JP7783155B2 - ワクチン開発のための改善されたｂ型インフルエンザウイルス複製 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年2月19日に出願された米国特許出願 62/297,400に基づく優先権を主張しており、その内容は、本明細書において出典明記により全体に組み込まれる。

政府の権利声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたHHSN272201400008Cに基づく米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

B型インフルエンザウイルスは、ヒトの呼吸器疾患の主要な原因である。前記インフルエンザウイルスゲノムのセグメント化された性質は、２つ以上のインフルエンザウイルスに感染した細胞においてウイルス複製中のセグメントのリアソータントを可能にする。遺伝子突然変異とドリフトを組み合わせた前記セグメントのリアソータントは、時間の経過と共に無数のインフルエンザウイルスの分岐系統を生じさせ得る。新しい系統は、それらのヘマグルチニン(HA)及び/又はノイラミニダーゼタンパク質(NA)において抗原変異を示し、特に、前記HAタンパク質をコードする遺伝子は、高い変異性を有する。インフルエンザの予防のための主な現在の施術は、ワクチン接種である。前記インフルエンザHAタンパク質は、ウイルスに対するホストの防御免疫応答のための主要標的抗原であり、非常に高い変異性を有するため、インフルエンザウイルスの単離並びに最近のアウトブレイクに関連するウイルスにおけるHA抗原の同定及び特徴付けは、ワクチン製造のために重要である。流行及び予測に基づいて、ワクチンは、優勢且つ、予測されるインフルエンザウイルス系統に対する防御免疫応答を刺激するように設計される(Park et al., 2004)。

インフルエンザウイルスには、A型、B型及びC型の３つの一般的な型があり、それらは、内部タンパク質の間に血清学的な交差反応性が無いことによって定義される。B型インフルエンザウイルスは、糖タンパク質HAの抗原性及び遺伝的差異に基づいて２つの系統にさらに分類される。

A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスによるヒトへの感染の負担は大きく、B型インフルエンザウイルス感染の影響は、いくつかのシーズンにおいてA型インフルエンザウイルス感染の影響を超える可能性がある。過去数十年にわたり、２つのB型インフルエンザウイルスリネージ(ビクトリア及びヤマガタ)のウイルスが、ヒトにおいて流行しており、両方のリネージが現在、世界保健機関(WHO)の勧告によりインフルエンザウイルスに代表されるようになった。ヒト用のB型インフルエンザウイルスワクチンは、半世紀以上にわたり入手可能であるが、高収率の候補を開発するための組織的な努力は行われていない。インフルエンザウイルスは、その抗原性に基づいて、3種類(A型、B型及びC型インフルエンザ)に分類される; しかしながら、A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスのみが、ヒトの健康上の問題を引き起こす。A型インフルエンザウイルスは、H1－H18及びN1－N11をそれぞれ指す、18のヘマグルチニン(HA、主要ウイルス抗原)及び11のノイラミダナーゼ(NA、第2のウイルス抗原)サブタイプにさらに分けられる。A型インフルエンザウイルスは、毎年の流行(HAの抗原エピトープに点突然変異を有する抗原エスケープ変異体によって生じる)及び時折起こるパンデミックの原因である。パンデミックは、ヒトが防御免疫応答を欠くHAタンパク質をコードする鳥類又は鳥類/ヒト/豚リアソータントインフルエンザウイルスによって引き起こされる。B型インフルエンザウイルスの疫学は、A型インフルエンザウイルスの疫学と異なる。B型インフルエンザウイルスは、主にヒトにおいて循環し、パンデミックを引きこさない。それにもかかわらず、B型インフルエンザウイルス感染がインフルエンザ関連の罹患率及び死亡率に及ぼす影響は相当であり、いくつかのシーズンでA型インフルエンザウイルスの罹患率及び死亡率を超えている(Paul-Glezen et al., 2013; Tafalla et al., 2016; van de Sandt et al., 2015)。1983年まで、B型インフルエンザウイルスの系統はヒトにおいて1種類しか循環しなかった。それ以来、2つの系統(B/Victoria/2/1987に因んで名づけられたビクトリア、及びB/ヤマガタ/16/1988に因んで名づけられたヤマガタ)が、それらのHAに基づき、遺伝的且つ、抗原的に区別され得る。2000年まで、これら2つの系統のうちの1系統は、シーズンを支配する傾向があった; しかしながら、2001年以来、両方のB型インフルエンザウイルスリネージが毎年ヒト個体群において共循環している(Belshe, 2010; Belshe et al., 2010)。

最近まで、ほとんどのインフルエンザワクチンは3価であった: すなわち、それらは、H1N1及びH3N2サブタイプのA型インフルエンザ系統、並びにB型インフルエンザ系統から構成される。2件の研究により、推奨B型インフルエンザワクチン系統が、特定のインフルエンザシーズンの半分の時間のみの優勢系統であることが示された(Belshe, 2010; Ambrose et al., 2010)。これらの知見とヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスの継続的な循環を基に、2012年に世界保健機関(WHO)は、ヒトインフルエンザワクチンに両系統のB型インフルエンザウイルスを推奨した。従って、ほとんどの季節性インフルエンザウイルスは、現在4価である。

WHO推奨ワクチン系統のHA及びNAウイルスRNA(vRNA)セグメントを、「バックボーン」系統の残りの6つのvRNAセグメントと組み合わせることによって、多くのインフルエンザワクチンが生み出される。生存弱毒化A型及びB型インフルエンザウイルスのために、ウイルスのバックボーンが、1960年代に開発された(Maassab, 1969)。多くの不活化A型インフルエンザウイルスワクチンは、孵化鶏卵における効率的な複製のために選択されたA/プエルトリコ/8/34 (H1N1; PR8)ウイルスバックボーンに基づいている。不活化B型インフルエンザワクチンに関しては、B/リー/40、B/パナマ/45/90、又は野生型系統が、バックボーンとして使用されている(www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/summary_b_vic_cvv_nh1516.pdf)。

本発明は、培養細胞においてウイルス力価及び/又はHA収率を増強し且つ、孵化鶏卵においてウイルス力価及び/又はHA収率を増強し得るB型インフルエンザウイルスの「内部」遺伝子におけるいくつかの突然変異、並びにB型インフルエンザウイルスのウイルス糖タンパク質NA及びNAにおけるいくつかの突然変異に関連する。例示的なリアソータント又は組換え親B型インフルエンザウイルスは、２つの主要B型インフルエンザウイルスリネージを表す(すなわち、「B/ビクトリア」及び「B/ヤマガタ」リネージ)。各リネージについてウイルスライブラリーを作製し、次いでライブラリーを、選択された細胞で継代培養し、及びウイルス増殖が増強された突然変異を同定した。ワクチンウイルスマスター系統(内部遺伝子である、「バックボーン」は、選択されたHA及びNA、例えば、循環系統のもの又は循環系統であると予想されるものと共に使用される)におけるこれら突然変異の１つ以上の使用は、インビトロ及び/又は孵化鶏卵において高いウイルス力価をもたらし、より効率的なB型インフルエンザウイルスの増殖、及びより迅速且つ、費用効果の高いワクチン製造を可能にする。

いくつかの戦略が、増強された特性(例えば、高い力価(例えば、培養細胞及び/又は孵化鶏卵において10⁸ PFU/mL又はそれ以上、例えば5x10⁸、10⁹、5x10⁹又は10¹⁰ PFU/mL)で複製するウイルス)を有するB型インフルエンザウイルス(例えば、リアソータント又は組換えB/ヤマガタウイルス及びB/ビクトリアウイルスに基づく)を開発するために用いられ得る(ランダム変異誘発及び増殖を増強する突然変異の包括的なテストを含む)。本明細書で述べるように、B型インフルエンザウイルスの収率を増加させる多くの増殖増強突然変異(アミノ酸及び非コードヌクレオチド置換の両方)が同定された。B型インフルエンザウイルスポリペプチド中の個々の増殖増強アミノ酸残基又はB型インフルエンザウイルスセグメント中の非コードヌクレオチド配列中の個々の増殖増強アミノ酸残基は、同一のインフルエンザウイルスポリペプチド中の１つ以上の他の増殖増強残基又は同一ウイルスセグメントの非コードヌクレオチドと組み合わせられ得るか、又は他のインフルエンザウイルスポリペプチド又はウイルスセグメント中の１つ以上の他の増殖増強残基及び/又はヌクレオチド置換(例えば、プロモーター配列中の、又はプロモーター配列とオープンリーディングフレームの間のヌクレオチド中の増殖増強ヌクレオチド)、それぞれと組み合わせられ得る。特に、前記6つの「内部」B型インフルエンザウイルスRNAセグメントにランダム突然変異を有するウイルスライブラリーは、効率的な複製をもたらす突然変異についてスクリーニングされた。細胞培養において高収率をサポートする候補ウイルスを、ビクトリア及びヤマガタリネージの8種の異なるウイルスのHA及びNA遺伝子でテストした。ヒトインフルエンザウイルス増殖に使用される哺乳動物における候補ワクチンウイルスの力価を増加させた突然変異の組合せを同定し、インフルエンザウイルスの最も一般的な増殖システムである孵化鶏卵においての使用を確認した。これらのB型インフルエンザウイルスのバックボーンは、改善されたワクチンウイルス産生のために使用され得る。

例えば、NPタンパク質における1つ以上の増殖増強残基、例として、NPにおける1、2、3又は4個又はそれ以上の増殖増強残基、Mタンパク質における1、2、3又は4個又はそれ以上の増殖増強残基(例えば、BM2における1、2、3又は4個の増殖増強因子、又はM1における1、2、3又は4個又はそれ以上の増殖増強残基)、PAにおける1、2、3又は4個又はそれ以上の増殖増強残基、又はNS1における1、2、3又は4個又はそれ以上の増殖増強残基、又はNP、PA、NS、又は他のウイルスセグメントのウイルス非コード配列における増殖増強ヌクレオチドは、ウイルス力価を増強するためにB型インフルエンザウイルス(例えば、ワクチン)を、調整する際に組み合わせられ得る。一実施形態において、非コード配列中の増殖増強ヌクレオチドは、ウイルスセグメントに導入され得るか、又はウイルスセグメントに存在する場合、B型インフルエンザウイルスに含めるために選択され得る。一実施形態において、HA及び/又はNAにおける1つ以上(例えば、1、2、3、4又は5又はそれ以上)の増殖増強残基は、インフルエンザウイルスのHAウイルスセグメント又はNAウイルスセグメントに導入され得るか、又はHA若しくはNAに存在する場合、含まれるように選択され得る。一実施形態において、前記1つ以上の増殖増強残基は、少なくとも1.2、2、2.8、4、3、5、6、8、10、100、又は200倍又はそれ以上、ウイルス増殖を増強し得る。

一実施形態において、本開示は、PA、PB1、PB2、NP、M(M1及びBM2タンパク質をコードする)、及び/又はNS(NS1及びNS2タンパク質をコードする)(例えば、以下の特定の位置で選択されたアミノ酸残基において、M1及びBM2; M1、BM2、及びNS1; NP; M1及びNS1; NP、M1及びBM2; NP及びM1; NP、M1及びNS1; BM2及びNS1; BM2、NS1及びPA; M1、BM2及びPA; M1、BM2、NP及びPA;)のための1つ以上のウイルスセグメントにおいて、1つ以上の特定の位置(本明細書に記載のものを含む)で選択されたアミノ酸残基を有し; 及び任意で増殖増強非コードヌクレオチド置換も含み、及び一実施形態において、目的のHA及びNA遺伝子(例えば、年次及びパンデミック系統から、又は本明細書に記載の選択されたアミノ酸残基を有するHA及びNAウイルスセグメント)を含み、例えば、例年の系統及びパンデミック系統由来の目的のHA及びNA遺伝子/タンパク質、又は本明細書に記載の選択されたアミノ酸残基を有するHA及びNAウイルスセグメントを含む、単離された組換え(例えば、リアソータント)B型インフルエンザウイルスを提供する。このウイルスは、細胞培養(MDCK又はVero細胞において)又は孵化鶏卵においてより効率的且つ、費用効果的に産生される。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、NPにおいて、それぞれ、28、40、51、52、57、204及び343位にアラニン、プロリン、プロリン、グルタミン酸、セリン、メチオニン又はプロリンを有する、すなわち、組換えB型インフルエンザウイルスにおけるNPセグメントにおいて、それぞれ、28、40、51、52、57、204又は343位での残基が、アラニン、プロリン、プロリン、グルタミン酸、セリン、メチオニン又はプロリンでないが、MDCK細胞、Vero細胞又は卵において増強された複製と相関する残基である、対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞及び/又は卵を含む細胞において増殖を増強する、NPにおいて28、40、51、52、57、204、及び/又は343位にアミノ酸残基、及び/又はNP vRNAにおいて500位にc以外のヌクレオチド、又はそれらの何れかの組合せ、を有する。前記組換えウイルスは、本明細書で記載されたM1、BM2、PA、PB2、及び/又はNS1、のうちの1つ以上、及び任意でPB1において、1つ以上の特定の位置で他の選択されたアミノ酸を任意に含み得る。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、例えば、NPにおいて28、40、51、52、57、204、及び/又は343の位置でそれぞれ、アラニン、プロリン、プロリン、グルタミン酸、セリン、メチオニン又はプロリンを有する対応するウイルスと比較して、MDCK細胞、Vero細胞又は卵において、1つ以上のホストタンパク質との相互作用が増強される結果となるNPにぴて28、40、51、52、57、204、及び/又は343の位置でアミノ酸残基を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、限定されないが、28位にアラニン以外の残基、40位にプロリン以外の残基、51位にプロリン以外の残基、52位にグルタミン酸以外の残基、57位にセリン以外の残基、204位にメチオニン以外の残基、及び/又は343位にプロリン以外の残基、及び/又は1795ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチド(イタリックは、ヌクレオチドを示す; 位置はポジティブセンスcRNAに相対的である)、又は何れかそれらの組合せ、を含む、NPにおける増殖増強残基を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、NPにおいて、28位にスレオニン、40位にセリン、51位にグルタミン、52位にリジン、57位にグリシン、214位にスレオニン、及び/又は343位にスレオニン、NP vRNAにおいて、1795ヌクレオチド位にヌクレオチドa、及び/又は500ヌクレオチド位にヌクレオチドｔ、又は何れかそれらの組合せ、並びにM、PA、PB1、PB2及び/又はNSウイルスセグメント中の1つ以上の特定の位置で任意に選択されたアミノ酸残基を有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、M1において、例として34、54、77、86、又は97位にそれぞれグリシン、アスパラギン酸、アルギニン、メチオニン又はイソロイシンを有する、すなわち、前記MセグメントにおけるM1において、34、54、77、86、又は97位それぞれの残基が、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、メチオニン又はイソロイシンでないが、MDCK細胞、Vero細胞又は卵において増強された複製と相関する残基である、対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増強された増殖を増強するM1における34、54、77、86、及び/又は97位にアミノ酸残基を有する。前記組換えウイルスはまた、本明細書に記載されているようなPA、BM2、PB2、NP、及び/又はNS1、及び任意でPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を任意で含み得る。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、例えばM1において、34、54、77、86、又は97のそれぞれの位置でグリシン、アスパラギン酸、アルギニン、メチオニン又はイソロイシンを有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵において1つ以上のホストタンパク質と増殖を増強する、M1における34、54、77、86、及び/又は97位にアミノ酸残基を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、M1において、34、54、77、86、又は97位でそれぞれ、バリン若しくはアスパラギン、グリシン、リジン、スレオニン若しくはアスパラギン、並びにNP、PA、PB1、PB2、及び/又はNSの1つ以上の特定の位置で任意で選択されたアミノ酸残基を有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、BM2において、26、27、58又は80の残基それぞれでグリシン、ヒスチジン、ヒスチジン又はアルギニンを有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強するBM2における26位、27位、58位、又は80位にアミノ酸残基を有する。前記組換えウイルスはまた、本明細書で記載されたNS1、PA、NP、PB2、及び/又はM1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基として任意で含まれ得る。一実施形態において、BM2において26位の残基は、アルギニンであり、27位はアルギニンであり、58位はアルギニンであり、又は80位はグリシンである。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、42位にチロシン、117位にメチオニン、176位にリジン、252位にセリン、又は39位にaを有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強するNS1における42位にチロシン以外のアミノ酸残基、117位にメチオニン以外のアミノ酸残基、176位にリジン以外のアミノ酸残基、及び/又は252位にセリン以外のアミノ酸残基、39位にa以外のヌクレオチド、38位の後にヌクレオチドの挿入、又は何れかそれらの組合せを有する。前記組換えウイルスはまた、例えば、本明細書で記載されたPA、PB2、BM2、NP、及び/又はM1、及び任意でPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を含み得る。一実施形態において、前記組換えインフルエンザウイルスは、NS1において42位にアスパラギン、117位にチロシン、176位にグルタミン、252位にスレオニン、39ヌクレオチド位にg、38ヌクレオチド位の後にさらにg、又はそれら何れかの組合せ、及び本明細書で記載されたPA、PB2、BM2、NP、及び/又はM1の1つ以上の特定の位置で任意で選択されたアミノ酸を有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、387位にチロシン、434位にバリン、494位にアスパラギン酸、524位にスレオニン、及び/又は2272位にヌクレオチドa、2213位にg、1406位にa、又は1445位にc、又はそれら何れかの組合せを有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強する、PAにおいて387位にチロシン以外のアミノ酸残基、434位にバリン以外のアミノ酸残基、494位にアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、524位にスレオニン以外のアミノ酸残基、及び/又はPA vRNAにおいて2272位にa以外のヌクレオチド、2213位にg以外のヌクレオチド、1406位にa以外のヌクレオチド、及び/又は1445位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有する。前記組換えウイルスはまた、例えば、本明細書で記載されたようなNS1、BM2、NP、PB2、及び/又はM1、及び任意でPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を任意に含み得る。一実施形態において、前記組換えインフルエンザウイルスは、PAにおいて、387位にヒスチジン、434位にアラニン、又は494位にアスパラギン、534位にアラニン、及び/又はPA vRNAにおいて2272位にt、2213位にa、1406位にg、及び/又は1445位にt、又はそれら何れかの組合せを有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、16位にアスパラギンを有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強するPB2において、16位のアスパラギン以外のアミノ酸残基を有する。前記組換えウイルスはまた、本明細書に記載されたPA、NS1、BM2、NP、及び/又はM1、及び任意でPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を任意で含み得る。一実施形態において、前記組換えインフルエンザウイルスは、PB2における16位でセリンを有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、HA1において34位にスレオニン、98位にアルギニン、129位にリジン、168位にアスパラギン、194位にアスパラギン、及び/又は196位にスレオニン、及び/又はHA2において、39位にリジン、56位にセリン、61位にリジン、112位にアスパラギン酸を有する対応するウイルスと比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強する、HA1において34位にスレオニン以外のアミノ酸残基、98位にアルギニン以外のアミノ酸残基、129位にリジン以外のアミノ酸残基、168位にアスパラギン以外のアミノ酸残基、194位にアスパラギン以外のアミノ酸残基、及び/又は196位にスレオニン以外のアミノ酸残基、及び/又はHA2において、39位にリジン以外のアミノ酸残基、56位にセリン以外のアミノ酸残基、61位にリジン以外のアミノ酸残基、又は112位にアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、又はそれら何れかの組合せのアミノ酸残基を有する。前記組換えウイルスはまた、本明細書に記載されたPA、BM2、PB2、NS1、NP、及び/又はM1、及び/又はPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を任意で含み得る。一実施形態において、前記組換えインフルエンザウイルスは、34位にイソロイシン、129位にグルタミン酸、168位にグルタミン酸若しくはアスパラギン酸、196位にプロリン、アラニン、イソロイシン若しくはアスパラギン、98位にリジン、194位にアスパラギン酸、39位にグリシン(HA2において)、56位にグリシン(HA2において)、51位にアスパラギン(HA2において)、又は112位にグルタミン酸(HA2において)、又はそれら何れかの組合せを有する。

一実施形態において、前記リアソータント又は組換えB型インフルエンザウイルスは、例として、NAにおいて、76位でT、102位でR、105位でE、139位でP、169位でN、434位でG、436位でT、及び/又は457位でDを有する対応するウイルス、このウイルスは、本明細書に記載されたPA、PB2、BM2、NP、NS1、及び/又はM1、及びPB1の1つ以上の特定の位置で選択されたアミノ酸残基を任意で含み得る、と比較してMDCK細胞、Vero細胞又は卵を含む細胞において増殖を増強する、NAにおいて、76位にスレオニン(T)以外のアミノ酸残基、102位にアルギニン(R)以外のアミノ酸残基、105位にグルタミン酸(E)以外のアミノ酸残基、139位にプロリン(P)以外のアミノ酸残基、169位にアスパラギン酸(N)以外のアミノ酸残基、434位にグリシン(G)以外のアミノ酸残基、436位にスレオニン以外のアミノ酸残基、及び/又は457位にアスパラギン酸(D)以外のアミノ酸残基、又はそれら何れかの組合せを有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、76位にメチオニン(M)、102位にリジン(K)、105位にリジン(K)、139位にセリン(S)、169位にスレオニン(T)、434位にグルタミン酸(E)、436位にメチオニン(M)、及び/又は457位にアスパラギン(N)、又はそれら何れかの組合せを有する。

