JP7776176B2 - 環状ｒｎａを調製するための構築物及び方法 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年８月２７日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１１５０２９号の優先権を享有することを主張し、その内容全体が参照により本出願に組み込まれる。

［テキストファイルでの配列表の提出］
テキストファイルで提出された補正書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列を含む環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製するための構築物および方法、それによって調製されるｃｉｒｃＲＮＡ、ならびにその使用方法に関する。

近年、コード能を有する環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）が発見されているが、コード能を有する環状ＲＮＡをインビトロで正確かつ効率的に調製することは依然として課題である。環状ＲＮＡを生成する現在の方法は、使用する酵素に応じて主に２つのカテゴリーに分類される。１つ目のカテゴリーの方法は、グループＩイントロンの自己触媒作用を利用して環状ＲＮＡを生成する。２つ目のカテゴリーの方法では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して環状ＲＮＡを生成する。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１を介したライゲーションは、ＲＮＡを環状化するために一般的に使用される方法であるが、ライゲーションプロセス中に挿入や欠失が導入されるため、線状ＲＮＡの末端を正確にライゲーションできない。さらに、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチドは、線状ＲＮＡ前駆体が環状ＲＮＡに効率的にライゲーションできるようにするために、線状ＲＮＡ前駆体の両端を結合することが通常必要とされている。スプリントオリゴヌクレオチドはライゲーション後に除去する必要があり、ポリマー副産物が形成される可能性がある。

スプリントオリゴヌクレオチドを使用したり、コードＲＮＡの末端に不必要な配列を導入したりすることなく、高収率で環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製する方法が必要とされている。

本出願は、ライゲーションにより環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製するための線状ＲＮＡ及び構築物、ならびに環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製する方法を提供する。

本出願の一態様は、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＲＮＡエレメントの第１の部分、（ｂ）エフェクターＲＮＡ配列、及び（ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分を含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分とＲＮＡエレメントの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長の二本鎖領域を形成し、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端およびＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックを形成し、前記ニックはＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２）によってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域の長さは少なくとも６ｂｐ、８ｂｐ、１０ｂｐ、１２ｂｐまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域が約６ｂｐ長から約２５ｂｐ長である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、３７℃及び１．０Ｍ Ｎａ^＋のイオン強度で約－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下（例えば、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下）の最小自由エネルギーを有する。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの長さは少なくとも２０ｎｔであり、例えば、少なくとも約５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１０００ｎｔ、またはそれ以上である。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に約２、３、４、５、６、またはそれ以上の塩基対（ｂｐ）のいずれかを含む。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に少なくとも２（例えば、少なくとも４）ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の塩基対のいずれかを含む。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分およびＲＮＡエレメントの第２の部分は、Ｎ個のヌクレオチドの参照ＲＮＡエレメントに由来し、ここで、Ｎは８より大きい整数であり、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントのＸからＮ番目のヌクレオチドを含み、Ｘは、１より大きくＮより小さい整数であり、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントの１からＸ－１番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分および／またはＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、３’末端に第１の外来配列を含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分が、第１の外来配列に相補的な第２の外来配列を含み、第１の外来配列と第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、第１の外来配列および／または第２の外来配列は少なくとも４ｎｔ長である。いくつかの実施形態では、第１の外来配列はＧＵＵＵである。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、天然に存在するＲＮＡエレメントまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントはｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントはＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡである。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、コードＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドが、抗原性ポリペプチド（例えば、病原体の抗原性ポリペプチド、または腫瘍抗原ペプチド）、機能性タンパク質（例えば、酵素）、受容体タンパク質（例えば、可溶性受容体）、および標的化タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）からなる群から選択される。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列はコードＲＮＡ配列であり、ＲＮＡエレメントは、コードＲＮＡの翻訳を促進する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはその一部である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、ピコルナウイルス（ＰＶ）ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ、アデノウイルス（ＡｄＶ）ＩＲＥＳ、ヒトパピローマウイルス３１型（ＨＰＶ３１）ＩＲＥＳ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）ＩＲＥＳ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＲＥＳ、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳ、ＦＧＦ９ ＩＲＥＳ、ＳＬＣ７Ａ１ ＩＲＥＳ、及びＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳからなる群から選択されるＩＲＥＳに由来する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳが、ＣＶＢ３ウイルスまたはその誘導体のＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＣＶＢ３ウイルスのＩＲＥＳが配列番号１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分が配列番号１の３８２～７４１番目のヌクレオチドを含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分が配列番号１の１～３８１番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分が配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分が配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分が配列番号１の３４３～７４１番目のヌクレオチドを含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分が配列番号１の１～３４２番目のヌクレオチドを含む。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、前記エフェクターＲＮＡ配列はコードＲＮＡ配列であり、前記線状ＲＮＡは、コードＲＮＡの３’末端に作動可能に連結されたインフレーム２Ａペプチド（例えば、Ｔ２ＡまたはＰ２Ａ）コード配列をさらに含む。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は非コードＲＮＡ配列であり、前記エフェクターＲＮＡ配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および長い介在非コード（ｌｉｎｃ）ＲＮＡからなる群から選択される非コードＲＮＡ配列である。

上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、少なくとも約５０ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば少なくとも約６０、９０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１２００、１５００ｎｔ、またはそれ以上のいずれかである。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列が約５０ｎｔ～約５０００ｎｔ長である。

いくつかの実施形態では、上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによる線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、線状ＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されたＴ７プロモーターを含む。

本出願の別の態様は、ｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法を提供し、この方法は、（ａ）環状化ＲＮＡ生成物を提供するために、線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションを可能にする条件下で、上記の線状ＲＮＡのいずれか１つによる線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させることと、（ｂ）環状化ＲＮＡ生成物を単離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡを提供することとを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼ１である。いくつかの実施形態では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼ２である。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ライゲーションによって導入される挿入または欠失など、線状ＲＮＡに対して外因性のヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、ライゲーションがスプリントオリゴヌクレオチドの存在を必要としない。いくつかの実施形態では、ライゲーションの効率が少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上）である。

上記の調製方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、この方法は、環状化ＲＮＡ生成物をＲＮＡｓｅ Ｒで処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、環状化ＲＮＡ生成物を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸構築物のインビトロ転写によって線状ＲＮＡを得ることをさらに含む。

上記のいずれか１つの方法を使用して調製されたｃｉｒｃＲＮＡも提供される。

いくつかの実施形態では、上記のいずれか１つの線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションによって形成される環状ＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡはｃｉｒｃＲＮＡワクチンである。

いくつかの実施形態では、有効量の上記のいずれか１つのｃｉｒｃＲＮＡを被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における疾患または症状を治療または予防する方法が提供される。

さらに、上記の方法のいずれかに使用するための組成物、キット、および製品が提供される。

図１は、線状ＲＮＡ構築物中のＩＲＥＳエレメントの２つの部分を連結するＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用したコード環状ＲＮＡの生成を示す概略図である。ＥＧＦＰコードＲＮＡは、インビトロ転写およびＴ４ ＲＮＡリガーゼによるライゲーション後のＲＮＡ転写物のアーチ部分である。線状ＲＮＡ構築物のニックは、環状ＲＮＡ生成物のライゲーション部位に対応する。ライゲーション部位を囲む順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）プライマーは、逆転写とそれに続くライゲーション部位を含む配列のＰＣＲ増幅によってライゲーションを検出するように設計された。 図２Ａは、ＲＮＡフォールドによって予測される野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの二次構造を示す図である。構造内の各円はヌクレオチドを表す。四角で囲まれた領域（本明細書では「操作されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳ領域」とも呼ばれる）は、分子内二本鎖の形成を促進し得る、非常に安定な二本鎖構造を有するＣＶＢ３ ＩＲＥＳ内の領域を表す。この領域は図の右側に拡大されている。それぞれ部位１および部位２内に分割部位を有する２つの操作されたＩＲＥＳ分割部分を含む線状ＲＮＡ構築物は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによる操作されたＩＲＥＳ分割部分のライゲーションを介して環状ＲＮＡを生成するように設計された。 図２Ｂは、線状ＲＮＡ転写物中の部位１に分割部位を有する操作されたＩＲＥＳ分割部分の第１の例示的な対における操作されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳ領域の予測された二次構造を示す図である。ライゲーション部位は矢印でマークされており、４つのヌクレオチドＧＵＵＵおよびその逆相補配列が、ライゲーション部位のすぐ隣の操作されたＩＲＥＳ分割部分に付加された。 図２Ｃは、線状ＲＮＡ転写物中の部位２に分割部位を有する操作されたＩＲＥＳ分割部分の第１の例示的な対における操作されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳ領域の予測された二次構造を示す図である。ライゲーション部位は矢印でマークされており、４つのヌクレオチドＧＵＵＵおよびその逆相補配列が、ライゲーション部位のすぐ隣の操作されたＩＲＥＳ分割部分に付加された。 図３は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１を使用した、図２ＢのＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割に基づく構築物の線状ＲＮＡ転写物のライゲーションによって生成された環状ＲＮＡサンプル（すなわち、部位１ライゲーション環状ＲＮＡ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を示す図である。上のクロマトグラフでは、環状ＲＮＡサンプルはＲＮＡｓｅ Ｒで処理されなかった。下のクロマトグラフでは、環状ＲＮＡサンプルがＲＮＡｓｅ Ｒで処理された。 図４Ａは、部位１および部位２に連結された環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰの発現を示す図である。 図４Ｂは、部位１ライゲーション環状ＲＮＡによるトランスフェクションの２４時間後の細胞におけるＥＧＦＰ発現を検出するウェスタンブロットの結果を示す図である。 図５Ａは、前駆体ＲＮＡ転写物および部位１ライゲーション環状ＲＮＡサンプルを使用した、ライゲーション接合部にわたるＰＣＲ増幅産物を示す図である。 図５Ｂは、部位１ライゲーション環状ＲＮＡにおけるライゲーション接合部のサンガー配列決定を示す図である。 図６は、エフェクターＲＮＡ配列に隣接する分割ＩＲＥＳ部分を含む線状ＲＮＡ前駆体を示す図である。前記分割ＩＲＥＳ部分は、天然に存在するＩＲＥＳの一部のみを再構成する。 図７は、例示的なｓｇＲＮＡの二次構造および潜在的な分割部位を示す図である。 図８は、標的ＲＮＡに結合した例示的なＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡの二次構造および潜在的な分割部位を示す図である。

本出願は、エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列を含む環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製するための線状ＲＮＡ前駆体および構築物を提供する。本明細書に記載の線状ＲＮＡ前駆体は、５’末端から３’末端まで、ＲＮＡエレメントの第１の分割（スプリット）部分、エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列、およびＲＮＡエレメントの第２の分割部分を含み、前記ＲＮＡエレメントには安定した二本鎖領域がある。線状ＲＮＡ前駆体の２つの分割部分は、互いに会合して前記ＲＮＡエレメントを再構成し、安定な二本鎖領域にニックを形成することができる。ＲＮＡリガーゼ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２など）を使用してニックをライゲーションすると、ｃｉｒｃＲＮＡが生成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、ＣＶＢ３ウイルスのＩＲＥＳなどの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。また、本明細書に記載の線状ＲＮＡ前駆体および構築物を使用してｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法も提供される。この方法により、スプリントオリゴヌクレオチドを使用せずに、高効率かつ正確にｃｉｒｃＲＮＡをインビトロで生成することができる。さらに、本明細書に記載の方法において、分子内ライゲーションを促進するために使用されるＲＮＡエレメントの分割部分は、例えばコードＲＮＡ配列の翻訳を促進するなどの機能的役割を果たすことができ、それによって免疫原性を有する可能性がある、またはｃｉｒｃＲＮＡのカーゴサイズを減少させる可能性がある追加のライゲーション配列の導入を回避することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＲＮＡエレメント（ＩＲＥＳなど）の第１の部分、（ｂ）エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列、および（ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分を含む線状ＲＮＡが提供され、ここで、ＲＮＡエレメントの第１の部分とＲＮＡエレメントの第２の部分とが互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長の二本鎖領域を形成し、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端とＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端が二本鎖領域にニックを形成し、そのニックはＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）によって連結され得る。

