JP7788014B2 - 人体構造性材料の生合成製造方法 - Google Patents

人体構造性材料の生合成製造方法

Info

Publication number
JP7788014B2
JP7788014B2 JP2024576792A JP2024576792A JP7788014B2 JP 7788014 B2 JP7788014 B2 JP 7788014B2 JP 2024576792 A JP2024576792 A JP 2024576792A JP 2024576792 A JP2024576792 A JP 2024576792A JP 7788014 B2 JP7788014 B2 JP 7788014B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
materials
polypeptide
nucleic acid
collagen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2024576792A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2025526544A (ja
Inventor
霞 ▲楊▼
小▲賓▼ ▲蘭▼
振瑞 何
玲玲 王
永健 ▲張▼
欣 ▲劉▼
▲海▼▲紅▼ 宋
Original Assignee
山西▲錦▼波生物医▲薬▼股▲フン▼有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 山西▲錦▼波生物医▲薬▼股▲フン▼有限公司 filed Critical 山西▲錦▼波生物医▲薬▼股▲フン▼有限公司
Publication of JP2025526544A publication Critical patent/JP2025526544A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7788014B2 publication Critical patent/JP7788014B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A61L15/325—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/28—Materials or treatment for tissue regeneration for liver reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/04—Macromolecular materials
    • A61L31/043—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
    • A61L31/044—Collagen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