一実施形態において、本発明は、本明細書で記載した特定の位置で2つ以上の選択されたアミノ酸残基を有するワクチンインフルエンザウイルス由来の6つの「内部」遺伝子、及び第1のインフルエンザウイルス分離株から選択されたNA遺伝子セグメント、及び同一の分離株又は異なる分離株由来のHA遺伝子セグメントを有する単離された組換えリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。

一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、PA、PB1、PB2、NP、M1及び/又はNS1の1つ、2つ、3つ又はそれ以上の特定の位置で特定のアミノ酸残基を有し、及び配列番号1～6(B/ヤマガタ/1/73の内部遺伝子)のうちの1つによってコードされる対応するポリペプチドと80～99の間の何れかの整数を含む、少なくとも80%(例えば、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%)の連続したアミノ酸配列同一性を有する、例えば、NPにおいて28位にA以外、40位にP以外、51位にP以外、52位にE以外、57位にS以外、204位にM以外、及び/又は343位にP以外のポリペプチド及び/又はNP vRNAにおいて、1795位にg又は500位にt、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位にG以外の残基、54位にD以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基、97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位にH以外、80位にR以外、27位にH以外、26位にG以外（例えば、58位にR,80位にG、27位にR）、及び/又はBM2において、26位にR; SN1において、42位にY以外、117位にM以外、176位にK以外、及び/又は252位にS以外、及び/又はNS1 vRNAにおいて、a39g、38位の後にgの追加、又はそれら何れかの組合せ; PB2において16位にN以外; 及び/又はPAにおいて、387位にY以外、434位にV以外、494位にD以外、524位にT以外、及び/又はPA vRNAにおいて、a2272t、g2213a、a1406g、及び/又はc1445t、又はそれら何れかの組合せ、を有する組換えB型インフルエンザウイルスである。前記特定された残基以外の残基は、保存的な置換であってもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり; 脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びスレオニンであり; アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり、及びイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。一実施形態において、保存的アミノ酸置換群は: スレオニン－バリン－ロイシン－イソロイシン－アラニン; フェニルアラニン－チロシン; リジン－アルギニン; アラニン－バリン; グルタミン酸－アスパラギン酸; 及びアスパラギン－グルタミンである。非保存的置換もまた想定される。

一実施形態において、本発明のB型インフルエンザウイルスは、配列番号1～6のうちの1つによって、それぞれコードされる対応するポリペプチドと80～99の間の何れかの整数を含む、少なくとも80%(例えば、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%)の連続したアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、PA、NS1、M又はNPの1つ、2つ、3つ又はそれ以上の特定の位置で特定のアミノ酸残基を有する組換えB型インフルエンザウイルスである。一実施形態において、本発明のB型インフルエンザウイルスは、PA、PB1、PB2、NP、M1及び/又はNS1の1つ以上の特定の位置で特定のアミノ酸残基を有し且つ、例えば、保存的置換である残基を有するポリペプチド等の配列番号1～6のうちの1つによってコードされる対応するポリペプチドと80～99の間の何れかの整数を含む、少なくとも80%(例えば、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%)の連続したアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する組換えB型インフルエンザウイルスである。

また、本明細書に記載の特定の位置での選択されたアミノ酸残基の何れかの組合せも含まれる。

特定の位置で残基を有するPA、NP、M及び/又はNSのウイルスセグメントは、本発明のリアソータントワクチンウイルスを提供するために、PB1のウイルスセグメント、PB2のウイルスセグメント、HAのウイルスセグメント、及びNAのウイルスセグメントと組み合わせられ得る。一実施形態において、前記リアソータントウイルスにおけるHAウイルスセグメントは、PA、PB1、PB2、NP、M及びNSのウイルスセグメントに対して異種である。一実施形態において、前記リアソータントにおけるNA遺伝子セグメントは、PA、PB1、PB2、NP、M及びNSのウイルスセグメントに対して異種である。一実施形態において、前記リアソータントにおけるAウイルスセグメントは、1つのインフルエンザウイルス単離株若しくは系統(「親」)、又はその変異体(例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%のアミノ酸配列同一性を有するインフルエンザウイルスタンパク質をコードするウイルスセグメントを有する、又は親インフルエンザウイルス単離株若しくは系統の配列に対して1、2、5、10、又は20個の置換を有する)からのPA、PB1、PB2、NP、M及びNSのウイルスセグメントを有する。一実施形態において、前記親系統は、配列番号1～6の少なくとも1つに対応する配列を有するウイルスセグメントを有し、前記組換えウイルスは、本明細書に記載されたPA、NS、NP又はMの置換の少なくとも1つを有する前記ウイルスセグメントの少なくとも1つ、及び前記親ウイルスセグメントの少なくとも1つを有する。一実施形態において、前記リアソータントウイルスにおけるHA遺伝子セグメントは、キメラHA遺伝子セグメント(例えば、前記親単離株又は系統のHA遺伝子セグメント由来のHAシグナルペプチド配列及び/又はHA膜貫通ドメイン配列に連結された相同性HA外部ドメイン配列のキメラ、又はその変異体)である。一実施形態において、前記単離された組換えウイルスにおけるNA遺伝子セグメントは、キメラNA遺伝子セグメント(例えば、前記親単離株又は系統のNA遺伝子セグメント由来のNA膜貫通ドメイン配列に連結された相同性NA外部ドメイン配列、又はその変異体、及び/又は前記親単離株又は系統由来のstalk配列、又はその変異体)等の、例として、B型インフルエンザウイルスNA及びA型インフルエンザウイルスNAのキメラである。一実施形態において、前記単離された組換えウイルスにおけるNA遺伝子セグメントは、キメラNA遺伝子セグメント(例えば、前記親単離株又は系統のNA遺伝子セグメント、又はその変異体、及び/又は第2の単離株又は系統由来のstalk配列、又はその変異体由来のNA膜貫通ドメイン配列に連結された相同性NA外部ドメイン配列のキメラ)等のキメラNA遺伝子セグメントである。一実施形態において、前記単離された組換えウイルスは、相同性HA遺伝子セグメント、相同性NA遺伝子セグメント、キメラHA遺伝子セグメント、キメラNA遺伝子セグメント、又はそれら何れかの組合せを有する。vRNA又はcRNAを調製するために使用される核酸配列は、組換え方法論によって特定の位置に前記残基を導入するものであり得、又は前記特定の位置に前記残基を有するものを選択し得る。

本明細書に記載されるように、NA及び/又はHAの相同性遺伝子セグメントを運ぶためのワクチンウイルスとして有用なインフルエンザウイルス単離株(例えば、B/ヤマガタ-リネージ又はB/ビクトリア-リネージのウイルスを有するB/ヤマガタ1/73のリアソータント)は、MDCK細胞において連続的に継代培養され(例えば、約10～12回であるが、より少ない継代回数でもあり得る)、それら細胞において複製が増強されたウイルスを得る。一実施形態において、複製が増強された連続的に継代培養した後に得られたウイルスは、連続的に継代培養されなかったウイルスより少なくとも0.5～1又は2logs高い力価を有する。一実施形態において、連続的に継代培養した後に得られたウイルスは、前記親ウイルスに対すして２つ以上の内部遺伝子における置換を有した。

従って、培養中(例えば、MDCK又はVero細胞又は卵)の細胞内で増殖又は継代培養されるワクチンウイルスに対し、目的のHA及びNA配列と共に用いる場合、培養細胞内でウイルスの増殖を増強するPA、BM2、NP、M1及び/又はNS1の1つ以上の特定の位置での開示された残基は、有意に高いウイルス力価をもたらし得る。従って、本発明は、細胞培養において、複製が増強されたインフルエンザウイルスを選択する方法を提供する。前記方法は、インフルエンザワクチンの製造に適した細胞を提供すること; 細胞において1つ以上のインフルエンザウイルス単離株を連続的に培養すること; 及び連続培養の前に1つ以上の単離株と比較して増殖が増強された連続培養ウイルスを単離することを含む。一実施形態において、前記細胞は、イヌ科動物又は霊長類、例えばヒト又はサル細胞である。

本発明は、本発明の複数のインフルエンザウイルスベクター、例えば6:1:1リアソータント、6:2リアソータント及び7:1リアソータントを含むリアソータントを調製するために有用なものを提供する。本発明の範囲内の6:1:1リアソータントは、ワクチンウイルス由来の6個の内部遺伝子セグメント、異なる(第2の)ウイルス単離株由来のNA遺伝子セグメント、及び第3の単離株由来のHA遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスであり; 本発明の範囲内の6:2リアソータントは、ワクチンウイルス由来の6個の内部遺伝子セグメント、及び異なる(第2の)ウイルス単離株由来のNA遺伝子セグメント及びHA遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスであり; 本発明の範囲内の7:1リアソータントは、ワクチンウイルス由来の6個の内部遺伝子セグメント及びNA遺伝子セグメント、及び前記ワクチンウイルスとは異なるウイルスソースに由来するHA遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルス、又は6個の内部遺伝子及び前記ワクチンウイルスに由来するHA遺伝子セグメントを有するインフルエンザウイルスであり、並びにNA遺伝子セグメントは、前記ワクチンウイルスとは異なるウイルスソースに由来する。

本発明の一実施形態において、複数は、以下を含むベクターから選択されたvRNA又はcRNA産生のためのベクターを含む; 転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM DNA、例えばcDNA、に動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター、及び転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター。一実施形態において、PB1、PB2、PA、NP、M、及びNSのvRNA又はcRNA産生のための前記DNAは、培養した哺乳類細胞(例えば、MDCK細胞、Vero細胞又はPER.C6（登録商標）細胞及び任意で孵化鶏卵も)において高力価に複製するインフルエンザウイルス由来、及び/又はワクチンウイルス由来(例えば、ヒトにおいて重大な疾患を引き起こさないもの)の配列を有する。NAのvRNA又はcRNA産生のためのDNA、例えばcDNAは、何れかのNA由来であり得、及びHAのvRNA又はcRNA産生のためのDNAは、何れかのHA由来であり得る。一実施形態において、vRNA又はcRNA産生のためのDNAは、A型又はC型インフルエンザウイルスのためのものであり得る。NA及びHAのvRNA又はcRNA産生のためのDNAは、異なる系統又は単離株(6:1:1リアソータント)又は同一系統又は単離株(6:2リアソータント)由来であり得、又はNAは、前記内部遺伝子(7:1リアソータント)と同一系統又は単離株由来であり得る。前記複数はまた、インフルエンザウイルスPAをコードするベクター、インフルエンザウイルスPB1をコードするベクター、インフルエンザウイルスPB2をコードするベクター、インフルエンザウイルスNPをコードするベクター、及び任意でNP、NS、M(例えば、M1及びBM2)、HA又はNAをコードする1つ以上のベクターから選択されたmRNA産生のためのベクターを含む。前記ウイルスタンパク質をコードするベクターは、転写終結配列をさらに含み得る。

本発明の範囲内でリアソータントの前記内部遺伝子を提供し得るウイルスは、MDCK細胞において高い力価、例えば、少なくとも約10⁵ PFU/mLの力価(例えば、少なくとも10⁶ PFU/mL、10⁷ PFU/mL又は10⁸ PFU/mL); 孵化卵において高い力価、例えば、少なくとも約10⁷ EID₅₀/mL(例えば、少なくとも10⁸ EID₅₀/mL、10⁹ EID₅₀/mL又は10¹⁰ EID₅₀/mL); MDCK細胞等の細胞において高い力価、例えば、少なくとも約10⁷ PFU/mL(例えば、少なくとも10⁸ PFU/mL)を有し、又はこれらホスト細胞のうち２つ以上において高い力価を有する、ウイルスを含む。

一実施形態において、MDCK細胞又はVero細胞等の細胞における本発明の前記リアソータントの力価は、特定の位置に特定の残基を有さない対応するウイルスの力価より1log、2log、3log、又はそれ以上であり得る。

一実施形態において、PB1、PB2、PA、NP、M及びNSの内部遺伝子のDNAは、配列番号1～6のうちの1つによってコードされる対応するポリペプチドと実質的に同じ活性を有するタンパク質をコードする。本明細書で使用される「実質的に同じ活性」は、約0.1％、1％、10％、30％、50％、90％、例えば100％まで又はそれ以上を、又は対応する全長ポリペプチドの活性又はタンパク質レベルがそれぞれ約80%、90%又はそれ以上である検出可能なタンパク質を含む。一実施形態において、例えば、少なくとも80%(例えば、90%、92%、95%、97%、98%又は99%(80～99の間の何れかの整数を含む))の実質的同一であるポリペプチドをコードする前記核酸配列は、配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドと連続的なアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態において、前記単離された核酸分子及び/又は精製された核酸分子は、例えば、少なくとも50%(例えば、60%、70%、80%又は90%(50～100の間の何れかの整数を含む))、又は配列番号1～6のうち1つに対し、より連続的なアミノ酸配列同一性等の実質的同一である核酸配列を含む。一実施形態において、前記単離された核酸分子及び/又は精製された核酸分子はまた、配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも80%(例えば、90%、92%、95%、97%、98%又は99%(80～99の間の何れかの整数を含む))の連続的なアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし得る。一実施形態において、前記インフルエンザウイルスポリペプチドは、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換(残基の10%又は20%までの保存的置換)の組合せ、又は配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドと比較して1つ以上(例として、2、5、10、15、20又はそれ以上)の保存的なアミノ酸置換(例えば、2、5、10、15、20又はそれ以上の10%又は20%までの保存的置換)を有し、及び配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドと比較して、PA、PB2、BM2、NP、M1及び/又はNS1の1つ以上に特徴的な残基を有する。一実施形態において、前記インフルエンザウイルスポリペプチドは、配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドと比較して、1つ以上(例えば2、3、4、5、6、7又は8)の保存的及び/又は非保存的置換を有する。

従って、本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質を発現若しくはコードする、又は天然及び組換えvRNA若しくはcRNAの両方のインフルエンザvRNA若しくはcRNAを発現若しくはコードする単離及び精製ベクター又はプラスミドの使用を含む。前記ベクターは、インフルエンザcDNA(例えば、A型、B型、C型インフルエンザDNA)を含み得る(Fields et al. (eds.), Lippincott、Williams and Wickens (2006)、本明細書において出典明記により全体に組み込まれる)。何れかの適切なプロモーター又は転写終結配列は、タンパク質又はペプチド(例えば、ウイルスタンパク質若しくはペプチド、非ウイルスタンパク質若しくはペプチド、又は治療用のタンパク質若しくはペプチド)を発現させることが出来る。

本発明の組成物又は複数のベクターは、目的の相同性遺伝子又はオープンリーディングフレーム(例えば、ワクチンとして又は遺伝子置換において有用な免疫原性ペプチド又はタンパク質をコードする外来遺伝子)を含み得、例えば癌治療又はワクチンにおいて有用なエピトープ、又は遺伝子治療に有用なペプチド若しくはポリペプチドをコードし得る。ウイルスを調製する場合、前記目的の遺伝子又はcDNAを含むベクター又はプラスミドは、インフルエンザウイルス遺伝子のためのベクター若しくはプラスミドの代わりに用いられ得るか、又はすべてのインフルエンザウイルス遺伝子のためのベクター若しくはプラスミドに加えられ得る。従って、本発明の他の実施形態は、前記ベクターの1つが、所望の核酸配列に連結された(例えば、3’インフルエンザコード配列又はその一部を任意で含む3’インフルエンザウイルス配列に連結された所望のcDNA)、5’インフルエンザウイルスコード配列又はその一部を任意で含む5’インフルエンザウイルス配列で置換されているか、又はそれをさらに含む、上記の組成物若しくは複数のベクターを含む。一実施形態において、cDNA等の所望の核酸配列は、アンチセンス(アンチゲノム)方向である。インフルエンザウイルス複製を許容するホスト細胞と上記の他のベクターをコンジュゲーションしたベクターの導入は、前記ベクターの相同性配列に対応するvRNA又はcRNAを含む組換えウイルスをもたらす。

vRNA又はcRNAのためのベクター中の前記プロモーターは、RNAポリメラーゼＩプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、又はT3プロモーターであり得、及び任意で前記ベクターは、RNAポリメラーゼＩ転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列、又はリボザイム等の転写終結配列を含む。本発明の範囲内のリボザイムは、限定されないが、テトラヒメナリボザイム（tetrahymena ribozyme）、RNase P、ハンマーヘッドリボザイム（hammerhead ribozyme）、ヘアピンリボザイム（hairpin ribozyme）、肝炎リボザイム（hepatitis ribozyme）、並びに合成リボザイム（synthetic ribozyme）が含まれる。一実施形態において、前記RNAポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトRNAポリメラーゼＩプロモーターである。

vRNA、cRNA又はウイルスタンパク質発現ベクターにおける前記プロモーター又は転写終結配列は、前記プロモーター又は何れか他のベクターと同一であっても異なってもよい。一実施形態において、インフルエンザvRNA又はcRNAを発現する前記ベクター又はプラスミドは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ又はヒト細胞を含む霊長類細胞等の鳥類又は哺乳類ホスト細胞における少なくとも1つの特定のホスト細胞での発現、又は1つ以上のホストでの発現のために適したプロモーターを含む。

一実施形態において、vRNA又はcRNAのための少なくとも1つのベクターは、任意にRNAポリメラーゼII転写終結配列に連結される、他のリボザイム配列に連結されウイルスコード配列に連結されリボザイム配列に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む。一実施形態において、vRNA又はcRNA産生のための少なくとも2(例えば3、4、5、6、7又は8)のベクターは、ウイルスコード配列を含むウイルス配列に対応する配列に対して5’であり、第2の配列に対して5’であり、転写終結配列に対して5’である第1のリボザイム配列であるRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む。各vRNA又はcRNAにおける各RNAポリメラーゼIIプロモーターは、他の何れかのvRNA又はcRNAにおけるRNAポリメラーゼIIプロモーターと同一であっても、異なってもよい。同様に、各vRNA又はcRNAにおける各リボザイム配列は、他の何れかのvRNA又はcRNAにおける前記リボザイム配列と同一であっても、異なってもよい。一実施形態において、単一ベクター内の前記リボザイム配列は、同一ではない。

一実施形態において、本発明は、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたPB1 DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたPB2 DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたHA DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたNP DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたNA DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたM DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、及び転写終結配列に連結されたNS DNA、例えばcDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、を含むリアソータントのための複数のインフルエンザウイルスベクターを提供する。ここで、PB1、PB2、PA、NP、NS及びMのためのDNAは、1つ以上のインフルエンザワクチン種ウイルス由来であり、前記特定の位置で2つ以上の特徴的な残基を含み; 及びインフルエンザウイルスPAをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスPB1をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスPB2をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスNPをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスHAをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスNAをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスM1をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、インフルエンザウイルスBM2をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、又はインフルエンザウイルスNS2をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生のためのベクター、を含む。一実施形態において、少なくとも1つのベクターは、配列番号1～6のうちの1つによってコードされる対応するポリペプチドと実質的に同じ活性を有するPB1、PB2、PA、NP、M若しくはNS、又はその一部をコードする対応する配列、例えば、配列番号1～6のうちの1つによってコードされるポリペプチドに対し少なくとも80%(例えば、85%、90%、92%、95%、98%、99%又は100%(80～100の間の何れかの整数を含む))のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。必要に応じて、2つのベクターが、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM cCNAに動作可能に連結されたプロモーターを含む前記ベクター(例えば、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM1 cDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター及び転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスBM2 cDNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むベクター)の代わりに使用され得る。

本発明の複数の前記ベクターは、物理的に連結されていてもよく、又は各ベクターは、個々のプラスミド又は他の、例えば線状の核酸デリバリービヒクル上に存在してもよい。一実施形態において、各vRNA又はcRNA産生ベクターは、別々にプラスミド上にある。一実施形態において、各mRNA産生ベクターは別々のプラスミド上にある。

本発明はまた、インフルエンザウイルスを調製する方法を提供する。当該方法は、感染性インフルエンザウイルスを産生するために有効な量で、細胞を本発明の複数の前記ベクターと例えば、順次又は同時に接触させることを含む。本発明はまた、複数の前記ベクターと接触した細胞からウイルスを単離することを含む。従って、本発明はさらに、単離されたウイルス、並びに本発明の複数の前記ベクター又はウイルスと接触したホスト細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、vRNA又はタンパク質産生ベクターの何れか他のベクターの前に前記細胞を、1つ以上のベクター、vRNA又はcRNA又はタンパク質産生ベクターと接触させることを含む。一実施形態において、当該方法で使用されるvRNA又はcRNAベクターのプロモーターは、RNAポリメラーゼＩプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T3プロモーター又はT7プロモーターである。一実施形態において、前記RNAポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトRNAポリメラーゼＩプロモーターである。一実施形態において、当該方法で使用される各vRNA又はcRNAベクターは、別々のプラスミド上にある。一実施形態において、当該方法で使用されるvRNA又はcRNAベクターは、1つのプラスミド上又は2つ若しくは3つの異なるプラスミド上にある。一実施形態において、当該方法で使用される各mRNAベクターは、別々のプラスミド上にある。一実施形態において、当該方法で使用されるPA、PB1、PB2及びNPの前記mRNAベクターは、1つのプラスミド上又は2つ若しくは3つの異なるプラスミド上にある。

