JP7785258B2

JP7785258B2 - 多量体ＩｇＡ抗体の作製法及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体

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Publication number: JP7785258B2
Application number: JP2022510493A
Authority: JP
Inventors: 泰造上下; 耕史郎田畑; 忠樹鈴木; 秀樹長谷川
Original assignee: JAPAN INSTITUTE FOR HEALTH SECURITY; Toko Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: JAPAN INSTITUTE FOR HEALTH SECURITY; Toko Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2025-12-15
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CA3171544A1; TW202202514A; EP4130021A1; US20230167199A1; CN115397833A; WO2021193553A1; BR112022018985A2; JPWO2021193553A1; EP4130021A4; AU2021242058A1; KR20230005165A

Description

本発明は、多量体ＩｇＡ抗体、好ましくは多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の作製法、及び多重特異性多量体ＩｇＡ抗体に関する。

生体内において最も産生量の多い抗体であるＩｇＡ抗体はインフルエンザ等の粘膜組織を標的とした呼吸器感染症に対する生体防御の最前線防御因子として機能している。この分泌型ＩｇＡ抗体（ＳＩｇＡ）は二量体以上の多量体を形成しており、特に四量体ＳＩｇＡは、ＩｇＧや単量体ＩｇＡより機能活性が高いことが明らかになっている。

発明者らの以前の研究では、モノクローナルＩｇＧ抗体の可変領域配列以外の定常領域をＩｇＡのフレームに置き換えることにより、該モノクローナル抗体の抗原認識部位を保持しつつＩｇＡに変換した抗体を得、該抗体を人為的に分泌型化及び四量体化させたモノクローナル四量体ＳＩｇＡを作製する技術を開発した（特許文献１）。しかしながら、この技術で作製した四量体ＳＩｇＡの持つ８つのＦａｂ領域は全て同一の可変領域を持っており、単一のエピトープに対する反応性しか有していない。

現在、抗体に存在する複数のＦａｂにそれぞれ異なる可変領域を搭載した多重特異性抗体が実用化されている。多重特異性抗体は、抗体医薬だけでなく、研究用ツールや診断薬の開発など、さまざまな分野での応用が期待されている技術である。しかしながら、その製造方法は複雑であり、１つの多重特異性抗体を作製するためには多大な労力を伴うことから、実用化されている多重特異性抗体の種類は限定的である。

特許第６５６４７７７号

本発明は、多量体ＩｇＡ抗体、特に多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を簡便かつ効率よく製造する方法を提供することを目的とした。

本発明者らは、鋭意研究の結果、それぞれ別々の培養細胞で作製した二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体、及び分泌片（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、以下「ＳＣ」ともいう）を試験管内で混合することによって、簡便且つ効率よく二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造できることを見出し、本発明を完成させた。さらに、分泌片を混合しない場合も、混合した場合より効率は落ちるが、同様に二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造できることを見出した。本発明の技術は、二重特異性三量体及び四量体抗体だけでなく、単一特異性三量体及び四量体抗体、及び三重特異性以上の多重特異性三量体及び四量体抗体の製造にも適用できる。

すなわち、本発明は
［１］二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造するための方法、
［２］さらに分泌片を混合することを含む、［１］記載の方法、
［３］前記二量体ＩｇＡ抗体が第１の抗原結合部位を含み、前記単量体ＩｇＡ抗体が第２の抗原結合部位を含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が製造される、［１］又は［２］記載の方法、
［４］第３の抗原結合部位を含む別の単量体ＩｇＡ抗体をさらに混合する、［３］記載の方法、
［５］前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含む、［３］記載の方法、
［６］前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含み、前記別の単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第３の抗原結合部位を含む、［４］記載の方法、
［７］前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、［２］～［６］のいずれか１項記載の方法、
［８］分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合することを含む、請求項［１］～［７］のいずれか１項記載の方法、
［９］前記二量体ＩｇＡ抗体及び前記単量体ＩｇＡ抗体がそれぞれ別々に培養細胞で作製された組換えＩｇＡ抗体である、［１］～［８］のいずれか１項記載の方法、
［１０］製造された三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離することをさらに含む、［１］～［９］のいずれか１項記載の方法、
［１１］製造された三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体を分離することをさらに含む、［１０］記載の方法。
［１２］第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体、
［１３］さらに分泌片を含む、［１２］記載の抗体、
［１４］第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子との重合物である、［１２］記載の抗体、
［１５］第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子と、分泌片との重合物である、［１３］記載の抗体、
［１６］４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む、［１２］～［１５］のいずれか１項記載の抗体、
［１７］前記分泌片が野生型ＳＣ又はＳＣ変異体である、［１３］、［１５］および［１６］のいずれか１項記載の抗体、および
［１８］［１２］～［１７］のいずれか１項記載の抗体を含む医薬組成物
を提供する。

本発明の多量体ＩｇＡ抗体は、１つの抗体分子の中に、１つの二量体ＩｇＡ抗体に由来する４つのＦａｂ領域及び単量体ＩｇＡ抗体に由来する２つ又は４つのＦａｂ領域を搭載することにより、一種類または二種類以上のＦａｂ領域を有することができる。したがって、本発明によれば、多量体ＩｇＡ抗体、特に多重特異性多量体ＩｇＡ抗体が得られる。本発明の多量体ＩｇＡ抗体および多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、各抗原に対する高い抗原結合性又は中和活性を有する。また、本発明の方法において二量体ＩｇＡ抗体同士、単量体ＩｇＡ抗体同士は重合することが出来ないことから、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体及び第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を用いる場合、本発明の方法により製造される三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は１００％の確率で多重特異性抗体となる。本発明は、二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体の少なくとも２つのタンパク質をイン・ビトロで混合するだけという簡便な方法により、多量体抗体、特に多重特異性多量体抗体、特に多重特異性三量体及び四量体抗体、特に二重特異性三量体及び四量体抗体を作製するものであり、抗体を用いた研究用ツールやデリバリーツール、診断薬、医薬品の開発のプラットフォームとして有用である。本発明では、さらにＳＣを混合することにより、多量体抗体の製造効率が向上する。

本願の二重特異性四量体ＩｇＡ抗体の製造の一例を示す模式図である。野生型ＳＣのアミノ酸配列、及びＳＣ１２欠失変異体のアミノ酸配列を示す。野生型ＳＣの塩基配列を示す。ＳＣ１２欠失変異体の塩基配列を示す。ＳＣ１２のＩｇＡ抗体多量体化促進能を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」（実線で示される）は、単量体ＩｇＡ１抗体と二量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、二量体ＩｇＡ１抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「Ｔｒｉ／ＴｅｔＩｇＡ」は、細胞内で作出した三量体及び四量体ＩｇＡ１抗体（コントロール）を示す。ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔのＩｇＡ抗体四量体形成促進能の比較を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）の有無による、ＳＣ１２存在下でのＩｇＡ抗体多量体形成効率を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ１２＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、ＳＣ１２、及び添加剤を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、ＳＣ１２、及び添加剤を混合した結果を示す。添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）の有無による、野生型ＳＣ存在下でのＩｇＡ抗体多量体形成効率を示すグラフである。図中、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、単量体ＩｇＡ１抗体、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型二量体ＩｇＡ１抗体、野生型ＳＣ、及び添加剤を混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、及び野生型ＳＣを混合した結果を示す。「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ－ｗｔ＋Ｓｕｐｐｌｅ」は、蛍光標識ｍＣｈｅｒｒｙ融合型単量体ＩｇＡ１抗体、二量体ＩｇＡ１抗体、野生型ＳＣ、及び添加剤を混合した結果を示す。各添加剤によるＩｇＡ多量体形成促進効果を示すグラフである。ＩｇＡ抗体の定常領域の違い（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ｍ２）による多量体形成効率を示すグラフである。反応時間の長さによる多量体形成効率の違いを示すグラフである。異なる２種類の特異性を有した単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を用いて、ＳＣの有無による三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成効率の違いを示すグラフである。図中、「Ｈｅｔｅｒｏ」は異なる特異性を有する単量体ＩｇＡ２ｍ２（ｍＡ２）と二量体ＩｇＡ１（ｄＡ１）の組み合わせを示し、「Ｈｏｍｏ」は同一の特異性を有するｍＡ２とｄＡ１の組み合わせを示す。