相互参照
本願は、出願日が２０２２年８月２３日であり、出願番号が２０２２１１０１７５４６．９であり、発明の名称が「人体構造性材料の生合成製造方法」である中国特許出願の優先権を主張するものであり、該特許出願は、参照により本願に組み込まれるものとする。
技術分野
本願は、合成生物の技術分野に属し、人体構造性材料の生合成製造方法に関する。
人体構造性材料は、主にコラーゲン内の構造性タンパク質を含み、このようなタンパク質は、細胞、組織に対して接着、支持機能を有し、主な細胞外マトリックスの構成成分である。
コラーゲンは、人体の結合組織に広く分布するタンパク質の１種であり、また、人体の含有量が最も多いタンパク質であり、タンパク質の総量の２５％～３５％を占めることができ、現在、人体に少なくとも２８種のコラーゲンサブタイプがあり、それぞれ異なる組織器官に位置することが見出された。ＶＩＩ型コラーゲンは、線維型のコラーゲンに属し、例えば皮膚、口腔粘膜、子宮頸部などの複層鱗状上皮の基底膜領域に分布するため、基底膜コラーゲンとも呼ばれる。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚におけるアンカーフィブリルの主な成分であり、これらのフィブリルは、表皮基底膜の層状樹状突起から真皮結合組織まで延び、表皮と真皮との間の接着に役立つ。動物実験により、ＶＩＩ型コラーゲンは、組織ラミニンにより、繊維細胞の遊走及びサイトカインの分泌を促進し、皮膚の損傷及び修復に関与し、組換えＶＩＩ型コラーゲンを人為的に注射することによって栄養不良型大疱性表皮剥離症を補正してもよいことが証明された。
現在、人々は、主に動物組織からの抽出又は遅発性ウイルストランスフェクションによりＶＩＩ型コラーゲン粗製品を得る。残念ながら、ＶＩＩ型コラーゲンは、生体内の含有量が低く、抽出プロセスが複雑であり、動物由来の免疫反応もコラーゲンの応用における制限を引き起こす重要な原因である。遅発性ウイルストランスフェクションは、比較的低い免疫原性を有するが、操作の難易度が高く、標的遺伝子容量に大きな制限がある。中国のコラーゲン産業の日増しの拡大に伴い、生合成経路を利用してコラーゲンを取得することは、ますます成熟しており、特にヒト化コラーゲンは世界でリードする。２０２１年に、中国国家薬品監督管理局は、生合成コラーゲンに対して命名分類を行い、組換えヒト化コラーゲンとは、ＤＮＡ組換え技術によって製造されたヒトコラーゲン特定型遺伝子がコードする全長又は一部のアミノ酸配列の断片、又はヒトコラーゲン機能を含む断片の組み合わせである。
ＶＩＩ型コラーゲンは、３本の同じα１鎖からなるホモ三量体であり、分子形式がα１α１α１（ＶＩＩ）である。３つのα１（ＶＩＩ）鎖が一緒に歪んで、プロコラーゲンの３つの紐状分子を形成する。プロコラーゲン分子は、細胞から分泌され、酵素処理により末端から余分なタンパク質断片が除去される。プロコラーゲン分子は、加工後、未成長の薄い束を配列し、成熟したＶＩＩ型コラーゲンを形成する。各α１ポリペプチド鎖は、中央コラーゲン性の三重螺旋領域を含み、両側が非コラーゲン性のアミノ末端及びカルボキシ末端である。コラーゲン性の構造領域は、特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙ繰り返し配列からなる三重螺旋ドメインである。ＶＩＩ型コラーゲンの遺伝子突然変異は、コラーゲンの合成障害又は構造異常を引き起こし、様々なレベルの水疱を引き起こし、水疱の症状は、皮膚、口腔粘膜、食道などの部位に現れる可能性がある。大部分がナンセンス突然変異であるが、依然としてミスセンス突然変異が発生し、コラーゲンの細胞内での滞留と誤折り畳みを引き起こし、膣粘膜と基底膜の固有層との連結に影響を与える。
現在、ＶＩＩ型コラーゲンは、主に酵素分解法と遅発性ウイルストランスフェクションにより得られる。酵素分解法とは、動物由来の組織をプロテアーゼにより処理することにより、抽出してＶＩＩ型コラーゲン誘導体を得ることをいう。しかしながら、該方法で抽出されたコラーゲンは、既に本来の生物学的活性を失っており、該コラーゲンの真の機能を発揮することができない。遅発性ウイルストランスフェクションとは、レトロウイルスベクターを構築し、さらに細胞トランスフェクションを行い、最後に精製してＶＩＩ型コラーゲンを得ることをいう。しかしながら、該方法の製造プロセスには、製造難易度が高く、高純度のウイルスを取得することが困難であること、遅発性ウイルスベクターの宿主ゲノムにおける組み込みにランダム性があり、挿入部位及びその近傍の遺伝子の発現に干渉する可能性があること、組み込みコピー数の正確な制御が困難であること、標的遺伝子の容量が小さいことという欠陥がある。したがって、人体構造性材料として広く適用されるように、該欠陥を克服できる組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの生合成方法が求められている。
従来技術の欠陥に対して、本願は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンのコア機能領域のスクリーニング及び合成プロセスを設計した。本願は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの機能領域のスクリーニング及びタンパク質合成プロセスを設計し、初回の発明に属する。
一態様では、本願は、（繰り返し単位）ｎを含み、該繰り返し単位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列を含み、各繰り返し単位が直接連結され、繰り返し単位の数ｎが４～２０であるポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンである。
一実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸配列を有する。
一態様では、本願は、本明細書に記載のポリペプチドのヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、精製タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。精製タグは、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＳＵＭＯタグ、又はＮｕｓＡタグであってもよい。一実施形態では、核酸は、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
一実施形態では、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本願は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態では、核酸は、核酸に操作可能に連結された発現制御要素を含んでもよい。一実施形態では、発現制御要素は、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサーであってもよい。
一態様では、本願は、本明細書に記載の核酸又は本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。一実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、動物細胞及び／又は昆虫細胞である。一実施形態では、原核細胞は、大腸菌細胞である。一実施形態では、大腸菌は、大腸菌ＢＬ２１である。
一態様では、本願に係る本明細書に記載のポリペプチドを生産する方法は、
適切な培養条件で本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップ（１）と、
ポリペプチドを含む宿主細胞及び／又は培地を収穫するステップ（２）と、
ポリペプチドを精製するステップ（３）と、を含む。
精製ステップは、（１）Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーカラムでポリペプチドを粗精製するステップ、（２）ＴＥＶ酵素を添加して酵素切断を行うステップ、及び（３）イオン交換カラムでポリペプチドを精密精製するステップからなる群から選択されるステップによって行われてもよい。
