JP7791815B2 - 蛍光性ベータラクタマーゼ基質および関連する検出方法 - Google Patents

蛍光性ベータラクタマーゼ基質および関連する検出方法

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Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
本発明は、β－ラクタマーゼ型酵素活性の検出のためのプローブに関する。特に、本発明は、触媒活性β－ラクタマーゼの存在を検出するための新規な蛍光性基質およびそのような基質を使用する検出方法に関する。
［背景技術］
β－ラクタム抗生物質は、その構造にβ－ラクタム環を含有する周知のクラスの抗生物質である。しかし、細菌は、抗生物質のβ－ラクタム環の加水分解を促進する酵素であるβラクタマーゼを産生することによって、これらの抗生物質に対する耐性を獲得する傾向があり、これにより、薬剤を無効にすることができる。細菌耐性は、世界的な問題となっている。抗生物質耐性菌の中で、カルバペネム系薬剤に対して耐性を獲得するものは現在治療ができないとされている。実際に病院では、それらを保有する患者がこの感染症で死亡する確率は５０％である。
従って、このような状況において、β－ラクタム抗生物質に耐性である細菌を同定するために、β－ラクタマーゼ活性、特にカルバペネマーゼ活性を検出することが有用である。
プローブによって発せられる蛍光の捕捉によるこの活性の検出は、プローブによる単純な吸収(simple absorption)の間の白色光残留物の収集よりもはるかに感度の高い方法であり、すなわち、検出閾値は、はるかに低い。蛍光発光の検出は実施が非常に容易であり、その結果、蛍光分子は、生命科学にとって非常に魅力的なツールである。例えば、ＥＳＩＰＴ（「励起状態分子内陽子移動」）と呼ばれる励起状態における分子内陽子移動をもたらすフルオロフォアのクラスは、特に、a) Ormson, S.M., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994) 19, 45-91; b) Legourrierec, D., et al. Progress in Reaction Kinetics (1994), 19, 211-275; and c) Zhao, 1., Ji, S.,Chen, Y., Guo, H., & Yang, P. (2012)に記載されている。励起状態分子内陽子移動（ＥＳＩＰＴ）：光物理学的な原理から蛍光分子プローブおよび発光材料における新しいクロモフォアおよび適用の開発まで。Physical Chemistry Chemical Physics, 14 (25), 8803。ＥＳＩＰＴ現象として特定のフェノール化合物中に見出される上昇した蛍光の第一の解釈は、Ｗｅｌｌｅｒ（サリチル酸メチルについて：Weller, A. (1961). Fast Reactions of Excited MoIecuIes. Progress in Reaction Kinetics and Mechanism 1, 187)、ならびにＨｅｌｌｅｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（ヒドロキシフェニルベンゾオキサゾールについて：Heller A., et Williams, D.L., 1. Phys. Chem. (1970) 74, 4473-4480)に起因し得る。
ＥＳＩＰＴフルオロフォアのクラスは、従来のフルオロフォアと比較してその優れた特性のために、生命科学の研究者にとって特に魅力的である。ＥＳＩＰＴフルオロフォアの非常に優れた特性は以下の通りである：
（ａ）大きなストークスシフトはしばしば１３０ｎｍを超え、２５０ｎｍの値に達することができ、これは、検出の感度を最大にする器具選択を可能にする；これは細胞および組織の構成要素による自己蛍光から逃れること／自己蛍光を無視することによる；
（ｂ）固体状態（すべての既知のフルオロフォアの中でまれな特性である）において、輝く蛍光を発光するフルオロフォアを設計する能力。この最後の特性は、拡散によって引き起こされる最小限の希釈で、活性化部位で高強度シグナルを生成することを可能にする；
（ｃ）組織の透明性が最大である、赤色または近赤外線（６００～８５０ｎｍ）を発するＥＳＩＰＴフルオロフォアを設計する能力；このようなフルオロフォアを使用するプローブはまた、生きている動物におけるイメージングに特に適している；そして最後に、
（ｄ）ＥＳＩＰＴフルオロフォアのヒドロキシルが含む水素原子を、化学的または生化学的分析対象物に関して特異的な反応性を有する置換基であって、この置換基の開裂が蛍光の出現を引き起こす置換基に置き換えることによって、蛍光を発しない基質を設計する能力。
蛍光の産生をもたらす基質の使用による酵素活性の検出方法の感度レベルは、（ｉ）光退色速度、（ｉｉ）その産生部位での蛍光シグナルの蓄積の程度（したがって、当該部位からの拡散速度、およびフルオロフォアが沈殿するか否かを知るという問題）、（ｉｉｉ）基質が機能する実際の消光（extinguishing）／点灯（lighting）モード（非形質転換基質の蛍光によるバックグラウンドの欠如）、および（ｉｖ）励起スペクトルおよび発光スペクトルスタッキング（ベースラインでのそれらの分離が最も好ましい構成である；上記のａ）の点を参照のこと）の程度、に密接に関連する。（ｉｖ）の点は非常に特に重要なものである。なぜならば、ベースラインでの完全な分離が（全ての可能な波長でフルオロフォアを励起するための）光源用のフィルターの非常に広い選択の機会を提供するからであり、しかし、さらにより重要なことは、（フルオロフォアによって発せられた全ての波長から来る光子を収集するための）検出器用のフィルターの非常に広い選択の機会を提供するからである。（ｉｖ）の点はまた、確立されたフルオロフォアで遭遇する頻繁に起こる問題である組織自己蛍光（天然フルオロフォアの弱いストークスシフトを特徴とする）による検出方法の妨害を最小限に抑える。確立されたフルオロフォアは、ほとんどがそれ自体は弱いストークスシフトを示す。
ＥＳＩＰＴフルオロフォアの重要なクラスの中で、ジクロロ－ＨＰＱ（６－クロロ－２－（５－クロロ－２－ヒドロキシフェニル）－４（３Ｈ）－キナゾリノン；ＣＡＳ番号：２８６８３－９２－３）は、それが水性／生理学的媒体に完全に不溶性である一方で、固体状態では高い蛍光性であり、さらに溶液中ではなく固体状態においてのみであることを考慮すると、特に興味深い。
β－ラクタマーゼを検出するためのいくつかのプローブが開発されている。しかし、これらのプローブは、非常に高価であるか、またはその産生部位での蛍光シグナルの高度の蓄積を保証しない。実際には、遺伝子型検出（β－ラクタマーゼメッセンジャーＲＮＡのＰＣＲ）が、細菌耐性を検出するために、現在の診断業界に好まれているようであるが、高いコストおよび長い分析時間を生じさせるため、批判されるべきである。
このような状況において、β－ラクタマーゼ活性、特にカルバペネマーゼ活性を検出することができる改善されたプローブを提供することが有用であろう。
本発明の目的の１つは、水性媒体中で安定であり、非蛍光性、または放出されたフルオロフォアがそれ自体の蛍光性である波長とは大きく異なった波長における穏やかな蛍光性でとどまり、しかし、小蛍光分子を含む追跡分子にフラグメント化するためにβ－ラクタマーゼと迅速に反応する、新規なβ－ラクタマーゼ基質を提案することである。
［概要］
本発明は第一に、式（Ｉ）の化合物に関する。
ここで：
－Ｗは－Ｏ－または－ＮＲ１３－であり、Ｒ１３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり；
－Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１結合の切断後に得られるＨＷＲ１が、フルオロフォアのクラス、好ましくは励起状態で分子内陽子移動をもたらすフルオロフォアのクラスに属するようなものであり；
－Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は次のいずれかのように定義される：
○ Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ４はＣ１－Ｃ４アルキルであるか；
○ または、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ＹはＯ、ＮＲ１４、Ｎ（Ｒ１４）２ ＋またはＳであり、好ましくはＮＲ１４またはＮ（Ｒ１４）２ ＋であり、
● ｐ＝０、１、２、３、４または５、
● ｑ＝０または１、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、
● それぞれのＲ１４は独立に、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アミノ保護基、または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１に等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基であるか；
○ または、Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３とＲ４とが互いに結合し、それらが結合する炭素原子と共に脂肪族炭素環を形成し；
－Ｒ５とＲ６とは同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ５－Ｃ１０アリールを表し；
－Ｒ７は、水素原子、またはＣ１－Ｃ４アルキルおよびＣ１－Ｃ４アルコキシから選択される基であり；
－Ｒ８は、水素原子を表し；
－Ｖは、酸素原子または硫黄原子を表し；
－ｎは０または１であり；
－Ｚは－Ｓ－、－ＳＯ－、または－ＣＲ９Ｒ１０－であり；Ｒ９およびＲ１０は同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルを表し；
－ＱはＨ、カチオンまたはＲ１６であり、ここでＲ１６はＣ１－Ｃ６アルキルであり、任意にアリールまたはＯ－（ＣＯ）－Ｒで置換され、Ｒは独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキルおよびＣ３－Ｃ６シクロアルキルから選択され；
－Ｒ１１はオルガニル基、オルガニルアミノ基、オルガニルオキシ基、またはオルガニルチオ基であり、
－Ｘは結合、または
から選択される基を表す。
出願人らは、以下の特性を有するβ－ラクタマーゼ基質の系統を開発した：
－強力な蛍光を発生させることによる、拡張スペクトラムβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）メンバーの活性、またはカルバペネマーゼの活性に対する迅速な応答；
－酵素変換時における、酵素活性部位でのシグナル保持のユニークな特性が認識された「ＥＬＦ９７アルコール」を含むフルオロフォア、好ましくはＥＳＩＰＴフルオロフォアの放出；及び
－標的酵素活性の非存在下では、大部分または完全に非蛍光性であり、したがって、有利なシグナル対バックグラウンド比を介して検出感度を最大にする。
したがって、本発明による化合物（Ｉ）は、蛍光の発生によるβ－ラクタマーゼ活性の存在を明らかにする。
より特に、プローブが標的β－ラクタマーゼ酵素に遭遇する前は見えず、したがって「ステルスプローブ」と呼ばれ得る。しかしながら、それが前記酵素によって化学的に修飾される場合（β－ラクタム環の加水分解開環）、それはカスケード反応を介して断片化し、検出可能なフルオロフォアを放出する。プローブは３つの分子成分を含む：ｉ）自己不溶性スペーサーであり、ｉｉ）標的酵素の基質の役割を果たすセファロスポリンまたはカルバペネム基を一端に有し、および、ｉｉｉ）前記断片化によってＨＷＲ１として放出される場合、フルオロフォアのクラスに属するＷＲ１基を他端に有する。
本発明におけるスペーサーの選択肢は対応する分子プローブに２つの実質的な利点を提供する：（ａ）ＷＲ１とのその化学結合が自然加水分解に対して安定であり、したがって、フルオロフォアの放出および偽陽性シグナルの生成に対して安定であり、そして（ｂ）セファロスポリンまたはカルバペネムユニットとのその化学結合はカルバメートの性質のものであり、加水分解安定性を保証するだけでなく、結合の小さなサイズが、酵素による十分な分子認識を保証し、したがって、効率的な代謝回転速度を保証するため、非常に重要なものである。
環化のためにスペーサーを予備組織化する２つの方法は、－Ｎ－Ｃ（Ｖ）－Ｏ－基のα炭素上に２つのアルキル置換基を導入すること（または炭素環を形成すること）からなるか、またはヘテロシクリル環中に窒素基－Ｎ－Ｃ（Ｖ）－Ｏ－とそのα炭素との間の結合を含めることからなり、断片化処理を促進する。
したがって、本発明は、本特許出願において記載された変異体はその実施の有無にかかわらず、生細胞分析（細菌）を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断試験におけるβ－ラクタマーゼまたはカルバペネマーゼ活性の検出のための、式（Ｉ）の化合物に関する。本発明による式（Ｉ）の化合物はまた、動物において、ｉｎ ｖｉｖｏでβ－ラクタマーゼを検出するために使用され得る。従って、本発明はまた、ヒトにおけるβ－ラクタマーゼのｉｎ ｖｉｖｏ検出のための、本発明による式（Ｉ）の化合物に関する。
より特に、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、β－ラクタマーゼ活性の存在を検出するための方法に関し、以下の工程を含む。
－分析する試料を化合物（Ｉ）と接触するように置くこと
－Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中のβ－ラクタマーゼの有無との相関。
Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、スペーサーの環化後にＨＷＲ１の放出をもたらすことによる、本発明による式（Ｉ）の化合物を使用して得ることができる沈殿物は強い蛍光性であり、一方で、対応する式（Ｉ）の化合物は、穏やかに蛍光性であるか、または全く蛍光性ではない。本発明による化合物は、オフ／オンモードに従って作動し、したがって、リードアウト前に過剰のプローブを洗い流す必要なし（「無洗浄アッセイ」）で、この酵素活性のプロービングを可能にするβ－ラクタマーゼ基質である。従って、本発明による化合物は酵素が存在しない場合（オフモード）、蛍光性ではないか、または穏やかに蛍光性であるが、β－ラクタマーゼ酵素の存在下では化合物は断片化され、検出され得るフルオロフォアを放出する（オンモード）。
特に、本発明による検出方法は、生理学的条件において、特にｐＨ７．４に緩衝された水性媒体中で、実施することができる。
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物の合成における中間体である式（ＩＩ）の化合物に関する：
ここで：
－Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｚ、ｎ、Ｑ、Ｘ、およびＶは化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりであり、
－Ｒ１２は、水素原子またはアミン官能保護基を表す。
本発明はまた、以下の工程を含む化合物（Ｉ）の調製方法に関する：
－本明細書で定義される化合物（ＩＩ）の実施
－式（ＩＩＩ）の化合物の実施
ここでＲ１は化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりであり、Ｍは脱離基を表し、好ましくはハロゲン化物原子、特にＣｌ、イミダゾリル基、トリアゾリル基、およびパラ－ニトロフェノキシルから選択され、好ましくは、Ｍはパラ－ニトロフェノキシルを表す。
－前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応によって化合物（Ｉ）を得ること。
本発明による種々の化合物は、少なくとも別段の限定がない限り、可能な全ての光学異性体形態で見出すことができ、場合によっては、全ての割合で混合物の形態として見出すことができる。特定の実施形態によれば、不斉炭素原子を含む本発明による化合物はラセミ形態で見出され、ほぼ等しい割合でＲ体およびＳ体として見出される。別の実施形態によれば、本発明の式（Ｉ）化合物はジアステレオマーまたはエナンチオマーのいずれかであり、８０％を超える、または９５％を超えるジアステレオマーまたはエナンチオマーの過剰率で、または純粋な異性体形態であり、すなわち、９９％を超えるジアステレオマーまたはエナンチオマーの過剰率で、異性体富化形態で見出すことができる。
化合物は、古典的な分離技術、例えば、光学活性な酸または塩基を用いたラセミ塩の分別晶析法（その原理は周知であるか、または最も頻繁であり、キラル相または非キラル相での古典的なクロマトグラフィー技術である）によって、ジアステレオマーまたはエナンチオマー中で富化された形態で単離することができる。
適用可能であれば、本発明による化合物は、塩、特に塩酸塩、酢酸塩、ヒドロトリフルオロ酢酸塩、ナトリウム塩、またはアンモニウム塩の形態で見出すことができる。
本発明をより詳細に説明する。最初に、使用される特定の用語を定義する。
［詳細な説明］
〔定義〕
「脂肪族複素環」とは、本発明の文脈において、置換されているかまたは置換されていない飽和環であって、３～２０員、好ましくは５～１０員、さらに好ましくは５、６、７または８員を含み、Ｏ、ＮまたはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含むものであると理解される。
「脂肪族炭素環」とは、本発明の文脈において、置換されているかまたは置換されていない飽和環であって、炭素原子のみで構成される３～３０員、好ましくは５～１０員、さらに好ましくは５、６、７または８員を含むものであると理解される。
「アルキル」とは、本発明の文脈において、直鎖または分岐鎖であり得る飽和炭化水素鎖であると理解される。好ましくは、アルキルという用語は特に明記しない限り、少なくとも、１～１２個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を含むアルキル基、特にアルキル（Ｃ１－Ｃ４）基を指す。メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、およびｔｅｒｔ－ブチルは、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル基（１～４個の炭素原子を有するアルキル）の例である。
「アルキレン」とは、２価のアルキル基であると理解される。
「ヘテロアルキル」とは、本発明の文脈において、１～６個の炭素原子、ならびに、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される１～３個のヘテロ原子からなる直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖であると理解される。窒素および硫黄原子は任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に４級化されてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳはヘテロアルキル基の任意の内部位置に、またはアルキル基に結合された分子の残りの部分の位置に配置されてもよい。
「アリール」とは、単環、二環または多環式環であり、特に明記しない限り、少なくとも５～２４員、５～２０員、５～１５員であり、好ましくは単結合および二重結合の変更を含み、少なくとも１つの芳香環を含む、不飽和炭化水素であると理解される。任意のアリール基の例として、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニルおよびシンナミル基を挙げることができる。アリールという用語はまた、１Ｈ－フェナレン－１－オン（ＣＡＳ番号５４８－３９－０）のように、構成炭素の１つが－Ｃ（Ｏ）カルボキシの形態で見出される、単環、二環または多環で、不飽和の、炭化水素環を含む。
「アリーレン」とは、２価アリール基であると理解される。
「ヘテロアリール」とは、特に明記しない限り、少なくとも５～２４員、好ましくは６～２０員、より好ましくは６～１５員を含み、炭素環に組み込まれた、酸素、窒素または硫黄原子の中から選択される少なくとも１つの芳香族基および少なくとも１つのヘテロ原子を含む、単環、二環または多環の炭素環式環であると理解される。ヘテロアリール基の例として、２－、３－または４－ピリジニル、２－または３－フルオイル、２－または３－チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チアダゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、ピリダジニル、インドリル、オキサニル、４（１Ｈ）－キノリノニル、ジベンゾチオフェニル、ジベンゾフラニルおよび９Ｈ－カルバゾリルを挙げることができる。ヘテロアリールという用語はまた、４（３Ｈ）－ピリミジノニル、４（３Ｈ）－キナゾリノニル、または４（１Ｈ）－キノリノンなどの、構成炭素原子の１つがカルボキシ－Ｃ（Ｏ）の形態で見出される前記基を含む。
さらなる明記なしに基が置換されているとされている場合、これは、特に、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、シアノ、アルキル、トリフルオロアルキル、トリフルオロメチル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアクリアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル基の中から選択される、１つまたはいくつかの置換基によって置換されていることを意味し、前記基自体が置換され得ることを意味する。これらの置換基の定義に使用される用語は、当業者によって通常認識されるものである。
「アルコキシ」および「アリールオキシ」とは、本発明の文脈において定義されるアルキルおよびアリールを有する－Ｏ－アルキルおよび－Ｏ－アリール基とそれぞれ理解される。
「ハロアルキル」とは、少なくとも１個の水素原子がハロゲン原子によって置換されている、飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖と理解される。
「β－ラクタマーゼ」とは、β－ラクタム環を開くための、β－ラクタムの加水分解を触媒する能力を有する、β－ラクタマーゼ酵素であると理解される。
「β－ラクタム」とは、４員環状アミドであると理解される。
古典的には、用語「アルケニル」は直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指し、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含み、特に明記しない限り、２～２０個の炭素原子、好ましくは２～６個の炭素原子が存在している。
本発明の文脈において、用語「アルケニレン」は２価アルケニル基を指す。
用語「アルキニル」は直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指し、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含み、特に明記しない限り、２～１２個の炭素原子、好ましくは２～６個の炭素原子が存在している。
「アルキニレン」とは、２価アルキニル基であると理解される。
「結合アーム」とは、化合物の２つの部分を共有結合で連結する２価の基であると理解される。
「オルガニル基」とは、任意の有機置換基であると理解され、機能型に関わらず、炭素原子に、前記オルガニル基を化合物に結合するために使用される１つの遊離原子価を有する。
「オルガニルチオ基」とは、任意の有機置換基であると理解され、機能型に関わらず、硫黄原子に、前記オルガニル基を化合物に結合するために使用される１つの遊離原子価を有する
「オルガニルオキシ基」とは、任意の有機置換基であると理解され、機能型に関わらず、酸素原子に、前記オルガニル基を化合物に結合するために使用される１つの遊離原子価を有する。
「オルガニルアミノ基」とは、任意の有機置換基であると理解され、機能型に関わらず、窒素原子に、前記オルガニル基を化合物に結合するために使用される１つの遊離原子価を有する。
「親水性基（water-solubilizing group）」または「親水性基（hydro solubilizing group）」とは、水性媒体に対するプローブの溶解性を改善することを可能にする親水性基であると理解され、特に、親水性基を水素原子で置換することのみで、それと異なるプローブに関する。特に、前記親水性基は、プローブの静電的特性を改変することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「保護基」は、分子中の再生した官能基または他の官能基を攻撃しない、容易に入手可能な試薬によって選択的に除去され得る、化学的置換基を指す。適切な保護基は、当技術分野で公知であり、開発され続けている。適切な保護基は、例えば、Ｗｕｔｚら（"Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition," Wiley- Interscience, 2007）に見出すことができる。Ｗｕｔｚら（６９６～９２７ページ）によって記載されているようなアミノ基の保護のための保護基が、特定の実施形態において使用される。アミノ保護基の代表的な例としては、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アセチル（Ａｃ）、カルボキシベンジル基（Ｃｂｚ）、ベンジル基（Ｂｎ）、アリル、およびトリフルオロアセチルが挙げられるが、これらに限定されない。
「蛍光」は、分子が所与の波長の光によって励起されることで、より長い波長の光を発光する特性である。蛍光は、フルオロフォアと入射光子との相互作用の結果もたらされる現象である。この方法は励起とも呼ばれる。光子の吸収の結果、フルオロフォア中の電子の、その基本状態からより高いエネルギーレベルへの移行がもたらされる。その後、電子は光子を放出することによって、その元のレベルに戻る。この過程を蛍光発光と呼ぶ。そのとき、フルオロフォアは、吸収された光子の波長よりも長い波長の光を発光する。これは、励起状態の寿命期間中にエネルギーが散逸するために、発光された光子のエネルギーが吸収された光子のエネルギーよりも小さくなるという事実に単純に起因する。これは、特許出願ＷＯ ２００４／０５８７８７に与えられた定義である。
本発明による化合物（Ｉ）は、β－ラクタマーゼによって触媒される化学反応、特に加水分解、の間に別の物質に変換されるので、「β－ラクタマーゼ基質」と呼ばれる。水性媒体中でのこのような反応の間に、化合物（Ｉ）（「プローブ」とも呼ばれる）は標的β－ラクタマーゼの作用下で切断され、これはプローブの断片化をもたらすが、これには、高度に不溶性であり、およびその場で沈殿する化合物の形成が含まれる；固体状態の採用の際に、適切な波長の光によって励起される場合、強い蛍光を発し始める。
本発明の文脈における「スペーサー」は化合物（Ｉ）のフラグメントであり、これは一端に、ｉｉ）標的酵素の基質の役割を果たすβ－ラクタム基を有し、そして他端に、ｉｉｉ）前記フラグメント化によってＨＷＲ１として放出される場合に、フルオロフォアのクラス、より具体的に固体フルオロフォアのクラスに属するＷＲ１基を有する。
〔式（Ｉ）の化合物〕
本発明は、式（Ｉ）の化合物に関する。
ここで：