一実施形態において、本発明は、細胞培養において複製が増強されたインフルエンザウイルスを選択する方法を提供する。当該方法は、インフルエンザワクチンの産生に適した細胞を提供すること; 1つ以上のインフルエンザウイルス単離株を前記細胞において連続的に培養すること; 連続培養前の1つ以上の前記単離株と比較して増殖が増強された連続培養ウイルスを単離することを含む。一実施形態において、前記細胞は、げっ歯類又は霊長類細胞である。

ヘルパーウイルス感染を必要としない、本明細書に記載のウイルスを産生する当該方法は、ウイルス突然変異研究、並びにワクチンの産生(例えば、AIDS、インフルエンザ、B型肝炎（hepatitis B）、C型肝炎（hepatitis C）、ライノウイルス（rhinovirus）、フィロウイルス（filoviruses）、マラリア（malaria）、ヘルペス（herpes）、及び口蹄疫（foot and mouth disease）)及び遺伝子治療ベクター(癌、AIDS、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）、筋ジストロフィー（muscular dystrophy）、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ornithine transcarbamylase deficiency）及び中枢神経系腫瘍（central nervous system tumors）)において有用である。従って、医学療法(例えば、ワクチン又は遺伝子療法のため)に使用するためのウイルスが提供される。

本発明はまた、単離されたウイルスポリペプチド、並びに本発明の組換えウイルスを調製及び使用する方法を提供する。当該方法は、ホスト生物(例えば、哺乳動物)に有効量の本発明のインフルエンザウイルス(不活性化ウイルス調製物、任意でアジュバント及び/又は担体と組み合わせて)を投与すること、例えば、そのウイルス又は抗原的に密接に関連するウイルスによる哺乳動物等の動物の感染を予防又は改善するために有効な量で投与することを含む。一実施形態において、前記ウイルスは、筋肉内に投与されるが、他の実施形態において、前記ウイルスは、鼻腔内に投与される。いくつかの投与プロトコールにおいて、全ての容量は、筋肉内又は鼻腔内に投与され、他のものでは筋肉内及び鼻腔内投与の組合せが用いられる。前記ワクチンは、組換えインフルエンザウイルス、他の病原体、追加の生物学的薬剤又は微生物構成成分(例えば多価ワクチンを形成する)を含むインフルエンザウイルスの他の単離株をさらに含み得る。一実施形態において、例えば、不活性化インフルエンザウイルス及び粘膜アジュバントを含む鼻腔内ワクチン接種は、鼻咽頭並びに血清IgGにおいてウイルス特異的IgA及び中和抗体を誘導し得る。

本発明の前記インフルエンザウイルスは、他の抗ウイルス剤(例えば、アマンタジン、リマンタジン及び/又はノイラミニダーゼ阻害剤)と共に使用され得、例えば、前記ウイルスは、例として、それらの抗ウイルス剤の前及び/又は後に、又はそれらと併用して、別々に投与され得る。

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B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 B/ヤマガタ1/1973(配列番号1～6、9及び10)の核酸配列及びHA(配列番号7)及びNA(配列番号8)のアミノ酸配列。 MDCK細胞におけるライブラリー継代の概要及び高収率(HY)候補(HY(Yam)及びHY(Vic))の同定。意図されたvRNAにランダム突然変異を有するヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのウイルスライブラリーを、MDCK細胞で12回継代培養し、又は2回継代し、混合し、さらに10回継代した。各ウイルスリネージで700以上のウイルスプラークが選択された。赤血球凝集及びウイルス力価に基づいて、各系統の上位8つの候補が、段階的選択プロセスで同定された。組み合わせの突然変異をテストすることは、RG(Yam)♯8及びRG(Vic)♯2の選択をもたらした。追加の突然変異の導入(Vero細胞におけるウイルスライブラリースクリーニングで同定された)は、高収率ワクチンバックボーンHY(Yam)及びHY(ViC)をもたらした。HA力価、赤血球凝集力価。 MDCK細胞におけるライブラリー継代の概要及び高収率(HY)候補(HY(Yam)及びHY(Vic))の同定。意図されたvRNAにランダム突然変異を有するヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのウイルスライブラリーを、MDCK細胞で12回継代培養し、又は2回継代し、混合し、さらに10回継代した。各ウイルスリネージで700以上のウイルスプラークが選択された。赤血球凝集及びウイルス力価に基づいて、各系統の上位8つの候補が、段階的選択プロセスで同定された。組み合わせの突然変異をテストすることは、RG(Yam)♯8及びRG(Vic)♯2の選択をもたらした。追加の突然変異の導入(Vero細胞におけるウイルスライブラリースクリーニングで同定された)は、高収率ワクチンバックボーンHY(Yam)及びHY(ViC)をもたらした。HA力価、赤血球凝集力価。 B/ヤマガタ-リネージ(A)及びB/ビクトリア-リネージ(B)の高収率候補の選択についてのウイルス力価(増殖カイネティクス)及び赤血球凝集(HA)力価。ヤマガタ-リネージ(A)及びビクトリア-リネージ(B)の高収率ワクチンバックボーンを保有するウイルス。前記候補ウイルスにおいて検出された突然変異を、表1及び表2にそれぞれ示す。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示される。統計的有意性は、線形混合モデル(*p<0.05; **p<0.01)を用いて決定した; 高収率ワクチン候補の力価が、野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は、示されていない。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す。 B/ヤマガタ-リネージ(A)及びB/ビクトリア-リネージ(B)の高収率候補の選択についてのウイルス力価(増殖カイネティクス)及び赤血球凝集(HA)力価。ヤマガタ-リネージ(A)及びビクトリア-リネージ(B)の高収率ワクチンバックボーンを保有するウイルス。前記候補ウイルスにおいて検出された突然変異を、表1及び表2にそれぞれ示す。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示される。統計的有意性は、線形混合モデル(*p<0.05; **p<0.01)を用いて決定した; 高収率ワクチン候補の力価が、野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は、示されていない。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す。 B/ヤマガタ-リネージ(A)及びB/ビクトリア-リネージ(B)の再生高収率候補のウイルス力価及びHA力価。B/ヤマガタ系統(A)及びB/ビクトリア系統(B)ウイルスに導入された突然変異を表3及び表4にそれぞれ示す。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示される。P値を、線形混合モデル(*p<0.05; **p<0.01)を用いて計算した; 高収率ワクチン候補の力価が、野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は、示されていない。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す。 B/ヤマガタ-リネージ(A)及びB/ビクトリア-リネージ(B)の再生高収率候補のウイルス力価及びHA力価。B/ヤマガタ系統(A)及びB/ビクトリア系統(B)ウイルスに導入された突然変異を表3及び表4にそれぞれ示す。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示される。P値を、線形混合モデル(*p<0.05; **p<0.01)を用いて計算した; 高収率ワクチン候補の力価が、野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は、示されていない。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す。 キメラHA及びNAコンストラクト。B型インフルエンザウイルスHA(緑色)及びNA(青色)タンパク質の外部ドメインを、A型インフルエンザウイルスPR8 HA(紫色)及びNA(ダークオレンジ色)vRNAの残存配列の間に挿入した。ワイドバーはコード領域を示す。小さいバーは、非コード領域(NCR)を示す。SP、シグナルペプチド; TM、膜貫通ドメイン; CT、細胞質側末端。 高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスの増殖カイネティクス及びHA力価。(A)指示されたヤマガタ-リネージの野生型ウイルスを、ヤマガタ-リネージの高収率候補RG(Yam)♯8(表3)及びPA-a2272t突然変異を有するRG(Yam)♯8と比較した; 後者のウイルスは、リード候補H(Yam)として選択された。(B)指示されたビクトリア-リネージの野生型ウイルスを、ビクトリア-リネージ高収率候補RG(Vic)♯2(表4)及びPA-a2272t突然変異を有するRG(Vic)と比較した; 後者のウイルスはリード候補HY(Vic)として選択した。両方の実験セットにおいて、MDCK細胞は、指示されたウイルスを用い、0.001モルで3回感染させ、35℃でインキュベートした。指示された時点で、ウイルス及び赤血球凝集力価を、それぞれ、プラークアッセイ又は赤血球凝集アッセイを実行することによって決定した。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色アスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す; ベージュ色のアスタリスクは、赤色と青色で描かれた前記ウイルスの比較を示す。 高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスの増殖カイネティクス及びHA力価。(A)指示されたヤマガタ-リネージの野生型ウイルスを、ヤマガタ-リネージの高収率候補RG(Yam)♯8(表3)及びPA-a2272t突然変異を有するRG(Yam)♯8と比較した; 後者のウイルスは、リード候補H(Yam)として選択された。(B)指示されたビクトリア-リネージの野生型ウイルスを、ビクトリア-リネージ高収率候補RG(Vic)♯2(表4)及びPA-a2272t突然変異を有するRG(Vic)と比較した; 後者のウイルスはリード候補HY(Vic)として選択した。両方の実験セットにおいて、MDCK細胞は、指示されたウイルスを用い、0.001モルで3回感染させ、35℃でインキュベートした。指示された時点で、ウイルス及び赤血球凝集力価を、それぞれ、プラークアッセイ又は赤血球凝集アッセイを実行することによって決定した。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色アスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスとの比較を示す; ベージュ色のアスタリスクは、赤色と青色で描かれた前記ウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 異なるHA及びNA vRNAを有する野生型及び高収率ウイルスの比較。それぞれの天然野生型単離株(WT)、又はHA(Yam)(A～C)若しくはHY(Vic)(D～F)の単離株の内部vRNAセグメントと組み合わせて指示されたウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルス(黒色のグラフによって指示されたウイルスは、ヒトB型インフルエンザウイルス単離株の8つの野生型vRNAセグメントを有する)。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。 HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンの交換。(A及びB)2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを保有するウイルスとの比較。(C及びD) 2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを有するウイルスとの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す; ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンの交換。(A及びB)2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを保有するウイルスとの比較。(C及びD) 2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを有するウイルスとの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す; ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンの交換。(A及びB)2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを保有するウイルスとの比較。(C及びD) 2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを有するウイルスとの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す; ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンの交換。(A及びB)2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを保有するウイルスとの比較。(C及びD) 2つの野生型ヤマガタ-リネージウイルスのウイルス及び赤血球凝集力価とHY(Yam)又はHY(Vic)の内部遺伝子と組み合わせて同一のHA及びNA vRNAを有するウイルスとの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。P値を、線形混合モデルを用いて算出した(*P < 0.05; **P < 0.01)。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す; ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01); 高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01); 高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01); 高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01); 高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01); 高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 高収率インフルエンザウイルスA及びBワクチンウイルスバックボーンの比較。(A及びB)(i)指示されたウイルス; (ii)指示されたHA及びNA vRNAをHY(Yam)の内部遺伝子と組み合わせて有するウイルス; 及び(iii)指示されたA型/B型キメラHA及びNA vRNAを高収率A型インフルエンザウイルスの内部遺伝子と組み合わせを有するウイルスのウイルス収率及び赤血球凝集力価。(C及びD)で比較した。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った。(E及びF)孵化鶏卵における指示された野生型及びハイブリッドウイルスの比較。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性を、線形混合モデル(A～D)を用いることによって、又は２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテスト（Tukey’s post hoc test）(E及びF)によって決定した(*P < 0.05; **P < 0.01);高収率ワクチン候補の力価が野生型ウイルスの力価よりも低い場合、P値は示されていない。赤色及び青色のアスタリスクは、それぞれのウイルスとWTウイルスの比較を示す。ベージュのアスタリスクは、赤色及び青色で描かれたウイルスの比較を示す。 HY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの全ウイルスタンパク質収率及びHA含量の評価。A) 同一の天然野生型ウイルス(WT)又はHY(Yam)の内部vRNAと組み合わせて、示されたヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルスの比較。B) 示されたビクトリア-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルスと、同一の野生型ウイルス(WT)又はHY(Vic9の内部vRNAとの組合せでの比較。スクロース勾配精製ウイルスサンプルであるMDCK細胞増殖の全ウイルスタンパク質収率を示す(左及び中央)。PNGaseF処理は、HA1及びHA2を脱グリコシル化する; グリコシル化HA2がM1と同様の分子量で移動するため、この処理を実施した。HA含量(右)は、前記全ウイルスタンパク質量及びHAの相対量に基づいて計算した。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定（Dunnett’s test）を用いて評価し、野生型ウイルスの全ウイルスタンパク質収率及びHA含量を組換え高収率ワクチンウイルスと比較した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 HY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの全ウイルスタンパク質収率及びHA含量の評価。A) 同一の天然野生型ウイルス(WT)又はHY(Yam)の内部vRNAと組み合わせて、示されたヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルスの比較。B) 示されたビクトリア-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを有するウイルスと、同一の野生型ウイルス(WT)又はHY(Vic9の内部vRNAとの組合せでの比較。スクロース勾配精製ウイルスサンプルであるMDCK細胞増殖の全ウイルスタンパク質収率を示す(左及び中央)。PNGaseF処理は、HA1及びHA2を脱グリコシル化する; グリコシル化HA2がM1と同様の分子量で移動するため、この処理を実施した。HA含量(右)は、前記全ウイルスタンパク質量及びHAの相対量に基づいて計算した。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定（Dunnett’s test）を用いて評価し、野生型ウイルスの全ウイルスタンパク質収率及びHA含量を組換え高収率ワクチンウイルスと比較した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 マウスにおけるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの病原性。A～C) B/マサチューセッツ/2/2012 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ヤマガタ-リネージウイルス(B/マサチューセッツ/2/2012)とB/ヤマガタ/1/73の残存vRNAとの組合せ(ウイルスライブラリーの作成に使用される)、及びB/マサチューセッツ/2/2012 HA及びRAをHY(Yam)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスとの比較。D～F) B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーの作成に使用される)の残存vRNAと組み合わせて、B/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAを有するウイルスである野生型ビクトリア系統ウイルス(B/ブリスベン/60/2008)、及びB/ブリスベン/60/2008 HA及びNA vRNAをHY(Vic)の残存vRNAと組み合わせて有するウイルスの比較。BALB/cマウス（1群あたり5匹）に、10⁶pfuの指示されたウイルスを鼻腔内接種し、体重変化（A及びD）及び生存（B及びE）について毎日モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、指示されたウイルス10⁶pfuを用いて10匹の追加のマウスに感染させた。感染後3日目及び6日目に、各群のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺ウイルス力価を測定した(C及びF)。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 単一リアソータントウイルスの増殖カイネティクス及び赤血球凝集力価。A) ヤマガタ-リネージウイルスライブラリーの作成(B/ヨコハマ/UT-K31/2012のHA及びNA vRNAを用いたB/ヤマガタ/1/73)に用いた前記親ウイルスとHY(Yam)の個々のvRNAも有するウイルスの比較。B) ビクトリア-リネージのウイルスライブラリーの作成(すなわち、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAを用いたB/ヤマガタ/1/73)に用いた前記親ウイルスとHY(Vic)の個々のvRNAも有するウイルスとの比較。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±SDが示されている。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性は、線形混合モデルを用いて決定した(*P < 0.05; **P < 0.01)。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとコンパレータウイルスとの比較を示す(黒色で描かれている)。 単一リアソータントウイルスの増殖カイネティクス及び赤血球凝集力価。A) ヤマガタ-リネージウイルスライブラリーの作成(B/ヨコハマ/UT-K31/2012のHA及びNA vRNAを用いたB/ヤマガタ/1/73)に用いた前記親ウイルスとHY(Yam)の個々のvRNAも有するウイルスの比較。B) ビクトリア-リネージのウイルスライブラリーの作成(すなわち、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAを用いたB/ヤマガタ/1/73)に用いた前記親ウイルスとHY(Vic)の個々のvRNAも有するウイルスとの比較。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±SDが示されている。示された値は、3回の独立した実験の平均±SDである。統計的有意性は、線形混合モデルを用いて決定した(*P < 0.05; **P < 0.01)。アスタリスクの色は、それぞれのウイルスとコンパレータウイルスとの比較を示す(黒色で描かれている)。 35℃でのミニレプリコンアッセイにおけるルシフェラーゼ活性。NPタンパク質又はPA及びNS vRNAにおける突然変異がウイルスポリメラーゼ活性に及ぼす影響。293T(A)又はMDCK(B)細胞に、ポリメラーゼタンパク質及び野生型又は突然変異NPのタンパク質を発現するプラスミド、及びルシフェラーゼをコードするウイルス様RNAを転写するプラスミドを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、MDCK細胞に、上記のタンパク質発現プラスミド、及びルシフェラーゼをコードし及び前記PA vRNA(C)又はNS vRNA(D)の非コード領域に支持された突然変異を有する野生型又は突然変異ウイルス様RNAを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示されている。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 35℃でのミニレプリコンアッセイにおけるルシフェラーゼ活性。NPタンパク質又はPA及びNS vRNAにおける突然変異がウイルスポリメラーゼ活性に及ぼす影響。293T(A)又はMDCK(B)細胞に、ポリメラーゼタンパク質及び野生型又は突然変異NPのタンパク質を発現するプラスミド、及びルシフェラーゼをコードするウイルス様RNAを転写するプラスミドを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、MDCK細胞に、上記のタンパク質発現プラスミド、及びルシフェラーゼをコードし及び前記PA vRNA(C)又はNS vRNA(D)の非コード領域に支持された突然変異を有する野生型又は突然変異ウイルス様RNAを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示されている。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 35℃でのミニレプリコンアッセイにおけるルシフェラーゼ活性。NPタンパク質又はPA及びNS vRNAにおける突然変異がウイルスポリメラーゼ活性に及ぼす影響。293T(A)又はMDCK(B)細胞に、ポリメラーゼタンパク質及び野生型又は突然変異NPのタンパク質を発現するプラスミド、及びルシフェラーゼをコードするウイルス様RNAを転写するプラスミドを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、MDCK細胞に、上記のタンパク質発現プラスミド、及びルシフェラーゼをコードし及び前記PA vRNA(C)又はNS vRNA(D)の非コード領域に支持された突然変異を有する野生型又は突然変異ウイルス様RNAを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示されている。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 35℃でのミニレプリコンアッセイにおけるルシフェラーゼ活性。NPタンパク質又はPA及びNS vRNAにおける突然変異がウイルスポリメラーゼ活性に及ぼす影響。293T(A)又はMDCK(B)細胞に、ポリメラーゼタンパク質及び野生型又は突然変異NPのタンパク質を発現するプラスミド、及びルシフェラーゼをコードするウイルス様RNAを転写するプラスミドを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、MDCK細胞に、上記のタンパク質発現プラスミド、及びルシフェラーゼをコードし及び前記PA vRNA(C)又はNS vRNA(D)の非コード領域に支持された突然変異を有する野生型又は突然変異ウイルス様RNAを遺伝子導入した。48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た; 平均力価±s.d.が示されている。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてダネット検定を用いて評価した(*P < 0.05; **P < 0.01)。 HA、NP及びM1 VLPの統合及び組成に対するHYバックボーンにおけるM1突然変異の寄与。293T細胞を、HA、NA、NP、BM2、NS2、及び野生型又は突然変異体M1のタンパク質発現プラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入の48時間後、細胞培養上清中の細胞溶解物及びVLPを、抗HA、抗NP、及び抗M1モノクローナル抗体でウェスタンブロットした。HA、NP、及びM1のバンド強度を、ImageJソフトウェア(NIH)を用いて定量し、VLP中のHA、NP、及びM1の相対パーセンテージを、(B)に示す。データは、3回の独立した実験から得た。平均力価±s.d.を示す。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてテューキーポストホックテストを用いて決定した(*p<0.05; **p<0.01)。 HA、NP及びM1 VLPの統合及び組成に対するHYバックボーンにおけるM1突然変異の寄与。293T細胞を、HA、NA、NP、BM2、NS2、及び野生型又は突然変異体M1のタンパク質発現プラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入の48時間後、細胞培養上清中の細胞溶解物及びVLPを、抗HA、抗NP、及び抗M1モノクローナル抗体でウェスタンブロットした。HA、NP、及びM1のバンド強度を、ImageJソフトウェア(NIH)を用いて定量し、VLP中のHA、NP、及びM1の相対パーセンテージを、(B)に示す。データは、3回の独立した実験から得た。平均力価±s.d.を示す。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてテューキーポストホックテストを用いて決定した(*p<0.05; **p<0.01)。 IFN活性に対するNS1変異の効果。A) IFN-β合成を阻害する野生型及び突然変異NS1の能力を比較するために、293T細胞に、野生型又はNS1タンパク質発現プラスミド及び前記IFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-βを遺伝子導入した。細胞を24時間インキュベートし、5MOlでセンダイウイルスを感染させ、再び24時間インキュベートし、次いで溶解してホタルルシフェラーゼを測定した。B)IFN-β刺激遺伝子の合成を阻害する野生型及び突然変異NS1の能力を決定するために、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及びレポータープラスミドplSRE-Luc(インターフェロン調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする)を遺伝子導入した。24時間後、細胞をヒトIFN-βで刺激した。遺伝子導入の48時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た。平均力価±s.d.を示す。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてテューキーポストホックテストを用いて決定した(*p<0.05; **p<0.01)。 IFN活性に対するNS1変異の効果。A) IFN-β合成を阻害する野生型及び突然変異NS1の能力を比較するために、293T細胞に、野生型又はNS1タンパク質発現プラスミド及び前記IFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-βを遺伝子導入した。細胞を24時間インキュベートし、5MOlでセンダイウイルスを感染させ、再び24時間インキュベートし、次いで溶解してホタルルシフェラーゼを測定した。B)IFN-β刺激遺伝子の合成を阻害する野生型及び突然変異NS1の能力を決定するために、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及びレポータープラスミドplSRE-Luc(インターフェロン調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする)を遺伝子導入した。24時間後、細胞をヒトIFN-βで刺激した。遺伝子導入の48時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。データは、3回の独立した実験から得た。平均力価±s.d.を示す。統計的有意性は、1元配置分散分析を用いて、続いてテューキーポストホックテストを用いて決定した(*p<0.05; **p<0.01)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。 選択されたHYクローンにおけるウイルスセグメントのヌクレオチド配列(ヤマガタ1/73からのPB2及びPB1; 配列番号11及び12); a1406g/c1445t/a2272tを有するヤマガタ1/73からのPA(配列番号13); P40S, c500tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号14)又はP40S/M204Tを有するヤマガタ1/73からのNP(配列番号15); R77Kを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号16)又はM86Tを有するヤマガタ1/73からのM(配列番号17); 及びa39g K176Qを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号18)又は38(+1)gを有するヤマガタ1/73からのNS(配列番号19)。

