JP7777830B2 - フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いた鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造方法 - Google Patents

フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いた鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造方法

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Description

本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、末端に炭素－炭素間二重結合を有する、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物に、更に炭素－炭素間二重結合を導入し、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造する方法に関する。また、本発明は、末端アルケン生成酵素 ＢｅｓＣの存在下、末端にアミノ基を有する第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造し、当該化合物から、更にフェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造する方法に関する。さらに、本発明は、このようにして第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造し、次いで、フェルラ酸デカルボキシラーゼの存在下、当該不飽和カルボン酸化合物から、両末端に炭素－炭素間二重結合を有する鎖状の不飽和炭化水素化合物を製造する方法に関する。
本発明はまた、これら製造方法に用いられ得る、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体、該改変体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されているベクター、及び前記ＤＮＡ又は前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前記宿主細胞を用いた前記改変体の製造方法に関する。
ブタジエン（１，３－ブタジエン）は、各種合成ゴム（ブタジエンゴム、スチレン－ブタジエンゴム、アクリロニトリル－ブタジエンゴム等）、ポリマー樹脂（ＡＢＳ樹脂、ナイロン６６等）といった様々な高分子化合物の原料として用いられるため、化学産業において極めて重要な有機化合物と言える。また、これらブタジエンを原料とする高分子化合物は、自動車用タイヤ等の工業用品だけでなく、衣料品等の生活用品にも幅広く利用されている。そのため、ブタジエンの需要は年々増加しており、その年間需要は１３００万トンとなり、また市場規模も１５０億ドルに達している。
ブタジエンは、従前より、主に石油からエチレン及びプロピレンを製造する際に副生するＣ４留分を精製することにより製造されてきた。しかしながら、石油等の化石燃料の枯渇や温室効果ガス排出による地球温暖化等の環境問題により、前述の増加の一途を辿るブタジエン需要に対応すべく、持続可能なブタジエン製造を実現する必要性が高まっている。そして、その対応策として、再生可能資源であるバイオマス資源由来物質から、酵素を利用して、ブタジエンを製造する方法の開発が盛んに行なわれている。
例えば、特許文献１においては、キシロースを原料とし、それをクロチルアルコール等に変換し得る酵素活性を有する微生物を用い、ブタジエンを製造する方法が開示されている。また、特許文献２においては、キシロースを原料とし、それを２，３－ブタンジオールに変換し得る酵素活性を有する微生物を用い、ブタジエンを製造する方法が開示されている。このように、酵素を利用したブタジエン等の不飽和炭化水素化合物の製造は多々試みられている。
さらに、本発明者らによって、フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）が関与する、フェルラ酸の脱炭酸反応による４－ビニルグアイヤコール（４ＶＧ）の生成（非特許文献１ 参照）を、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物の製造に応用できることが明らかとなっている（特許文献３）。すなわち、ＦＤＣを用い、ムコン酸等から、下記式に示すような脱炭酸反応を経て、ブタジエン等を製造できることが、本発明者らによって見出されている。
しかしながら、ムコン酸は高価であるため、実用化の弊害になることが懸念される。そのため、酵素を用いて、ブタジエン等の炭素－炭素間二重結合を少なくとも２つ有する不飽和化合物をより安価に製造する方法を開発することが望ましい。
特開２０１４－３０３７６号公報 特開２０１５－２２８８０４号公報 国際公開第２０１９－０２２０８３号
Ｋａｒｌ Ａ．Ｐ．Ｐａｙｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１５年、５２２巻、７５５７号、４９７～５０１ページ Ｊ Ａ Ｍａｒｃｈａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１９年、５６７巻、７７４８号、４２０～４２４ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、酵素を用いて、炭素－炭素間二重結合を少なくとも２つ有する不飽和化合物を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ムコン酸の代わりにＬ－リジン（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）を出発材料として、ブタジエンの生成に至る下記反応スキームを構想した。なお、Ｌ－リジンは比較的安価に入手することが可能であるため、ブタジエン製造におけるコストを抑えることが可能となる。
さらに、本発明者らは、Ｌ－リジンからＬ－アリルグリシン（Ｌ－ａｌｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）の製造においては、非特許文献２に開示されている酵素、ＢｅｓＣを利用し得ることを着想した。当該酵素は、末端のプロピルアミノ基を酸化することにより、当該基中の炭素－炭素間結合を開裂し、末端に炭素－炭素間二重結合を形成させる反応を、触媒する活性を有する。また、ペンタジエン酸（ｐｅｎｔａｄｉｅｎｏａｔｅ）からブタジエン（ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）の製造においては、上述のとおり本発明者らによって明らかにされているＦＤＣを利用し得ることを着想した（特許文献３）。
しかしながら、Ｌ－アリルグリシンからペンタジエン酸の生成に関与する酵素の報告は見出せなかった。そこで、本発明者らは、下記フェニルアラニンからケイ皮酸の生成に関与するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）がこれに利用し得るのではないかと考えた。
そして、実際に、ＢｅｓＣとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＰＡＬ（ＡｔＰＡＬ）を高発現させた大腸菌を培養し、それを処理して得た細胞溶解液と、ＦＤＣを高発現させた大腸菌を培養し、それを処理して得た細胞溶解液とを混合し、Ｌ－リジンを添加したところ、ブタジエンが生成されることが明らかになった。
さらに、由来が異なるＰＡＬ（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ由来のＰＡＬ（ＡｖＰＡＬ）、Ｐｌａｇｉｏｃｈａｓｍａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＰＡＬ（ＰａＰＡＬ））についても前記同様にブタジエン生成について検証した。その結果、ＡｖＰＡＬ又はＰａＰＡＬを用いても、前記ＡｔＰＡＬ同様にブタジエンを生成できることが明らかになった。さらに、これらの中では、ＡｖＰＡＬが際立って高いペンタジエン酸の生成に関する触媒活性を有していることも本発明者らは見出した。
さらにまた、このＡｖＰＡＬについて、多種のアミノ酸置換を導入し、ブタジエン生成能について検証した結果、以下の（１）～（５）のいずれかのアミノ酸置換において、導入前の野生型と比較して、ブタジエン生産量が向上することも見出し、本発明を完成するに至った。
（１）１０８位のロイシンを、メチオニン、フェニルアラニン又はバリンに置換、
（２）１０７位のフェニルアラニンを、トリプトファンに置換、
（３）２１９位のロイシンを、イソロイシンに置換、
（４）２２３位のアスパラギンを、イソロイシンに置換、
（５）１０４位のロイシンを、アラニンに置換。
すなわち、本発明は、ＰＡＬの存在下、末端に炭素－炭素間二重結合を有する、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物に、更に炭素－炭素間二重結合を導入し、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造する方法に関する。また、本発明は、ＢｅｓＣの存在下、末端にアミノ基を有する第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造し、当該化合物から、更にフェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造する方法に関する。さらにまた、本発明は、このようにして第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造し、当該不飽和カルボン酸化合物から、ＰＤＣの存在下、両末端に炭素－炭素間二重結合を有する鎖状の不飽和炭化水素化合物を製造する方法に関する。
本発明はまた、これら製造方法に用いられ得る、ＰＡＬ変異体、該変異体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが挿入されているベクター、及び前記ＤＮＡ又は前記ベクターが導入された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前記宿主細胞を用いた前記変異体の製造方法に関する。
より具体的に、本発明は、以下を提供するものである。
［１］ フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、下記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、第１のアミノ基を脱離させ、第２の炭素－炭素間二重結合を形成させる工程を含む、下記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する方法
［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
［２］ 末端アルケン生成酵素 ＢｅｓＣの存在下、第１のアミノ基と末端に第２のアミノ基とを有する、下記式（１）で表される鎖状のカルボン酸化合物又はその幾何異性体から、第２のアミノ基及びメチレン基を脱離させ、前記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する工程を含み、当該化合物又はその幾何異性体から、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する、［１］に記載の方法
［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
［３］ ［１］又は［２］に記載の方法により、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造し、フェルラ酸デカルボキシラーゼの存在下、前記不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、カルボキシル基を脱離させる工程を含む、下記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体を製造する方法
