本明細書において使用される用語「細胞増殖性障害」は、細胞の調節されない又は異常な成長、又は両方が、癌性であるか又は癌性でない、望ましくない状態又は疾患の発達に繋がり得る状態を指す。例証的本開示の細胞増殖性障害は、細胞分裂が調節されない様々な状態を包含している。例証的細胞増殖性障害は、新生物、良性腫瘍、悪性腫瘍、前癌状態、上皮内(in situ)腫瘍、被包型腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍、固形癌、免疫学的腫瘍、血液学的腫瘍、癌、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫、及び急速に分裂する細胞を含むが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される用語「急速に分裂する細胞」は、同じ組織内の隣接細胞もしくは並置された細胞において予想されるか又は認められる速度を超える速度又はより大きい速度で分裂する任意の細胞として規定される。細胞増殖性障害は、前癌又は前癌状態を含む。細胞増殖性障害は、癌を含む。好ましくは、本明細書に提供される方法は、癌の症状を治療又は緩和するために使用される。用語「癌」は、固形癌、並びに血液学的腫瘍及び／又は悪性腫瘍を含む。「前癌細胞」又は「前癌性細胞」は、前癌又は前癌状態である細胞増殖性障害が顕在化している細胞である。「癌細胞」又は「癌性細胞」は、癌である細胞増殖性障害が顕在化している細胞である。癌細胞又は前癌性細胞を同定するために、任意の測定の再現性のある手段を使用してよい。癌細胞又は前癌性細胞は、組織試料(例えば生検試料)の組織学的タイピング又はグレード化により同定され得る。癌細胞又は前癌性細胞は、好適な分子マーカーの使用により同定され得る。

例証的非癌性状態又は障害は、関節リウマチ；炎症；自己免疫疾患；リンパ増殖性状態；末端肥大症；リウマチ様脊椎炎；変形性関節症；痛風、他の関節炎状態；敗血症；敗血性ショック；内毒素性ショック；グラム陰性菌敗血症；毒素性ショック症候群；喘息；成人呼吸窮迫症候群；慢性閉塞性肺疾患；慢性肺炎症；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；膵線維症；肝線維症；急性及び慢性腎疾患；過敏性腸症候群；発熱(pyresis)；再狭窄；脳マラリア；脳卒中及び虚血性傷害；神経外傷；アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；急性及び慢性疼痛；アレルギー性鼻炎；アレルギー性結膜炎；慢性心不全；急性冠症候群；悪液質；マラリア；ハンセン病；リーシュマニア症；ライム病；ライター症候群；急性滑膜炎；筋肉変性；滑液嚢炎；腱炎；腱滑膜炎；ヘルニア状、断裂した、もしくは脱出した椎間板症候群；骨化石症；血栓症；再狭窄；珪肺；肺サルコイドーシス；骨粗鬆症などの骨吸収疾患；移植片－対－宿主反応；多発性硬化症；狼瘡；線維筋痛；ＡＩＤＳ、並びに帯状疱疹、Ｉ型もしくはＩＩ型単純ヘルペス、インフルエンザウイルス及びサイトメガロウイルスなどの他のウイルス性疾患；並びに、糖尿病を含むが、これらに限定されるものではない。

例証的癌は、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管癌、虫垂癌、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、基底細胞癌腫、皮膚癌（非メラノーマ）、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、尿路膀胱癌、骨関節癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽腫、テント上未分化神経外胚葉腫瘍、視覚伝導路及び視床下部の神経膠腫、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管癌、神経系癌、神経系リンパ腫、中枢神経系癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚T細胞性リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（胃部）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍グリオーマ、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、眼球癌、島細胞腫（内分泌性膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎臓の癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔の癌、肝臓癌、肺癌、非－小細胞肺癌、小細胞肺癌、ＡＩＤＳ－関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、髄芽腫、メラノーマ、眼球内（眼）メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平頸部癌、口腔癌、舌癌、多発性内分泌腺腫症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖疾患、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口の癌、口腔癌、口腔咽頭癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性潜在的腫瘍、膵臓癌、島細胞膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂及び尿道の移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌腫、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃部）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、睾丸癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、腎盂及び尿路及び他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない。

「肺癌」は、肺の細胞が関与する細胞増殖性障害である。一態様において、肺癌は、肺細胞に影響を及ぼす細胞増殖性障害の全ての型を含む。一態様において、肺癌は、肺癌、肺の前癌又は前癌状態、肺の良性増殖又は病巣、及び肺の悪性増殖又は病巣、並びに肺以外の体の組織及び臓器の転移性病巣を含む。好ましい態様において、本開示の方法は、肺癌又は肺の細胞増殖性障害を治療すために、使用されてよい。一態様において、肺癌は、肺の全ての癌型を含む。別の態様において、肺癌は、悪性肺新生物、上皮内(in situ)癌腫、定型カルチノイド腫瘍、及び非定型カルチノイド腫瘍を含む。別の態様において、肺癌は、小細胞肺癌（「ＳＣＬＣ」）、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、扁平上皮癌、腺癌、小型細胞癌腫、大型細胞癌腫、腺扁平上皮癌、及び中皮腫を含む。別の態様において、肺癌は、「瘢痕癌腫」、気管支肺胞癌、巨細胞癌腫、紡錘細胞癌、及び大型細胞神経内分泌癌を含む。一態様において、肺癌は、ステージ０、ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶの肺癌を含む。別の態様において、肺癌は、組織学的及び超微細構造の不均一を有する肺新生物（例えば混合細胞型）を含む。

一態様において、肺癌は、肺細胞に影響を及ぼす細胞増殖性障害の全ての型を含む。一態様において、肺の細胞増殖性障害は、肺癌、肺の前癌状態を含む。一態様において、肺の細胞増殖性障害は、肺の過形成、化生、及び異形成を含む。別の態様において、肺癌は、アスベスト起因性過形成、扁平化生、及び良性反応性中皮化生を含む。別の態様において、肺の細胞増殖性障害は、重層扁平上皮による円柱上皮の置き換え、及び粘膜異形成を含む。別の態様において、タバコの煙及びアスベストなどの吸入された有害な環境物質に曝露された個体は、肺の細胞増殖性障害を発症するリスクが増大し得る。別の態様において、肺の細胞増殖性障害の発症に対し個体を罹りやすくする先行する肺疾患は、慢性間質性肺炎、壊死性肺疾患、強皮症、リウマチ性疾患、サルコイドーシス、間質性肺炎、結核、反復性肺炎、特発性肺線維症、肉芽腫、石綿症、硬化性肺胞炎、及びホジキン病を含む。

「結腸癌」は、結腸の細胞が関与する細胞増殖性障害である。好ましい態様において、本開示の方法は、結腸癌又は結腸の細胞増殖性障害を治療するために使用されてよい。一態様において、結腸癌は、結腸の全ての癌型を含む。別の態様において、結腸癌は、散発性及び遺伝性結腸癌を含む。別の態様において、結腸癌は、悪性結腸新生物、上皮癌腫(in situ)、定型カルチノイド腫瘍、及び非定型カルチノイド腫瘍を含む。別の態様において、結腸癌は、腺癌、扁平上皮癌、及び腺扁平上皮癌を含む。別の態様において、結腸癌は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、家族性腺腫様ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ-ジェガース症候群、ターコット症候群及び若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝性症候群に関連している。別の態様において、結腸癌は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、家族性腺腫様ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ・ジェガース症候群、ターコット症候群及び若年性ポリポーシスからなる群から選択される遺伝性症候群により引き起こされる。

一態様において、結腸癌は、結腸細胞に影響を及ぼす細胞増殖性障害の全ての型を含む。一態様において、結腸癌は、結腸癌、結腸の前癌状態、結腸の腺腫性ポリープ、及び結腸の異時性病巣を含む。一態様において、結腸癌は、ステージ０、Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＶＡ、ＩＶＢ及びＩＶＣの結腸癌を含む。一態様において、結腸癌は、腺腫を含む。一態様において、結腸癌は、結腸の過形成、化生又は異形成により特徴付けられる。別の態様において、結腸の細胞増殖性障害の発症に対し個体を罹りやすくする先行する結腸疾患は、先行する結腸癌を含む。別の態様において、結腸の細胞増殖性障害の発症に対し個体を罹りやすくする進行中の疾患は、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む。一態様において、結腸の細胞増殖性障害は、ｐ５３、ｒａｓ、ＦＡＰ及びＤＣＣからなる群から選択される遺伝子における変異に関係している。別の態様において、個体は、ｐ５３、ｒａｓ、ＦＡＰ及びＤＣＣからなる群から選択される遺伝子における変異の存在に起因した、結腸の細胞増殖性障害の発症の上昇したリスクを有する。

「乳癌」は、乳房の細胞に関与した細胞増殖性障害である。好ましい態様において、乳癌は、乳房細胞に影響を及ぼす細胞増殖性障害の全ての型を含む。一態様において、乳癌は、乳癌、乳房の前癌又は前癌状態、乳房の良性増殖又は病巣、及び乳房の悪性増殖又は病巣、並びに乳房以外の体の組織及び臓器の転移性病巣を含む。別の態様において、乳癌は、乳房の過形成、化生、及び異形成を含む。

一態様において、乳癌は、乳房の前癌状態である。一態様において、本開示の方法は、乳房の前癌状態を治療するために使用されてよい。一態様において、乳房の前癌状態は、乳房の非定型過形成、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、腺管内癌、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、小葉新生物形成、及び乳房のステージ０又はグレード０の成長又は病巣（例えば、ステージ０又はグレード０の乳癌、又は上皮癌腫）を含む。別の態様において、乳房の前癌状態は、米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）により承認されたＴＮＭ分類スキームに従い病気分類されており、ここでは原発性腫瘍（Ｔ）は、ステージＴ０又はＴｉｓに割当てられ；並びに、所属リンパ節（Ｎ）は、ステージＮ０に割当てられ；並びに、遠隔転移（Ｍ）は、ステージＭ０に割り当てられている。

一態様において、本開示の方法は、乳癌を治療するために使用されてよい。一態様において、乳癌は、乳房癌の全ての型を含む。一態様において、乳癌は、原発性上皮乳癌を含む。別の態様において、乳癌は、乳房が、リンパ腫、肉腫又はメラノーマなどの他の腫瘍に関与されている癌を含む。別の態様において、乳癌は、乳房の癌腫、乳房の腺管癌、乳房の小葉癌、乳房の未分化癌、乳房の葉状嚢肉腫、乳房の血管肉腫、及び乳房の原発性リンパ腫を含む。一態様において、乳癌は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶの乳癌を含む。一態様において、乳房の腺管癌は、浸潤性癌、プレドミナント導管内成分による上皮浸潤性癌、炎症性乳癌、並びに面皰、粘液性（膠様）、髄様、リンパ球浸潤を伴う髄様、乳頭状、硬性、及び管状からなる群から選択される組織型を伴う乳房の腺管癌を含む。一態様において、乳房小葉癌は、プレドミナント上皮性成分による浸潤性小葉癌、浸潤性小葉癌、及び浸潤性小葉癌を含む。一態様において、乳癌は、パジェット病、腺管内癌を伴うパジェット病、及び浸潤性腺管癌腫を伴うパジェット病を含む。別の態様において、乳癌は、組織学的及び超微細構造の不均一を有する乳房新生物（例えば混合細胞型）を含む。

上皮腫瘍サイズは、約１×１０^９個細胞／１ｃｍ^３であり、細胞直径１０μｍと推定される(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。正常細胞直径は５～１０μｍである(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。腫瘍細胞直径は、～２０μｍであることができる(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009、Backmanら、Nature, 35-36, 2000)。従ってこの上皮腫瘍サイズは、約１．２５×１０^８個細胞／１ｃｍ^３であり、細胞直径２０μｍと推定される(Del Monteら、Cell Cycle, 505-506, 2009)。典型的楕円体容積は、下記式を使用し計算することができる：π／６×（長さ）×（幅）×（高さ）（簡略化のために、Ｌ＝Ｗ＝Ｈ）。腫瘍サイズに相関された細胞数の計算の例は、表２に示している。

一態様において、癌の治療は、腫瘍サイズの減少を生じる。腫瘍サイズの減少はまた、「腫瘍退縮」とも称される。好ましくは治療後、腫瘍サイズは、治療前のそのサイズに対し、５％以上減少され；より好ましくは、腫瘍サイズは、１０％以上減少され；より好ましくは、２０％以上減少され；より好ましくは、３０％以上減少され；より好ましくは、４０％以上減少され；更により好ましくは、５０％以上減少され；及び、最も好ましくは、７５％より大きい又はそれ以上減少される。腫瘍サイズは、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、腫瘍サイズは、腫瘍の直径として測定されてよい。

別の態様において、癌治療は、腫瘍容積の減少を生じる。好ましくは、治療後、腫瘍容積は、治療前のそのサイズに対し、５％以上減少され；より好ましくは、腫瘍容積は、１０％以上減少され；より好ましくは、２０％以上減少され；より好ましくは、３０％以上減少され；より好ましくは、４０％以上減少され；更により好ましくは、５０％以上減少され；及び、最も好ましくは、７５％以上より大きく減少される。腫瘍容積は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。

別の態様において、癌の治療は、腫瘍の数の減少を生じる。好ましくは、治療後、腫瘍数は、治療前の数に対し、５％以上減少され；より好ましくは、腫瘍数は、１０％以上減少され；より好ましくは、２０％以上減少され；より好ましくは、３０％以上減少され；より好ましくは、４０％以上減少され；更により好ましくは、５０％以上減少され；及び、最も好ましくは、７５％より大きく減少される。腫瘍数は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、腫瘍数は、肉眼で又は特定の倍率で視認できる腫瘍をカウントすることにより測定されてよい。好ましい態様において、この特定の倍率は、２×、３×、４×、５×、１０×、又は５０×である。

別の態様において、癌の治療は、原発性腫瘍部位から離れた他の組織又は臓器における転移性病巣の数の減少を生じる。好ましくは、治療後、転移性病巣の数は、治療前の数に対し、５％以上減少され；より好ましくは、転移性病巣の数は、１０％以上減少され；より好ましくは、２０％以上減少され；より好ましくは、３０％以上減少され；より好ましくは、４０％以上減少され；更により好ましくは、５０％以上減少され；及び、最も好ましくは、７５％より大きく減少される。転移性病巣の数は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、転移性病巣の数は、肉眼で又は特定の倍率で視認できる転移性病巣をカウントすることにより測定されてよい。好ましい態様において、この特定の倍率は、２×、３×、４×、５×、１０×、又は５０×である。

別の態様において、癌の治療は、担体のみを受け取る集団と比べ、治療された対象の集団の平均生存期間の増大を生じる。好ましくは、平均生存期間は、３０日間より長く；より好ましくは、６０日間より長く；より好ましくは、９０日間より長く；及び、最も好ましくは、１２０日間より長く増大される。集団の平均生存期間の増加は、任意の再現可能な手段により測定されてよい。好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加は、例えば活性化合物による治療の開始後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてよい。別の好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加はまた、例えば活性化合物による治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてもよい。

別の態様において、癌の治療は、未治療の対象の集団と比較して、治療した対象の集団の平均生存期間の増加を生じる。好ましくは、平均生存期間は、３０日間より長く；より好ましくは、６０日間より長く；より好ましくは、９０日間より長く；及び、最も好ましくは、１２０日間より長く増大される。集団の平均生存期間の増加は、任意の再現可能な手段により測定されてよい。好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加は、例えば活性化合物による治療の開始後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてよい。別の好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加はまた、例えば活性化合物による治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてもよい。

別の態様において、癌の治療は、本開示の組換えポリペプチドではない療法を受ける集団と比較して、治療した対象集団の平均生存期間の増加を生じる。好ましくは、平均生存期間は、３０日間より長く；より好ましくは、６０日間より長く；より好ましくは、９０日間より長く；及び、最も好ましくは、１２０日間より長く増大される。集団の平均生存期間の増加は、任意の再現可能な手段により測定されてよい。好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加は、例えば活性化合物による治療の開始後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてよい。別の好ましい態様において、集団の平均生存期間の増加はまた、例えば活性化合物による治療の第１ラウンドの完了後の生存の平均の長さを集団について計算することにより、測定されてもよい。

別の態様において、癌の治療は、担体のみを受け取る集団と比べ、治療された対象の集団の死亡率の減少を生じる。別の態様において、癌の治療は、未治療の集団と比較して、治療した対象の集団の死亡率の減少を生じる。更なる態様において、癌の治療は、本開示の組換えポリペプチドではない薬物による単剤療法を受ける集団と比較して、治療した対象の集団の死亡率の減少を生じる。好ましくは、死亡率は、２％より大きく；より好ましくは、５％より大きく；より好ましくは、１０％より大きく；及び最も好ましくは、２５％より大きく減少される。好ましい態様において、治療された対象の集団の死亡率の減少は、任意の再現可能な手段により測定されてよい。別の好ましい態様において、集団の死亡率の減少は、例えば活性化合物による治療の開始後の単位時間当たりの疾患－関連死の平均数を集団について計算することにより、測定されてよい。別の好ましい態様において、集団の死亡率の減少はまた、例えば活性化合物による治療の第１ラウンドの完了後の単位時間当たりの疾患－関連死の平均数を集団について計算することにより、測定されてもよい。

別の態様において、癌の治療は、腫瘍増殖率の減少を生じる。好ましくは、治療後、腫瘍増殖率は、治療前の数に対し、少なくとも５％減少され；より好ましくは、腫瘍増殖率は、少なくとも１０％減少され；より好ましくは、少なくとも２０％減少され；より好ましくは、少なくとも３０％減少され；より好ましくは、少なくとも４０％減少され；より好ましくは、少なくとも５０％減少され；更により好ましくは、少なくとも５０％減少され；並びに、最も好ましくは、少なくとも７５％減少される。腫瘍増殖率は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、腫瘍増殖率は、単位時間当たりの腫瘍直径の変化に従い測定される。

別の態様において、癌の治療は、腫瘍再増殖の減少を生じる。好ましくは、治療後、腫瘍再増殖は、５％未満であり；より好ましくは、腫瘍再増殖は、１０％未満であり；より好ましくは、２０％未満；より好ましくは、３０％未満；より好ましくは、４０％未満；より好ましくは、５０％未満；更により好ましくは、５０％未満；及び最も好ましくは、７５％未満である。腫瘍再増殖は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、腫瘍再増殖は、例えば治療後の先行する腫瘍退縮後の腫瘍の直径の増加を測定することにより、測定されてよい。別の好ましい態様において、腫瘍再増殖の減少は、治療が停止された後に再度発生する腫瘍の不具合(failure)により指標化される。

別の態様において、癌の治療、予防、又は緩和は、細胞の増殖率の減少を生じる。好ましくは、治療後の、細胞増殖率は、少なくとも５％；より好ましくは、少なくとも１０％；より好ましくは、少なくとも２０％；より好ましくは、少なくとも３０％；より好ましくは、少なくとも４０％；より好ましくは、少なくとも５０％；更により好ましくは、少なくとも５０％；及び最も好ましくは、少なくとも７５％減少される。細胞増殖率は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、細胞増殖率は、例えば単位時間当たりの組織試料中の分裂細胞の数を測定することにより、測定される。

別の態様において、癌の治療、予防、又は緩和は、増殖している細胞の集団の減少を生じる。好ましくは、治療後、増殖している細胞の集団は、少なくとも５％；より好ましくは、少なくとも１０％；より好ましくは、少なくとも２０％；より好ましくは、少なくとも３０％；より好ましくは、少なくとも４０％；より好ましくは、少なくとも５０％；更により好ましくは、少なくとも５０％；及び最も好ましくは、少なくとも７５％減少される。増殖している細胞の集団は、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、増殖している細胞の集団は、例えば組織試料中の非分裂細胞の数に対する分裂細胞の数を定量することにより、測定される。別の好ましい態様において、増殖している細胞の集団は、分裂指数と同等である。