定義
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、本発明の核酸分子(例えば、ベクター又はプラスミド)、ペプチド若しくはポリペプチド(タンパク質)、又はウイルスを指し、その結果、インビボ物質と関連しないか、又はインビトロ物質から実質的に精製される。単離されたウイルス調製物は、一般に、インビトロ培養及び増殖によって、及び/又は卵における継代培養を経て得られ、他の感染因子を実質的に含まない。

本明細書中で使用される場合、「実質的に精製された」とは、対象の種が、優勢な種であることを意味し、例えば、モル基準で、組成物中の何れか他の個々の種よりも方法であり、好ましくは存在する種の少なくとも約80%より大きい、及び任意で、前記組成物中に存在する種の90%又はそれ以上(例えば、95%、98%、99%又はそれ以上)である。

本明細書中で使用される場合、「実質的に含まない」とは、その薬剤についての標準的な検出方法を用いて、特定の感染性薬剤の検出レベル未満を意味する。

「組換え」ウイルスは、前記ウイルスのゲノムに変化を導入するために、例えば、組換えDNA技術を用いてインビトロで操作されたウイルスである。リアソータントウイルスは、組換え又は非組換え技術によって調製することが出来る。

本明細書中で使用される場合、用語「組換え核酸」又は「組換えDNA配列又はセグメント」は、インビトロで化学的に後に改変され得る、例えばソースに由来するか、又は単離されたDNA等の核酸を指し、その結果、その配列は天然に存在しないか、又はそれらが天然ゲノムに存在するように位置付けられていない自然発生配列に対応する。ソースから「誘導された」DNAの例は、有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形態で化学的に合成される配列であり得る。ソースから「単離された」そのようなDNAの一例は、例えば、制限酵素の使用によって、化学的手段によって前記ソースから切り取られ又は除去される有用なDNA配列であり、その結果、遺伝子工学の方法論によって本発明のためにそれをさらに操作(例えば、増幅)することが出来る。

本明細書中で使用される場合、「異種（heterologous）」インフルエンザウイルス遺伝子又は遺伝子セグメントは、組換え(例えば、リアソータント)インフルエンザウイルスにおける他のインフルエンザウイルス遺伝子又は遺伝子セグメントの大部分とは異なるインフルエンザウイルスソース由来である。

用語「単離ポリペプチド」、「単離ペプチド」又は「単離タンパク質」は、合成起源のもの、又はそのいくつかの組合せを含む、cDNA又は組換えRNAによってコードされるポリペプチド、ペプチド又はタンパク質を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を指す。対照的に、用語「天然タンパク質」は、天然に存在する(例えば、非組み換えの)ソースから単離されたタンパク質を示すために本明細書で使用される。分子生物学的技術は、前記タンパク質の天然型と比較して同一の特性を有する組換え型を産生するために用いられ得る。

比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野において周知である。従って、何れか2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することが出来る。

これらの数学的アルゴリズムのコンピュータによる実施を、配列の同一性を決定するために配列の比較に利用することが出来る。これらのプログラムを使用するアライメントを、デフォルトのパラメータを使用して実行することが出来る。BLAST解析を実行するソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に利用可能である。当該アルゴリズムは、クエリ配列における長さWの短い単語を認識することによって高いスコアリング配列ペア(HSPs)を最初に同定することを含み、これはデータベース配列内の同じ長さのワードに位置合わせされたときに、ある正の値の閾値スコアTに一致するか又充足するかの何れかである。Tは、近傍ワードスコア閾値と称される。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけるために検索を開始するための種として作用する。前記ワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させることが出来る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータM(一致する残基のペアについての報酬スコア; 常に>0)及びN(不一致残基についてのペナルティースコア; 常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを用いて前記累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ低下すると、各方向のワードヒットの延長が停止され、1つ以上のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積のために、前記累積スコアがゼロ以下になるか、何れかの配列の終わりに達する。

配列同一性のパーセントを計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析を行うことが出来る。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小合計確立(P(N))であってもよく、これは、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然起こる可能性の指標を提供する。例えば、テスト核酸配列とリファレンス核酸配列の比較における最小合計確立が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、テスト核酸配列は、リファレンス配列と類似していると考えられる。

BLASTプログラム(ヌクレオチド配列)は、11のワード長(W)、10の期待値(E)、100のカットオフ、M=5、N=4及び両方の鎖の比較をデフォルトとして用いることが出来る。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、3のワード長(W)、10の期待値(E)、及びBLOSUM62スコアリングマトリックスをデフォルトとして用いることが出来る。http://www.ncbi.n1m.nih.gov. 参照。アライメントは、検査によって手動で行うことも出来る。

配列比較のために、典型的には、1つの配列は、テスト配列が比較されるリファレンス配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト及びリファレンス配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、リファレンス配列に対するテスト配列のパーセント同一性を計算する。

B型インフルエンザウイルスの構造及びプロパゲーション（propagation）
B型インフルエンザウイルスは、少なくとも10個のタンパク質をコードする8つの一本鎖ネガティブセンスウイルスRNA(vRNA)のゲノムを保有する。前記インフルエンザウイルスのライフサイクルは、前記ホスト細胞の表面上のシアル酸含有受容体への赤血球凝集素(HA)の結合が始まり、次いで受容体介在性エンドサイトーシスが始まる。後期エンドソームにおける低pHは、HAにおける立体構造のシフトを誘発し、それによってHA2サブユニットのN末端(融合ペプチドと称される)を露出させる。融合ペプチドは、ウイルスとエンドソームの膜の融合を起こし、マトリックスタンパク質(M1)及びRNP複合体が、細胞質に放出される。RNPは、vRNAをカプセル化する核タンパク質（NP）と、PA、PB1、及びPB2タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。RNPは、転写及び複製が起こる核内に輸送される。前記RNAポリメラーゼ複合体は、5’キャップ及び3’ポリA構造を有するmRNAの合成、完全長相補RNA(cRNA)、及びcRNAを鋳型として用いたゲノムvRNAの3つの異なる反応を触媒する。次いで、新たに合成されたvRNA、NP、及びポリメラーゼタンパク質は、RNPに組み立てられ、核から輸出され、子孫ウイルス粒子の出芽が起こる原形質膜に輸送される。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去することにより感染の後期で重要な役割を担い、前記細胞表面から新しく組み立てられたビリオンを放出し、ウイルス粒子の自己凝集を防止する。ウイルスアセンブリは、タンパク質-タンパク質及びタンパク質-vRNA相互作用を含むが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。

本発明のB型インフルエンザウイルス
細胞培養及び/又は孵化鶏卵におけるウイルスの複製能力を増加させる突然変異は、インフルエンザウイルスを増幅し、強力なインフルエンザワクチンプラットフォームを確立することに有効である。現在、ほとんどのB型インフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で作成される。MDCK細胞で作成されたインフルエンザワクチンは、現在、米国及び欧州でのヒトへの使用が承認されており、Vero細胞由来のインフルエンザワクチンは、ヒトへの使用が欧州で承認されている。本明細書に記載されるように、ワクチンウイルス単離株の「内部」ウイルス遺伝子(前記ウイルス表面糖タンパク質HA及びNAをコードするものを除くウイルス遺伝子)、例えば、B/ヨコハマ/UT-K31/2012(ヤマガタ-リネージを表す)由来のNA及びHA遺伝子又はB/ヨコハマ/UT-K1A/2011(ビクトリア-リネージを表す)由来のNA及びHA遺伝子を有するB/ヤマガタ1/73の内部遺伝子におけるランダム突然変異を保有するウイルスライブラリーは、細胞(例えば、MDCK又はVero細胞)において作成及び継代培養される。同定された突然変異は、より効率的なB型インフルエンザウイルスの増殖及びより費用効果の高いワクチン製造を可能にする、細胞においてより高いウイルス力価をもたらす(異種細胞及び/又は孵化鶏卵中のウイルス力価も増加し得る)。前記内部ウイルスセグメント及びウイルス糖タンパク質のコード領域における突然変異に加えて、非コード領域の突然変異は、ウイルス力価は、例えば、前記NPセグメントにおけるg1795a、前記NSセグメントにおけるa39g、前記NSセグメントにおける位置38の後のg追加、又は前記PAセグメントにおけるg2213a若しくはa2272t、を増加させることが観察された。増殖増強をもたらす得られたコード配列はまた、例えば、イヌ細胞又は霊長類細胞等の哺乳動物細胞又はニワトリ胚等の鳥類細胞における発現に最適化されたコドン使用頻度であり得る。前記突然変異は、様々な組み合わせで使用することができ、その結果は、使用中の細胞系統(又は卵)及び前記ウイルスの複製における所望するレベルの改善に影響される。1つ以上の選択された突然変異が、ワクチンウイルス単離株の1つ以上の内部遺伝子に導入されてもよく、1つ以上の突然変異を有する1つ以上の内部遺伝子を、ワクチンウイルスとして有用なリアソータントに含めるために選択され得る。次いで、そのウイルスを他のウイルス、例えば1つ以上のA型インフルエンザウイルス及び/又は1つ以上のB型インフルエンザウイルスと組み合わせて多価ワクチンを形成し得る。

本発明において使用され得る細胞株
何れかの細胞、例えば、何れかの鳥類若しくは哺乳類動物細胞、例えば、ヒト(293T又はPER.C6（登録商標）細胞)、又はイヌ(MDCK)、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、齧歯類(例えばミンク(例えば、MvLu1細胞))、又はハムスター(例えば、CHO細胞)、又は非ヒト霊長類(例えば、突然変異細胞を含む、Vero細胞)は、インフルエンザウイルスの効率的な複製をサポートし、インフルエンザウイルスを単離及び/又は増殖させるために使用され得る。単離されたウイルスは、リアソータントウイルスを調製するために使用され得る。一実施形態において、ワクチン製造のためのホスト細胞は、継代哺乳動物又は鳥類細胞株若しくは継代細胞系統である。使用される前記細胞の完全な特徴付けは、最終産物の純度に関する適切なテストを含めることが出来るように行われ得る。細胞の特徴付けに使用され得るデータは、(a) その起源、派生、及び継代培養履歴; (b) その増殖及び形態学的特徴に関する情報; (c) 外来性薬剤のテスト結果; (d) 前記細胞が、他の細胞株の中ではっきりと認識出来るようにする生化学的、免疫学的、及び細胞遺伝学的パターン等の特徴を区別すること; 及び(e) 腫瘍原生のテスト結果、を含む。一実施形態において、使用される前記ホスト細胞の継代培養レベル又は集団倍加は可能な限り低い。

一実施形態において、前記細胞は、WHO認定、又は証明可能な、継代細胞株である。このような細胞株を証明するための要件には、家系、生育特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性腫瘍原生及び保存条件の少なくとも1つに関する特徴付け、並びに動物、卵及び細胞培養におけるテストが含まれる。そのような特徴付けを用いて、前記細胞が検出可能な外来薬剤を含まないことを確認する。一部の国において、細胞核学が必要な場合もある。加えて、腫瘍原生は、ワクチン製造に使用されるものと同じ継代レベルである細胞においてテストされ得る。前記ウイルスは、ワクチン製造の前に一貫した結果を与えることが示されたプロセスによって精製され得る(例えば、World Health Organization, 1982参照)。

前記ホスト細胞によって産生されたウイルスは、ワクチン又は遺伝子治療製剤の前に高度に精製され得る。一般に、前記精製手順は、細胞DNA及び他の細胞成分、及び外来薬剤の広範な除去をもたらす。DNAを大幅に分解又は変性させる手順もまた、使用され得る。

インフルエンザワクチン
本発明のワクチンは、本発明の単離された組換えインフルエンザウイルス、及び任意で他の単離されたインフルエンザウイルスを含む1つ以上の他の単離されたウイルス、1つ以上の免疫原性タンパク質又は1つ以上の単離されたインフルエンザウイルスの糖タンパク質又は1つ以上の他の病原体(例えば、1つ以上の細菌由来の免疫原性タンパク質、非インフルエンザウイルス、酵母又は真菌)、又は本発明の単離されたインフルエンザウイルスの1つ以上の免疫原性タンパク質を含む1つ以上のウイルスタンパク質(例えば、DNAワクチン)をコードする単離された核酸、を含む。一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス又は他の病原体に対するワクチンベクターであり得る。

完全なビリオンワクチンは、限外濾過によって濃縮され得、次いで、ゾーン遠心分離又はクロマトグラフィーによって精製され得る。多価ワクチンに含まれるような本発明の前記ウイルス以外のウイルスは、例えば、ホルマリン又はβ-プロピオラクトンを用いた精製の前又は後に不活性化され得る。

サブユニットワクチンは、精製された糖タンパク質を含む。このようなワクチンは、以下のようにして調製され得る: 界面活性剤で処理することによって断片化したウイルス懸濁液を用いて、表面抗原を、例えば超遠心分離によって精製する。従って、サブユニットワクチンは、主にHAタンパク質及びNAタンパク質も含有する。使用される前記界面活性剤は、例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(Bachmeyer, 1975)等のカチオン性界面活性剤、アンモニウムデオキシコール酸等のアニオン性界面活性剤(Laver & Webster, 1976); 又はTRITON X 100の名称で市販されているような非イオン性界面活性剤であり得る。前記ヘマグルニチンはまた、前記ビリオンをブロメリン等のプロテアーゼで処理した後、精製され得る。前記サブユニットワクチンは、多価ワクチンにおいて本発明の弱毒化ウイルスと組合せられ得る。

スプリットワクチンは、脂質を溶解する薬剤で処理に供されたビリオン(virion)を含む。スプリットワクチンは、以下のように調製することが出来る: 上記のように得られた精製ウイルスの水性懸濁液を、不活性化した又は不活性化しないで、撹拌下で、界面活性剤に関連するエチルエーテル又はクロロホルムのような脂質溶媒で処理する。前記ウイルスエンベロープ脂質の溶解は、ウイルス粒子の断片化をもたらす。元の脂質環境が除去された赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ、並びにコア又はその分解産物を主成分とする前記スプリットワクチンを含有する水相を回収する。その後、まだ完了されていなければ、残留感染性粒子は、不活性化される。前記スプリットワクチンは、多価ワクチンにおける本発明の弱毒化ウイルスと組み合わせられ得る。

不活性化ワクチン
不活性化されたインフルエンザウイルスワクチンは、限定されないが、ホルマリン又はβ-プロピオラクトン処理等の既知の方法を用いて複製ウイルスを活性化することによって提供される。本発明において使用することが出来る不活性型ワクチン型は、全ウイルス(WV)ワクチン又はサブビリオン(SV)(スプリット)ワクチンを含むことが出来る。前記WVワクチンは、インタクトな不活性化ワクチンを含み、前記SVワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する界面活性剤で破壊された精製ウイルスを含み、その後残留ウイルスの化学的不活性化を含む。

加えて、使用することが出来るワクチンには、表面抗原又はサブユニットワクチンと称される、単離されたHA及びNA表面タンパク質を含むワクチンが含まれる。

生存弱毒化ウイルスワクチン
生存弱毒化インフルエンザウイルスワクチン、例えば本発明の組換えウイルスを含むワクチンを、インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するために使用することが出来る。弱毒化は、弱毒化ドナーウイルスから複製された単離株又はリアソータントウイルスへの既知の方法による弱毒化された遺伝子の移入によって単一工程で達成され得る。A型インフルエンザウイルスに対する耐性は、主にHA及び/又はNA糖タンパク質に対する免疫応答の発生によって媒介されるため、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、リアソータントウイルス又は臨床分離株に由来する。前記弱毒化遺伝子は、弱毒化親に由来する。このアプローチにおいて、弱毒化をもたらす遺伝子は、一般的に、HA及びNA糖タンパク質をコードしない。

インフルエンザウイルスを再現可能で弱毒化することが出来るウイルス(ドナーインフルエンザウイルス)が利用可能であり、例えば、低温適応(ca)ドナーウイルスを弱毒化ワクチン製造に用いることが出来る。生存、弱毒化リアソータントウイルスワクチンは、病原体の複製されたウイルスとcaドナーウイルスを交配することによって精製され得る。次いで、前記弱毒化caドナーウイルスの表面抗原を有するウイルスの複製を阻害する適切な抗血清の存在下で、リアソータントの子孫を、25℃(毒性ウイルスの複製にとって制限的である)で選択する。有用なリアソータントは、(a)感染性、(b)血清学的陰性の非成体哺乳動物及び免疫学的に初回刺激を受けた成体哺乳類動物についての弱毒化、(c) 免疫原性及び(d)遺伝的に安定、である。前記caリアソータントの前記免疫原性は、それらの複製レベルに匹敵する。従って、新しい野生型ウイルスによる前記caドナーウイルスの６つの転移可能な遺伝子の獲得は、成人及び非成人の両方の感受性の強い哺乳動物ワクチン接種に用いるためにこれらのウイルスを再現性良く弱毒化した。

これらの突然変異遺伝子を有するウイルスを救済するために、部位特異的突然変異誘発によってインフルエンザウイルス遺伝子に他の弱毒化突然変異を導入することが出来る。弱毒化突然変異を、前記ゲノムの非コード領域並びにコード領域に導入することが出来る。そのような弱毒化突然変異を、HA又はNA以外の遺伝子、例えばPB2ポリメラーゼ遺伝子に導入することも出来る。従って、部位特異的突然変異誘発によって導入された弱毒化突然変異を有する新規ドナーウイルスを作成することもでき、そのような新規ドナーウイルスは、前記caドナーウイルスについて上述と類似の様式で生存弱毒化リアソータントワクチン候補の作成において用いられ得る。同様に、他の既知であり且つ、適切な弱毒化ドナー系統を、インフルエンザウイルスとリアソートさせ、哺乳類の前記ワクチン接種における使用に適した弱毒化ワクチンを得ることが出来る。

一実施形態において、そのような弱毒化ウイルスは、前記オリジナルの臨床分離株の抗原決定基と実質的に同様の抗原決定基をコードする前記ウイルス由来の遺伝子を維持する。これは、前記弱毒化ワクチンの目的が、ウイルスの元の臨床分離株と実質的に同じ抗原性を提供することであるためであるが、前記ワクチンが、ワクチン接種された哺乳動物において重大な疾患状態を誘導する可能性を最小限に抑える程度に病原性を欠いている。

従って、多価ワクチンにおける前記ウイルスは、動物(例えば、哺乳動物)において、免疫応答を誘導するためのワクチンとして、既知の方法に従って、弱毒化又は不活化され、製剤化され及び投与され得る。そのような弱毒化ワクチン又は不活性化ワクチンが臨床分離株又はそれから誘導される高い増殖系統と類似の抗原性を維持しているか否かを決定するための方法は当該技術分野において周知である。そのような既知の方法は、前記ドナーウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを排除するための血清又は抗体の使用; 化学的選択(例えば、アマンタジン又はリマンチジン); HA及びNA活性及び阻害; 及び前記抗原決定基(例えば、HA又はNA遺伝子)をコードするドナー遺伝子が、前記弱毒化ウイルスに存在しないことを確認するための核酸スクリーニング(例えば、プローブハイブリダイゼーション又はPCR)を含む。

