JP7777215B2 - 小胞に存在する生体分子の分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、小胞に存在する生体分子の分析方法に関する。

細胞外小胞はサイズが小さいため、フローサイトメーター等を用いて表面抗原を直接検出および定量することは難しい。そこで、抗体等が固相化されたビーズに小胞を捕捉した後に表面抗原を検出および定量する方法が開発されている。特許文献１には、細胞外小胞表面マーカーを認識する抗体が結合したビーズとエクソソームとを反応させ、続いてこれらとＡＰＣ標識テトラスパニン任意抗体とを反応させて、フローサイトメーターに供してエクソソームの表面マーカーを検出および定量する方法が開示されている。特許文献２および３には、細胞内の分子またはウイルスなどの標的を金属標識し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって金属元素を検出することで標的を検出する方法が開示されている。特許文献４には、質量分析によってエクソソーム上の複数の表面抗原を同時に定量する技術が開示されている。

欧州特許出願公開第３０９３６６４号明細書 国際公開第２０１６／１０９６０３号 国際公開第２０１６／１８２４０２号 国際公開第２０２０／２３５４２４号

捕捉剤に小胞を固定し、抗体によって小胞の表面抗原を検出するとき、特許文献１～４に記載の方法によれば良好な感度で複数の表面抗原を同時に定量することは困難であった。本発明は、小胞に存在する複数の生体分子を良好な感度で同時に定量できる分析方法を提供することを目的とする。

本発明は、
支持体に固相化された捕捉分子と小胞を含む試料とを接触させることと、
第１金属粒子で標識された第１検出分子と前記小胞とを接触させることと、
第２金属粒子で標識された第２検出分子と前記小胞とを接触させることと、
前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子を誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析またはＩＣＰ発光分光分析によって定量することと、
を含む小胞に存在する生体分子の分析方法に関する。

本発明によれば、小胞に存在する複数の生体分子を良好な感度で同時に定量することができる。

図１は、実験１において、エクソソーム表面のＣＤ９発現量を金イオン量により定量したグラフである。 図２は、実験１において、エクソソーム表面のＣＤ８１発現量をパラジウムイオン量により定量したグラフである。 図３は、実験３において、エクソソーム粒子数（横軸）に対する３種の金属イオン量（縦軸）をプロットしたグラフである。 図４は、実験４において、培養細胞の培養時間（横軸）に対する３種の金属イオン量（縦軸）をプロットしたグラフである。 図５は、実験５において、用いた血清量（横軸）に対する３種の金属イオン量（縦軸）をプロットしたグラフである。

［小胞に存在する生体分子の分析方法］
本発明の一態様に係る小胞に存在する生体分子の分析方法は、
支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させる工程と、
第１金属粒子で標識された第１検出分子と前記小胞とを接触させる工程と、
第２金属粒子で標識された第２検出分子と前記小胞とを接触させる工程と、
前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子を誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析またはＩＣＰ発光分光分析によって定量する工程と、を含む。

本発明に係る方法によれば、小胞に存在する複数の生体分子を同時に定量することができる。小胞に存在する複数の生体分子のプロファイルが明らかになれば、小胞の種類を同定することもできる。本発明に係る方法によれば、生体分子への検出分子の結合を質量分析によって検出および定量するため、小胞に存在する生体分子を高感度で分析することができる。また、本発明に係る方法によれば、広いダイナミックレンジ（１×１０^６～１×１０^１０）の小胞の量で、当該小胞に存在する生体分子を分析することができる。

本明細書において、小胞は膜に包まれた袋状の構造を有する。小胞は細胞外小胞およびエンベロープウイルス等を含む。細胞外小胞は、タンパク質や核酸等の情報伝達物質を含む脂質二重膜で囲まれた数十～数百ｎｍのサイズの小胞である。細胞外小胞は、細胞から放出され、他の細胞へ情報を伝えることが知られている。細胞外小胞はエクソソーム、微小小胞体およびアポトーシス小体等を含む。エクソソームの大きさは例えば直径５０ｎｍ～１５０ｎｍ程度であり、微小小胞体の大きさは例えば直径１００ｎｍ～１μｍ程度であり、アポトーシス小体の大きさは例えば直径１μｍ～５μｍ程度である。本発明に係る方法において、小胞は好ましくはエクソソームである。エクソソームに含まれる生体分子は、がんおよび生活習慣病を含む疾病の発見および診断に利用され得る。エンベロープウイルスとしては、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス等が挙げられる。エンベロープウイルスは遺伝子組換えウイルスであってもよい。

小胞に存在する生体分子は、タンパク質、核酸、糖鎖等を含む任意の分子であってよい。小胞に存在するタンパク質は、膜タンパク質、細胞接着分子、受容体タンパク質、膜の融合または切り離しに関与するタンパク質、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質、疾患特異的マーカータンパク質等であってもよい。小胞に存在するタンパク質は、糖タンパク質であってよい。小胞に存在する核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ等を含んでよい。小胞に存在する生体分子は、小胞内に存在していてもよいが、好ましくは小胞の表面に存在する。

＜支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させる工程＞
支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させる工程について説明する。この工程によって、支持体上に小胞が捕捉される。支持体上に小胞を捕捉することで、小胞を濃縮することができ、検出感度を向上させることができる。さらには、捕捉分子と小胞とを接触させた後、支持体を洗浄することにより非特異的に結合した小胞を除き、バックグラウンドノイズを下げることが可能となる。本発明によれば、例えば小胞が微量、例えば試料に含まれる小胞の数が１×１０^１０未満（例えば、１×１０^６以上１×１０^１０未満）であっても、小胞上の生体分子を定量することができる。本実施形態の一側面において、上記小胞に存在する生体分子の分析方法は、小胞の密度（単位体積あたりの小胞の数）を定量できる、と把握することもできる。すなわち、上記小胞に存在する生体分子の分析方法は、小胞の密度が１×１０^１０／１００μｌ未満（例えば、１×１０^６／１００μｌ以上１×１０^１０／１００μｌ未満）であっても、小胞上の生体分子を定量することができる。捕捉分子は、小胞に存在していることが知られている生体分子に結合する分子であることが好ましい。捕捉分子はタンパク質（抗体、レクチン等）であってもよく、核酸分子（アプタマー、相補配列を有する核酸分子等）であってもよい。捕捉分子は小胞表面に発現しているタンパク質、例えばエクソソームマーカー、微小小胞体マーカー、アポトーシス小体マーカー、その他の膜タンパク質に結合する分子であってよい。捕捉分子は疾患特異的マーカーに結合する分子であってもよい。捕捉分子は、好ましくは細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子である。