別の態様において、癌の治療、予防、又は緩和は、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズの減少を生じる。好ましくは、治療後、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、治療前のそのサイズに対し、少なくとも５％減少され；より好ましくは、少なくとも１０％減少され；より好ましくは、少なくとも２０％減少され；より好ましくは、少なくとも３０％減少され；より好ましくは、少なくとも４０％減少され；より好ましくは、少なくとも５０％減少され；更により好ましくは、少なくとも５０％減少され；及び、最も好ましくは、少なくとも７５％減少される。細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、任意の再現可能な測定手段により測定されてよい。好ましい態様において、細胞増殖の領域又はゾーンのサイズは、細胞増殖の領域又はゾーンの直径又は幅として測定されてよい。

別の態様において、癌の治療、予防、又は緩和は、異常な外観又は形態を有する細胞の数又は割合の減少を生じる。好ましくは、治療後、異常な形態を有する細胞の数は、治療前のそのサイズに比べ、少なくとも５％減少され；より好ましくは、少なくとも１０％減少され；より好ましくは、少なくとも２０％減少され；より好ましくは、少なくとも３０％減少され；より好ましくは、少なくとも４０％減少され；より好ましくは、少なくとも５０％減少され；更により好ましくは、少なくとも５０％減少され；及び、最も好ましくは、少なくとも７５％減少される。異常な細胞の外観又は形態は、任意の再現可能な測定手段により、測定されてよい。一態様において、異常な細胞の形態は、例えば倒立組織培養顕微鏡を使用し、顕微鏡により測定される。一態様において、異常な細胞の形態は、核多型の形をとる。

一態様において、癌又は細胞増殖性障害の治療は、細胞死を生じ、並びに好ましくは、細胞死は、集団内の細胞数の少なくとも１０％の減少を生じる。より好ましくは、細胞死は、少なくとも２０％の減少；より好ましくは、少なくとも３０％の減少；より好ましくは、少なくとも４０％の減少；より好ましくは、少なくとも５０％の減少；最も好ましくは、少なくとも７５％の減少を意味する。集団内の細胞数は、任意の再現可能な手段により測定されてよい。一態様において、集団内の細胞数は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により測定される。別の態様において、集団内の細胞数は、免疫蛍光顕微鏡により測定される。別の態様において、集団内の細胞数は、光学顕微鏡により測定される。別の態様において、細胞死を測定する方法は、Liらの文献((2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8)に示されたようなものである。好ましい態様において、細胞死は、免疫原性細胞死により起こる。

疾患もしくは障害を有する個体に言及して本明細書において使用される用語「対象」又は「個体」又は「患者」は、疾患又は障害などを有することが疑われる。対象、個体又は患者(patent)は、本開示において互換的に使用され、且つ哺乳類及び非-哺乳類を包含してよい。対象は、小児患者又は成人患者である。

哺乳類の例は、哺乳綱の任意のメンバー：ヒト、チンパンジー、及び他のエイプ及びモンキー種などの非-ヒト霊長類；例えば畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜動物；ウサギ、イヌ、及びネコなどの家庭内動物；ラット、マウス及びモルモットなどの齧歯類を含む実験動物などを含むが、これらに限定されるものではない。非哺乳類の例は、鳥類、魚類及び同類のものを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に提供される方法及び組成物の一部の態様において、哺乳類は、ヒトである。

本開示の治療方法は、組換えポリペプチドの対象へのインビボ投与に関与している。本組換えポリペプチドは、全身的（例えば、経口、静脈内）又は局所的（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が発生している組織もしくは臓器へ直接の注射）のいずれか任意の好適な方法により、投与される対象へ投与されてよい。好ましくは、本組換えポリペプチドは、静脈内に投与される。

本組換えポリペプチドは、単回投与量、又は反復投与量、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０回又はそれよりも多い投与量の投与で投与される。一部の態様において、一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入における組換えポリペプチドの有効量は、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ又は約３５ｍｇ／ｋｇを含む。一部の態様において、一回目注入及び二回目注入の総投与量は、４０ｍｇ／ｋｇ以下である。一部の態様において、三回目注入及び四回目注入の総投与量は、４０ｍｇ／ｋｇを超えない。一部の態様において、五回目注入及び六回目注入の総投与量は、４０ｍｇ／ｋｇ以下である。一部の態様において、一回目注入、三回目注入及び／又は五回目注入の投与量は、約２０ｍｇ／ｋｇ～約２２ｍｇ／ｋｇである。一部の態様において、二回目注入、四回目注入及び／又は六回目注入の投与量は、約１４ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇである。一部の態様において、一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入の組換えポリペプチドの有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇを含む。好ましい態様において、一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入の組換えポリペプチドの有効量は、約２０ｍｇ／ｋｇを含む。

本明細書において使用される用語「注入」又は「複数回の注入」は、任意の薬剤又は化合物の針又はカテーテルを通じた投与を指す。注入又は複数回の注入は、静脈又は組織への、任意の薬剤又は化合物の注射を含むことができ、例えば投与は、静脈内、皮下、筋肉内又は硬膜外であることができる。

本開示の治療方法は、ＩＬ－１０阻害薬の対象へのインビボ投与に関与している。ＩＬ－１０阻害薬は、全身的（例えば、経口、静脈内）又は局所的（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が発生している組織もしくは臓器へ直接の注射）のいずれか任意の好適な方法により、投与される対象へ投与されてよい。好ましくは、ＩＬ－１０阻害薬は、静脈内に投与される。

一実施態様において、組換えポリペプチド、組換えポリペプチド用量及びレジメンは、当該技術分野のいて公知のものを含み、例えば米国特許第10,150,801号、第10,323,071号、第10,351,607号、第10,301,364号及び第10,370,421号；米国特許出願第16/551,659号及び第16/443,517号；並びに、PCT出願PCT/SG2019/050420及びPCT/SG2017/050648などに記載されており；その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

このＩＬ－１０阻害薬は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＩＦＮγ模倣薬、ＩＦＮγ拮抗薬又はそれらの組合せであってよい。好ましくは、ＩＬ－１０を減少する薬剤は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）である。一部の態様において、ＩＦＮγは、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５又は約１００μｇ又はそれ以上の投与量で投与される。一部の態様において、ＩＦＮγは、約５０μｇ～約１００μｇの投与量で投与される。好ましい態様において、ＩＦＮγは、約７０μｇの投与量で投与される。

本開示の治療方法は、免疫細胞増殖因子の対象へのインビボ投与に関与している。この免疫細胞増殖因子は、全身的（例えば、経口、静脈内）又は局所的（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が発生している組織もしくは臓器へ直接の注射）のいずれか任意の好適な方法により、投与される対象へ投与されてよい。好ましくは、免疫細胞増殖因子は、静脈内に投与される。

一部の態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）又は顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。一部の態様において、少なくとも１種の免疫細胞増殖因子は、ＦＬＴ３Ｌである。一部の態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約１μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約６μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、約１１μｇ／ｋｇ、約１２μｇ／ｋｇ、約１３μｇ／ｋｇ、約１４μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約１６μｇ／ｋｇ、約１７μｇ／ｋｇ、約１８μｇ／ｋｇ、約１９μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇの量で投与される。一部の態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約４μｇ／ｋｇ～約１３μｇ／ｋｇの量である。一部の態様において、ＦＬＴ３Ｌは、約７μｇ／ｋｇの量である。

本開示の治療方法は、ＴＮＦα阻害薬の対象へのインビボ投与に関与している。このＴＮＦα阻害薬は、全身的（例えば、経口、静脈内）又は局所的（例えば、腹腔内、髄腔内、脳室内、疾患もしくは障害が発生している組織もしくは臓器へ直接の注射）のいずれか任意の好適な方法により、投与される対象へ投与されてよい。好ましくは、ＴＮＦα阻害薬は、皮下に投与される。

一部の態様において、このＴＮＦα阻害薬は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害薬である。一部の態様において、ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦαＲである。一部の態様において、ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦαＲ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル又はゴリムマブである。好ましい態様において、ＴＮＦαＲは、エタネルセプトである。一部の態様において、ＴＮＦαＲは、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ又は約１０ｍｇの投与量で投与される。一部の態様において、ＴＮＦαＲは、約４ｍｇ～約６ｍｇの投与量で投与される。好ましい態様において、ＴＮＦαＲは、約５ｍｇの投与量で投与される。

一実施態様において、本明細書において明らかにされた癌対象を治療する方法は、免疫療法薬を投与することを含む。一実施態様において、免疫療法薬は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞又は操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞である。一実施態様において、免疫療法薬は、組換えポリペプチド又は組換えポリペプチドをコードしている核酸である。一実施態様において、免疫療法薬は、抗体、チェックポイント阻害薬、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍溶解性ウイルス、癌ワクチン又はそれらの組合せである。一実施態様において、免疫療法薬の投与は、その対象において起こり得る、毒性サイトカイン放出又は「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）又は「重度のサイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）又は「サイトカインストーム」を引き起こさない。一実施態様において、免疫療法薬の投与は、その対象において起こり得る、毒性サイトカイン放出又は「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）又は「重度のサイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）又は「サイトカインストーム」を引き起こす。一実施態様において、ＣＲＳ、ｓＣＲＳ又はサイトカインストームは、免疫療法薬の投与の結果として起こる。一実施態様において、「サイトカインカスケード」又は「高サイトカイン血症」は、サイトカイン放出症候群のより重度の形である。一実施態様において、「高サイトカイン血症」は、３日間持続したサイトカインストームである。

一実施態様において、重度のサイトカイン放出症候群（ｓＣＲＳ）は、上昇したレベルのいくつかの炎症性サイトカイン、複数の臓器の機能障害及び発熱により特徴付けられる。一実施態様において、サイトカイン放出症候群において測定されたサイトカインは、ＩＬ－６である。一実施態様において、発熱は、一過性である。一実施態様において、発熱は、少なくとも１日又は複数日の期間持続する。一実施態様において、発熱は、３日間持続する。一実施態様において、発熱は、低くとも約３８℃である。一実施態様において、発熱の温度は、低くとも約３８℃、３９℃、４０℃、４１℃又は４２℃である。一実施態様において、ｓＣＲＳの対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルは、少なくとも約１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９又は１９０ｍｇ／Ｌである。好ましい実施態様において、ＣＲＰレベルは、少なくとも約１８０ｍｇ／ｍＬである。一実施態様において、１日の事象は、ｓＣＲＳを生じなくてよい。一実施態様において、２日のサイトカインストームは、３日目にｓＣＲＳを発症する。

一実施態様において、高サイトカイン血症は、上昇したレベルのいくつかの炎症性サイトカイン及び発熱により特徴付けられる。一実施態様において、サイトカイン放出症候群において測定されたサイトカインは、ＩＬ－６である。一実施態様において、発熱は、一過性である。一実施態様において、発熱は、少なくとも１日又は複数日の期間生じる。一実施態様において、発熱は、低くとも約４０℃である。一実施態様において、発熱の温度は、低くとも約３８℃、３９℃、４０℃、４１℃又は４２℃である。一実施態様において、高サイトカイン血症の対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルは、少なくとも約１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９又は２３０ｍｇ／Ｌである。好ましい実施態様において、ＣＲＰレベルは、約２００～約２２０ｍｇ／ｍＬである。

一実施態様において、致死的多臓器機能障害及び有害事象は、重度のサイトカインストームにより特徴付けられる。一実施態様において、サイトカイン放出症候群において測定されるサイトカインは、ＩＬ－６である。一実施態様において、発熱は、低くとも約４０℃である。一実施態様において、発熱の温度は、低くとも約３８℃、３９℃、４０℃、４１℃又は４２℃である。一実施態様において、発熱は、少なくとも１日又は複数日の期間持続する。一実施態様において、発熱は、３日間持続する。一実施態様において、重度のサイトカインストームにより特徴付けられる致死的有害事象を伴う対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルは、少なくとも約２２０ｍｇ／ｍＬである。一実施態様において、重度のサイトカインストームにより特徴付けられる致死的多臓器不全を伴う対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルは、少なくとも約２２０ｍｇ／ｍＬである。

一実施態様において、癌対象を治療する方法は、サイトカイン放出を減少するための追加の薬剤を含んでよい。一実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、コルチコステロイドである。一実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、アポトーシス細胞又は該アポトーシス細胞を含有する組成物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、ＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、アルファ－１アンチトリプシン又はその断片又はそのアナログを含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びアルファ－１アンチトリプシン又はその断片又はそのアナログを含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、テルル－ベースの化合物を含む。別の実施態様において，有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びテルル－ベースの化合物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫調節薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及び免疫調節薬を含む。

当業者は、毒性サイトカイン放出又は毒性サイトカインレベルの減少は、対象における毒性サイトカインレベルの産生の減少又は阻害、あるいは対象におけるサイトカイン放出症候群又はサイトカインストームの出現の阻害又は低下を含むことを理解するであろう。別の実施態様において、毒性サイトカインレベルは、ＣＲＳ又はサイトカインストーム時に低下される。別の実施態様において、毒性サイトカインレベルの産生の減少又は阻害は、ＣＲＳ又はサイトカインストームを治療することを含む。別の実施態様において、毒性サイトカインレベルの産生の減少又は阻害は、ＣＲＳ又はサイトカインストームを予防することを含む。別の実施態様において、毒性サイトカインレベルの産生の減少又は阻害は、ＣＲＳ又はサイトカインストームを緩和することを含む。別の実施態様において、毒性サイトカインレベルの産生の減少又は阻害は、ＣＲＳ又はサイトカインストームを改善することを含む。別の実施態様において、毒性サイトカインは、炎症促進性サイトカインを含む。別の実施態様において、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－６を含む。別の実施態様において、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－１βを含む。別の実施態様において、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦαを含む。別の実施態様において、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、もしくはＴＮＦα、又はそれらの任意の組合せを含む。

T細胞免疫療法により治療される患者に関して、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（特にサイトカインＩＬ６、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα）が頻繁に認められる(Suntharalingamら、N. Engl. J. Med., 1018-1028, 2006；Turtleら、J. Clin. Invest., 2123-2138, 2016)。更にサイトカイン放出症候群は、異常高熱（≧３８℃）（ＩＬ６及び／又はＩＦＮγ由来）(Davilaら、Sci. Transl. Med., 1-10, 2014)及び／又は低体温症（≦３５℃）（ＴＮＦα由来）(Bradyら、Clin. Transl. Immunology, 1-7, 2014；Alegreら、Eur. J. Immunol, 707-710, 1990)により特徴付けられる。

一実施態様において、免疫療法薬の投薬スケジュール及び対象へ投与される免疫療法薬の量は、致死的有害作用、ＣＲＳ、サイトカインストーム、ｓＣＲＳ及び／又は高サイトカイン血症を予防するために調節される。一実施態様において、対象におけるＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルは、提供される免疫療法薬の量を決定するために使用される。一実施態様において、免疫療法薬の第１の量は、対象内で致死的有害事象を誘導しない。一実施態様において、免疫療法薬の第１の量は、少なくとも約１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９又は２３０ｍｇ／Ｌである対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルを得るのに有効な量で提供される。好ましい実施態様において、ＣＲＰレベルは、約２００～約２２０ｍｇ／ｍＬである。一実施態様において、免疫療法薬の第１の量は、約３８℃、３９℃、４０℃、４１℃又は４２℃の一過性発熱を誘導する。一実施態様において、免疫療法薬は、１～２時間の期間にわたる一過性発熱を誘導する。一実施態様において、免疫療法薬は、１～５時間の期間にわたる一過性発熱を誘導する。

一実施態様において、免疫療法薬の第２の量は、高サイトカイン血症を誘導しない。一実施態様において、免疫療法薬の第２の量は、対象内で致死的有害事象を誘導しない。一実施態様において、免疫療法薬の第２の量は、少なくとも約１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９又は１８０ｍｇ／ｍＬである対象由来の血液中のＣ－反応性タンパク（ＣＲＰ）レベルを得るのに有効な量で提供される。好ましい実施態様において、ＣＲＰレベルは、約１５９ｍｇ／ｍＬ～約１６９ｍｇ／ｍＬである。一実施態様において、免疫療法薬の第２の量は、高サイトカイン血症も、サイトカインストームが特徴的な致死的多臓器機能障害及び有害事象も誘導しない。

一実施態様において、サイトカイン放出症候群は、数種の炎症性サイトカインの上昇したレベル、並びに低血圧、高熱及び悪寒などの対象における有害な生理的反応により特徴付けられる。一実施態様において、炎症性サイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、及びＴＮＦαを含む。別の実施態様において、ＣＲＳは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、もしくはＴＮＦα、又はそれらの任意の組合せの上昇したレベルにより特徴付けられる。別の実施態様において、ＣＲＳは、ＩＬ－８、もしくはＩＬ－１３、又はそれらの任意の組合せの上昇したレベルにより特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－５、フラクタルクリン、又はそれらの組合せ又はそれらのサブセットの増加により特徴付けられる。更に別の実施態様において、ＩＬ－６は、ＣＲＳ又はサイトカインストームのマーカーを構成する。別の実施態様において、ＩＦＮ－γは、ＣＲＳ又はサイトカインストームのマーカーを構成する。別の実施態様において、比較的大きい腫瘍組織量を伴う患者は、サイトカイン放出症候群のより高い出現率及び重症度を有する。

別の実施態様において、３０例のヒト及びマウスにおいて、ＣＲＳ又はサイトカインストームにおいて増加したサイトカインは、下記表１及び２に列挙したサイトカインの任意の組合せを含んでよい。

一実施態様において、表３のサイトカインＦｌｔ－３Ｌ、フラクタルカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１３は、ＣＲＳ又はサイトカインストームにおいて有意であると考えられる。別の実施態様において、表３のＩＦＮ－α、５ＩＦＮ－β、ＩＬ－１及びＩＬ－１Ｒａは、ＣＲＳ又はサイトカインストームにおいて重要であるように見える。別の実施態様において、Ｍ－ＣＳＦは、重要性は不明である。別の実施態様において、表３に列記された任意のサイトカイン、又はその組合せは、ＣＲＳ又はサイトカインストームのマーカーとして使用されてよい。

一実施態様において、表２のＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＯＰ－１β、及びＴＮＦ－αは、ＣＲＳ又はサイトカインストームにおいて有意であると考えられる。別の実施態様において、表４のＩＬ－２７、ＭＣＰ－３、ＰＧＥ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－αＲ１、及びＭＩＧは、ＣＲＳ又はサイトカインストームにおいて重要であるように見える。別の実施態様において、ＩＬ－２３及びＩＬ－２５の重要性は、不明である。別の実施態様において、表４に列記された任意のサイトカイン、又はその組合せは、ＣＲＳ又はサイトカインストームのマーカーとして使用されてよい。

当業者は、用語「サイトカイン」は、サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子アルファ）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ－１アルファ、ＭＩＰ－１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ）、及び他の可溶性炎症メディエーター、例えば活性酸素種及び一酸化窒素などを包含してよいことを理解するであろう。

一実施態様において、特定のサイトカインの増加した放出は、有意であるか、重要であるかもしくは重要性が不明であるかに関わらず、プリオンではなく、特定のサイトカインが、サイトカインストームの一部であることを意味する。一実施態様において、少なくとも１種のサイトカインの増加は、サイトカインストーム又はＣＲＳの結果ではない。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特定のサイトカイン又はサイトカイン群の増加したレベルの給源であり得る。

別の実施態様において、サイトカイン放出症候群は、以下の症状のいずれか又は全てにより特徴付けられる：硬直を伴う又は伴わない発熱、不快感、疲労、拒食症、筋肉痛、関節痛、悪心、吐気、頭痛、皮膚発疹、悪心、吐気、下痢、速呼吸、低酸素血症、心臓血管系頻拍、脈圧拡大、低血圧症、増大した心拍出量（早期）、潜在的に下落した心拍出量（後期）、上昇したＤ－ダイマー、出血を伴う又は伴わない低フィブリノゲン血症、高窒素血症、肝高トランスアミナーゼ血症、高ビリルビン血症、頭痛、精神状態の変化、錯乱、せん妄、喚語困難又は明らかな失語症、幻覚、振戦、測定障害、歩行の変化、発作。別の実施態様において、サイトカインストームは、ＩＬ－２放出及びリンパ球増殖により特徴付けられる。一実施態様において、サイトカインストームは、免疫療法薬から放出されたサイトカインの増加により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、ＣＡＲ－Ｔ細胞により放出されたサイトカインの増加により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、ＣＡＲ－Ｔ細胞以外の細胞により放出されたサイトカインの増加により特徴付けられる。