－Ｗは－Ｏ－または－ＮＲ１３－であり、Ｒ１３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり；
－Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１結合の切断後に得られるＨＷＲ１が、フルオロフォアのクラス、好ましくは励起状態で分子内陽子移動をもたらすフルオロフォアのクラスに属するようなものであり；
－Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は次のいずれかのように定義される：
○ Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ４はＣ１－Ｃ４アルキルであるか；
○ または、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ＹはＯ、ＮＲ１４、Ｎ（Ｒ１４）２ ＋またはＳであり、好ましくはＮＲ１４またはＮ（Ｒ１４）２ ＋であり、
● ｐ＝０、１、２、３、４または５、
● ｑ＝０または１、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、
● それぞれのＲ１４は独立に、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アミノ保護基、または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１に等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基であるか；
○ または、Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３とＲ４とが互いに結合し、それらが結合する炭素原子と共に脂肪族炭素環を形成し；
－Ｒ５とＲ６とは同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ５－Ｃ１０アリールを表し；
－Ｒ７は、水素原子、またはＣ１－Ｃ４アルキルおよびＣ１－Ｃ４アルコキシから選択される基であり；
－Ｒ８は、水素原子を表し；
－Ｖは、酸素原子または硫黄原子を表し；
－ｎは０または１であり；
－Ｚは－Ｓ－、－ＳＯ－、または－ＣＲ９Ｒ１０－であり；Ｒ９およびＲ１０は同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルを表し；
－ＱはＨ、カチオンまたはＲ１６であり、ここでＲ１６はＣ１－Ｃ６アルキルであり、任意にアリールまたはＯ－（ＣＯ）－Ｒで置換され、Ｒは独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキルおよびＣ３－Ｃ６シクロアルキルから選択され；
－Ｒ１１はオルガニル基、オルガニルアミノ基、オルガニルオキシ基、またはオルガニルチオ基であり、
－Ｘは結合、または
から選択される基を表す。
特定の実施形態において、化合物（Ｉ）は、式（Ｉａ）のものである：
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、ＸおよびＶは、化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりである。
別の実施形態では、化合物（Ｉ）は、式（Ｉｂ）のものである：
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、ＸおよびＶは、化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりである。
式（Ｉｂ）の化合物は、カルバペネマーゼ活性を検出するのに特に有用である。
Ｒ１基は、－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１結合の切断後に放出された、ＨＷＲ１に対応する得られた蛍光沈殿物がフルオロフォアのクラスに属するように選択され、好ましくは励起状態における分子内陽子移動（ＥＳＩＰＴ）をもたらすフルオロフォアのクラスに属するように選択される。
ＥＳＩＰＴフルオロフォアは、１００ｎｍを超え、しばしば２００ｎｍに近づくストークスシフトを示す。全てのＥＳＩＰＴフルオロフォアがアルキル化されるか、アシル化されるか、またはそうでなければ機能化されて、そのフェノール種のＷＨ基が励起状態の陽子の分子内移動を引き起こす場合、全てのＥＳＩＰＴフルオロフォアは１００ｎｍを超えるストークスシフトに対応する蛍光のこの発光を失う。この機能化は、照射による励起の間水素原子の移動を防止し、従って、陽子移動法に特徴的な蛍光の放出を防止する。
式（Ｉ）の化合物のカルバメート基または尿素基へのＨＷＲ１の組み込みは、陽子移動を妨げる。分子内陽子移動は、したがって、－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１結合の切断後に得られる基を使用して起こり得る。
最も頻繁には、Ｒ１基はフェニル基に対応し、置換されていないか、または置換されているか、および／または、窒素のようなヘテロ原子を含むことも可能であり、１個以上の不飽和の炭素環と併合されているフェニル基に対応する。ＷがＯの場合、－ＯＲ１のフェノキシ誘導体は、基質に結合していない場合、ＥＳＩＰＴクラスのフルオロフォアに属するその陽子化した形態のＨＯ－Ｒ１フェノリック誘導体に対応する。
特に、明細書ＷＯ２０１３／０４５８５４、ＷＯ２０１４／０２０２８５、およびＷＯ２０１５／１９７９８１を参照することができ、これらは、本発明において使用され得るこのようなＥＳＩＰＴフルオロフォアの例を提供する。
好ましくは、Ｒ１は、１つ以上の芳香環を含む芳香族基を含み、置換されているか、または非置換であり、当該環は窒素原子、酸素原子もしくは硫黄原子、から選択される１つ以上のヘテロ原子、および／またはＣ＝Ｏカルボニルの形態の１つ以上の炭素原子を含むことが可能である。
ＷＲ１は式（Ａ１）に記載の芳香族－ＯＲ１であってもよい。
ここで：
－Ｘ２は酸素原子であり、Ｘ１は－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ５－Ｃ２４アリール、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－Ｏ－フェニル、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－ＮＨ－フェニル、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、または－Ｓ－（Ｃ５－Ｃ２４アリール基）であり、前記アルキル、アリール、アルケニル、およびフェニルの基は任意に置換されているか；
または、Ｘ２は窒素原子を表し、ＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合され、任意で置換されているＣ５－Ｃ２４ヘテロアリールを形成しているか、のいずれかであり；
－
はＣ５－Ｃ２４アリールまたはＣ５－Ｃ２４のヘテロアリールを表し、これは任意で置換され、例えば、フェニル基、ナフチル基、および：
の中から選択され
前記基は任意で置換されており；
Ｘ３はＳ、ＯまたはＮＲｄを表し、Ｒｄは水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキル基を表す。
有利には、－ＯＲ１はアリールオキシ種であり、好ましくは、以下の好ましい構造（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）の１つに対応する：
－
ここで、
○ Ｔは－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）－または－Ｎ（Ｃ５－Ｃ２４アリール）－であり；
○ Ｒｅは水素原子または－ＣＮもしくは－ＣＯＯＲｈなどの電子求引基であり、ＲｈはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲｅは－ＣＯＮＲｉＲｊであり、ＲｉおよびＲｊは、同一であるか、または異なっており、ＲｉおよびＲｊは水素原子もしくはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲｅは－ＣＦ３、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはヘテロアリールであり、前記ヘテロアリールおよびアルケニルは任意に置換されており；
○ Ｒｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、－ＯＨ、－ ＮＨ２、－ＮＲｋＲＩ、－ＮＨＲｋまたは－ＯＲｋであり、ＲｋおよびＲＩは、同一であるか、または異なっており、ＲｋおよびＲＩは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ４アルキル基を表し；
○ または、ＲｅおよびＲｆは、それぞれ互いに結合して、４または５員を含む炭化水素鎖を形成し、飽和または不飽和であり、置換されているか、または非置換であり、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって隔てられていてもよく；
○ Ｒｇは、水素原子、Ｂｒ、Ｃｌ、ＩまたはＦ原子であり；
－
ここで、
○ Ｔ’は－ＮＨ２、－ＯＨ、Ｃ５－Ｃ２４アリール基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、－ＳＨ、－ＮＨＲ’ｇ、－ＯＲ’ｇ、－ＮＲ’ｇＲｈ’、－ＳＲ’ｇ、または任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルケニル基、またはヘテロアリールであり、Ｒ’ｇおよびＲｈ’は同一であるか、または異なっており、Ｃ１－Ｃ４アルキル基またはＣ５－Ｃ２４アリール基を表し；
○ Ｒ’ｅは水素原子または－ＣＮもしくは－ＣＯＯＲ’ｉなどの電子求引基であり、Ｒ’ｉはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ’ｅは－ＣＯＮＲ’ｊＲ’ｋであり、Ｒ’ｊおよびＲ’ｋは同一であるか、または異なっており、水素原子、もしくはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ’ｅは－ＣＦ３、もしくは２－オキサゾリル、２－チアゾリル、２－イミダゾリル、２－ベンゾイミダゾリル、４－ピリミジノン－２－イルもしくはキナゾリノン－２－イル基である；
○ Ｒ’ｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素原子、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＲ’ＩＲ’ｍ、またはＯＲ’Ｉであり、Ｒ’ＩおよびＲ’ｍは同一であるか、または異なっており、Ｃ１－Ｃ４アルキル基を表し；
○ またはＲ’ｅおよびＲ’ｆはそれぞれ互いに結合して、４または５員を含む炭化水素鎖を形成し、飽和または不飽和であり、置換されているか、または非置換であり、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって隔てられていてもよく；
－
ここで、
－Ｘ’２は酸素原子であり、Ｘ’１は－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ５－Ｃ２４アリール、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－Ｏ－フェニル、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－ＮＨ－フェニル、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、または－Ｓ－（Ｃ５－Ｃ２４アリール基）であり、前記アルキル基、アリール基、アルケニル基、およびフェニル基は、任意に置換されているか；
または、Ｘ２は窒素原子を表し、ＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合され、任意で置換されているＣ５－Ｃ２４ヘテロアリールを形成しているか、のいずれかであり；
－
は、任意で置換されているＣ５－Ｃ１０アリールまたはＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールを表す。
式（Ａ１）～（Ａ４）において、置換基が任意で置換されていてもよいと言及された場合、置換基は１個以上の置換基で任意に置換されていてもよい。１個以上の置換基は、好ましくは、ハロゲン化物、－ＣＮ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ５－Ｃ１０アリール、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ５－Ｃ２４ヘテロシクロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２、ヒドロキシ、オキソ、アリールオキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル基から選択され、前記シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルはハロゲン化物、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、オキソ、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６アルキル）２によって置換され得る。
本発明の特定の実施形態によれば、ＷＲ１は、以下の式（Ａ５）または（Ａ６）のうちの１つに応答する－ＯＲ１を有する芳香族基である：
このようなフルオロフォア（Ａ６については約１７０ｎｍである）、またはＨＰＱの任意のアナログの非常に大きなストークスシフトは、プローブの優れた感度に寄与し、そして放出されたフルオロフォアを、分析が行われる生物学的試料に由来し得る天然の蛍光から容易に区別可能なものにする。