Ｉ．定義
以下に別段の定義がない限り、本明細書で使用される用語は、当技術分野で一般的に使用されるものと同じように使用される。

「線状ＲＮＡ」という用語は、５’末端および３’末端を有するＲＮＡ分子を指す。線状ＲＮＡは、ヘリックスやループ領域などの二次構造を持つ場合がある。

「ＲＮＡエレメント」という用語は、二本鎖領域を含む二次構造に折り畳まれるＲＮＡモチーフを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、同じ分子上の核酸領域を調節するシス調節ＲＮＡエレメントである。ＲＮＡエレメントは、天然に存在するＲＮＡエレメント（例えば、ＩＲＥＳ）または人工のＲＮＡエレメント（例えば、アプタマー）であり得る。

ＲＮＡエレメントの「第１の部分」および「第２の部分」という用語は、本明細書ではＲＮＡエレメントの「５’」部分および「３’」部分、「第１の分割部分」および「第２の分割部分」、または「第１の分割」及び「第２の分割」と交換可能に使用され、ＲＮＡエレメントと実質的に同じ二次構造に自己集合することができる参照ＲＮＡエレメントの操作されたフラグメントを指す。いくつかの実施形態では、参照ＲＮＡエレメントは、内部位置Ｘで、参照ＲＮＡエレメントの位置Ｘから末端までのヌクレオチドを含む第１の部分（すなわち、３’部分）と、参照ＲＮＡエレメントの位置１から位置Ｘ－１までのヌクレオチドを含む第２の部分（すなわち、５’部分）との二部分に分けられるか、または分割される。位置Ｘは、参照ＲＮＡエレメントの「分割部位」と呼ばれる。第１の部分および／または第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントには存在しない外来配列をさらに含み得る。第１の部分および／または第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントの配列に対して欠失または置換を有していてもよい。外来配列、欠失および置換は、前記ＲＮＡエレメントの第１部分および第２部分を通じて前記再構成されたＲＮＡエレメントの機能及び活性を大きく変化させない（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％を超えて減少させない）。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸配列」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。

「デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ）」、「ｄＲＮＡ」、「ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ（ＡＤＡＲ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ）」および「ａｒＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ，ＡＤＡＲ）を動員してＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化することができる操作されたＲＮＡに言及する場合、本明細書では互換的に使用される。例示的なｄＲＮＡは、例えば、ＷＯ２０２１／００８４４７、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７１２９２、およびＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１１３２９０に記載されており、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質および標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）と複合体を形成することができるＲＮＡを指す。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子、または２つ以上のＲＮＡ分子における相補的領域のハイブリダイゼーションを介して互いに会合した２つ以上のＲＮＡ分子を含み得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのみを含むことができる。「ｃｒＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」は、標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の標的配列に対して十分な相補性を有するガイド配列を含み、これは、標的核酸へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡと部分的に相補的であり、ｃｒＲＮＡと塩基対を形成し、ｃｒＲＮＡの成熟において役割を果たす可能性がある。「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」は、単一分子内に互いに融合されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを有する操作されたガイドＲＮＡである。

「治療用ポリペプチド」という用語は、治療効果を有するポリペプチドを指す。治療用ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、または天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に１つまたは複数の変異（例えば、挿入、欠失、置換など）を有する機能的フラグメント及び誘導体を含む、その操作された機能的バリアント（変体）、ならびに天然に存在するタンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であり得る。治療用ポリペプチドは、天然に存在する対応物を持たない操作されたタンパク質であってもよい。治療用ポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖または複数のポリペプチド鎖を有し得る。

「抗原性ポリペプチド」という用語は、哺乳動物の免疫系を誘発して、このポリペプチドまたはその一部に特異的な抗体を発生させるために使用できるポリペプチドを指す。本明細書に記載される抗原性ポリペプチドには、天然に存在するタンパク質、タンパク質ドメイン、および天然に存在するタンパク質に由来する短いペプチドフラグメントが含まれる。抗原性ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質の１つ以上の既知のエピトープを含み得る。抗原性ポリペプチドは、免疫原性を改善するキャリアタンパク質または多量体化タンパク質を含み得る。

「機能的タンパク質」という用語は、遺伝性疾患または状態の治療において機能的である、天然に存在するタンパク質、その機能的バリアント、またはその操作された誘導体を指す。前記疾患または状態は、前記機能的タンパク質に対応する野生型の天然タンパク質における突然変異などの変化によって全体的または部分的に引き起こされる可能性がある。

「標的化タンパク質」という用語は、標的分子に特異的に結合するポリペプチドを指す。本明細書に記載の標的化タンパク質には、抗体ベースおよび非抗体ベースの結合タンパク質またはその標的結合部分が含まれる。

「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造（それらが望ましい抗原結合活性を示す限り）を包含する。本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、または抗原に結合するが完全な抗体構造を含まないその他の抗体フラグメントを含む抗体フラグメントを指す。

本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、および「…に特異的である」という用語は、標的と標的化部分との間の結合などの、測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する標的化部分は、他の分子への結合よりも大きい親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間でこの標的に結合する標的化部分（例えば、抗体）である。いくつかの実施形態では、標的化部分の無関係な分子への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されるところ、標的への標的化部分の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する標的化部分の解離定数（ＫＤ）は、１０^－５Ｍ以下、１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、または１０^－１２Ｍ以下である。いくつかの実施形態では、特異的結合には、排他的結合が含まれ得るが、排他的結合が必要ではない。標的化部分の結合特異性は、当技術分野で知られている方法により実験的に決定することができる。このような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ、およびペプチドスキャンが含まれるが、これらに限定されない。

参照タンパク質の「機能的バリアント」という用語は、参照タンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはその一部に由来するバリアントポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを指し、このバリアントは、前記参照タンパク質またはポリヌクレオチドと実質的に同じ活性（例えば、標的への結合または酵素活性）を有する。「実質的に同じ活性」とは、参照タンパク質またはポリヌクレオチドの活性と比べて少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の活性レベルのいずれかを意味する。

本明細書で使用される「導入すること」または「導入」という用語は、ｃｉｒｃＲＮＡなどの１つもしくは複数のポリヌクレオチド、または本明細書に記載のベクターを含む１つまたは複数の構築物、その１つまたは複数の転写物を宿主細胞に送達することを意味する。本願の方法は、宿主細胞への本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡまたは構築物の導入を達成するために、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない多くの送達システムを使用することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入できる。このような方法は、本願のｃｉｒｃＲＮＡをコードする核酸を培養細胞または宿主生物内に投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築物の転写物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、宿主細胞に送達するためのエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。

本明細書で使用されるように、「作動可能に連結された」とは、第２の核酸配列と作動可能に連結された第１の核酸配列を指す場合、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている状況を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーターは前記コード配列に作動可能に連結される。同様に、シグナルペプチドのコード配列は、シグナルペプチドがそのポリペプチドの細胞外分泌に影響を与える場合、ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結された核酸配列は連続しており、かつ２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、オープンリーディングフレームが整列される。

本明細書で使用される場合、「相補性」とは、伝統的なワトソンクリック塩基対形成により、核酸が別の核酸と水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第二の核酸と水素結合（すなわち、ワトソンクリック塩基対形成）を形成できる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個中約５、６、７、８、９、１０個、それぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続残基が、第２の核酸配列内の同じ数の連続残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたる少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか１つである相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本出願の目的上、有益なまたは所望の臨床結果には、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化を予防するまたは遅らせること）、疾患の蔓延を予防するまたは遅らせること、疾患の発生または再発を予防するまたは遅らせること、疾患の進行を遅延するまたは遅らせること、病状の改善、疾患の寛解（部分的または完全にかかわらず）、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行を遅らせること、生活の質を高めること、および／または生存期間の延長のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。「治療」には、疾患の病理学的結果の軽減も含まれる。本出願の方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図する。

「個体」、「被験者」、および「患者」という用語は、本明細書ではヒトを含む哺乳動物を記述するために互換的に使用される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体はマウスなどのげっ歯類である。いくつかの実施形態では、個体は遺伝性の疾患または状態を患っている。いくつかの実施形態では、個体はコロナウイルス感染症を患っている。いくつかの実施形態では、個体はコロナウイルス感染症に罹患するリスクがある。いくつかの実施形態では、個体は治療を必要としている。

当技術分野で理解されているように、「有効量」とは、所望の治療結果（例えば、抗体の産生を刺激し、１つ以上のコロナウイルスに対する免疫力を改善し、疾患もしくは状態の1つ以上の症状の重症度または継続期間を軽減し、重症度を安定させ、または疾患もしくは状態の1つ以上の症状を除去すること）をもたらすのに十分な組成物の量を指す。治療用途の場合、有益なまたは所望の結果には、例えば、合併症および疾患の進行中に示される中間病理学的表現型を含む、疾患（生化学的、組織学的および／または行動的）に起因する１つまたは複数の症状の軽減、疾患に罹患している患者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の投与量の低減、別の薬剤の効果の増強、疾患の進行の遅延、および／または患者の生存期間の延長が含まれる。いくつかの実施形態では、有効量の治療薬は生存期間（全生存期間および無増悪生存期間を含む）を延長し得、客観的な反応（完全な反応または部分的な反応を含む）を引き起こし、疾患または状態の１つ以上の兆候または症状をある程度軽減し、および／または被験者の生活の質を改善する。いくつかの実施形態では、有効量は、予防的有効量であり、感受性のある個体および／または疾患や状態を発症する可能性がある個体に投与した場合に、疾患または状態の１つ以上の将来の症状の重症度を予防または軽減するのに十分な組成物の量である。予防的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、例えば、将来の疾患のリスクの除去または軽減、将来の疾患の重症度の軽減、または疾患の発症の遅延（例えば、疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状の遅延、その合併症、および疾患の将来の進行中に現れる中間の病理学的表現型）などの結果が含まれる。

本明細書で使用される「野生型」という用語は、当業者によって理解される技術用語であり、突然変異体またはバリアントとは区別される、天然に存在する生物、菌株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。

本開示は、バリアントおよび誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づくいくつかのタイプの組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入、欠失、および共有結合のバリアントおよび誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は「バリアント」という用語と同義であり、一般に、参照分子または出発分子に対して何らかの方法で修飾および／または変更された分子を指す。

したがって、参照配列、特に本明細書に開示されるポリペプチド配列に対して置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸をペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置特定に使用できる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意に削除して、切り詰められた（truncated）配列を提供してもよい。あるいは、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）は、例えば、可溶性の、または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部としての配列の発現など、配列の使用に応じて欠失され得る。

「非天然」または「操作された」という用語は互換的に使用され、人が関与していることを示す。核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界で自然に結合する、及び自然界で見られるような少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、あらゆる長さのタンパク質フラグメント、融合タンパク質および修飾タンパク質を含む、あらゆる種類の天然タンパク質および合成タンパク質を包含する。これには、糖タンパク質、ならびに他のすべての種類の修飾タンパク質（例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化、ビオチン化などから生じるタンパク質）を含むがこれらに限定されない。

「薬学的に許容される担体」とは、薬学的製剤中の有効成分以外の、被験者に対して非毒性の１つまたは複数の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、凍結保護剤、等張化剤、保存剤、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体または賦形剤は、毒物学的試験および製造試験の必要な基準を満たしている、および／または米国食品医薬品局またはその他の州／連邦政府が作成する『不活性成分ガイド（Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ）』に含まれているか、米国薬局方またはその他の一般的に認められている医薬品にリストされている、哺乳類、特にヒトでの使用を目的とした薬局方に記載されていることが好ましい。

「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指すために使用され、適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌および／またはそのような治療用製品の使用に関する警告に関する情報が含まれている。

「製品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患または症状（例えば、コロナウイルス感染症）の治療のための薬剤、または本明細書に記載のバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む、任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。特定の実施形態では、製造物またはキットは、本明細書に記載の方法を実行するためのユニットとして宣伝、配布、または販売される。