［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
［４］ 前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１の特徴を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼである、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載の方法
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンである、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンである、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンである。
［５］ 下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されている、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換。
［６］ ［５］に記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ。
［７］ ［６］に記載のＤＮＡを含むベクター。
［８］ ［６］に記載のＤＮＡ又は［７］に記載のベクターが導入された宿主細胞。
［９］ ［８］に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体の製造方法。
［１０］ フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体の製造方法であって、フェニルアラニンアンモニアリアーゼにおいて、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換を導入する工程を含む、方法
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸を、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸を、トリプトファンに置換、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸を、イソロイシンに置換、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸を、イソロイシンに置換、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸を、アラニンに置換。
本発明によれば、酵素を用いて、炭素－炭素間二重結合を少なくとも２つ有する不飽和化合物を製造する方法を提供することが可能となる。例えば、本発明によって、比較的安価なＬ－リジンを出発材料として、ブタジエンを製造することも可能となる。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、又はＰｌａｇｉｏｃｈａｓｍａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｔＰＡＬ、ＡｖＰＡＬ、又はＰａＰＡＬ）と、フェルラ酸デカルボキシラーゼとの混合溶液に、フェニルアラニンを添加し、生成されたスチレン量を測定した結果を示す、グラフである。 ＡｔＰＡＬ、ＡｖＰＡＬ、又はＰａＰＡＬと、フェルラ酸デカルボキシラーゼとの混合溶液に、アリルグリシンを添加し、生成されたブタジエン量を測定した結果を示す、グラフである。
後述の実施例に示すとおり、本発明者らによって、下記のとおり、３種の酵素を用いた三段階の反応によって、ブタジエン等の炭素－炭素間二重結合を両末端に有する不飽和炭化水素化合物を製造できることが明らかになった。
特に、Ｌ－アリルグリシンからペンタジエン酸の生成に関与する酵素として、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が利用できることを、本発明者らが明らかにした。
したがって、本発明は、下記反応工程を含む、炭素－炭素間二重結合を少なくとも２つ有する鎖状の不飽和化合物を製造する方法に関する。
＜第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造方法＞
前記のとおり、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、前記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体（第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物）から、第１のアミノ基を脱離させ、第２の炭素－炭素間二重結合を形成させる工程を含む、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体（第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物）を製造する方法を、提供するものである。
本発明において、前記反応において生成される「第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」としては、末端の炭素－炭素間二重結合を含む、少なくとも２つの炭素－炭素間二重結合を有する、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を意味する。
本発明において、各化学式中の（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示す。なお、「炭素数０の直鎖状炭化水素基」とは、各化学式で表される化合物、並びにそれらの幾何異性体において（Ａ）を介して結合している炭素原子どうしが、（Ａ）を介さずに直接結合していることを意味する。さらに、置換されていてもよい直鎖状炭化水素基の炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を少なくとも１つ形成してもよい。また、（Ａ）において炭化水素基が有していてもよい置換基とは、例えば、炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基が挙げられる。各化学式中の（Ａ）として、好ましくは、炭素数０の直鎖状炭化水素基である。
本発明において、各化学式中のＲ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す。「炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｉ－ペンチル基が挙げられる。「炭素数１～５の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基」としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｉ－ブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｉ－ペンチルオキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、１，２－ジメチル－プロポキシ基が挙げられる。各化学式中のＲ１として、好ましくは、水素原子である。Ｒ２として、好ましくは、水素原子又はメチル基である。
各化学式中の（Ａ）、Ｒ１及びＲ２の組み合わせとして、好ましくは各々、炭素数０の直鎖状炭化水素基、水素基及び水素基、又は、炭素数０の直鎖状炭化水素基、水素基及びメチル基である。また、本発明において、「第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」としては、好ましくは、ペンタジエン酸、４－メチルペンタジエン酸、３－メチルペンタジエン酸である。
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を脱アミノさせる条件については、当該脱アミノが促進され、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
例えば、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼと、その基質である第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物が添加される反応液としては、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ６～８の緩衝液が挙げられ、より好ましくはｐＨ６～７の塩化カリウム及びリン酸ナトリウムを含む緩衝液が挙げられる。
また、反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。さらに、反応時間としては、前記不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
また、生成される第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物は、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」とは、ＥＣ番号：４．３．１．２４として登録されている酵素であり、フェニルアラニンを基質とし、ケイ皮酸とアンモニアを生成する反応を、触媒する酵素を意味する。また、ＰＡＬ、チラーゼ、フェニルアラニンデアミナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、Ｌ－チロシンアンモニアリアーゼ、フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ、Ｌ－フェニルアラニンアンモニアリアーゼとも称される酵素である。
後述の実施例に示すとおり、その由来を問わず、上述の第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造に関与し得る。したがって、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼとしては、特に制限はなく、様々な生物由来のものを用いることができる。例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの由来としては、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｌａｇｉｏｃｈａｓｍａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ、Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ、Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍが挙げられる。これらの中で、後述の実施例に示すとおり、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性がより高いという観点から、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）が好ましい。
また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との同一性が、１５％以上（例えば、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上）であることが好ましく、２０％以上（例えば、３０％以上、４０％以上）であることがより好ましく、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることがさらに好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。なお、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との「同一性」とは、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼのアミノ酸総数に対する、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼと配列番号：２に記載のアミノ酸配列と一致したアミノ酸数の割合（％）を意味する。