１．用語
本明細書において使用される用語は、特に定義されない限り、当該技術分野で一般に使用される意味を有する。

「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）と呼ばれるタンパク質であり、抗原に特異的に結合する能力を有する。抗体は、Ｙ字型に配置された２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）の計４本のポリペプチド鎖からなる基本単位を有し、１個以上の基本単位が集まって１つの抗体分子が形成される。該４本のポリペプチド鎖には、アミノ酸配列の変化が比較的少ない定常領域（重鎖の定常領域：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び軽鎖の定常領域：ＣＬ）、及びアミノ酸配列の変化が大きい可変領域（重鎖の可変領域：ＶＨ、及び軽鎖の可変領域：ＶＬ）が存在する。

「多量体」とは、上記の基本単位を２個以上含む抗体をいう。後述するように、本願の製造方法によって作製される抗体は、三量体及び四量体抗体である。したがって、本願明細書において使用される場合、「多量体」は、三量体又は四量体、又は三量体及び四量体の混合物を意味する。

「Ｆａｂ領域」は、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインとからなる、抗原結合部位を含む領域である。

「多重特異性」とは、抗体が２つ以上の異なるエピトープ（抗原決定基）に特異的に結合することができることを意味する。「二重特異性」とは、抗体が２つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。「三重特異性」とは、抗体が３つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。同様に、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、及び八重特異性とは、抗体がそれぞれ４つ、５つ、６つ、７つ、及び８つの異なるエピトープに特異的に結合することができることを意味する。一般的に、多重特異性抗体は、各々が異なるエピトープに特異的な二種類以上の抗原結合部位（パラトープ）を含む。ここで、「異なるエピトープ」は、同じ抗原上の異なるエピトープであってもよく、または異なる抗原上のエピトープであってもよい。

「単一特異性」とは、抗体が同じ抗原の同じエピトープに結合する、１つ又は複数の抗原結合部位を有することを意味する。

「抗原結合部位」は、エピトープに結合する抗体分子上の領域を意味する。抗原結合部位は、重鎖のＶＨ及び軽鎖のＶＬを含む。本明細書において、第１の、第２の、第３の、及び第４の抗原結合部位とは、異なる抗原上のエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、それぞれ異なるアミノ酸配列からなる領域を意味する。

「ＩｇＡ」は、抗体（免疫グロブリン）のアイソタイプの１つである。本明細書においては、「ＩｇＡ抗体」又は「ＩｇＡ型抗体」ともいう。ヒトのＩｇＡは、定常領域の違いによりＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスに分類される。さらにＩｇＡ２は、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、およびＩｇＡ２（ｎ）の３つのアロタイプに分けられる。ＩｇＡは、血清中では主に単量体ＩｇＡとして存在しており（血清型ＩｇＡ）、ＩｇＡ１が主要構成要素である。粘膜に分泌されると、二量体以上の多量体ＩｇＡとして存在し（分泌型ＩｇＡ又はＳＩｇＡ）、ＩｇＡ２が約半分程度を占める。多量体ＩｇＡは、２分子以上のＩｇＡがＪ鎖（Ｊｏｉｎｉｎｇｃｈａｉｎ）又はＪ鎖及びＳＣにより重合したものである。多量体ＩｇＡには、ＳＣを含むものと含まないものが存在する。二量体ＩｇＡは、一般に、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の割合が４：４：１である分子を指す。

「ＳＣ（又は分泌片）」は、分子量約７０ｋＤａの糖鎖修飾されたポリペプチドであり、多量体免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）の細胞外ドメインに由来する。Ｎ末端から５つの免疫グロブリン様ドメインを有し、それぞれＤ１～Ｄ５と名付けられている。このうちＤ１が多量体ＩｇＡとの結合に必須であり、特にＤ１に存在する免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）に類似した構造が、多量体ＩｇＡとの結合に重要な役割を担う。

ｐＩｇＲは、粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現している、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型の膜貫通型タンパク質であり、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞質内領域からなる。ｐＩｇＲは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生したＪ鎖を含む多量体ＩｇＡ分子を特異的に認識して結合し、上皮細胞中に取り込み、結合したまま頂端部（apical）側へ輸送する。ここで、上皮細胞のタンパク質分解酵素により、ｐＩｇＲの細胞外ドメインと膜貫通領域との間が切断され、多量体ＩｇＡがｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と結合した状態で内腔側粘膜層へ分泌される（分泌型ＩｇＡ又はＳＩｇＡ）。切断後のｐＩｇＲの細胞外ドメインがＳＣに相当する。本明細書において使用する場合、ＳＣを分子内に含むＩｇＡ抗体を「分泌型ＩｇＡ抗体」という。

「Ｊ鎖」は、Ｎ結合型糖鎖を有する分子量約１５ｋＤａのポリペプチドである。Ｊ鎖は、生物間で高度に保存されており、多量体ＩｇＡがｐＩｇＲと相互作用するうえで不可欠である。

２．多量体ＩｇＡ抗体の製造方法
本発明の第一の態様において、二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される（以下、「本願の製造方法」ともいう）。本願の製造方法のさらなる態様として、二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣを混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される。本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、２つの単量体ＩｇＡ抗体とが重合して、１つの四量体ＩｇＡ抗体が製造される。さらに、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、２つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとが重合して、１つの四量体ＩｇＡ抗体が製造される（図１）。また、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つの単量体ＩｇＡ抗体とが重合して、１つの三量体ＩｇＡ抗体が製造される。またさらに、本願の製造方法によれば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとが重合して、１つの三量体ＩｇＡ抗体が製造される。

混合する二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体は、それぞれ異なる可変領域を含んでいてもよく、又は同一の可変領域を含んでいてもよい。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体の全ての可変領域が同一である場合、得られる三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は単一特異性抗体である。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体が２種以上の異なる可変領域を含む場合、二重ないし八重の、多重特異性抗体が得られる。例えば、４つのＦａｂ領域の全てが第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を用いて、二重特異性三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。例えば、４つのＦａｂ領域の全てが第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第２の抗原結合部位を含む第１の単量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第３の抗原結合部位を含む第２の単量体ＩｇＡ抗体とを用いて、三重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。例えば、４つのＦａｂ領域の２つが第１の抗原結合部位を含み、残りの２つが第２の抗原結合部位を含む二重特異性二量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第３の抗原結合部位を含む第１の単量体ＩｇＡ抗体と、２つのＦａｂ領域の両方が第４の抗原結合部位を含む第２の単量体ＩｇＡ抗体とを用いて、三重特異性三量体ＩｇＡ抗体、及び三重又は四重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得てもよい。このように、混合する二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体に含まれる可変領域を変更することにより、所望の二重ないし六重の多重特異性三量体ＩｇＡ抗体、及び所望の二重ないし八重の多重特異性四量体ＩｇＡ抗体を得ることができる。したがって、本発明の好ましい態様では、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体及び第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、又は第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣを混合することを含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の製造方法が提供される。

本願の製造方法においては、二量体ＩｇＡ抗体同士は重合せず、また、単量体ＩｇＡ抗体同士も重合しない。したがって、第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体とを混合した場合、又は第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣを混合した場合は、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が１００％の確率で得られる