本明細書に記載される本発明の実施形態には、「からなる」および／または「から本質的になる」実施形態が含まれることが理解される。

本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体に向けられた変形を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」という記述には、「Ｘ」についての記述も含まれる。

本明細書で使用される場合、値またはパラメータ「（では）ない」という言及は、一般に、値またはパラメータ「以外」を意味し、説明する。例えば、その方法がＸ型の疾患の治療に使用されないということは、その方法がＸ型以外の疾患の治療に使用されることを意味する。

本明細書において「約Ｘ～Ｙ」とは、「約Ｘ～約Ｙ」と同義である。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用される「Ａおよび／またはＢ」などの語句「および／または」は、ＡとＢとの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；ならびにＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、本明細書で使用される「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句「および／または」は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡとＣ；ＡとＢ；ＢとＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することを意図している。

ＩＩ．線状ＲＮＡと構築物
本出願は、線状ＲＮＡ前駆体（本明細書では線状ＲＮＡ（直鎖状ＲＮＡ）とも称する）および治療用ポリペプチドなどのポリペプチドをコードする環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を調製するための構築物を提供する。本明細書に記載の線状ＲＮＡ前駆体は、エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列に隣接するＲＮＡエレメントの２つの分割部分を含む。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼを使用してＲＮＡエレメントの分割部分の末端を連結することによって得ることができる。前記線状ＲＮＡは、セクションＡ「ＲＮＡエレメント」に記載されるＲＮＡエレメントの第１の部分および第２の部分のいずれか１つ、およびセクションＢ「エフェクターＲＮＡ配列」に記載されるＲＮＡエレメントの第１の部分および第２の部分のいずれか１つを含み得る。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＲＮＡエレメントの第１の部分、（ｂ）エフェクターＲＮＡ配列、及び（ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分を含み、前記ＲＮＡエレメントの第１の部分とＲＮＡエレメントの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長（例えば、長さ約６～２５ｂｐ）の二本鎖領域を形成し、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端およびＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックを形成し、前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、３７℃及び１．０Ｍ Ｎａ^＋のイオン強度で約－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の最小自由エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの長さは少なくとも２０ｎｔ（例えば、少なくとも約５０ｎｔ、または約２０～１０００ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に少なくとも２（例えば、少なくとも４）ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、天然に存在するＲＮＡエレメントまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントはｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントはＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡである。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列が約５０ｎｔ～約５０００ｎｔ長である。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および長鎖遺伝子間非コード（ｌｉｎｃ）ＲＮＡからなる群から選択される非コードＲＮＡ配列である。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＲＮＡエレメントの第１の部分、（ｂ）コードＲＮＡ配列、及び（ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分を含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分とＲＮＡエレメントの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長（例えば、長さ約６～２５ｂｐ）の二本鎖領域を形成し、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端およびＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックを形成し、前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、３７℃及び１．０Ｍ Ｎａ^＋のイオン強度で約－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の最小自由エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの長さは少なくとも２０ｎｔ（例えば、少なくとも約５０ｎｔ、または約２０～１０００ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に少なくとも２（例えば、少なくとも４）ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、天然に存在するＲＮＡエレメントまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、ＲＮＡ配列の翻訳を促進する。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列が約５０ｎｔ～約５０００ｎｔ長である。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、例えば、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質などの治療用ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＲＮＡエレメントの第１の部分、（ｂ）エフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列、及び（ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分を含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分およびＲＮＡエレメントの第２の部分は、Ｎ個のヌクレオチドの参照ＲＮＡエレメントに由来し、ここで、Ｎは８より大きい整数であり、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントのＸからＮ番目のヌクレオチドを含み、Ｘは、１より大きくＮより小さい整数であり、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントの１からＸ－１番目のヌクレオチドを含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分とＲＮＡエレメントの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長（例えば、長さ約６～２５ｂｐ）の二本鎖領域を形成し、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端およびＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックを形成し、前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、３７℃及び１．０Ｍ Ｎａ^＋のイオン強度で約－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の最小自由エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの長さは少なくとも２０ｎｔ（例えば、少なくとも約５０ｎｔ、または約２０～１０００ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に少なくとも２（例えば、少なくとも４）ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分および／またはＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、３’末端に第１の外来配列を含み、ＲＮＡエレメントの第１の部分が、第１の外来配列に相補的な第２の外来配列を含み、第１の外来配列と第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、第１の外来配列はＧＵＵＵである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、天然に存在するＲＮＡエレメントまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、コードＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列が約５０ｎｔ～約５０００ｎｔ長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、コードＲＮＡの翻訳を促進する。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、例えば、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質などの治療用ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の第１の部分、（ｂ）コードＲＮＡ配列、及び（ｃ）ＩＲＥＳの第２の部分を含み、ＩＲＥＳの第１の部分およびＩＲＥＳの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４ｂｐ長（例えば、長さ約６～２５ｂｐ）の二本鎖領域を形成し、ＩＲＥＳの第１の部分の５’末端およびＩＲＥＳの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックを形成し、前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、３７℃及び１．０Ｍ Ｎａ^＋のイオン強度で約－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の最小自由エネルギーを有する。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はニックの５’側に少なくとも２（例えば、少なくとも４）ｂｐを含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳの第１の部分およびＩＲＥＳの第２の部分は、Ｎ個のヌクレオチドの参照ＩＲＥＳに由来し、ここで、Ｎは８より大きい整数であり、ＩＲＥＳの第１の部分は、参照ＩＲＥＳのＸからＮ番目のヌクレオチドを含み、Ｘは、１より大きくＮより小さい整数であり、ＩＲＥＳの第２の部分は、参照ＩＲＥＳの１からＸ－１番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳの第１の部分および／またはＩＲＥＳの第２の部分は、参照ＩＲＥＳに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳの第２の部分は、３’末端に第１の外来配列を含み、ＩＲＥＳの第１の部分が、第１の外来配列に相補的な第２の外来配列を含み、第１の外来配列と第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、第１の外来配列はＧＵＵＵである。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＣＶＢ３、ＥＶ７１、ＥＭＣＶ、ＰＶ、ＨＣＶ、ＡｄＶ、ＨＰＶ３１、ＨＨＶ、ＲＳＶ、及びＣＳＦＶからなる群から選択されるウイルスのＩＲＥＳに由来する。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ヒトＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ９ ＩＲＥＳ、ＳＬＣ７Ａ１ ＩＲＥＳ、またはＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳに由来する。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列の長さは約５０ｎｔ～約５０００ｎｔである。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、例えば、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質などの治療用ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡを提供し、この線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：（ａ）ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの３８２～７４１番目のヌクレオチド（ヌクレオチド番号は、配列番号１によるものである）を含む第１のＲＮＡ部分、（ｂ）コードＲＮＡ配列、及び（ｃ）ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの１～３８１番目のヌクレオチドを含む第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分および第２のＲＮＡ部分が互いに会合して二本鎖領域を形成し、この二本鎖領域は、第１のＲＮＡ部分の５’末端および第２のＲＮＡ部分の３’末端から形成されるニックを含み、前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ部分および／または第２のＲＮＡ部分は、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ部分は、３’末端に第１の外来配列を含み、第１のＲＮＡ部分が、第１の外来配列に相補的な第２の外来配列を含み、第１の外来配列と第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、第１の外来配列はＧＵＵＵである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ部分が配列番号３のヌクレオチド配列を含み、第２のＲＮＡ部分が配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列が約５０ｎｔ～約５０００ｎｔ長である。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、例えば、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質などの治療用ポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで：ＩＲＥＳの第１の部分、任意選択のシグナルペプチド、コードＲＮＡ配列、２Ａペプチドをコードする配列、及びＩＲＥＳの第２の部分を含む。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡ配列は、配列番号１０または１１のヌクレオチド配列を転写することにより得られる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の線状ＲＮＡのいずれか１つをコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターが、線状ＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターは、配列番号６に示されるような配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターはインビトロ転写を駆動することができる。

いくつかの実施形態では、核酸構築物はプラスミドである。いくつかの実施形態では、プラスミドは、線状ＲＮＡをコードする配列をプラスミドベクターにクローニングすることによって得られる。プラスミドは、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）クローニングまたは制限酵素を使用するクローニングなどの当技術分野で知られている技術によって生成することができる。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、プラスミドを発現する細菌の抗生物質による選択を可能にする抗生物質発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、提供されるプラスミドは細菌から精製され、線状ＲＮＡ構築物の生成に使用され得る。線状ＲＮＡのインビトロ転写に適した任意のプラスミドベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、プラスミドは、線状ＲＮＡのインビトロ転写前に線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドは、制限酵素消化によって線状化される。いくつかの実施形態では、組換えプラスミドはＰＣＲ増幅によって線状化される。

Ａ．ＲＮＡエレメント
本明細書に記載の線状ＲＮＡは、二本鎖らせん領域を含む広範な二次構造を有するＲＮＡエレメントの分割部分を含む。分割部分（すなわち、第１の部分および第２の部分）は、参照ＲＮＡエレメントに基づいて操作されることができ、すなわち、参照ＲＮＡエレメントは、参照ＲＮＡエレメントの安定な二本鎖領域内の「分割部位」（すなわちヌクレオチドへの５’側のホスホジエステル結合）によって５’部分（すなわち、本明細書に記載の線状ＲＮＡにおける第２の部分）と３’部分（すなわち、本明細書に記載の線状ＲＮＡの第１の部分）に分けられる。例えば、Ｎ個のヌクレオチドを有するＲＮＡエレメントにおいて分割部位がＸ番目のヌクレオチドの５’側にあり、ＸおよびＮは整数であり、Ｘは１より大きくＮより小さい場合、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、当該ＲＮＡエレメントの１番目のヌクレオチドからＸ－１番目のヌクレオチドを含み、且つＲＮＡエレメントの第２の部分は、当該ＲＮＡエレメントのＸ～Ｎ番目のヌクレオチドを含む。分割部分は、１つまたは複数の外来配列をＲＮＡエレメントの第１の部分および／または第２の部分に導入すること、ＲＮＡエレメントの第１の部分および／または第２の部分の１つまたは複数のヌクレオチドを削除すること、および／またはＲＮＡエレメントの第１の部分および／または第２の部分の１つ以上のヌクレオチドを置換することによってさらに操作することができる。線状ＲＮＡのＲＮＡエレメントの分割部分は互いに会合して二本鎖領域を再構成することができるが、第１の部分の５’末端と第２の部分の３’末端には分割部位にニックが生じ、このニックは、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２）によって連結できる。

ＲＮＡエレメントの分割部位は、ＲＮＡエレメントが２つの部分に分割されるときに、線状ＲＮＡ配列におけるエフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡなど）の２つの末端に配置されるように、最初に安定な二本鎖領域を同定することによって選択でき、これら２つの部分が会合してニックのある二本鎖領域を形成できる。二本鎖領域の自由エネルギーが低いため、ＲＮＡリガーゼによる分子内ライゲーションが促進される。ＲＮＡエレメント中の安定な二本鎖領域は、当技術分野で既知の方法を使用して計算的に同定することができる。例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）（Ｈｏｆａｃｋｅｒ，Ｉ．Ｌ．Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｅｒｖｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，３４２９－３４３１（２００３））およびＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３），３４０６－１５，（２００３）））ソフトウェアは、コンピューターによってＲＮＡ分子を折り畳み、ＲＮＡ分子の二本鎖領域を含む二次構造を予測するために使用できるＷｅｂサーバーである。例えば、図２Ａは、ＲＮＡフォールドソフトウェア（ＲＮＡｆｏｌｄ）によって予測されるＣＶＢ３ ＩＲＥＳの二次構造を示す。自由エネルギーの低い領域と二本鎖らせん領域（図２Ａの四角で囲った領域など）を選択して、例えば、図２Ａに示す部位１や部位２などの二本鎖領域内の分割部位を操作できる。分割部位は、ＲＮＡエレメントの機能に影響を与えることが知られているヌクレオチド位置に隣接してはならない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメント内の容易にアクセスできるホスホジエステル結合が分割部位として選択される。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、高いＧＣ含量、例えば、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上のＧＣ塩基対のいずれか１つを有する。