捕捉分子がエクソソームマーカーに結合する分子であり、検出分子が任意の生体分子に結合する分子であるとき、各試料中のエクソソームを支持体に捕捉したうえで、エクソソームに存在する任意の生体分子の発現を定量することができる。捕捉分子が微小小胞体マーカー、アポトーシス小体マーカー等の細胞外小胞のマーカーに結合する分子であり、検出分子が任意の生体分子に結合する分子であるとき、微小小胞体マーカー、アポトーシス小体マーカー等の細胞外小胞に存在する任意の生体分子の発現を定量することができる。

捕捉分子が疾患特異的マーカーに結合する分子であるとき、疾患特異的マーカーを有する小胞が支持体上に捕捉される。検出分子の少なくとも１つが各小胞のマーカーに結合する分子であるとき、疾患特異的マーカーが各小胞にどの程度存在するかを定量することができる。捕捉分子が疾患特異的マーカーに結合する分子であるとき、小胞のマーカーに結合する分子を捕捉分子として用いる場合と比べて、小胞上の疾患特異的マーカーの検出の精度が向上する場合がある。

エクソソームマーカーとしてはＡｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ等が挙げられ、テトラスパニンはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等を含む。微小小胞体マーカーとしてはインテグリン、セレクチン、ＣＤ４０等が挙げられる。アポトーシス小体マーカーとしてはフォスファチジルセリン、アネキシンＶ等が挙げられる。疾患特異的マーカーとしてはＣａｒｃｉｎｏｍａ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９（ＣＡ１９－９）等が挙げられる。捕捉分子は、これらのタンパク質を認識する抗体であってよい。エクソソームをより選択的に捕捉する場合、捕捉分子は好ましくは抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体からなる群より選択される。

支持体はマルチウェルプレートまたはビーズであってよい。支持体としてマルチウェルプレート（例えば９６ウェルプレート）を用いた場合、分析のスループット性を向上させることができる。支持体に捕捉分子を固相化する方法は特に限定されず、化学結合、水素結合、イオン結合、錯体形成、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、立体選択的相互作用等によって固相化すればよい。捕捉分子が抗体である場合、抗体のＦｃドメインと部位特異的に結合するリンカー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ等）が固定化された支持体を用いることにより、支持体に捕捉分子を固相化することもできる。

例えば、捕捉分子を含む水溶液をマルチウェルプレートに添加することで、上記捕捉分子の固相化を行う場合、上記水溶液における上記捕捉分子の濃度は、１～１０μｇ／ｍＬであってもよく、０．１～１μｇ／ｍＬであってもよい。

上記捕捉分子を溶解する水溶液は、緩衝液であることが好ましい。上記緩衝液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、酢酸緩衝液酢酸、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。上記水溶液は、塩が含まれていてもよい。上記水溶液に含まれる塩の濃度は、１５０ｍＭ以下であることが好ましく、１０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１５ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが更に好ましい。上述の塩としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）等が挙げられる。上記水溶液のｐＨは、捕捉分子が安定的に存在できれば特に制限されないが、例えば、６以上１０以下であることが好ましい。

本実施形態の一側面において、上記捕捉分子は、２０℃以上３０℃以下の環境において上記マルチウェルプレート（支持体）と接触させることが好ましい。換言すれば、上記水溶液の温度は、２０℃以上３０℃以下であることが好ましい。

本実施形態の一側面において、捕捉分子と支持体とを接触させる時間は、例えば、０．５時間以上３時間以下であってもよいし、１時間以上２時間以下であってもよい。

本実施形態の他の側面において、捕捉分子が固相化された支持体は、ＰＢＳ液等で洗浄して、余剰の捕捉分子を除去してもよい。また、捕捉分子が固相化された支持体は、ブロッキング剤でブロッキング処理を行ってもよい。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡ、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２（日油株式会社製）、カゼイン等が挙げられる。上記ブロッキング剤の濃度は、１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、２重量％以上５重量％以下であることがより好ましい。

支持体がマルチウェルプレートであるとき、捕捉分子が固相化されたウェル中に小胞を含む試料を添加して、捕捉分子と小胞とを接触させればよい。支持体がビーズであるとき、捕捉分子が固相化されたビーズまたはこれを含む懸濁液に小胞を含む試料を添加および撹拌して、捕捉分子と小胞とを接触させればよい。支持体がカラムに備えられた充填剤であるとき、小胞を含む試料をカラムに流し込めばよい。捕捉分子と小胞とを接触させた後、支持体を洗浄してもよい。洗浄により、結合しなかった小胞および非特異的に結合した小胞を除くことができる。

１つの支持体（例えばマルチウェルプレートの１ウェル）上に２種以上の捕捉分子が固相化されていてもよく、１つの支持体上に１種の捕捉分子が固相化されてもよい。一態様として、１種の捕捉分子を１つの支持体に固相し、他の１つの捕捉分子を他の支持体に固相し、同じ試料をそれぞれの捕捉分子に接触させてそれぞれの支持体上に小胞を捕捉してもよい。

本実施形態において、支持体上に固相化されている捕捉分子の量は、０．０１～２μｇであることが好ましく、０．０１～１μｇであることがより好ましく、０．０１～０．５μｇであることが更に好ましく、０．０１～０．１μｇであることが更により好ましい。