混合する二量体ＩｇＡ抗体及び／又は単量体ＩｇＡ抗体は、その重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸であることが好ましい。疎水性アミノ酸として、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、グリシンが挙げられ、好ましい例として、イソロイシンが挙げられる。このようなＩｇＡ抗体の重鎖定常領域は、天然配列からなるものであってもよく、又は遺伝子組み換え技術によって第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に改変されたものであってもよい。本発明によると、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基がイソロイシンであるＩｇＡ２ｍ２抗体を用いた場合、重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸以外であるＩｇＡ１抗体のみを用いた場合と比べて、多量体ＩｇＡ抗体の形成効率が上がった（実施例５）。ＩｇＡ１の定常領域のアミノ酸配列を配列番号１に、ＩｇＡ２ｍ２の定常領域のアミノ酸配列を配列番号２に示す。

ＳＣとしては、野生型ＳＣ又はＳＣ変異体のいずれを用いてもよい。ＳＣ変異体としては、例えば、少なくともドメインＤ１を含むＳＣ変異体が挙げられ、例えば、ＳＣのドメインＤ２～Ｄ５のうち１以上のドメイン又はＤ２～Ｄ５の領域の一部を欠失した変異体が挙げられる。好ましくは、少なくともドメインＤ１およびＤ２を含むＳＣ変異体、ＳＣのドメインＤ４及びＤ５の欠失変異体、ＳＣのドメインＤ３～Ｄ５の全てを欠失した変異体（本明細書において、「ＳＣ１２」という）等が挙げられる。さらに好ましくは、ＳＣとして、野生型ＳＣ（配列番号３）又はＳＣ１２（配列番号４）あるいはそれらの変異体が用いられ、またさらに好ましくはＳＣ１２又はその変異体が用いられる。かかるＳＣ変異体としては、例えば、配列番号３又は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本願の製造方法では、ＳＣを用いても、用いなくてもよく、好ましくはＳＣを用いる。ＳＣを用いると、三量体及び／又は四量体ＩｇＡ抗体の形成効率が向上する。

本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体の由来は、特に限定されず、例えば、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。

ＩｇＡ抗体が特異的に結合する抗原は、特に限定されない。所望の三量体ＩｇＡ抗体及び／又は四量体ＩｇＡ抗体を作製するために適当なＩｇＡ抗体を選択すればよい。

本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体のサブクラスは、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２のいずれであってもよく、又はＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方を使用してもよい。好ましくは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方を使用してもよい。例えば、二量体ＩｇＡ１抗体と単量体ＩｇＡ２抗体を使用してもよい。さらに、ＩｇＡ２のいずれのアロタイプを用いてもよい。

本願の製造方法において使用されるＩｇＡ抗体は、天然のＩｇＡ抗体であってもよく、又は組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。ここで、「組み換え抗体」とは、天然の抗体配列を改変した抗体、および配列改変の有無にかかわらず、遺伝子組み換え技術により人為的に作製した抗体を包含する。例えば、非ＩｇＡ型抗体をＩｇＡ型に変換した組み換えＩｇＡ抗体を用いてもよい。非ＩｇＡ型抗体としては、例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＹ抗体が挙げられる。非ＩｇＡ型抗体の由来は、特に限定されず、例えば、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物抗体、げっ歯類由来の抗体、鳥類由来の抗体等が挙げられる。例えば、ＩｇＧ抗体の可変領域をＩｇＡ抗体のバックボーンフレームワークに移植することによって、又はＩｇＧ抗体のＣＤＲのみをＩｇＡ抗体のＣＤＲに移植することによって作製された組み換えＩｇＡ抗体を使用してもよい。さらに、組み換えＩｇＡ抗体には、ある動物種由来の抗体の可変領域と別の動物種の由来のＩｇＡ抗体の定常領域を組み合わせたキメラ組み換えＩｇＡ抗体、ある動物種由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物種の由来のＩｇＡ抗体のＣＤＲに移植した組換え抗体も包含される。遺伝子組み換え技術は、当該分野でよく知られている。

したがって、本明細書において「ＩｇＡ抗体」とは、少なくとも一部がＩｇＡ抗体に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。

本願の製造方法において使用される二量体ＩｇＡ抗体は、好ましくはＳＣを含まない。また、本願の製造方法において使用される二量体ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖を含む。

混合する二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体は、当該分野において既知の方法によって作製すればよい。例えば、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体は、それぞれ別々に培養細胞で作製されたものであってもよい。二量体ＩｇＡ抗体は、例えば、該ＩｇＡ抗体を構成する重鎖タンパク質、軽鎖タンパク質及びＪ鎖を１つの宿主細胞内で共発現させることによって作製してもよい。単量体ＩｇＡ抗体は、例えば、該ＩｇＡ抗体を構成する重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質を１つの宿主細胞内で共発現させるよって作製してもよい。

宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。昆虫細胞としては、限定するものではないが、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株等が挙げられる。

上記のタンパク質（二量体ＩｇＡ抗体の場合、重鎖タンパク質、軽鎖タンパク質及びＪ鎖；単量体ＩｇＡ抗体の場合、重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質）を１つの宿主細胞内で共発現させる工程は、例えば、これらのタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを該細胞内に導入することによって行えばよい。発現ベクター及び導入方法は当該分野でよく知られている。発現ベクターとしては、ファージベクター、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を使用することができ、宿主に適当なベクターが当業者により適宜選択される。発現ベクター導入後、細胞を培養して目的のタンパク質を発現させる。細胞培養条件は当業者によって適宜選択される。

本願の製造方法においては、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体及びＳＣに加えて、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合してもよい。分子シャペロンタンパク質は、タンパク質分子のフォールディングに寄与するタンパク質である。分子シャペロンタンパク質としては、Ｈｓｐ６０ファミリー、Ｈｓｐ７０ファミリー、Ｈｓｐ９０ファミリー、Ｈｓｐ１００ファミリー、低分子量Ｈｓｐファミリー、イソメラーゼ類、及びこれらの補助因子などがあり、例えば、Ｄｎａｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ等が挙げられ、２種以上の分子シャペロンタンパク質を用いてもよい。ジスルフィド結合イソメラーゼは、アミノ酸残基間のジスルフィド結合に寄与する酵素である。酸化型グルタチオンは、ジスルフィド結合を形成するために必要な酸化的条件を作り出す。これらの物質の少なくとも１つを用いることにより、ＩｇＡ抗体の四量体形成が促進される。本願の製造方法において、好ましくは、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも２つの物質をさらに混合してもよく、さらに好ましくは、分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ及び酸化型グルタチオンをさらに混合する。また、本願の製造方法において、好ましくは、分子シャペロンタンパク質及びジスルフィド結合イソメラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合してもよい。

本願の製造方法において、二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣ、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ＳＣ、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合は、ｐＨ６～１０、好ましくはｐＨ７～８に調整した緩衝液中で行えばよい。緩衝液としては、例えば、限定するものではないが、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。混合時の適当な温度は、当業者により適宜決定することができるが、例えば２５℃～４５℃、好ましくは３０℃～４３℃、より好ましくは３５℃～４０℃、例えば３７℃前後である。混合時間は、特に限定されず、反応容量等の他の条件に基づき当業者により適宜決定することができるが、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、又は４８時間以上であってもよく、好ましくは２４時間～７２時間程度であってもよい。二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体の混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、及びＳＣの混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合比率、又は二量体ＩｇＡ抗体、単量体ＩｇＡ抗体、ＳＣ、ならびに分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質の混合比率は、特に限定されず、当業者により適宜決定することができる。

かくして製造された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体は、その分子サイズ等の特性に基づいて、他のＩｇＡ抗体（多量体化しなかった二量体ＩｇＡ抗体及び単量体ＩｇＡ抗体）から分離することができ、さらに、三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体も互いに分離することができる。三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の他のＩｇＡ抗体からの分離には、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析等を用いることができる。したがって、本願の製造方法は、三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離する工程をさらに含んでいてもよい。