いくつかの実施形態では、分割部位は、参照ＲＮＡエレメントの中間点近くに選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、ＲＮＡエレメントの第２の部分と実質的に同じ長さを有する。例えば、ＲＮＡエレメントの第１の部分の長さは、ＲＮＡエレメントの第２の部分の長さとの異なりは、約１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、５以下、またはそれ以下のヌクレオチドのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分の長さは、ＲＮＡエレメントの第２の部分の長さとの異なりは、約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、またはそれ以下のいずれか１つである。

いくつかの実施形態では、分割部位は、少なくとも約４ｂｐ、例えば少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のｂｐの長さのいずれか１つなどの長さの二本鎖領域内で選択される。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｂｐの長さのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、約２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、または６以下のｂｐの長さのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域の長さは、約４～２５、４～１５、４～１０、６～２５、６～１５、６～１０、１０～１５、１０～２０、または１０～２５ｂｐのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は約６ｂｐ～約２５ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はステムループの一部である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はヘリックスである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域はバルジをさらに含む。

いくつかの実施形態では、二本鎖領域の最小自由エネルギーは、例えば、ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）またはＭフォールド（Ｍｆｏｌｄ）ソフトウェアによって予測されたように、約－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、例えば、約－５．５、－６、－６．５、－７、－７．５、－８、－８．５、－９、－９．５、－１０、－１０．５、－１１、－１１．５、－１２、－１２．５、－１３、－１４、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域の最小自由エネルギーは、約－１５～－５．５、－１０～－５．５、－８～－５．５、－１５～－８、－１２～－８、または－１０～－８ｋｃａｌ／ｍｏｌのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの最小自由エネルギーは、約－５０、－１００、－１５０、－２００、－２５０、－３００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のいずれか１つである。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは少なくとも２０ｎｔの長さであり、例えば、少なくとも約５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００ｎｔまたはそれ以上の長さのヌクレオチドのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、約１０００、９００、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、または２０ｎｔ以下の長さのヌクレオチドのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、約２０～５０、５０～１００、２０～２００、２０～３００、２０～５００、２０～１０００、５０～２００、５０～１０００、１００～１０００、１００～５００、２００～５００、２００～１０００、３００～１０００、３００～８００、４００～９００、または５００～１０００ｎｔの長さのヌクレオチドのいずれか１つである。

図１に示すように、例示的な線状ＲＮＡでは、ＲＮＡエレメントの第１の部分はエフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）の５’末端に隣接し、ＲＮＡエレメントの第２の部分はコードＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）の３’末端に隣接する。ＲＮＡエレメントの第１部分は、ＲＮＡエレメントの第２部分と自己集合して、分割部位にニックを有する二本鎖領域を形成し、ＲＮＡリガーゼの基質として機能する。いくつかの実施形態では、ニックの５’側および／または３’側にすぐ隣接する塩基対は、ＲＮＡリガーゼによってニックのライゲーションを促進する。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、ニックの３’側に少なくとも２ｂｐ、例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上のｂｐの塩基対を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、ニックの５’側に少なくとも２ｂｐ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｂｐの塩基対を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分およびＲＮＡエレメントの第２の部分は、Ｎ個のヌクレオチドを有する参照ＲＮＡエレメントに由来し、ここで、Ｎは８より大きい整数であり、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントのＸ～Ｎ番目のヌクレオチドを含み、Ｘは１より大きくＮより小さい整数であり、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントの１からＸ－１番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントのＸ～Ｎ番目のヌクレオチドからなるか、または実質的に参照ＲＮＡエレメントのＸ～Ｎ番目のヌクレオチドからなり、且つＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントの１からＸ－１番目のヌクレオチドからなるか、または実質的に参照ＲＮＡエレメントの１からＸ－１番目のヌクレオチドからなる。

いくつかの実施形態では、参照ＲＮＡエレメントと比較して、ＲＮＡエレメントは外因性配列を有さない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端とＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端とを連結することによって再構成されたＲＮＡエレメントは、参照ＲＮＡエレメントと同一である。

いくつかの実施形態では、ニックのライゲーション後のＲＮＡエレメントは、参照ＲＮＡエレメントの一部である。この部分には安定な二本鎖領域が含まれている。この部分は参照ＲＮＡエレメントの機能を持っていても持っていなくてもよい。

いくつかの実施形態では、ニックのライゲーション後のＲＮＡエレメントは、参照ＲＮＡエレメントのすべてのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ニックのライゲーション後のＲＮＡエレメントが参照ＲＮＡエレメントである。

いくつかの実施形態では、参照ＲＮＡエレメントと比較して、ＲＮＡエレメントは１つまたは複数の外因性配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性である第１の配列を含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性である第２の配列を含む。

例えば、ニックを含む二本鎖領域をさらに安定化し、それによってＲＮＡリガーゼによるニックのライゲーションを促進するために、外来配列をＲＮＡエレメントの第１の部分またはＲＮＡエレメントの第２の部分に導入することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は、３’末端に第１の外来配列を含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、第１の外来配列に相補的な第２の外来性配列を含み、ここで、前記第１の外来配列および第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、第１の外来配列および第２の外来配列は、それぞれ少なくとも４ｎｔ長、例えば約４、５、６、７、８またはそれ以上のヌクレオチド長のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、第１の外来配列はＧＵＵＵであり、第２の外来配列はＡＡＡＣである。

ＲＮＡエレメントは、調節ＲＮＡエレメントなどの天然ＲＮＡエレメント、その誘導体、または人工ＲＮＡエレメントであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントはシス調節ＲＮＡエレメントである。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、コードＲＮＡ配列の翻訳を促進する調節ＲＮＡエレメントである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは全長ＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、安定な二本鎖領域を含むＩＲＥＳの一部である。ＩＲＥＳの部分はタンパク質の翻訳を促進する機能を持たない可能性がある。

例えば、図６に示されるように、例示的な線状ＲＮＡにおいて、第１の部分および第２の部分は、安定性の高い二本鎖領域を含むＣＶＢ３ ＩＲＥＳのステムループ部分に由来する。第１の部分および第２の部分は、コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡ（たとえばｇＲＮＡ、ｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｌｉｎｃＲＮＡなど）であり得るエフェクターＲＮＡ配列に隣接する。

いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳはウイルスＩＲＥＳ配列である。非限定的な例において、ＩＲＥＳ配列は、ＣＶＢ３、ＥＶ７１、ＥＭＣＶ、ＰＶ、ＨＣＶ、ＡｄＶ、ＨＰＶ３１、ＨＨＶ、ＲＳＶ、およびＣＳＦＶからなる群から選択されるウイルスからのＩＲＥＳであり得る。例えば、“Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ＩＲＥＳ，”ＲＮＡ．２００６ Ｏｃｔ；１２（１０）：１７５５－１７８５を参照されたい。同文献の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列は細胞ＩＲＥＳ配列である。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ＦＧＦ９ ＩＲＥＳ、ＳＬＣ７Ａ１ ＩＲＥＳ、またはＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳなどのヒトＩＲＥＳに由来する。例示的なＩＲＥＳ配列は、ｒｅｐｒｏｄ．ｎｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｉｒｅｓｂａｓｅ／ｖｉｅｗ＿ｅｕｋａｒｙｏｔｅ．ｐｈｐ、及びｃｏｂｉｓｈｓｓ０．ｉｍ．ｎｕｋ．ｅｄｕ．ｔｗ／Ｈｕｍａｎ＿ＩＲＥＳ＿Ａｔｌａｓ／などのデータベースで見つけることができ、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、ＣＶＢ３ウイルスのＩＲＥＳまたはその誘導体である。ＣＶＢ３ ＩＲＥＳの例示的な配列は配列番号１である。ＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるＣＶＢ３ ＩＲＥＳの二次構造を図２に示す。ＣＶＢ３ ＩＲＥＳは、安定な二本鎖領域内の２つの異なる分割部位で分割できる。分割部位１は３８２番目のヌクレオチドの５’末端にあり、番号付けは配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は配列番号１の３８２～７４１番目のヌクレオチドを含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は配列番号１の１～３８１番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。分割部位２は３４３番目のヌクレオチドの５’末端にあり、番号付けは配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は配列番号１の３４３～７４１番目のヌクレオチドを含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は配列番号１の１～３４２番目のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントの第１の部分は配列番号５のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡエレメントの第２の部分は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、Ｃａｓヌクレアーゼで作動可能なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）などのガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは遺伝子編集用である。例示的なＣａｓヌクレアーゼには、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃｍｓ１、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋおよびＣａｓＸが含まれるが、これらに限定されない。図７は、ｓｇＲＮＡ内の潜在的な分割部位を示す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントがｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）であり、エフェクターＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）またはその一部である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、ｓｎｏＲＮＡのＨ／ＡＣＡボックスである。Ｈ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡは、２つのヘアピンと２つの一本鎖領域を含むよく見られる二次構造を持っている。図８は、Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡにおける潜在的な分割部位を示す。例示的なＨ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡ配列は、ｓｎｏｓｔｒｉｐ．ｂｉｏｉｎｆ．ｕｎｉ－ｌｅｉｐｚｉｇ．ｄｅにあるｓｎｏＳｔｒｉｐのＷｅｂサーバーで見つけることができる。Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡは、ウリジンを標的ＲＮＡ内のプソイドウリジンに変換するために使用できる。Ｈ／ＡＣＡ ｓｎｏＲＮＡ配列はｍＲＮＡ編集に使用できる。例えば、ＵＳ８６０３４５７Ｂ２を参照されたい。

ＲＮＡエレメントの第１部分とＲＮＡエレメントの第２部分は、線状ＲＮＡのライゲーション配列として機能する。ＲＮＡエレメントの第１の部分および第２の部分以外に、本明細書に記載される線状ＲＮＡは、追加のライゲーション配列を有さない。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、５’末端に５’ライゲーション配列、および３’末端に３’ライゲーション配列を含まず、ここで、５’ライゲーション配列および３’ライゲーション配列は、５’ライゲーション配列および３’ライゲーション配列とハイブリダイズするスプリントオリゴヌクレオチドの存在下で、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ）を介して互いにライゲーションされ得る。

Ｂ．エフェクターＲＮＡ配列
本明細書に記載の線状ＲＮＡ前駆体およびｃｉｒｃＲＮＡは、コードＲＮＡ配列または非コードＲＮＡ配列であり得るエフェクターＲＮＡ配列を含む。例示的な非コードＲＮＡとしては、ガイドＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ）、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ）、または長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、少なくとも約５０ｎｔ長、例えば、少なくとも約１００、１５０、２００、３００、６００、９００、１２００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００ｎｔ、またはそれ以上のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、約５０００、４０００、３０００、２０００、１５００、１２００、９００、６００、３００、２００、１５０、または１００ｎｔ長以下のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、約５０～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～２０００、２０００～５０００、５０～５０００、１００～５０００、１００～３０００、５００～５０００、５００～２５００、２５００～５０００、または１０００～５０００ｎｔ長のいずれか１つである。

いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、任意の目的のポリペプチドをコードするコードＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも約１５アミノ酸長、例えば、少なくとも約２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上のアミノ酸の長さのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの長さは約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、または２０アミノ酸以下のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約２０～５０、５０～１００、２０～２００、２０～５００、２０～１０００、５０～５００、５０～１０００、１００～５００、１００～１０００、２００～１０００、または５００～１０００アミノ酸の長さのいずれか１つである。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質（例えば、抗体）である。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、抗原性ポリペプチドをコードする。ｃｉｒｃＲＮＡワクチンは、抗原性ポリペプチドをコードするコードＲＮＡ配列を含む線状ＲＮＡを使用して調製することができる。抗原性ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、全長タンパク質もしくはそのフラグメント、または被験者において免疫応答を誘発することができる抗原性融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、アミノ酸長が１００以下の短いペプチドである。抗原性ポリペプチドは、１つ以上のエピトープを含むタンパク質抗原からの天然由来のペプチドフラグメント、または１つ以上の天然エピトープ配列を有する人工的に設計されたペプチドであり得、ペプチドリンカーは場合により隣接するエピトープ配列の間に配置され得る。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、抗原性タンパク質の単一のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、単一の抗原性タンパク質に由来する約１、２、３、４、５、１０またはそれ以上のエピトープのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、複数（例えば、２、３、４、５、１０またはそれ以上）の異なる抗原性タンパク質に由来するエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ制限エピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープとＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープの両方を含む。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、細菌またはウイルスなどの病原体に由来する抗原性タンパク質もしくはそのフラグメントまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、そのバリアントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２などのコロナウイルスの抗原性タンパク質またはフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣＯＶ、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質もしくはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。ＣｉｒｃＲＮＡワクチンは、例えばＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７４９９８に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の線状ＲＮＡおよび構築物は、当技術分野で既知のｃｉｒｃＲＮＡワクチンのいずれかを調製するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、疾患または症状に関与する抗原などの自己抗原の抗原性タンパク質もしくはそのフラグメントまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは腫瘍抗原ペプチドである。腫瘍抗原ペプチド配列は当技術分野で公知であり、がん抗原ペプチドデータベース（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ：Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＵＲＬ：ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ）などの公共データベースで見つけることができる。本明細書に記載の線状ＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡにおけるコードＲＮＡ配列は、既知の腫瘍抗原ペプチドまたはそれらの組み合わせのいずれかをコードし得る。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは腫瘍特異的抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ネオ抗原、すなわち、個体の腫瘍細胞に存在する新たに獲得され発現された抗原のエピトープを含む。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のエピトープペプチドのアミノ酸配列は、Ｔ細胞エピトープ予測のためのバイオインフォマティクスツールを使用して、抗原タンパク質（ネオアンチゲンを含む）の配列に基づいて予測される。Ｔ細胞エピトープ予測のための例示的なバイオインフォマティクスツールは当技術分野で知られており、例えば、Ｙａｎｇ Ｘ．ａｎｄ Ｙｕ Ｘ．（２００９）“Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ”Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１９（２）：７７－９６を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質の配列は当技術分野で既知であるか、または公共のデータベースで入手可能である。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質（ネオアンチゲンを含む）の配列は、治療される個体のサンプル（腫瘍サンプルなど）を配列決定することによって決定される。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、またはより高次の多量体の形成を媒介するドメインなどの多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは三量体化ドメインである。非限定的な例において、多量体化ドメインは、Ｔ４フィブリチンタンパク質のＣ末端フォルドン（Ｆｄ）ドメインを含み、Ｃ末端フォルドンドメインは、Ｔ４フィブリチンタンパク質の三量体化を媒介するドメインである。別の例では、多量体化ドメインは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＧＣＮ４転写活性化因子の三量体化ドメインに基づくＧＣＮ４ベースのイソロイシンジッパー（ＩＺ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＮ４ ＩＺドメインまたはＴ４フィブリチンＦｄドメインは、当技術分野で知られている技術に従って、それらの免疫原性を低下させるために修飾され得る。例えば、ＧＣＮ４ ＩＺドメインは、その免疫原性を低下させるためにＮ結合型グリコシル化部位で修飾することができる（Ｓｌｉｅｐｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２９０，Ｎｏ．１２，ｐｐ．７４３６－７４４２）。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは免疫原性キャリアタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、免疫原性キャリアタンパク質にコンジュゲートしたエピトープペプチドを含む。例示的な免疫原性キャリアタンパク質としては、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、修飾のジフテリア毒素交差反応物質（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、およびインフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＨｉＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は標的化タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は抗体またはその抗原結合フラグメントである。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は抗体をコードする。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは中和抗体、すなわち、タンパク質とその結合パートナーとの間の相互作用をブロックする抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体は、例えば、結合パートナーへのタンパク質の結合をブロックすることによって、タンパク質の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はチェックポイント阻害剤、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１の抗体阻害剤である。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍抗原などの細胞表面抗原に特異的に結合する。例示的な腫瘍抗原には、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、及びメソテリンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、細菌またはウイルスなどの病原体上の標的抗原に特異的に結合する。

抗体は、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、抗原に結合することができる、またはインタクトな抗体（すなわち、抗原結合フラグメントが由来する無傷の抗体）と競合して抗原に結合することができる、無傷のまたは完全な抗体よりも少ないアミノ酸残基を有する、無傷のまたは完全な抗体の一部またはフラグメントであり得る。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって調製できる。抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラダイアボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、中和抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）、またはそれらの抗原結合フラグメントなどの遺伝子操作された抗体であり得る。

いくつかの実施形態では、抗体はウイルスタンパク質に結合する中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ウイルスタンパク質の受容体に結合する中和抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞へのウイルスの進入に必要な受容体（例えば、ＡＣＥ２受容体）に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、コロナウイルスのＳタンパク質に結合し、その細胞感染能力を阻止または低下させる中和抗体（ｎＡｂ）である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ｎＡｂは、１つまたは複数の変異を含むＳタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ｎＡｂは、Ｓ２領域に少なくとも１つの点変異、例えば、Ｋ９８６Ｐ、Ｖ９８７Ｐ、Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９ＰもしくはＡ９４２Ｐ変異、またはそれらの組み合わせを含むＳタンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態では、ｎＡｂは、Ａ２２２Ｖ、Ｅ４０６Ｗ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４３９Ｋ、Ｌ４５５Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｑ４９３Ｆ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａから選択される少なくとも１つの点変異、またはそれらの組み合わせを含むＳタンパク質またはそのフラグメントに結合する。いくつかの実施形態では、ｎＡｂは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、機能的抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体（ＶＨＨまたはナノボディ）である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の結合および中和のための例示的なｎＡｂは、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｃ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎｆｏｒｍ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５８８，６８２－６８７（２０２０）、および中国特許出願ＣＮ１１１６９００５８Ａに記載されており、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、抗体ではない標的化タンパク質をコードする。非抗体ベースの標的化タンパク質の例としては、リポカリン、アンチカリン（ヒトリポカリンに由来する人工抗体模倣タンパク質）、「Ｔボディ」、ペプチド（例えば、ＢＩＣＹＣＬＥ（商標）ペプチド）、アフィボディ（アルファヘリックスから構成される抗体模倣体、例えば、３ヘリックスバンドル）、ペプチボディ（ペプチド－Ｆｃ融合体）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質、リピートモチーフからなる操作された抗体模倣タンパク質）、アフィマー、アビマー、ノッティン（３つのジスルフィド橋を含むタンパク質構造モチーフ）、モノボディ、アフィニティークランプ、外部ドメイン、受容体外部ドメイン、受容体、サイトカイン、リガンド、免疫サイトカイン、およびセントリインが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｒｏｄｒｉｇｏ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｄａｙ ２０．１０（２０１５）：１２７１－１２８３を参照されたい。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は可溶性受容体をコードする。可溶性受容体（可溶性受容体デコイまたは「トラップ」と呼ばれることもある）は、受容体タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含むことができる。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部をコードするヌクレオチド配列は、細胞からの分泌のためにシグナルペプチドに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、天然に存在する受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性受容体バリアントは、細胞外ドメインに１つ以上の変異を含むバリアントなど、天然に存在する受容体の細胞外ドメインの操作されたバリアントを含む。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、そのリガンドに対する天然受容体の親和性と比較して、そのリガンドに対する可溶性受容体の親和性を増加させる１つ以上の変異を含む。

いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、受容体またはそのバリアントの細胞外ドメインに作動可能に連結された１つまたは複数の追加のタンパク質ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、例えばヒト免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性受容体はヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。

いくつかの実施形態では、可溶性受容体はシグナル伝達受容体の細胞外ドメインを含み、可溶性受容体は内因性受容体とそのリガンドとの間の結合を遮断することによってシグナル伝達経路の活性を低下または阻害することができる。

いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、ウイルスタンパク質に結合する受容体、および／またはウイルスの進入を媒介する受容体である。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は可溶性ＡＣＥ２受容体である。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、コロナウイルスのＳタンパク質に結合できる可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントである。いくつかの実施形態では、可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ２受容体バリアントは酵素的に活性である。他の実施形態では、ＡＣＥ２受容体バリアントは酵素的に不活性である。いくつかの実施形態では、可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、野生型（ＷＴ）ヒト組換えＡＣＥ２（ＡＰＮ０１）の可溶性細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、ヒトＡＣＥ２の細胞外ドメインに１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、Ｓタンパク質のＲＢＤに対する結合親和性が増加するように、親和性成熟を介して操作される。可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、例えば、Ｈａｓｃｈｋｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２０１３ Ｓｅｐ；５２（９）：７８３－９２；Ｇｌａｓｇｏｗ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｎｏｖ ２０２０，１１７（４５）２８０４６－２８０５５；及びＨｉｇｕｃｈｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０９．１６．２９９８９１に記載されており、それらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、可溶性ＡＣＥ２受容体バリアントは、融合タンパク質、例えば、細胞外ＡＣＥ２受容体ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との融合体である。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は機能性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７およびＷＯ２０２０２３７２２７（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、機能的な酵素またはタンパク質の産生（および特定の場合には分泌）のために標的細胞（例えば、ヒトまたはマウス細胞）によって発現することができる。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、シグナルペプチドを治療用ポリペプチドのアミノ末端に作動可能に連結することによって分泌されるように操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、標的細胞による１つまたは複数の治療用ポリヌクレオチドの発現により、被験者が欠損している機能的な酵素またはタンパク質（例えば、尿素サイクル酵素またはリソソーム蓄積障害に関連する酵素）が産生されることが観察される場合がある。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、ＩＤＵＡ、ＯＴＣ、ＦＡＨ、ミニＤＭＤ、ＤＭＤ、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＣＯＬ３Ａ１、ＢＭＰＲ２、ＡＨＩ１、ＦＡＮＣＣ、ＭＹＢＰＣ３、ＩＬＲＧ２、またはＡＲＧ１などのタンパク質をコードし、ここで、機能性タンパク質の欠乏は疾患または障害に関連している。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列はタンパク質（例えば、リソソーム酵素）であり、このタンパク質の欠乏はリソソーム蓄積障害に関連する。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列はタンパク質（例えば、酵素）をコードし、このタンパク質の欠乏は代謝障害に関連する。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、尿素サイクル酵素（例えば、ＡＲＧ１）を含む。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列はタンパク質（例えば、ｐ５３またはＰＴＥＮ）をコードし、このタンパク質の欠乏はがんに関連する。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは腫瘍抑制因子を含む。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする。蛍光タンパク質は当業者に周知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、２つ以上のポリペプチド、例えば２つ以上の治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、治療用ポリペプチドおよびレポータータンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列によってコードされるポリペプチド内の様々なドメインまたはフラグメントは、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。グリシンリンカー、グリシン－セリンリンカー、および他のアミノ酸を含むリンカーなどの柔軟なペプチドリンカーは、当技術分野で知られている（例えば、適切なペプチドリンカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５；６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている）。ペプチドリンカーは計算法によって設計することもできる。ペプチドリンカーは、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、または５０を超えるアミノ酸の任意の長さであり得る。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列はコドン最適化されている。コドン最適化配列は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコドンが置換されたものであってもよい。コドンの最適化に影響を与える要因は、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子、または合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物、遺伝子、または遺伝子のセット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的な変動、（ｉｖ）デコードｔＲＮＡに応じたコドンの変動、（ｖ）全体またはトリプレットの１つの位置におけるＧＣ％に応じたコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば天然に存在する配列との類似度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する事前知識、および／または（ｘ）各アミノ酸のコドンセットの体系的な変動のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチドは、リボザイム衝突を最小限に抑え、および／または発現配列とＩＲＥＳとの間の構造干渉を制限することができる。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、コードＲＮＡ配列の機能的ポリペプチドへの翻訳を促進する１つまたは複数の追加エレメントをコードするか、またはそれに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加エレメントは、コードＲＮＡ配列の翻訳をモニタリングするのに有用である。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、シグナルペプチド（ＳＰ）を含むポリペプチドをコードする。非限定的な例では、シグナルペプチドは、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）からのシグナル配列およびプロペプチド、ヒトＩｇＥ免疫グロブリンからのシグナル配列、またはＭＨＣ Ｉのシグナルペプチド配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、コードＲＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの分泌を促進することができる。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列の３’末端は、インフレーム２Ａペプチドコード配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、３’末端に終止コドンを含まない。いくつかの実施形態では、インフレーム２Ａペプチドコード配列が終止コドンを置き換える。いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は終止コドンを含まず、コードＲＮＡを構成するヌクレオチドの数は３の倍数である。いくつかの実施形態では、終止コドンを有さず、ＲＮＡを構成するヌクレオチドの数が３の倍数であるコードＲＮＡ配列は、線状ＲＮＡ前駆体を使用して調製されるｃｉｒｃＲＮＡのローリングサークル翻訳を可能にする。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドコード配列は、線状ＲＮＡ前駆体を使用して調製されるｃｉｒｃＲＮＡのローリングサークル翻訳を可能にする。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ローリングサークル翻訳によって生成されたポリペプチドの単量体ポリペプチド配列への切断を可能にする。非限定的な例では、２Ａペプチドコード配列は、配列番号９または１２に示される配列などのＰ２ＡまたはＴ２Ａペプチドをコードする。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列は、アフィニティータグまたは識別タグをコードするヌクレオチド配列を含む。例示的なタグとしては、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、およびＭＢＰタグが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、コードＲＮＡ配列の５’末端は、コザック配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、コザック配列はタンパク質翻訳開始部位として機能する。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、５’末端から３’末端まで、ＲＮＡエレメント（例えば、ＩＲＥＳ）の第１の部分、コザック配列、コードＲＮＡ配列、およびＲＮＡエレメントの第２の部分（例えば、ＩＲＥＳ）を含む。

いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、コードＲＮＡ配列の３’末端およびＲＮＡエレメントの第２の部分（例えば、ＩＲＥＳ）の５’末端に配置されたポリＡまたはポリＡＣ配列をさらに含む。内部ポリＡ配列またはポリＡＣスペーサーは、長さが１～５００ヌクレオチドの範囲（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド）であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列またはポリＡＣ配列は、長さが１０～７０、２０～６０、または３０～６０ヌクレオチドの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、ポリＡ配列もポリＡＣ配列も含まない。理論や仮説に束縛されるものではないが、ｃｉｒｃＲＮＡのＩＲＥＳ配列の前に追加された内部ポリＡ配列またはポリＡＣスペーサーは、ＩＲＥＳによって開始される効率的なタンパク質翻訳のために、ＩＲＥＳエレメントの機能的な第２構造を維持するのに役立つ。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列またはポリＡＣスペーサーは、コードＲＮＡの発現を増加させる。

ＩＩＩ．ｃｉｒｃＲＮＡの調製方法
本出願はさらに、上記セクションＩＩに記載された線状ＲＮＡまたは構築物のいずれか１つを使用してｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法を提供する。ＲＮＡリガーゼによる本明細書に記載の線状ＲＮＡの分子内ライゲーションにより、ＲＮＡエレメントおよびエフェクターＲＮＡ（例えば、コードＲＮＡ）配列を含むｃｉｒｃＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、インビトロで線状ＲＮＡを環状化することによって調製される。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用して線状ＲＮＡを環状化することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡはインビトロで環状化される。いくつかの実施形態では、線状ＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによって環状化され得る。非限定的な例では、線状ＲＮＡは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４ Ｒｎｌ１）およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４ Ｒｎｌ２）などのリガーゼによって環状化され得る。本明細書に記載される線状ＲＮＡは、一本鎖核酸アダプター、例えばスプリントオリゴヌクレオチドの存在なしに環状化される。

いくつかの実施形態では、（ａ）環状化ＲＮＡ生成物を提供するために線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションを可能にする条件下で、本明細書に記載のいずれか１つの線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させることと、（ｂ）環状化ＲＮＡ生成物を単離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡを提供することとを含む、ｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記ライゲーションはスプリントオリゴヌクレオチドの存在を必要としない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、インビトロで線状ＲＮＡを環状化するステップを含み、（ａ）環状化ＲＮＡ生成物を提供するために線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションを可能にする条件下で、本明細書に記載のいずれか１つの線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させることと、（ｂ）環状化ＲＮＡ生成物を単離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡを提供することとを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションはスプリントオリゴヌクレオチドの存在を必要としない。

いくつかの実施形態では、（ａ）環状化ＲＮＡ生成物を提供するために線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションを可能にする条件下で、本明細書に記載のいずれか１つの線状ＲＮＡをＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と接触させることと、（ｂ）環状化ＲＮＡ生成物を単離し、それによってｃｉｒｃＲＮＡを提供することとを含む、ｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記ライゲーションはスプリントオリゴヌクレオチドの存在を必要としない。

ＲＮＡリガーゼを使用して、本明細書に記載の線状ＲＮＡの５’－リン酸化末端を線状ＲＮＡの３’－ヒドロキシル基に酵素的に結合させて、新たなホスホジエステル結合を形成してもよい。反応例では、製造業者のプロトコールに従って、線状環状ＲＮＡを１～１０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）と共に２５℃で８時間インキュベートする。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助する並列の５’領域と３’領域の両方と塩基対合できる線状核酸を必要とせずに起こり、つまり、前記ライゲーションはスプリントライゲーションではない。

Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１によるライゲーションにより、ライゲーション部位でのヌクレオチドの挿入または欠失が生じる可能性がある。いくつかの実施形態では、追加の配列がｃｉｒｃＲＮＡに導入されないように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して本明細書に記載の線状ＲＮＡをライゲーションする。

本明細書に記載の方法は、高い分子内ライゲーション効率を有する。ライゲーション効率は、ＨＰＬＣまたはアガロースゲル電気泳動などの当技術分野で知られている方法を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション効率は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、この方法は、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、またはそれより少ない量のポリマーｃｉｒｃＲＮＡ産物、すなわち、ひとつのｃｉｒｃＲＮＡへの線状ＲＮＡの複数のコピーのライゲーションをもたらす。

いくつかの実施形態では、この方法は、線状ＲＮＡをコードする核酸構築物のインビトロ転写を行って、線状ＲＮＡを得ることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、環状化ＲＮＡ産物をＲＮａｓｅ Ｒで処理して線状ＲＮＡ転写物を消化することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、ｃｉｒｃＲＮＡ産物からｃｉｒｃＲＮＡを精製することをさらに含む。非限定的な例では、ｃｉｒｃＲＮＡはゲル精製または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。いくつかの実施形態では、アガロースゲル電気泳動により、線状ＲＮＡ前駆体分子およびニックが入った環から環状ＲＮＡ産物を簡単かつ効果的に分離することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーによって環状ＲＮＡを精製することを含む。いくつかの実施形態では、精製された環状ＲＮＡは、－８０℃で保存することができる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡを単離するステップは、ｃｉｒｃＲＮＡをゲル精製することを含む。いくつかの実施形態では、精製されたｃｉｒｃＲＮＡは－８０℃で保存することができる。

ＩＩＩ．環状ＲＮＡ及びその使用方法
本出願はさらに、本明細書に記載の調製方法のいずれか１つ、または線状ＲＮＡもしくは構築物のいずれか１つを使用して調製されたｃｉｒｃＲＮＡおよび組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡエレメントおよびエフェクターＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、エフェクターＲＮＡ配列は、ｇＲＮＡ、ｄＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡおよびコードＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子の配列である。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡエレメント（例えば、ＩＲＥＳ）と、抗原性ポリペプチド、機能性タンパク質、受容体タンパク質、または標的化タンパク質などの治療用ポリペプチドをコードするコードＲＮＡ配列とを含む。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡエレメント（例えば、ＩＲＥＳ）と、抗原性ポリペプチドをコードするコードＲＮＡ配列とを含むｃｉｒｃＲＮＡワクチンである。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンはコロナウイルスワクチンまたはがんワクチンである。

いくつかの実施形態では、複数のｃｉｒｃＲＮＡを含むカクテル組成物が提供され、各ｃｉｒｃＲＮＡは、抗原性ポリペプチド、感染因子の受容体タンパク質、または標的化タンパク質（例えば、中和抗体などの抗体）をコードするコードＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、複数のｃｉｒｃＲＮＡは、抗原性ポリペプチド（例えば、Ｓタンパク質またはそのフラグメント）の異なる変異体など、互いに異なる抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のｃｉｒｃＲＮＡは、受容体タンパク質（例えば、ＡＣＥ２）の異なる変異体など、互いに異なる受容体タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、複数のｃｉｒｃＲＮＡは、異なる抗体（例えば、中和抗体）など、互いに異なる標的化タンパク質をコードする。

本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡは、遺伝性疾患（例えば、遺伝性遺伝疾患、代謝性疾患およびがん）、および感染症（例えば、コロナウイルスなどのウイルス感染症）を含むがこれらに限定されない、個体における疾患または状態を治療または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、個体内のリボソームによるローリングサークル翻訳を受ける。

いくつかの実施形態では、機能的タンパク質をコードするコードＲＮＡ配列を含む有効量のｃｉｒｃＲＮＡを個体に投与することを含む、個体における疾患または状態を治療または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、機能性タンパク質は、酵素、受容体、リガンド、シグナル伝達分子、または転写因子である。いくつかの実施形態では、疾患または症状は代謝性疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または状態はリソソーム蓄積障害である。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんである。

本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡによってコードされる治療用ポリペプチドに対応する天然に存在するタンパク質の変異または欠損に関連する遺伝性疾患または状態を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、治療用ポリペプチドに対応する天然に存在するタンパク質の不十分なレベルおよび／または活性に関連する疾患または状態である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、治療用ポリペプチドに対応する天然に存在するタンパク質における１つまたは複数の変異に関連する遺伝性遺伝病である。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、野生型タンパク質、またはその機能的バリアント（例えば、機能的フラグメント、融合タンパク質、または変異体）である。

いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７に開示されるような機能的な酵素またはタンパク質の産生（および特定の場合には、分泌）のために標的細胞（例えば、ヒトまたはマウス細胞）によって発現され得る任意のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、シグナルペプチドを治療用ポリペプチドのアミノ末端に作動可能に連結することによって分泌されるように操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、標的細胞による１つまたは複数の治療用ポリヌクレオチドの発現により、被験者が欠損している機能的な酵素またはタンパク質（例えば、尿素サイクル酵素またはリソソーム蓄積障害に関連する酵素）が産生されることを観察し得る。

本願の方法によって治療され得る疾患関連変異の例としては、がんに関連するＴＰ５３^Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳＩ）に関連するＩＤＵＡ^{Ｗ４０２Ｘ}（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ変異）、エーラス・ダンロス症候群に関連するＣＯＬ３Ａ１^{Ｗ１２７８Ｘ}（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ変異）、原発性肺高血圧症に関連するＢＭＰＲ２^{Ｗ２９８Ｘ}（例、８９３Ｇ＞Ａ）、ジュベール症候群に関連するＡＨＩ１^{Ｗ７２５Ｘ}（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）、ファンコニ貧血に関連するＦＡＮＣＣ^{Ｗ５０６Ｘ}（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）、原発性家族性肥大型心筋症に関連するＭＹＢＰＣ３^{Ｗ１０９８Ｘ}（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）、およびＸ連鎖重度複合免疫不全症に関連するＩＬ２ＲＧ^{Ｗ２３７Ｘ}（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は単一遺伝子疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は多遺伝子性疾患である。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくともまたは少なくとも約２０時間、２４時間、３０時間、または３６時間の機能的半減期を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ヒト細胞において少なくともまたは少なくとも約２０時間、２４時間、３０時間、または３６時間の治療効果の持続期間を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ヒト細胞において、同じ発現配列を含む同等の線状ＲＮＡの治療効果以上の治療効果の持続期間を有する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、ヒト細胞において、同じ発現配列を含む同等の線状ＲＮＡの機能的半減期以上の機能的半減期を有する。

いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドをコードするコードＲＮＡ配列を含むｃｉｒｃＲＮＡワクチン、または複数のｃｉｒｃＲＮＡを含むカクテル組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における疾患または状態を治療または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ウイルス、例えばコロナウイルスなどの感染因子のタンパク質またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、感染因子はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

いくつかの実施形態では、受容体タンパク質をコードするコードＲＮＡ配列を含む有効量のｃｉｒｃＲＮＡを個体に投与することを含む、個体における疾患または症状を治療または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質は、ウイルス、例えばコロナウイルスなどの感染因子の受容体である。いくつかの実施形態では、受容体タンパク質は、可溶性ＡＣＥ２受容体などの可溶性受容体である。

いくつかの実施形態では、抗体などの標的化タンパク質をコードするコードＲＮＡ配列を含む有効量のｃｉｒｃＲＮＡを個体に投与することを含む、個体における疾患または状態を治療または予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は中和抗体である。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、標的化タンパク質は、ウイルス、例えばコロナウイルスなどの感染因子に特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、本出願は、個体における疾患または状態の治療または予防のためのｃｉｒｃＲＮＡを提供する。

いくつかの実施形態において、本出願は、個体における疾患または状態を治療または予防するための薬剤の製造における、治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含むｃｉｒｃＲＮＡの使用を提供する。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、裸のｃｉｒｃＲＮＡとして、またはトランスフェクション剤を含む医薬組成物として投与される。非限定的な例では、トランスフェクション剤はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。投与用のｃｉｒｃＲＮＡ組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンまたは医薬組成物）を投与するために使用できるリピドソームの他の例としては、プロタミン、カチオン性ナノエマルション、修飾デンドリマーナノ粒子、プロタミンリポソーム、カチオン性ポリマー、カチオン性ポリマーリポソーム、多糖類粒子、カチオン性脂質ナノ粒子、カチオン性脂質－コレステロールナノ粒子、カチオン性脂質－コレステロールＰＥＧナノ粒子、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥの商標で販売されているカチオン性脂質トランスフェクション試薬、ＦＵＧＥＮＥの商標で販売されている非リポソームトランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組み合わせをトランスフェクション剤として使用することができる。

いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ペグ化の性質、全成分の比率、およびサイズなどの生物物理学的パラメーターによって影響を受け得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、カチオン性脂質、コレステロールおよびペグ化脂質を含む。例えば、リポソーム製剤は、カチオン性脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡを含み得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２－１７６を参照されたい。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約３５％～約４５％のカチオン性脂質、約４０％～約５０％のカチオン性脂質、約５０％～約６０％のカチオン性脂質、および／または約５５％～約６５％のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、リポソーム中の脂質対ＲＮＡの比は、約５：１から約２０：１、約１０：１から約２５：１、約１５：１から約３０：１、および／または少なくとも３０：１であってもよい。適切なリポソーム製剤は、例えばＷＯ２０２０２３７２２７に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡはトランスフェクション試薬とともに配合されない。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは裸のＲＮＡとして送達される。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、遺伝子銃またはエレクトロポレーションによって送達される。

投与のためのｃｉｒｃＲＮＡ組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンまたは医薬組成物）は、血管系への全身注射、リンパ節への全身注射、皮下注射もしくはデポ、または局所注射によって被験者に投与することができる。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、国際公開ＷＯ２０１２１７０９３０号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもののような脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。

いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡの制御放出および／または持続放出のために製剤化され得る。非限定的な例として、徐放用の合成ナノキャリアは、本明細書に記載される、および／または国際公開ＷＯ２０１０１３８１９２および米国公開ＵＳ２０１００３０３８５０に記載されるように、当技術分野で知られている方法によって製剤化することができ、これらの文献のそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは制御放出および／または持続放出用に製剤化され得、前記製剤は結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーである少なくとも１つのポリマーを含む。ＣＹＳＣポリマーは、米国特許第８，３９９，００７号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、ワクチンとして使用するために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡをカプセル化することができる。非限定的な例として、合成ナノキャリアは、少なくとも１つの抗原およびワクチン剤形用の賦形剤を含み得る（国際公開ＷＯ２０１１１５０２６４および米国公開ＵＳ２０１１０２９３７２３を参照、その全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形は、同じまたは異なる抗原を有する少なくとも２つの合成ナノキャリアと賦形剤とを含み得る（国際公開ＷＯ２０１１１５０２４９および米国特許公開ＵＳ２０１１０２９３７０１を参照、これらの全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。ワクチン剤形は、本明細書に記載の方法、当技術分野で公知の方法、および／または国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号および米国公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号に記載の方法によって選択することができ、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、アジュバントは、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、リン酸ジメチルジオクタデシルアンモニウムまたは酢酸ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、およびマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の全脂質抽出物の無極性画分または前記無極性画分の一部を含んでもよい（例えば、米国特許第８，２４１，６１０号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、合成ナノキャリアは、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡおよびアジュバントを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノキャリアは、国際公開番号ＷＯ２０１１１５０２４０および米国公開番号ＵＳ２０１１０２９３７００に記載されている方法によって製剤化することができ、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡはアジュバントとして使用される。一例として、細胞質におけるＲＮＡセンシングは自然免疫を引き起こす可能性があり、自然免疫シグナル伝達はさまざまな経路で適応免疫に寄与することが知られている。したがって、抗原性ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡまたは第２のｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ポリペプチドをコードしないｃｉｒｃＲＮＡ）は、抗原性ポリペプチドに対する適応免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用することができる。

いくつかの実施形態では、本出願のｃｉｒｃＲＮＡ組成物は、他の予防的または治療的化合物とともに投与され得る。非限定的な例として、予防的または治療的化合物はアジュバントまたはブースターであってもよい。本明細書で使用される場合、ワクチンなどの予防組成物に言及する場合、「ブースター」という用語は、予防組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の早期投与後に投与することができる。予防組成物の初回投与とブースターの投与の間の時間は、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、１０日間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間、１８ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間、１１年間、１２年間、１３年間、１４年間、１５年間、１６年間、１７年間、１８年間、１９年間、２０年間、２５年間、３０年間、３５年間、４０年間、４５年間、５０年間、５５年間、６０年間、６５年間、７０年間、７５年間、８０年間、８５年間、９０年間、９５年間または９９年間以上であってもよいが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、投与のためのｃｉｒｃＲＮＡ組成物（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンまたは医薬組成物）は、鼻腔内に投与され得る。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンは、生ワクチンの投与と同様に鼻腔内に投与され得る。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、当技術分野で知られている不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内または皮内に投与され得る。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンは、ワクチンがより高い免疫応答を誘発することを可能にし得るアジュバントを含む。非限定的な例として、アジュバントは、ヒト小児集団においてより高い免疫応答を誘発することができるサブミクロンの水中油型エマルジョンであってもよい（例えば、米国特許公開ＵＳ２０１２００２７８１３号および米国特許ＵＳ８５０６９６６号に記載されているアジュバント含有ワクチンを参照、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

Ｖ．組成物、キットおよび製品
さらに、本出願は、本明細書に記載の線状ＲＮＡ、構築物、またはｃｉｒｃＲＮＡのいずれか１つを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれか１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する本明細書に記載の治療薬を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；防腐剤、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）；ＥＤＴＡおよび／または非イオン性界面活性剤などのキレート剤を含む。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用の密封バイアルなどの単回使用のバイアルに収容される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は多用途バイアルに収容される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は全体として容器内に収容される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結保存される。

本出願はさらに、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡを調製するための方法のいずれか１つに使用するためのキットおよび製品を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の線状ＲＮＡまたは線状ＲＮＡをコードする構築物、およびｃｉｒｃＲＮＡを調製するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２などのＲＮＡリガーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは逆転写酵素をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡのいずれか１つと、疾患または状態（例えば、コロナウイルス感染症またはがん）を治療または予防するための説明書とを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、ｃｉｒｃＲＮＡを投与するための説明書を含む。

本発明のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、任意選択で、緩衝液や解釈情報などの追加コンポーネントを提供する場合がある。したがって、本出願は、バイアル（例えば、密封バイアルなど）、ボトル、ジャー、柔軟な包装などを含む製品も提供する。

組成物の使用に関する説明書には、一般に、目的の治療のための用量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、またはサブユニット用量であり得る。例えば、個体または多くの個体の効果的な治療を提供するために、十分な用量の本明細書に開示されるようなｃｉｒｃＲＮＡを含むキットが提供され得る。さらに、個体への複数回投与（例えば、ｃｉｒｃＲＮＡワクチンの場合、最初のワクチン投与およびその後のブースター投与）を可能にするのに十分な用量のｃｉｒｃＲＮＡを含むキットが提供され得る。キットはまた、複数の単位用量の医薬組成物および使用説明書を含み、薬局（例えば、病院薬局および調剤薬局）での保管および使用に十分な量で包装されてもよい。

いくつかの実施形態では、キットは送達システムを含む。送達システムは、単位用量送達システムであってもよい。用量当たり送達される溶液または懸濁液の体積は、約５～約２０００μｌ、約１０～約１０００μｌ、または約５０～約５００μｌのいずれかであり得る。これらのさまざまな剤形の送達システムは、単位用量または複数回用量パッケージのシリンジ、スポイトボトル、プラスチック製スクイーズユニット、アトマイザー、ネブライザー、または医薬品エアロゾルであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡのいずれか１つの送達システムが提供され、それには前記ｃｉｒｃＲＮＡおよび前記ｃｉｒｃＲＮＡを送達するためのデバイスが含まれる。

本明細書で開示されるすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、同等または類似の特徴の一般的な一連の例にすぎない。

本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内ならびに本発明の添付の特許請求の範囲内に含まれるものであることが理解される。

実施例１．ライゲーションによるインビトロｃｉｒｃＲＮＡ生成
ｃｉｒｃＲＮＡにはキャップやポリ（Ａ）テールがないため、ｃｉｒｃＲＮＡの翻訳プロセスを開始するには内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が必要である。ここで、合理的に設計された分割ＩＲＥＳエレメント（本明細書では「ＩＲＥＳ分割」または「分割ＩＲＥＳ部分」とも呼ばれる）を使用して、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用してコーディング環状ＲＮＡを効率的かつ正確に生成する。図１は、ＩＲＥＳ分割を含む構築物を使用してｃｉｒｃＲＮＡを生成する方法の概要を示す。まず、ＲＮＡ転写物（「前駆体」または「線状ＲＮＡ前駆体」とも呼ばれる）は、互いに会合してＲＮＡ転写物の両端にニックを有する安定な分子内二次構造を形成する２つのＩＲＥＳ分割を含む構築物のインビトロ転写によって得られる。続いて前記ニックをＴ４ ＲＮＡリガーゼで連結して環状ＲＮＡを生成する。

ＲＮＡフォールド（ＲＮＡｆｏｌｄ）ソフトウェアを使用して、野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号１）の二次構造を分析した。野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳには非常に安定な二本鎖ＲＮＡ構造が含まれており、これが分子内二本鎖の形成を促進する可能性があることを発見した。図２Ａの四角で囲まれた領域を参照されたい。したがって、二本鎖ＲＮＡ領域内の２つの部位を選択して、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ部分の分割ペアを操作した。ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の第１の対（本明細書では「部位１ ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割」とも呼ばれる）において、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の５’部分（配列番号２）は、野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号１）の１～３８１番目のヌクレオチド及び第一の外因性の配列ＧＵＵＵを含み、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の３’部分（配列番号３）は、野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号１）の３８２から７４１番目のヌクレオチド及び第二の外因性の配列ＡＡＡＣを含む。図２Ｂを参照されたい。ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の第２の対（本明細書では「部位２ ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割」とも呼ばれる）では、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の５’部分（配列番号４）は、野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号１）の１～３４２番目のヌクレオチド及び第一の外因性の配列ＧＵＵＵを含み、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の３’部分（配列番号５）は、野生型ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号１）の３４３から７４１番目のヌクレオチド及び第二の外因性の配列ＡＡＡＣを含む。図２Ｃを参照されたい。二本鎖構造の安定性を維持するために、本発明者らは、４つのヌクレオチドＧＵＵＵおよびその逆相補配列（ＡＡＡＣ）を分割部位のすぐ隣に挿入した（図２Ｂ～２Ｃの四角で囲まれた配列）。