小胞は、培養細胞、培養組織またはその培養上清に由来してもよいが、好ましくは生体に由来する。生体に由来する試料（生体試料）は、被検体から得た血液であってよく、生体組織、尿、糞便、汗、唾液、リンパ液、羊水、母乳、胸水、腹水、脳脊髄液、涙等であってもよい。血液は、全血であってもよいが、好ましくは血漿または血清である。試料は、生理食塩水、緩衝液等で希釈されてもよい。生体試料の採取は、生体試料の種類に応じ、適宜公知の方法で行えばよい。被検体はヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。小胞が生体に由来するとき、生体内の小胞に存在する生体分子の種類および量を測定することができる。

小胞を含む試料は、適宜精製または前処理されてもよく、ろ過、遠心分離、超遠心分離、アフィニティ分離、透析、沈殿処理等の操作を行ってもよい。小胞を含む試料は、小胞の精製画分であってもよく、エクソソームの精製画分であってもよい。小胞を含む試料がエクソソームの精製画分であるとき、試料中の夾雑物を減らし、測定の精度を向上させることができる。エクソソームの精製は、市販の精製キット、超遠心分離、密度勾配遠心、サイズ除去クロマトグラフィー、フィルター処理等の公知の方法によって行うことができる。一方で、本発明に係る方法によれば、超遠心分離などの小胞の精製を行わなくても、小胞を含む試料から小胞を選択的に捕捉および濃縮し、小胞に含まれる生体分子を定量することが可能である。

＜第１金属粒子で標識された第１検出分子と小胞とを接触させる工程および第２金属粒子で標識された第２検出分子と小胞とを接触させる工程＞
第１金属粒子で標識された第１検出分子と小胞とを接触させる工程および第２金属粒子で標識された第２検出分子と小胞とを接触させる工程について説明する。これらの工程によって、小胞に第１金属粒子および第２金属粒子が結合する。第１検出分子と小胞とを接触させる工程および第２検出分子と小胞とを接触させる工程は、順に行われてもよいし、同時に行われてもよい。すなわち、支持体上の小胞に、第１検出分子と第２検出分子とを順に接触させてもよく、第１検出分子と第２検出分子とを予め混合して支持体上の小胞に接触させてもよい。検出分子と小胞との接触後に、支持体を洗浄してもよい。洗浄により、過剰な検出分子および非特異的に結合した検出分子を除くことができる。

本発明においては少なくとも２種の検出分子が使用される。検出分子は３種以上、４種以上、５種以上または１０種以上が使用されてもよく、５０種以下が使用されてもよい。３種以上の検出分子が使用される場合、第３以降の検出分子は、第１検出分子または第２検出分子と同時に小胞に接触させてもよいし、第１検出分子を小胞に接触させる工程または第２検出分子を小胞に接触させる工程とは別の工程で小胞に接触させてもよい。

本発明においては、検出分子と小胞とを接触させる工程と、支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させる上記の工程とは、どちらを先に行ってもよい。捕捉分子と小胞とを接触させる工程を先に行う場合は、例えば小胞を含む試料を支持体に添加し、支持体に捕捉された小胞に対して検出分子を含む溶液を添加すればよい。小胞と検出分子とを接触させる工程を先に行う場合は、例えば小胞を含む試料と検出分子とを混合し、反応させた溶液を支持体に添加すればよい。１つの支持体上の小胞に、第１検出分子および第２検出分子を接触させてもよく、複数の支持体上の小胞に対して、第１検出分子および第２検出分子をそれぞれ接触させてもよい。

本明細書において、第１検出分子と第２検出分子とをあわせて検出分子ということがある。３種以上の検出分子を使用する場合も同様である。検出分子は、タンパク質、核酸、糖鎖等を含む任意の生体分子に結合する分子であってよい。検出分子は、例えば小胞に存在していることが知られている生体分子に結合する分子を含んでもよいし、小胞に存在していることが一般的ではない生体分子、または恒常的には小胞に存在していない生体分子に結合する分子を含んでもよい。生体分子がタンパク質であるとき、生体分子は膜タンパク質、細胞接着分子、受容体タンパク質、膜の融合または切り離しに関与するタンパク質、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質、疾患特異的マーカータンパク質等であってもよい。生体分子は、糖タンパク質、糖鎖であってよい。生体分子が核酸であるとき、生体分子はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ等を含んでよい。

検出分子はタンパク質（抗体、レクチン等）であってもよく、核酸分子（アプタマー、相補配列を有する核酸分子等）であってもよい。検出分子の少なくとも１つは、小胞に含まれる生体分子、例えばエクソソームマーカー、微小小胞体マーカー、アポトーシス小体マーカー等の細胞外小胞マーカー、その他の膜タンパク質、糖鎖に結合する分子であってよい。検出分子の少なくとも１つは、疾患特異的マーカーに結合する分子であってよい。検出分子の少なくとも１つ（第１検出分子および第２検出分子から選択される少なくとも１つ）は、例えば細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子であってよい。検出分子の少なくとも１つがエクソソームマーカーに結合する分子であるとき、支持体に捕捉された小胞の種類の同定、例えばエクソソームであるかどうかを判断し得る。例えば小胞がエクソソームであるかどうかは、複数のエクソソームマーカーの有無を確認することによって判断され得る。小胞上の複数のエクソソームマーカーは、捕捉分子と検出抗体の組み合わせによって検出されてもよいし、少なくとも２種の検出抗体の組み合わせによって検出されてもよい。検出分子の少なくとも１つが疾患特異的マーカーに結合する分子であるとき、支持体に捕捉された小胞に存在する疾患特異的マーカーを定量することができる。

第１検出分子と第２検出分子とは異なる分子である。第１検出分子と第２検出分子は同じ生体分子に結合する分子であってもよく、異なる生体分子に結合する分子であってもよい。検出分子のうちの１つは、捕捉分子と同じ分子であってもよい。検出分子の少なくとも１つは、捕捉分子が結合する分子と同じ分子に結合してもよい。検出分子の少なくとも１つは、捕捉抗体が結合する分子と異なる分子に結合してもよい。本実施形態の一側面において、検出分子は、捕捉分子と異なる分子であってもよい。