また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼには、フェニルアラニンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～２００個、好ましくは２～１５０個、より好ましくは２～１００個、さらに好ましくは２～７０個、より好ましくは２～５０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
さらに、後述の実施例に示すとおり、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１の特徴を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであることが好ましい。
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン又はバリンである、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンである、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンである。
なお、本発明において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼに関し、「対応する部位」とは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と、他種に由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ等のアミノ酸配列とを整列させた際に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における１０８位のロイシン、１０７位のフェニルアラニン、１０４位のロイシン、２１９位のロイシン及び２２３位のアスパラギンの各々と同列になる部位のことである。
また、前記（１）～（５）の特徴に関し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニン、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファン、及び、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸がフェニルアラニンのうちの少なくとも１の特徴を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであることが好ましく、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸がメチオニン及び配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸がトリプトファンのうちの少なくとも１の特徴を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであることがより好ましい。
さらにまた、このような各部位において特定のアミノ酸を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、野生型のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってもよく、また前記（１）～（５）のうちの少なくとも１の特徴を有するように、アミノ酸置換が導入された、フェニルアラニンアンモニアリアーゼの変異体であってもよい。
かかる変異体としては、より具体的に、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかが挙げられる。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入され、更に、前記部位以外の１若しくは数個の部位にて、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体。
置換、欠失、付加、及び／又は挿入されている「複数」のアミノ酸、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との「同一性」については、それらの好適な態様（範囲）含め、上述のとおりである。また、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ変異体は、天然又は非天然（人工的）に生じるものであってもよい。すなわち、人工的にアミノ酸置換等が導入された、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体も含まれる。
なお、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、又は、その天然若しくは非天然の変異体が、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、公知の手法（例えば、クロマトグラフィー質量分析）により、生成される当該不飽和カルボン酸化合物の量を直接測定することにより判定することができる。
また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼのアミノ末端及びカルボキシル末端のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡに、他のタンパク質をコードするＤＮＡの読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼの精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼの検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン－アビジン間結合が挙げられる。また、このようにして化学的に付加される「他の化合物」としては、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼの検出を容易にする目的の場合には、例えば、Ｃｙ３、ローダミン等の蛍光色素が好適に用いられる。
また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、保存剤が挙げられる。
＜第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造を介した、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造方法＞
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、上述の第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物製造の原料となる、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物も、下記反応に示すとおり、生成できることを見出している。
すなわち、酵素 ＢｅｓＣを用いることによって、前記式（１）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体（第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物）の末端のプロピルアミノ基を酸化することにより、当該基中の炭素－炭素間結合を開裂し、末端に炭素－炭素間二重結合を形成させることによって、前記式（２）で表される第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造できることを、本発明者らは見出している。したがって、本発明は、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造を介した、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の製造方法の態様もとり得る。
本発明において、「第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」としては、第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、前記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を意味する。また、それを生成するための原料となる「第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」としては、第１のアミノ基と末端に第２のアミノ基とを有する、前記式（１）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を意味する。
これら化合物において（Ａ）及びＲ１については、それらの好適な態様を含め、上述のとおりであるが、「第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」として、好ましくは、Ｌ－アリルグリシン、Ｌ－（２－メチルアリル）グリシン、Ｌ－（３－メチルアリル）グリシンである。「第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物」として、好ましくは、Ｌ－リジン、４－メチルリジン、３－メチルリジンである。
本発明にかかるＢｅｓＣの存在下、第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の末端に炭素－炭素間二重結合を形成させる条件については、当該二重結合の形成が促進され、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
例えば、本発明にかかるＢｅｓＣと、その基質である第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物が添加される反応液としては、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ６～８の緩衝液が挙げられ、より好ましくはｐＨ６～７の塩化カリウム及びリン酸ナトリウムを含む緩衝液が挙げられる。さらに、前記反応をより促進し易くなるという観点から、硫酸鉄が含まれていることが好ましい。
反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。さらに、反応時間としては、前記不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
また、生成される第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物は、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
また、原料となる第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物は、後述の実施例において示すように、市販の製品として購入することができる。また、当業者であれば、公知の合成方法（例えば、発酵法によるＬ－リジンの製造法（ＪＰＨ０５３０９８５Ａ）に記載の方法）を適宜参酌しながら、合成することもできる。
（ＢｅｓＣ）
「ＢｅｓＣ」とは、β－エチニルセリン生合成（Ｂｅｓ）に関する１の酵素である。当該酵素は、末端のプロピルアミノ基を酸化することにより、当該基中の炭素－炭素間結合を開裂し、末端に炭素－炭素間二重結合を形成させる反応を、触媒する活性を有する、末端アルケン生成酵素である（非特許文献２）。