一態様では、本願は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター及び／又は本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物を提供する。例えば、組成物は、ポリペプチドを含んでもよい。ポリペプチドの濃度は、１ｍｇ／ｍｌより大きく、５ｍｇ／ｍｌより大きく、１０ｍｇ／ｍｌより大きく、又は１２ｍｇ／ｍｌより大きくてもよい。
一実施形態では、組成物は、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料、化粧品原料、薬用補助材料及び食品添加物のうちの１種又は複数種である。
一態様では、本願は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター及び／又は本明細書に記載の宿主細胞及び／又は本明細書に記載の組成物の、インビトロでの細胞接着の促進における使用、又は細胞接着を促進する製品若しくはキットの製造における使用を提供する。
一態様では、本願は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター及び／又は本明細書に記載の宿主細胞及び／又は本明細書に記載の組成物の、高級医療器具、例えば、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料など、高級化粧品原料及び薬用補助材料、並びに食品添加物の製造における応用を提供する。
一態様では、本願は、細胞を本明細書に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、細胞増殖を促進する方法を提供する。好ましくは、前記細胞は、哺乳動物細胞などの動物細胞である。
本願の実施形態は、以下を含む。
現在の研究の現状に対して、本願は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンを生合成する方法、即ち人体構造性材料の製造方法を提供し、具体的なプロセスは、機能領域のスクリーニング、及び菌種の構築のステップ（１）と、大規模な生物発酵培養及びタンパク質の誘導発現のステップ（２）と、ヒト化ＶＩＩ型コラーゲンの精製及び任意の酵素切断のステップ（３）と、を含む。
項１によれば、機能領域のスクリーニング及び菌種の構築は、以下のように行うことができる。（１）機能領域を大規模にスクリーニングして、標的遺伝子断片を得て、（２）得られた標的遺伝子断片をＰＥＴ－２８ａ－Ｔｒｘ－Ｈｉｓ発現ベクターに挿入して組換え発現プラスミドを得て、（３）組換え発現プラスミドを大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、スクリーニングして陽性大腸菌遺伝子工学菌を得る。
項１によれば、大規模な生物発酵は、以下のように行うことができる。スクリーニングして得られた陽性大腸菌遺伝子工学菌を抗生物質貯液の振とうフラスコに添加し、２２０ｒｐｍ、３７℃の定温振とう機で培養した。
項１によれば、タンパク質の誘導発現は、以下のように行うことができる。（１）培養後の振とうフラスコを１６～３０℃に降温し、（２）ＩＰＴＧ母液を添加して誘導発現を行い、（３）誘導発現後の菌液を遠心フラスコに入れ、６０００ｒｐｍ、４℃で１２ｍｉｎ遠心分離した後、菌体を収集した。
項１によれば、ヒト化ＶＩＩ型コラーゲンの精製及び任意の酵素切断は、以下のように行うことができる。（１）Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーカラムでヒト化ＶＩＩ型コラーゲンを粗精製し、（２）一定の比率でＴＥＶ酵素を添加して酵素切断を行い、（３）イオン交換カラムによりヒト化ＶＩＩ型コラーゲンを精密精製した。
項２によれば、スクリーニングされた機能領域を以下に示す。
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７のアミノ酸配列：ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１のアミノ酸配列：ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２のアミノ酸配列：ＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）。
本願では、大腸菌のコドンを最適化し、最適化後の塩基配列は、以下のとおりである。
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の塩基配列は、ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＴＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）であり、
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の塩基配列は、ＧＧＡＣＴＡＡＣＡＧＧＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＴＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＴＧＡＣＣＧＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）であり、
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の塩基配列は、ＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）である。
本願で製造された組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンアミノ酸配列は、ヒトの天然ＶＩＩ型コラーゲンの機能領域に由来し、該機能領域及び類似の機能領域、アミノ酸配列をそれぞれ突然変異及び修飾したタンパク質を含む。
本願で製造された組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンでは、その応用分野は、高級医療器具、例えば、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、組織注射充填材料、皮膚の修復再生材料、口腔粘膜の修復再生材料、子宮頸部粘膜の修復再生材料、産婦人科生物材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料などの製造、高級化粧品原料及び高級薬用補助材料の製造、並びに食品添加物などの製造を含む。
本願の利点は、以下を含む。
本願は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンのコア機能領域及びアミノ酸配列を提供し、
本願は、初めて組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンを成功裏に生合成しており、
本願で製造された組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンは、高い細胞接着効果又は細胞増殖促進効果を有し、人体に適用して免疫反応を発生させず、
その製造方法が簡単で、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンを大規模に取得することができ、
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンは、その優れた性能により、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、組織注射充填材料、皮膚の修復再生材料、口腔粘膜の修復再生材料、子宮頸部粘膜の修復再生材料、産婦人科生物材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料など、高級化粧品原料及び高級薬用補助材料の製造、並びに食品添加物などの分野において幅広く応用されることが期待されている。