例えば捕捉分子が細胞外小胞の表面抗原に対する抗体であるとき、検出分子の少なくとも１つは細胞外小胞の表面抗原に対する抗体であってよく、検出分子の少なくとも１つは疾患特異的マーカータンパク質に対する抗体であってよい。例えば捕捉分子が疾患特異的マーカータンパク質に対する抗体であるとき、検出分子の少なくとも１つは細胞外小胞の表面抗原に対する抗体であってよい。

複数の検出分子は、それぞれ異なる金属粒子によって標識される。すなわち、第１金属粒子および第２金属粒子は、それぞれ異なる金属元素を含む。それぞれの金属量を同時に測定することができ、金属粒子に紐付いた検出分子の量を評価することができる。金属粒子に含まれる金属元素としては、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、銅（Ｃｕ）、テルル（Ｔｅ）、ビスマス（Ｂｉ）、鉛（Ｐｂ）、鉄（Ｆｅ）、セリウム（Ｃｅ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニオブ（Ｎｂ）、タングステン（Ｗ）、アンチモン（Ｓｂ）、スズ（Ｓｎ）、バナジウム（Ｖ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、亜鉛（Ｚｎ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、チタン（Ｔｉ）等が挙げられる。材質の安定性および合成の容易性の観点からは、検出分子の少なくとも１つは金、白金、イリジウム、パラジウム、銀および銅から選択される金属元素を含むことが好ましく、これらのいずれかの金属元素から構成されることが好ましい。本実施形態の一側面において、第１金属粒子および第２金属粒子は、それぞれ単体金属であってもよいし、２種以上の金属元素からなる合金であってもよい。

例えば、第１金属粒子が金属元素Ａ及び金属元素Ｂからなる合金であり、第２金属粒子が金属元素Ａ及び金属元素Ｃからなる合金である場合、金属元素Ａの量は第１検出分子及び第２検出分子の総量に対応し、金属元素Ｂ及び金属元素Ｃそれぞれの量は第１検出分子の量、第２検出分子の量に対応する。後述するように本実施形態に係る分析方法では、第１金属粒子及び第２金属粒子をＩＣＰ質量分析などによって同時に定量することから、第１検出分子及び第２検出分子の総量、第１検出分子の量、並びに、第２検出分子の量を同時に見積もること、さらには第１検出分子及び第２検出分子の総量を用いて第１金属粒子量及び第２金属粒子量の補正が可能になる。

金属粒子は金属ナノ粒子、金属ナノロッド、金属ナノプレートであってよい。小胞と検出分子との結合を阻害しないために金属粒子は小さいことが好ましく、金属粒子の粒子径（粒子の最大部分の長さ）は通常１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下であり、より好ましくは１００ｎｍ以下である。金属粒子が略球体であるとき、直径は５００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。当該直径の下限値は、１０ｎｍ以上であってもよい。金属粒子が金属ナノロッドであるとき、その短軸の長さは１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下または１０ｎｍ以下であってよく、長軸の長さは５００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。当該短軸の長さの下限値は、２ｎｍ以上であってもよい。当該長軸の長さの下限値は、５ｎｍ以上であってもよい。金属粒子が金属ナノプレートであるとき、その厚みは１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下または３０ｎｍ以下であってよく、平面の最大長さは５００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。当該厚みの下限値は、４ｎｍ以上であってもよい。当該平面の最大長さの下限値は、１０ｎｍ以上であってもよい。金属粒子の大きさは、例えば、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察、走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）観察、又は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行って計測してもよい。装置としては、超高分解能分析走査電子顕微鏡ＳＵ－７０（株式会社日立製作所製）が挙げられる。また、最大長径に関しては動的光散乱式粒度分布測定装置（ＤＬＳ）で測定してもよい。装置としては、ゼータ電位・粒径・分子量測定システムＥＬＳＺ－２０００ＺＳ（大塚電子株式会社製）が挙げられる。他の最大長径の測定装置として、レーザ回折式粒子径分布測定装置ＳＡＬＤ－７５００ｎａｎｏ（株式会社島津製作所製）や、ナノ粒子解析システムＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）が挙げられる。金属ナノロッドや金属ナノプレートのような異方性金ナノ粒子の最大長径を、ＳＥＭ観察写真、ＳＴＥＭ観察写真、又はＴＥＭ観察写真から計測する場合には、任意の異方性金ナノ粒子１２５個の最大長径を計測した合計１２５点のデータから、上下１０％を除いた１００点のデータを用意し、それらの平均値を求めることによって最大長径を算出してもよい。

本実施形態において、上記金属粒子の表面は、界面活性剤で被覆されていてもよい。このようにすることで、水溶液中における金属粒子の安定性が付与される。本実施形態の一側面において、水溶液中における金属粒子の安定性を向上させる観点から、上記水溶液は分散剤を含んでいてもよい。分散剤としては、例えばクエン酸ナトリウムが挙げられる。

本実施形態において、金属粒子を検出分子に標識する方法は、特に制限されず公知の方法を用いればよい。例えば、マレイミドなどの官能基を用いた化学修飾法や物理吸着法等が挙げられる。また、金属粒子で標識された検出分子は、市販品を購入してもよい。

本実施形態において、上記第１検出分子および上記第２検出分子それぞれは、塩を含有する水溶液中で上記小胞と接触させることが好ましい。当該水溶液に含まれる塩の濃度は、１５０ｍＭ以下であることが好ましく、１５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、２０ｍＭ以上１５０ｍＭ以下であることが更に好ましく、２０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが更により好ましい。上述の塩としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）等が挙げられる。この場合において、検出分子の濃度は、９６ウェルプレートを使用し、溶液１００μＬをプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ－２００ ｐｒｏ， ＴＥＣＡＮ社）で測定した際、極大吸収波長における吸光度が０．０１以上２以下であることが好ましく、０．５以上１．５以下であることがより好ましい。なお、極大吸収波長を有さない場合は吸収波長５５０ｎｍにおける吸光度を用いる。