また、本願の製造方法によって製造された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体の特異性の確認は、ＥＬＩＳＡ法、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の既知の方法により行うことができる。本願の製造方法によって製造される多量体ＩｇＡ抗体は、その多くが四量体ＩｇＡ抗体である。したがって、本願の製造方法によれば、三量体ＩｇＡ抗体と比べて四量体ＩｇＡ抗体を高い割合で含む、三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体の混合物が得られる。

３．多重特異性多量体ＩｇＡ抗体
本発明の第二の態様において、第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体が提供される（以下、「本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体」ともいう）。本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体のさらなる態様として、第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域、及びＳＣを含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体が提供される。本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、好ましくは、上記した本願の製造方法によって得られる。

該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、好ましくは、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体との重合物である。該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、さらに好ましくは、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体と、ＳＣとの重合物である。例えば、１つの二量体ＩｇＡ抗体と、１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体は、ＳＣを介して三量体化又は四量体化されている。例えば、該二量体ＩｇＡ抗体は第１の抗原結合部位を含み、該単量体ＩｇＡ抗体は第２の抗原結合部位を含む。好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む。さらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、少なくとも２つの第２のＦａｂ領域、及びＳＣを含む。またさらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域及び２つの第２のＦａｂ領域を含む二重特異性三量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域及び４つの第２のＦａｂ領域を含む二重特異性四量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域、及び２つの第３のＦａｂ領域を含む三重特異性四量体ＩｇＡ抗体であってもよい。またさらに好ましい例において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域及びＳＣを含む二重特異性三量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、４つの第２のＦａｂ領域及びＳＣを含む二重特異性四量体ＩｇＡ抗体、又は４つの第１のＦａｂ領域、２つの第２のＦａｂ領域、２つの第３のＦａｂ領域及びＳＣを含む三重特異性四量体ＩｇＡ抗体であってもよい。またさらに好ましい例において、前記４つの第１のＦａｂ領域は二量体ＩｇＡ抗体に由来し、前記２つ又は４つの第２又は第３のＦａｂ領域は単量体ＩｇＡ抗体に由来する。

本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２のいずれであってもよく、又はその両方を含んでいてもよい。好ましくは、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２の両方を含んでいてもよい。さらに好ましくは、該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、二量体ＩｇＡ１由来の４つのＦａｂ領域、及び単量体ＩｇＡ２由来の２つ又は４つのＦａｂ領域を含んでいてもよい。また、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体に含まれるＩｇＡ２は、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、又はＩｇＡ２（ｎ）であってもよい。

本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、その重鎖定常領域の第４５８番目のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸であってもよい。疎水性アミノ酸として、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、グリシンが挙げられ、好ましい例として、イソロイシンが挙げられる。

本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。例えば、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体が、１つの二量体ＩｇＡ抗体と１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体との重合物である場合、又は１つの二量体ＩｇＡ抗体と１つ又は２つの単量体ＩｇＡ抗体とＳＣとの重合物である場合、該二量体ＩｇＡ抗体及び該単量体ＩｇＡ抗体のいずれか、又は全てが組み換えＩｇＡ抗体であってもよい。

本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を構成するＩｇＡ抗体及びＳＣについては、上記「２．多量体ＩｇＡ抗体の製造方法」に記載したとおりである。

４．医薬組成物
本発明の第三の態様において、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を含む医薬組成物が提供される（以下、「本願の医薬組成物」ともいう）。本願の医薬組成物は、好ましくは、本願の多重特異性多量体ＩｇＡ抗体、又は該多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の混合物を有効成分として含む。

本願の医薬組成物は、例えば、疾患の治療、予防、又は診断等のために使用することができる。本願の医薬組成物を使用する対象疾患は、特に限定されず、例えば、感染症、例えば、寄生虫、細菌、真菌、ウイルス、異常プリオン等の病原体による感染症、及び悪性腫瘍等が挙げられる。感染症のさらなる例として、インフルエンザウイルス感染症、ＲＳウイルス感染症、エボラウイルス感染症、重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の粘膜感染症が挙げられる。

本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、該医薬組成物の使用目的に適当な抗原結合部位を有する。例えば、疾患の診断、予防、治療等に用いる場合、例えば、１つの対象疾患に関連する２つの異なるタンパク質（例えば、原因タンパク質、マーカータンパク質等）に特異的に結合する、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体を用いることができる。例えば、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質にそれぞれ特異的に結合するものであってもよい。また、例えば、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体は、標的細胞に特異的なタンパク質及び治療に有効なタンパク質にそれぞれ特異的に結合するものであってもよい。本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の標的となり得る抗原又はエピトープの例として、限定するものではないが、エボラウイルスの糖タンパク質の複数のエピトープ、ＳＦＴＳウイルスの糖タンパク質であるＧｎタンパク質及びＧｃタンパク質、ＣＤ３やＣＤ８などのリンパ球のマーカータンパク質、及び癌特異抗原等が挙げられる。

本願の医薬組成物は、粉剤、液剤等の剤型に製剤化して投与することができる。本願の医薬組成物は、製薬分野で既知の賦形剤、添加剤、増粘剤等をさらに含んでいてもよい。例えば、本願の医薬組成物は、鼻腔粘膜上への噴霧による投与、ネブライザーを用いた下気道への吸入による投与等により投与してもよい。

本願の医薬組成物は、ヒトを対象とするものであってもよく、又は非ヒト哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物、チンパンジー、ゴリラ、カニクイザル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類等を対象とするものであってもよい。

本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖、軽鎖、ＳＣ、及びＪ鎖のいずれかは、当該医薬組成物の対象動物に由来する（対象とする動物型である）アミノ酸配列を含むことが好ましい。さらに好ましくは、本願の医薬組成物に含まれる多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖、軽鎖、ＳＣ、及びＪ鎖はいずれも、当該医薬組成物の対象動物に由来する（対象とする動物型である）アミノ酸配列を含む。ここで、重鎖及び軽鎖に関し「対象とする動物型である」とは、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域が対象とする動物のＩｇＡ重鎖及びＩｇＡ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＳＣ及びＪ鎖に関し「対象とする動物型である」とは、多重特異性多量体ＩｇＡ抗体のＳＣ及びＪ鎖が対象とする動物のＳＣ及びＪ鎖のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、ＳＣ及びＪ鎖のアミノ酸配列は、目的とする抗原結合活性を有している限り変異を含んでいてもよい。

以下、実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明の実施例に限定されるものではない。

［材料及び調製］
１．ＩｇＡ発現プラスミドベクターの作製
ヒトＩｇＡ１の定常領域であるα１重鎖（ＨＣ）の発現ベクターは下記の通り作製した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ^ＴＭ（登録商標）ＭＡＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して、実施した。簡潔に記述すると、鋳型としてｐＦＵＳＥ－ＣＨＩｇ－ｈＡ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、プライマーは制限酵素であるＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩが認識するサイトを含むＩｇＡ１抗体定常領域を増幅する適切なプライマーセットを用いて、ヒトＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子をＰＣＲを行い増幅した。ＰＣＲ条件は９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃ １０秒で３０サイクルで実施した。続いて、Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）が報告したヒトγ１ＨＣの発現ベクターを鋳型とし、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩが認識するサイトを含み、シグナル配列を除くＩｇＧ１抗体定常領域であるγ１ＨＣを除去するための適切なプライマーセットを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃ ３０秒で３０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。精製されたα１ＨＣとγ１ＨＣを除去したＴ．Ｔｉｌｌｅｒらの発現ベクターはＸｈｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で制限酵素処理した。制限酵素産物の精製は、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩを用いて行った。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、全量をＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。