医薬組成物
接種に適した(例えば、鼻、非経口又は経口投与)本発明の医薬組成物は、1つ以上のインフルエンザ単離株、例えば1つ以上の弱毒化又は不活性化インフルエンザウイルス、そのサブユニット、及び/又は1つ以上のそのタンパク質をコードする単離された核酸を含み、任意で滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルジョンをさらに含む。前記組成物は、当該分野で公知の補助剤又は賦形剤をさらに含むことが出来る。本発明の組成物は、一般に、個々の用量(単位用量)の形態で提示される。

従来のワクチンは、一般に、その組成物に入る各系統由来の約0.1～200μg、例えば、30～100μgのHAを含む。本発明の前記ワクチン組成物の主成分を形成するワクチンは、単一のインフルエンザウイルス、又は1つ以上のリアソータントを含む少なくとも2つ又は3つのインフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスの組合せを含むことが出来る。

非経口投与のための調節物には、当該分野で公知の補助剤又は賦形剤を含み得る滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び/又はエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の有機エステルである。担体又は密封包帯剤は、皮膚浸透性を高め、抗原吸収を増強するために使用され得る。経口投与のための液体投与形態は、一般に、前記液体投与形態を含むリポソーム溶液を含み得る。リポソームを懸濁するために適した形態は、精製水等の当該分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有するエマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、及びエリキシルを含む。このような組成物はまた、不活性希釈剤の他にアジュバント、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、又は甘未剤、香味剤、又は芳香剤を含むことが出来る。

本発明の組成物を個々に投与するために使用する場合、前記組成物の有効性を改善するために望ましい塩、緩衝剤、アジュバント、又は他の物質をさらに含むことが出来る。ワクチンに関して、特定の免疫応答を増強することが出来るアジュバント、物質を使用することが出来る。通常、前記アジュバント及び前記組成物は、免疫系に提示する前に混合されるか、又は別々であるが、免疫される生物の同じ部位に存在する。

ワクチン中の不均一性は、少なくとも2種のインフルエンザウイルス系統、例えば2～20系統又は何れかの範囲又はその中の値で複製されたインフルエンザウイルスを混合することによって提供され得る。当該分野で公知の技術を用いて、ワクチンを、インフルエンザウイルスの単一の系統におけるバリエーションのために提供することが出来る。

本発明による医薬組成物は、少なくとも1つの化学療法化合物、例えば、遺伝子療法のための免疫抑制剤、抗炎症剤若しくは免疫増強剤、及びワクチンのための、限定されないが、ガンマグロブリン（gamma globulin）、アマンタジン（amantadine）、グアニジン（guanidine）、ヒドロキシベンゾイミダゾール（hydroxybenzimidazole）、インターフェロン-α（interferon-α）、インターフェロン-β（interferon-β）、インターフェロン-γ（interferon-γ）、腫瘍壊死因子-アルファ（tumor necrosis factor-alpha）、チオセミカルバゾン（thiosemicarbarzones）、メチアゾン（methisazone）、リファンピン（rifampin）、リバビリン（ribavirin）、ピリミジンアナログ（pyrimidine analog）、プリンアナログ（purine analog）、フォスカーネット（foscarnet）、ホスホノ酢酸（phosphonoacetic acid）、アシクロビル（acyclovir）、ジデオキシヌクレオシド（dideoxynucleosides）、プロテアーゼ阻害剤（protease inhibitor）、又はガンシクロビル（ganciclovir）を含む化学療法薬、をさらに又は付加的に含み得る。

前記組成物は、可変であるが少量のエンドトキシンを含まないホルムアルデヒド、及び安全であることが見出され且つ、前記組成物が投与される生物における望ましくない効果を与えない防腐剤も含み得る。

医薬品の目的
前記組成物(又はそれが惹起する抗血清)の投与は、「予防的」又は「治療的」目的のためのものであり得る。予防的に提供される場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状又は臨床兆候が現れる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、その後の何れかの感染を予防又は軽減するために役立つ。予防的に提供される場合、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の何れかの症状又は臨床兆候が現れる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、前記疾患に関連する1つ以上の症状又は臨床兆候を予防又は軽減するために働く。

治療的に提供される場合、実際の感染の症状又は臨床兆候の検出時にウイルスワクチンが提供される。前記化合物の治療的投与は、実際の感染の何れかを弱めるために働く。治療的に提供される場合、遺伝子療法組成物は、前記疾患の症状又は臨床兆候の検出時に提供される。前記化合物の治療的投与は、その疾患の症状又は臨床兆候を弱めるために働く。

従って、本発明のワクチン組成物は、感染の症状の前(予期される感染を予防又は弱めるため)又は実際の感染の開始後の何れかに提供され得る。同様に、遺伝子治療のために、前記組成物は、障害又は疾患の症状又は臨床兆候の何れかが現れる前、又は1つ以上の症状が検出された後に提供され得る。

組成物は、その投与がレシピエント哺乳動物によって許容され得る場合、「薬理学的に許容される」と称される。そのような薬剤は、投与される量が、生理学的に有意である場合、「治療的有効量」で投与されると称される。本発明の組成物は、その存在がレシピエント患者の生理学における検出可能な変化をもたらす場合、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも1つの系統に対する少なくとも1つの一次又は二次体液性又は細胞性免疫応答を増強する場合に生理学的に重要である。

提供される「保護」は、絶対的である必要はなく、すなわち、コントロール個体群又は哺乳動物のセットと比較して統計的に有意な改善がある場合、前記インフルエンザ感染を完全に予防又は根絶する必要はない。保護は、前記インフルエンザ感染の症状の発現又は臨床兆候の重症度又は迅速性を軽減することに限定され得る。

医薬品の管理
本発明の組成物は、受動免疫又は能動免疫の何れかによって、1つ以上の病原体、例えば1つ以上のインフルエンザウイルス系統に耐性を付与することが出来る。能動免疫において、弱毒化生存ワクチン組成物は、ホスト(例えば、哺乳動物)に予防的に投与され、投与に対する前記ホストの免疫応答は、感染及び/又は疾患に対して保護される。受動免疫のために、誘発された抗血清を回収し、少なくとも1つのインフルエンザウイルス系統によって引き起こされる感染を有することが疑われるレシピエントに投与することが出来る。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫によって所望の遺伝子産物の予防又は治療レベルをもたらすことが出来る。

一実施形態において、前記ワクチンは、雌及び胎児若しくは新生児(胎盤中又は母乳中の抗体の受動取り込みを介して)の両方を保護するために働く免疫応答の産生を引き起こすために十分な時間と量の条件下で哺乳類の雌(妊娠又は出産時又はその前で)に提供される。

従って、本発明は、障害又は疾患、例えば病原体の少なくとも1つの系統による感染による感染を予防又は弱めるための方法を含む。本明細書で使用される場合、ワクチンは、その投与が疾患の臨床兆候又は症状の全部または部分的な弱毒化(すなわち、抑制)、又は前記疾患に対する固体の全体的又は部分的な免疫性の何れかをもたらす場合、疾患を予防又は弱めると称される。本明細書で使用される場合、遺伝子治療組成物の投与が、疾患の臨床兆候又は症状の全部又は部分的弱毒化(すなわち、抑制)の何れかをもたらす場合、遺伝子治療組成物は、疾患を予防する又は弱めると称される。

弱毒化されたインフルエンザウイルス及び1つ以上の他の単離されたウイルス、1つ以上のその単離されたウイルスタンパク質、1つ以上のそのウイルスタンパク質をコードする1つ以上の単離された核酸分子、又はそれらの組合せを含む、本発明の1つ以上のインフルエンザウイルスを有する組成物は、意図された目的を達成する何れかの手段によって投与され得る。

例えば、このような組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口又は経皮経路等の様々な非経口経路によるものであり得る。非経口投与は、ボーラス注射又は経時的な段階的パーヒュージョン(perfusion)によって達成され得る。

インフルエンザウイルスに関連する病状を予防、抑制又は治療するための典型的なレジメンは、1回の治療として投与される、又は1週間～約24ヶ月、又はその中の任意の範囲若しくは値までの期間にわたり、増強若しくはブースター投薬として繰り返される。

本発明によれば、組成物の「有効量」は、所望の効果を達成するために十分な量である。前記有効投与量は、前記レシピエントの種、年齢、性別、健康状態及び体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存し得ることが理解される。以下に提供される有効用量の範囲は、本発明を限定することを意図せず、及び用量範囲を表す。

哺乳類の成体生物等の動物のための生存弱毒化又は死滅ウイルスワクチンの投与量は、約10²-10¹⁵、例えば、10³-10¹²プラーク形成単位(PFU)、又はその中の何れかの範囲若しくは値であり得る。不活性化ワクチンの用量は、約0.1～1000、例えば30～100μgのHAタンパク質の範囲であり得る。しかしながら、既存のワクチンを出発点として、前記投与量は、従来の方法で決定される安全且つ、有効な量でなければならない。

複製されたウイルスワクチンの各用量における免疫反応性HAの投与量は、適切な量、例えば30～100μg又はその中の何れかの範囲若しくは値、又は政府機関若しくは認証専門機関によって推奨される量を含むように標準化され得る。NAの量もまた、標準化され得るが、この糖タンパク質は精製及び保存中に不安定であり得る。

複製されたウイルスワクチンの各用量における免疫反応性HAの投与量は、適切な量、例えば1～50μg又はその中の何れかの範囲若しくは値、又は米国公衆衛生局(PHS)が推奨する量を含むように標準化され得、これは通常、年上の子供(3歳以上)の場合は1成分あたり15μg、3歳未満の子供の場合は、1成分当たり7.5μgである。NAの量もまた、標準化され得るが、この糖タンパク質は、プロセッサ精製及び保存に不安定であり得る(Kendal et al., 1980; Kerr et al., 1975)。各0.5ml容量のワクチンは、約1～500億個のウイルス粒子、好ましくは100億個の粒子を含み得る。

例示的な実施形態
一実施形態において、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、
例えば、これに限定されないが、34位にT以外の残基、129位にK以外の残基、168位にN以外の残基、196位にT以外の残基、又はそれら何れかの組合せの残基を含むHAにおける残基; 限定されないが、169位にN以外の残基、及び/又は434位にG以外の残基を含むNAにおける残基; 限定されないが、28位にアラニン(A)以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、1795ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチド、又はそれらの組合せを含むNPにおける残基; 限定されないが、34位にG以外の残基、54位にアスパラギン酸(D)以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基を含むM1における残基; 限定されないが、58位にH以外の残基、及び/又は80位にR以外の残基を含むBM2における残基; 限定されないが、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基、39位にa以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組み合わせ等のMDCK細胞における複製を増強するアミノ酸を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、例えば、HA1において、34位に残基I、129位に残基E、168位にE、D、196位にP、イソロイシン(I)、A又はN、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、169位に残基T及び/又は434位に残基E; NPにおいて、28位に残基T、40位に残基S、51位に残基Q、52位に残基K、57位に残基G、214位に残基T、1795ヌクレオチド位でg、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位に残基バリン(V)又はN、54位に残基G、77位に残基K、86位に残基T、97位に残基N、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位に残基R及び/又は80位に残基Gを含み; NS1において、117位に残基チロシン(Y)、176位に残基グルタミン(Q)、252位に残基T、39ヌクレオチド位にg、38ヌクレオチド位の後にg付加、又はそれら何れかの組合せ等のMDCK細胞における増強された複製をもたらすアミノ酸を有する。

一実施形態において、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、例えば、これに限定されないが、98位にR以外の残基、194位にN以外の残基、及び/又は196位にT以外の残基を含むHA1における残基、及び/又は限定されないが、39位にK以外の残基、56位にS以外の残基、61位にK以外の残基、又は112位にD以外の残基、又はそれら何れかの組合せを含むHA2における残基; 限定されないが、76位にT以外の残基、102位にR以外の残基、105位にE以外の残基、139位にP以外の残基、436位にT以外の残基、457位にD以外の残基、又はそれら何れかの組合せを含むNaにおける残基; 限定されないが、343位にP以外の残基を含むNPにおける残基; 34位にG以外の残基、97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せを含むM1における残基; 58位にH以外の残基、80位にR以外の残基、27位にH以外の残基、26位にG以外の残基、又はそれら何れかの組合せを含むBM2における残基; 限定されないが、42位にY以外の残基を含むNS1における残基; 387位にY以外の残基、434位にV以外の残基、494位にD以外の残基、524位にT以外の残基、ヌクレオチド位2272にa以外のヌクレオチド、ヌクレオチド位2213にg以外のヌクレオチドを含むPAにおける残基、16位にN以外のの残基を含むPB2における残基; 又はそれら何れかの組合せ、等のVero細胞において複製を増強するアミノ酸を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、HAにおいて、196位にP、I、A又はN(HA1において)、98位に残基K(HA1において)、194位に残基D(HA1において)、39位に残基G(HA2において)、56位に残基G(HA2において)、51位に残基N(HA2において)、又は112位に残基E(HA2において)、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、76位に残基M、102位に残基K、105位に残基K、139位に残基S、436位に残基M、及び/又は457位に残基N、又はそれら何れかの組合せ; NPにおいて、343位に残基T; M1において、34位に残基V又はN及び/又は97位に残基Nを含む; BM2において、58位に残基R、80位に残基G、27位に残基R、26位に残基R、又はそれら何れかの組合せ; NS1において残基N; PAにおいて、387位に残基H、434位に残基A、494位に残基N、534位に残基A、ヌクレオチド位2272にg、ヌクレオチド位2213にt; PB2において16位に残基S; 又はそれら何れかの組合せ等のVero細胞における複製を増強するアミノ酸を有する。

一実施形態において、B/ヤマガタ-リネージに関連するウイルスについて、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、HA1において、129位にK以外、168位にN以外、194位にN以外、196位にT以外、112位にD以外、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、76位にT以外、102位にR以外、105位にE以外、139位にP以外、434位にG以外、436位にT以外、457位にD以外、又はそれら何れかの組合せ; NPにおいて、52位にE以外、57位にS以外、343位にP以外、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位にG以外、77位にR以外、97位にI以外のアミノ酸、又はNP vRNAにおいて、500位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位にH以外、80位にR以外、27位にH以外、26位にG以外、又はそれら何れかの組合せ; NS1において、117位にM以外、252位にS以外、及び/又はPAにおける494位にD以外、及び/又はPA vRNAにおいて2272位にa以外のヌクレオチド、2213ヌクレオチド位にg以外、1406位にa以外、及び/又は1445位にc以外、又はそれら何れかの組合せ; PB2において、16位にN以外の残基; 又はそれら何れかの組合せ、のアミノ酸を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、HA1において、129位にE、168位にD; 196位にP、194位にD、HA2において、112位、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、76位にM、102位にK、105位にK、139位にS、434位にE、436位にM、及び/又は457位にN、又はそれら何れかの組合せ; NPにおいて、52位にK、57位にG、343位にT、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位にV又はN、77位にK、97位にN、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位にR、80位にG、27位にR、26位にR、又はそれら何れかの組合せ; NS1において、117位にY、252位にT、又はそれら何れかの組合せ; PAにおいて、494位にN、2272位にt、2213位にa; PB2において、16位にS; 又はそれら何れかの組合せ、を含む。

一実施形態において、B/ビクトリア-リネージに関連したB型インフルエンザウイルスについて、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、HA1において、34位にT以外、98位にR以外、196位にT以外、及び/又はHA2において、39位にK以外、56位にS以外、61位にK以外の残基、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、169位にN以外、及び/又は457位にD以外; NPにおいて、28位にA以外、40位にP以外、51位にP以外、204位にM以外、又はNP vRNAにおいて、1795位にg以外又は500位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せ; M1において、54位にD以外及び/又は86位にM以外; BM2において、80位にR以外; NS1において、42位にY以外、176位にK以外、39位にa以外のヌクレオチド; PAにおいて、387位にY以外、434位にV以外、524位にT以外のアミノ酸、又はPA vRNAにおいて、2272ヌクレオチド位でa以外、2213ヌクレオチド位でg以外、1406位でa以外のヌクレオチド、1445位でc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せ、を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、HA1において、34位にI、196位にP、I、A又はN、98位にK、及びHA2において、39位にG、56位にG、61位にN、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、169位にT及び/又は457位にN; NPにおいて、28位にT、40位にS、51位にQ、204位にT、1795位にa、又はそれら何れかの組合せ; M1において、54位にG及び/又は86位にT; BM2において、80位にG; NS1において、42位にN、176位にQ、39位にg、38位の後にg付加; PAにおいて、387位にH、434位にA、534位にA、2272位にt、2213位にa、又はそれら何れかの組合せ、を有するアミノ酸を有する。

一実施形態において、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、以下のうちの1つ以上、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上を有する： 387位にY以外、434位にV以外、494位にD以外、524位にT以外の残基、a2272、g2213、a1406、c1445以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せ; PA又はPA vRNAにおいて、例えば、2272t、2213a、1406g、1445t、387H、434A、494N、524A、又はそれら何れかの組合せ(例えば、387位に残基H、434位に残基A、494位に残基N、524位に残基A、又はそれら何れかの組合せ); HA1において、34位にT以外、98位にR以外、129位にK以外、168位にN以外、194位にN以外、及び/又は196位にT以外、HA2において、39位にK以外、56位にS以外、61位にK以外、又は112位にD以外、例えば、HA1において、34I、K129E、168D、196P/I/A/N、98K、又は194D、及びHA2において、39G、56G、61N、又は112E、又はそれら何れかの組合せを含む; NAにおいて、76位にT以外の残基、102位にR以外の残基、105位にE以外の残基、139位にP以外の残基、169位にN以外の残基、434位にG以外の残基、436位にT以外の残基、及び/又は457位にD以外の残基、例えば、169T、434E、76M、102K、105K、139S、436M、457N、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位にH以外、80位にR以外、27位にH以外、26位にG以外の残基、例えば、58位に残基R、80位に残基G、27位に残基R、及び/又は26位に残基R; 28位にA以外; NPにおいて、40位にP以外、51位にP以外、52位にE以外、57位にS以外、204位にM以外、及び/又は343位にP以外、及び/又は1795位にg、又はそれら何れかの組合せ、例えば、28位に残基T、40位に残基S、51位に残基Q、52位に残基K、57位に残基G、214位に残基T、343位に残基T、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位にG以外、54位にD以外、77位にR以外、86位にM以外、97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せ、例えば、34位に残基V又はN、54位に残基G、77位に残基K、86位に残基T、及び/又は97位に残基N; PB2において、16位にN以外。一実施形態において、前記組換えウイルスは、M1 34V/I97N、BM2 58R/80G、NP 40S、NS1 86Tを有する。

一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、目的のHA及びNA遺伝子と共に使用され得る、PA、NP、M(M1及びBM2)、及び/又はNSについての1つ以上のセグメントにおいて特定の位置で２つ以上の選択されたアミノ酸残基を有する組換え又はリアソータントインフルエンザウイルスである。一実施形態において、前記組換えリアソータントインフルエンザウイルスは、NPにおいて、A28T、P40S、P51Q、E52K、S57G、M204T、及び/又はP343T、及び/又はg1795a; M1において、G34V/N、D54G、R77K、M86T、I97N; BM2において、H58R、R80G、H27R、G26R; NS1において、M117Y、K176Q、S252T、a39g、38位の後にg付加、Y42N、PAにおいてa2272t、g2213g、Y387H、V434A、D494N、T524A; の２つ以上を有する。

一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、目的のHA及びNA遺伝子と共に使用され得る、PA、BM2、NP、M1、及び/又はNSについての1つ以上のセグメントにおいて特定の位置で２つ以上の選択されたアミノ酸残基を有する組換え又はリアソータントインフルエンザウイルスである。例えば、一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、M1 34V/I97N、BM2 58R/80G、NP 40S、M1 M86Tを有する、又はNP P40S若しくはNP E52Kを有する、又はNP、M1、並びに任意でNS1及びBM2において表3におけるクローン1～8のような置換及びNP、M1、及び任意でNS1において、表4におけるクローン1～8のような置換を有する。

一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、PA vRNAにおいて、a1406g、c1445t、a2272t、NPにおいて、P40S又はP40S/M204T、NP vRNAにおいて、c500t、M77K又はM86T、及びNS vRNAにおいて、a39g又は38(+1)g、又はNSにおいて、K176 Qの2つ以上を有する組換え又はリアソータントインフルエンザウイルス、例えば、PA a1406g/c1445t/a2272t、NP P40S、c500t、M R77K及びNS a39g K176Qを有するインフルエンザウイルス、又はPA a1406g/c1445t/a2272、NP P40S/M204T、c500t、M M86T及びNS 38(+1)gを有するインフルエンザウイルスである。