本実施形態の一側面において、上記塩を含有する水溶液は、緩衝液であることが好ましい。上記緩衝液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、酢酸緩衝液、酢酸リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。上記塩を含有する水溶液のｐＨは、検出分子が安定的に存在できれば特に制限されないが、例えば、６以上１０以下であることがより好ましい。

また、検出分子を安定化させる観点から、上記塩を含有する水溶液は、ブロッキング剤を更に含んでいてもよい。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡ、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２（日油株式会社製）、カゼイン等が挙げられる。上記ブロッキング剤の濃度は１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、２重量％以上５重量％以下であることがより好ましい。

本実施形態の他の側面において、上記第１検出分子および上記第２検出分子それぞれは、２０℃以上３０℃以下の環境において上記小胞と接触させることが好ましい。換言すれば、上記塩を含有する水溶液の温度は、２０℃以上３０℃以下であることが好ましい。

本実施形態において、検出分子と小胞とを接触させる時間は、検出分子と小胞との相互作用が平衡状態に到達するのであれば特に制限されないが、例えば、０．５時間以上３時間以下であってもよいし、１時間以上２時間以下であってもよい。

＜小胞に結合した第１金属粒子および第２金属粒子を誘導結合プラズマ質量分析またはＩＣＰ発光分光分析によって定量する工程＞
小胞に結合した第１金属粒子および第２金属粒子を誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）またはＩＣＰ発光分光分析（ＩＣＰ－ＡＥＳ／ＩＣＰ－ＯＥＳ）によって定量する工程について説明する。検出分子を介して小胞に結合した金属粒子は、まず、王水（濃硝酸と濃塩酸との混合液）、硝酸、塩酸、硫酸等の酸によって溶解および抽出される。剥離液によって支持体から金属粒子を分離した後、剥離液に含まれる金属粒子を酸によって溶解してもよい。王水（濃塩酸：濃硝酸＝３：１）の濃度は５０％以上であってよい。金属粒子を溶解する温度は例えば２５℃以上であり、反応時間は１０分以上２４時間以下であってよい。金属粒子を高感度で検出する観点からは、金属粒子を王水によって溶解することが好ましい。

１つの支持体に第１検出分子および第２検出分子が結合しているとき、酸処理によって複数の金属元素を含む溶液が得られる。１つの支持体に第１検出分子が結合し、他の支持体に第２検出分子が結合しているとき、酸処理によって得られる金属元素を含む溶液を混合して複数の金属元素を含む溶液を得ることができる。

複数の金属元素を含む溶液はＩＣＰ－ＭＳ装置またはＩＣＰ－ＡＥＳ装置に導入される。ＩＣＰ－ＭＳの場合、溶液中の金属元素は誘導結合プラズマによってイオン化され、電場または磁場などによって分離されて、各元素の濃度が定量される。ＩＣＰ－ＡＥＳの場合、プラズマによって励起された元素から放出される光の波長と強度から、各元素の濃度が定量される。誘導結合プラズマは、アルゴンガスのプラズマであってよい。

定量された金属イオン量は、小胞に存在する生体分子の量に相関する。ＩＣＰ－ＭＳまたはＩＣＰ－ＡＥＳによれば、複数の金属イオン量を同時に定量することができるため、小胞に存在する複数の生体分子を高感度に同時定量することができる。

ＩＣＰ－ＭＳ装置としては、例えばＩＣＰＭＳ－２０３０（株式会社島津製作所製）等が挙げられる。ＩＣＰ－ＡＥＳ装置としてはＩＣＰＥ－２０３０（株式会社島津製作所製）が挙げられる。

［診断補助方法］
本発明の一態様に係る診断補助方法は、上記の分析方法によって得られた小胞に存在する生体分子の種類および量に基づいて、疾患を診断するための情報を提供する工程を含む。

本発明に係る診断補助方法によれば、疾患を診断するための情報を簡便に提供することが可能となる。本発明に係る診断補助方法は、医師による判断工程を含まず、人間を診断する方法には該当しない。本発明に係る診断補助方法は、非侵襲的な方法で疾患を診断するための情報を提供することができる。

本発明に係る診断補助方法は、上記の小胞に存在する生体分子を分析する方法および上記の分析方法によって得られた小胞に存在する生体分子の種類および量に基づいて、疾患を診断するための情報を提供する工程を含んでもよい。

生体試料から得られる小胞に存在する特定の生体分子、例えば細胞外小胞マーカー、疾患特異的マーカーおよび／またはこれらの組み合わせは、疾患の診断マーカーとして利用され得る。疾患特異的マーカーは、ｍｉＲＮＡ等の核酸、脂質、タンパク質等の生体分子であってよい。疾患としては、肺がん、大腸がん、すい臓がん、子宮頸がん、乳がん、膠芽腫等のがん、生活習慣病、精神神経疾患、免疫・アレルギー疾患、感染症等が挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実験１）
培養細胞（ＭＣＦ７）を培養した培地上清をフィルター（０．２２μｍ）でろ過した後、ろ液を超遠心（１０００００ｇ、７０ｍｉｎ）処理することで、エクソソーム画分を調製した。得られたエクソソーム画分をＰＢＳで懸濁し、１．０×１０^１０、１．０×１０^９、１．０×１０^８、１．０×１０^７、１．０×１０^６、または０（ｂｌａｎｋ）のエクソソーム粒子数（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含む試料を準備した。粒子数はＮａｎｏＳｉｇｈｔ（日本カンタム・デザイン株式会社）によって検出した。抗ＣＤ９抗体を金（Ａｕ）粒子（粒子径４０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ）および抗ＣＤ８１抗体をパラジウム（Ｐｄ）粒子（粒子径１００ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｄ－ＣＤ８１ Ａｂ）を準備した。