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の精製状況である（５では、サンプリングされたサンプルがなく、６では、精製して収集された、サンプリングされたフロースルーサンプルが標的タンパク質である）。 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の精製状況である（３及び４では、精製して収集された、サンプリングされたフロースルーサンプルが標的タンパク質である）。 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の精製状況である（２２では、精製して収集された、サンプリングされたフロースルーサンプルがタンパク質であり、２６では、酵素切断後のタンパク質であり、２７では、溶液交換後のタンパク質である）。 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の増殖促進作用の図である。 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の増殖促進作用の図である。 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の増殖促進作用の図である。
本願の目的、技術手段及び利点をより明確にするために、以下に本願の実施例を参照しながら、本願の実施例における技術手段を明確、完全に説明し、明らかに、説明された実施例は、本願の一部の実施例であり、全ての実施例ではない。本願の実施例に基づいて、当業者が創造的な労働をすることなく、取得した全ての他の実施例は、いずれも本願の保護範囲に属する。
本明細書に使用されるように、ポリペプチドとは、ペプチド結合を介して連結された複数のアミノ酸残基である。本明細書では、ポリペプチドは、ヒトＶＩＩ型コラーゲン由来の繰り返し単位を複数含む。ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列を含む（繰り返し単位）ｎを含んでもよい。本明細書では、各繰り返し単位は、直接連結されてもよく、１つ以上のアミノ酸残基を隔て連結されてもよい。繰り返し単位の数ｎは、４～２０であってもよく、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９であってもよい。ポリペプチドの濃度は、１ｍｇ／ｍｌより大きく、５ｍｇ／ｍｌより大きく、１０ｍｇ／ｍｌより大きく、又は１２ｍｇ／ｍｌより大きくてもよい。
本明細書では、本願の繰り返し単位は、以下の配列を含んでもよく、以下の配列であってもよい。
ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、又は
ＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
本明細書に使用されるように、「核酸」とは、ヌクレオチド間で連結された複数のヌクレオチドである。ヌクレオチド間の連結は、例えばホスホジエステル結合であってもよい。本明細書における核酸は、本願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリペプチドの後続処理を容易にするために、本願の核酸は、精製タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＳＵＭＯタグ又はＮｕｓＡタグをコードするヌクレオチド、及び必要に応じてリーダー配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
本明細書に使用されるように、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸運搬ツールである。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質を発現させることができる場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入することができ、それに搬送された遺伝物質要素を宿主細胞において発現させる。ベクターは、当業者に公知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ファージ、例えば、λファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウイルスなどを含むが、これらに限定されない。ベクターは、様々な、発現を制御する要素を含んでもよく、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない。なお、ベクターは、複製開始部位をさらに含んでもよい。ベクターは、細胞に導入して発現させるために、本願の核酸を含んでもよい。ベクターは、上記核酸に操作可能に連結された発現制御要素、例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサーを含んでもよい。
本明細書に使用されるように、用語「宿主細胞」は、分子生物学技術によって核酸分子を導入した細胞である。これらの技術は、ウイルスベクターのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、及びエレクトロポレーション、脂質トランスフェクション、及び粒子銃により加速して裸ＤＮＡに導入することを含む。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であってもよい。例えば、真核細胞は、酵母細胞、動物細胞及び／又は昆虫細胞である。原核細胞は、大腸菌細胞であってもよい。
本明細書では、本願のポリペプチドの繰り返し単位又はポリペプチドには、一定の突然変異が存在してもよい。例えば、これらの部分のうちの１つ又は複数のアミノ酸配列には、アミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入が存在してもよい。つまり、本願は、細胞の接着及び／又は増殖を促進する活性を有する限り、繰り返し単位変異体を使用することができる。具体的には、変異体は、特定の配列と一定の百分率の同一性、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有してもよい。特定の配列は、本願の任意の配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～６であってもよいが、好ましくは、これらの変異体は、本願により同定されたコア配列を保留する。
本願のポリペプチドは、任意の適切な方法で製造され、例えば、合成により製造されてもよい。好ましくは、本願のポリペプチドは、組換え方式で製造されてもよい。
本願のポリペプチド、核酸、ベクター及び／又は宿主細胞は、組成物又はキットに製造されてもよい。組成物又はキットは、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料、化粧品原料、薬用補助材料及び食品添加物のうちの１種又は複数種を含んでもよい。組成物は、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料、化粧品原料、薬用補助材料及び食品添加物のうちの１種又は複数種であってもよい。該組成物又はキットは、インビトロで細胞の接着若しくは増殖を促進するか、又はインビボで細胞の接着若しくは増殖を促進することができる。
本願は、人体構造性材料の製造に用いられる組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの機能領域のスクリーニング及び合成プロセスの具体的なプロセスを開示する。本願は、合成生物の技術分野に属する。本願における組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの生合成製造方法は、具体的には、機能領域のスクリーニング、及び菌種の構築のステップ（１）と、生物の発酵、誘導及び発現のステップ（２）と、ヒト化ＶＩＩ型コラーゲンの精製及び任意の酵素切断のステップ（３）と、を含む。本願で製造された組換えヒト化コラーゲンアミノ酸配列は、ヒトの天然ＶＩＩ型コラーゲンの機能領域に由来し、該機能領域及び類似の機能領域、アミノ酸配列をそれぞれ突然変異及び修飾したタンパク質を含む。本願で製造された組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンは、細胞接着及び細胞増殖を促進する高い活性を有し、人体に適用されて免疫反応を発生させず、かつその製造方法は、新規であり、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンを大規模に取得することができ、人体構造性材料の製造に広く適用される。その応用分野は、高級医療器具、例えば、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、組織注射充填材料、皮膚の修復再生材料、口腔粘膜の修復再生材料、子宮頸部粘膜の修復再生材料、産婦人科生物材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料などの製造、高級化粧品原料及び高級薬用補助材料の製造、並びに食品添加物などの製造を含む。