一実施形態によれば、Ｒ１は、フルオレセイン（ローダミンおよびロドールを含む）、クマリン（７－アミノ－および７－ヒドロキシ－クマリンを含む）、シアニン、フェノキサジンおよびアクリジノンからなる群から選択される。
本発明の一実施形態によれば、Ｒ２は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルであり、Ｒ３は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルまたは水素原子であり、Ｒ４は（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである。別の実施形態によれば、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なっていても、（Ｃ１－Ｃ４）アルキル基を表し、例えば、メチルまたはエチルを表す。具体的な実施形態によれば、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝－ＣＨ３である。
別の実施形態によれば、Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は互いに結合されて、それらに結合している原子と共に、脂肪族炭素環を形成している。例えば、Ｒ３およびＲ４は互いに結合され、ｍ＝３、４、５、または６である－（ＣＨ２）ｍ－鎖を形成している。
有利には、Ｒ３は水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルであり、好ましくは水素原子であり、Ｒ２およびＲ４は互いに結合し、Ｒ２からＲ４への方向で－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ－ＣＨ２－鎖を形成し、Ｙは－ＣＨ２－、－ＮＲ１４－、またはＮ（Ｒ１４）２ ＋－を表し、Ｒ１４は水素原子または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１と等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基（hydro solubilizing group）である。
具体的な実施形態では、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ＹはＯ、ＮＲ１４、Ｎ（Ｒ１４）２ ＋またはＳであり、好ましくはＮＲ１４またはＮ（Ｒ１４）２ ＋であり、
● ｐ＝０、１、２、３、４または５、
● ｑ＝０または１、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、
● それぞれのＲ１４は独立に、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アミノ保護基、または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１に等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基である。
例えば、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ＹはＮＲ１４またはＮ（Ｒ１４）２ ＋、
● ｐ＝２、３、４または５、
● ｑ＝１、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、ならびに
● それぞれのＲ１４は独立に、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アミノ保護基、または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１に等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基である、または
Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ｐ＝２、３、４または５、
● ｑ＝０、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６。
具体的な実施形態において、ＹはＮ（Ｒ１４）２ ＋であり、正電荷はＮ原子上にあり、したがって、アンモニウムである。この場合、対イオンが存在する。対イオンは、ハロゲン化物、トリフルオロ酢酸、および酢酸からなる群から選択することができる。
具体的な実施形態において、ｑ＝１およびＬは結合アームであり、特に、－（Ｌ１）ｍ１－（Ｌ２）ｍ２－（Ｌ’１）ｍ’１－アーム（ピぺラジン方向－＞ＧＰ基）：
－Ｌ１およびＬ’１、同一または異なっており、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル）－、－Ｎ（フェニル）－、－Ｎ（アリール）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ－、－ＳＯＣ－、－Ｎ＝Ｎ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－および－ＣＯＮＨ－の中から選択される；
－Ｌ２は次の２価の基から選択される：（Ｃ１－Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ１－Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ１－Ｃ２０）アルキニレン、（Ｃ６－Ｃ２４）アリーレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキルアリーレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルケニルアリーレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキニルアリーレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキルシクロアルキレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルケニルシクロアルキレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキニルシクロアルキレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルケニルヘテロシクロアルキレン、（Ｃ７－Ｃ４４）アルキニルヘテロシクロアルキレン；前記基はトリアゾール基によって隔てられるか、または終了し、置換されていることまたは非置換であることが可能であり、特に、（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６－Ｃ１０）アリール、アミド、イミド、ホスフィド、ニトリド、（Ｃ１－Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１－Ｃ１０）アルキニル、及び－ＯＨの中から選択される１つ以上の置換基によって、置換されていることまたは非置換であることが可能であり；および
ｍ、ｍ’１及びｍ２、同一または異なっており、これらは０または１と等しい。
Ｌアームは、存在する場合、ピペラジンからＧＰ基を伸長するために、または合成の理由のために選択される。好ましい一実施形態によれば、Ｌは、－（Ｌ１）ｍ１－（Ｌ２）ｍ２－（Ｌ’１）ｍ’１を表し、Ｌ１＝－Ｃ（Ｏ）－、ｍ１＝ｍ２＝１、ｍ’１＝１または０であり、ならびに、Ｌ２およびＬ’１は上述に定義されるとおりである。特に、Ｌは－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｐ－Ｌ３－を表し、ｐは１、２、３または４と等しく、Ｌ３はトリアゾール基であり、特に、１Ｈ－１、２、３トリアゾール基である。
ＧＰは親水性基である。親水性基の例として、水溶液中で荷電種を形成することができる基を挙げる。水溶性ＧＰ基の例として、
－アミン（第１級、第２級、第３級、または第４級）、アミジン、グアニジン、またはテトラゾールの中から選択されるＦ１官能基；
－特に、アンモニウム、カルボン酸塩、スルホン酸塩またはリン酸塩の型の基である、Ｆ２カチオン性またはアニオン性官能基；
－これらのＦ１および／またはＦ２官能基の１つ以上を含む基；
－ポリエチレングリコール；
－グルコース、ガラクトースおよびマンノースのような糖または多糖類；
－ポリリジン、ポリアルギニン、ＴＡＴペプチドなどのペプチド基、ならびに
－アミノ酸
を挙げる。
アミン官能基の例として、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、およびジアルキルアミンを挙げ、アルキル基は同一または異なっており、１～４個の炭素原子を含む。
環化のためにスペーサーを予備組織化するこれらの２つの方法は、－Ｎ－Ｃ（Ｖ）－Ｏ－基のα炭素上に２つのアルキル置換基を導入すること（もしくは炭素環を形成すること）、またはヘテロシクリル環中に窒素－Ｎ－Ｃ（Ｖ）－Ｏ－基とそのα炭素との間の結合を含めることのいずれかからなり、脱モル化方法（immolation process）を促進する。
一実施形態によれば、Ｒ５およびＲ６は同一であり、水素原子を表す。一実施形態によれば、Ｒ７は水素原子、またはメチルのような（Ｃ１－Ｃ４）ａｌｙｌ基、および、好ましくは水素原子を表す。
一実施形態によれば、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ、水素原子を表す。
Ｘは、結合、または
から選択される基を表す。
本発明の場合、二重結合は任意の構成（ＺまたはＥ）を有することができる。一実施形態によれば、Ｘは結合、または
から選択される基を表し、好ましくはＸは結合である。
Ｒ１１が、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、５～１０個の環原子を有するヘテロシクリル、５～１０個の環原子を有するＣ５－Ｃ１０アリール、Ｃ７－Ｃ１６アラルキル、および－ＮＲ’’Ｒ’’’から選択され；前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびアラルキルは、独立して、オキソ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、５～１０個の環原子を有するヘテロシクリル、Ｃ５－Ｃ１０アリール、５～１０個の環原子を有するヘテロアリール、－ＯＨ、－ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｏ－（ＣＯ）－Ｒ、および－（ＣＯ）－Ｒから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されていてもよく；それぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシおよび－ＮＲ’’Ｒ’’’から独立して選択され、それぞれのＲ’’およびＲ’’’はＨおよびＣ１－Ｃ６アルキルから独立して選択される。
好ましくは、Ｒ１１はＣ１－Ｃ６アルキル、ＮＲ’’Ｒ’’’、およびＣ１－Ｃ６ヘテロアルキルから選択され、前記アルキルおよびヘテロアルキルは、オキソ、５～１０個の環原子を有するヘテロアリール、Ｃ５－Ｃ１０のアリール、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、－Ｏ－（ＣＯ）－Ｒ、および－ＯＨから独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換されており；ＲはＨおよびＣ１－Ｃ６アルキルから選択されており、ならびに、Ｒ’’およびＲ’’’はＨおよびＣ１－Ｃ６アルキルから独立して選択され、より好ましくはＲ１１は
から選択される。
カチオンＱは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋から選択できる。
特定の実施形態によれば、ＺはＳであり、ｎは１である。別の特定の実施形態によれば、Ｚは－ＣＲ９Ｒ１０－であり、ｎは０であり；Ｒ９およびＲ１０は同一または異なっており、互いに独立して、水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルを表す。
特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、式（Ｉｃ）のものである：
ここで、Ｒ１、Ｒ１１、Ｚ、Ｑ、ｎ、Ｘ、およびＹ、ならびにｎは、式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりである。
特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、式（Ｉｄ）のものである：
ここで、Ｒ１、Ｒ１１、Ｑ、Ｘ、およびＹは、式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりである。
式（Ｉｄ）の化合物は、式（Ｉｄ’）、（Ｉｄ’’）または（Ｉｄ’’’）であり得る：
式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりである。
式（Ｉｄ）の化合物は、以下の化合物から選択することができる：

特定の実施形態によれば、化合物（Ｉ）は、式（Ｉｅ）のものである：
ここで、Ｒ１、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｑ、ＸおよびＹは、式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりである。
式（Ｉｅ）の化合物は、式（Ｉｅ’）、（Ｉｅ’’）または（Ｉｅ’’’）であり得る：