抗ＣＤ９抗体が固相化された各ウェルにエクソソームを含む試料を添加し、エクソソームを支持体に捕捉させた。Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ溶液およびＰｄ－ＣＤ８１ Ａｂ溶液をそれぞれ各ウェルに添加し、捕捉されたエクソソーム表面を抗体染色した。過剰な抗体は洗浄して取り除いた。各ウェルに王水を添加して、抗体を介してエクソソームに結合していた金属粒子を溶出した。金属粒子が含まれる溶液をＩＣＰ－ＭＳ（「ＩＣＰＭＳ－２０３０」株式会社島津製作所製）に供して、ＡｕイオンおよびＰｄイオンを定量した。これによってエクソソーム上の表面抗原を定量できる。

各エクソソーム粒子数でのＡｕイオン量を定量し、エクソソーム粒子数に対するＡｕイオン量をプロットすると、高い相関性でエクソソーム粒子数依存的にＡｕイオン量が増加していることが確かめられた（図１）。同様に、各エクソソーム粒子数ごとのＰｄイオン量を定量し、エクソソーム粒子数に対するＰｄイオン量をプロットすると、高い相関性でエクソソーム粒子数依存的にＰｄイオン量が増加していることが確かめられた（図２）。１０^１０未満の粒子数のエクソソームにおいて、表面抗原を高感度で定量することができた。

この方法は、様々な金属粒子で標識した様々な抗体（検出分子）によって小胞の生体分子が定量可能であることを示している。本発明に係る方法により、試料中の小胞の任意の生体分子を同時に定量できることが示唆される。

（実験２）
培養細胞（ＭＣＦ７）を培養した培地上清をフィルター（０．２２μｍ）でろ過した後、ろ液を超遠心（１０００００ｇ、７０ｍｉｎ）処理することで、エクソソーム画分を調製した。得られたエクソソーム画分をＰＢＳで懸濁し、１．０×１０^１０、１．０×１０^９、１．０×１０^８、１．０×１０^７、１．０×１０^６、または０（ｂｌａｎｋ）のエクソソーム粒子数（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含む試料をそれぞれ１００μｌ準備した。粒子数はＮａｎｏＳｉｇｈｔ（日本カンタム・デザイン株式会社）によって計測した。抗ＣＤ９抗体を金（Ａｕ）粒子（粒子径４０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ）（濃度：５３０ｎｍに対する吸光度が０．１）、抗ＣＤ６３抗体を白金（Ｐｔ）粒子（粒子径３０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、および抗ＣＤ８１抗体をパラジウム（Ｐｄ）粒子（粒子径１００ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｄ－ＣＤ８１ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、を準備した。

次に以下の手順で、９６ウェルプレートに抗ＣＤ９抗体（捕捉分子）を固相化した。まず、抗ＣＤ９抗体を含む溶液（濃度：５３０ｎｍに対する吸光度が０．１）を１つのウェルあたり１００μｌ添加し、４℃で１２時間インキュベートした。次に、各ウェルにブロッキング剤を１つのウェルあたり２００μｌ添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、抗ＣＤ９抗体が固相化された各ウェルにエクソソームを含む試料を１００μｌ添加し、エクソソームを支持体に捕捉させた。Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ溶液、Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ溶液、およびＰｄ－ＣＤ８１ Ａｂ溶液の等量混合液をそれぞれ各ウェルに１００μｌ添加し、捕捉されたエクソソーム表面を抗体染色した。前述の各金属標識抗体は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２を含む水溶液（「１５０ｍＭ ＮａＣｌ」として表記）、もしくは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２を含む水溶液（「２０ｍＭ ＮａＣｌ」として表記）にそれぞれ懸濁したものを用いた。金属標識抗体との反応後、過剰な抗体は洗浄液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液）で洗浄して取り除いた。各ウェルに王水を３００μｌ添加して、抗体を介してエクソソームに結合していた金属粒子を溶出した。前述の金属粒子が含まれる溶液を水で１８倍希釈し、ＩＣＰ－ＭＳ（「ＩＣＰＭＳ－２０３０」株式会社島津製作所製）に供して、Ａｕイオン、Ｐｔイオン、およびＰｄイオンを定量した。これによってエクソソーム上の表面抗原を定量した。

各エクソソーム粒子数でのＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄイオン量を定量し、ｂｌａｎｋでの検出イオン量に対する、各エクソソーム粒子数での検出イオン量の比率（Ｓ／Ｎ比）を算出した（表１）。１０^１０、および１０^９粒子数のエクソソーム分析において、１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で抗体反応させた場合と比較して、２０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液中で反応させた場合の方がＳ／Ｎ比が向上していた（表１）。通常、塩は抗体反応や金属粒子分散性の安定化のために使用されている。このことは、低塩濃度の水溶液中で抗体反応をさせた方が、エクソソームの質量分析において良好なデータが得られることを示している。

（実験３）
培養細胞（ＭＣＦ７）を培養した培地上清をフィルター（０．２２μｍ）でろ過した後、ろ液を超遠心（１０００００ｇ、７０ｍｉｎ）処理することで、エクソソーム画分を調製した。得られたエクソソーム画分をＰＢＳで懸濁し、１．０×１０^１０、１．０×１０^９、１．０×１０^８、１．０×１０^７、１．０×１０^６、または０（ｂｌａｎｋ）のエクソソーム粒子数（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含む試料をそれぞれ１００μｌ準備した。粒子数はＮａｎｏＳｉｇｈｔ（日本カンタム・デザイン株式会社）によって計測した。抗ＣＤ９抗体を金（Ａｕ）粒子（粒子径４０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ）（濃度：５３０ｎｍに対する吸光度が０．１）、抗ＣＤ６３抗体を白金（Ｐｔ）粒子（粒子径３０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、および抗ＣＤ８１抗体をパラジウム（Ｐｄ）粒子（粒子径１００ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｄ－ＣＤ８１ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）を準備した。