別の実施態様において、サイトカインストームは、心機能障害、成人呼吸窮迫症候群、神経毒、腎及び／又は肝の不全、並びに播種性血管内凝固を含む、致死的な可能性のある合併症につながる。

当業者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）又はサイトカインストームの特徴は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの引き金がひかれた後、数日から数週間のうちに起こると推定されることを理解するであろう。一実施態様において、免疫療法薬は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの引き金である。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの引き金である。別の実施態様において、ＣＲＳ又はサイトカインストームの引き金は、ＣＡＲ－Ｔ細胞ではない。

一実施態様において、サイトカインストームの指標としての、サイトカインレベル又は濃度の測定は、サイトカインのレベル又は濃度の増加倍率、増加率（％）、正味の増加又は変化の割合として表されることができる。別の実施態様において、特定のレベル又は濃度を上回る絶対サイトカインレベル又は濃度は、サイトカインストームが進行している又は経験しようとしている対象の指標であることができる。別の実施態様において、特定のレベル又は濃度での、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けていない対照対象において通常認められるレベル又は濃度での絶対サイトカインレベル又は濃度は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けている対象におけるサイトカインストームの発生を阻害又は減少する方法の指標であることができる。

当業者は、用語「サイトカインレベル」は、濃度の尺度、変化倍率、変化率（％）の尺度、又は変化の割合の尺度を包含することができることを理解するであろう。更に、血液、唾液、血清、尿、及び血漿中のサイトカインを測定する方法は、当該技術分野において周知である。

一実施態様において、サイトカインストームは、数種の炎症性サイトカインの上昇に関連しているという認識にも関わらず、ＩＬ－６レベルは、サイトカインストームの共通の測定として及び／又はサイトカインストームの治療の有効性の共通の測定として使用されてよい。当業者は、他のサイトカインは、サイトカインストームのマーカーとして使用されてよく、例えばＴＮＦ－α、ＩＢ－ｌａ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、もしくはＩＮＦ－γのいずれか、又はこれらの任意の組合せは、ＣＲＳ又はサイトカインストームのマーカーとして使用されてよいことを理解するであろう。更に、サイトカインを測定するアッセイ方法は、当該技術分野において周知である。当業者は、サイトカインストームに影響を及ぼす方法は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に同様に影響を及ぼすことを理解するであおう。

一実施態様において、サイトカイン放出症候群は、グレード化される。別の実施態様において、グレード１は、その症状が、致死的ではなく、且つ例えば発熱、悪心、疲労、頭痛、筋肉痛、不快感などの対症治療のみを必要とするサイトカイン放出症候群を説明する。別の実施態様において、グレード２の症状は、酸素、液体又は低血圧症のための昇圧剤など、軽度の介入を必要とし且つこれに反応する。別の実施態様において、グレード３の症状は、積極的介入を必要としかつこれに反応する。別の実施態様において、グレード４の症状は、致死的症状であり、人工呼吸器を必要とし、且つ患者は臓器毒性を示す。

別の実施態様において、サイトカインストームは、ＩＬ－６及びインターフェロンガンマの放出により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、ＩＬ－６の放出により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、インターフェロンガンマの放出により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、表１及び２に列挙された任意のサイトカイン又はそれらの組合せの放出により特徴付けられる。別の実施態様において、サイトカインストームは、当該技術分野において公知の任意のサイトカイン又はそれらの組合せの放出により特徴付けられる。

一実施態様において、症状の発現は、免疫療法薬の注入の開始後、数分から数時間で始まる。別の実施態様において、症状は、ピークのサイトカインレベルと同時に起こる。

一実施態様において、癌を治療する方法は、免疫療法薬を投与することを含む。一実施態様において、免疫療法薬は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞の癌療法を受けている対象においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を支援することができる。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの発生の阻害又は低下を支援することができる。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの治療を支援することができる。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの予防を支援することができる。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの改善を支援することができる。別の実施態様において、追加の薬剤は、ＣＲＳ又はサイトカインストームの緩和を支援することができる。

一実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、アポトーシス細胞又は該アポトーシス細胞を含有する組成物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、アポトーシス細胞上清又は該上清を含有する組成物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、ＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、アルファ－１アンチトリプシン又はその断片又はそのアナログを含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びアルファ－１アンチトリプシン又はその断片又はそのアナログを含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、テルル－ベースの化合物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びテルル－ベースの化合物を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫調節薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及び免疫調節薬を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞を含む。別の実施態様において、有害なサイトカイン放出を減少するための追加の薬剤は、免疫療法薬、及びＴｒｅｇ細胞を含む。

別の実施態様において、本明細書に開示された方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の、イピリムマブなどの１又は複数のＣＴＬＡ－４－遮断薬との併用療法を利用する。別の実施態様において、ＣＴＬＡ－４は、自己免疫寛容を維持することを補助するＴ細胞活性化の強力な阻害薬である。別の実施態様において、別の実施態様においては抗体である抗－ＣＴＬＡ－４遮断薬の投与は、Ｔ細胞活性化の正味の作用を生じる。別の実施態様において、本明細書に開示された組成物及び方法は、アポトーシス細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び１又は複数のＣＴＬＡ－４－遮断薬を含む併用療法を利用する。

別の実施態様において、本明細書に開示された組成物及び方法により治療されるか、予防されるか、阻害されるか、改善されるか、発生が減少されるか、又は緩和されることができる、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＮＫ細胞投与から生じる他の毒性は、Ｂ細胞形成不全又は腫瘍融解症候群（ＴＬＳ）を含む。

一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞癌療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性に影響を及ぼさない。別の実施態様において、ＣＡＲばＴ細胞癌療法を受けている対象におけるＣＲＳ又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を約５％より多く低下する。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞癌療法を受けている対象におけるＣＲＳ又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を約１０％より多く低下する。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞癌療法を受けている対象におけるＣＲＳ又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を約１５％より多く低下する。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞癌療法を受けている対象におけるＣＲＳ又はサイトカインストームの発生を阻害又は低下する方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を約２０％より多く低下する。

細胞毒性を定量する任意の好適な方法を使用し、ＣＡＲを発現するように修飾された免疫細胞の活性は、実質的に未変化であり続けるかどうかを決定することができる。例えば、細胞毒性は、「実施例」に説明されたような細胞毒性アッセイなどの、細胞培養－ベースのアッセイを使用し、定量することができる。細胞毒性アッセイは、死滅細胞のＤＮＡを優先的に染色する色素を使用することができる。別の場合において、細胞集団内の生存細胞及び死滅細胞の相対数を測定する、蛍光アッセイ及びルミネセンスアッセイを、使用することができる。そのようなアッセイに関して、プロテアーゼ活性は、細胞生存能及び細胞毒性のマーカーとして働き、並びに標識した細胞透過性ペプチドは、試料中の生存細胞数に比例した蛍光シグナルを発生する。様々な細胞毒性アッセイのためのキットは、Promega及びLife Technologiesなどの製造業者から市販されている。別の実施態様において、細胞毒性の測定は、定性的であってよい。別の実施態様において、細胞毒性の測定は、定量的であってよい。更なる実施態様において、細胞毒性の測定は、細胞傷害性サイトカインの発現における変化に関連されてよい。

一態様において、本明細書に開示された癌対象を治療する方法は、腫瘍上の特異抗原を認識するＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加を生じる。特異抗原を認識するナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の前駆体頻度（確率）は、約１～１０／１００万個細胞である(Lammermannら、Immunological Reviews, 26-43, 2008)。ヒトにおける総ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は、約４×１０^１０個細胞である(Boonら、Annu. Rev. Immunol., 175-208, 2006)。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）における総ナイーブＣＤ８Ｔ細胞は、約３×１０^７個細胞である(Blattmanら、 J. Exp. Med., 657-664, 2002)。従って、ヒト腫瘍－特異抗原を認識するヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の前駆体頻度を、約～５／１００万個細胞と想定し、腫瘍－特異抗原を認識するヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の数は、約２×１０^５個細胞（４×１０^１０×５／１０^６）である。

プライミング後のＣＤ８^＋Ｔ細胞発現は、約≧１００００倍である（５００００×：ＬＣＭＶ／ＬＭ感染）(Blattmanら、J. Exp. Med., 657-664, 2002、Haringら、Immunity,19-29, 2006、Butlerら、Cellular Microbiology, 925-933, 2011、Arensら、Immunol. Rev., 190-205, 2010)。１個のＣＤ８Ｔ細胞は、２～３個の標的腫瘍細胞を死滅させる(Wiedemannら、PNAS,10985-10990, 2006、McGavernら、 Nature Immunol, 918-925, 2002)。

一態様において、本明細書に開示された癌対象を治療する方法は、腫瘍上の特異抗原を認識するＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加を生じる。一部の実施態様において、このＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^－ＣＤ６２Ｌ^＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－）、及びエフェクターＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^－ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－）である。好ましい実施態様において、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞である。

一部の態様において、本開示の方法による治療後、腫瘍上の特異抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、治療前に比べ、１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１３倍、約１３．５倍、約１４倍、約１４．５倍、約１５倍、約１５．５倍、約１６倍、約１６．５倍、約１７倍、約１７．５倍、約１８倍、約１８．５倍、約１９倍、約１９．５倍又は約２０倍増大される。

一部の態様において、本開示の方法による治療後、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^－ＣＤ６２Ｌ^＋）の割合は、治療前に比べ、１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１３倍、約１３．５倍、約１４倍、約１４．５倍、約１５倍、約１５．５倍、約１６倍、約１６．５倍、約１７倍、約１７．５倍、約１８倍、約１８．５倍、約１９倍、約１９．５倍又は約２０倍増大される。

一部の態様において、本開示の方法による治療後、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－（エフェクターメモリー細胞）の割合は、治療前に比べ、１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１３倍、約１３．５倍、約１４倍、約１４．５倍、約１５倍、約１５．５倍、約１６倍、約１６．５倍、約１７倍、約１７．５倍、約１８倍、約１８．５倍、約１９倍、約１９．５倍又は約２０倍増大される。

一部の態様において、本開示の方法による治療後、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^－ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－（エフェクター）の割合は、治療前に比べ、１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１３倍、約１３．５倍、約１４倍、約１４．５倍、約１５倍、約１５．５倍、約１６倍、約１６．５倍、約１７倍、約１７．５倍、約１８倍、約１８．５倍、約１９倍、約１９．５倍又は約２０倍増大される。

一実施態様において、本明細書に開示された方法は、同種異系のドナー細胞の拒絶を克服するのに有用である追加の工程を含む。一実施態様において、この方法は、一実施態様において同種異系のＣＡＲ－Ｔ細胞であるＣＡＲ－Ｔ細胞の投与に先立つ、完全又は部分的リンパ球枯渇の工程を含む。別の実施態様において、リンパ球枯渇は、該同種異系Ｔ細胞が、それらが指向された腫瘍を攻撃することができるのに十分であるが、骨髄移植手術により宿主免疫系をレスキューするのに必要な期間であるには不充分な期間、それが宿主対移植片反応を遅延するように調節される。別の実施態様において、２－アミノ－２－［２－（４－オクチルフェニル）エチル］プロパン－１，３－ジオール（ＦＴＹ７２０）、５－［４－フェニル－５－（トリフルオロメチル）チオフェン－２－イル］－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］１，２，４－オキサジアゾール（ＳＥＷ２８７１）、３－（２－（ヘキシルフェニルアミノ）－２－オキソエチルアミノ）プロパン酸（Ｗ１２３）、２－アンモニオ－４－（２－クロロ－４－（３－フェノキシフェニルチオ）フェニル）－２－（ヒドロキシメチル）ブチ－イル水素リン酸塩（ＫＲＰ－２０３リン酸塩）又は他の当該技術分野において公知の薬剤などの、リンパ節からの同種異系Ｔ細胞の放出を遅延する薬剤は、有効性を有し且つ移植片対宿主疾患を開始しない同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を可能にするよう、本明細書に開示された組成物及び方法の一部として使用されてよい。一実施態様において、同種異系Ｔ細胞によるＭＨＣ発現は、発現抑制され、同種異系細胞の拒絶を軽減する。別の実施態様において、アポトーシス細胞は、同種異系細胞の拒絶を防止する。

一実施態様において、本明細書に開示された癌対象を治療する方法は、免疫療法薬を投与することを含む。一実施態様において、この免疫療法薬は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、その対象に対し異種である。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１又は複数のドナーに由来する。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１又は複数の骨髄ドナーに由来する。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１又は複数の血液バンクへの献血に由来する。一実施態様において、これらのドナーは、マッチしたドナーである。一実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、普遍的同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同系ＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マッチしない第三者のドナーに由来する。別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、プールされた第三者のドナーＴ細胞由来である。一実施態様において、ドナーは、骨髄ドナーである。別の実施態様において、ドナーは、血液バンクドナーである。一実施態様において、本明細書に開示された組成物及び方法のＣＡＲ－Ｔ細胞は、１又は複数のＭＨＣ非拘束性腫瘍－指向性キメラ受容体を含む。一実施態様において、非自己Ｔ細胞は、自己免疫反応を防止又は最小化するよう、当該技術分野において公知のプロトコールに従い操作されるか又は投与され、これはその全体が引用により本明細書中に組み込まれている米国特許出願第20130156794号に説明されている。

別の実施態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、その対象にとって自己である。一実施態様において、患者自身の細胞が使用される。この実施態様において、患者自身の細胞が使用される場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、免疫療法薬の後に投与される。

一部の実施態様に従い、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対象へ全身投与される。別の実施態様において、投与は、静脈内経路を介する。あるいは、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、非限定的に非経口、腹腔内、関節内、筋肉内及び皮下の経路を含む、様々な他の経路で、対象へ投与されてよい。各々の可能性は、本明細書に開示されたような個別の実施態様を表している。

一部の実施態様に従い、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びサイトカインストームを減少する追加の薬剤は、対象へ全身投与される。別の実施態様において、投与は、静脈内経路を介する。あるいは、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びサイトカインストームを減少する追加の薬剤は、非限定的に非経口、腹腔内、関節内、筋肉内及び皮下の経路を含む、様々な他の経路で、対象へ投与されてよい。各々の可能性は、本明細書に開示されたような個別の実施態様を表している。

一実施態様において、この調製品は、例えば、患者の体の特定の領域への調製品の直接の注射により、全身的様式よりもむしろ局所的に投与される。別の実施態様において、特定の領域は、腫瘍又は癌を含む。

別の実施態様において、この免疫療法薬は、非限定的に食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及び同類のものなどの、好適な生理的緩衝液中に懸濁され、対象へ投与される。加えて、この懸濁媒体は、細胞の生存能を維持するために助けとなる補充品を更に含んでよい。別の実施態様において、この追加の薬剤は、非限定的に食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及び同類のものなどの、好適な生理的緩衝液中に懸濁され、対象へ投与される。

一部の実施態様に従い、本医薬組成物は、静脈内に投与される。別の実施態様に従い、本医薬組成物は、単回投与量で投与される。代わりの実施態様に従い、本医薬組成物は、反復投与量で投与される。別の実施態様に従い、本医薬組成物は、２回投与量で投与される。別の実施態様に従い、本医薬組成物は、３回投与量で投与される。別の実施態様に従い、本医薬組成物は、４回投与量で投与され得。別の実施態様に従い、本医薬組成物は、５回以上の投与量で投与される。一部の実施態様に従い、本医薬組成物は、静脈内注射のために製剤化される。

一実施態様において、修飾されたＣＡＲ－発現する免疫細胞を対象へ提供する任意の好適な方法は、本明細書に説明された方法を使用することができる。一実施態様において、対象へ細胞を提供する方法は、造血細胞移植（ＨＣＴ）、ドナー由来のＮＫ細胞の癌患者への注入、又はそれらの組合せを含む。

本開示は、組換えポリペプチド（例えば、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ）、対象のＩＬ－１０阻害薬（例えばＩＦＮγ）、免疫細胞増殖因子（例えばＦＬＴ３Ｌ）、ＴＮＦα阻害薬（例えばＴＮＦαＲ）、及び任意に免疫療法薬（例えば抗－ＰＤ１抗体）により、癌を有する対象を治療するための投薬レジメンを提供する。この組換えポリペプチド、ＩＬ－１０阻害薬、免疫細胞増殖因子、ＴＮＦα阻害薬及び免疫療法薬の投薬量は、先に本明細書において説明されている。

一部の態様において、本組換えポリペプチドは、静脈内に投与される。一部の態様において、組換えポリペプチドは、皮下に投与される。一部の態様において、対象のＩＬ－１０阻害薬は、静脈内に投与される。一部の態様において、対象のＩＬ－１０阻害薬は、皮下に投与される。一部の態様において、免疫細胞増殖因子は、静脈内に投与される。一部の態様において、免疫細胞増殖因子は、皮下に投与される。一部の態様において、ＴＮＦα阻害薬は、静脈内に投与される。一部の態様において、ＴＮＦα阻害薬は、皮下に投与される。

一部の態様において、本免疫療法薬は、反復注入として投与される。一部の態様において、免疫療法薬は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回又は少なくとも１４回投与される。一部の態様において、免疫療法薬は、１回投与される。

一部の態様において、本免疫療法薬の一回目注入は、プライミング治療サイクルの組換えポリペプチド六回目注入の後、及びブースティング治療サイクルにおいて本組換えポリペプチドの一回目注入の前に投与される。一部の態様において、本免疫療法薬の一回目注入は、プライミング治療サイクルにおける組換えポリペプチドの一回目注入後、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日で投与される。一態様において、本免疫療法薬は、プライミング治療サイクルにおける組換えポリペプチドの一回目注入後、約１０日～約１４日で投与される。好ましい態様において、本免疫療法薬は、プライミング治療サイクルにおける組換えポリペプチドの一回目注入後、約１２日で投与される。

一態様において、この投薬レジメンは、免疫細胞増殖因子、ＩＬ－１０阻害薬、ＴＮＦα阻害薬及び組換えポリペプチドの投与を含む治療サイクルを含む。一部の態様において、治療サイクルは、対象におけるＴ細胞の数を増加する。一部の態様において、治療サイクルは、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞の数を増加する。一部の態様において、治療サイクルは、対象におけるＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞の数を増加する。一部の態様において、治療サイクルは、ＣＤ８^＋エフェクターメモリー細胞の数を増加する。一部の態様において、治療サイクルは、ＣＤ８^＋エフェクター細胞の数を増加する。一態様において、治療サイクルは、プライミング治療サイクルである。一部の態様において、治療サイクルは、ブースティングサイクルである。

一態様において、この投薬レジメンは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも６のプライミング治療サイクルを含む。好ましい態様において、投薬レジメンは、１のプライミング治療サイクルを含む。一態様において、投薬レジメンは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５のブースティング治療サイクルを含む。一態様において、投薬レジメンは、５を超えないブースティング治療サイクルを含む。好ましい態様において、投薬レジメンは、１のプライミング治療サイクル及び少なくとも１のブースティングサイクルを含む。好ましい態様において、投薬レジメンは、１のプライミングサイクル及び５以下のブースティング治療サイクルを含む。

一態様において、本免疫細胞増殖因子は、ＩＬ－１０阻害薬又はＴＮＦα阻害薬の、少なくとも約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間又は約３０時間前に投与される。好ましい態様において、免疫細胞増殖因子は、ＩＬ－１０阻害薬又はＴＮＦα阻害薬の、少なくとも約２４時間前に投与される。

一態様において、本免疫細胞増殖因子は、少なくとも１日１回、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間又は少なくとも２３日間投与される。一態様において、免疫細胞増殖因子は、１日１回、約７日間～約１２日間投与される。好ましい態様において、免疫細胞増殖因子は、１日１回、約７日間投与される。

一態様において、本ＩＬ－１０阻害薬及びＴＮＦα阻害薬は、同時に投与される。一態様において、ＩＬ－１０阻害薬及びＴＮＦα阻害薬は、連続して投与される。一態様において、ＩＬ－１０阻害薬は、ＴＮＦα阻害薬の前に投与される。一態様において、ＩＬ－１０阻害薬は、ＴＮＦα阻害薬の後に投与される。