ここで、Ｙは式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりである。
式（Ｉｅ）の化合物は、以下の化合物から選択することができる：

一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物において：
－Ｗは－Ｏ－であり；
－Ｒ１は、式（Ｉ）に存在する－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ１結合の切断後に得られるＨＯＲ１のようなものである。ＨＯＲ１はフルオロフォアのクラス、好ましくは励起状態で分子内陽子移動をもたらすフルオロフォアのクラスに属し、－ＯＲ１が式（Ａ１）の基に対応するようなものである：
ここで：
－Ｘ２は酸素原子であり、Ｘ１は－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ５－Ｃ２４アリール、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－Ｏ－フェニル、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－ＮＨ－フェニル、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、または－Ｓ－（Ｃ５－Ｃ２４アリール基）であり、前記アルキル、アリール、アルケニル、およびフェニルの基は任意に置換されているか；
または、Ｘ２は窒素原子を表し、ＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合され、任意で置換されているＣ５－Ｃ２４ヘテロアリールを形成しているか、のいずれかであり；
－
はＣ５－Ｃ２４アリールまたはＣ５－Ｃ２４のヘテロアリールを表し、これは任意で置換され、例えば、フェニル基、ナフチル基、および：
の中から選択され
前記基は任意で置換されており；
Ｘ３はＳ、ＯまたはＮＲｄを表し、Ｒｄは水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキル基を表し；
－Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は次のように定義される：
Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
● ＹはＯ、ＮＲ１４、Ｎ（Ｒ１４）２ ＋またはＳであり、好ましくはＮＲ１４またはＮ（Ｒ１４）２ ＋であり、
● ｐ＝０、１、２、３、４または５、
● ｑ＝０または１、
● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、
● それぞれのＲ１４は独立に、水素原子、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アミノ保護基、または－（Ｌ）ｑ－ＧＰを表し、ｑは０または１に等しく、Ｌは結合アームであり、ＧＰは親水性基であるか；
－Ｒ５とＲ６とは同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ５－Ｃ１０アリールを表し；
－Ｒ７は、水素原子、またはＣ１－Ｃ４アルキルおよびＣ１－Ｃ４アルコキシから選択される基であり；
－Ｒ８は、水素原子を表し；
－ｎは０または１であり；
－Ｚは－Ｓ－、または－ＣＲ９Ｒ１０－であり；Ｒ９およびＲ１０は同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルを表し；
－ＱはＨ、またはカチオンであり、
Ｒ１１が、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニル、５～１０個の環原子を有するヘテロシクリル、５～１０個の環原子を有するＣ５－Ｃ１０アリール、Ｃ７－Ｃ１６アラルキルから選択され；
前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびアラルキルは、独立して、オキソ、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、５～１０個の環原子を有するヘテロシクリル、Ｃ５－Ｃ１０アリール、５～１０個の環原子を有するヘテロアリール、－ＯＨ、－ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＯ２、－ＣＮ、および－（ＣＯ）－Ｒから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されていてもよく；
それぞれのＲは、独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシおよび－ＮＲ’’Ｒ’’’から独立して選択され、
それぞれのＲ’’およびＲ’’’はＨおよびＣ１－Ｃ６アルキルから独立して選択され、
－Ｘは結合、または
から選択される基を表す。
〔式の化合物（ＩＩ）〕
本発明はまた、式（ＩＩ）の化合物に関する：
ここで：
－Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｚ、ｎ、Ｑ、ＸおよびＶは化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりであり、
－Ｒ１２は、水素原子またはアミン官能保護基を表す。
式（ＩＩ）の化合物はアミン官能保護基による式（Ｉ）の化合物の合成中間体である。アミン官能保護基は、例えば、Organic Synthesis, Greene T.W. et Wuts P.G.N., ed. John Wiley and Sons, 2006に記載された保護基、およびKocienski P.J., 1994, Georg Thieme Verlagに記載された保護基などの保護基であると理解される。
一実施形態によれば、Ｒ１２はアミン官能保護基である。例えば、Ｒ１２は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオロフェニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アリールオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基、または２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）基などのアリール基またはカルバメート基の中から選択されるアミン官能保護基を表す。
特定の実施形態によれば、Ｒ１２は水素原子を表す。
特定の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は式（ＩＩａ）のものである：
ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｑ、Ｘ、およびＹは式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりであり、Ｒ１２は式（ＩＩ）の化合物に対して定義されるとおりである。
別の特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＩｂ）のものである：
ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０，Ｒ１１、Ｑ、Ｘ及びＹは式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりであり、Ｒ１２は式（ＩＩ）の化合物に対して定義されるとおりである。
有利には、式（ＩＩ）の化合物は式（ＩＩｃ）のものである：
ここで、Ｒ１１、Ｚ、Ｑ、ｎ、ＸおよびＹは、式（Ｉ）の化合物に対して定義されとおりであり、Ｒ１２は式（ＩＩ）の化合物に対して定義されるとおりである。
特定の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は式（ＩＩｄ）のものである：
ここで、Ｒ１１、Ｑ、ＸおよびＹは式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりであり、Ｒ１２は式（ＩＩ）の化合物に対して定義されるとおりである。
別の特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は式（ＩＩｅ）のものである：
ここで、Ｒ１１、Ｑ、ＸおよびＹは式（Ｉ）の化合物に対して定義されるとおりであり、Ｒ１２は式（ＩＩ）の化合物に対して定義されるとおりである。
〔式（Ｉ）の化合物の調製方法〕
本発明はまた、以下の工程を含む式（Ｉ）の化合物の調製方法に関する：
－化合物（ＩＩ）の実施；
－式（ＩＩＩ）の化合物の実施：
ここで、Ｒ１は化合物（Ｉ）に対して定義されるとおりであり、Ｍは脱離基を表し、好ましくはハロゲン原子、特にＣｌ、イミダゾリル基、トリアゾリル基、およびパラ－ニトロフェノキシから選択され、より好ましくは、Ｍはパラ－ニトロフェノキシルを表し、
－前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応によって化合物（Ｉ）を得ること。
－前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応によって化合物（Ｉ）を得ること
この方法は、Ｘが結合である場合に特に適している。
一実施形態によれば、化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応は、Ｒ１２が水素原子である化合物（ＩＩ）を用いて実施される。
別の実施形態によれば、Ｒ１２が水素原子ではない化合物（ＩＩ）が入手可能であり、化合物（ＩＩ）のアミン官能基を脱保護する工程は、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に付加して、Ｒ１２＝Ｈなどの化合物（ＩＩ）を得る反応の前に実行される。
Ｖ＝Ｏの場合、化合物（ＩＩ）は、以下の工程に従って有利に得ることができる：
－次式の化合物（Ｖ）の実施：
－式の化合物（ＶＩ）の実施
－化合物（ＶＩ）を化合物（Ｖ）に付加反応させて化合物（ＩＩ）を得、ここで、Ｒ８、Ｒ１１、Ｑ、ＸおよびＺは本発明の文脈において定義される通りであり、Ｋは、脱離基、特にハロゲン、特に塩素、またはイミダゾリル基もしくはパラ－ニトロフェニル基を表す。
特定の実施形態によれば、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖａ）の化合物である：
ここで、Ｒ８、Ｒ１１、Ｑ、Ｚ、ＸおよびＫは、発明の文脈において定義されるとおりである。
別の特定の実施形態によれば、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖｂ）のものである：
ここで、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｑ、ＸおよびＫは、発明の文脈において定義されるとおりである。
本発明はまた、Ｘが
である場合の式（Ｉ）の化合物の調製方法に関する。この場合、化合物は、当業者に周知の反応である薗頭カップリング反応を用いて調製することができる。この方法は、以下のステップを含むことができる：
－次の式（ＶＩＩ）の化合物の実施：
－式（ＶＩＩＩ）の化合物の実施
－および、前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応によって化合物（Ｉ）を得ること、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ、およびｎは本発明の文脈上において定義されるとおりであり、ＬＧは脱離基を表し、好ましくはハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート）から選択される。
この方法は、パラジウム触媒および銅助触媒のような標準条件を用いて実施することができる。
本発明はまた、Ｘが
である場合の式（Ｉ）の化合物の調製方法に関する。この場合、化合物は、当業者に周知の反応である鈴木カップリング反応を用いて調製することができる。この方法は、以下のステップを含むことができる：
－次の式（ＶＩＩ）の化合物の実施：
－式（ＩＸ）の化合物の実施
－および、前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＩＸ）との反応によって化合物（Ｉ）を得ること、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ、およびｎは本発明の文脈上において定義されるとおりであり、ＬＧは脱離基を表し、好ましくはハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート）から選択される、各Ｒ１５はＯＨを表し、または各Ｒ１５が互いに結合し、それらが結合するＢ原子と共に、５～１０個の環原子を有する複素環を形成する。互いに結合しているＲ１５基の例には、ピナコール、カテコール、およびメチルイミノジアセテートが含まれる。
この方法は、パラジウム触媒および塩基のような標準条件で実施することができる。
本発明はまた、Ｘが
である場合の式（Ｉ）の化合物の調製方法に関する。この場合、化合物は、当業者に周知の反応である鈴木カップリング反応を用いて調製することができる。この方法は、以下のステップを含むことができる：
－下記式（ＶＩＩ）の化合物の実施
－式（Ｘ）の化合物の実施
－および、前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（Ｘ）との反応によって化合物（Ｉ）を得ること、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ、およびｎは本発明の文脈上において定義されるとおりであり、ＬＧは脱離基を表し、好ましくはハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート）から選択され、Ｒ１５はＯＨを表し、または各Ｒ１５が互いに結合し、それらが結合するＢ原子と共に、５～１０個の環原子を有する複素環を形成する。互いに結合しているＲ１５基の例には、ピナコール、カテコール、およびメチルイミノジアセテートが含まれる。