次に（実験２）と同様の手順で、９６ウェルプレートに抗ＣＤ９抗体（捕捉分子）を固相化した。その後、抗ＣＤ９抗体が固相化された各ウェルにエクソソームを含む試料を１００μｌ添加し、エクソソームを支持体に捕捉させた。Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ溶液、Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ溶液、およびＰｄ－ＣＤ８１ Ａｂ溶液の等量混合液を各ウェルに１００μｌ添加し、捕捉されたエクソソーム表面を抗体染色した。前述の各金属標識抗体は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２を含む水溶液にそれぞれ懸濁したものを用いた。金属標識抗体との反応後、過剰な抗体は洗浄液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液）で洗浄して取り除いた。各ウェルに王水を３００μｌ添加して、抗体を介してエクソソームに結合していた金属粒子を溶出した。前述の金属粒子が含まれる溶液を水で１８倍希釈し、ＩＣＰ－ＭＳ（「ＩＣＰＭＳ－２０３０」株式会社島津製作所製）に供して、Ａｕ、Ｐｔ、およびＰｄイオンを定量した。これによってエクソソーム上の表面抗原を定量した。

各エクソソーム粒子数でのＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ各イオン量を定量し、エクソソーム粒子数に対する３種イオン量をプロットすると、３種全ての金属について、高い相関性（決定係数 Ｒ２＞０．９９）でエクソソーム粒子数依存的にイオン量が増加していることが確かめられた（図３）。

（実験４）
培養細胞（ＭＣＦ７）を４８時間まで培養し、各時点（培養開始０，１２，２４，３６，４８時間後）での培地上清を回収した後、フィルター（０．２２μｍ）でろ過したサンプルを分析に供した。抗ＣＤ９抗体を金（Ａｕ）粒子（粒子径４０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ）（濃度：５３０ｎｍに対する吸光度が０．１）、抗ＣＤ６３抗体を白金（Ｐｔ）粒子（粒子径３０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、および抗ＣＤ８１抗体をパラジウム（Ｐｄ）粒子（粒子径１００ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｄ－ＣＤ８１ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、を準備した。

次に（実験２）と同様の手順で、９６ウェルプレートに抗ＣＤ９抗体（捕捉分子）を固相化した。その後、抗ＣＤ９抗体が固相化された各ウェルに前述の培地上清試料を１００μｌ添加し、エクソソームを支持体に捕捉させた。Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ、Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ、およびＰｄ－ＣＤ８１ Ａｂの等量混合液を各ウェルに１００μｌ添加し、捕捉されたエクソソーム表面を抗体染色した。前述の各金属標識抗体は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２を含む水溶液にそれぞれ懸濁したものを用いた。金属標識抗体との反応後、過剰な抗体は洗浄して取り除いた。各ウェルに王水を３００μｌ添加して、抗体を介してエクソソームに結合していた金属粒子を溶出した。金属粒子が含まれる溶液をＩＣＰ－ＭＳ（「ＩＣＰＭＳ－２０３０」株式会社島津製作所製）に供して、Ａｕ、Ｐｔ、およびＰｄイオンを定量した。これによってエクソソーム上の表面抗原を定量した。

各培養時間で回収した培地上清を前述の通りに前処理したサンプルのＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ各イオン量を定量し、各サンプルに対する３種イオン量をプロットすると、３種全ての金属について、培養時間依存的にイオン量が増加していることが確かめられた（図４）。このことは、本法を用いた細胞培養過程でのエクソソーム分泌量のモニタリングが可能であることを示唆している。

（実験５）
血清検体（１０μＬ，５０μＬ，１００μＬ）にＴｗｅｅｎ－２０を終濃度０．０５％となるように添加したサンプルを分析に供した。抗ＣＤ９抗体を金（Ａｕ）粒子（粒子径４０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ）（濃度：５３０ｎｍに対する吸光度が０．１）、抗ＣＤ６３抗体を白金（Ｐｔ）粒子（粒子径３０ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、および抗ＣＤ８１抗体をパラジウム（Ｐｄ）粒子（粒子径１００ｎｍ）で金属標識した検出分子（Ｐｄ－ＣＤ８１ Ａｂ）（濃度：５００ｎｍに対する吸光度が０．１）、を準備した。

次に（実験２）と同様の手順で、９６ウェルプレートに抗ＣＤ９抗体（捕捉分子）を固相化した。その後、抗ＣＤ９抗体が固相化された各ウェルに前述の血清検体を１０μＬ，５０μＬ，１００μＬ添加し、エクソソームを支持体に捕捉させた。Ａｕ－ＣＤ９ Ａｂ溶液、Ｐｔ－ＣＤ６３ Ａｂ溶液、およびＰｄ－ＣＤ８１ Ａｂ溶液の等量混合液を各ウェルに１００μｌ添加し、捕捉されたエクソソーム表面を抗体染色した。前述の各金属標識抗体は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、１％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｌｉｐｉｄｕｒｅ ＢＬ８０２を含む水溶液に懸濁したものを用いた。金属標識抗体との反応後、過剰な抗体は洗浄液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液）で洗浄して取り除いた。各ウェルに王水を３００μｌ添加して、抗体を介してエクソソームに結合していた金属粒子を溶出した。前述の金属粒子が含まれる溶液を水で１８倍希釈し、ＩＣＰ－ＭＳ（「ＩＣＰＭＳ－２０３０」株式会社島津製作所製）に供して、Ａｕ、Ｐｔ、およびＰｄイオンを定量した。これによってエクソソーム上の表面抗原を定量した。

各血清量の検体を前述の通りに前処理したサンプルのＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ各イオン量を定量し、各サンプルに対する３種イオン量をプロットすると、３種全ての金属について、分析サンプル量依存的にイオン量が増加していることが確かめられた（図５）。このことは、少なくとも１０μＬ以上の血清検体に対して本法が適用可能であることを示唆している。

［態様］
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

（第１項）
一態様に係る小胞に存在する生体分子の分析方法は、
支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させることと、
第１金属粒子で標識された第１検出分子と前記小胞とを接触させることと、
第２金属粒子で標識された第２検出分子と前記小胞とを接触させることと、
前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子を誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析またはＩＣＰ発光分光分析によって定量することと、
を含む。