ＢｅｓＣの由来としては、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の生成を促進する触媒活性を有する限り、特に制限はなく、様々な生物由来のものを用いることができる。例えば、ＢｅｓＣの由来としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａが挙げられる。これらの中で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のＢｅｓＣ（配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるＢｅｓＣ）が好ましい。
また、本発明にかかるＢｅｓＣは、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列との同一性が、１５％以上（例えば、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上）であることが好ましく、２０％以上（例えば、３０％以上、４０％以上）であることがより好ましく、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることがさらに好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。なお、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列との「同一性」とは、本発明にかかるＢｅｓＣのアミノ酸総数に対する、本発明にかかるＢｅｓＣと配列番号：１１に記載のアミノ酸配列と一致したアミノ酸数の割合（％）を意味する。
また、本発明にかかるＢｅｓＣは、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列に、天然又は非天然（人工的）に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明にかかるＢｅｓＣには、ＢｅｓＣのアミノ酸配列（配列番号：１１に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～８０個、好ましくは２～７０個、より好ましくは２～６０個、さらに好ましくは２～５０個、より好ましくは２～４０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。
なお、ＢｅｓＣ、又は、その天然若しくは非天然の変異体が、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、公知の手法（例えば、クロマトグラフィー質量分析）により、生成される当該不飽和カルボン酸化合物の量を直接測定することにより判定することができる。
また、本発明にかかるＢｅｓＣは、上述の本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ同様に、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。さらにまた、本発明にかかるＢｅｓＣは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ同様に、他の成分と混合して用いてもよい。
＜鎖状の不飽和炭化水素化合物の製造方法＞
後述の実施例に示すとおり、本発明者らは、上述の第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から、両末端に炭素－炭素間二重結合を有する鎖状の不飽和炭化水素化合物を、生成できることも見出している。
すなわち、上述のとおり、フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いることによって、下記式（２）で表される第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から、下記式（３）で表される第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を製造する工程と、当該不飽和カルボン酸化合物から、フェルラ酸デカルボキシラーゼを用いることによって、カルボキシル基を脱離させることによって、下記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体（以下、単に「鎖状の不飽和炭化水素化合物」とも称する）を製造する工程とを含む、下記に示す製造方法の態様もとり得る。
本発明において、前記反応において生成される「鎖状の不飽和炭化水素化合物」としては、両末端に炭素－炭素間二重結合を有する、前記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体を意味する。
当該化合物において（Ａ）及びＲ１については、それらの好適な態様含め、上述のとおりであるが、「鎖状の不飽和炭化水素化合物」として、好ましくは、ブタジエン、イソプレンである。
本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼの存在下、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を脱炭酸させる条件については、当該脱炭酸が促進され、不飽和炭化水素化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
例えば、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼと、その基質である不飽和炭化水素ジカルボン酸化合物が添加される反応液としては、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ６～８の緩衝液が挙げられ、より好ましくはｐＨ６～７の塩化カリウム及びリン酸ナトリウムを含む緩衝液が挙げられる。さらに、前記反応をより促進し易くなるという観点から、プレニル化されたフラビンモノヌクレオチド（ｐｒＦＭＮ）又はそのアイソマー（ｐｒＦＭＮｋｅｔｉｍｉｎｅ、ｐｒＦＭＮｉｍｉｎｉｕ、これらｐｒＦＭＮ及びそのアイソマーについては、非特許文献１参照のほど）が含まれていることが好ましい。
また、反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。さらに、反応時間としては、前記不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
また、このような条件にて生成される鎖状の不飽和炭化水素化合物は、大概気化し易いため、揮発性ガスの公知の回収、精製方法により採取することができる。かかる採取方法としては、ガスストリッピング、分留、吸着、脱着、パーベーパレーション、固相に吸着させた不飽和炭化水素化合物の熱若しくは真空による固相からの脱着、溶媒による抽出、又はクロマトグラフィー（例えば、ガスクロマトグラフィー）等が挙げられる。また、生成される不飽和炭化水素化合物が液体である場合にも、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
（フェルラ酸デカルボキシラーゼ）
「フェルラ酸デカルボキシラーゼ」とは、ＥＣ番号：４．１．１．１０２として登録されている酵素であり、通常、フェルラ酸を脱炭酸して４－ビニルグアイヤコール（４ＶＧ）を生成する反応を、触媒する酵素を意味する。
本発明において、「フェルラ酸デカルボキシラーゼ」は、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物からカルボキシル基を脱離させ、鎖状の不飽和炭化水素化合物を生成する反応を、触媒する活性を有するものであれば、特に制限はなく、様々な生物由来のものを用いることができる。例えば、特許文献３の表１～６に示されるような、ＵＮＩＰＲＯＴ上で「Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ」に該当するタンパク質が挙げられる。また、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼとして、好ましくは、サッカロミケス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼ、コウジカビ由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ：Ａ２ＱＨＥ５等）が挙げられ、より好ましくはサッカロミケス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼが挙げられる。なお、「サッカロミケス」とは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミケス）属に属する細菌を意味し、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｕｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｕｌｄｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｉｏｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｔｉｎｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｚｏｎａｔｕｓが挙げられる。
サッカロミケス由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼとして、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＡＴＣＣ ２０４５０８／Ｓ２８８ｃ株）（パン酵母）由来のＦＤＣ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ：Ｑ０３０３４、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるフェルラ酸デカルボキシラーゼ）の他、ＵＮＩＰＲＯＴ上で「Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ」に該当するサッカロミケス由来のタンパク質が挙げられ、より具体的には、下記表１に記載のフェルラ酸デカルボキシラーゼが挙げられる。なお、自然界においてヌクレオチド配列が変異することにより、タンパク質のアミノ酸配列の変化が生じ得ることは理解されたい。
また、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼは、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列との同一性が、１５％以上（例えば、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上）であることが好ましく、２０％以上（例えば、３０％以上、４０％以上）であることがより好ましく、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることがさらに好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。なお、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列との「同一性」とは、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸総数に対する、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼと配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と一致したアミノ酸数の割合（％）を意味する。