この方法は、パラジウム触媒および塩基のような、標準条件で実施することができる。
式（Ｘ）の化合物は、三重結合のhdroborationによって式（ＶＩＩＩ）の化合物から得ることができる。式（Ｘ）の化合物中の二重結合は、ＥまたはＺであり得る。
〔β－ラクタマーゼの存在の検出〕
本発明はまた、以下の工程を含む、β－ラクタマーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ検出のための方法に関する：
－分析する試料を化合物（Ｉ）に接触するように置くこと、
－Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中のβ－ラクタマーゼの有無と相関させること。
本発明はまた、以下の工程を含む、抗生物質耐性菌をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法に関する：
－分析する試料を化合物（Ｉ）に接触するように置くこと、
－Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中の抗生物質耐性細菌の有無と相関させること。
本発明はまた、化合物（Ｉ）を含む、β－ラクタマーゼを検出するためのキットに関する。
本発明はまた、化合物（Ｉ）を含む、β－ラクタマーゼを検出するための装置に関する。好ましくは、前記装置はｉｎ－ｖｉｔｒｏ診断医療装置（ＩＶＤ）である。
一実施形態によれば、β－ラクタマーゼはカルバペネマーゼである。
本発明はまた、以下の工程を含む、カルバペネマーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法に関する：
－分析する試料を化合物（Ｉ）に接触するように置くこと、
－Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
－蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中のカルバペネマーゼの有無と相関させること。
本発明による式（Ｉ）の化合物はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ、動物またはヒトにおいてβ－ラクタマーゼを検出するために使用されてもよい。
式（Ｉ）の化合物の投与は、例えば、静脈内または腹腔内注入によって、または経皮的に、溶液中に当該分子を含む噴霧を使用することによって完了することができる。
式（Ｉ）の化合物の蛍光の分析は、蛍光または落射蛍光タイプの断層撮影技術を用いて、イメージングチャンバ内で行うことができる。
本発明はまた、本発明による化合物（Ｉ）の手段によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、β－ラクタマーゼの存在を検出するための方法に関する。
試料は、ヒト、動物、植物または微生物に由来する任意の適切な生物学的試料であり得る。ヒトまたは動物に由来する試料の場合、これは特に生物学的流体の試料、特に全血、血清、血漿、尿、組織試料、または単離された細胞の試料であってもよく、特に、細胞培地の試料であってもよい。植物由来の試料の場合、これは、植物抽出物、真菌または藻類の抽出物、生細胞の抽出物であってもよく、特に細胞培地の抽出物であってもよい。試料が植物を直接含むことも可能である。微生物由来の試料の場合、微生物は細菌、ウイルス、真菌または酵母であってもよく、微生物相であってもよい。試料は、微生物、または後者の抽出物、または微生物が培養された培地さえも直接含んでもよい。全ての場合において、試料は、プローブの存在下に置かれる前に、そのまま使用され得るか、または当業者に周知の濃縮した種の、または培養した種の調製物に供され得る。
化合物または蛍光沈殿物の分析は、
－蛍光沈殿物を、蛍光沈殿物の吸収波長で光を生成することができる光源に暴露する工程、および
－得られた沈殿物の蛍光を検出するステップ、を含むことができる。
分析はまた、蛍光の検出するステップに続いて、前記蛍光沈殿物によって提供されるシグナルに基づいて分析試料を選別するステップを含んでもよい。選別された試料は、微生物培養物のディッシュのような空間で分離された微生物のコロニーであり得る。選別された試料はまた、微生物の生体分子またはコロニーのいずれかを含む、小さな物体、液体、固体、ゼラチン状または不均一な組成物であり得る。いくつかの試料について並行して検知が行われる場合、選別は、例えば、フローサイトメトリーまたはデジタルミリ流体またはマイクロ流体装置のような、発光した蛍光を代表する光学シグナルに従って選別することができる装置内で運動するように設定された試料の流れを転換することによって行うことができる。
本発明は、β－ラクタマーゼの活性を、フルオロフォア、好ましくはＥＳＩＰＴフルオロフォアを使用する蛍光イメージングによってアクセス可能にする。有利なことに、自然分解による（すなわち、生理学的媒体中の標的β－ラクタマーゼの非存在における）バックグラウンドノイズは観察されなかった。プローブ自体はわずかに蛍光性であるか、または全く蛍光性ではなく、特に、検出／イメージング機器が設定されるフルオロフォア繊維の発光波長において蛍光性である。したがって、プローブはオン／オフモードで機能し、最大感度を有する分析の開発に使用することができる。
本発明によるプローブは、生命科学におけるいくつかの高感度な適用について興味深い。特に：（１）寒天プレート上の細菌コロニーによって発現されるβ－ラクタマーゼ活性の高収率標的化（コロニーの分析）；（２）生物学的液体中のβ－ラクタマーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出（血液学およびその他）；（３）フローサイトメトリー中の単純な細胞のレベルでのβ－ラクタマーゼ活性の可視化；（４）培養細胞中の細胞内β－ラクタマーゼの検出（共焦点蛍光顕微鏡法）；（５）β－ラクタマーゼの（組織レベルでの）組織化学的検出；および最後に（６）動物全体のｉｎ ｖｉｖｏイメージ、の点である。
したがって、本発明によるβ－ラクタマーゼ基質としての式（Ｉ）の化合物は、多数の潜在的用途を有する。これらの適用の例は、細菌コロニーの分析の設計を含む。これらは、現在、寒天皿（ペトリ皿）上で実施され、ここで、３，０００個までのコロニーがマルチウェルディッシュに含まれるウェルのような分けられた区画にそれらを能動的に分離する必要なく、識別され得る。したがって、（１）目的の病原系統を細菌系統群の中から同定することを可能にする臨床試料に関する試験を設計すること、および（２）古典的な細菌宿主（しばしば商業的）によって発現された自己産生タンパク質のバンクの大規模並行試験を完了すること、が可能である。このタンパク質の収集は、特定の目的のタンパク質を含むと理解することができ、例えば、特定のβ－ラクタム基に対して選択性を有するβ－ラクタマーゼ、またはβ－ラクタムを加水分解するβ－ラクタマーゼを含むと理解することができる。特に、β－ラクタマーゼまたは酵素の指向進化法の分野では、容易に１０６を超える非常に多数のタンパク質変異体をふるい分けるための効果的かつ高感度の分析が強く求められている。本発明によるプローブの適用は、寒天溶液がディッシュに注がれるか、またはそれ自体がゲル化する前に、寒天溶液中に溶解することによって、最も容易に想像することができる。代替として、基質はコロニーに導入される前に、フィルターの浸漬によってコロニーと培養される。本発明によるプローブがこのようなコロニーの分析に寄与する主な利点は、フルオロフォアのその場での沈殿であり；これにより、蛍光シグナルの希釈が非常に低減され、これにより、長いインキュベーション期間が可能になり、したがって、分析の感度が高くなる。ジクロロ－ＨＰＱ（約１４０ｎｍ）またはＨＰＱの任意のアナログの非常に大きなストークスシフトは誤って推定されるべきではなく；また、それは優れた感度に寄与し、そして発光した蛍光は生物学的試料に由来し得る天然の蛍光から容易に識別可能である。
本発明によるプローブは、肉眼で見える蛍光イメージング、すなわち生物全体にも使用することができる。この場合、プローブは、目的の活性に到達するために細胞壁を貫通する。
添付の図面に関連する例は、限定的な方法ではなく、本発明を例示することができる。
〔実施例〕
〔実施例１：化合物１５の合成〕
（ＥＬＦ－９７）
乾燥ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中のアントラニルアミド（２．０００ｇ、１１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、５－クロロサリチルアルデヒド（１．８３１ｇ、１１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）で処理し、当該混合物を３０分間還流する。次に、パラ－トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）（４０ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ、０．０２当量）を添加し、還流をさらに１時間続ける。当該反応混合物を室温に下げ、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）（２．６７８ｇ、１１．８ｍｍｏｌ、１．０１当量）で少しずつ処理する。撹拌を一夜続ける。得られた粗懸濁液を濾過し、濾過ケーキをＥｔＯＨで２回、およびジエチルエーテルで２回洗浄する。ＥＬＦ－９７（３．４１ｇ、１１．１１ｍｍｏｌ、９５％）を明るいベージュ色の粉末として得、さらに精製することなく後の工程で使用する。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 13.38 (s, 1H), 12.64 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.10 (s,1H), 7.88 (q, J =7.8 Hz, 2H), 7.49 (d, J =7.6 Hz,1H), 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H)
スペクトルデータは文献値（M. Prost, L. Canaple, J. Samarut, J. Hasserodt. Tagging Live Cells that Express Specific Peptidase Activity with Solid-State Fluorescence. ChemBioChem 2014, 15, 1413－1417）に従う。
（化合物４）
トルエン（５０ｍＬ）中の２－アミノメチルピペリジン（１）（３．０ｇ、２６．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を無水フタル酸（３．８９ｇ、２６．３ｍｍｏｌ、１．０当量）で少しずつ処理し、続いてトリエチルアミン（５５０μＬ、３．９５ｍｍｏｌ、０．１５当量）を滴下する。混合物を、Ｄｅａｎ－Ｓｔａｒｋ装置を用いて２時間還流する。混合物を濾過し、濾液を減圧下で乾燥状態まで減らす。生成物２（５．４２ｇ、２２．２ｍｍｏｌ、８５％）を淡黄色固体として得、さらに精製することなく次の工程で使用する。
化合物２（５．４２ｇ、２２．２ｍｍｏｌ、１．０当量）の氷冷エタノール溶液（４５ｍＬ）を、炭酸カリウム（３．９９ｇ、２８．９ｍｍｏｌ、１．３当量）、ヨウ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（８２０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、０．１０当量）、および臭化アリール（２．５０ｍｍＬ、２８．９ｍｍｏｌ、１．３当量）で処理する。冷却浴を除去し、混合物を３６時間撹拌する。反応が完了したことを検証し、混合物をセライトのパッド上で濾過し、濾液を減圧下で乾燥状態まで蒸発させた。油状残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液で洗浄し、２層を分離し、有機相を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で２回洗浄する。合わせた水相をＥｔＯＡｃで３回抽出する。合わせた有機相は、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して、乾燥状態まで蒸発させる。粗油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ ８０／２０～６０／４０ｖ／ｖ）により精製して、３（３．５８２ｇ、１２．６ｍｍｏｌ、５７％）を淡黄色油として得る。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.89－7.82 (m, 2H), 7.75－7.68 (m, 2H), 3.68 (d, J = 4 Hz, 2H), 3.13－3.05 (m, 1H), 2.98－2.88 (m, 1H), 2.64－2.54 (m, 1H), 1.87－1.78 (m, 1H), 1.76－1.68 (m, 1H), 1.63－1.54 (m, 1H), 1.45－1.34 (m, 2H), 1.30－1.15 (m, 1H)。
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 168.4, 133.7, 131.9, 123.0, 55.5, 46.4, 43.4, 30.6, 26.1, 24.1.