本願を以下の実施例により説明する。当業者は、実施例が例示的なものに過ぎず、制限的なものではないことを理解されたい。本願は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例１ 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの構築及び発現
大規模な機能領域のスクリーニングを行い、以下の異なる組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの標的遺伝子断片を得た。
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）：ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ、
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ、
組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：ＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰ、
（４）組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）：ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＴＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＴＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧ、
（５）組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：ＧＧＡＣＴＡＡＣＡＧＧＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＴＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＧＴＴＧＡＣＣＧＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＴＡＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴ、
（６）組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の塩基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：ＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＧｄ。
合成した遺伝子断片をｐＥＴ－２８ａ－Ｔｒｘ－Ｈｉｓ発現ベクターに挿入して組換え発現プラスミドを得た。
構築に成功した発現プラスミドを大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。具体的なプロセスは、以下のとおりである。（１）超低温の冷蔵庫から大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）を取り出して氷に置き、半融解する時に、形質転換対象のプラスミドを大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）に２μｌ添加し、２～３回程度均一に混合した。（２）混合物を氷上で３０ｍｉｎ氷浴した後、４２℃の水浴で４５～９０ｓ熱ショックし、取り出した後、氷上で２ｍｉｎ氷浴した。（３）生物学的安全キャビネットに転移し、７００μｌの液体ＬＢ培地を添加し、３７℃、２２０ｒｐｍの条件下で６０ｍｉｎ培養した。（４）２００μｌの菌液を、硫酸カナマイシンを含有するＬＢプレートに均一に塗布した。（５）大きさが均一なコロニーが成長するまで、プレートを３７℃のインキュベーターで１５～１７ｈ培養した。
形質転換されたＬＢプレートから５～６個の単一コロニーを選択し、抗生物質（硫酸カナマイシン）貯液を含む振とうフラスコに入れ、２２０ｒｐｍ、３７℃の定温振とう機で７ｈ培養した。さらに、培養後の振とうフラスコを１６℃まで降温し、ＩＰＴＧを添加して一定時間誘導発現させた後、サンプリングして電気泳動検出を行い（図１～３における「菌液」レーン）、菌液を遠心フラスコに分注し、８０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、菌体を収集し、菌体の重量を記録した。
収集した菌体を平衡作動液で再懸濁し、菌液を１５℃以下に降温し、均質化し、高圧で２回均質化し、完了した後に菌液を収集した（図１～３における「均質化」レーン）。均質化した菌液を遠心フラスコに分注し、１７０００ｒｐｍ、４℃で３０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、上清及び沈殿物に対して電気泳動検出を行った（図１～３における「上清」と「沈殿物」レーン）。
組換えヒト化ＶＩＩ型コラーゲンを精製して酵素切断を行い、具体的なプロセスは、以下のとおりである。（１）粗精製について、ａ、カラムを水洗した。ｂ、平衡液（２００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのイミダゾール）でカラムを平衡化した。ｃ、サンプリングについて、液体が流れ終わるまで、遠心分離後の上清をカラムに添加し、フロースルー液に対して電気泳動検出を行った（図１～３における「フロースルー」レーン）。ｄ、雑種タンパク質の洗浄について、液体が流れ終わるまで、２５ｍＬのスクラビング溶液（２００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのイミダゾール）を添加し、スクラビング溶液に対してフロースルー及び電気泳動検出を行った（図１～３の「スクラビング」レーン）。ｅ、標的タンパク質の収集について、２０ｍＬの溶離液（２００ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのイミダゾール）を添加し、フロースルー液を収集し、紫外可視分光光度法によりタンパク質の濃度を検出し、以下の式（Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２８０ｘ希釈倍数ｘ吸光係数）に従ってタンパク質の濃度を計算し、電気泳動検出を行った。（図１～３における「溶離」レーン）。ｆ、１Ｍのイミダゾール作動液でカラムを洗浄した（図１～３の「１Ｍ洗浄」レーン）。ｇ、精製水でカラムを洗浄した。（２）酵素切断（図１～３における「切断後」レーン）について、タンパク質の総量とＴＥＶ酵素の総量との比が２０：１になるように、ＴＥＶ酵素を添加し、１６℃で酵素切断を２ｈ行い、標的コラーゲンを取得した。サンプリングして電気泳動検出を行った。酵素切断後のタンパク質液を透析バッグに入れ、４℃で２ｈ透析し、さらに新しい透析液に転移して、４℃で一晩透析した。（３）精密精製について、ａ、カラムの平衡化について、Ａ液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭの塩化ナトリウム）を使用してカラムを平衡化し、流速を１０ｍｌ／ｍｉｎとした。ｂ、サンプリングについて、流速を５ｍｌ／ｍｉｎとし、サンプリングしてフロースルー液を収集し、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７、Ｃ７Ｐ１１及びＣ７Ｐ１２を取得して、電気泳動検出を行った。図１のレーン６は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の見かけ分子量を示し、該見かけ分子量が予測された分子量２７．８ｋＤａとほぼ一致する。図２のレーン３及び４は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の見かけ分子量を示し、該見かけ分子量が予測された分子量２８．５ｋＤａとほぼ一致する。図３レーン２６は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の見かけ分子量を示し、該見かけ分子量が予測された分子量２７．５とほぼ一致する。分離されたＣ７Ｐ７、Ｃ７Ｐ１１及びＣ７Ｐ１２のアイデンティティをさらに確認するために、発明者は、実施例３において組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの質量分析検出を行った。