また、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼは、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼには、フェルラ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列（配列番号：１３に記載のアミノ酸配列等）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～１５０個、好ましくは２～１００個、より好ましくは２～８０個、さらに好ましくは２～５０個、より好ましくは２～３０個、さらに好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、２個）である。また、かかるフェルラ酸デカルボキシラーゼ変異体は、天然又は非天然（人工的）に生じるものであってもよい。すなわち、人工的にアミノ酸置換等が導入された、フェルラ酸デカルボキシラーゼ改変体も含まれる。
なお、フェルラ酸デカルボキシラーゼ、又は、その天然若しくは非天然の変異体が、鎖状の不飽和炭化水素化合物を生成する触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、例えば、後述の実施例に示すとおり、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）にて、不飽和炭化水素化合物の量を直接測定することにより判定することができる。
また、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼは、上述の本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ同様に、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。さらにまた、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ同様に、他の成分と混合して用いてもよい。
＜本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを有するベクター＞
次に、本発明にかかる酵素（本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、本発明にかかるＢｅｓＣ、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼ）をコードするＤＮＡ等について説明する。かかるＤＮＡを導入することによって、宿主細胞の形質を転換し、本発明にかかる各種酵素を当該細胞において製造させること、ひいては第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物を製造させることが可能となる。
本発明にかかるＤＮＡは、上述の本発明にかかる酵素をコードする限り、天然のＤＮＡであってもよく、天然のＤＮＡに人為的に変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、各種細菌からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作製し、これを展開して、本発明にかかる酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明にかかる酵素をコードする遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、各種細菌から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
そして、このように調製したＤＮＡに、必要に応じ、上述のアミノ酸置換をコードする変異を導入することは、当業者であれば、公知の部異特異的変異導入法を利用することで行うことができる。部異特異的変異導入法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８５年、８２巻、２号、４８８～４９２ページ）、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｂｙ－ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８９年、７７巻、５１～５９ページ）が挙げられる。
また、当業者であれば、上述のアミノ酸置換が導入されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を人工的に設計し、該配列情報に基づき、自動核酸合成機を用いて、本発明にかかるＤＮＡを化学的に合成することもできる。
さらに、本発明にかかるＤＮＡは、コードする本発明にかかるデカルボキシラーゼの発現効率を宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化した本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
また、本発明においては、前述のＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターの態様もとり得る。
本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージＤＮＡが挙げられる。また、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ２２、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、宿主細胞が昆虫由来であれば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを、植物由来であればＴ－ＤＮＡ等、動物由来であればレトロウイルス、アデノウイルスベクター等の動物ウイルスベクターも、本発明にかかるベクターとして用いることもできる。また、本発明にかかるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明にかかるＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
また、本発明にかかるベクターは、前記ＤＮＡがコードする本発明にかかる酵素を宿主細胞内にて発現可能な状態で含んでなる発現ベクターの形態であってもよい。本発明にかかる「発現ベクター」は、これを宿主細胞に導入して本発明にかかる酵素を発現させるために、前記ＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含むことが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
ベクターには、本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡが１種ずつ挿入されていてもよく、また複数種のＤＮＡを１のベクターに挿入してもよい。ベクターに複数種のＤＮＡを挿入する場合において、一つのベクターに複数種のＤＮＡが挿入される場合、これらのＤＮＡはオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１又は複数の遺伝子から構成される核酸配列単位である。
本発明において、かかるベクターの態様としては、
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクター、
本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクターとの組み合わせ、
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクターとの組み合わせ、又は
本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが挿入されているベクターとの組み合わせが、挙げられる。
また、本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡとが挿入されているベクター、
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼとが挿入されているベクター、又は
本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼとが挿入されているベクターも、挙げることができる。
また、本発明にかかるＤＮＡ又はベクターは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
＜第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤＞
上述のとおり、本発明にかかる酵素、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを用いることにより、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進することが可能となる。
したがって、本発明は、本発明にかかる酵素、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤を提供する。
より具体的には、以下の態様が挙げられる
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるＢｅｓＣ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含む、第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡとが挿入されているベクターを含む、第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含む、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡとが挿入されているベクターを含む、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるＢｅｓＣ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含む、第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤、
本発明にかかるＢｅｓＣをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするＤＮＡと、本発明にかかるフェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡとが挿入されているベクターを含む、第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤。
このような剤としては、本発明にかかる酵素等を含むものであれば良いが、他の成分と混合して用いてもよい。かかる他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
また、本発明は、このような剤を含むキットをも提供することができる。本発明のキットにおいて、上記剤は、本発明にかかるＤＮＡ等が導入され、形質転換された、後述の宿主細胞の態様にて含まれていてもよい。さらに、このような剤の他、各種基質（第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物）、本発明にかかるＤＮＡ等を導入するための宿主細胞、該宿主細胞を培養するための培地、及びそれらの使用説明書等が、本発明のキットに含まれていてもよい。また、このような使用説明書は、本発明の剤等を上述の第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の製造方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の製造方法の実験手法や実験条件、及び本発明の剤等に関する情報（例えば、ベクターのヌクレオチド配列等が示されているベクターマップ等の情報、本発明にかかる酵素の配列情報、宿主細胞の由来、性質、当該宿主細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