第１項に記載の分析方法によれば、小胞に存在する複数の生体分子を同時に定量することができる。

（第２項）
第１項に記載の分析方法において、前記第１金属粒子および前記第２金属粒子はそれぞれ異なる金属元素を含む。

第２項に記載の分析方法によれば、それぞれの金属量を測定することができる。

（第３項）
第１項または第２項に記載の分析方法において、前記第１検出分子および前記第２検出分子それぞれは、塩を含有する水溶液中で前記小胞と接触させる。第３項に記載の分析方法によれば、小胞に存在する複数の生体分子を、精度良く定量することができる。

（第４項）
第１項～第３項のいずれかに記載の分析方法において、前記捕捉分子は細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子である。

第４項に記載の分析方法によれば、捕捉分子が細胞外小胞マーカーに結合するとき、細胞外小胞を支持体に捕捉することができる。捕捉分子が疾患特異的マーカーに結合するとき、疾患特異的マーカーを含む小胞が支持体に捕捉される。

（第５項）
第４項に記載の分析方法において、前記捕捉分子は抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体からなる群より選択される。

第５項に記載の分析方法によれば、エクソソームを支持体に捕捉することができる。

（第６項）
第１項～第５項のいずれかに記載の分析方法において、前記第１検出分子および前記第２検出分子から選択される少なくとも１つは、小胞に含まれる生体分子に結合する分子である。

第６項に記載の分析方法によれば、小胞に含まれる任意の分子を検出および定量することができる。

（第７項）
第６項に記載の分析方法において、前記第１検出分子および前記第２検出分子から選択される少なくとも１つは、細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子である。

第７項に記載の分析方法によれば、小胞の種類を同定することができる。また、小胞における疾患特異的マーカーの発現を定量することができる。

（第８項）
第１項～第７項のいずれかに記載の分析方法において、前記第１金属粒子および前記第２金属粒子から選択される少なくとも１つは、金、白金、イリジウム、パラジウム、銀および銅からなる群より選ばれる金属元素を含む。

第８項に記載の金属元素は安定性および合成の容易性に優れる。

（第９項）
第１項～第８項のいずれかに記載の分析方法において、前記第１金属粒子および前記第２金属粒子の粒子径は５００ｎｍ以下である。

第９項に記載の分析方法によれば、小胞と検出分子との結合を阻害しにくい。

（第１０項）
第１項～第９項のいずれかに記載の分析方法において、前記小胞は生体に由来する。

第１０項に記載の分析方法によれば、生体に由来する小胞に存在する生体分子の種類および量を測定することができる。

（第１１項）
第１項～第１０項のいずれかに記載の分析方法において、前記小胞はエクソソームである。

第１１項に記載の分析方法によれば、エクソソームに含まれる生体分子を定量でき、がんおよび生活習慣病を含む各種疾病の発見および診断に利用され得る。

（第１２項）
第１項～第１１項のいずれかに記載の分析方法において、前記支持体はマルチウェルプレートである。

第１２項に記載の分析方法によれば、分析のスループット性を向上させることができる。

（第１３項）
第１項～第１２項のいずれかに記載の分析方法において、前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子の少なくとも１つを王水によって溶解することを含む。

第１３項に記載の分析方法によれば、金属粒子を高感度で検出することができ、小胞に含まれる生体分子の検出感度を向上させることができる。

（第１４項）
一態様に係る診断補助方法は、第１項～第１３項に記載の分析方法によって得られた小胞に存在する生体分子の種類および量に基づいて、疾患を診断するための情報を提供することを含む。

第１４項に記載の診断補助方法によれば、非侵襲的な方法で疾患を診断するための情報を提供することができる。

Claims (14)

1. 支持体に固相化された捕捉分子と小胞とを接触させることと、
   第１金属粒子で標識された第１検出分子と前記小胞とを接触させることと、
   第２金属粒子で標識された第２検出分子と前記小胞とを接触させることと、
   前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子を誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析またはＩＣＰ発光分光分析によって定量することと、
   を含む小胞に存在する生体分子の分析方法であって、
   前記第１検出分子と前記小胞とを接触させること及び前記第２検出分子と前記小胞とを接触させることは、順に行われるか又は同時に行われ、
   前記第１検出分子および前記第２検出分子それぞれは、塩を含有する水溶液中で前記小胞と接触させ、
   前記水溶液に含まれる前記塩の濃度は、１５０ｍＭ以下である、方法。
2. 前記第１金属粒子および前記第２金属粒子はそれぞれ異なる金属元素を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記水溶液に含まれる前記塩の濃度は、２０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記捕捉分子は細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子である、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記捕捉分子は抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１検出分子および前記第２検出分子から選択される少なくとも１つは、前記小胞に含まれる生体分子に結合する分子である、請求項１または２に記載の方法。
7. 前記第１検出分子および前記第２検出分子から選択される少なくとも１つは、細胞外小胞マーカーおよび疾患特異的マーカーからなる群より選択されるマーカーに結合する分子である、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１金属粒子および前記第２金属粒子から選択される少なくとも１つは、金、白金、イリジウム、パラジウム、銀および銅からなる群より選ばれる金属元素を含む、請求項１または２に記載の方法。
9. 前記第１金属粒子および前記第２金属粒子の粒子径は５００ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の方法。
10. 前記小胞は生体に由来する、請求項１または２に記載の方法。
11. 前記小胞はエクソソームである、請求項１または２に記載の方法。
12. 前記支持体はマルチウェルプレートである、請求項１または２に記載の方法。
13. 前記小胞に結合した前記第１金属粒子および前記第２金属粒子の少なくとも１つを王水によって溶解することを含む、請求項１または２に記載の方法。
14. 請求項１または２に記載の方法によって得られた小胞に存在する生体分子の種類および量に基づいて、疾患を診断するための情報を提供することを含む診断補助方法。