HRMS: ESI: [M+H] + m/z found 245.1290, calc. 245.1290.
ｉＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ ６／１ｖ／ｖ（１７５ｍｌ）中の３（３．５８２ｇ、１２．６ｍｍｏｌ、１．０当量）の氷冷溶液を水素化ホウ素ナトリウム（６６５ｍｇ、１７．５８ｍｍｏｌ、５．０当量）で少しずつ処理する。冷却を除去し、混合物を室温で一晩（ｏ／ｎ）撹拌する。次いで、濃ＨＣｌを用いてｐＨを１に調整する。得られた混合物を濾過し、濾液を８０℃に２時間加熱する。イソプロピルアルコールを減圧下で除去し、得られた水溶液をジエチルエーテルで５回洗浄し、２Ｍ ＮａＯＨ水溶液で塩基性にし、ジエチルエーテルで抽出する。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、乾燥状態まで蒸発させ、４を淡黄色油（１．９３９ｇ、１２．６ｍｍｏｌ、定量収率）として得る。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 5.99－5.86 (m, 1H), 5.24－5.13 (m, 2H),3.41(ddt, J = 14 Hz, J = 6Hz, J = 1.5 Hz, 1H), 3.04-2.90 (m,3H), 2.74 (dd, J = 13 Hz, J = 3 Hz, 1H), 2.21 (tt, J = 9.6 Hz, J = 3.3H, 2 Hz), 1.80－1.71 (m, 1H), 1.68－1.43 (m, 2H), 1.39－1.25 (m, 3H).
13C -NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 157.34, 134.50, 117.71, 58.62, 56.29, 51.90, 42.31, 28.85, 24.92, 23.58.
HRMS: ESI : [M+H] + m/z found 155.1543, calc. 155.1548.
（化合物６）
－２０℃のＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ（２０ｍＬ、１／１ｖ／ｖ）中の７－アミノセファロスポラン酸（５）（２．０００ｇ、７．３４５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、１０Ｍ ＮａＯＨ（２ｍＬ）で処理し、得られた混合物を－２０℃で３０分間撹拌する。濃ＨＣｌでｐＨを３に調整する。次に、温度を０℃にし、こうして形成された淡黄色沈殿を濾別し、ＭｅＯＨ、アセトン、およびエーテルで洗浄し、次いで乾燥させる。所望のアルコール６がオフホワイトの粉末として得られる（１．４５１ｍｇ、６．３０２ｍｍｏｌ、８６％）。
1H -NMR (300 MHz, DMSO): δ (ppm) = 4.83 (AB system, Δμ = 59 Hz, J = 5 Hz, 2H), 4.21 (AB system, Δμ =17 Hz, J = 13 Hz, 2H), 3.52 (AB system, Δμ = 26 Hz, J =18 Hz, 2H).
スペクトルデータは、文献値（S. Desgranges, C. C. Ruddle, L. P. Burke, T. M. McFadden, J. E. O’Brien, D. Fitzgerald-Hughes, H. Humphreys, T. P. Smyth, M. Devocelle. β-Lactam-host defence peptide conjugates as antibiotic prodrug candidates targeting resistant bacteria. RSC Advances 2012, 2, 2480）に従う。
ＰＥ（３０ｍＬ）中のベンゾフェノンヒドラゾン（８）（４．９０６ｇ、２５．００ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を酸化水銀（ＩＩ）（２５．４６９ｇ、２５．２５ｍｍｏｌ、１．０１当量）で処理し、得られた混合物を室温で６時間、昼光排除下で撹拌する。得られた紫色混合物を濾過して水銀含有残渣を除去し、得られた溶液を減圧下で蒸発させる。標的試薬ジアゾジフェニルメタン９（４．５７０ｇ、２３．５３ｍｍｏｌ、９４％）を含有する紫色の液体をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に溶解し、さらに精製することなく次の工程で迅速に使用する。
ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）中の化合物６（５．０００ｇ、２１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液（８０ｍＬ）を、ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）（１３．３ｍＬ、５４．２９ｍｍｏｌ、２．５当量）で処理し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌する。透明な溶液を－３０℃に冷却し、２－チオフェンアセチルクロリド（３．４８ｍＬ、２８．２３ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴下して添加しる。得られた混合物を－２０℃で２時間撹拌し、氷水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出する。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、それらの体積を減圧下で８０ｍｌに調整する。溶液を０℃に冷却し、紫色になるまで、ＥｔＯＡｃ中の上記ジアゾジフェニルメタン９溶液（４．４２９ｇ、２２．８０ｍｍｏｌ、１．０５当量）で処理する。得られた溶液の体積を真空下で減少させた後、ペンタン溶液（３００ｍＬ）に滴下し、それにより淡黄色固体の沈殿を生じる。後者を濾別し、二重に保護された生成物１０（３．９５７ｇ、７．６０１ｍｍｏｌ、２段階にわたって３５％）を得る。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 9.23－9.12 (m, 1H), 7.54－7.46 (m, 11H), 7.01－6.88 (m, 3H), 5.89－5.67 (m, 1H), 5.20－5.02 (m, 2H), 4.21 (d, J = 4 Hz, 1H), 3.78 (s, 2H), 3.62 (s, 1H), 2.95 (s, 1H), 2.79 (s, 1H).
スペクトルデータは、文献値（S. Desgranges, C. C. Ruddle, L. P. Burke, T. M. McFadden, J. E. O’Brien, D. Fitzgerald-Hughes, H. Humphreys, T. P. Smyth, M. Devocelle. β-Lactam-host defence peptide conjugates as antibiotic prodrug candidates targeting resistant bacteria. RSC Advances 2012, 2, 2480）に従う。
（化合物１５）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のアルコール１０（１．０００ｇ、１．９２１ｍｍｏｌ、１．０当量）の氷冷溶液を、４－ニトロフェニルクロロホルメート（７７５ｍｇ、３．８４２ｍｍｏｌ、２．０当量）、ピリジン（１５５μＬ、１．９２１ｍｍｏｌ、１．０当量）および４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２４ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ、０．１当量）で処理する。室温で２時間撹拌した後、水洗し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮する。粗残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ ７０／３０）により精製して、所望の炭酸塩１１を淡黄色固体（６８５ｍｇ、０．９９９ｍｍｏｌ、５２％）として得る。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.26 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 7 Hz, 2H), 7.40－7.23 (m, 11H), 7.03－6.98 (m, 1H), 6.96 (d, J = 11 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 9 Hz, 1H), 5.89 (dd, J = 9 Hz, J = 5 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 13 Hz, 1H), 5.04－4.95 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.52 (AB system, Δμ = 55 Hz, J = 19 Hz, 2H)。
スペクトルデータは、文献値（S. Desgranges, C. C. Ruddle, L. P. Burke, T. M. McFadden, J. E. O’Brien, D. Fitzgerald-Hughes, H. Humphreys, T. P. Smyth, M. Devocelle. β-Lactam-host defence peptide conjugates as antibiotic prodrug candidates targeting resistant bacteria. RSC Advances 2012, 2, 2480）に従う。
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の溶液１１（１００ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ、１．０当量）を第１級アミン４（２５ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、１．２当量））で処理し、撹拌混合物を氷浴中で冷却した後、ＤＩＰＥＡ（１２７μＬ、０．７２９ｍｍｏｌ、５．０当量）を添加する。５分後、氷浴を除去し、溶液を３０℃で一晩撹拌する。次に、飽和Ｎａ２ＣＯ３（２回）及びＮａＨＣＯ３（２回）の水溶液を使用して混合物を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させる。得られた粗油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９９／１ｖ／ｖ）により精製して、所望のカルバメート１２を黄色油（３９ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、３８％）として得る。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.57－7.48 (m, 1H), 7.42－7.22 (m, 11H), 7.09－6.84 (m, 3H), 5.94－5.75 (m, 1H), 5.25－4.94 (m, 3H), 3.94－3.63 (m, 2H), 3.49－3.12 (m, 4H), 3.04－2.74 (m, 2H), 2.53－1.98 (m, 4H), 1.81－1.37 (m, 6H).