ヒトＩｇＡ２のアロタイプであるα２ｍ２ＨＣは、ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ－ＤＢに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒは、α２ｍ２ＨＣがＭ６０１９２及びＡＪ０１２２６４）をヒト用にコドン最適化を行い、人工合成した（ＧｅｎｅＡｒｔＳｔｒｉｎｇｓＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ）。その時に可変領域のクローニングを容易にするため、可変領域の最後のアミノ酸アラニンと定常領域の最初のアミノ酸セリンのコドンを改編し、ＮｈｅＩ切断サイトを作製した。ＮｈｅＩ－ＨＦ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦで処理した合成配列と、同一の制限酵素で処理したα１ＨＣは、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩを用いて精製した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。

ヒト軽鎖（ＬＣ）は、抗体の各アイソタイプ間で共通であるため、Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒらによって報告されたλ ＬＣ発現ベクターを使用した。

２．抗体可変領域遺伝子のα１、α２ｍ２ＨＣ、及びλ ＬＣ発現ベクターへのクローニング
インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）のヘマグルチニン（ＨＡ）に対して広域に結合する抗体クローンとして知られているＦ０４５－０９２を使用した。Ｆ０４５－０９２はＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅに登録されている配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒは重鎖がＡＢ６４９２７０，軽鎖がＡＢ６４９２７１）をヒト用にコドン最適化を行い、それぞれα１ＨＣ（重鎖）、α２ｍ２ＨＣ（重鎖）、及びλ ＬＣ（λ鎖）の発現ベクターへ組み込めるように調整し人工合成した（ＧｅｎｅＡｒｔＳｔｒｉｎｇｓＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ）。ＡｇｅＩ－ＨＦ（全ての鎖）及びＮｈｅＩ－ＨＦ（重鎖）、ＸｈｏＩ（λ鎖）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で処理した合成配列と、同一の制限酵素で処理したα１ＨＣ、α２ｍ２ＨＣ、及びλＬＣの発現ベクターは、ＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩを用いて精製した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。

３．蛍光標識ＩｇＡ１（ｍＣ－Ａ１）、及びＩｇＡ２ｍ２抗体（ｍＣ－Ａ２）の発現プラスミドＤＮＡの作製
ＩｇＡ抗体の異なるサブクラスであるα１及びα２ｍ２の重鎖における２４１番目のシステインまでを欠損させたＣＨ２及びＣＨ３から構成されたＩｇＡ１Δ及びＩｇＡ２ｍ２Δ変異体を、制限酵素サイトを付加した特異的プライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲにより作出した。また、５’及び３’末端に制限酵素ＡｇｅＩの認識配列を付加したプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を用いてＰＣＲを行い、蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙの配列を特異的に増幅させた。その後、各ＩｇＡΔ変異体、及びｍＣｈｅｒｒｙを制限酵素ＡｇｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて至適条件で制限酵素処理を実施した後、アガロースゲル電気泳動を行うことで、制限酵素によって消化された目的産物のバンドのみを回収した。回収した目的産物をＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて精製し、その精製したＩｇＡΔ変異体をコードしたＤＮＡ断片及び、ｍＣｈｅｒｒｙをコードしたＤＮＡ断片を１：３（＝ＩｇＡ１Δ：ｍＣｈｅｒｒｙ）で混合し、等量のＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、１６℃で３０分反応させライゲーションを行った。環化されたＩｇＡΔとｍＣｈｅｒｒｙをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に４２℃で形質転換した。プラスミドＤＮＡ抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行い、サンガー法を用いてシークエンス配列の解析を行った。ｍＣｈｅｒｒｙは、ＩｇＡ１Δ及びＩｇＡ２ｍ２Δをコードする配列の５’側に付加した。また、この蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙが融合したＩｇＡΔ変異体をそれぞれｍＣ－Ａ１抗体、並びにｍＣ－Ａ２抗体とした。実施した操作は全て添付された説明書に従った。

４．Ｊ鎖及び分泌片（ＳＣ）のクローニング
Ｊ鎖（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＭ＿１４４６４６）を、コーディング配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列を、さらに３’側にＮｏｔＩ認識配列を付加したものを人工遺伝子合成サービス（ユーロフィンジェノミクス）により人工合成した。その後、ＸｈｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びＮｏｔＩ－ＨＦ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて、至適の条件で制限酵素処理を実施し、同一の条件で哺乳類培養細胞用の発現ベクターであるｐＣＸＳＮベクターもまた制限酵素処理を実施した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。

野生型ＳＣ（ＳＣ－ｗｔ）は、ｐＩｇＲ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＭ＿００２６４４）の５’末端から１８０９ｂｐ（シグナル配列を含む）を使用し、そのＳＣ配列の５’側にＸｈｏＩ認識配列とｋｏｚａｋ配列、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断配列、６ｘＨｉｓｔａｇを含むＤＮＡフラグメント（配列番号７）を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ＳｔｒｉｎｇｓＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて人工合成を行った。合成したＤＮＡフラグメントをＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲを実施し、ＤＮＡ精製を行った。その後、至適の条件下でＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素処理を行い、同一の条件で哺乳類培養細胞用の発現ベクターであるｐＣＸＳＮベクターもまた制限酵素処理を実施した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、一部をＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃で形質転換した。プラスミド抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。実施した操作は全て添付された説明書にしたがった。ＳＣ－ｗｔをコードする遺伝子配列を図２－２に示す。

５．ＳＣ１２欠失変異体の発現プラスミドＤＮＡの作製
５つのドメインを持つＳＣを鋳型として、特異的なプライマーとＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用し、最適なプライマーセット及び塩基長を考慮し至適条件でＰＣＲを行うことで、ＳＣのドメイン１及び２をコードする配列を増幅させた。また、ＳＣの各ドメインはＢｅｔｈらの先行研究（ｅＬｉｆｅ, ５, ｅ１０６４０, ２０１６）に従って決定した。ＰＣＲ反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的の塩基長が特異的に増幅されていることを確認し、ＰＣＲ産物をＭｏｎｏＦａｓＤＮＡ精製キットＩ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡ精製を行った。また、精製したＤＮＡフラグメントは、Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いてリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）により環状にセルフライゲーションさせた。ライゲーションの操作が終了後、環化された欠失変異体をコードしたプラスミドＤＮＡ（配列番号８）をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（ＴａｋａｒａＢｉｏ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に４２℃で形質転換した。プラスミドＤＮＡ抽出はＰｕｒｅＹｉｅｌｄＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍにより行った。抽出したプラスミドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンスを実施した。シークエンス反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いて行い、精製はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ^ＴＭＫｉｔにより行った。以上、全ての操作は添付の説明書に従い実施した。実施した操作は全て添付された説明書にしたがった。ＳＣ１２欠失変異体をコードする遺伝子配列を図２－３に示す。

６．単量体ＩｇＡ抗体、及び二量体ＩｇＡ抗体の発現
単量体ＩｇＡ抗体の構成分子は重鎖、軽鎖であり、二量体ＩｇＡ抗体は重鎖、軽鎖、Ｊ鎖から構成されている。単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を構成する分子を発現するプラスミドＤＮＡを、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆｈｕｍａｎｃｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．９ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに、Ｅｘｐｉ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて、それぞれ共導入した。その後、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。

７．ｍＣ－Ａ１、及びｍＣ－Ａ２抗体の発現
ｍＣ－Ａ１及びｍＣ－Ａ２抗体は、軽鎖を有していないため、各重鎖とＪ鎖をコードしたプラスミドＤＮＡをそれぞれ、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆｈｕｍａｎｃｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．９ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬにＥｘｐｉ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて、共導入した。その後、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。