一態様において、本組換えポリペプチドは、反復注入として投与される。一部の実施態様において、二回目注入は、一回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日又は少なくとも７日で投与される。好ましい実施態様において、二回目注入は、一回目注入後少なくとも１日で投与される。一態様において、三回目注入は、一回目注入後、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日又は少なくとも７日で投与される。好ましい態様において、三回目注入は、一回目注入後、少なくとも４日で投与される。一態様において、四回目注入は、一回目注入後、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日又は少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日又は少なくとも１０日で投与される。好ましい態様において、四回目注入は、一回目注入後、少なくとも５日で投与される。一態様において、五回目注入は、一回目注入後、少なくとも６日又は少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日又は少なくとも１３日で投与される。好ましい態様において、五回目注入は、一回目注入後、少なくとも８日で投与される。一態様において、六回目注入は、一回目注入後、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日又は少なくとも１４日で投与される。

一態様において、本ＴＮＦα阻害薬及び組換えポリペプチドは、同時に投与される。一態様において、ＴＮＦα阻害薬及び組換えポリペプチドは、連続して投与される。一態様において、ＴＮＦα阻害薬は、組換えポリペプチドの前に投与される。一態様において、ＴＮＦα阻害薬は、組換えポリペプチドの後に投与される。

一態様において、本組換えポリペプチドの一回目注入は、ＩＬ－１０阻害薬の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間又は少なくとも２８時間で投与される。一部の態様において、組換えポリペプチドの一回目注入は、ＩＬ－１０阻害薬の投与後、約３時間又は約４時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの一回目注入は、ＩＬ－１０阻害薬の投与後、約４時間で投与される。

一態様において、ＩＬ－１０阻害薬の一回目投与量及び組換えポリペプチドの一回目投与量は、同時に又は連続して投与される。一態様において、組換えポリペプチドの一回目投与量は、ＩＬ－１０阻害薬の一回目投与量の後に、時間をおいて投与される。一態様において、一回目の組換えポリペプチドは、ＩＬ－１０阻害薬の一回目投与量の投与後、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの一回目投与量は、ＩＬ－１０阻害薬の一回目投与量の投与後、約３又は４時間で投与される。一態様において、組換えポリペプチドの二回目投与量は、組換えポリペプチドの一回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの二回目投与量は、一回目の組換えポリペプチドの投与後、約２４時間で投与される。

一態様において、組換えポリペプチドの四回目投与量は、組換えポリペプチドの三回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの四回目投与量は、三回目の組換えポリペプチドの投与後、約２４時間で投与される。

一態様において、組換えポリペプチドの六回目投与量は、組換えポリペプチドの五回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの六回目投与量は、五回目の組換えポリペプチドの投与後、約２４時間で投与される。

本開示の一態様において、組換えポリペプチドの二回目投与量は、組換えポリペプチドの一回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの二回目投与量は、組換えポリペプチドの一回目投与量の投与後、約２４時間で投与される。

一態様において、組換えポリペプチドの三回目投与量は、組換えポリペプチドの二回目投与量後、約１、２、３、４、５、６又は７日で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの三回目投与量は、組換えポリペプチドの二回目投与量後、約３日で投与される。一態様において、組換えポリペプチドの四回目投与量は、組換えポリペプチドの三回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの四回目投与量は、組換えポリペプチドの三回目投与量の投与後、約２４時間で投与される。

一態様において、組換えポリペプチドの五回目投与量は、組換えポリペプチドの四回目投与量後、約１、２、３、４、５、６又は７日で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの五回目投与量は、組換えポリペプチドの四回目投与量後、約３日で投与される。一態様において、組換えポリペプチドの六回目投与量は、組換えポリペプチドの五回目投与量の投与後、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間で投与される。好ましい態様において、組換えポリペプチドの六回目投与量は、組換えポリペプチドの五回目投与量の投与後、約２４時間で投与される。

先の態様はいずれも、本明細書に明らかにされたいずれか他の態様と組合せることができる。

実施例
実施例1：組換えペプチドの作出方法

材料及び方法

本開示の組換えポリペプチドを作出する方法は、表４に明らかにしたＰＣＲプライマーを利用した。

鋳型ＤＮＡの調製

シナガチョウ由来の完全長ＣＲＹＡＡ配列（配列番号：１７）を、Ｐｆｕポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応において増幅した。Ａ１プライマー（配列番号：３３）及びＡ２プライマー（配列番号：３４）を、このＰＣＲ反応において使用した。この遺伝子を、ｐＥＴ２４ａベクター(Novagen)内のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に、製造業者のプロトコールを使用し、クローニングした。このライゲーション混合物を、大腸菌ＤＨ５アルファ細胞へ形質転換し、形質転換体を、ＬＢアンピシリンプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを、いくつかの形質転換体から単離し、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の制限消化によりスクリーニングした。シナガチョウＣＲＹＡＡ（配列番号：１７）を含む配列を検証したクローンを同定し、且つ鋳型として使用した。

ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド配列を含むプラスミドのクローニング

ＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：２５）を含む組換えプラスミドを、以下の様式で調製した。ＰＣＲを、先に説明した鋳型ＤＮＡ、フォワードプライマーＩｏＥ１（配列番号：３５）及びリバースプライマーＩｏＥ２（配列番号：３６）を用いて行った。ＰＣＲの温度及び時間は、以下のようにプログラムした：９５℃で５分間の変性；それに続く、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長のＰＣＲ反応を３０サイクル；７２℃で１０分間の最後の伸長。全てのＰＣＲ増幅は、Ｐｆｕウルトラポリメラーゼ(Stratagene)により行った。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ＧＦＸ（商標）ＰＣＲＤＮＡ及びゲル結合精製キット(GE Healthcare)を用い、ゲルから抽出し、且つｐＥＴ２４ａ(Novagen)ベクターへライゲーションした。このライゲーション混合物を、ＤＨ５アルファ大腸菌株へ形質転換し、且つ形質転換体を、アンピシリン含有するＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離した。配列を検証したクローンであるプラスミド＿１を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿１、フォワードプライマーＩｏＥ３（配列番号：３７）及びリバースプライマーＩｏＥ４（配列番号：３８）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、３２サイクル（９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間）、それに続く７２℃で５分間。ＰＣＲ産物を、精製し、ｐＥＴ２４ａプラスミドへ、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用しクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿２を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿２、フォワードプライマーＩｏＥ５（配列番号：３９）及びリバースプライマーＩｏＥ６（配列番号：４０）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３５サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿３を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿３、フォワードプライマーＩｏＥ７（配列番号：４１）及びリバースプライマーＩｏＥ８（配列番号：４２）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の２８サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿４を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿４、フォワードプライマーＩｏＥ９（配列番号：４３）及びリバースプライマーＩｏＥ１０（配列番号：４４）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３３サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿５を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿５、フォワードプライマーＩｏＥ１１（配列番号：４５）及びリバースプライマーＩｏＥ１２（配列番号：４６）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３０サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿６を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿６、フォワードプライマーＩｏＥ１３（配列番号：４７）及びリバースプライマーＩｏＥ１４（配列番号：４８）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３２サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿７を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿７、フォワードプライマーＩｏＥ１５（配列番号：４９）及びリバースプライマーＩｏＥ１６（配列番号：５０）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３２サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。配列を検証したクローンであるプラスミド＿８を鋳型として、後続のＰＣＲ増幅ラウンドに使用した。

ＰＣＲ増幅を、プラスミド＿８、フォワードプライマーＩｏＥ１７（配列番号：５１）及びリバースプライマーＩｏＥ１８（配列番号：５２）を用いて行った。ＰＣＲ増幅及びクローニングを、先に説明した手順及び以下のＰＣＲ条件を用いて実施した：９５℃で５分間、それに続く９５℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３２サイクル、最後に７２℃で５分間の伸長。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを使用する電気泳動により分離し、臭化エチジウムにより染色した。このＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、抽出し、且つｐＥＴ２４ａプラスミドへクローニングした。このライゲーション混合物を、大腸菌細胞のＤＨ５アルファ株へ形質転換し、形質転換体を、アンピシリンを含有するＬＢプレート上で選択した。配列を検証したクローンであるプラスミド＿９は、正確なリーディングフレームでＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：２５）を含む。

組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの発現

プラスミド＿９を、発現用大腸菌株ＢＬ２１へ形質転換し、並びにアンピシリン－耐性コロニーを選択した。ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチドについて予想される分子量は、２０ｋＤａであった（図２）。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したルリア－ベルターニ（ＬＢ）－寒天プレートから単独コロニーを選択した。この調製において、３ｍｌのＬＢ培地（１Ｌ当たり１０ｇトリプトン、１０ｇＮａＣｌ及び５ｇ酵母エキス）及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌコニカルチューブに、単独コロニーを接種し、３７℃及び２００ＲＰＭに設定した振盪インキュベーターにおいて一晩成長させた。この培養物を、１００ｍｌの２ＹＴ培地（１Ｌ当たり１６ｇトリプトン、１５ｇ酵母エキス及び８ｇＮａＣｌ）及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、滅菌した５００ｍｌエレンマイヤーフラスコに、培養液３ｍｌを添加することにより、更に増殖させ、並びに３７℃及び２００ＲＰＭに設定した振盪インキュベーターにおいて一晩成長させた。これは、シード培養物を生じた。

６Ｌのバイオリアクターを使用し、このシード培養物を更に増殖した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＹＴ培地４Ｌに、３７℃及び２００ＲＰＭに設定した振盪インキュベーターにおいて一晩成長させたシード培養物１００ｍｌを接種した。バイオリアクターにおいて、培養物を、３７℃、２ＳＬＰＭ（標準流量／分）の空気流及び２００ＲＰＭの撹拌でインキュベーションした。ＯＤ６００が０．６５～０．７５に到達した時点で、タンパク質過剰発現が、１．０ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、誘導された。これらの細胞を、７～８時間成長させ、撹拌速度、温度及び空気流は、各々、４００ＲＰＭ、２８℃及び４ＳＬＰＭに設定した。発泡を制御するために、ポリグリコールＰ－２０００消泡剤を、必要に応じて添加した。誘導の７～８時間後、細胞を、８０００ｒｐｍで１５分間、４℃での遠心分離により収集した。細胞ペレットを、－８０℃で、凍結貯蔵した。

組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの精製

この調製において、ペレットは、ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）の６ｇと同等であり、これを緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液）４０ｍｌ中に再浮遊させ、氷上の音波処理により破壊し（１０秒パルスと３０秒インターバルの２８サイクル、３０％振幅、超音波細胞破壊器Misonix Ultrasonic Liquid Processors S-4000, USAを使用）、溶解性分析のための総タンパク質抽出物を得た。総タンパク質抽出物を、ＳＳ－３４型ローターを使用する、Sorvall RC5C Plus (USA)超遠心分離機を使用し、１４，０００ｒｐｍで４５分間４℃で遠心分離した。この上清を、０．４５μｍフィルター(Millipore)を通して濾過し、同じ緩衝液で平衡としたＱ－セファロース陰イオン交換カラム上に装加した。Ｑ－セファロースは、床の高さ２０ｃｍまでＣ２６／４０カラム(GE Healthcare)へ充填した。ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）を含有する上清の容量４０ｍＬを、AKTA FPLC(GE Healthcare)を用い、流量５ｍｌ／分で、このカラムに装加した。ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）を、５０ｍＭトリス－ＨＣｌを含有する平衡緩衝液、ＮａＣｌ緩衝液を使用することにより、濃度勾配により溶離させ、疎水性相互作用カラムへ更に適用するために、Ａ_２８０吸光度を基に１本のピークを収集した。収集した溶離液を、１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。

疎水性相互作用クロマトグラフィー

イオン交換クロマトグラフィー後、溶離したＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）を、一緒にプールし、アミコンウルトラ１５ｍｌ遠心式フィルター(Merck)により濃縮し、その後飽和硫酸アンモニウム緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、３．８Ｍ硫酸アンモニウム、１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＤＴＡ）へ添加し、最終濃度１．２Ｍの硫酸アンモニウムとした。硫酸アンモニウムの添加により濃縮された生成物を、０．４５μｍシリンジフィルター(Millipore)を用いて濾過し、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Ｃ１０／２０カラム、Ge Healthcare）へ、流量２ｍｌ／分で装加した。Source 15PHE(GE Healthcare)を、Ｃ１０／２０カラム(GE Healthcare)へ、床の高さ１０ｃｍとなるよう充填し、緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、１０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＤＴＡ）により予備平衡化した。このカラムを、緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＥＤＴＡ）を用いるタンパク質溶離を、硫酸アンモニウムを減少し且つグリセロールを増加する線形勾配で実現した。溶離されたタンパク質を、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。これらの画分は更に、アミコンウルトラ１５ｍｌ遠心式フィルター(Merck)により濃縮した。

ゲル濾過を使用する緩衝液交換

精製した組換えポリペプチドを更に、セファデックスＧ－２５カラムを使用することにより、ＰＢＳ緩衝液へ交換した。セファデックスＧ－２５は、Ｃ２６／１００カラム(GE Healthcare)へ床の高さ８５ｃｍとなるよう充填し、ＰＢＳ緩衝液の流量１ｍｌ／分で予備平衡化した。濃縮されたタンパク質が、２．５時間後に溶離し、１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。次に得られた溶離液を、アミコンウルトラ１５ｍｌ遠心式フィルター(Merck)により濃縮した。

実施例２：免疫応答の誘導又は増強の方法

癌細胞株を、ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチド（配列番号：９）により処理し、ここでＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチドは、様々な濃度に希釈し、且つヒト癌細胞株Ｈ４４１（肺癌、ＨＴＢ－１７４、ＡＴＣＣ）、Ｈ４６０（肺癌、ＨＴＢ－１７７、ＡＴＣＣ）、ＨＣＴ１５（結腸癌、ＣＣＬ－２２５、ＡＴＣＣ）及びＭＣＦ７（乳癌、ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）と共に、全て３７℃でインキュベーションした。ＣＲＴ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、及びカスパーゼ３／７アッセイとして、組換えポリペプチドのインキュベーション時間は、Ｈ４４１に関して、各々、６０分間、１時間５０分、１時間４０分、及び２時間４５分であり、Ｈ４６０に関して、各々、３０分間、１時間１５分、１時間５分及び２時間３０分であり、ＨＣＴ１５に関して、各々、５５分間、１時間５０分、１時間３０分及び２時間３０分であり、並びにＭＣＦ７に関して、各々、１時間１０分、１時間４０分、１時間４５分、及び２時間４５分であった。フローサイトメトリーを使用し、ＣＲＹＡ＿１Ｂ組換えポリペプチドで処理した細胞及び未処理の対照細胞における、カルレティキュリン（ＣＲＴ）（図３－６）、ＨＳＰ７０（図７－１０）、ＨＳＰ９０（図１１－１４）及びカスパーゼ３／７（図１５－１８）の細胞表面発現を評価した。これは、各々、ＣＲＴｍＡｂ(Abcam)、ＨＳＰ７０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)、ＨＳＰ９０ｍＡｂ(Enzo Life Sciences)及びカスパーゼ３／７(Invitrogen assay)を使用し、FACSCalibur(BD Biosciences)を用いて実施した。

癌は、腫瘍内で（腫瘍内不均一性）、しかし腫瘍間でも（腫瘍間不均一性）、広範な遺伝子及び表現型の変動を受け得る。原発性腫瘍の潜在性サブクローンから播種されることが多い再発腫瘍は、癌死亡率の主な原因である。同様に、癌進行の致死的後期段階である転移は、原発性腫瘍由来の複数の遺伝的に区別される早期サブクローンを受け継いでいる。しかし、この転移性腫瘍は、原発性腫瘍の不均一性よりも、より少ない腫瘍内不均一性を示す。腫瘍間不均一性の主な原因は、原発性腫瘍の腫瘍内不均一性に起源がある。癌の免疫編集プロセスのために、腫瘍は、減弱された免疫原性を呈し、且つ免疫抑制性微小環境を作製し、宿主免疫系による腫瘍の根絶を妨げ得る。

癌細胞は、腫瘍の危険信号を隠匿する能力を有し、これは（インターロイキン（ＩＬ）－４及びＩＬ－１０）を放出するＴｈ２細胞により、腫瘍微小環境の慢性炎症を引き起こし、正常健常対象と比べ、癌対象におけるより高い血清ＩＬ－１０レベルに繋がる。ＩＬ－１０は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘導し（図１９及び２０）、並びにＤＣ活性化及び機能性を阻害する、抗炎症性サイトカインである。ＩＬ－１０は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で作製された腫瘍微小環境に繋がり、腫瘍回避を生じる。これは最終的には、適応免疫の活性化の低下を引き起こす。対照的に、細菌及びウイルス感染は、危険信号を露わにし、このことは、ＩＬ－１２及びＩＦＮγ免疫賦活性サイトカインを微小環境へ放出する（図１９）Ｔｈ１細胞による急性炎症につながり、適応免疫の活性化を生じる。

カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、腫瘍及び病原体を取り込むように、樹状細胞（ＤＣ）を動員する危険信号である。ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０は、樹状細胞の成熟又は活性化を誘導する危険信号であり、これらは次にＩＬ－１２及びＩＬ－６を産生する。その後樹状細胞は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩとの関係において抗原をリンパ節内のＴ細胞へ提示することができる。活性化されたＤＣは、ＩＬ－１２を産生することができ、これはＴ細胞の活性化を促進するＴｈ１サイトカインであり、このことは次に、ＩＬ－２及びＩＦＮγを産生する。活性化された－ＤＣ由来の急性の一過性の高いＩＬ－６は、急性炎症を引き起こし、発熱を生じ、このことは免疫Ｔ細胞活性化を促進する。ＩＬ－６の慢性発現は、慢性炎症を引き起こし、これは免疫活性化を妨げる。

実施例３：インターフェロンガンマの血清ＩＬ－１０に対する作用

癌患者における血清ＩＬ－１０のレベルは、正常健常対象と比べ、増加している。例えば、肺癌ステージＩＩＩ－ＩＶのヒト患者及び正常健常対象における血清ＩＬ－１０は、各々、１７．７ｐｇ／ｍＬ及び９．２ｐｇ／ｍＬである（ＩＬ－１０比１．９２４）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマを伴うマウスＣ５７ＢＬ／６及び正常健常マウスにおける血清ＩＬ－１０は、各々、９５ｐｇ／ｍＬ及び５０ｐｇ／ｍＬである（ＩＬ－１０比１．９）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマを伴うマウスＣ５７ＢＬ／６及び正常健常マウスの血清ＩｇＧは、各々、１２００及び６５０ＭＦＩである（ＩｇＧ比１．８４６）。ＭＣ３８（結腸癌）を伴うマウスＣ５７ＢＬ／６及び正常健常マウスにおける血清ＩＬ－１０は、各々、７０ｐｇ／ｍＬ及び５０ｐｇ／ｍＬである（ＩＬ－１０比１．４）。Ｅ０７７１（乳癌）を伴うマウスＣ５７ＢＬ／６及び正常健常マウスにおける血清ＩＬ－１０は、各々、７０ｐｇ／ｍＬ及び５０ｐｇ／ｍＬである（ＩＬ－１０比１．４）。

ＩＦＮγは、血清ＩＬ－１０のレベルを阻害するので、ＩＦＮγの静脈内注射を、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を持つマウスへ投与し、血清ＩＬ－１０に対する作用を決定した。血液は、ＩＦＮγ注射後３．５時間で採取し、血清ＩＬ－１０を、Luminexアッセイにより決定した。表５及び図２１は、増加したＩＦＮγ用量は、マウスにおける血清ＩＬ－１０レベルの減少を生じることを示している。

実施例４：ＭＣ３８、Ｅ０７７１及びＢ１６Ｆ１０のインビボ腫瘍チャレンジ及び再チャレンジの方法及び投薬レジメン

方法。雌の１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス(Charles River Laboratories, USA)を飼育し、且つ「実験動物の国際ケアに関する評価及び認証協会（ＡＡＡＬＡＩＣ）」の指針に従い、病原体の存在しない条件下で維持した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスには、側腹部へ、１００μｌＰＢＳ中の１×１０^６個ＭＣ３８／Ｅ０７７１／Ｂ１６Ｆ１０細胞を皮下接種した。腫瘍容積を、キャリパーで測定し、式（Ａ×Ｂ２）／２［Ａ：腫瘍の最大直径；Ｂ：最小直径］を使用し計算した。腫瘍がおよそ１００ｍｍ^３に達した時点で、本発明者らは、図２２の処置スケジュールに従い、腹腔内注射により、組換えポリペプチド及びＩＦＮガンマの処置を開始した。