実施例２ 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの細胞増殖促進の活性の検出
コラーゲンの細胞増加促進の活性の検出方法について、中華人民共和国医薬品業界規格ＹＹＴ１８４９－２０２２組換えコラーゲンを参照してもよい。具体的な実施方法は、以下のとおりである。
（１）該方法の原理について、ＣＣＫ８試薬にＷＳＴ８［化学名：２－（２－メトキシ－４－ニトロフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ベンゼンジスルホン酸）－２Ｈ－テトラゾールモノナトリウム塩］を含有し、ＷＳＴ８が電子伝達体である１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムジメチル硫酸塩（１－メトキシＰＭＳ）の作用で細胞中の脱水素酵素によって高度な水溶性を有する黄色ホルマザン生成物（Ｆｏｒｍａｚａｎ ｄｙｅ）に還元される。生成されたホルマザン生成物の数は、生細胞の数に比例する。したがって、この特性を利用して細胞増殖及び毒性分析を直接的に行うことができる。
２）試験の群分けについて、完全培地ＤＭＥＭは、陰性対照であり、８％ＮａＣｌは、陽性対照であり、コラーゲン溶液（８％ＮａＣｌ中の溶液）は、供試品であり、細胞を含まない完全培養液は、ゼロ調整ウェルである。
（３）試料製造について、完全培地でコラーゲンを最高濃度まで溶解し、０．２２μｍ精密ろ過膜で濾過して除菌し、各濃度に製造した。ＮａＣｌを完全培地で溶解し、最終濃度を８％とし、濾過して除菌した。
（４）プレートにおける細胞播種について、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のコンフルエントが約９０％である場合、トリプシンを消化して計数した。各ウェル（５－１０）×１０３個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、辺縁ウェルに１００μＬのＰＢＳを添加してブロッキングした。２４ｈ培養して接着した。
（５）細胞投与について、細胞接着後、上清を吸引して捨て、対応する群の溶液を順に置換し、群ごとに４つの重複ウェルを持ち、４８ｈ培養した。
（６）実験検出について、培養液を捨て、１００μＬ（５μＬのＣＣＫ８溶液を含む）の基礎培地を添加し、インキュベーターで１～２ｈインキュベートし、酵素結合免疫検出器を用いて４５０波長で検出した。細胞生存率の計算式は、以下のとおりである。
細胞生存率＝｛（Ａｓ－Ａｂ）／（Ａｃ－Ａｂ）｝×１００％。ここで、Ａｓは、組換えコラーゲン試験ウェルの吸光度であり、Ａｂは、ゼロ調整ウェルの吸光度であり、Ａｃは、陰性ウェルの吸光度である。
図４は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ７の増殖促進作用を示す図である。図５は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１１の増殖促進作用を示す図である。図６は、組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンＣ７Ｐ１２の増殖促進作用を示す図である。図４～６に示すように、陰性対照群と比較して、陽性対照群の細胞生存率は、ゼロであり、差は、統計学的差異を有する。Ｃ７Ｐ７は、１２ｍｇ／ｍｌで顕著な増殖促進作用を示したが、Ｃ７Ｐ１１及びＣ７Ｐ１２は、細胞増殖を促進しなかった。予想外に、発明者は、Ｃ７Ｐ１１及びＣ７Ｐ１２と比較して、Ｃ７Ｐ７は、細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の増加により証明されるように、細胞増殖を促進できることを発見した（表１を参照）。
表１ 細胞生存率
実施例３ 組換えＶＩＩ型ヒト化コラーゲンの質量分析検出
実験方法
タンパク質サンプルをＤＴＴにより還元しヨードアセトアミドによりアルキル化処理した後、トリプシンを添加して一晩酵素分解した。酵素分解によって得られたペプチド断片を、さらにＣ１８ＺｉｐＴｉｐによって脱塩した後、マトリックスα－ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）と混合してプレート化した。最後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析計ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＵｌｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅＴＭ、Ｂｒｕｃｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙを使用して分析を行った（ペプチドマスフィンガープリンティングの技術はＰｒｏｔｅｉｎ Ｊ．２０１６；３５：２１２－７を参照することができる）。
データ検索は、ローカルｍａｓｃｏサイト上のＭＳ／ＭＳ Ｉｏｎ Ｓｅａｒｃｈページから処理される。タンパク質同定結果は、酵素分解後に生成されたペプチド断片の一次マススペクトルから得られる。検出パラメータについて、Ｔｒｙｐｓｉｎ酵素分解において、２つの未切断部位を設定する。システインのアルキル化を固定修飾とする。メチオニンの酸化を可変修飾とする。同定用のデータベースは、ＮＣＢｐｒｏｔである。
表２ Ｃ７Ｐ７質量分析検出分子量及び対応するポリペプチド
ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ ＧＦＰＧＶＰＧＧＴＧＰＫＧＤＲＧＥＴＧＳＫＧＥＱＧＬＰＧＥＲＧＬＲＧＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）
検出ポリペプチド断片は、理論配列と比較して、被覆率が９７．９１％であり、検出結果が非常に信頼できる。
表３ Ｃ７Ｐ１１質量分析検出分子量及び対応するポリペプチド
ＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰＧＬＴＧＰＴＧＡＶＧＬＰＧＰＰＧＰＳＧＬＶＧＰＱＧＳＰＧＬＰＧＱＶＧＥＴＧＫＰＧＡＰＧＲＤＧＡＳＧＫＤＧＤＲＧＳＰＧＶＰＧＳＰＧＬＰＧＰＶＧＰＫＧＥＰＧＰＴＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）
検出ポリペプチド断片は、理論配列と比較して、被覆率が１００％であり、検出結果が非常に信頼できる。
表４ Ｃ７Ｐ１２質量分析検出分子量及び対応するポリペプチド
ＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＰＧＡＫＧＤＲＧＬＰＧＰＲＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰＧＥＫＧＥＡＧＲＡＧＥＰＧＤＰＧＥＤＧＱＫＧＡＰＧＰＫＧＦＫＧＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５）
検出ポリペプチド断片は、理論配列と比較して、被覆率が９３．７５％であり、検出結果が非常に信頼できる。
上記実施例は、本願の好ましい実施形態であり、本願の実施形態は、上記実施例に限定されるものではなく、本願の精神及び原理から逸脱することなく行われる任意の変更、修飾、置換、組み合わせ、簡略化は、いずれも同等の置換方式であり、本願の保護範囲に含まれる。