８．組換えＩｇＡ抗体、及びｍＣ－Ａ１／２の精製
回収した細胞培養液を、３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞などのデブリを取り除き、培養上清のみを回収した。また、この遠心の操作は計２回行った。その後、グラスファイバーフィルター及びステリカップ（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、上清のろ過を行った。組換えＩｇＡ抗体、及びｍＣ－Ａ１／２の精製はヒトＩｇＡ抗体の定常領域を特異的に認識するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＩｇＡＡｆｆｉｎｉｔｙＭａｔｒｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。精製方法は説明書に従い実施した。簡潔に精製方法を以下に記述する。カラムは１０ＣＶのＰＢＳで平衡化され、濾過した培養上清をカラムにロードする。１０ＣＶのＰＢＳでカラムを洗浄し、５ＣＶの０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で抗体を溶出し、溶出液は１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、説明書に従って実施した。

９．ゲル濾過クロマトグラフィーによる単量体及び二量体ＩｇＡ抗体の分離
単量体及び二量体ＩｇＡ抗体の濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。組換えＩｇＡ抗体の分画には、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００ＧＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、また、ｍＣ－Ａ１／２はＳｕｐｅｒｏｓｅ１２１０／３００ＧＬを用いて、説明書に従ってゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。クロマトグラフィーの条件は、ＰＢＳを流速０．５ｍＬ／分、カラム平衡化１．５ＣＶ、溶出０．２ｍＬ／Ｆｒａｃｔｉｏｎ（計１．５ＣＶ）で実施した。単量体、及び二量体ＩｇＡ抗体を含むフラクションをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓを用いて濃縮した。濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。

１０．組換えＳＣ１２の発現と精製
ＳＣ１２をコードするプラスミドＤＮＡを、ヒト腎臓細胞由来の哺乳培養細胞であるＥｘｐｉ２９３Ｆｈｕｍａｎｃｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２．９ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬにＥｘｐｉ２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、遺伝子導入した。その後、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで振盪培養を行い、一週間後に細胞培養液を回収した。その後、回収した細胞培養液を３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により細胞などのデブリを取り除き、培養上清のみを回収した。また、この遠心の操作は計２回行った。培養上清中のＳＣ１２は、各タンパク質のＣ末端側のＨｉｓタグを認識するＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅｅｘｃｅｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたアフィニティカラムを用いて精製した。簡潔に記述すると、平衡化溶液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、洗浄液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、溶出液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。平衡化溶液５ＣＶ（カラム体積）を通し、カラムの平衡化をした後、培養上清を通した。洗浄は、洗浄液２０ＣＶで行い、溶出は溶出液５ＣＶで実施し、平衡化溶液５ＣＶで再平衡化した。ＳＣ１２の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、説明書に従って実施した。

［実施例１：細胞外における多量体ＩｇＡ抗体の形成］
発明者らの先行研究（特許文献１）により、三量体及び四量体分泌型ＩｇＡ抗体（ｔＳＩｇＡ）を構成する重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）、Ｊ鎖（ＪＣ）及び分泌片（ＳＣ）を哺乳類培養細胞へ共発現させることで、効率良くｔＳＩｇＡが産生されることが明らかにされた。さらに、ＳＣの有無によってｔＳＩｇＡの形成効率に差があることから、ＳＣは培養細胞内においてＩｇＡ抗体の三量体及び四量体形成の促進因子として機能していることが示唆された。このＳＣが有するＩｇＡ抗体の三量体及び四量体形成促進能は、細胞内に共在した４種類のタンパク質が相互作用することで形成された三量体及び四量体ＩｇＡ抗体（Ｔｒｉ／ＴｅｔＩｇＡ）を測定することで評価された。そこで、細胞内という限定的な環境ではなく、細胞外条件において、ＳＣが、別々の細胞から産生された各単離タンパク質からの多量体ＩｇＡ抗体形成の促進因子として機能するかを評価した。なお、ＳＣのドメイン１及び２から構成されるＳＣ１２は、細胞内における三量体及び四量体形成促進能がＳＣ－ｗｔよりも高いことが示されたことから、本実施例では、ＳＣとしてＳＣ１２を用いた。

上記の通り作製した、ＳＣ１２、単量体ＩｇＡ１抗体（ｍＡ１）及び二量体ＩｇＡ１抗体（ｄＡ１）の最終濃度がそれぞれ１．２５ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で一週間反応させた。その後、コスモスピンフィルターＨ（ナカライテクス）を用いて抗体サンプルの前処理を行い、反応液中に生成されたＴｒｉ／ＴｅｔＩｇＡをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子サイズにより分離後、ＵＶ（２８０ｎｍ）により検出し、抗体の重合度の評価を行った。ＨＰＬＣシステムはＡｇｉｌｅｎｔ１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カラムはＫＷ４０４－４Ｆ（ｓｈｏｄｅｘ）を使用した。溶離液にはリン酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎの条件で実施した。また、ＩｇＡ抗体混合液はそれぞれ９μＬ使用した。クロマトグラムはＯｐｅｎＬＡＢＣＤＳＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎＥｄｉｔｉｏｎ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解析を行った。

結果を図３に示す。図中、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ抗体と二量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｍＡ１＋ＳＣ１２」は、単量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。「ｄＡ１＋ＳＣ１２」は、二量体ＩｇＡ抗体とＳＣ１２を混合した結果を示す。コントロールとして、特許文献１に記載の方法を用いて細胞内で作出した三量体及び四量体ＩｇＡ抗体（Ｔｒｉ／ＴｅｔＩｇＡ）を使用した。

その結果、「ｍＡ１＋ＳＣ１２」及び「ｄＡ１＋ＳＣ１２」の組合せでは、三量体／四量体ＩｇＡ抗体のピークは検出されなかった。一方で、「ｍＡ１＋ｄＡ１＋ＳＣ１２」の３種類のタンパク質を混合させることで、ｄＡ１よりも分子量が大きく、また細胞内条件で作出した「Ｔｒｉ／ＴｅｔＩｇＡ」と同等の検出時間で、多量体ＩｇＡ抗体のピークが検出された。以上の結果により、三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成にはＳＣ１２の存在に加え、ｍＡ１とｄＡ１の共存が必要であることが示された。さらに、細胞外においても細胞内と同様に三量体／四量体ＩｇＡ抗体の形成が可能なことが明らかとなった。さらに、単量体同士、二量体同士では重合しないことが示された。したがって、三量体／四量体ＩｇＡ抗体は、二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体が重合することによって形成されることが分かった。

［実施例２：ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔ存在下における多量体ＩｇＡ抗体形成の比較］
実施例１により、細胞外において、ＳＣ、単量体及び二量体ＩｇＡ抗体を混合することにより多量体ＩｇＡ抗体が形成したことから、ＳＣは多量体ＩｇＡ抗体形成に寄与することが示された。また、発明者らの以前の研究では、細胞内条件においてＳＣ－ｗｔと比べ、ＳＣ１２は三量体／四量体形成促進能が高いことが示された。そこで、細胞外条件において効率良く三量体／四量体ＩｇＡ抗体を産生する方法を探索するために、ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔの四量体形成促進能を比較した。

上記の通り作製した、ＳＣ１２、ＳＣ－ｗｔ、ｍＡ１及びｄＡ１、並びに蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙをＩｇＡ抗体のＦａｂに相当する領域に置換したｍＣｈｅｒｒｙ融合ＩｇＡ抗体（ｍＣ－Ａ１）の単量体（ｍＣ－ｍＡ１）及び二量体（ｍＣ－ｄＡ１）の最終濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で６時間反応させ、反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡをＥＬＩＳＡ法によって検出した。

ＥＬＩＳＡ法は以下のように行った。９６ウェルハーフプレートに５０μｌの組換えＨＡ（Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／１９９７（Ｈ３Ｎ２）由来，５μｇＨＡ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを加え室温、１時間ブロッキングを行った。その後、２００倍希釈した抗体サンプルの３倍段階希釈系列をつくり、各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、ＨＡ抗原を介してプレートに捕捉された抗体を、５ｎｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ－ＢｌｏｔＨＲＰａｎｔｉ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｅｍｉｌｕｍＨＲＰＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＥＲＣＫ）を用いて、発色反応をさせ、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定した。また、解析はコントロールのＯＤ値が１．５になるようにプレートごとに係数を算出し、その係数を各サンプルに乗算することでプレート間の補正を実施した。