本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。

実施例1
ワクチンの収率は、経済的な観点から重要である。さらに重要なことは、タイトなスケジュールで大多数のワクチンを産生するための能力は、ウイルスが流行している間に多くの命を救う可能性がある。細胞培養及び/又は孵化鶏卵におけるウイルスの複製能力を増加させる突然変異は、インフルエンザウイルスを増幅し、強力なインフルエンザワクチンプラットフォームを確立するために有用である。現在、ほとんどのインフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で作成される。MDCK細胞において作成されたインフルエンザワクチンは、現在、米国及び欧州でヒトへの使用が承認されており、Vero細胞由来のインフルエンザワクチンは、欧州において、ヒトへの使用が承認されている。

これら特定のホスト細胞におけるワクチンウイルスの増殖のための高収率のB型インフルエンザウイルスバックボーンを開発するために、B/ヤマガタ/1/73の内部遺伝子のランダム変異誘発を実施した; 突然変異ウイルスライブラリーのHA及びNA遺伝子は、2つの主要B型インフルエンザウイルスリネージを代表する、B/ヨコハマ/UT-K31/2012 (ヤマガタ-リネージ) 又はB/ヨコハマ/UT-K1A/2011 (ビクトリア-リネージ)由来である。作成された前記ウイルスライブラリーは、「内部」ウイルス遺伝子並びにウイルス表面糖タンパク質ヘマグルニチン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)をコードする遺伝子におけるランダム突然変異、並びに非コード突然変異を有する。向上した増殖を付与する突然変異、及びこれがワクチンウイルス候補であることがさらに調べられた。特に、これらワクチンウイルス候補は、インフルエンザワクチンウイルスの産生のために一般的に使用される増殖系: すなわち、孵化鶏卵、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞、及びアフリカミドリザル(Vero)細胞においてより高い収率を与える。これらワクチン候補は、B型インフルエンザウイルスワクチン製造プロセスを改善するために使用され得る。

材料及び方法
細胞
MDCK細胞を、5％（vol/vol）のウシ新生仔血清を含むMEM中で増殖させた。Vero細胞を、10%(vol/vol)のFBSを含むMEM中で維持した。293Tヒト胎児腎臓細胞を、10%(vol/vol)FBSを補充したDMEMで増殖させた。

プラスミドの構築
B/ヤマガタ/1/73ウイルスの8つのウイルスRNAの配列を用いて、PCRによって増幅され且つ、連結されたgBlocks遺伝子断片(Integrated DNA Technologies)を設計した; 得られたウイルスcDNAをRNAポリメラーゼIベクターpHH21に挿入した(Neumann et al., 1999)。B/ヨコハマ/UT-K31/2012、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/ヨコハマ/P-2922/2005, B/トウキョウ/UTE2/2008、B/トチギ/UT-T1/2011、B/マサチューセッツ/2/2012、及びB/ブリスベン/60/2008ウイルスのvRNAを、RNeasy Kit(Qiagen)を用いてウイルスストックから抽出した。ウイルスHA及びNA遺伝子を、One-Step RT-PCR Kit (Invitrogen)を用いて遺伝子特異的オリゴヌクレオチドで増幅し、PCR産物をpHH21ベクターにクローニングした。B/ヤマガタ/16/1988のHA及びNA遺伝子を、結合したgBlockes遺伝子断片のPCR増幅によって合成し、続いてpHH21へのクローニングによって合成した。B/ヨコハマ/UT-K31/2012、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/マサチューセッツ/2/2012及びB/ブリスベン/60/2008ウイルスのA/B型キメラHA及びNA遺伝子を、オーバーラッピングPCRによって作成した。

プラスミドライブラリーの構築
GeneMorph II Random Mutagenesis Kitを用いたエラープローンPCRにより、B/ヤマガタ/1/73ウイルスの6つの内部遺伝子の各々に1～4のランダム突然変異を導入した。ランダムに突然変異導入されたPCR産物を、前記pHH21ベクターに挿入し、得られたプラスミドライブラリーの多様性を、各ウイルス遺伝子について少なくとも24個の大腸菌コロニーの配列分析により確認した。

ウイルスレスキュー及びウイルスライブラリー作成
前記内部遺伝子にランダム突然変異を有する野生型ウイルス及びウイルスライブラリーを、逆遺伝学的アプローチを活用して作成した(Neumann et al., 1999)。野生型構築物の代わりに突然変異プラスミドライブラリーを用いて293T細胞に遺伝子導入することによってウイルスライブラリーを作成した。48時間後、プラスミドを遺伝子導入した293T細胞からの上清を回収し、MDCK細胞で増幅してウイルスストックを作成した; 前記ウイルスストックの力価を、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて決定した。

ウイルス増殖カイネティクスの評価
野生型又は組換えウイルスを、感染多重度(MOI).0001でMDCK細胞に三重に接種した。感染後、細胞を0.6μg/mLのTPCK-トリプシンを含むMEM/BSA培地と共にインキュベートした。指定の時点で上清を回収し、ウイルス力価をMDCK細胞におけるプラークアッセイによって評価した。

孵化鶏卵におけるウイルス複製を分析するために、10日齢の孵化鶏卵（ウイルス当たり4個）に1×10⁴ pfuのウイルスを接種し、35℃でインキュベートした。尿膜液（allantoic fluid）を指示された時点で収集し、ウイルス力価をMDCK細胞におけるプラークアッセイの使用によって決定した。

MDCK細胞又は孵化鶏卵で増幅されたウイルスの赤血球凝集力価を、赤血球凝集アッセイを用いて決定した。簡単に説明すると、1ウェルあたり50μLのPBSを含有する96ウェルU底マイクロタイタープレート（Thermo Scientific）中で50μLのウイルスサンプルを2倍に連続希釈した。次に、50μLの0.5%のターキー赤血球細胞を、各ウェルに添加し、プレートを室温で45分間インキュベートし、赤血球凝集力価を、凝集が起こった最も高い希釈の逆数として計算した。

ウイルス濃度及び精製
MDCK細胞を4-Layers Easy-Fill Cell Factories (Thermo Scientific)で増幅させ、細胞が約95％の集密度に達したときにMOI 0.001で野生型又は高収率のB型インフルエンザウイルスに感染させた。細胞培養上清を48時間後に回収し、遠心分離により清澄化した(Beckman SX4750 rotorにて3,500 rpm、15分間、4°C)。ウイルスを、超遠心分離(Beckman Type19 rotorにて18,500rpm、90分間、4℃)によってペレット化し、5mLのPBSに再懸濁し、Beckman SW32 rotorにて90分間、4℃、25,000rpmで遠心分離した20～50%(wt/vol)連続スクロース勾配にロードした。ウイルス含有バンドを回収し、PBSで希釈し、遠心分離(25,000 rpm、90分間、4°C、Beckman SW32 rotor)によって再びペレット化した。前記ウイルスペレットを400μLのPBSに再懸濁し、等分し、-80℃で保存した。

全タンパク質アッセイ
ウイルス濃縮物の全タンパク質収率を、Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific)を製造元の指示に従って使用して決定した。

PNGase Fを用いたウイルスタンパク質のグリコシル化
糖部分を除去するために、10μLのウイルス濃縮物を変性させた。次いで、前記サンプルを、2μLの1/10希釈PNGase F酵素液(製造者により提供された緩衝液中)（New England Biolabs）と共に最終濃度1％のNonidet P-40と共に37℃で20時間インキュベートした。

SDS/PAGE
2μLのウイルス濃縮物をPBSと混合して総量10μLとし、2％（vol/vol）のβ-メルカプトエタノール（還元剤として）を含む2.5μLのローディング色素を加え、95℃、5分間加熱した。次いで、サンプルを、NuPage 4～12％（wt/vol）Bris-Trisプレキャストゲル（Life technology）にロードし、これを1×Mes緩衝液（Bio-Rad）を用いて150Vで120分間ランし、次いでSYPRO-Ruby（Sigma）で染色した。タンパク質量の定量は、ImageJソフトウェア（NIH）を用いて行った。HA含量は、HA1、HA2、NP、及びM1の量の合計でHA量（HA1及びHA2の量を合計することによって計算される）を除算し、この値に全ウイルスタンパク質量を掛けることによって計算した。

マウスにおける毒性調査
6週齢の雌BALB/cマウス(Jackson Laboratory)をイソフルランで麻酔し、10⁶pfuのB型インフルエンザウイルスを50μLの容量で鼻腔内接種した。1群あたり5匹のマウスに感染させた; このサンプルサイズは、群間の大きな影響を検出するのに適している。マウスは無作為化され、試験者は盲検化されなかった。体重変化及び生存を毎日、14日の間モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、1ウイルス当たり10匹のマウスに10⁶pfuで感染させた; 感染後3日目及び6日目に、各群の5匹のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺のウイルス力価を測定した。

遺伝的安定性テスト
高収率ワクチンバックボーンの遺伝的安定性を評価するために、B/ヨコハマ/UT-K31/2012及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAと組み合わせられたHY(Yam)及びHY(Vic)を保有するウイルスそれぞれを、MOI 0.01でMDCK細胞において10回継代培養した。各継代培養後に回収されたウイルスは、サンガー配列決定によって配列決定された。

ミニレプリコンアッセイ
ミニレプリコンアッセイについて、293T細胞及びMDCK細胞に、0.05μgのpPolI-B/ヤマガタ/1/73-NS-Luc(ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする)又はpPolIC250-B/ヤマガタ/1/73-NS-Luc(イヌRNAポリメラーゼIプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする)のそれぞれと共に、B/ヤマガタ/1/73 PB2、PB1、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドを、それぞれ0.25μg遺伝子導入した。細胞を0.025μgのpGL4.74（hRluc / TK）（トランスフェクション効率をモニターするための内部コントロール; Promega）で同時に遺伝子導入した。前記遺伝子導入した細胞を、35℃、48時間インキュベートし、溶解させ、デュアルルシフェラーゼシステム検出Kit (Promega）を製造業者のプロトコールを用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ホタルルシフェラーゼ発現レベルをウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。示されたデータは、3つの独立した実験の±SDの平均値である。

B/ヤマガタ/1/73 PA及びNS1 vRNAの非コード領域における突然変異の有意性を調べるために、上記のように細胞に遺伝子導入した; しかしながら、pPolIC250-NP(0)Fluc(0)を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子がPA又はNS vRNAの野生型又は突然変異非コード領域のそれぞれに隣接するレポーター構築物で置き換えた。遺伝子導入の48時間後、ルシフェラーゼ活性を上記のように測定した。

VLP出芽アッセイ
VLP出芽アッセイのために、293T細胞に、野生型又は突然変異B/ヤマガタ/1/73 M1、HA、NA、NP、BM2、及びNS2の各タンパク質発現プラスミド2μgを遺伝子導入した。遺伝子導入の48時間後に、培養上清を回収し、清澄化し、20%(wt/vol)スクロースクッションにロードし、Beckman SW 60 Ti rotorで60,000rpmで2時間超遠心分離した; ペレット化したVLPを、PBS中、4℃で一晩再懸濁した。並行して、遺伝子導入した細胞をRIPA緩衝液で溶解した。

精製したVLP及び細胞溶解物を別々に5×ローディング色素緩衝液と混合し、NuPage 4～12％（wt/vol）のBris-Trisプレキャストゲル（Life Technology）上で分画した。タンパク質を、iBlot乾式ブロッティングシステム（Invitrogen）を用いてニトロセルロース膜に移した。次いで、5％（wt/vol）スキムミルクを含む0.05％Tween20（PBS-T）を含むPBSを用いて、室温で3時間、前記膜をブロックした。次いで、B/ブリスベン/60/2008 HA (1:1,000; my BioSource, MBS430175)に対するモノクローナル抗体、又はB型インフルエンザウイルスNP (1:1,000; Abcam, ab47876) 又はM1 (1:2,000; Abcam, ab82608)タンパク質に対するモノクローナル抗体と4℃で一晩インキュベートした。PBS-Tでそれぞれ10分間4回洗浄した後、室温で1時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたゴートアンチマウス二次抗体(1:2,000; Life Technology)と共に前記膜をインキュベートした。PBS-Tでそれぞれ10分間4回洗浄した後、lumi-lightウェスタンブロッティング基質（Roche Applied Science）を用いてブロットを展開し、次いでオートラジオグラフィーで可視化した。タンパク質量の定量は、ImageJソフトウェア（NIH）を用いて行った。VLPへのHA、NP及びM1タンパク質取り込みのパーセンテージを計算するために、以下の式を使用した: (突然変異タンパク質の全量に対する突然変異VLPにおけるタンパク質の量の比 (VLP + 細胞ライセート)/野生型タンパク質の全量に対する野生型VLP中のタンパク質の量の比 (VLP +細胞ライセート)) × 100。

IFNアンタゴニストアッセイ
野生型及び突然変異NS1タンパク質のIFN-アンタゴニスト活性を評価するために、293T細胞に、NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-β(Bale et al., 2012)を遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後、細胞にセンダイウイルスをMOI 5で1時間感染させた。細胞を24時間インキュベートし、Glo溶解緩衝液（Promega）で溶解した; 次いで、Steady-Gloアッセイ緩衝液（Promega）を添加し、ルシフェラーゼ発現を測定した。他のセットの実験において、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpISRE-Luc（Promega）を遺伝子導入した。24時間後、細胞を104U/mLのヒトIFN-βでさらに24時間処理し、続いて溶解及びルシフェラーゼ発現レベルの測定を行った。

統計分析
データの統計分析を、Rソフトウェア（www.r-project.org）、v3.1を使用して実施した。複数の群を、いくつかの時点で独立して収集した測定値と比較するために、２元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテストを用いた。1つの時点で収集された複数の群からの測定値を比較するために、1元配置分散分析、続いてテューキー又はダネットのポストホックテストを用いた。複数の群を依存測定と比較するために(例えば、アリコートを異なる時間点で同じ培養物から収集した細胞培養におけるウイルス増殖曲線)、RパッケージNLMEを使用してデータに対する線形混合効果モデル; 時間、ウイルス系統、及びこれら2つの要因間の相互作用を考慮した。RパッケージPHIAを使用して、同じ時点で対の様式で系統を比較するための対比マトリックスを構築した(例えば、感染後24時間で群_1 vs. 群_2、感染後24時間で群_1 vs. 群_3、感染後24時間で群_2 vs. 群_3)。個々に比較を行った; 従って、最終的なP値を、Holmの方法を用いて複数の比較を説明することによって調整した。

増殖曲線からの生データを分析前に対数スケールに変換した; 結果は、P(又は調整P値)＜0.05で統計的に有意であると考えられた。群間の差異は、ルビーンテストを用いて評価した。

倫理及びバイオセーフティー
マウスにおける実験は、「動物実験の適切な実施に関する基本的なガイドライン」および動物福祉法における関連活動および関連する動物福祉規則および公衆衛生サービス政策に規定されているように、ウィスコンシン大学マディソン校の動物管理及び使用プロトコールに従って行われた。すべての実験は、動物の法的及び倫理的な責任の両方を認識し且つ、承認するウィスコンシン大学マディソン校の動物管理及び使用委員会によって承認される(プロトコール番号V00806)。

結果
MDCK細胞における高収率変異体のウイルスライブラリースクリーン
高収率のA型インフルエンザウイルスPR8ワクチンバックボーンを開発する戦略と類似する、突然変異誘発及びスクリーニングアプローチを使用して、B型インフルエンザウイルスの高収率に関連する突然変異を同定した。前記6つの内部vRNA断片は、B/ヤマガタ/1/73由来であり、これはMDCK細胞で効率的に増殖し、ビクトリア及びヤマガタリネージが分離する前に単離された。エラープローンPCRに基づく突然変異誘発法を用いて、前記ウイルスタンパク質に1～4個のランダムなアミノ酸変化を保有するcDNAライブラリーを作製した(図2)。次いで、これらのcDNAライブラリーを用いてウイルスライブラリーを作製した。内部のvRNA(すなわち、PB2、PB1、PA、NP、M及びNS)の各々を表す6つの別個のライブラリーが作成された(図2);ポリメラーゼvRNAの組合せのための3つのライブラリー(PB2+PB1、PB2+PA、PB2+PB1+PA); PB2、PB1、PA、及びNPタンパク質がウイルス複製複合体を形成するので、ポリメラーゼ及び核タンパク質（NP）vRNAのための1つのライブラリー(すなわち、PB2+PB1+PA+NP); A型インフルエンザウイルスのPB2及びNS1タンパク質(NS vRNAによってコードされる)が、ホスト毒性の重要な決定因子(Wright et al., 2013)であるので、PB2及びNS vRNA(PB2+NS)のための1つのライブラリー; 及びA型インフルエンザウイルスのM1タンパク質(M vRNAによってコードされる)が高い増殖特性に関連するので、M及びNS vRNAのための1つのライブラリー。これらの12種類のウイルスライブラリーのそれぞれは、ビクトリア(B/ヨコハマ/UT-K1A/2011)又はヤマガタ(B/ヨコハマ/UTK31/2012)リネージの代表的なウイルスのHA及びNA vRNAを用いて作成され、合計24のウイルスライブラリーが得られた。ビクトリア-リネージ又はヤマガタ-リネージのHA及びNA vRNAを用いて作製されたライブラリーは、それぞれ、「ビクトリア-リネージ」又は「ヤマガタ-リネージ」ライブラリーと称される。

増強された増殖特性を有する変異体を選択するために、各ライブラリーをMDCK細胞で12回継代培養した。並行して、MDCK細胞で2回継代培養した後、ウイルスライブラリーを合わせ、次いでMDCK細胞で10回継代培養を行った(図2)。ビクトリア-リネージ及びヤマガタ-リネージのライブラリーからそれぞれ、700以上のウイルスプラークを無作為に選び、合計1,472個のプラーク精製ウイルスを得た(図2)。次いで、前記プラーク精製されたウイルスをMDCK細胞で増幅し、その収率を赤血球凝集アッセイ(高いHA収率のサロゲートとして)で評価し、親ビクトリア-リネージ及びヤマガタ-リネージのウイルスの収率と比較した(B/ヤマガタ/1/73ウイルスの6つの残りvRNAと組み合わされたビクトリア-リネージ又はヤマガタ-リネージのHA及びNA vRNAを有する)。29のヤマガタ-リネージ及び28のビクトリア-リネージのウイルスは、それぞれのコントロールウイルスの少なくとも2倍の赤血球凝集力価で同定された。これらの候補ウイルスは、MDCK細胞で再増幅され、それらの高収率特性は、MDCK細胞における赤血球凝集力価及び複製カイネティクスを評価することによって確認された(高いHA収率のための別のサロゲートとして使用される)(図3)。

次に、各リネージの上位8つの候補のウイルスゲノム全体を配列決定し、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージの高収率候補に対して異なるセットの突然変異が見出された(アミノ酸変化及び非翻訳領域の変化を評価した)(表1及び2)。ヤマガタ-リネージライブラリーから単離された8つの高収率候補のうち7つは、M1マトリックスタンパク質にG34V及びI97N突然変異、及びBM2イオンチャネルタンパク質(M遺伝子によってもコードされる)にH58R及びR80G突然変異を有しており(表1)、これらのアミノ酸置換が、MDCK細胞において効率的な複製を与えることを示唆している。

ビクトリア-リネージのライブラリーから得られた8つの高収率候補の全てが、NPにおけるP40S突然変異及びM1におけるM86T突然変異をコードしていた(表2)。加えて、これら8つの高収率候補のうち6つは、NS vRNAの非コード領域におけるヌクレオチドの変化をコードしていた: 38位の後にヌクレオチド付加を5つのウイルス(NS-38(+1)g（非コード領域の全てのヌクレオチド変化をイタリックで示す)において検出し、a39gヌクレオチド置換が、1つのウイルスで検出された(表2)。g1795a突然変異は、3つの高収率候補におけるNP断片の非コード領域において同定された(表2)。

HA及びNA vRNAは、PCR媒介性ランダム突然変異によって標的化されなかったが、いくつかの突然変異が、HA及びNAタンパク質で検出された(表1及び2)。具体的には、ビクトリア-リネージのライブラリー由来の8つの高収率候補のうちの7つにおいて、HAの196位のトレオニンが、種々の他のアミノ酸(例えば、アラニン、イソロイシン、プロリン、又はアスパラギン)で置換された(表2)、これは、この位置での強い選択圧を示唆している。

突然変異の潜在的組合せ効果
次に、逆遺伝学アプローチを使用して、上位8つの高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージ候補において見出される突然変異の様々な組み合わせを保有するウイルスを作成した(表3及び4)。例えば、高収率候補♯21(MDCK細胞において最も高い力価で複製された)(図3)において見出されたNP-E52K及びM1-R77K突然変異は、高収率候補♯23及び♯26に見出されたNS1-M117Y/S252T突然変異と組み合わせられた(図3)。ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのライブラリーの内部vRNAは、同じウイルスに由来するため、高収率ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージの候補に見出される突然変異も組み合わせられた(表3及び4)。得られたウイルスを、それらのMDCK細胞において赤血球凝集力価及びウイルス力価についてテストした(図4)。高収率候補のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージは全て、MDCK細胞においてより効率的に複製され、1つ以上の時点で野生型ウイルスより高い赤血球凝集力価を有し、及びこれらの差のほとんどは、統計的に有意であった(図4)。