結果。ＭＣ３８は、転移モデルのための、化学物質で誘導されたグレードＩＩＩのＳＭＡＤ４－欠失転移性結腸直腸腺癌であり、並びにＥ０７７１は、再発モデルのための、トリプル－ネガティブ癌クローディン－低自己－再生自発的乳腺癌である。癌に対する適応免疫の顕著な特徴は、癌再発を予防するために、同じ新抗原に再遭遇した時点で、より迅速且つ強固に反応する免疫記憶を持つ長期生存した新抗原－特異的Ｔ細胞に関するものである。長期の適応免疫記憶の証明のために、本発明者らは、腫瘍チャレンジ実験からの完全奏効（ＣＲ）マウスをまとめてプールし、次にこれらのＣＲマウスを、生存腫瘍細胞で再チャレンジし、原発性腫瘍の完全拒絶後６ヶ月での原発性腫瘍の反対側への外から強制された生存腫瘍細胞注射により、自発的腫瘍再発を模倣した。腫瘍成長の徴候が存在しない場合、これは、ヒトでのおよそ１５～２０年に相当するマウスの６ヶ月の適応免疫が巧くいったことを示している。ＭＣ３８は、ＳＭＡＤ４－欠失の表現型を有し、これは結腸癌患者の転移及び生存不良に関連している。ＭＣ３８腫瘍チャレンジ実験は、原発性腫瘍バリアントは、初期の腫瘍の自発的部分退縮後に攻撃的に成長を開始し、及びおよそ４０％のマウスは、１又は２の局所領域的転移を発症したことを示している。組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）処置後のＣＲマウスに関して、転移は、最初に完全退縮を受けるのに対し、原発性腫瘍は最初に部分退縮を受け、その後最終的には完全退縮を受ける。本発明者らは、以下のように仮定した：１）組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ処置前、ドミナント新抗原に対し予め存在するＴ細胞の免疫選択は、原発性腫瘍の初期の自発的部分退縮を引き起こし、並びに持続性の免疫圧力は最終的には、ドミナント新抗原－欠失及び／又はＭＨＣ－Ｉ－欠損の腫瘍バリアントの自然選択につながる；２）次に原発性腫瘍バリアントは、突然攻撃的に成長し、且つ局所領域的転移が発生した（免疫回避）；３）組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ処置後、薬剤誘発した新抗原は、より大きい原発性腫瘍バリアントと比べ、より小さい転移を対象とする比較的高い薬物濃度に起因する転移に大部分は由来した；４）この転移は、複数の転移のみのサブドミナント新抗原及び恐らく１つの共有されたサブドミナント新抗原により、完全退縮を受けたが、原発性腫瘍バリアントは、１つの共有されたサブドミナント新抗原による限定された部分退縮を平行して受けた；５）転移のＣＲ後、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの後続の投与量は、共有されたサブドミナント新抗原に加え、複数の原発性のみのサブドミナント新抗原を誘導した；６）この原発性腫瘍バリアントは最終的に、完全退縮を受けた。対照的に、ＤＣ－媒介型新抗原－ベースのワクチンが、サブドミナント新抗原を混入することなく、患者のＴＩＬ又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のエクスビボスクリーニングされた免疫ドミナント新抗原のみを使用する場合、これは腫瘍バリアントを回避することにより、転移及び原発性腫瘍の完全な根絶は不可能であろう。

ＭＣ３８腫瘍チャレンジモデルの全ＣＲ率は、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ処置後、７０％であり、且つＣＲマウスに関する無再発生存率は、腫瘍再チャレンジ後の腫瘍再発のない長期免疫により、１００％であった（図２３Ａ及び２３Ｂ）。広範囲に及ぶ腫瘍内不均一性を伴うトリプル－ネガティブ乳癌であるＥ０７７１は、特にヒト乳癌患者の再発のための薬物処置後に、エンリッチされた腫瘍－開始（幹細胞様）ＣＤ４４^＋ＣＤ２４^－／低細胞の特徴を持つクローディン－低腫瘍表現型を有する。Ｅ０７７１の幹細胞様腫瘍－開始する能力の観点から、本発明者らは、これを、自発的腫瘍再発のモデルに使用した。組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ処置後、本発明者らは、Ｅ０７７１腫瘍チャレンジモデルにおいて６０％のＣＲ率を達成した（図２３Ｃ）。本発明者らは、６ヶ月間観察し、ＣＲ後の自発的Ｅ０７７１腫瘍再発の徴候は存在しなかった。本発明者らは、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂは、Ｅ０７７１－由来のドミナント新抗原、及び癌幹細胞サブクローンのものを含む複数のサブドミナント新抗原を同時に誘導し、その新抗原の多様性(multiplicity)は、Ｅ０７７１が自発的に再発するのを防いだと仮定した。更に本発明者らは、ＣＲマウスを、外から強制された腫瘍再発として、生存Ｅ０７７１腫瘍細胞により再チャレンジし、並びに再チャレンジ後に腫瘍成長の徴候は存在せず、このことは、長期間生きている適応免疫記憶が巧くいったことを指摘している（図２３Ｄ）。興味深いことに、本発明者らは、ＭＣ３８及びＥ０７７１の両腫瘍モデルに関して、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ処置後に、２種の異なる腫瘍退縮パターンが存在することを認め、一方はＣＲまで連続する腫瘍退縮である（図２３Ａ）のに対し、他方は一時的腫瘍再燃と、その後のＣＲまでの腫瘍退縮であった（図２３Ｃ）。同一の腫瘍チャレンジ及び腫瘍再チャレンジ実験を、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマモデルで実行した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍チャレンジモデルの全ＣＲ率は、処置レジメン後４０％であり、並びにＣＲマウスに関する無再発生存率は、１００％であり、腫瘍再チャレンジ後に腫瘍再発のない長期間免疫を伴った（図２４Ａ及び２４Ｂ）。本発明者らは、免疫系のプライミングは、複雑であり、且つ腫瘍が一過性に成長し及び／又は実質的免疫細胞が一過性に腫瘍を浸潤する間に遅延され、この期間に腫瘍サイズの増大を生じ得るので、免疫療法後、腫瘍再燃が起こり得ると仮定している。

加えて組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）を、健常な免疫適格Ｂ６マウス（ｎ＝７）に、臨床投与量の１．６倍で、７連続日、毎日投与し、薬物の血清ピーク濃度は～８００μｇ／ｍｌであり、これは実験終了時に行動、体重、食物摂取量及び重要な血清化学パラメータに有意な変化を示さなかったが、ただ初回投与量後に体重及び食物摂取量に注目に値する低下を示したが、通常はその後２～３日のうちに回復し、初回投与量後の後続投与量による大きい影響はなかった。

正常ヒトＰＢＭＣ（３名の健常ドナー）について、自然免疫細胞及び適応免疫細胞で生成される、カスパーゼ３／７を測定することにより、インビトロ毒性も調べた。本発明者らの結果は、ＰＢＭＣ生存能は、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）の８００μｇ／ｍＬの注射であっても、有意に減少しなかった（図２５）ことを示し、これは同等の薬物血清ピーク濃度で有害事象を伴わないインビボ安全性プロファイルを裏付けている。まとめるとこれは、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）は、癌再発及び注目に値する有害事象を欠く、長期の適応免疫を強力に活性化することを指摘している。

考察。抗－ＰＤ－１療法など固形腫瘍に対するチェックポイントを遮断する癌免疫療法の臨床での成功にもかかわらず、抗－ＰＤ－１療法に反応するＰＤ－Ｌ１＋腫瘍表現型を持つ患者の限定されたサブセットのみ存在し、且つ非常に著しい数の反応する患者は、大部分は反復免疫療法処置の免疫圧力から生じる新抗原欠失及び／又はＭＨＣ－Ｉ－欠損の腫瘍バリアントの自然選択のために、再発した（ぶり返しまでの平均時間：６２４日間）。より良い治療効率、及び腫瘍表現型の制限を伴わないより広範な患者を対象とするために、エクスビボＤＣワクチン、長ペプチドワクチン、ＲＮＡワクチン及びＤＮＡワクチンなどの、個別化されたＤＣ媒介型新抗原ベースのワクチンが、新規ポリクローナルＴ細胞免疫応答を引き起こし、結果を後押しした。このポリクローナルＴ細胞は、新抗原欠失バリアントから派生した腫瘍のリスクを軽減することができるが、β２－ミクログロブリン欠損症から生じるＭＨＣ－Ｉ提示の全体の喪失は、依然効果的な腫瘍回避機序としてあり続ける。更に患者の切除可能な腫瘍試料、手術不可能な腫瘍の問題、時間のかかる（約３～５ヶ月）及び費用のかかるＧＭＰ製造、エクスビボにおけるインシリコ新抗原予測の正確性の課題は、依然解決されるべき手強い問題点である。対照的に、腫瘍内腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）療法、エクスビボにおける新抗原予測を伴わない抗原－認知不能(agnostic)ワクチンは、ネクロプトーシス、プログラムされたネクローシスを介して、腫瘍細胞を選択的に感染し、複製し及び溶解するのに複製－コンピテントな適応されたウイルスを使用し、これは、細胞膜の透過性及び腫瘍抗原の放出及び内因性ＤＣを介した免疫原性細胞死のためのＤＡＭＰを引き起こす。しかしながら、ＯＶの全身的静脈内注入が、遠位の転移性腫瘍の効果的治療には必要とされるが；しかし、そのような全身的注入は、ＯＶが、循環中に迅速に希釈され、血清因子により中和され、並びに肝臓及び脾臓において捕獲されることを引き起こすであろう。結果的に、ＯＶのＩＶ注入は、可能性のある投与量を制限するグレード４の毒性以外に、腫瘍内注射のものに類似した効能を達成するために、２桁より大きい、実質的高投与量を必要とし、製造技術の手腕次第であろう。更にバイオセーフティ規制の承認が、各臨床等級のＯＶには要求され、且つ必要とされる高い臨床ＩＶ投与量の製造技術の手腕には、依然課題が多い。対照的に、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂは、標準的な生物学的製造プロセスを使用する組換えタンパク質である。更に、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂは、複数の個人化されたインサイチュ新抗原を全身的に誘導し、新抗原欠失バリアントの回避を軽減し、ＨＳＰ７０－発現する腫瘍細胞の効果的認識のために、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ９０－ペプチドを介してＣＤ４^＋Ｔ細胞を、及びＣＤ４^＋ヘルパーのインターロイキン－２プライミングを介してＮＫ細胞を、相乗的に活性化し、ＭＨＣ－Ｉ－欠損（ＮＫ細胞感受性）バリアントを根絶し、且つＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－媒介した末梢の免疫寛容を最小化するために、Ｔ細胞上のＰＤ－１発現減少のためのＣＤ７０－ＣＤ２７ライゲーションを強力に始動させることができる。従って新抗原欠失、ＭＨＣ－Ｉ－欠損バリアント及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－媒介した免疫寛容などの減弱された免疫原性、並びに骨髄系由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ及び制御性Ｔ細胞などの免疫抑制性腫瘍微小環境構成要素を考慮し、本発明者らは、まず第一により良いＤＣ活性化のために、免疫抑制性腫瘍微小環境をどのように再プログラム化するかに焦点を当てることを選択した。本稿記載時に、本発明者らは、免疫適格マウスにおける、各々ＭＣ３８及びＥ０７７１の結腸直腸及び乳房の両方の同系腫瘍モデルに関して、腫瘍微小環境を再形成し、ＣＲの増加を生じるために、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂと相乗的であるアジュバントを、スクリーニングし、同定し且つ検証した。まとめると、画期的医薬品（ＦＩＣ）の組換えα－結晶組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂは、固形－腫瘍癌型及び腫瘍表現型とは関わりなく、プレアポトーシス性の個別化された腫瘍－由来のＣＲＴ－ペプチド、ＨＳＰ７０－ペプチド及びＨＳＰ９０－ペプチドの、強力な、全身性の、実時間及びインサイチュの誘導を示し、癌再発を防止するためのＴ細胞ポリクローナル多様性による抗腫瘍長期免疫を誘起し、また正常な細胞及び宿主に対する、それぞれ、最小の毒性及び有害事象も明らかにした。

実施例５：樹状細胞（ＤＣ）のＦＬＴ３Ｌ増殖

樹状細胞のＦＬＴ３Ｌ増殖

腫瘍抗原を捕獲し且つＴ細胞活性化／増殖のために抗原をＴ細胞へ提示することに寄与する樹状細胞を、腫瘍部位で増殖することによる、免疫応答を改善する代替のアプローチの必要性が、当該技術分野において存在する。ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の、腫瘍部位で稀なヒトＣＤ１４１^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣ又はマウスＣＤ１０３^＋ＸＣＲ１^＋ＤＣを増殖する能力を試験した。６名の健常志願者を、プラセボ（ｎ＝２）又はＦＬＴ３Ｌ（ｎ＝４；２０μｇ／ｋｇ／日の皮下注射）のいずれかにより、１４連続日処置した。ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣ集団（最終ＦＬＴ３Ｌ／プラセボ注射後２日）は、プラセボ群及びＦＬＴ３Ｌ－処置群からのＰＢＭＣ中、各々、１．５％及び１８．８％であった（表６）。ＤＣ増殖比は、ＦＬＴ３Ｌ処置後、１２．３３倍であった。従ってＦＬＴ３Ｌの皮下注射は、健常志願者由来のヒトＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣを増殖する。

６匹のアカゲザルを、プラセボ（ｎ＝２）又はＦＬＴ３Ｌ（ｎ＝４；５６０μｇ／ｍ^２の静脈内注射）のいずれかにより、７連続日処置した。ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣ集団（最終ＦＬＴ３Ｌ／プラセボ注射後２日）は、プラセボ群及びＦＬＴ３Ｌ－処置群からのＰＢＭＣ中、各々、１．０％及び１２．６％であった（表６）。ＤＣ増殖比は、ＦＬＴ３Ｌ処置後、１２．６倍であった。従って、ＦＬＴ３Ｌの皮下注射は、健常アカゲザル由来のＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣを増殖する。

処置前血清ＦＬＴ３Ｌ比：０．５～０．６×（健常者に対し）である６名の進行した病期の肺癌患者を、プラセボ（ｎ＝２）又はＦＬＴ３Ｌ（ｎ＝４；２０μｇ／ｋｇ／日の皮下注射）のいずれかにより、１４連続日処置した。ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣ集団（最終ＦＬＴ３Ｌ／プラセボ注射後２日）は、プラセボ群及びＦＬＴ３Ｌ－処置群からのＰＢＭＣ中、各々、１．６％及び７．２５％であった（表６）。ＤＣ増殖比は、癌患者に関するＦＬＴ３Ｌ処置後、４．５３倍であった。従ってＦＬＴ３Ｌは、癌患者由来のヒトＰＢＭＣにおいてＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣを増殖するが、健常ヒトにおける増殖倍率（１２．３３倍）よりも少なかった。

癌患者に関するＦＬＴ３Ｌ静脈内投薬期間の決定

処置前ＩＬ－１０／ＩｇＧ比：１．４５～１．６×（健常者に対し）である２０名の進行した病期の肺癌患者を、ＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣの少なくとも１２倍の増殖（先の実験における健常ヒトにおいて認められる増加倍率）を達成するために必要とされる投薬期間の全体の長さを決定するために、ＦＬＴ３Ｌを静脈内注射６μｇ／ｋｇで、様々な期間、毎日処置した。血清ＦＬＴ３Ｌレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定した。ＩＬ－１０／ＩｇＧレベルは、Luminexアッセイにより決定した。表７は、この実験の結果を示す。

ＦＬＴ３Ｌ静脈内投与量の決定を癌患者に関して決定するために、処置前血清ＦＬＴ３Ｌ比：０．６～０．８×（健常者に対し）である２０名の進行した病期の肺及び膵癌患者を、以下の判定基準に合致するよう、ＦＬＴ３Ｌ静脈内注射の治験投与量（μｇ／ｋｇ）で、１２連続日、毎日処置した。癌患者からのＰＢＭＣ中のＨＬＡ－ＤＲ＋Ｌｉｎ－ＤＣ増殖比の判定基準は、必要なＦＬＴ３Ｌ投与量の決定のために、ＦＬＴ３Ｌ処置後に、少なくとも１２倍（健常ヒトのそれに類似）に設定した。血清ＦＬＴ３Ｌレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定した。血清ＩＬ－１０／ＩｇＧレベルは、Luminexアッセイにより決定した。図２７は、ＦＬＴ３Ｌ静脈内投与量と健常者に対するＩＬ１０／ＩｇＧ比の間の相関関係を示し、ここで回帰直線は、ｙ＝３．４ｘ＋０．７８であると決定された。

先の実験から、従来型のヒトＦＬＴ３Ｌ処置（皮下注射による）は、７４０μｇ／ｍ^２（２０μｇ／ｋｇ）の投与量を用い、１４日間持続する。７日間のＦＬＴ３Ｌ処置（１２．６×、投与量５６０μｇ／ｍ^２の静脈内注射による）は、健常対象に関する１４日目（１２．３３×、投与量７４０μｇ／ｍ^２の皮下注射による）のそれと同様のＤＣ－増殖の有効性を達成した。限定されたＤＣ増殖能（癌患者：４．５３×、対、健常者：１２．３３×）及び限定された生存期間を伴う癌患者の場合においては、最適化された投与量及び期間のＦＬＴ３Ｌ処置のために、より効果的な静脈内注射が使用される。

実施例６：ヒトＰＢＭＣ中のＩＬ－１０及びＣＴＬＡ－４発現レベルに対するＩＦＮガンマの作用

最高血清インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）濃度（Ｃｍａｘ）及び半減期を、健常ヒト志願者で試験した。６名の健常志願者に、プラセボ又はＩＦＮγ（アクティミューン（登録商標））のいずれかを特定された投与量で静脈内に注射し、並びにＩＦＮγのＣｍａｘレベルを測定した（表８）。投与量５０及び７０μｇのＣｍａｘは、各々、１ｎｇ／ｍｌ及び１．７５ｎｇ／ｍｌであった。ＩＦＮγの血清半減期は、およそ３０分間であった。投与量５０μｇの１－時間平均濃度Ｃ_{ａｖｇ（１ｈｒ）}は、０．６ｎｇ／ｍｌ［（１＋０．５＋０．２５）／３＝０．５８］であるのに対し、投与量７０μｇのＣ_{ａｖｇ（１ｈｒ）}は、１ｎｇ／ｍｌ［（１．７５＋０．８７５＋０．４３７５）／３＝１．０２］であった。血清ＩＦＮγのＣｍａｘレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定した。

ＣＴＬＡ４発現を、ＩＦＮγを静脈内注射したヒト健常志願者由来のヒトＰＢＭＣにおいて測定した。６名の健常志願者に、プラセボ又はＩＦＮγ（アクティミューン（登録商標））のいずれかを特定された投与量で静脈内に注射し、並びにＣＴＬＡ４発現を測定した（表８）。ＣＴＬＡ－４発現ＭＦＩ（平均蛍光強度）は、ＦＡＣＳ分析により評価した。変化倍率は、プラセボに対して計算した。健常志願者からのＰＢＭＣ中のＣＴＬＡ－４発現は、注射したＩＦＮγ投与量と正相関する。

ＩＬ－２産生を、ＩＦＮγを静脈内に注射されたヒト健常志願者から単離したＰＢＭＣにおいて測定した。６名の健常志願者に、プラセボ又はＩＦＮγ（アクティミューン（登録商標））のいずれかを特定された投与量で静脈内に注射し、並びにＩＬ－２産生を測定した（表８）。ＰＢＭＣ細胞は、抗－ＣＤ３ｍＡｂ／ＣＤ８０－Ｉｇ－コートされたビーズと共にインキュベーションし、Ｔ細胞を４８時間活性化した。ＩＬ－２レベルは、ＥＬＩＳＡにより決定した。健常志願者由来のＰＢＭＣ中のＩＬ－２産生は、注射したＩＦＮγ投与量及びＣＴＬＡ－４発現と負相関する。