結果を図４に示す。ＳＣ１２又はＳＣ－ｗｔの存在下で、ｍＡ１とｍＣ－ｄＡ１を反応させた時は、ｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１を反応させた時と比べ、ＯＤ値は高い値を示した。また、ＳＣ１２とＳＣ－ｗｔを比較すると、ｍＣ－ｍＡ１を用いた場合では差がないものの、ｍＣ－ｄＡ１を用いた際、ＳＣ１２存在下においてＯＤ値が高い値を示す結果となった。以上の結果から、ＳＣ１２は、ＩｇＡ抗体の多量体形成の促進能が高いことが明らかにされた。さらに、本実験で用いたＩｇＡ抗体は、Ｆ０４５－０９２の可変領域を含むＦａｂ領域を有するＩｇＡ抗体とｍＣ－Ａ１であり、これらの抗体は同一の定常領域をもつものの、可変領域が異なる。つまり、本願の多量体ＩｇＡ抗体の製造方法は、可変領域非依存型であり、特異性の異なる二重以上の特異性、好ましくは二重ないしは三重特異性のＩｇＡ抗体を作製可能であること、さらに、二量体ＩｇＡ抗体と単量体ＩｇＡ抗体が異なる可変領域を有していても、多量体ＩｇＡ抗体を形成可能であることが示された。

［実施例３：多量体形成促進に関わる因子の同定１］
実施例２により、ＳＣ１２は、ＳＣ－ｗｔと比べて、ＩｇＡ抗体の多量体形成促進能が高いことが明らかになった。そこで、更に多量体形成を増強させるためにＳＣ及びＩｇＡ抗体以外のタンパク質成分添加の検討を行った。

上記の通り作製した、ＳＣ１２、ＳＣ－ｗｔ、ｍＡ１及びｄＡ１、並びにｍＣ－ｍＡ１及びｍＣ－ｄＡ１をそれぞれ最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、及び添加剤（Ｓｕｐｐｌｅ）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、ローテーターを用いて３７℃で６時間反応させた。Ｓｕｐｐｌｅは、シャペロンタンパク質ＤｎａＫＭｉｘ（５μＭＤｎａＫ、１μＭＤｎａＪ、１μＭＧｒｐＥ）及びＧｒｏＥＭｉｘ（０．５μＭＧｒｏＥＬ、１μＭＧｒｏＥＳ）、ジスルフィド結合イソメラーゼＤｓｂＣ（３７５μｇ／ｍＬ）、及び酸化グルタチオンＧＳＳＧ（３０ｍＭ）を含有した。反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡを、実施例２と同様にＥＬＩＳＡ法によって検出した。

結果を図５Ａ及びＢに示す。ＳＣ１２存在下では、「ｍＡ１＋ｍＣ－ｄＡ１」及び「ｍＣ－ｍＡ１＋ｄＡ１」のどちらの混合液においてもＳｕｐｐｌｅを加えることで、三量体／四量体ＩｇＡ形成の指標であるＯＤ値の上昇が認められた（図５Ａ）。また、どちらの混合液においても、ＯＤ値が二倍以上上昇した。さらに、ＳＣ－ｗｔ存在下においても同様に、Ｓｕｐｐｌｅを加えることでＳＣ１２と同程度ほどの大幅なＯＤ値の上昇が認められた（図５Ｂ）。

［実施例４：多量体形成促進に関わる因子の同定２］
Ｓｕｐｐｌｅに含まれる４つの大きな構成因子をそれぞれ単独でＳＣ１２の存在下でｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１を反応させることで、各因子の多量体形成への寄与を評価した。反応および検出は、添加剤としてＤｎａＫＭｉｘ、ＧｒｏＥＭｉｘ、ＧＳＳＧ、またはＤｓｂＣを単独で添加する以外は実施例３と同様に行った。

結果を図６に示す。分子シャペロンとして働くＤｎａＫＭｉｘ又はＧｒｏＥＭｉｘを添加した場合、同程度のＯＤ値が認められた。一方で、ジスルフィド結合イソメラーゼであるＤｓｂＣは、４つの構成因子の中で最も高いＯＤ値の増強が認められた。しかしながら、ジスルフィド結合を形成するために必要な酸化的条件を作り出す酸化型グルタチオンＧＳＳＧ添加条件では、４つの因子の中で三量体／四量体ＩｇＡ形成促進効率が最も低かった。以上の結果により、本実験で使用したＳｕｐｐｌｅは、ＩｇＡ抗体の三量体化／四量体化を促進するために有用であることが明らかとなった。

［実施例５：多量体形成促進に関わる因子の同定３］
ＩｇＡ抗体の多量体化に寄与する因子として、ＩｇＡ抗体の定常領域に着眼した。ＩｇＡ抗体は、定常領域の違いによりＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスに分類され、さらにＩｇＡ２はＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、ＩｇＡ２（ｎ）の３つのアロタイプに分けられる。発明者らの先行研究（特許文献１）では、これらの定常領域の違いにより、細胞内条件において三量体／四量体ＩｇＡ抗体形成効率が異なった。そこで、細胞外条件においても同様にＩｇＡ抗体サブクラスの違いにより多量体形成効率に差が認められるかを評価した。すなわち、ＩｇＡ抗体の定常領域の違いによる多量体形成効率を、異なるサブクラスであるＩｇＡ１とＩｇＡ２ｍ２を用いて比較した。

上記の通り作製したｍＣ－Ａ１およびｍＣ－Ａ２を、実施例３と同様に、単量体と二量体ＩｇＡ抗体の組み合わせにＳＣ１２を加え、さらにＳｕｐｐｌｅも加え反応させた後、三量体／四量体ＩｇＡ形成の評価を行った。

結果を図７に示す。ＩｇＡ１抗体の単量体及び二量体を組み合わせた場合と比べ、ＩｇＡ２ｍ２抗体とＩｇＡ１抗体の組み合わせでは、ＯＤ値の増強が認められた。以上の結果により、ＩｇＡ２ｍ２は四量体形成能が高いことが明らかとなった。

［実施例６：多量体形成促進に関わる因子の同定４］
ＩｇＡ抗体の多量体化に与える因子として、反応時間の検討を実施した。ＳＣ１２及びＳｕｐｐｌｅの存在下で、ｍＣ－ｍＡ１とｄＡ１をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で反応させた。反応開始の６時間、１２時間、及び２４時間後にサンプルを回収し、ＥＬＩＳＡ法にて、三量体／四量体ＩｇＡ形成を評価した。

結果を図８に示す。大きな変化は認められないものの、反応時間を伸ばすことでＯＤ値の増強認められた。以上の結果から、至適な反応時間を探索することで、更なる多量体ＩｇＡ抗体の形成効率の増加が見込まれる。

［実施例７：異なる亜型のＨＡを用いた二重特異性ＩｇＡ抗体の評価］
実施例２では、ｍＣｈｅｒｒｙ融合型ＩｇＡ抗体の単量体及び二量体をＳＣ－ｗｔ及びＳＣ１２の存在下で混合することにより、可変領域の異なる三量体／四量体ＩｇＡ抗体が形成されることを明らかにした。更に、実施例５では、ＩｇＡ抗体のサブクラスの違いによる多量体形成効率の違いについても明らかにした。そこで、本実施例では、検出タグを付加した亜型の異なる２種類のインフルエンザウイルスタンパク質ＨＡと、それぞれのＨＡに特異性を有するＩｇＡ抗体クローンを用いて、本願の方法により形成された三量体／四量体ＩｇＡ抗体の二重特異性を検証した。