＜本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡ等が導入された宿主細胞＞
次に、本発明にかかるＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞について説明する。前述のＤＮＡ又はベクターの導入によって形質転換された宿主細胞を用いれば、本発明にかかる酵素を製造することが可能となり、ひいては、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物を製造させることも可能となる。
本発明にかかるＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は特に限定されず、例えば、微生物（大腸菌、出芽酵母、分裂酵母、枯草菌、放線菌、糸状菌等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、比較的安価な培地にて、短時間にて高い増殖性を示し、ひいては生産性高い、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の製造に寄与し得るという観点から、微生物を宿主細胞として利用することが好ましく、大腸菌を利用することがより好ましい。
また、本発明にかかるＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のプレニル化を誘導し、鎖状の不飽和炭化水素化合物の生産性向上に寄与するｐｒＦＭＮ又はそのアイソマーを産生するという観点から、フラビンプレニルトランスフェラーゼを保持する細胞であることが好ましい。
また、本発明にかかるＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は、扱いが容易であり、毒性タンパク質の発現が可能であるとの観点から、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）細胞が好ましい。
本発明にかかるＤＮＡ又はベクターの導入も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌等の微生物への導入方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、植物細胞への導入方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞への導入方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
このようにして宿主細胞内に導入されたＤＮＡ等は、宿主細胞内において、そのゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されてもよく、相同組み換えによって保持されてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持し得る。
＜宿主細胞を用いた、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の製造方法＞
上述のとおり、本発明にかかる酵素を発現するように形質転換された宿主細胞を、培養することにより、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物を製造することができる。したがって、本発明においては、本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成された、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物を採取する工程を含む、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の製造方法も提供される。
「本発明にかかる酵素を発現するように形質転換された宿主細胞」については、上述のとおりである。また、かかる宿主細胞において発現又は保持させる、本発明にかかる酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡが挿入されたベクターの組み合わせは、上述の＜本発明にかかる酵素をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを有するベクター＞及び＜第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の生成を促進するための剤＞に示した例に基づき、出発とする材料（基質）及び最終生成物の組み合わせを鑑み、当業者であれば適宜設計変更することができる。
前記細胞の培養条件については、後述のとおりであるが、培地には、各種基質（第１の鎖状の不飽和カルボン酸化合物、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物）が添加されていることが好ましい。培養温度は、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜設計変更し得るが、通常２０～４０℃であり、好ましくは２５～３７℃である。
本発明において、「培養物」とは、宿主細胞を培地で培養することによって得られる、増殖した宿主細胞、該宿主細胞の分泌産物及び該宿主細胞の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。このような宿主細胞及び／又は培養物からの、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物の採取についても、特に制限はなく、上述の公知の回収、精製方法を用いて行うことができる。また、採取の時期としては、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜調整され、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物又は鎖状の不飽和炭化水素化合物が生成し得る時間であればよいが、通常３０分～７日であり、好ましくは１２時間～２日である。
＜本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体の製造方法＞
後述の実施例に示す通り、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ等が導入された宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞内にて当該改変体を製造することができる。
したがって、本発明は、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体の製造方法をも提供することができる。
本発明において、「宿主細胞を培養する」条件は、前記宿主細胞が本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体を製造できる条件であればよく、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。
かかる培地としては、宿主細胞が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明にかかるベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、アンピシリン）や、本発明にかかるベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。
そして、このようにして培養した宿主細胞から、「該細胞に発現したタンパク質を採取する」方法としては、例えば、宿主細胞を濾過、遠心分離等により培地から回収し、回収した宿主細胞を、細胞溶解、磨砕処理又は加圧破砕等によって処理し、さらに、限外濾過処理、塩析、硫安沈殿等の溶媒沈殿、クロマトグラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）等によって、宿主細胞において発現したタンパク質を精製、濃縮する方法が挙げられる。また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体に、前述の精製タグタンパク質が付加されている場合には、該タグタンパク質が吸着する基質を用いて精製し、採取することもできる。さらに、これらの精製、濃縮方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
また、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体は、上記生物学的合成に限定されることなく、本発明にかかるＤＮＡ等及び無細胞タンパク質合成系を用いても製造することができる。かかる無細胞タンパク質合成系としては特に制限はないが、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられる。さらに、当業者であれば、市販のペプチド合成機等を用い、本発明にかかるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体を化学的に合成することもできる。
また、本発明は、第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性が高められたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体の製造方法であって、フェニルアラニンアンモニアリアーゼにおいて、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換を導入する工程を含む、製造方法をも提供する。
（１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸を、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
（２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸を、トリプトファンに置換、
（３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸を、イソロイシンに置換、
（４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸を、イソロイシンに置換、
（５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸を、アラニンに置換。
「第２の鎖状の不飽和カルボン酸化合物から第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性が高められたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体」とは、前記アミノ酸置換が導入されることにより、前記導入前と比較して第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性が高いフェニルアラニンアンモニアリアーゼを意味し、その比較対象は通常、上記様々な生物由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ及びその天然の変異体である。
フェニルアラニンアンモニアリアーゼにおける「アミノ酸置換の導入」は、コードするＤＮＡの改変によって行うことができる。このような「ＤＮＡの改変」は、上記の通り、当業者においては公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法、改変された配列情報に基づくＤＮＡの化学的合成法を用いて、適宜実施することが可能である。また、「アミノ酸置換の導入」は、上述の通り、ペプチドの化学的合成法を用いても行うことができる。