Claims (22)

  1. （繰り返し単位）ｎを含むポリペプチドであって、前記繰り返し単位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と９０％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、各繰り返し単位が直接連結され、繰り返し単位の数ｎが８～２０であり、前記ポリペプチドは、細胞増殖を促進する活性を有し、組換えＶＩＩ型コラーゲンである、ポリペプチド。
  2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４と９０％～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
  4. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７のヌクレオチド配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７と８０％～９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の核酸。
  5. 精製タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の核酸。
  6. 前記精製タグは、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＳＵＭＯタグ、又はＮｕｓＡタグである、請求項５に記載の核酸。
  7. リーダー配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の核酸。
  8. 請求項３に記載の核酸を含む、ベクター。
  9. 前記核酸に操作可能に連結された発現制御要素をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記発現制御要素は、プロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサーである、請求項９に記載のベクター。
  11. 請求項３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. 前記真核細胞は、酵母細胞、動物細胞及び／又は昆虫細胞であり、並びに／又は、原核細胞は、大腸菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 適切な培養条件で宿主細胞を培養するステップ（１）と、
    ポリペプチドを含む宿主細胞及び／又は培地を収穫するステップ（２）と、ポリペプチドを精製するステップ（３）と、を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチドを生産する方法。
  15. 前記ステップ（３）は、（１）Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーカラムでポリペプチドを粗精製するステップ、（２）ＴＥＶ酵素を添加して酵素切断を行うステップ、及び（３）イオン交換カラムでポリペプチドを精密精製するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３から７のいずれか一項に記載の核酸、請求項８から１０のいずれか一項に記載のベクター及び／又は請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、組成物。
  17. 生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料、化粧品原料、薬用補助材料及び食品添加物のうちの１種又は複数種である、請求項１６に記載の組成物。
  18. インビトロでの細胞接着の促進又は細胞増殖の促進における使用のための組成物であって、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３から７のいずれか一項に記載の核酸、請求項８から１０のいずれか一項に記載のベクター及び／又は請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、組成物。
  19. 細胞接着を促進する又は細胞増殖を促進するための製品又はキットであって、前記製品又はキットが、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３から７のいずれか一項に記載の核酸、請求項８から１０のいずれか一項に記載のベクター及び／又は請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、製品又はキット。
  20. 高級医療器具、生体被覆材、ヒトバイオミメティック材料、整形美容材料、オルガノイド培養材料、心血管ステント、コーティング材料、組織注射充填材料、眼科材料、産婦人科生物材料、神経修復再生材料、肝臓組織材料及び血管修復再生材料、３Ｄプリント人工臓器生物材料、高級化粧品原料及び薬用補助材料、並びに食品添加物のうちの１種又は複数種の製造のための方法であって、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３から７のいずれか一項に記載の核酸、請求項８から１０のいずれか一項に記載のベクター及び／又は請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を使用するステップを含む、方法。
  21. 細胞をインビトロで請求項１又は２に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、細胞増殖を促進するためのインビトロの方法。
  22. 前記細胞は、動物細胞である、請求項２１に記載のインビトロの方法。
JP2024576792A 2022-08-23 2023-02-22 人体構造性材料の生合成製造方法 Active JP7788014B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211017546.9 2022-08-23
CN202211017546.9A CN117143223B (zh) 2022-08-23 2022-08-23 一种生物合成人体结构性材料的制备方法
PCT/CN2023/077661 WO2024040894A1 (zh) 2022-08-23 2023-02-22 一种生物合成人体结构性材料的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2025526544A JP2025526544A (ja) 2025-08-15
JP7788014B2 true JP7788014B2 (ja) 2025-12-17