ヤマガタ-リネージRG(Yam) #8 (NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、及びNS-a39g突然変異をコードする)及びビクトリア-リネージRG(Vic) #2 (NP-P40S/M204T、M1-M86T、及びNS-38 (+1)g突然変異をコードする)は、各群で最も高い力価を有するためリード候補ワクチンバックボーンとして選択された。

Vero細胞における高収率変異体のウイルスライブラリースクリーン
理想的なワクチンウイルスバックボーンは、ヒトインフルエンザワクチンの商業生産に現在使用されている3つの増殖系、すなわちMDCK細胞、Vero細胞、及び孵化鶏卵において高い収率を与えるはずである。MDCK細胞における高収率B型インフルエンザウイルスワクチンバックボーンの開発と並行して、24の全てのウイルスライブラリー(図2)を、Vero細胞に継代培養した。B型インフルエンザウイルスライブラリーの力価が、Vero細胞において低かったため、最初に前記ライブラリーを、MDCK細胞及びVero細胞の共培養で5回継代培養し、続いて、Vero細胞で5回、継代培養した。並行して、共培養したMDCK及びVero細胞で2回継代培養した後、ウイルスライブラリーを組合せ、共培養細胞にてさらに3回継代培養し、次いでVero細胞で5回継代培養した。合計382の個々のウイルスプラークを前記種々のウイルスライブラリーから無作為に採取し、Vero細胞で増幅した。赤血球凝集アッセイの結果に基づいて、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのから上位6つの候補を選び、それらの完全なゲノム配列を決定した(表5及び6)。

高収率の候補は、前記MDCK細胞継代培養後に同定された突然変異のいくつかを保有し、これは、共培養細胞の継代培養中に前記MDCK細胞において選択された可能性がある。これら突然変異は、位置M1-34/97、BM2-58又は-80、及びHA1-196 (表1及び2を表5及び6と比較して)のアミノ酸変化を含む。位置M1-34/97及びBM2-58の突然変異は、ヤマガタ-リネージライブラリーにおいてのみ検出され、一方、位置BM2-80の突然変異は、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスの両方で生じた。HA1-196の位置での突然変異は、ビクトリア-リネージのウイルス中でも優勢であったが、ヤマガタ-リネージの1つのウイルスでも発生した。加えて、MDCK細胞における継代培養後に以前に見出されなかった突然変異は、両方のウイルスリネージの高収率候補で見出されたPAの非コード領域におけるa2272tヌクレオチド置換が最も顕著に観察された(表5及び6)。

高収率ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージワクチンウイルス候補の選定
次に、前記Vero細胞での継代培養後に見出されたPA-a2272t突然変異が、RG(Yam)♯8及び/又はRG(Vic)♯2の増殖特性を増強するか否かをテストした。得られたウイルス(HY(Yam)及びHY(Vic)それぞれ)は、RG(Yam)♯8及びRG(Vic)♯2と比較して、より高い赤血球凝集及びウイルス力価を示し、及び親ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスと比較された; これらの差のいくつかは小さかった(統計的に有意であった)。故に、HY(Yam) (NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g、PA-a2272tをコードする)及びHY(Vic) (NP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1)g、PA-a2272tをコードする)を、高収率候補として選択した。

異なるB型インフルエンザウイルスHA及びNA遺伝子を有する高収率ワクチンウイルスバックボーンの評価
B/ヤマガタ/UT-K31/2012及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011それぞれのＨＡ及びＮＡ遺伝子を用いてHY(Yam)及びHY(Vic)を開発した。高収率ワクチンウイルスバックボーンHY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスは、一般的な増殖増強効果を有するため、ＷＨＯが推奨するワクチンを含む数十年に渡って単離された6つのB型インフルエンザウイルスのHA及びNA遺伝子を有するHY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスバックボーンをテストした(図7)。テストされた1つ以上の時点で、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスバックボーンは、親ウイルスと比較してより高いウイルス又は赤血球凝集力価を与えたが、全ての相違が統計的に有意ではなかった。テストしたウイルスに関し、HY(Vic)は、HY(Yam)よりも大きな増殖増強効果を示した。

HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンの交換
次に、HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンが、他のB型インフルエンザウイルスリネージ由来のHA及びNA遺伝子を保有するウイルスの効率的な複製をサポートするか否かをテストした（図8）。ビクトリア-リネージのHA及びNA遺伝子をコードするHY(Yam)ウイルス、及びヤマガタ-リネージのHA及びNA遺伝子をコードするHY(Vic)ウイルスについて、高いウイルス力価及び赤血球凝集力価が検出された。全体的に、HY(Yam)ワクチンバックボーンは、いくつかの時点で、HY(Vic)ワクチンバックボーンより、わずかに高いウイルス力価又は赤血球凝集力価をもたらしたが、これらの差のほとんどは統計的に有意ではなかった。これらのデータは、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンバックボーンが両方のリネージのウイルスへ効率的な複製をもたらすことを示している。

A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスワクチンバックボーンの比較
B型インフルエンザウイルスのHA及びNA遺伝子を保有するキメラA型インフルエンザウイルスが以前に作成されている(Horimoto et al., 2004 and Flandorfer et al., 2003)。A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの使用は、前記ワクチン製造プロセスを簡易化し得る。A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの間のリアソータントは、インフルエンザvRNAセグメントの5 '及び3'末端領域に位置する型特異的ウイルスパッケージングシグナルのために、おそらく自然発生しない(Fujii et al., 2003; Baker et al., 2014)。従って、A型インフルエンザPR8ウイルスHA及びNAタンパク質の細胞外ドメインをB型インフルエンザウイルスの対応する部分で置換したvRNAセグメントを作成した(図5)。次いで、以下の3つのウイルスの赤血球凝集及びウイルス力価を比較した: 野生型ヤマガタ-リネージB型インフルエンザウイルス; ヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA遺伝子を有するHY(Yam); 及びヤマガタ-リネージウイルスのA型/B型キメラHA遺伝子及びNA遺伝子を有する高収率PR8ウイルス(図9A～B)。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った(図9C～D)。テストしたほとんどの時点で、高収率のA型インフルエンザワクチン又はB型インフルエンザワクチンウイルスバックボーンは、野生型ウイルスと比較して赤血球凝集力価及びウイルス力価を有意に増加させた。A型インフルエンザワクチン及びB型インフルエンザワクチンバックボーンの比較は、B型インフルエンザワクチンバックボーンにてより高いウイルス力価を示したが、興味深いことに、A型インフルエンザワクチンバックボーンにてより高い赤血球凝集力価を示した。加えて、両方のリネージを代表する２つのB型インフルエンザワクチンについて、A型インフルエンザワクチンバックボーンは、孵化鶏卵における赤血球凝集力価及びウイルス力価に関してB型インフルエンザワクチンバックボーンよりも優れていた(図4E～F)。B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/ヨコハマ/P-2922/2005、B/トウキョウ/UTE2/2008、又はB/トチギ/UT-T1/2014由来のHA及びNAを含む他のB型インフルエンザウイルスは、バックボーン(野生型又は高収率)にも関わらず、孵化鶏卵において良く増殖せず、これらヒトウイルスのHA及びNA遺伝子が、孵化鶏卵における効率的な増殖を制限し得ることを示唆している。

全ウイルスタンパク質収率及びHA含量の評価
不活性化インフルエンザワクチンの大半の調製物は、H1 HA、H3 HA、及びB型HAタンパク質の各々15μgを含む。従って、ワクチンの最適化のために、全ウイルスタンパク質収率及びHA含量が重要なパラメータであり、MDCK細胞におけるそれぞれの野生型ウイルスと異なるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの全タンパク質収率及びHA含量を比較することを促した。細胞培養上清を、感染細胞から収集し、ウイルスを濃縮し、スクロース勾配遠心分離を用いて精製した。次いで、全ウイルスタンパク質収率を、Pierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）を用いて決定した。並行して、精製されたウイルスサンプルをPNGase Fで処理し、得られたHA脱グリコシル化をもたらし、HA2(そのグリコシル化形態では、M1とサイズが類似している)を、より容易に検出することが出来る。SDS / PAGE（図10A～B）を用いてサンプルを分離し、HA1、HA2、NP及びM1の量をデンシトメトリー分析に基づいて決定した。HA含量は、HA量（HA1及びHA2の量を合計して計算した）をHA1、HA2、NP及びM1の量の合計で割って、この値にゲル電気泳動によって分析されたサンプル中の全ウイルスタンパク質量の値を掛けたものである（図10A～B）。テストした全てのウイルスについて、全ウイルスタンパク質収率及びHA含量は、HA及びNA vRNAが由来する野生型ウイルスと比較して、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンのバックボーンで有意に高かった。

マウスにおけるPR8-HYに基づくワクチンウイルスの毒性
実験的アプローチは、増加された複製能力を有する突然変異を選択するために設計され、これは、哺乳動物においてそれらの毒性を増加し得る。この疑問に対処するために、1つの群あたり5匹のマウスを、野生型ヤマガタ-リネージウイルス、野生型B/ヤマガタ/1/73ウイルス(前記ウイルスライブラリーを作成するために用いられた)の残りの6つの遺伝子の組合せにおいてヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを保有するウイルス、及びHY(Yam)ワクチンウイルスバックボーンを有する組合せのヤマガタリネージウイルスのHA及びNA vRNAを保有するウイルスを10⁶pfuで感染させた(図11A-B)。並行して、10匹のマウスの群に10⁶pfuの上述のウイルスを感染させ、肺ウイルス力価を評価するために感染後3日目及び6日目にそれぞれ5匹の動物を殺した(図11C)。同様に、ビクトリア-リネージウイルス及びHY(Vic)ワクチンバックボーンを用いて実験を実施した(図11D～F)。野生型B/ヤマガタ/1/73ウイルスバックボーンは、B/マサチューセッツ/2/2012及びB/ブリスベン/60/2008バックボーンそれぞれよりも高い病原性を示した。しかしながら、HY(Yam)及びHY(Vic)の収率増強突然変異は、マウスにおける毒性をさらに増加させなかった; 実際には、B/ヤマガタ/1/73バックボーンと比較してわずかに減少効果を示した。

HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンバックボーンの遺伝的安定性
ワクチンウイルスは、それら所望の特性が維持されるように遺伝的に安定でなければならない。高収率候補の遺伝的安定性をテストするために、HY(Yam)ウイルスの10連続継代培養を、MDCK細胞において、B/ヨコハマ/UTK31/2012のHA及びNA vRNA、及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAを有するHY(Vic)ウイルスを用いて実施した。各継代培養後、前記ウイルスのゲノム配列をサンガー配列決定によって決定した。ヤマガタ-リネージウイルスに関して、突然変異は、検出されなかった。ビクトリア-リネージウイルスに関して、HY(Vic)の高収率特性を規定する内部遺伝子における突然変異は検出されなかった。しかしながら、5回の継代培養の後にHA1-196T及び-196Iをコードする混合個体分が検出され; 10回の継代培養後に、HA1-196I突然変異体のみが検出された。

同様に、両方のリネージのいくつかの野生型及び高収率のB型インフルエンザウイルスを孵化鶏卵に継代培養した(表7)。5～10回の連続継代培養後、内部遺伝子に卵-適応突然変異は検出されなかった。しかしながら、HAのアミノ酸196-196にグリコシル化を保有するウイルスについて、そのグリコシル化部位が失われた突然変異が生じた。この結果は、ビクトリア-リネージのウイルスにおけるグリコシル化部位での突然変異の早期発見と一致する(表2)。まとめると、当該データは、MDCK細胞及び孵化鶏卵における少なくとも5～10の連続継代培養について、HY(Yam)及びHY(Vic)における収率増強突然変異が遺伝的に安定であったことを示している。

HY(Yam)及びHY(Vic)の高収率特性に対する個々のvRNAの寄与
HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンバックボーンは、いくつかのvRNAに突然変異を有する。HY(Yam)及びHY(Vic)表現型に対するこれら突然変異の寄与をよりよく理解するために、逆遺伝学を用いて、HY(Yam)又はHY(Vic)の個々の突然変異体vRNAセグメントを保有するウイルスを作成した: 例えば、野生型B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーを生み出すために使用された)、野生型B/ヤマガタ/1/73(HY(Yam)において見出されたNP-P40Sをまたコードする)、又はHY(Yam)の6つの残りのvRNAとヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAが組み合わされてウイルスが生み出された(図12)。得られたウイルスを、MDCK細胞におけるそれらの複製能力及び赤血球凝集力価についてテストした（図12）。個別にテストした場合、NP-P40S、M1-R77K及びNS-a39g+NS1-K176Q突然変異は、リファレンスウイルスと比較して、1つ以上の時点でヤマガタ-リネージウイルスのウイルス力価及び赤血球凝集力価を有意に増加させた。ビクトリア-リネージのウイルスについて、テストした突然変異の各々は、1つ以上の時点で統計的に有意な増殖増強効果を有した。HY(Yam)又はHY(Vic)に見出される個々の突然変異を有するウイルスの大部分は、高収率ワクチン候補と同じくらいの効率では複製せず、いくつかの突然変異の組合せが、HY(Yam)及びHY(Vic)の高収率特性にとって重要であることを示している。

ウイルス複製複合体の活性に対するHY(Yam)及びHY(Vic)における個々の突然変異の影響
NP-P40S突然変異は、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージライブラリーそれぞれの由来のNP-M204Tと組み合わせて個別に選択した。加えて、これらの突然変異は、他の増殖増強突然変異なしでテストした場合、ウイルス力価及び赤血球凝集力価を増加させた(図12)。これらの突然変異がウイルス複製複合体の活性に影響するか否かを評価するために、293T及びMDCK細胞に、B/ヤマガタ/1/73ウイルスの3つのポリメラーゼサブユニット、野生型又は突然変異B/ヤマガタ/1/73 NP、及び前記ルシフェラーゼレポータータンパク質を発現するB型インフルエンザウイルス様RNAを発現するプラスミドを遺伝子導入した(NP-M204T突然変異は、NP-P40Sと組み合わせてのみウイルスライブラリーから選択されたため、別々にテストしなかった)。興味深いことに、NP-P40S及び-P40S/M204T突然変異は、ウイルス複製複合体の複製活性を有意に減少させた(図13A～B)。

PA-a2272t突然変異は、Vero細胞のウイルスライブラリーの継代培養中に発生し(表5及び6)、ビクトリア-リネージワクチン候補のウイルス力価及び赤血球凝集力価を有意に増加させた(図6)。この突然変異は、ミニレプリコンアッセイにおいて、ウイルス様RNAの複製を有意に増加させることが見出された(図10C)。HY(Yam)及びHY(Vic)は、NS-a39g及びNS-38(+1)g突然変異をそれぞれ保有する。これらの突然変異は、ルシフェラーゼを発現するウイルス様RNAに導入された。両方の突然変異により、ウイルス様RNA由来の前記レポータータンパク質の発現の有意な増加をもたらした(図13D); この効果は、NS-a39g突然変異と比較してNS-38(+1)g突然変異に関して実質的に大きかった。

ウイルス様粒子の組成に対するHY(Yam)及びHY(Vic)における個々の突然変異の影響
個々にテストした場合、HY(Yam)及びHY(Vic)におけるM1-R77K及びM1-M86T突然変異は、ウイルス力価及び赤血球凝集力価に影響を与えた(図12)。M1はビリオンの主要な構成成分であり、このタンパク質の突然変異は、ビリオンの組成に影響を及ぼす可能性がある。293T細胞に、B/ヤマガタ/1/73 HA、NA、NP、BM2、NS2、及び野生型又は突然変異M1タンパク質の発現のためのプラスミドを遺伝子導入した; ウイルスタンパク質のこのセットの発現は、効率的なウイルス様粒子(VLP)の形成及び放出をもたらす(Gomez-Puertas et al., 1999)。細胞培養上清を回収し、ウイルスタンパク質のVLP取り込み効率を評価した(図14)。M1における両方の突然変異は、培養上清中のウイルスHA、NP、及びM1タンパク質の量を有意に増加させ、これは、恐らくM1-R77K及び-86T突然変異によって付与されたウイルス力価及び赤血球凝集力価を増加させた。

IFNアンタゴニスト活性に対するHY(Yam)NS1タンパク質における突然変異の影響
前記NS1タンパク質は、主要インフルエンザウイルスIFNアンタゴニストである(Yuan et al., 2001; Dauber et al., 2004)。NS1のIFN-β合成を妨害する能力に対するHY（Yam）NS1-K176Q突然変異の効果を評価するために、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及び前記IFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-β(Bale et al., 2012)を遺伝子導入した。次に、細胞にセンダイウイルスを感染させてIFN-β合成を刺激し、レポーター遺伝子発現を増加させた。野生型及び突然変異体NS1は、IFN-βをダウンレギュレートする能力が同等であった(図12A)。IFN-β刺激遺伝子の発現を妨げる野生型及び突然変異体NS1の能力を決定するために、293T細胞に、野生型及び突然変異体NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする、前記レポータープラスミドpISRE-Luc (Promega)を遺伝子導入した。細胞を、IFN-βで24時間後に刺激し、再び24時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼ発現についてアッセイした。NS1-K176Qタンパク質は、IFN調節プロモーターからの遺伝子合成を抑制することが野生型NS1よりもわずかに低い(図12B)。これは、他の機構がその増殖増強効果を説明することを示唆している。

考察
現在まで、高収率のB型インフルエンザワクチンバックボーンを開発するための体系的な取り組みは実施されていない。Vodeiko et al. (Vodeiko et al., 2003)は、孵化鶏卵における複製能力が異なる2つのB型インフルエンザウイルスを比較した。リアソータント実験により、表現型の相違に寄与するいくつかのvRNAが明らかにされた(Vodeiko et al., 2003); しかしながら、増殖特性を決定する特定のアミノ酸は同定されなかった。Kim et al. (Kim et al., 2015)は、B型インフルエンザウイルスの低温適応がそれらの増殖特性を増強することを見出した。HA、NA、及びNPにおけるいくつかのアミノ酸変化(ここで報告された変異ではない)は、ウイルス力価の増加に関与していた(Kim et al., 2015)。Le et al. (2015)は、2002～2007年に単離されたB/リー/40とヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのB型インフルエンザウイルスの間のリアソータントテストした; 14の高収率候補の全てが、B/リー/40ウイルスのNP vRNAを保有しており、これは、このvRNAが効率的な複製能力を付与することを示唆している。Ping et al. (2015)は、高収率A型インフルエンザウイルスバックボーンを開発するためのより包括的な戦略を発表した。これはB型インフルエンザウイルスに適用される:内部遺伝子にランダム突然変異を保有するウイルスライブラリーから、MDCK及びVero細胞におけるB型インフルエンザウイルス複製が向上した候補が選択された。突然変異の組み合わせにより、MDCK及びVero細胞、並びに孵化鶏卵においても高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのワクチン候補(ヤマガタ-リネージワクチンのNP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g、及びPA-a2272tをコードする突然変異、並びにビクトリア-リネージワクチンのNP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1)g、及びPA-a2272tをコードする突然変異)が得られた。リネージ特異的ワクチンバックボーンが、両方の系統のウイルスに使用される単一のバックボーンよりも利点を提供するか否かを決定するために、(セミ)産業設定におけるさらなる研究が必要となる。

HY(Yam)及びHY(Vic)から得られた全ウイルスタンパク質収率及びHA含量は、野生型ウイルス由来のものよりも実質的に高かった(図10)。高いウイルス及びHA収率は、費用対効果の高いワクチン生産にとって重要である。さらに重要なことに、ワクチンのウイルス収率の増加は、一年を通しての高いワクチン需要、及び短縮されたウイルス産生ワクチン製造時間において必須である。しかしながら、ウイルス力価又はHA収率の観察された差異のいくつかは小さく(統計的に有意であった)、及びHY(Yam)及びHY(Vic)が産業ワクチン製造におけるワクチンウイルス収率を増加させる程度は現在知られていない。