このようなアミノ酸置換導入によって、オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたかどうかは、上記の通り、クロマトグラフィー質量分析等により評価することができる。また、このようにして製造されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体は、第３の鎖状の不飽和カルボン酸化合物を生成する触媒活性において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるフェニルアラニンアンモニアリアーゼに対し、１．２倍以上（１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上）であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましく、３倍以上であることがさらに好ましく、４倍以上であることがより好ましく、５倍以上であることがさらに好ましい。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明者らは、３種（ＢｅｓＣ、ＰＡＬ、ＦＤＣ）の酵素を用いた３段階の反応にて、Ｌ－リジンを出発材料としてブタジエンを生成する、下記反応スキームを構想した。
そこで、この反応スキームについて以下のとおりにして実証実験を行った。
（実施例１）
＜プラスミドベクターの調製＞
先ず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来ＢｅｓＣ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＰＡＬ、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＤＣを大腸菌にて効率良く発現させるために、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変したヌクレオチド配列を設計した。次いで、かかる改変ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを常法に沿って化学合成した。そして、このようにして調製したＤＮＡとｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のキットＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）を使用）により連結することによって、当該各種野生型遺伝子を大腸菌において各々発現可能なプラスミドベクター（ＢｅｓＣベクター、ＰＡＬベクター、ＦＤＣベクター１）として調製した。同様にして、大腸菌（Ｋ－１２）株からフラビンプレニルトランスフェラーゼ（以下「ＵｂｉＸ」とも称する）をコードする遺伝子（配列番号：１５）をＰＣＲ法により増幅したＤＮＡとｐＣｏｌＡＤｕｅｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により連結することにより、当該野生型のＵｂｉＸを大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ＵｂｉＸベクター）を調製した。
なお、実施例１及び後述の実施例２にて用いた各酵素のアミノ酸配列、それをコードするＤＮＡ配列（野生型の配列、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変された配列）は、下記表２に示す配列番号に記載の配列を参照のほど。
＜酵素発現用培地の調製及び酵素活性の測定＞
前記のとおり調製したベクター（５μｇのＢｅｓＣベクター、又は５μｇのＰＡＬベクター）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）株（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、１００μＬ）に、ヒートショック法により導入し、野生型のＢｅｓＣ又はＰＡＬを発現する形質転換体を調製した。そして、これら形質転換体を各々、アンピシリンを添加したＬＢ培地にて６時間培養した。なお、かかる６時間の培養（前培養）により、これら形質転換体の増殖は頭打ちとなる。そのため、後述の酵素反応開始時点での菌体量は、これら形質転換体間において均一となる。
また、１２ｇ／Ｌ トリプトン、２４ｇ／Ｌ イーストエクストラクト、１０ｇ／Ｌ グリセロール、９．４ｇ／Ｌ リン酸水素二カリウム、２．２ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、２０ｇ／Ｌ ラクトース、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンとなるように添加し、酵素発現用培地を調製した。
５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに、前記６時間培養した大腸菌培養液１ｍＬと前記酵素発現用培地１００ｍＬとを添加し、３７℃、振盪速度１８０ｒｐｍにて更に１８時間培養した。培養後の培地を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した後、タンパク質抽出溶液 Ｂ－ＰＥＲＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１０ｍＬ添加し、ペレットを懸濁させた。氷浴上で浸透速度６０ｒｐｍにて振盪させたあと、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、各種細胞溶解液を調製した。
同様に、調製したベクター（５μｇのＦＤＣベクター１と、５μｇのＵｂｉＸベクター）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）株（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、１００μＬ）に、ヒートショック法により導入し、野生型のＦＤＣとＵｂｉＸとを共発現する形質転換体を調製した。アンピシリンおよびカナマイシンを添加したＬＢ培地にて６時間培養した。５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンを添加した上記酵素反応用培地を調製し、同様にして細胞溶解液を調製した。
そして、ヘッドスペース型ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＨＳ／ＧＳＭＳ）用の１０ｍＬバイアルに、各種細胞溶解液 １００μＬずつと、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を１００μＬ、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＬ－リジンを添加し、１ｍＬとなるように超純水を加えた。その直後にバイアルのキャップを閉め、３７℃、振盪速度１８０ｒｐｍにて酵素反応を行った。当該反応を開始してから１８時間後にバイアルのヘッドスペース中に生成された１，３－ブタジエン量を表すピーク面積を、ＧＣ－ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ－ＱＰ Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。
その結果、図には示さないが、Ｌ－リジンを添加しない場合ブタジエンが検出されなかったが、Ｌ－リジンを添加した場合において、１，３－ブタジエンの生成が確認された。
（実施例２）
実施例１に示したように、各種野生型酵素の組み合わせによって、Ｌ－リジンからのブタジエンの生成が認められた。そこで、この触媒活性をより向上させるべく、二段階目の反応を行うＰＡＬについて、他の宿主由来のＰＡＬを検討した。
＜プラスミドベクターの調製＞
Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ又はＰｌａｇｉｏｃｈａｓｍａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＰＡＬを大腸菌にて効率良く発現させるために、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変したヌクレオチド配列を設計した。次いで、かかる改変ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを常法に沿って化学合成し、前述と同様に当該各種野遺伝子を、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（各種ＰＡＬベクター）を各々調製した。
次に、ＦＤＣベクター１及びｐＴｒｃＨｉｓ Ｂベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をＰＣＲ法により増幅したＤＮＡとｐＺＡ３３ｌｕｃベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ社製）を、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により連結することにより、大腸菌内での酵素活性測定用ＦＤＣプラスミドベクター（ＦＤＣベクター２）を調製した。
＜酵素活性測定用培地の調製及び酵素活性の測定＞
調整したベクター（５μｇのＰＡＬベクター、５μｇのＵｂｉＸベクターと５μｇのＦＤＣベクター２）を、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）株（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、１００μＬ）に、ヒートショック法により導入し、各種ＰＡＬと野生型のＦＤＣとＵｂｉＸとを共発現する形質転換体を調製した。
そして、これら形質転換体を各々、アンピシリンとカナマイシンとクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地にて６時間培養した。なお、かかる６時間の培養（前培養）により、これら形質転換体の増殖は頭打ちとなる。そのため、後述の酵素反応開始時点での菌体量は、これら形質転換体間において均一となる。
また、１２ｇ／Ｌ トリプトン、２４ｇ／Ｌ イーストエクストラクト、１０ｇ／Ｌ グリセロール、９．４ｇ／Ｌ リン酸水素二カリウム、２．２ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、２０ｇ／Ｌ ラクトース、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、３０ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコールに加えて、基質として１ｍＭ フェニルアラニン又は１ｍＭ アリルグリシンを添加し、酵素活性測定用培地を調製した。
そして、ＨＳ／ＧＳＭＳ用の１０ｍＬバイアルに、前述の形質転換体の培養溶液を５０μＬと、酵素活性測定用培地１ｍＬを加え、その直後にバイアルのキャップを閉め、３７℃、振盪速度１８０ｒｐｍにて酵素反応を行った。当該反応を開始してから１８時間後にバイアルのヘッドスペース中に生成されたスチレン又は１，３－ブタジエン量を表すピーク面積を、ＧＣ－ＭＳによって測定した。
その結果、図１に示すとおり、フェニルアラニンを基質として加えた場合、下記のとおり、いずれのＰＡＬについてもスチレンの生成が見られた。またその生成量も３種のＰＡＬの間で大きな違いは見られなかった。
一方、図２に示すとおり、アリルグリシンを基質として加えた場合においても、いずれのＰＡＬからもブタジエンの生成が見られた。しかしながら、ブタジエンの生成量には大きな違いが見られ、ＡｖＰＡＬを用いた場合において最大のブタジエン生産が確認された。
（実施例３）
実施例２に示したように、野生型のＡｖＰＡＬにおいて、高いブタジエンの生成触媒活性が認められた。そこで、この高い触媒活性をより向上させるべく、酵素活性部位を各々他のアミノ酸に置換する変異を導入した。そして、得られた変異導入体について、前記触媒活性を評価した。