ＥＧＦＰをコードする環状ＲＮＡを生成するための２つの構築物は、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割の第１対と第２対を使用して設計される。各構築物は、５’から３’に、Ｔ７プロモーター（配列番号６）、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割対の３’部分、ＥＧＦＰコード配列（配列番号７）、ＦＬＡＧ－タグコード配列（配列番号８）、Ｐ２Ａ配列（配列番号９）、およびＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割対の５’部分を含む。部位１ ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割に基づく構築物（本明細書では「部位１構築物」とも呼ばれる）は、配列番号１０のＤＮＡ配列を有する。部位２ ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ分割に基づく構築物（本明細書では「部位２構築物」とも呼ばれる）は、配列番号１１のＤＮＡ配列を有する。

上記２つの構築物はそれぞれインビトロ転写を介して線状ＲＮＡ前駆体を提供し、これをＴ４ ＲＮＡリガー１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２により２５℃で８時間ライゲーションした。部位１構築物からの環状ＲＮＡ産物は、本明細書では部位１ライゲーション環状ＲＮＡと呼ばれる。部位２構築物からの環状ＲＮＡ産物は、本明細書では部位２ライゲーション環状ＲＮＡと呼ばれる。ライゲーション産物をＲＮａｓｅ Ｒで処理して、線状ＲＮＡ前駆体を除去した。図３は、ＲＮＡｓｅ Ｒ処理前後の、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１で連結された部位１ライゲーション環状ＲＮＡのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。環化効率は約７０％であり、ＲＮａｓｅ Ｒ処理により多くの線状ＲＮＡ産物が分解された。

次に、ウェルあたり４μｇ ｃｉｒｃＲＮＡで各環状ＲＮＡ産物を１２ウェルプレートにあるＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。図４Ａに示すように、部位１ライゲーション環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞ではＥＧＦＰ発現が検出されたが、部位２ライゲーション環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞ではＥＧＦＰ発現が検出されなかった。本発明者らは、ＥＧＦＰ発現の欠如は、部位２ライゲーション環状ＲＮＡにおけるライゲーションされたＩＲＥＳの機能的構造の破壊によるものである可能性があると推論した。ウェスタンブロット分析は、部位１ライゲーション環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ発現レベルが、同じ細胞におけるβ－チューブリンの発現レベルよりもはるかに高いことを示した（図４Ｂ）。

最後に、ライゲーション部位が正確であるかどうか、つまりライゲーション部位に挿入や欠失がないかをテストした。本発明者らは、部位１ライゲーション環状ＲＮＡを逆転写し、図１に示すように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用してライゲーション部位の接合部をＰＣＲ増幅した。図５Ａに示すように、ＰＣＲの結果、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いたＲＮＡ前駆体のライゲーション後に環状ＲＮＡが形成されたことが確認されたが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ処理を受けなかったＲＮＡ前駆体には環状ＲＮＡは発見されなかった。サンガー配列決定を使用して、本発明者らは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２によってライゲートされたサンプル中のライゲーション接合部位周囲の環状ＲＮＡの配列を決定した。図５Ｂに示すように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は線状ＲＮＡ前駆体のニックを正確に連結したが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１処理では少数の挿入および欠失が生じた。理論に束縛されるものではないが、これは、二本鎖ＲＮＡである基質を必要とする、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の基質要件によるものである可能性がある。

配列表
配列番号１ 野生型ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ ＲＮＡ配列
ＵＵＡＡＡＡＣＡＧＣＣＵＧＵＧＧＧＵＵＧＡＵＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＵＵＧＧＧＣＧＣＵＡＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＡＵＣＡＣＧＧＵＡＣＣＵＵＵＧＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＵＵＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＣＣＣＡＡＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＵＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＣＧＵＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＵＵＵＵＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＵＵＣＵＧＵＵＡＣＣＣＣＧＧＡＣＵＧＡＧＵＡＵＣＡＡＵＡＧＡＣＵＧＣＵＣＡＣＧＣＧＧＵＵＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＣＧＧＣＣＡＡＣＵＡＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＣＣＵＡＧＵＡＡＣＡＣＣＧＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＧＣＵＣＡＧＣＡＣＵＡＣＣＣＣＡＧＵＧＵＡＧＡＵＣＡＧＧＵＣＧＡＵＧＡＧＵＣＡＣＣＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＵＧＧＣＧＧＵＧＧＣＵＧＣＧＵＵＧＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＵＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＵＧＧＧＡＣＧＣＵＣＵＡＡＵＡＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＧＡＡＧＡＧＵＣＵＡＵＵＧＡＧＣＵＡＧＵＵＧＧＵＡＧＵＣＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＡＵＧＣＧＧＣＵＡＡＵＣＣＵＡＡＣＵＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＵＧＵＧＵＣＧＵＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＵＣＵＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＵＧＵＣＣＧＵＧＵＵＵＣＡＵＵＵＵＡＵＵＣＣＵＡＵＡＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＵＧＡＧＡＧＡＵＣＧＵＵＡＣＣＡＵＡＵＡＧＣＵＡＵＵＧＧＡＵＵＧＧＣＣＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＡＡＵＡＧＡＧＣＵＡＵＵＡＵＡＵＡＵＣＣＣＵＵＵＧＵＵＧＧＧＵＵＵＡＵＡＣＣＡＣＵＵＡＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＣＡＵＵＡＣＡＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＡＡＧＵＵＧＡＡＵＡＣＡＧＣＡＡＡ

配列番号２ 部位１ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割の５’部分（野生型ＣＶＢ３－ＩＲＥＳの１～３８１番目のヌクレオチド及び第一の外因性の配列ＧＵＵＵを含む。）

配列番号３ 部位１ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割の３’部分（野生型ＣＶＢ３－ＩＲＥＳの３８２～７４１番目のヌクレオチド及び第二の外因性の配列ＡＡＡＣを含む。）

配列番号４ 部位２ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割の５’部分（野生型ＣＶＢ３－ＩＲＥＳの１～３４２番目のヌクレオチド及び第一の外因性の配列ＧＵＵＵを含む。）

配列番号５ 部位２ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割の３’部分（野生型ＣＶＢ３－ＩＲＥＳの３４３～７４１番目のヌクレオチド及び第二の外因性の配列ＡＡＡＣを含む。）

配列番号６ Ｔ７プロモーター配列
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ

配列番号７ ＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧ

配列番号８ ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列
ＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧ

配列番号９ Ｐ２Ａ配列
ＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ

配列番号１０ 部位１構築物（ＥＧＦＰをコードするＲＮＡに隣接する部位１ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＴＧＡＧＴＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＴＴ

配列番号１１ 部位１構築物（ＥＧＦＰをコードするＲＮＡに隣接する部位２ ＣＶＢ３－ＩＲＥＳ分割）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＴＡＣＣＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＧＴＧＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＣＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＴＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＴＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＧＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＴＧＡＧＴＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴ

配列番号１２ Ｔ２Ａペプチドコード配列
ＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＵＣＵＵＣＵＡＡＣＡＵＧＣＧＧＵＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＵＣＣＣＧＧＣＣＣＵ

配列番号１３
ＣＡＣＣＧＡＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＴＧＣＧＡＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣ

配列番号１４
ＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧ

配列番号１５
ＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧ

Claims (13)

1. ５’末端から３’末端まで：
   （ａ）ＲＮＡエレメントの第１の部分、
   （ｂ）エフェクターＲＮＡ配列、及び
   （ｃ）ＲＮＡエレメントの第２の部分
   を含む線状ＲＮＡであって、
   前記ＲＮＡエレメントが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはその一部であり、
   前記ＲＮＡエレメントの第１の部分と前記ＲＮＡエレメントの第２の部分が互いに会合して、少なくとも４塩基対（ｂｐ）長の二本鎖領域が形成されており、
   前記ＲＮＡエレメントの第１の部分の５’末端および前記ＲＮＡエレメントの第２の部分の３’末端は、二本鎖領域にニックが形成されており、
   前記ニックはＲＮＡリガーゼによってライゲーションされ得る、線状ＲＮＡ。
2. 前記二本鎖領域が６ｂｐ長から２５ｂｐ長である、請求項１に記載の線状ＲＮＡ。
3. 前記ＲＮＡエレメントが少なくとも２０ｎｔ長である、請求項１又は２に記載の線状ＲＮＡ。
4. 前記二本鎖領域が前記ニックの３’側に少なくとも２ｂｐを含み、及び／又は前記二本鎖領域が前記ニックの５’側に少なくとも２ｂｐを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡ。
5. 前記ＲＮＡエレメントの第１の部分および／または前記ＲＮＡエレメントの第２の部分が、参照ＲＮＡエレメントに対して外因性の配列を含み、
   任意で、前記ＲＮＡエレメントの第２の部分が、３’末端に第１の外来配列を含み、前記ＲＮＡエレメントの第１の部分が、前記第１の外来配列に相補的な第２の外来配列を含み、前記第１の外来配列と前記第２の外来配列は、ニックの５’末端に隣接する塩基対が形成されている、請求項１に記載の線状ＲＮＡ。
6. 前記エフェクターＲＮＡ配列が、コードＲＮＡ配列であり、任意で、前記コードＲＮＡ配列が治療用ポリペプチドをコードする、請求項１～５のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡ。
7. 前記ＲＮＡエレメントが、前記コードＲＮＡの翻訳を促進し、
   前記ＩＲＥＳが、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、ピコルナウイルス（ＰＶ）ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ、アデノウイルス（ＡｄＶ）ＩＲＥＳ、ヒトパピローマウイルス３１型（ＨＰＶ３１）ＩＲＥＳ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）ＩＲＥＳ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＲＥＳ、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）ＩＲＥＳ、ＦＧＦ９ ＩＲＥＳ、ＳＬＣ７Ａ１ ＩＲＥＳ、及びＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳからなる群から選択されるＩＲＥＳに由来する、請求項６に記載の線状ＲＮＡ。
8. 前記ＩＲＥＳが、ＣＶＢ３ウイルスまたはその誘導体のＩＲＥＳであり、任意で、ＣＶＢ３ウイルスのＩＲＥＳが配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の線状ＲＮＡ。
9. 前記ＲＮＡエレメントの第１の部分が配列番号１の３８２～７４１番目のヌクレオチドを含み、前記ＲＮＡエレメントの第２の部分が配列番号１の１～３８１番目のヌクレオチドを含むか、又は、
   前記ＲＮＡエレメントの第１の部分が配列番号１の３４３～７４１番目のヌクレオチドを含み、前記ＲＮＡエレメントの第２の部分が配列番号１の１～３４２番目のヌクレオチドを含む、請求項８に記載の線状ＲＮＡ。
10. 前記コードＲＮＡの３’末端に作動可能に連結されたインフレーム２Ａペプチドコード配列をさらに含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡ。
11. 前記エフェクターＲＮＡ配列が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および長鎖遺伝子間非コード（ｌｉｎｃ）ＲＮＡからなる群から選択される非コードＲＮＡ配列である、請求項１～５のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡ。
12. （ａ）環状化ＲＮＡ生成物を提供するために線状ＲＮＡにおけるニックのライゲーションを可能にする条件下で、請求項１～１１のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡをＲＮＡリガーゼと接触させることと、
    （ｂ）環状化ＲＮＡ生成物を単離することにより、ｃｉｒｃＲＮＡを提供することと
    を含む、ｃｉｒｃＲＮＡを調製する方法。
13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の線状ＲＮＡをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。