B型インフルエンザウイルス配列の評価により、天然B型インフルエンザウイルスの中でHY(Yam)及びHY(Vic)のアミノ酸変化は、稀であることが明らかになった(NP-P40S、NP-M204T、及びM1-M86Tの突然変異は、それぞれ1つの単離株において見出されている; 前記M1-R77K突然変異は、14の単離株で報告されている; 及び前記NS1-K176Q突然変異は検出されていない)。B型インフルエンザウイルスNPタンパク質の3D構造は解明されているが(Ng et al., 2012)、位置40(PからSへの突然変異がヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのライブラリーから選択されている)は、構造的データが得られなかったN末端の71アミノ酸であり、この領域が非常にフレキシブルであることを示唆している。B型インフルエンザウイルスNPタンパク質の配列分析は、40位のプロリンが高度に保存されていることを明らかにした: 3,234個の配列のうち1個だけがNP-40Pをコードしない(唯一の例外、B/テネシー/01/2015は、この研究で見られるようにNP-40Sをコードする)。興味深いことに、前記NP P40S突然変異は、ミニレプリコンアッセイにおいてウイルス複製複合体の活性を低下させ、この突然変異の収率増強効果は複製及び転写以外の機能によって媒介されることを示唆している。例えば、NP中のこの領域は、ウイルスリボヌクレオタンパク質複合体の核から細胞質への輸送中、又はビリオンアセンブリ中に、ウイルス若しくは細胞タンパク質と相互作用を起こす可能性がある。

ウイルス収率を増加させるvRNAセグメントの非コード領域においてもいくつかの突然変異が同定された。これらの突然変異のいくつかは、ミニレプリコンアッセイで測定されるように、複製及び転写レベルの増加をもたらした。これらの突然変異は、例えば、vRNAの安定性を増加させるか、又はウイルスポリメラーゼ複合体との相互作用に影響を与え得る。これらの突然変異の正確な機構的機能を解明するためにはさらなる研究が必要である。

総括すると、B型インフルエンザウイルスバックボーンが開発され、ヒトインフルエンザワクチンウイルス産生に現在使用されている増殖系における季節性B型インフルエンザワクチンの力価を増加させることが出来る。

表1: 選択されたヤマガタ-リネージの高収率クローンのアミノ酸変化。

表2: 選択されたビクトリア-リネージの高収率クローンのアミノ酸変化。
この表及び以下の表における小文字及び斜体の突然変異は、非コード領域におけるヌクレオチドの変化を示す。

表3: 逆遺伝学を用いて作成されたヤマガタリネージHYワクチンウイルス候補のアミノ酸変化。

表4: 逆遺伝学を用いて作成されたビクトリアリネージHYワクチンウイルス候補のアミノ酸変化。
ウイルスライブラリーを、MDCK細胞において合計12回継代培養した(例えば2回継代後にライブラリーを混合し、さらに10回継代培養した(図2))。MDCK細胞の継代培養後、プラークアッセイを行い、1,400個を超える個体のプラークを採取した。高収率候補を表1～4に示す。

表5及び6は、同様のプロトコールを用いてVero細胞の増殖を増強させる変化を示す。
表5: HYヤマガタリネージウイルスに適合したVero細胞のアミノ酸変化。

表6: HYビクトリアリネージウイルスに適合したVero細胞のアミノ酸変化。

表7 孵化鶏卵の連続したウイルス継代培養後に検出されたアミノ酸変化

全ての刊行物、特許及び特許出願は、出典明記により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明をその特に好ましい実施形態に関連して記載してきたが、多くの詳細が、説明のために記載されており、当業者にとって本発明は追加の実施形態を加えることが可能であり、本明細書に記載されたいくつかの詳細は、本発明の基本的な原理から逸脱することなく顕著に変更され得ることが明らかである。
［１］ PA、PB1、PB2、NP、NS及びMウイルスセグメント、異種又はキメラインフルエンザウイルスNAウイルスセグメント、及び異種又はキメラインフルエンザウイルスHAウイルスセグメントを有する単離された組換えB型インフルエンザウイルスであって、ここで、前記NSウイルスセグメントが、42位にY以外の残基、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基をコードし、及び/又は39ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド又は38位の後にヌクレオチド挿入、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記Mウイルスセグメントが、34位にG以外の残基、54位にD以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基、又は97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するM1ポリペプチドをコードし; 又は前記Mウイルスセグメントが、58位にH以外の残基、80位にR以外の残基、27位にH以外の残基、又は26位にG以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するBM2ポリペプチドをコードし; 前記NPウイルスセグメントが、28位にA以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、及び/又は343位にP以外の残基を有するNPポリペプチドをコードし、及び/又は1795ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチドを有し又は500ヌクレオチド位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PAウイルスセグメントが、387位にY以外の残基、434位にV以外の残基、494位にD以外の残基、及び/又は524位にT以外の残基を有し、及び/又は2272ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチドを有し、1406位にa以外のヌクレオチドを有し、1445位にc以外のヌクレオチドを有し、又は2213位にg以外のヌクレオチドを有し、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PB2ウイルスセグメントが、16位にN以外の残基を有するPB2ポリペプチドをコードし; 又はそれら何れかの組合せ、である単離された組換えB型インフルエンザウイルス。
［２] 前記NPポリペプチドが、以下: 28位にT、40位にS、51位にQ、52位にK、57位にG、204位にT、343位にT、1795位にa又は前記NPウイルスセグメントが500位にtを有する、の少なくとも１つを有する、項目1に記載の単離されたウイルス。
［３] 前記M1ポリペプチドが、以下: 34位にV又はN、54位にG、77位にK、86位にT、又は97位にN、の少なくとも1つを有する、項目1又は2に記載の単離されたウイルス。
［４] 前記BM2ポリペプチドが、以下: 58位にR、80位にG、27位にR又は26位にR、の少なくとも1つを有する、項目1、2又は3に記載の単離されたウイルス。
［５] 前記NS1ポリペプチドが、以下: 42位にN、117位にY、176位にQ、252位にTの少なくとも1つを有し、又は前記NSセグメントが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入又は39ヌクレオチド位にgを有する、項目1～4の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［６] 前記PAウイルスセグメントが、以下: 387位にH、434位にA、494位にN、524位にA、1406位にg、2272位にｔ、1445位にt、の少なくとも1つ、又はそれら何れかの組合せ、を有する、項目1～5の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［７] 前記NPポリペプチドが、40位にSを有し且つ、前記NP vRNAが500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、77位にKを有し、前記NS1ポリペプチドが、176位にQを有し且つ、前記NS vRNAが39ヌクレオチド位にgを有し、並びに前記PA vRNAが1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、項目1～6の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［８] 前記NPポリペプチドが、40位にS及び204位にTを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、86位にTを有し、前記NS vRNAが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有し、並びに前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、項目1～7の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［９] 前記NA遺伝子セグメント及び前記HA遺伝子セグメントが、同一インフルエンザウイルス単離株由来である、項目1～8の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［１０] 前記PA、PB1、PB2、NP、NS、及びMウイルスセグメントが、以下: 配列番号2によってコードされるアミノ酸配列を有するPB1又は配列番号2によってコードされるPB1に対して少なくとも80%の配列同一性を有するPB1; 配列番号3よってコードされるアミノ酸配列を有するPB2又は配列番号3によってコードされる前記PB2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するPB2; 配列番号1によってコードされるアミノ酸配列を有するPA又は配列番号1によってコードされるPAに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するPA; 配列番号4によってコードされるアミノ酸配列を有するNP又は配列番号4によってコードされるNPに対して少なくとも80%の配列同一性を有するNP; 配列番号5によってコードされるアミノ酸配列を有するM又は配列番号5によってコードされるMに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するM; 又は配列番号6によってコードされるアミノ酸を有するNS又は配列番号6によってコードされるNSに対して少なくとも95%の配列同一性を有する; の少なくとも1つをコードする配列を含む、項目1～9の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［１１] 異種（heterologous）HA遺伝子セグメント又は異種NA遺伝子セグメントを有する、項目1～10の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［１２] 前記M1ポリペプチドが、34位にV、97位にN、又は86位にT、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記BM2ポリペプチドが、58位にR及び/又は80位にGを有し; 又は前記NPポリペプチドが、40位にS又は52位にKを有する、項目1～11の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
［１３] 項目1～12の何れか1項に記載された組換えウイルスを有するワクチン。
［１４] インフルエンザウイルスの調製方法であって、細胞を:
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、及び転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、
ここで、vRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記PB1、PB2、PA、NP、NS、及びM DNAが、1つ以上のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来し、ここで、NAのvRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記NA DNAは、異種又はキメラNAの配列を有し、及びHAのvRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記HA DNAは、異種又はキメラHAの配列を有し、ここで、前記NSウイルスセグメントは、42位にY以外の残基、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基を有するNS1ポリペプチドをコードし、及び/又は39位にa以外のヌクレオチド又は38位の後にヌクレオチドの挿入、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記Mウイルスセグメントが、34位にG以外の残基、54位にD以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基、97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するM1ポリペプチドをコードし、又は前記Mウイルスセグメントが、58位にH以外の残基、80位にR以外の残基、27位にH以外の残基、26位にG以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するBM2ポリペプチドをコードし; 又は前記NPウイルスセグメントが、28位にA以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、及び/又は343位にP以外の残基を有するNPポリペプチドをコードし、及び/又は1795位にg以外のヌクレオチド又は500位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PAウイルスセグメントが、387位にY以外の残基、434位にV以外の残基、494位にD以外の残基、及び/又は524位にT以外の残基を有し、及び/又は2272ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド、1406ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド、1445ヌクレオチド位にc以外のヌクレオチド、及び/又は2213ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PB2ウイルスセグメントが、16位にN以外の残基を有するPB2ポリペプチドをコードし; 又はそれら何れかの組合せ; と、
インフルエンザウイルスPAをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むｍRNA産生用ベクター、インフルエンザウイルスPB1をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むｍRNA産生用ベクター、インフルエンザウイルスPB2をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むｍRNA産生用ベクター、及びインフルエンザウイルスNPをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むｍRNA産生用ベクター; と
感染性インフルエンザウイルスを採取するために有効な量で接触させること: を含むインフルエンザウイルスの調製方法。
［１５] 前記細胞が、鳥類細胞又は哺乳動物細胞である、項目14に記載の方法。
［１６] 前記細胞が、Vero細胞、ヒト細胞又はMDCK細胞である、項目15に記載の方法。
［１７] 前記NPポリペプチドが、40位にSを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、77位にKを有し、前記NS1ポリペプチドが、176位にQを有し且つ、前記NS vRNAが39ヌクレオチド位にgを有し、及び前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、項目14～16の何れか1項に記載の方法。
［１８] 前記NPポリペプチドが、40位にS及び204位にTを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、86位にTを有し、前記NS vRNAが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有し、及び前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、項目14～16の何れか1項に記載の方法。
［１９] 前記感染性インフルエンザウイルスを単離することをさらに含む、項目14～18の何れか1項に記載の方法。
［２０] a) 配列番号6、18又は19によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: NS1において42位にN、117位にY、176位にQ、又は252位にT、39ヌクレオチド位にg若しくは38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有するNS vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスNS1;
b) 配列番号5、16又は17によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、M1において以下: 34位にV又はN、54位にG、77位にK、86位にT、又は97位にN; の少なくとも1つを有する、B型インフルエンザウイルスM1;
c) 配列番号5、16又は17によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、58位にR、80位にG、27位にR又は26位にRを有するB型インフルエンザウイルスBM2;
d) 配列番号4、14又は15によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: NPにおいて28位にT、40位にS、51位にQ、52位にK、57位にG、204位にT、又は343位にT、又は500ヌクレオチド位にtを有するNP vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスNP; 又は
e) 配列番号1又は13によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: 387位にH、434位にA、494位にN、又は524位にA、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にg、又は2272ヌクレオチド位にtを有するPA vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスPA;
のvRNA、cRNA又はmRNA発現のためのベクター。

Claims (23)

1. ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、およびＭウイルスセグメント、異種またはキメラインフルエンザウイルスＮＡウイルスセグメント、および異種またはキメラＨＡウイルスセグメントを有する単離された組換えＢ型インフルエンザウイルスであって、前記ＮＳウイルスセグメントがＮＳ１ポリペプチドをコードし、前記ＭウイルスセグメントがＭ１ポリペプチド及びＢＭ２ポリペプチドをコードし、前記ＮＰウイルスセグメントがＮＰポリペプチドをコードし、前記ＰＡウイルスセグメントがＰＡポリペプチドをコードし、または前記ＰＢ２ウイルスセグメントがＰＢ２ポリペプチドをコードし、ここで前記ＮＰポリペプチドは４０位にＳを有するか、または４０位にＳ及び２０４位にＴを有する、前記組換えＢ型インフルエンザウイルス。
2. 前記ＮＰポリペプチドが、５１位にＱ、５２位にＫ、５７位にＧ、又は３４３位にＴのうちの１つ以上をさらに含むか、又は前記ＮＰウイルスセグメントが、１７９５位にａを有する、請求項１に記載の単離されたウイルス。
3. 前記Ｍ１ポリペプチドが、以下の：３４位にＶまたはＮ、５４位にＧ、７７位にＫ、８６位にＴ、または９７位にＮのうちの少なくとも１つを有する、請求項１または２に記載の単離されたウイルス。
4. 前記ＢＭ２ポリペプチドが、以下の：５８位にＲ、８０位にＧ、２７位にＲまたは２６位にＲのうちの少なくとも１つを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
5. 前記ＮＳ１ポリペプチドが、４２位にＮ、１７６位にＱ、または２５２位にＴを有するか、または前記ＮＳウイルスセグメントが、ヌクレオチド３８位の後にｇのヌクレオチド挿入を有するか、又は３９位にｇを有するか、或いはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
6. 前記ＰＡポリペプチドが、３８７位にＨ、４３４位にＡ、４９４位にＮ、又は５２４位にＡのうちの少なくとも１つを有するか、または前記ＰＡウイルスセグメントが、２２７２位にｔを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離されたウイルス。
7. 前記ＮＰポリペプチドが、４０位にＳ、２０４位にＴを有し、Ｍ１ポリペプチドが７７位にＫを有し、ＮＳ１ポリペプチドが１７６位にＱを有し、ＮＳウイルスセグメントがヌクレオチド３９位にｇを有し、ＰＡウイルスセグメントがヌクレオチド２２７２位にｔを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
8. 前記ＮＰポリペプチドが、４０位にＳ及び２０４位にＴを有し、そして前記Ｍ１ポリペプチドが８６位にＴを有し、前記ＮＳウイルスセグメントがヌクレオチド３８の後にｇの挿入を有し、そして前記ＰＡウイルスセグメントがヌクレオチド２２７２位にｔを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
9. 前記ＮＡウイルスセグメントおよび前記ＨＡウイルスセグメントが、同一のインフルエンザウイルス単離株由来である、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離されたウイルス。
10. 前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、およびＭウイルスセグメントが、以下の：
    配列番号２によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１、又は配列番号２によりコードされるＰＢ１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；
    配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＡ、又は配列番号３によりコードされるＰＢ２に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；
    配列番号１によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２、または配列番号１によりコードされるＰＡに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；
    配列番号４によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＰ、または配列番号４によりコードされるＮＰに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；
    配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を有するＭ、または配列番号５によりコードされるＭに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；又は
    配列番号６によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＳ、または配列番号６によりコードされるＮＳに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ
    のうちの少なくとも１つをコードする配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたウイルス。
11. 異種ＨＡウイルスセグメントまたは異種ＮＡウイルスセグメントを有する、請求項１～
    １０のいずれか１項に記載の単離されたウイルス。
12. Ｍ１ポリペプチドが３４位にＶ、９７位にＮ、または８６位にＴ、またはそれらの任意の組合せを有し；またはＢＭ２ポリペプチドが５８位にＲおよび／または８０位にＧを有し；またはＮＰポリペプチドが４０位にＳを有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離されたウイルス。
13. Ｂ型インフルエンザウイルスをインビトロで製造する方法であって、以下の工程：
    インビトロで哺乳動物細胞を、感染性インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で、以下の：
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＰＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＰＢ１ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＰＢ２ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＨＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＮＰ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含むＮＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、
    転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むＭ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター、および
    転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを含むＮＳ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター
    であって、前記ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター中のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、およびＭ ＤＮＡが、１つまたは複数のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来し、ＮＡのｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター中のＮＡ ＤＮＡが、異種またはキメラＮＡの配列を有し、
    ＨＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡ産生用ベクター中のＨＡ ＤＮＡが、異種またはキメラＨＡの配列を有し、
    ＮＰ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡによってコードされるＮＰポリペプチドが、４０位にＳを有するか、または４０位にＳ及び２０４位にＴを有し；
    前記ＮＰポリペプチドにおける位置は、配列番号４によりコードされるＮＰポリペプチドに対するものであり；そして
    インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結したプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用ベクター、
    インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結したプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用ベクター、
    インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結したプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用ベクター、および
    インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結したプロモーターを含むｍＲＮＡ産生用ベクター
    と接触させる工程
    を含む、前記方法。
14. 前記細胞がヒト細胞である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞がＶｅｒｏ細胞、ヒト細胞またはＭＤＣＫ細胞である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ＮＰポリペプチドが、４０位でＳを有し、前記Ｍ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡによりコードされるＭ１ポリペプチドが７７位でＫを有し、前記ＮＳ ｖＲＮＡ又はｃＲＮＡによりコードされるＮＳ１ポリペプチドは１７６位にＱを有し、そして前記ＮＳ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡはヌクレオチド３９位にｇを有し、そして前記ＰＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡはヌクレオチド２２７２位にｔを有する、請求項１３～１５の何れか一項に記載の方法。
17. 前記ＮＰポリペプチドが、４０位にＳを、２０４位にＴを有し、そして前記Ｍ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡによりコードされるＭ１ポリペプチドが、８６位にＴを有し、
    前記ＮＳ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡはヌクレオチド３８位の後にｇの挿入を有し、
    前記ＰＡ ｖＲＮＡまたはｃＲＮＡはヌクレオチド２２７２位にｔを有する、請求項１３～１５の何れか一項に記載の方法。
18. 前記感染性インフルエンザウイルスを単離することをさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、およびＭのｖＲＮＡまたはｃＲＮＡが、以下の：
    配列番号２によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ１、又は配列番号２によりコードされるＰＢ１に対して少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するＰＢ１；
    配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＡまたは配列番号３によりコードされるＰＡに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＡ；
    配列番号１によりコードされるアミノ酸配列を有するＰＢ２または配列番号１によりコードされるＰＢ２に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＢ２；
    配列番号４によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＰまたは配列番号４によりコードされるＮＰに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＮＰ；
    配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を有するＭまたは配列番号５によりコードされるＭに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＭ；又は
    配列番号６によりコードされるアミノ酸配列を有するＮＳまたは配列番号６によりコードされるＮＳに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＮＳ
    のうちの少なくとも１つをコードする配列を含む、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＮＳウイルスセグメントが３８位の後にヌクレオチド挿入を有するか；または
    前記ＭウイルスセグメントによりコードされるＭ１ポリペプチドが、８６位にＴを有するか；または
    前記ＮＰウイルスセグメントによりコードされるＮＰポリペプチドが、４０位にＳを有するか；または
    前記ＰＡウイルスセグメントがヌクレオチド２２７２位にａ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の単離されたウイルス。
21. 前記ＮＳウイルスセグメントによってコードされるＮＳ１ポリペプチドが、１７６位にＱを有し、そして前記ＮＳウイルスセグメントがヌクレオチド３９位にａ以外のヌクレオチドを有するか；または
    前記ＭウイルスセグメントによってコードされるＭ１ポリペプチドが７７位にＫを有するか；または
    前記ＮＰウイルスセグメントによってコードされるＮＰポリペプチドが４０位にＳを有し、そして２０４位にＴを有するか；または
    前記ＰＡウイルスセグメントがヌクレオチド２２７２位にａ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の単離されたウイルス。
22. 前記ＭウイルスセグメントによってコードされるＭ１ポリペプチドが３４位にＶ、および／または９７位にＮを有するか；あるいは
    前記ＭウイルスセグメントによってコードされるＢＭ２ポリペプチドが５８位にＲ、２７位にＲ、および／または２６位にＲを有するか；あるいは
    前記ＮＰウイルスセグメントによってコードされるＮＰポリペプチドが３４３位にＴを有するか；あるいは
    前記ＰＡウイルスセグメントによってコードされるＰＡポリペプチドが４９４位にＮを有し、および／または前記ＰＡウイルスセグメントが、ヌクレオチド２２７２位にａ以外のヌクレオチドを有し、またはヌクレオチド２２１３位にｇ以外のヌクレオチドを有するか；あるいは
    前記ＰＢ２ウイルスセグメントによってコードされるＰＢ２ポリペプチドが１６位にＳを有する、請求項１に記載の単離されたウイルス。
23. 前記ＮＳウイルスセグメントによってコードされるＮＳ１ポリペプチドが４２位にＮを有するか；または
    前記ＭウイルスセグメントによってコードされるＢＭ２ポリペプチドが８０位にＧを有するか；または
    前記ＰＡウイルスセグメントによってコードされるＰＡポリペプチドが３８７位にＨ、４３４位にＡ、および／または５２４位にＡを有するか、または
    前記ＰＡウイルスセグメントが、ヌクレオチド２２７２位にａ以外のヌクレオチドを有し、またはヌクレオチド２２１３位にｇ以外のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の単離されたウイルス。