具体的には、各変異が導入されたアミノ酸配列をコードするプライマーを設計し、合成した。そして、実施例２にて調製した、野生型のＡｖＰＡＬをコードするベクターを鋳型として、前記プライマーを用い、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のプロトコールに従って、各変異が導入されたＰＡＬを、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ＰＡＬ改変体ベクター）を調製した。そして、上記＜酵素活性測定用培地の調製及び酵素活性の測定＞にて、野生型ＰＡＬベクターの代わりに、ＰＡＬ改変体ベクターを導入し、形質転換体を調製し、酵素活性を測定した。野生型のＰＡＬを用いた場合のブタジエン生成量を１．０として、ＰＡＬ改変体を用いた場合のブタジエン生産量を、下記表３に示す。
表３に示すとおり、多種のアミノ酸置換を導入した結果、以下のアミノ酸置換において、導入前の野生型と比較して、ブタジエン生産量の向上が認められた。
（１）１０８位のロイシンが、メチオニン、フェニルアラニン又はバリンに置換、
（２）１０７位のフェニルアラニンが、トリプトファンに置換、
（３）２１９位のロイシンが、イソロイシンに置換、
（４）２２３位のアスパラギンが、イソロイシンに置換、
（５）１０４位のロイシンが、アラニンに置換。
以上説明したように、本発明によれば、酵素を用いて、炭素－炭素間二重結合を少なくとも２つ有する不飽和化合物を製造する方法を提供することが可能となる。例えば、本発明によって、比較的安価なＬ－リジンを出発材料として、ブタジエンを製造することも可能となる。また、本発明によれば、化学合成によらず、生合成によって不飽和化合物を製造できるため、環境への負荷が少ない。したがって、本発明は、ブタジエンといった、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料の製造において極めて有用である。

Claims (8)

  1. フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下、第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、下記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、第１のアミノ基を脱離させ、第２の炭素－炭素間二重結合を形成させる工程を含む、下記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する方法
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  2. 末端アルケン生成酵素 ＢｅｓＣの存在下、第１のアミノ基と末端に第２のアミノ基とを有する、下記式（１）で表される鎖状のカルボン酸化合物又はその幾何異性体から、第２のアミノ基及びメチレン基を脱離させ、前記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する工程を含み、当該化合物又はその幾何異性体から、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造する、請求項１に記載の方法
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  3. 請求項１又は２に記載の方法により、前記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体を製造し、フェルラ酸デカルボキシラーゼの存在下、前記不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、カルボキシル基を脱離させる工程を含む、下記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体を製造する方法
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  4. 前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、下記（１）～（５）のうちの少なくとも１の特徴を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼである、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法
    （１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンである、
    （２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンである、
    （３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
    （４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンである、
    （５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンである。
  5. 下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されている、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体、該フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含み、
    第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、下記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、下記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤；
    （１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
    （２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
    （３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換；
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ １ 及びＲ ２ は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  6. 末端アルケン生成酵素 ＢｅｓＣ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、
    下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されている、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体、該フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含み、
    第１のアミノ基と末端に第２のアミノ基とを有する、下記式（１）で表される鎖状のカルボン酸化合物又はその幾何異性体から、下記式（３）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤；
    （１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
    （２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
    （３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換；
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ １ 及びＲ ２ は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  7. 下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されている、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体、該フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、
    フェルラ酸デカルボキシラーゼ、該フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含み、
    第１のアミノ基と末端に第１の炭素－炭素間二重結合とを有する、下記式（２）で表される鎖状の不飽和カルボン酸化合物又はその幾何異性体から、下記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤；
    （１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
    （２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
    （３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換；
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ １ 及びＲ ２ は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
  8. 末端アルケン生成酵素 ＢｅｓＣ、該酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、
    下記（１）～（５）のうちの少なくとも１のアミノ酸置換が導入されている、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体、該フェニルアラニンアンモニアリアーゼ改変体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターと、
    フェルラ酸デカルボキシラーゼ、該フェルラ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターとを含み、
    第１のアミノ基と末端に第２のアミノ基とを有する、下記式（１）で表される鎖状のカルボン酸化合物又はその幾何異性体から、下記式（４）で表される鎖状の不飽和炭化水素化合物又はその幾何異性体の生成を促進するための剤；
    （１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０８位又は該部位に対応するアミノ酸が、メチオニン、フェニルアラニン若しくはバリンに置換、
    （２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０７位又は該部位に対応するアミノ酸が、トリプトファンに置換、
    （３）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２１９位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （４）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２２３位又は該部位に対応するアミノ酸が、イソロイシンに置換、
    （５）配列番号：２に記載のアミノ酸配列の１０４位又は該部位に対応するアミノ酸が、アラニンに置換；
    ［前記式中（Ａ）は、置換されていてもよい炭素数０～５の直鎖状炭化水素基を示し、炭素数が２～５の場合は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。Ｒ １ 及びＲ ２ は、各々独立して、水素原子、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１～５の直鎖状若しくは分枝状のアルコキシ基又は水酸基を示す］。
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