ＩＬ－１０産生を刺激するために、ヒトＰＢＭＣ細胞を、１：２００希釈した黄色ブドウ球菌ｃｏｗａｎ－１株（ＳＡＣ）と共に、４８時間インキュベーションした。このインキュベーション後、ＩＦＮγを、異なる濃度で１時間添加した。ＩＬ－１０発現を、ＥＬＩＳＡにより決定し、表９に示した。これらの結果は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－１０を減少することを示している。

従って先の実験は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、ＩＬ－１０を減少し、より良い樹状細胞の機能性のために腫瘍微小環境を再プログラム化するが、同時にヒトＰＢＭＣにおいて、ＣＴＬＡ－４をアップレギュレートし、Ｔ細胞活性化を妨げることを示している。２つの矛盾する作用を最小化するために、ＩＦＮγの最適投与量は、７０μｇ（Ｃｍａｘ：１．７５ｎｇ／ｍＬ；Ｃ_{ａｖｇ（１ｈｒ）}：１ｎｇ／ｍＬの固定された投与量）であると決定され、これは活性化されたＴ細胞によりＩＬ－２産生を損なうことなく、ＩＬ－１０を３３％だけダウンレギュレートする。

実施例７：Ｍ２ＴＡＭを再プログラム化するＩＦＮガンマ

次に、本発明者らは、ＩＦＮガンマは、Ｍ２－様腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）のＭ１ＴＡＭへの再プログラム化を誘導することができるかどうかを試験し、このことは、カルレティキュリン－媒介性活性化後のＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮアルファ、及びＩＦＮベータの分泌に寄与する。健常ヒトＣＤ１４＋単球を、Ｍ－ＣＳＦ（１μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１μｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－１０（１μｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、Ｍ２－様マクロファージ細胞へ分化させた。分化したＭ２マクロファージ細胞を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）（１ｎｇ／ｍＬ）により１時間パルス処理した。４時間後、Ｍ２細胞及びＭ１細胞のレベルを測定した。表面発現マーカーＣＤ８０（Ｍ１マクロファージ）のアップレギュレーション並びにＭＡＲＣＯ及びＣＤ１６３（Ｍ２マクロファージ）のダウンレギュレーションを、ＦＡＣＳ分析により測定し、図２８に示した。Ｍ２マクロファージは、ＭＡＲＣＯ及びＣＤ１６３を高度に発現するのに対し、Ｍ１マクロファージは、ＣＤ８０を高度に発現する。Ｍ２マクロファージではなく、活性化されたＭ１マクロファージのみが、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５などの、炎症促進性サイトカインを産生することができる。まとめると、これは、ＩＦＮγは、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージへ再プログラム化することができることを示している。具体的には、これは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、７０μｇ（Ｃ_{ａｖｇ（１ｈｒ）：}１ｎｇ／ｍＬの固定された投与量）と低い静脈内注射投与量で、Ｍ２－様腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を再プログラム化し、Ｍ１ＴＡＭとなり始めることができ、且つカルレティキュリン－媒介性活性化後に、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮアルファ、及びＩＦＮベータの分泌を誘導することを示している。更にＩＦＮγは、ＩＬ－１０を減少し、より良い樹状細胞の機能性のために腫瘍微小環境を再プログラム化する。

実施例８：ＦＬＴ３Ｌ－増殖したＸＣＲ１＋樹状細胞を腫瘍部位へ動員するＸＣＬ１

ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド（ＸＣＬ１）は、ケモカイン受容体の“Ｃ”サブファミリー（ＸＣＲ１、ＧＰＲ５としても公知）のリガンドであり、ＸＣＲ１^＋ＤＣの腫瘍部位への走化性因子として働く。ＸＣＬ１は、ＸＣＲ１^＋ＤＣを、Ｂ１６Ｆ１０又はＭＣ３８メラノーマ腫瘍部位へ動員するかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに最初に、各々、２×１０^６個Ｂ１６Ｆ１０細胞又は２×１０^６個ＭＣ３８細胞を接種し、メラノーマを誘導した。マウスを、ＸＣＬ１又は空ベクターによりトランスダクションし、且つ全てＦＬＴ３Ｌを４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、腫瘍細胞接種から開始し、６日間静脈内注射した。腫瘍を、接種後７日目に単離した（最終ＦＬＴ３Ｌ注射の１日後）。表１０は、ＸＲＣ１^＋ＤＣ細胞の、両方の型の腫瘍部位への動員を示している。

従ってこれらの結果は、ＦＬＴ３Ｌによる処置後、増殖されたＸＣＲ１^＋ＤＣは、血液循環系内に残留し、且つＸＣＬ１は、ＸＣＲ１^＋ＤＣを、血管から腫瘍部位へ動員することを示している。

実施例９：マクロファージ及びＮＫ細胞を活性化しＸＣＬ１を放出させる組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）

サイトカイン－活性化されたＮＫ細胞はＸＣＬ１を放出する

サイトカインで処理されたＮＫ細胞が、ＸＣＬ１を放出するかどうかを決定するために、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞単離キットを使用し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞から精製した。ＮＫ細胞を、ＩＬ－１２（８０ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＬ－１５（８０ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＦＮアルファ（１０００ＩＵ／ｍｌ）、又はＩＦＮベータ（１０００ＩＵ／ｍｌ）又はそれらの組合せにより、２０分間活性化した。ＸＣＬ１のＭＦＩ（平均蛍光強度）を、ＦＡＣＳ分析により評価し、表１１に示した。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータによる処理は、対照と比べ、ＮＫ細胞からのＸＣＬ１放出の最高倍率の増加（１２倍増加）を生じた。

カルレティキュリン（ＣＲＴ）活性化されたマクロファージは、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮα及びＩＦＮβを産生する
カルレティキュリン（ＣＲＴ）－活性化されたマクロファージは、サイトカインＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮアルファ（ＩＦＮα）及びＩＦＮベータ（ＩＦＮβ）を放出するかどうかを決定するために、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（Ｍ１）細胞を、カルレティキュリン（１０μｇ／ｍｌ）により２０分間パルス処理した。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮα及びＩＦＮβの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカイン放出の尺度として、ＦＡＣＳ分析により評価した（表１２）。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮα及びＩＦＮβは全て、カルレティキュリン活性化されたマクロファージにより産生された。ＩＦＮα及びＩＦＮβは、カルレティキュリンによる処理後、最高レベルの放出を有した。

カルレティキュリン－媒介性マクロファージ及びＮＫ細胞は、ＸＣＲ１ ^＋ＤＣを腫瘍部位へ相乗的に動員する

次に、本発明者らは、ＸＣＬ１放出、並びにＸＣＲ１^＋ＤＣのＭＣ３８（結腸癌）又はＣ１４９８（急性骨髄性白血病）の腫瘍部位への動員を促進するために、カルレティキュリン（ＣＲＴ）－媒介性マクロファージは、ＮＫ細胞を活性化するかどうかを試験した。ＣＲＴは、マクロファージ上で豊富に発現されるＣＤ９１のリガンドである。ＸＣＬ１は、ＸＣＲ１のリガンドであり、ＸＣＲ１^＋ＤＣの走化性因子として働く。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０^６個のＭＣ３８結腸癌細胞（ｎ＝３）又はＭＣ３８．ＣＲＴ（ｎ＝１８；ＭＣ３８細胞は、ＰＢＳ中において組換えＣＲＴの３μｇ／１０^６個細胞と共に３０分間インキュベーションし、その後３回洗浄した）を接種した。ＭＣ３８．ＣＲＴ（表面ＣＲＴを発現しているＭＣ３８細胞）腫瘍－有するマウスを、更に６群に分けた：ＭＣ３８．ＣＲＴ、ＭＣ３８．ＣＲＴ／抗－ＸＣＬ１（ＸＣＬ１枯渇）、ＭＣ３８．ＣＲＴ／抗－ＮＫ１．１（ＮＫ細胞枯渇）、ＭＣ３８．ＣＲＴ／抗－Ｆ４／８０（マクロファージ枯渇）、ＭＣ３８．ＣＲＴ／抗－ＣＤ９１（ＣＤ９１受容体遮断）、及びＭＣ３８．ＣＲＴ／抗－ＣＲＴ（ＣＲＴ枯渇）。加えて、全てのマウスに、ＦＬＴ３Ｌ（４μｇ：５６０μｇ／ｍ^２／日）を、腫瘍接種から開始し、６日間、静脈内注射した。腫瘍を、接種後７日目に単離した（最終ＦＬＴ３Ｌ注射の１日後）。表１３は、腫瘍部位に動員されたＸＣＲ１^＋樹状細胞の数を示している。ＭＣ３８．ＣＲＴは、ＸＣＲ１^＋樹状細胞動員の増加を示したのに対し、ＸＣＬ１枯渇、ＮＫ細胞枯渇、マクロファージ枯渇、ＣＤ９１受容体遮断、ＣＲＴ枯渇は示さず、これは、ＸＣＬ１放出及びＸＣＲ１^＋樹状細胞の結腸癌腫瘍部位への動員を促進するよう、ＣＲＴは、ＮＫ細胞の活性化を媒介することを示唆している。

次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０^６個のＣ１４９８急性骨髄性白血病細胞（ｎ＝３）又はＣ１４９８．ＣＲＴ（ｎ＝１８；Ｃ１４９８細胞は、ＰＢＳ中において組換えＣＲＴの３μｇ／１０^６個細胞と共に３０分間インキュベーションし、その後３回洗浄した）を接種した。Ｃ１４９８．ＣＲＴ（表面ＣＲＴを発現しているＣ１４９８細胞）腫瘍－有するマウスを、更に６群に分けた：Ｃ１４９８．ＣＲＴ、Ｃ１４９８．ＣＲＴ／抗－ＸＣＬ１（ＸＣＬ１枯渇）、Ｃ１４９８．ＣＲＴ／抗－ＮＫ１．１（ＮＫ細胞枯渇）、Ｃ１４９８．ＣＲＴ／抗－Ｆ４／８０（マクロファージ枯渇）、Ｃ１４９８．ＣＲＴ／抗－ＣＤ９１（ＣＤ９１受容体遮断）、及びＣ１４９８．ＣＲＴ／抗－ＣＲＴ（ＣＲＴ枯渇）。加えて全てのマウスに、ＦＬＴ３Ｌ（４μｇ：５６０μｇ／ｍ^２／日）を、腫瘍接種から開始し、６日間、静脈内注射した。腫瘍を、接種後７日目に単離した（最終ＦＬＴ３Ｌ注射の１日後）。表１４は、腫瘍部位に動員されたＸＣＲ１^＋樹状細胞の数を示している。Ｃ１４９８．ＣＲＴは、ＸＣＲ１^＋樹状細胞動員の増加を示したのに対し、ＸＣＬ１枯渇、ＮＫ細胞枯渇、マクロファージ枯渇、ＣＤ９１受容体遮断、ＣＲＴ枯渇は示さず、これは、ＸＣＬ１放出及びＸＣＲ１^＋樹状細胞のＡＭＬ腫瘍部位への動員を促進するよう、ＣＲＴは、ＮＫ細胞の活性化を媒介することを示唆している。

組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）は、癌細胞株上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）発現を誘導する
組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ（配列番号：９）は、マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ、ヒトＨＣＴ１５結腸癌、及びヒトＭＣＦ７乳癌細胞株において、カルレティキュリン（ＣＲＴ）を誘導するかどうかを決定するために、４×１０^５個細胞を、１２－ウェルプレートに播種し、翌日これらの細胞を、ＣＲＹＡ＿１Ｂにより６０分間処理した。ＣＲＴ－発現している細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析により評価した。表１４は、ＣＲＹＡ＿１Ｂは、対照と比較し、各型の細胞のＣＲＴ発現を増大することを示している。

ＣＲＹＡ＿１Ｂは、癌細胞株上のＨＳＰ７０発現を誘導する

ＣＲＹＡ＿１Ｂは、マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ、ヒトＨＣＴ１５結腸癌、及びヒトＭＣＦ７乳癌細胞株においてＨＳＰ７０を誘導するかどうかを決定するために、４×１０^５個細胞を、１２－ウェルプレート上に播種し、翌日これらの細胞をＣＲＹＡ＿１Ｂにより１１０分間処理した。ＨＳＰ７０－発現している細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析により評価した。表１６は、ＣＲＹＡ＿１Ｂは、対照と比較し、各型の細胞のＨＳＰ７０発現を増大することを示している。

ＣＲＹＡ＿１Ｂは、癌細胞株上のＨＳＰ９０発現を誘導する

ＣＲＹＡ＿１Ｂは、マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ、ヒトＨＣＴ１５結腸癌、及びヒトＭＣＦ７乳癌細胞株においてＨＳＰ９０を誘導するかどうかを決定するために、４×１０^５個細胞を、１２－ウェルプレート上に播種し、翌日これらの細胞をＣＲＹＡ＿１Ｂにより１１０分間処理した。ＨＳＰ９０－発現している細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析により評価した。表１７は、ＣＲＹＡ＿１Ｂは、対照と比較し、各型の細胞のＨＳＰ９０発現を増大することを示している。

従ってまとめると、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂは、マウス腫瘍及びヒト腫瘍の両方の、強力なカルレティキュリン（ＣＲＴ）－インデューサーである。ＣＲＹＡ＿１Ｂは、腫瘍上のＣＲＴ発現を誘導する。次にＣＲＴは、ＣＤ９１への結合及びＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮアルファ、及びＩＦＮベータの産生の誘導を介して、Ｍ１腫瘍関連マクロファージを活性化する。このサイトカインの組合せは、腫瘍内ＮＫ細胞を活性化し、ＸＣＲ１受容体のリガンドであるＸＣＬ１の産生を生じる。結果的に、ＸＣＬ１は、ＸＣＲ１^＋ＤＣを、血管から腫瘍部位へ動員する。腫瘍上のＣＲＴ発現の誘導後、ＣＲＹＡ＿１Ｂは同じく、腫瘍上のＨＳＰ７０／９０の発現も誘導し、これは次に腫瘍内ＸＣＲ１^＋ＤＣを成熟し且つ活性化するように作用し、並びにＴ細胞をプライムし且つ増殖するために、捕獲された抗原を伴うこれらの樹状細胞のリンパ節への遊走を誘導する。従って、ＣＲＹＡ＿１Ｂによる処理は、樹状細胞の成熟及び増殖を誘導し、これにより免疫細胞反応をプライムする新規方法である。

実施例１０－Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂを使用する、インビボ併用療法

インビボマウスモデルにおいてＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ及びＣＲＹＡ＿１Ｂの作用を試験するために、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ及びＣＲＹＡ＿１Ｂ（ＣＲＴ－インデューサー）の併用療法を設計した。図２９は、様々な対照及び治療組合せの概略を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各群について、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（メラノーマ細胞の低免疫原性及び攻撃性表現型）を、皮下接種した：対照（ｎ＝５）、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＦＬＴ３Ｌ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）、及びＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝１０）。腫瘍は、４日間（４日目）で、およそ４０～５０ｍｍ^３に達した。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、その後ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日に４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続６日間、静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置の４時間前に、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇ静脈内注射した。ＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により、２０ｍｇ／ｋｇ及び１３．５ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。

実施例１１－Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ受容体、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ及びＰＤ１（ニボルマブ）遮断を使用する、インビボ併用療法

本発明者らは、ＴＮＦアルファ受容体（ＴＮＦαＲ）アジュバントは、時間ウインドウを広げることにより、抗－ＰＤ１治療を増強することができ、この治療は、プライミング相又は任意のブースティング相（１°－５°ブースティング）のいずれかにおいてであることができると仮定した。本発明者らはまた、ＴＮＦαＲは、セントラルメモリーＴ細胞の形成の速度を加速し、より短いプライム－ブーストの間隔を生じることができることも仮定した。メラノーマのインビボマウスモデルにおいて、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ受容体（ＴＮＦαＲ）、ＣＲＹＡ＿１Ｂ及び単回投与量のＰＤ１（ニボルマブ）遮断の作用を試験するために、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ＣＲＴ－インデューサー）及び単回ＰＤ１遮断の併用療法を、設計した（図３１）。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した。
ＩｇＧ２ａ群：
１）１８日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、
２）２２日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、
３）３０日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、及び
４）３７日目にＩｇＧ２ａを伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）；
抗－ＰＤ１群：
１）１８日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、
２）２２日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、
３）３０日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）、及び
４）３７日目に抗－ＰＤ１を伴うＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ（ｎ＝５）。

抗－ＰＤ１／ＩｇＧ２ａ処置群に関して、マウスには、抗－ＰＤ１群についてマウスの抗－ＰＤ１（ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ）を、又は対照群についてラットＩｇＧ２ａのいずれかを、全て指定された日に３ｍｇ／ｋｇで、静脈内に１回投与した。腫瘍は、５日間（５日目）で、およそ５５ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。次にＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。このマウスには、ＩＦＮγを０．３μｇ＊静脈内注射し、その４時間後ＴＮＦαＲを注射し（２０μｇ、皮下注射により）、その直後にＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。＊：ヒト固定投与量７０μｇからの変換［ヒト６０ｋｇと想定、７０／６０×３７（ヒトＫｍ）^＊＊×０．００７（マウス体表面積）^＊＊＝０．３μｇ］。ＣＲＹＡ＿１Ｂは、Ｔ細胞のプライミング及びブースティングの両方に使用した。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ提供）、その後２日の無処置を、１２日目に開始し、３サイクル繰り返した。Ｔ細胞をブーストするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ提供）、その後２日の無処置を、３１日目に開始し、２サイクル繰り返した。図３１は、投薬レジメンの概略を示している。動物とヒトの間の投与量の変換は、Nairら、J. Basic Clin Pharm,, 27-31, 201に従い算出した。１９、２３、３１、及び３８日目に、抗－ＰＤ１群及びＩｇＧ２ａ群の両方からマウスのＰＢＭＣを収集し、フローサイトメトリーにより分析し、集団におけるＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋（抗原曝露歴のある）Ｔ細胞の割合を決定した。全ての抗－ＰＤ１群について、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^－ＣＤ６２Ｌ^＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^＋ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－）、及びエフェクターＴ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ１２７^－ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ６２Ｌ^－）は、全てほぼ同等に分化し、セントラルメモリーＴ細胞は３４％であった（表１８）。全てのＩｇＧ２ａ群について、ドミナントな集団は、エフェクターメモリーＴ細胞（７０％）であり、セントラルメモリーＴ細胞は５％であった。

単回抗－ＰＤ１投与量が注射された群に関して、抗原曝露歴のあるセントラルメモリーＴ細胞の割合は、抗－ＰＤ１処理しないものの６．６倍であった（３３～３４％、対、５％ｗ／ｏ抗－ＰＤ１）。エフェクターメモリーＴ細胞のセントラルメモリーＴ細胞への転換は、ＣＤ６２Ｌのアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のダウンレギュレーションを介することができる。

実施例１２－Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ治療のための、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ受容体、組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂ及び反復投与量のＰＤ１（ニボルマブ）遮断を使用する、インビボ併用療法

インビボマウスモデルにおけるＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ受容体（ＴＮＦαＲ）、ＣＲＹＡ＿１Ｂ及び反復投与量のＰＤ１遮断の作用を試験するために、併用療法を設計した（図３２）。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した。
処置群：
１）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２日目に抗－ＰＤ１×１（ｎ＝５）、
２）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５日目に抗－ＰＤ１×２（ｎ＝５）、
３）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５／２８日目に抗－ＰＤ１×３（ｎ＝５）、
４）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５／２８／３１日目に抗－ＰＤ１×４（ｎ＝５）、
５）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５／２８／３１／３４日目に抗－ＰＤ１×５（ｎ＝５）、
６）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５／２８／３１／３４／３７日目に抗－ＰＤ１×６（ｎ＝５）、及び
７）ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＴＮＦαＲ／ＣＲＹＡ＿１Ｂ／２２／２５／２８／３１／３４／３７／４０日目に抗－ＰＤ１×７（ｎ＝５）。