抗体クローンとして、インフルエンザＡ型のＨ１及びＨ３亜型に対して特異性を有する抗体クローンである、１８－１８Ｋ（Ｈ１）及び１５－１９Ｌ（Ｈ３）を使用した。これらのクローンは、経鼻インフルエンザワクチンの臨床試験を実施し、被験者から分離されたものである。これらの抗体由来の可変領域を上記と同様の方法によって、α１ＨＣ、α２ｍ２ＨＣ、及びλ ＬＣの発現ベクター中にクローニングし、インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（Ｈ１／ＨＡ）に対して特異性を有する抗体クローン１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）（Ｈ３／ＨＡ）に対して特異性を有する抗体クローン１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体及び二量体ＩｇＡ１抗体を作製した。１８－１８Ｋ（Ｈ１）の重鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０に、軽鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。１５－１９Ｌ（Ｈ３）の重鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に、軽鎖可変領域の遺伝子配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。ＳＣ及びＳＣ１２も、上記の通り作製した。

１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体、１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体及び二量体ＩｇＡ１抗体、及びＳＣ又はＳＣ１２を各タンパク質の最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合した。具体的には、１８－１８Ｋの二量体ＩｇＡ１抗体と１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体を混合したＨｅｔｅｒｏ群、及び１５－１９Ｌの単量体ＩｇＡ２ｍ２抗体と二量体ＩｇＡ１抗体を混合したＨｏｍｏ群にそれぞれ、ＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２を加えた混合液、又はＳＣ－ｗｔ及びＳＣ１２のいずれも加えない混合液を、さらに還元型グルタチオン（富士フイルム和光純薬株式会社）を最終濃度０．０３ｍＭになるように添加し、サーマルサイクラーを用いて３７℃で１２時間反応させた。反応液中に生成された三量体／四量体ＩｇＡをＥＬＩＳＡ法によって検出した。

ＥＬＩＳＡ法は以下のように行った。３８４ウェルプレートに４０μｌのｓｔｒｅｐｔタグを付加した組換えＨ３／ＨＡ－Ｓｔｒｅｐｔ（Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２）由来，５μｇＨＡ／ｍＬ）を４℃で一晩固相化した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを加え室温、１時間ブロッキングを行った。その後、１００倍希釈した抗体サンプルの２倍段階希釈系列をつくり、各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、４０μｌのＨｉｓタグを付加した組換えＨ１／ＨＡ－Ｈｉｓ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）由来，１μｇＨＡ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、４０μｌの６０００倍希釈したｍＡｂ－ＨＲＰ－ＤｉｒｅｃＴ（ＭＢＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｅｍｉｌｕｍＨＲＰＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＥＲＣＫ）を用いて、発色反応をさせ、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定した。

結果を図９に示す。異なる特異性を有した抗体クローンを組み合わせたＨｅｔｅｒｏ群では、ＳＣ非存在下と比べ、ＳＣ存在下でＯＤ値の増強が認められた。さらに、これまでの結果と同様にＳＣ１２存在下ではＳＣ－ｗｔと比べ、ＯＤ値の更なる増強が認められた。一方で、同一の特異性を有した単量体ＩｇＡ２ｍ２（ｍＡ２）及び二量体ＩｇＡ１（ｄＡ１）を組み合わせたＨｏｍｏ群では、ＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２存在下においても、ＳＣ非存在下のＨｅｔｅｒｏ群に匹敵するＯＤ値は検出されなかった。

以上の結果から、Ｈ１／ＨＡへの結合能の獲得は、三量体／四量体ＩｇＡ抗体の形成自体によるものではなく、Ｈ３／ＨＡに特異性を示す抗体クローン１５－１９ＬのｄＡ１とＨ１／ＨＡに特異性を示す抗体クローン１８－１８ＫのｍＡ２の二種類のＩｇＡ抗体分子が、一つの三量体／四量体ＩｇＡ抗体分子を形成したことによるものであることが示された。また、ＳＣ非存在下のＩｇＡ１とＩｇＡ２ｍ２のＩｇＡアロタイプの組み合わせにおいても、三量体／四量体ＩｇＡ抗体が形成された。さらにＳＣ－ｗｔ又はＳＣ１２存在下でＩｇＡ抗体を反応させることで、より効率良く二重特異性を有した三量体／四量体ＩｇＡ抗体を作製することができることが明らかとなった。

SEQ ID NO:1; Amino acid sequence of IgA1 constant region
SEQ ID NO:2; Amino acid sequence of IgA2m2 constant region
SEQ ID NO:3; Amino acid sequence of wild-type SC
SEQ ID NO:4; Amino acid sequence of SC12
SEQ ID NO:5; Amino acid sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:6; Amino acid sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:7; Nucleotide sequence of wild-type SC containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:8; Nucleotide sequence of SC12 containing signal sequence, thrombin site, His tag
SEQ ID NO:9; Nucleotide sequence of heavy chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:10; Amino acid sequence of heavy chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:11; Nucleotide sequence of light chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:12; Amino acid sequence of light chain variable region of 18-18K(H1 specific)
SEQ ID NO:13; Nucleotide sequence of heavy chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:14; Amino acid sequence of heavy chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:15; Nucleotide sequence of light chain variable region of 15-19L(H3 specific)
SEQ ID NO:16; Amino acid sequence of light chain variable region of 15-19L(H3 specific)

Claims

二量体ＩｇＡ抗体、及び単量体ＩｇＡ抗体を混合することを含む、三量体及び四量体ＩｇＡ抗体を製造するための方法。
さらに分泌片を混合することを含み、前記分泌片が野生型ＳＣ又はドメインＤ１を含むＳＣ変異体である、請求項１記載の方法。
前記二量体ＩｇＡ抗体が第１の抗原結合部位を含み、前記単量体ＩｇＡ抗体が第２の抗原結合部位を含む、少なくとも二重特異性の三量体及び四量体ＩｇＡ抗体が製造される、請求項１又は２記載の方法。
第３の抗原結合部位を含む別の単量体ＩｇＡ抗体をさらに混合する、請求項３記載の方法。
前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含む、請求項３記載の方法。
前記二量体ＩｇＡ抗体の４つのＦａｂ領域がそれぞれ第１の抗原結合部位を含み、前記第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第２の抗原結合部位を含み、前記別の単量体ＩｇＡ抗体の２つのＦａｂ領域がそれぞれ第３の抗原結合部位を含む、請求項４記載の方法。
分子シャペロンタンパク質、ジスルフィド結合イソメラーゼ、酸化型グルタチオン、及び還元型グルタチオンからなる群から選択される少なくとも１つの物質をさらに混合することを含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
前記二量体ＩｇＡ抗体及び前記単量体ＩｇＡ抗体がそれぞれ別々に培養細胞で作製された組換えＩｇＡ抗体である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
製造された三量体ＩｇＡ抗体及び四量体ＩｇＡ抗体を他のＩｇＡ抗体から分離することをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
製造された三量体ＩｇＡ抗体と四量体ＩｇＡ抗体を分離することをさらに含む、請求項９記載の方法。
第１の抗原結合部位を含む第１のＦａｂ領域、及び第２の抗原結合部位を含む第２のＦａｂ領域を含む、少なくとも二重特異性の三量体又は四量体ＩｇＡ抗体。
さらに分泌片を含み、前記分泌片が野生型ＳＣ又はドメインＤ１を含むＳＣ変異体である、請求項１１記載の抗体。
第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子との重合物である、請求項１１記載の抗体。
第１の抗原結合部位を含む二量体ＩｇＡ抗体１分子と、第２の抗原結合部位を含む単量体ＩｇＡ抗体１分子又は２分子と、分泌片との重合物である、請求項１２記載の抗体。
４つの第１のＦａｂ領域、及び少なくとも２つの第２のＦａｂ領域を含む、請求項１２～１４のいずれか１項記載の抗体。
請求項１１～１５のいずれか１項記載の抗体を含む医薬組成物。