Family

ID=88904816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024576792A Active JP7788014B2 (ja) 2022-08-23 2023-02-22 人体構造性材料の生合成製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US12570724B2 (ja)
EP (1) EP4530294A4 (ja)
JP (1) JP7788014B2 (ja)
KR (1) KR102862752B1 (ja)
CN (1) CN117143223B (ja)
WO (1) WO2024040894A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120988101A (zh) * 2025-06-03 2025-11-21 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组vii型人源化胶原蛋白及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072255A (zh) 2016-04-08 2018-12-21 克里斯托生物技术股份有限公司 用于治疗皮肤的伤口、病症和疾病的组合物和方法
US20200165319A1 (en) 2018-11-28 2020-05-28 Shanxi Jinbo Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Polypeptide, process for the production thereof and use thereof
CN113621053A (zh) 2021-08-30 2021-11-09 江苏亨瑞生物医药科技有限公司 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593859A (en) * 1991-10-23 1997-01-14 Thomas Jefferson University Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems
US20020098578A1 (en) * 1992-10-22 2002-07-25 Darwin J. Prockop Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant dna systems
US6953839B2 (en) * 2003-04-23 2005-10-11 The Texas A&M University System Prokaryotic collagen-like proteins and uses thereof
US7424370B2 (en) * 2004-02-06 2008-09-09 Council Of Scientific And Industrial Research Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential
US20080081353A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Universite Laval Production of recombinant human collagen
JP5493264B2 (ja) * 2007-11-05 2014-05-14 ニプロ株式会社 コラーゲン基材
WO2010071938A1 (en) * 2008-12-24 2010-07-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel collagen constructs
GB2485385A (en) * 2010-11-12 2012-05-16 Univ Manchester Trimeric fusion protein comprising collagen and a prokaryotic/ viral trimerisation domain
US9040484B2 (en) * 2011-04-26 2015-05-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Production and delivery of a stable collagen
EP2753704A4 (en) * 2011-08-03 2015-07-08 Lotus Tissue Repair Inc COLLAGEN 7 AND ASSOCIATED METHODS
AU2015243535A1 (en) * 2014-04-08 2016-11-03 University Of Southern California Polypeptide compositions with Type VII collagen fibronectin Type Ill- like repeats and treatment methods for wound closure and healing
CN104098701B (zh) * 2014-07-23 2016-03-02 广州市暨鹏生物科技有限公司 重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用
CN105061589B (zh) * 2015-08-26 2018-02-27 华南理工大学 一种重组人ⅰ型胶原蛋白及其固定化发酵生产的方法
KR20180118795A (ko) * 2016-03-18 2018-10-31 인트렉손 코포레이션 Vii형 콜라겐 결핍증의 치료를 위한 조성물 및 방법
CN106554410B (zh) * 2016-06-02 2019-11-26 陕西东大生化科技有限责任公司 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法
US10786438B2 (en) * 2018-04-27 2020-09-29 Krystal Biotech, Inc. Recombinant nucleic acids encoding cosmetic protein(s) for aesthetic applications
DE102019207859A1 (de) * 2018-12-21 2020-06-25 Gelita Ag Synthetische und rekombinant hergestellte Kollagenpeptide mit biologischer Wirksamkeit
KR102135976B1 (ko) * 2019-10-24 2020-07-20 주식회사 에이바이오테크 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 펩타이드 및 이를 이용한 방법
CN113185604B (zh) * 2021-05-13 2021-12-14 江苏创健医疗科技有限公司 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用
CN113621052B (zh) * 2021-08-23 2022-06-07 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途
CN113683680B (zh) * 2021-09-15 2023-11-03 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途
CN113683679B (zh) * 2021-09-15 2023-10-31 山西锦波生物医药股份有限公司 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途
CN114920827B (zh) * 2022-06-29 2023-06-09 山西锦波生物医药股份有限公司 多肽及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072255A (zh) 2016-04-08 2018-12-21 克里斯托生物技术股份有限公司 用于治疗皮肤的伤口、病症和疾病的组合物和方法
US20200165319A1 (en) 2018-11-28 2020-05-28 Shanxi Jinbo Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. Polypeptide, process for the production thereof and use thereof
CN113621053A (zh) 2021-08-30 2021-11-09 江苏亨瑞生物医药科技有限公司 一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Christiano, A. M. et al.，The Journal of Biological Chemistry，1994年，Vol. 269, No. 32, Issue of August 12，pp. 20256-20262

Also Published As

Publication number Publication date
EP4530294A4 (en) 2025-11-05
KR102862752B1 (ko) 2025-09-23
CN117143223A (zh) 2023-12-01
WO2024040894A1 (zh) 2024-02-29
US12570724B2 (en) 2026-03-10
US20250129138A1 (en) 2025-04-24
EP4530294A1 (en) 2025-04-02
JP2025526544A (ja) 2025-08-15
CN117143223B (zh) 2024-03-08
KR20250017293A (ko) 2025-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109593126B (zh) 多肽、其生产方法和用途
JP7838126B2 (ja) 生合成による人体構造性材料の製造方法
WO2017206326A1 (zh) 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法
JP7746608B2 (ja) コラーゲン及びその使用
CN118324899B (zh) 一种重组xvii型人源化胶原蛋白、制备方法及其应用
CN116813749B (zh) 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和应用
CN117986355B (zh) 一种重组人源化iii型胶原蛋白及其制备方法和用途
CN118146355A (zh) 一种重组胶原蛋白及其制备方法、应用
JP7788014B2 (ja) 人体構造性材料の生合成製造方法
CN119390818B (zh) 生物合成人体结构性材料ⅵ型胶原蛋白的方法
CN121248801B (zh) 一种嵌合胶原蛋白及其表达方法
HK40126713A (zh) 一种多肽、重组xix型人源化胶原蛋白及其应用
CN119613532B (zh) 一种重组iii型人源化胶原蛋白及其制备方法和用途
HK40121938A (en) Biosynthesis-based preparation method for structural material of human body
HK40127493A (zh) 重组ii型人源化胶原蛋白及其用途
HK40121939A (en) Collagen and use thereof
HK40125817A (zh) 重组viii型人源化胶原蛋白及其用途
CN121609783A (zh) 一种具有抗氧化功效的重组ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用
CN120248090A (zh) 重组ii型人源化胶原蛋白及其用途
CN121873209A (zh) 一种具有抑制瘢痕增生的重组xvii型胶原蛋白及其制备方法和应用
CN118240065A (zh) 重组ⅵ型胶原蛋白及其制备方法、应用
CN119552267A (zh) 重组iii型人源化胶原蛋白以及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250212

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20250212

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20250212

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250708

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20251008

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20251111

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20251205

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7788014

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150