抗－ＰＤ１処置に関して、これらのマウスには、マウス抗－ＰＤ１（ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ）を、全て指定された日（複数可）に３ｍｇ／ｋｇで、静脈内に投与した。腫瘍は、５日間（５日目）で、およそ５５ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。その後ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。マウスは、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、その４時間後ＴＮＦαＲを注射し（２０μｇ、皮下注射により）、その直後にＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。＊：ヒト固定投与量７０μｇからの変換［ヒト６０ｋｇと想定、７０／６０×３７（ヒトＫｍ）^＊＊×０．００７（マウス体表面積）^＊＊＝０．３］。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、１２日目に開始し、３サイクル繰り返した。動物とヒトの間の投与量の変換は、Nairら、J. Basic Clin Pharm,, 27-31, 201に従い算出した。２３、２６、２９、３２、３５、３８及び４１日目に、全ての抗－ＰＤ１群からマウスのＰＢＭＣを採取し且つ分析し、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋（抗原曝露歴のある）Ｔ細胞の割合を決定した。これらのＴ細胞割合は、単回抗－ＰＤ１処置のそれに対する相対割合としてプロットした。ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞の相対割合は、表１９に示している。

考察したように、ＣＲＹＡ＿１Ｂは、Ｔ細胞のプライム及びブーストの両方に使用することができる。これらの結果に示されたように、「より短い」間隔のプライムからブーストに最適化されたＴ細胞は、ブースティング相におけるＴ細胞の迅速な増殖が必要とされる。具体的には、これは、先にプライムされたセントラルメモリーＴ細胞のブースティングを可能にし、並びに更に宿主における抗原曝露歴のあるＴ細胞の総数の増加を可能にする。腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞のプライミング及びブースティングは、より短いか又は限定された余命を持つ癌患者にとって、並びに大きい腫瘍サイズの患者にとって特に有利である。

プライミング相又は任意のブースティング相（１°－５°ブースティング）のいずれかでの単回の抗－ＰＤ１処理後、ＣＤ８^＋セントラルメモリーの割合は、全てほぼ同じ（約３３％）であるが、Ｔ細胞プライミング相時の抗－ＰＤ１処理は、Ｔ細胞ブースティング相よりも、より高い絶対数のＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞を生じる。これは、プライミング相におけるＴ細胞の全増殖率（＞１３回の細胞分裂で等しく≧１００００倍）は、任意のブースティング相（５～８回細胞分裂）のそれよりも実質的により大きいためである(Haringら、Immunity,19-29, 2006、Fraserら、Immunity, 171-183, 2013)。「７回」の抗－ＰＤ１注射の最大数は、認容性がある。しかし先に示したように、単回抗－ＰＤ１処置は、反復抗－ＰＤ１処置よりも、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞のより高い絶対数を達成し、次により多いＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞を達成する。これは、延長されたＰＤ１阻害は、Ｔ細胞の生存を損なうためである(Odorizziら、J. Exp. Med.,1125-1137, 2015)。従って、本発明者らは、単回抗－ＰＤ１処置に関する最適時間ウインドウは、プライミング相の組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂの最終注射と、最初のブースト相におけるＣＲＹＡ＿１Ｂの初回注射の間にあることを決定する。

実施例１３－Ｔ細胞プライミング及びＴ細胞ブースティングのプロトコール

Ｔ細胞プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（×１）（対照）

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ）細胞を皮下接種した（ｎ＝１０）（図３３）。腫瘍は、５日間（５日目）で、およそ５０～５５ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。樹状細胞を増殖するＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、その４時間後初回のＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を１２日目に行った。Ｔ細胞をプライムするＣＲＹＡ＿１Ｂに関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。２３日目に、マウスには、対照としてラットＩｇＧ２ａを３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。２５日目に、樹状細胞を増殖するために、ＦＬＴ３Ｌ処置を、マウスへの一日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）の７連続日静脈内注射により繰り返した。３２日目に、ＩＬ１０を減少し且つＭ２ＴＡＭのＭ１ＴＡＭへの再プログラム化するために、ＩＦＮγ処置を、０．３μｇのマウスへの静脈内注射により繰り返した。４時間後、Ｔ細胞ブースティングを、ＣＲＹＡ＿１Ｂの２日間処置（各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇの静脈内注射により）を導入し、その後２日間の無処置の１サイクルを、わずか２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返すことにより、実施した（図３３）。４０日目の、完全腫瘍退縮（ＣＲ）率は、１００％であった。Ｔ細胞プライム－ブースト効率－治癒効率は、先のプライム－ＩｇＧ２ａ－ブーストプロトコール（対照）のそれに対して、１００％ＣＲ（完全腫瘍退縮率）で最大治癒した腫瘍容積に関して決定した。１００％ＣＲでのベースライン腫瘍容積～５０ｍｍ^３は、対照としてプライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（×１、単回ブースト）プロトコールを使用し決定した。

３００ｍｍ ^３腫瘍に関するＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×１）

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（ｎ＝１０）。腫瘍は、約１３日間（１３日目）で、およそ３００～３１０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。図３４は、投薬レジメンの概略を示している。樹状細胞を増殖するＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を２０日目に行った。Ｔ細胞をプライムするＣＲＹＡ＿１Ｂに関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３１日目に、マウスには、マウス抗－ＰＤ１を３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。４５日目（抗－ＰＤ１注射から１４日目）に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ２）で、連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処置を繰り返した。５２日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞ブースティングレジメンを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置を使用することにより導入し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。図３４は、投薬レジメンを示している。６０日目の、完全腫瘍退縮（ＣＲ）率は、１００％であった。

３００ｍｍ ^３腫瘍に関するプライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×１）の効率－治癒効率は、プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（対照）の１００％ＣＲで～５０ｍｍ^３に対して、１００％ＣＲ（完全腫瘍退縮率）で最大治癒した腫瘍容積に関して決定した。～３００ｍｍ^３腫瘍の治療のための、ＣＲＹＡ＿１ＢプライミングとＣＲＹＡ＿１Ｂブースト（単回ブースト）の間の単回抗－ＰＤ１注射を使用し、本発明者らは、治癒腫瘍容積に関するおよそ６倍の治癒効率を達成した（～３００ｍｍ^３、対、～５０ｍｍ^３）。これは、先に示したように、ブースティングについて利用可能な、６．６倍のセントラルメモリーＴ細胞と相関している（プライム／抗－ＰＤ１の３３％、対、プライム／ＩｇＧ２ａの５％）。

４００ｍｍ ^３腫瘍に関するＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×１）

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（ｎ＝１０）。投薬レジメンは、図３５に示している。腫瘍は、～１４日間（１４日目）で、およそ４００～４１０ｍｍ^３に達し、本実験を開始した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。樹状細胞を増殖するＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を２１日目に行った。Ｔ細胞をプライムするＣＲＹＡ＿１Ｂに関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３２日目に、マウスには、マウス抗－ＰＤ１を３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。４６日目（抗－ＰＤ１注射から１４日目）に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処置を繰り返した。５３日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。７０日目の、完全腫瘍退縮（ＣＲ）率は、５０％であった。

治癒効率は、プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（対照）の１００％ＣＲで～５０ｍｍ^３に対して、１００％ＣＲ（完全腫瘍退縮率）で最大治癒した腫瘍容積に関して決定した。４００ｍｍ^３腫瘍の治療のための、ＣＲＹＡ＿１ＢプライミングとＣＲＹＡ＿１Ｂブースト（×１、単回ブースト）の間の単回抗－ＰＤ１注射を使用し、１００％ＣＲの代わりに、わずかに～５０％のＣＲを達成した。これは、より大きい腫瘍容積、攻撃性腫瘍遊走によるものであり、マウスにおける転移、単回ブースト後のエフェクターＴ細胞の自然の収縮(natural contraction)を生じた。従ってマウスは、全ての腫瘍転移を排除するのに充分に高いＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞を維持することができなかった。最終的にホメオスタシスに達する連続のＴ細胞の自然の縮小を避けるために、反復ブースト（２～５回のブースト）の投与が、高レベルの抗原曝露歴のあるＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞を維持する。喪失を伴わないＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞数の持続が、宿主における腫瘍転移の総根絶のために重要である。しかし反復ブースト後、完全に分化したＴ細胞は、再刺激が誘導した細胞死を受けやすい(Showら、Immunological Reviews, 68-82, 2010)。結果的に、突然のＴ細胞死に繋がるＴ細胞過剰刺激を防ぐために、最大５回のブースティングサイクルを実施することができる。

４００ｍｍ ^３腫瘍に関するＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×３）

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（ｎ＝１０）。図３６は、投薬レジメンの概略を示している。腫瘍は、～１４日間（１４日目）で、およそ４００～４１０ｍｍ^３に達し、本実験を開始した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。樹状細胞を増殖するＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を２１日目に行った。Ｔ細胞をプライムするＣＲＹＡ＿１Ｂに関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３２日目に、マウスには、マウス抗－ＰＤ１を３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。４６日目（抗－ＰＤ１注射から１４日目）に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処置を繰り返した。５３日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。６１日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。６８日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。７６日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。８３日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射により、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。９０日目に、完全腫瘍退縮（ＣＲ）率は、１００％であった。

４００ｍｍ ^３腫瘍に関するプライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×３）の有効性－治癒効率は、プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（対照）の１００％ＣＲで～５０ｍｍ^３に対して、１００％ＣＲ（完全腫瘍退縮率）で最大治癒した腫瘍容積に関して決定した。４００ｍｍ^３腫瘍のための合計３回のブーストによる、ＣＲＹＡ＿１ＢプライミングとＣＲＹＡ＿１Ｂブースティングの間の単回抗－ＰＤ１注射を使用し、本発明者らは、治癒した腫瘍容積に関しておよそ８倍の治癒効率を達成した（～４００ｍｍ^３、対、～５０ｍｍ^３）。

～５００ｍｍ ^３腫瘍に関するＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（ｎ＝１０）。投薬レジメンの概略は、図３７に示している。腫瘍は、～１５日間（１５日目）で、およそ５００～５１５ｍｍ^３に達し、本実験を開始した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。樹状細胞を増殖するＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＬ１０を減少し及びＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を２２日目に行った。Ｔ細胞をプライムするＣＲＹＡ＿１Ｂに関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３３日目に、マウスには、マウス抗－ＰＤ１を３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。４７日目（抗－ＰＤ１注射から１４日目）に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処置を繰り返した。５４日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射により、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。６２日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。６９日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。７７日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。８４日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。９２日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。９９日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。１０７日目に、樹状細胞を増殖するために、マウスへの、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）での連続７日間の静脈内注射による、ＦＬＴ３Ｌ処理を繰り返した。１１４日目に、ＩＬ１０を減少し及びＭ２ＴＡＭをＭ１ＴＡＭへ再プログラム化するために、マウスへの０．３μｇでの静脈内注射による、ＩＦＮγ処置を繰り返した。４時間後、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１ＢのＴ細胞のブースティングを、１サイクルとして２日間の処理（静脈内注射による各々、２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇ）、それに続く２日間の無処置により開始し、これをわずかに２サイクル（プライミングについての３サイクルに対し）繰り返した。１２２日目に、完全腫瘍退縮（ＣＲ）率は、１００％であった。

～５００ｍｍ^３腫瘍プロトコールに関するプライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）の治癒効率は、プライム－ＩｇＧ２ａ－ブースト（対照）の１００％ＣＲで～５０ｍｍ^３に対して、１００％ＣＲ（完全腫瘍退縮率）で最大治癒した腫瘍容積に関して決定した。～５００ｍｍ^３腫瘍のための合計５回のブーストによる、ＣＲＹＡ＿１ＢプライミングとＣＲＹＡ＿１Ｂブーストプロトコールの間の単回抗－ＰＤ１注射を使用し、治癒された腫瘍容積に関するおよそ１０倍の治癒効率（～５００ｍｍ^３、対、～５０ｍｍ^３）が達成された。注目すべきは、プライム－抗－ＰＤ１－ブースト（×５）の治癒効率は、プライミング－のみのプロトコールに比べ、約１２．５倍であった（～５００ｍｍ^３、対、～４０ｍｍ^３）＊。

実施例１４－ヒトにおける転移性大型腫瘍に関するＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）の治癒効率概算

以下の仮定を使用し、プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）プロトコール後のＣＤ４４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞総数の計算を、実施した（図３７）。仮定：ヒトの総ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞（４×１０^１０個細胞）(Boonら、Annu. Rev. Immunol., 175-208, 2006)。腫瘍抗原に関するヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞平均前駆体頻度（５／１００万個）(Lammermannら、Immunological Reviews, 26-43, 2008)。ヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞プライミング増殖（≧１００００倍）(Haringら、Immunity, 19-29, 2006)。ヒトメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞初回ブースティング増殖（４０倍；５～８回細胞分裂）(Williamsら、Nature,890-893, 2006；Fraserら、Immunity, 171-183, 2013)。ヒトメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞２～５回ブースティング増殖（～３倍；～１－２回細胞分裂）(Williamsら、Nature, 890-893, 2006；Raiら、J. of. Immunol., 5652-5659, 2014)。ヒト単独のＣＤ８^＋Ｔ細胞は、２～３標的を死滅させる(Wiedemannら、PNAS,10985-10990, 2006；McGavernら、Nature Immunol, 918-925, 2002)。ＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化は、単純化のために治癒効率の推定から除外している。

ヒトＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）処置プロトコールに従い、反復ブースティングにより引き起こされた持続した抗原曝露歴のあるＣＤ４４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、～２．６４×１０^１０個であり、これは～６．６×１０^１０個腫瘍細胞を死滅させると推定することができ、これはおよそ１０ｃｍ直径の腫瘍サイズに相当する。しかしヒトプライム－のみの処置後、抗原曝露歴のあるＣＤ４４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、約～２×１０^９個であり、これは～５×１０^９個腫瘍細胞を死滅させると推定することができ、これはおよそ４．３ｃｍ直径の腫瘍サイズに相当する。治癒された腫瘍容積の効率に従い、ヒトＴ細胞プライム－ＰＤ１（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）処置は、ヒトプライムのみの処置に比べ、１２．５８倍の治癒効率を有し（１０^３／４．３^３＝１２．５８）、これはマウスモデルの１２．５倍の治癒効率を裏付けている。

実施例１５－ＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量最適化

１）総ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の最大ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞（抗原曝露歴のあるＣＤ８^＋Ｔ細胞）(Baaten ら、 Front. Immunol., 1-12, 2012)の割合、及び２）総ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞の最小ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＰＤ１^＋ＴＩＭ３^＋Ｔ細胞（Ｔ細胞アネルギー又は消耗）(Chikumaら、J. Immunol., 6682-6689, 2009；Martinezら、Immunity, 265-278, 2015；Wangら、J. Hepatol., 731-741, 2019)の割合は、最適投与量レジメンを決定するための尺度であり、その割合は相対的に種で不変である。

ＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量最適化を決定するための実験を、設計し、且つ投与量戦略の概略を、図３９に示している。治療サイクルの第１日目；第２日目に異なるＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量を使用するＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関して、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（投与量_１日目；投与量_２日目）：２５ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２５ｍｇ／ｋｇ；１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１９ｍｇ／ｋｇ；１９ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１８ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）及び１８ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間、マウスへ静脈内に投与した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、１３日目の初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置の４時間前に、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射した。＊：ヒト固定投与量７０μｇからの変換［ヒト６０ｋｇと想定、７０／６０×３７（ヒトＫｍ）×０．００７（マウス体表面積）＝０．３］。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとしての、２日の処置（静脈内注射により、投与量_１日目；投与量_２日目ｍｇ／ｋｇ）、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３０日目に、全てのマウスのＰＢＭＣを、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋（抗原曝露歴のある）Ｔ細胞割合アッセイのために採取した。表２０は、本実験の結果を示している。

ＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量最適化の計算

種－不変的な最大ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋／最小ＰＤ１^＋ＴＩＭ３^＋Ｔ細胞の割合アッセイに従い、ＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量に関するルール／最大化(maximimums)は、以下のようである。
１）投与量_１日目＋投与量_２日目≦４０ｍｇ／ｋｇ
２）投与量_１日目≦２２ｍｇ／ｋｇ、
３）投与量_１日目≧投与量_２日目。

投与量_１日目＋投与量_２日目＞４０ｍｇ／ｋｇ、又は投与量_１日目＞２２ｍｇ／ｋｇの場合、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＰＤ１^＋ＴＩＭ３^＋Ｔ細胞の割合は、Ｔ細胞過剰刺激のために、有意に増加し（２５／１６ｍｇ／ｋｇ又は２５／１５ｍｇ／ｋｇについて１５％に対し、２２／１８ｍｇ／ｋｇについて５％）、アップレギュレートされたＴＯＸ遺伝子によるＴ細胞消耗を生じ、ＰＤ１及びＴＩＭ３の高発現につながる(Wangら、J. Hepatol., 731-741, 2019)。投与量_１日目＜投与量_２日目（例えば、１８ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、対、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ）の場合、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞の割合は、有意に減少する（１８／２０ｍｇ／ｋｇについて２８％、対、２０／１８ｍｇ／ｋｇについて３５％）（表２０）。本発明者らは、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ、及び２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇの最適投与量の範囲を各々得、プライミング後、全てＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞は３５％、及びＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ＰＤ１^＋ＴＩＭ３^＋Ｔ細胞はわずかに～５％であった（表２０）。

結果的に、最適投与量は、以下の条件を満足する。
１）投与量_１日目＋投与量_２日目≦４０ｍｇ／ｋｇ、
２）２０ｍｇ／ｋｇ≦投与量_１日目≦２２ｍｇ／ｋｇ、
３）１４ｍｇ／ｋｇ≦投与量_２日目≦２０ｍｇ／ｋｇ。

ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞の割合が３５％である場合、本発明者らは、非常に堅固な治療効果を認め、そのような割合は、１０～４０％の活性化されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を伴う非常に効果的なDryvax(ヒト天然痘)ワクチンにより裏付けられている(Millerら、Immunity, 710-722, 2008)。２０ｍｇ／ｋｇ及び１４ｍｇ／ｋｇは、各々、効果的治療結果を示す。新たな最適化された投与量の範囲は、以下で決定される。

種－不変的なＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋Ｔ細胞の割合の投与量最適化は、以下に由来する。
１）投与量_１日目＋投与量_２日目≦４０ｍｇ／ｋｇ
２）２０ｍｇ／ｋｇ≦投与量_１日目≦２２ｍｇ／ｋｇ、
３）１４ｍｇ／ｋｇ≦投与量_２日目≦２０ｍｇ／ｋｇ。

各々、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇなどの、より広い最適投与量の範囲が、決定された。

実施例１６－ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ受容体及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂを使用するＢ１６Ｆ１０メラノーマ治療に関するインビボ併用療法の使用の体温への副作用の決定

ヒト正常体温は、約３６．５～３７．５℃である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの正常体温は、約３６．５～３８℃である。ヒト及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、類似した体温の反応速度論を有する。ヒト及びＣ５７ＢＬ／６マウスの両方は、全てＩＬ６により誘導された、各々、ヒトＣＲＰ及びマウスＳＡＰの堅固なアップレギュレーションにより、急性炎症反応を開始し(mount)得るのに対し、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、マウスＳＡＰの軽度のアップレギュレーションにのみ反応し得(Mortensonら、J. Immunol, 885-889, 1983)、その欠損症は、ヒトＴ細胞癌免疫療法において頻繁に認められるＩＬ６サイトカインストームを予測することは失敗するであろう。ＣＲＹＡ＿１Ｂは、自然免疫の堅固で急性の活性化を誘導し、長期の適応免疫を生じる（図４０）。本発明者らは、プライミング相における、ＣＲＹＡ＿１Ｂの２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ処置に関する体温の変動を試験した。この目的は、可能性のある有害事象の何らかの徴候を観察することである。

ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂによるインビボ併用治療に関する体温の時間経過

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、治療サイクルの１日目；２日目にＣＲＹＡ＿１Ｂの２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）を使用する、ＦＬＴ３Ｌ／ＩＦＮγ／ＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンのために、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（図４１）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で、静脈内注射し、その４時間後初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置を１３日目に行った。体温をモニタリングするために、１３日目に、本発明者らは、ＣＲＹＡ＿１Ｂを２日処置（２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射による）で投与した。＊：ヒト固定投与量７０μｇからの変換［ヒト６０ｋｇと想定、７０／６０×３７（ヒトＫｍ）×０．００７（マウス体表面積）＝０．３］。表２１は、体温の結果を示す。有害事象－併用療法でＴＮＦαＲアジュバントを伴わないことで、中等度（グレード２）の低体温症。

ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαＲ及び組換えポリペプチドＣＲＹＡ＿１Ｂによるインビボ併用治療に関する体温の時間経過

３－サイクル治療の１日目；２日目にＣＲＹＡ＿１Ｂの２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）を使用する、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαＲ及びＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンのために、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０細胞（低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞）を皮下接種した（図４２）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリパーを使用し２次元で測定し、容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、ＦＬＴ３Ｌを、マウスへ、１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ^２）で、連続７日間静脈内注射した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、１３日目に、ＩＦＮγを０．３μｇ＊で静脈内注射し、その４時間後固定した低－投与量のＴＮＦαＲ（エンブレル）処置（２０μｇ^＊＊で皮下注射）を行った。＊：ヒト固定投与量７０μｇからの変換［ヒト６０ｋｇと想定、７０μｇ／６０×３７（ヒトＫｍ）^＊＊＊×０．００７（マウス体表面積）^＊＊＊＝０．３μｇ］。＊＊：マウス２０μｇは、ヒト５ｍｇと同等である［マウス２０ｇと想定、２０μｇ／０．０２×３（マウスＫｍ）^＊＊＊×１．６２（ヒト体表面積）^＊＊＊＝～５ｍｇ］。＊＊＊：Nair、J. Basic Clin Pharm., 27-31, 201。体温をモニタリングするために、１３日目に、本発明者らは、ＴＮＦαＲ注射直後に、１サイクルとして、ＣＲＹＡ＿１Ｂの２日処置（２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射による）、引き続き２日間無処置を投与し、これを３サイクル繰り返した。表２２は、この実験の結果を示す。

ＣＲＹＡ＿１Ｂによる治療に起因した有害事象（低体温症、対、異常高温症）の決定

Ｔ細胞免疫療法により治療された患者に関して、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（特にサイトカインＩＬ６、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα）は、頻繁に認められる(Suntharalingamら、N. Engl. J. Med., 1018-1028, 2006；Turtleら、J. Clin. Invest., 2123-2138, 2016)。更にサイトカイン放出症候群は、異常高温症（≧３８℃）により（ＩＬ６及び／又はＩＦＮγから）(Davilaら、Sci. Transl. Med., 1-10, 2014)及び／又は低体温症（≦３５℃）により（ＴＮＦαから）(Bradyら、Clin. Transl. Immunology, 1-7, 2014；Alegreら、Eur. J. Immunol, 707-710, 1990)、特徴付けられる。

先のように、ＣＲＹＡ＿１Ｂ投与時の癌宿主の体温変動は、プライミング相で起こる。ＴＦＮαＲアジュバント（エンブレル）を使用しない、ＣＲＹＡ＿１Ｂ臨床投与量の１－サイクル投与の間に、癌宿主は、グレード２有害事象（ＡＥ）（米国立癌研究所（ＮＣＩ）：有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）、第５．０版、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）、２０１７）、３７℃でホメオスタシスの中等度の低体温症（３２～３５℃）を経験するであろう。ＴＮＦα（低体温症の原因）を吸収するＴＦＮαＲアジュバント（エンブレル）により、ＣＲＹＡ＿１Ｂ臨床投与量の３－サイクル投与時に、癌宿主は、グレード２有害事象（ＡＥ）（米国立癌研究所（ＮＣＩ）：有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）、第５．０版、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）、２０１７）、３７℃でホメオスタシスの中等度の発熱（３９～４０℃）を経験するであろう。この体温調節は、ＴＮＦαＲ処置なし（中等度の低体温症）では認められない。全身性の自然発熱の範囲の異常高温症（３８～４１℃）は、癌免疫療法に関する免疫の活性化／反応をブーストする(Evansら、Nat. Rev. Immunol., 335-349, 2015；Fisherら、J. of Clin. Invest., 3846-3859, 2011)。管理できない重度（グレード４のＡＥ）（米国立癌研究所（ＮＣＩ）：有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）、第５．０版、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）、２０１７）である、３７℃に回復することのない長期間の低体温症又は異常高温症は、罹患率及び死亡率を上昇するであろう。しかし、低体温症は、患者にとって異常高温症よりも、より悪い危険因子である(Botaら、Intensive Care Med., 811-816, 2004；Lauplandら、Crit. Care Med., 145-151, 2012)。従って治療により上昇したレベルの様々なサイトカインにより引き起こされる発熱又は風邪などの好ましくない有害症状を生じる、Ｔ細胞免疫療法などの療法に関して、異常高温症の発熱範囲（３８～４１℃）は、低体温症よりも好ましい。

低体温症又は異常高温症の中等度（グレード２）の有害事象とは関わりなく、最適ＣＲＹＡ＿１Ｂ治療的投与量の範囲（２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇなど）において、癌宿主の挙動の有意な変化又は増大した罹患率の徴候は、主に体温の自己限定的な３７℃への回復を維持するマウスの能力のために、認められなかった。しかしＴＮＦαＲ（エンブレル）は、癌治癒効率を損なうことなく、全レジメンの一部として含まれ、体温を温度調節し、及び異常高温症に対する低体温症などの有害事象を防ぎ、その結果罹患率のリスクのより良い管理を可能にし(Botaら、Intensive Care Med., 811-816, 2004；Lauplandら、Crit. Care Med., 145-151, 2012)、並びに癌免疫療法の処置の増強を可能にした(Evansら、Nat. Rev. Immunol., 335-349, 2015；Fisherら、J. of Clin. Invest., 3846-3859, 2011)。

実施例１７－併用療法－ＴＮＦαＲを伴うインビボＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量最適化

投与量レジメンを、ＴＮＦαＲの併用治療を伴うＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量の最適化を決定するために、設計した（図４３）。治療サイクルの第１日目；第２日目に異なるＣＲＹＡ＿１Ｂ投与量を使用する、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦαＲ、及びＣＲＹＡ＿１Ｂレジメンに関して、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^６個のＢ１６Ｆ１０低免疫原性攻撃性メラノーマ細胞を皮下接種した（投与量_１日目；投与量_２日目）：２５ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２５ｍｇ／ｋｇ；１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２２ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１４ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、２０ｍｇ／ｋｇ；１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１９ｍｇ／ｋｇ；１９ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）、１８ｍｇ／ｋｇ；１８ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）及び１８ｍｇ／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）。腫瘍は、６日間（６日目）で、およそ８０～９０ｍｍ^３に達した。腫瘍サイズは、キャリーパーを用い二次元で測定し、且つ容積は、下記式により決定した：Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ２（式中、Ｌ及びＷは、各々、腫瘍の長直径及び短直径である）。ＦＬＴ３Ｌ処置に関して、次にＦＬＴ３Ｌを１日４μｇ（５６０μｇ／ｍ２）で７連続日、マウスへ静脈内に投与した。ＩＦＮγ処置に関して、マウスには、１３日目に、ＩＦＮγを０．３μｇで静脈内注射し、４時間後ＴＮＦαＲを注射し（２０μｇ、皮下注射による）、直後に初回ＣＲＹＡ＿１Ｂ処置をした。Ｔ細胞をプライムするためのＣＲＹＡ＿１Ｂ療法に関して、１サイクルとして、２日の処置（静脈内注射により、投与量_１日目；投与量_２日目（ｍｇ／ｋｇ））、その後２日の無処置を、３サイクル繰り返した。３０日目に、全てのマウスのＰＢＭＣを収集し、集団中のＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋（抗原曝露歴のある）Ｔ細胞の割合を決定するために分析した。

従って、ＴＮＦαＲアジュバントの添加により、ＣＲＹＡ＿１Ｂの最適投与量は、以下の条件で安全である：
１）投与量_１日目＋投与量_２日目≦４０ｍｇ／ｋｇ、
２）２０ｍｇ／ｋｇ≦投与量_１日目≦２２ｍｇ／ｋｇ、
３）１４ｍｇ／ｋｇ≦投与量_２日目≦２０ｍｇ／ｋｇ。

結論として、ＴＮＦαＲアジュバントは、体温調節並びに低体温症及び異常高温症の自然発熱－範囲（３８～４１℃）などの有害事象を防止するために、使用される。これは、最適化された投与量及び全治癒効率に負の影響を有さない。

従って各成分の用量最適化を考慮し、転移性大型腫瘍の治療のための、インビボ併用免疫療法プロトコールが決定された（図４４）。図４４は、プライム－ＰＤ－１－（ニボルマブ）遮断－ブースト（×５）レジメン、並びにこのレジメンにおけるＦＬＴ３Ｌ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦαＲ、ＣＲＹＡ＿１Ｂ及びＰＤ－１（ニボルマブ）遮断の投与量及びタイミングを示している。

本明細書において開示され及び請求された全ての方法は、本開示の観点から、必要以上の実験を行わずに、作製し且つ実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施態様に関して説明されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱しない限りは、本方法において、及び本明細書に説明された方法の工程もしくは工程の順番において、変更が適用されてよいことは、当業者には明らかであろう。更に具体的には、同じ又は類似の結果が達成される限りは、化学的及び生理的の両方に関連している特定の物質は、本明細書記載の物質と置き換えられてよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換及び修飾は全て、添付された請求項により規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると考えられる。

Claims

癌の治療方法において使用するための、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する組成物であって、
ここでこの方法が：
当該組成物を、
少なくとも１種のＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含有する第１の組成物；
少なくとも１種のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を含有する第２の組成物；及び任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種の腫瘍壊死因子アルファ受容体（ＴＮＦαＲ）を含有する第３の組成物、
と併用して、第４の組成物として投与することを含む、前記組成物。
癌の治療方法における使用のための、少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する組成物であって、
ここでこの方法が：
当該組成物を、
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び、
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物と併用して、第１の組成物として投与することを含む、前記組成物。
癌の治療方法における使用のための、少なくとも１種のＩＦＮγを含有する組成物であって、
ここでこの方法が：
当該組成物を、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び、
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物と併用して、第２の組成物として投与することを含む、前記組成物。
癌の治療方法において使用するための、少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する組成物であって、ここでこの方法が：
当該組成物を、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物と併用して、第３の組成物として投与することを含む、前記組成物。
前記方法が、抗－ＰＤ１抗体を含有する第５の組成物の併用投与を更に含む、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
癌の治療方法における使用のための、抗－ＰＤ１抗体を含有する組成物であって、ここでこの方法が：
当該組成物を、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び、
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物と併用して、第５の組成物として投与することを含む、前記組成物。
前記第１の組成物が、第２の組成物又は第３の組成物の少なくとも２４時間前に投与される、請求項１～６のいずれか一項記載の組成物。
前記第１の組成物が：
（ａ）１日１回、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間もしくは少なくとも２３日間；又は
（ｂ）１日１回、７日～１２日間；又は
（ｃ）１日１回、１２日間：投与される、請求項１～７のいずれか一項記載の組成物。
（ａ）第３の組成物及び第４の組成物が、同時にもしくは連続して投与されるか；又は
（ｂ）第３の組成物が、第４の組成物の前に投与されるか；又は
（ｃ）第３の組成物が、第４の組成物の後に投与される、請求項１～８のいずれか一項記載の組成物。
前記第４の組成物が、反復注入として投与され、ここで
ｉ）二回目注入が、一回目注入の少なくとも１日後に投与され；
ｉｉ）三回目注入が、一回目注入の少なくとも４日後に投与され；
ｉｉｉ）四回目注入が、一回目注入の少なくとも５日後に投与され；
ｉｖ）五回目注入が、一回目注入の少なくとも８日後に投与され；及び／又は
ｖ）六回目注入が、一回目注入の少なくとも９日後に投与される、請求項１～９のいずれか一項記載の組成物。
前記第３の組成物及び第４の組成物の一回目注入が、同時に又は連続して投与される、請求項１０記載の組成物。
前記第４の組成物の一回目注入が：
（ａ）第２の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、もしくは少なくとも２８時間に；又は
（ｂ）第２の組成物の投与後、３時間もしくは４時間に：投与される、請求項１０又は１１記載の組成物。
前記方法が、治療サイクルの併用投与を更に含み、
前記治療サイクルが、
ｉ）少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第６の組成物；
ｉｉ）対象における少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第７の組成物；
ｉｉｉ）任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第８の組成物；並びに
ｉｖ）配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物：
の併用投与を含む、請求項１～１２のいずれか一項記載の組成物。
癌の治療方法における使用のための、少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する組成物であって、
前記組成物が、前記方法において第６の組成物として投与され、
前記方法が：
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物；並びに
抗－ＰＤ１抗体を含有する第５の組成物；
と併用して、治療サイクルを投与することを含み、
前記第６の組成物が、前記治療サイクルにおいて、
対象における少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第７の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第８の組成物；および
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物；
と併用して投与される、前記組成物。
癌の治療方法における使用のための、少なくとも１種のＩＦＮγを含有する組成物であって、
前記組成物が、前記方法において第７の組成物として投与され、
前記方法が：
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物；並びに
抗－ＰＤ１抗体を含有する第５の組成物；
と併用して、治療サイクルを投与することを含み、
前記第７の組成物が、前記治療サイクルにおいて、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第６の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第８の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物；
と併用して投与される、前記組成物。
癌の治療方法における使用のための、少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する組成物であって、
前記組成物が、前記方法において、低体温症を緩和するために第８の組成物として任意選択で投与され、
前記方法が：
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物；並びに
抗－ＰＤ１抗体を含有する第５の組成物；
と併用して、治療サイクルを投与することを含み、
前記第８の組成物が、前記治療サイクルにおいて、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第６の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第７の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第９の組成物；
と併用して、低体温症を緩和するために任意選択で投与される、前記組成物。
癌の治療方法における使用のための、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する組成物であって、
前記組成物が、前記方法において第９の組成物として投与され、
前記方法が：
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第１の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第２の組成物；
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第３の組成物；及び
配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、又は配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドをコードしている核酸を含有する第４の組成物；並びに
抗－ＰＤ１抗体を含有する第５の組成物；
と併用して、治療サイクルを投与することを含み、
前記第９の組成物が、前記治療サイクルにおいて、
少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌを含有する第６の組成物；
少なくとも１種のＩＦＮγを含有する第７の組成物；および
任意選択で、低体温症を緩和するための少なくとも１種のＴＮＦαＲを含有する第８の組成物；
と併用して投与される、前記組成物。
前記治療サイクルが：
（ａ）少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、もしくは少なくとも５回；及び／又は
（ｂ）第４の組成物の六回目注入後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日もしくは少なくとも１８日、
で投与される、請求項１３～１７のいずれか一項記載の組成物。
前記治療サイクルが５回以下投与される、請求項１８記載の組成物。
前記第１の治療サイクルが、第４の組成物の六回目注入後、少なくとも１６日で投与される、請求項１８又は１９記載の組成物。
前記第６の組成物が：
（ａ）第７の組成物もしくは第８の組成物の、少なくとも２４時間前に；及び／又は
（ｂ）１日１回、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、もしくは少なくとも２３日間；又は、１日１回、合計５日間～１４日間もしくは７日間～１２日間：投与される、請求項１３～２０のいずれか一項記載の組成物。
（ａ）第８の組成物及び第９の組成物が、同時にもしくは連続して投与されるか；又は
（ｂ）第８の組成物が、第９の組成物の前に投与されるか；又は
（ｃ）第８の組成物が、第９の組成物の後に投与される、請求項１３～２１のいずれか一項記載の組成物。
前記第９の組成物が、反復注入として投与され、ここで：
ｉ）二回目注入が、一回目注入の少なくとも１日後に投与され；
ｉｉ）三回目注入が、一回目注入の少なくとも４日後に投与され；並びに
ｉｉｉ）四回目注入が、一回目注入の少なくとも５日後に投与される：請求項１３～２２のいずれか一項記載の組成物。
前記第８の組成物及び第９の組成物の一回目注入が、同時に投与される、請求項２３記載の組成物。
前記第９の組成物の一回目注入が：
（ａ）第７の組成物の投与後、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、もしくは少なくとも２８時間に；又は
（ｂ）第７の組成物の投与後、３時間もしくは４時間に；又は
（ｃ）第７の組成物の投与後、４時間に：投与される、請求項２３又は２４記載の組成物。
前記第５の組成物が、反復注入として投与され、並びにここで第５の組成物が、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、又は少なくとも１４回投与される、請求項５～２５のいずれか一項記載の組成物。
前記第５の組成物の一回目注入が、第４の組成物の六回目注入後及び第９の組成物の一回目注入前に投与される、請求項５～２６のいずれか一項記載の組成物。
前記第５の組成物が：
（ａ）第６の組成物の一回目注入前、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日に；又は
（ｂ）第６の組成物の一回目注入前、１０日～１４日に；又は
（ｃ）第６の組成物の一回目注入前、１４日に：投与される、請求項５～２７のいずれか一項記載の組成物。
第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物又は第９の組成物が、静脈内に投与される、請求項１～２８のいずれか一項記載の組成物。
前記少なくとも１種のＦＬＴ３Ｌが：
（ａ）１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、７μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、９μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１１μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１３μｇ／ｋｇ、１４μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇ、１７μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、１９μｇ／ｋｇ、もしくは２０μｇ／ｋｇ；又は
（ｂ）４μｇ／ｋｇ～１３μｇ／ｋｇ；又は
（ｃ）７μｇ／ｋｇ：の量である、請求項１～２９のいずれか一項記載の組成物。
前記少なくとも１種のＩＦＮγが、対象においてＭ２腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１ＴＡＭへ再プログラム化し、ここで再プログラム化が、表面マーカー発現の変化を含み、ここでＭＡＲＣＯ及びＣＤ１６３が、Ｍ２ＴＡＭ上に発現された表面マーカーであり、並びにＣＤ８０が、Ｍ１ＴＡＭ上に発現された表面マーカーである、請求項１～３０のいずれか一項記載の組成物。
前記少なくとも１種のＩＦＮγは、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、もしくは１００μｇ；又は５０μｇ～１００μｇ；又は７０μｇの投与量で投与される、請求項１～３１のいずれか一項記載の組成物。
前記ＴＮＦαＲが：
（ａ）１ｍｇ、２ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇもしくは１０ｍｇの投与量；又は
（ｂ）４ｍｇ～６ｍｇの投与量；又は
（ｃ）５ｍｇの投与量：で投与される、請求項１～３２のいずれか一項記載の組成物。
（ａ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び／又は六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び／又は四回目注入が、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇもしくは３５ｍｇ／ｋｇを含有するか：又は
（ｂ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入が、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの１０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇを含有するか；又は
（ｃ）第４の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入、四回目注入、五回目注入及び六回目注入、並びに第９の組成物の一回目注入、二回目注入、三回目注入及び四回目注入が、配列番号：９のポリペプチドに対し少なくとも９５％の配列同一性を有し且つ免疫応答を誘導するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドの２０ｍｇ／ｋｇを含有する、請求項１～３３のいずれか一項記載の組成物。
前記抗－ＰＤ１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ又はセミプリマブである、請求項５～３４のいずれか一項記載の組成物。
前記抗－ＰＤ１抗体が：
（ａ）０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ；又は
（ｂ）０．１ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇ；又は
（ｃ）３ｍｇ／ｋｇ：の投与量で投与される、請求項３５記載の組成物。
前記癌が：
（ａ）固形癌であり；前記固形癌が、少なくとも０．２ｃｍ、少なくとも０．５ｃｍ、少なくとも１ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも３ｃｍ、少なくとも４ｃｍ、少なくとも５ｃｍ、少なくとも６ｃｍ、少なくとも７ｃｍ、少なくとも８ｃｍ、少なくとも９ｃｍもしくは少なくとも１０ｃｍの直径を有する；及び／又は
（ｂ）癌の早期症状の再発であるか、もしくは癌の早期症状の転移である、
請求項１～３６のいずれか一項記載の組成物。
前記組換えポリペプチドが、配列番号：９のポリペプチドを含む、請求項１～３７のいずれか一項記載の組成物。
前記組換えポリペプチドが、配列番号：９のポリペプチドからなる、請求項１～３８のいずれか一項記載の組成物。