ESI : [M+H] +m/z found 701.2, calc. 701.2.
乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中の溶液１２（３９ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、１．０当量）に、１，３－ジメチルバルビツール酸（ＤＭＢＡ）（４３ｍｇ、０．２７８ｍｍｏｌ、５．０当量）を添加し、得られた混合物をアルゴンフラックスを用いて脱気した後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ、０．０１当量）で処理する。反応の完了後（典型的には約４時間）、当該反応混合物を乾燥状態まで蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、９９／１ｖ／ｖ）により精製して、所望の第２級アミン１３を黄色油として得る（１５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、４１％）。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.46－7.17 (m, 10H), 7.04－6.84 (m, 2H), 5.53－5.32 (m, 1H), 5.08－4.92 (m, 1H), 4.30－4.03 (m, 1H), 4.00－3.88 (m, 2H), 3.79－3.71 (m, 2H), 3.55－3.40 (m, 2H), 3.40－2.85 (m, 4H), 2.85－2.59 (m, 1H), 1.88－1.45 (m, 6H)。
ESI: [M+H] + m/z found 661.2, calc. 661.2.
乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中のＥＬＦ－９７（７ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、１．０当量）の氷冷懸濁液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２０μＬ、０．１１３ｍｍｏｌ、５．０当量）を、アルゴン雰囲気で滴下し、続いて乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中のトリホスゲン（２０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液を添加する。混合物を０℃で１時間撹拌し、室温で一晩撹拌する。翌朝、揮発性物質を液体－窒素トラップに捕捉しながら、減圧下で乾燥状態まで減らす。後者の含有物は、その後のエタノール性ヒドロキシドナトリウムの添加によって破壊される）。得られたＥＬＦ－９７のクロロギ酸塩（固体残渣）を、さらに精製することなく、次の工程で使用する。
乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中の上記で調製したＥＬＦ－９７のクロロホルメート（１．０当量）の氷冷懸濁液に、アルゴン下で、第２級アミン１３の透明な溶液（１５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を滴下する。撹拌を０℃でさらに３０分間続け、次いで室温で一晩続ける。当該反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で３回洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させる。粗生成物シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、８／２ｖ／ｖ）により精製して、所望の保護されたプローブ１４をオフホワイトの固体（１２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、５３％）として得る。
ESI: [M+H]+ m/z found 992.0, calc. 992.3。
乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中の氷冷溶液１４（１２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＴＦＡ（５００μＬ、過剰）およびアニソール（７．２μｇ、０．６６ｍｍｏｌ、５．５当量）で滴下処理する。撹拌した混合物は室温に温められ、質量分析によってモニターして完了点を決定する（１～２時間）。全ての不揮発性を減圧下で除去する。粗残渣を分取による精製に供する。凍結乾燥後に、目的化合物１５を白色粉末（１．５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ、１５％）として得るためのＨＰＬＣ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ０／１００～５０／５０ｖ／ｖ）。
ESI: [M+H] + m/z found 826.3, calc. 826.1.
〔実施例２：化合物１５の蛍光の検出〕
化合物１５の蛍光をβ－ラクタマーゼの有無で評価した。試験は、マイクロウェルプレート（７５μＭ、３７℃、１０Ｕ．ｍＬ－１）中でのインキュベーション／化学反応によって行った。蛍光をプレート蛍光光度計によって経時的に測定した。得られた結果を図１に示す。
結果は、本発明による化合物が蛍光（蛍光発生プローブ）を発することによってβ－ラクタマーゼ活性を検出することができることを示す。β－ラクタマーゼの存在下で、化合物１５は加水分解され、これは化合物の断片化、および強い蛍光を発する小蛍光分子（ＥＬＦ ９７）の放出をもたらす。しかしながら、酵素活性の非存在下では、２時間にわたって蛍光の変化は観察されず、したがって、（生理学的な）インキュベーション培地中のプローブ１５の安定性を証明した。
〔実施例３：化合物２５の合成〕
メタノール（２０ｍＬ）中のアルデヒド１６の氷冷溶液（１ｇ、４．３ｍｍｏｌ）に、水素化ホウ素ナトリウム（１当量、４．３ｍｍｏｌ、１６４ｍｇ）を添加した。溶液を０℃で２０分間撹拌した後、アセトン（２ｍＬ）を添加した。揮発性物質を減圧下で除去し、スライド残基を酢酸エチル／水（５０ｍＬ／２０ｍＬ）に溶解した。混合物を分液漏斗に移し、水相を除去し、有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して、実質的に純粋な形態の粗アルコール１７を黄色の淡色固体として得た。
粗アルコール１７を無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（１．０５当量、９１２ｍｇ）を添加した。フラスコを氷浴中に置き、ピリジン（２当量、８．６ｍｍｏｌ、０．７ｍＬ）を滴下した。次いで、当該反応物を室温で１６時間撹拌し、次いでジエチルエーテルで希釈し、セライト上で濾過した。得られた溶液にセライト（２０ｇ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。セライト吸着粗混合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル８：２）に供して、活性炭酸塩１８（１．０６ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、２段階にわたり６２％）を淡黄色固体として得た。
1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.35 － 8.16 (m, 2H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.41 － 7.33 (m, 2H), 5.31 (s, 2H), 1.35 (s, 12H).
無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＮ－メチル－Ｎ’－アリル－アミノメチルピペリジン１９（１．０当量、０．８９ｍｍｏｌ、２４０ｍｇ）の溶液に、カーボネート１９（１．０５当量、０．９３ｍｍｏｌ、３７３ｍｇ）および炭酸カリウム（５当量、４．４５ｍｍｏｌ、６１５ｍｇ）を添加した。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋２０＝５３０．４）によって判定される反応の完了時に、当該反応混合物を石油エーテルおよびジエチルエーテルの１：１混合物（１５ｍＬ）で希釈し、セライトを通して濾過し、セライトを１００ｍＬのＰＥ／Ｅｔ２Ｏ １：１混合物でリンスした。濾液を減圧下で濃縮して、実質的に純粋なカルバメート２０を黄淡色固体として生じ、これを次の工程に直接使用した。代替的には、これはキャラクタリゼーションのための溶離剤としてＥｔ２Ｏを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製され得る。
20: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.79 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.94 － 5.58 (m, 1H), 5.25 － 4.96 (m, 4H), 3.81 － 3.02 (m, 8H), 2.97 (s, 3H), 2.70 (brm, 2H), 2.39 (brm, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.33 (s, 12H).。
クルード２０を丸底フラスコに入れ、１，３－ジメチルバルビツール酸（３当量、２．６７ｍｍｏｌ、４１６ｍｇ）を添加し、続いてＤＣＭ（８ｍＬ）を添加した。当該溶液をアルゴンで１０分間パージし、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１ｍｏｌ％、１０ｍｇ）を添加し、当該混合物を室温で、アルゴン下で、２０～６０分間撹拌した。ＭＳによって判定された反応の完了後、溶媒を蒸発させ、２１を含有する粗混合物を、次の工程におけるさらなる精製と共に使用した。
ＥＬＦ－９７（１．３当量、１．１５７ｍｍｏｌ、３５５ｍｇ）をアルゴン下の丸底フラスコに入れ、続いてトリホスゲン（１．３当量、１．１５７ｍｍｏｌ、３４３ｍｇ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）を入れた。溶液を０℃に冷却し、ピリジン（６当量、０．４３ｍＬ）を滴下した。氷浴を除去し、溶液を室温で２０分間撹拌した。揮発性物質を減圧下で除去し、ＤＣＭ（５ｍＬ）を添加し、揮発性物質を減圧下で再び除去した。得られた固体ＥＬＦクロルホルメートをＤＣＭ（５ｍＬ）中に懸濁し、前記フラスコを氷浴中で冷却し、粗生成物２１（１当量、０．８９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液中に添加し、続いてＤＩＰＥＡ（３当量、０．４７ｍＬ）を添加した。ＭＳ中で２１が検出されなくなるまで当該反応物を室温で３時間撹拌した。次いで、当該反応物をＥｔ２Ｏ中で希釈し、０℃に冷却した後、静置した。ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）を添加した。当該混合物を分液漏斗に移し、有機相を水およびブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。固形残渣をＥｔ２Ｏに部分的に溶解し、２．５ｗ／ｗ％のトリエチルアミンで前処理したシリカパッドを通して濾過して、過剰な未反応ＥＬＦ－９７を除去し、シリカをＥｔ２Ｏ（２００ｍＬ）でリンスした。次いで、当該溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ １：０～３：７）に供して、純粋なボロネート２２をガラス状の黄淡色固体として得た（５３６．６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、７３％）（Ｍ＋Ｈ＋ ２２＝８２２．４）。
22: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.27 － 8.20 (m, 1H), 8.01 － 7.88 (m, 1H), 7.76 (appt, J = 7.5 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 7.39 － 7.26 (m, 4H), 7.18 － 7.01 (m, 1H), 5.23 － 4.76 (m, 2H), 4.70 － 4.37 (m, 1H), 4.20 － 3.81 (m, 3H), 3.70 (m, 1H), 3.38 － 3.11 (m, 2H), 3.13 － 2.68 (m, 6H), 1.46 (m, 9H), 1.39 － 1.26 (m, 12H)。
アリール－ピナコール－ボロン酸エステルを中間体２３とカップリングさせるための、公開された条件（Chem. Eur. J. 2020, 26, 3647-3652）を用いて、化合物２２をエノールトリフラート２３とカップリングさせることができ、化合物２４を与え、これを上記の参考文献に記載された条件で脱保護して化合物２５を与えることができる。
〔実施例４：化合物３２の合成〕
トリソプロピルアセチレン２６（１当量、２０ｍｍｏｌ、３．６４ｇ）を乾燥丸底フラスコにアルゴン下で入れ、無水ＴＨＦ（４０ｍｌ）で溶解した。フラスコを－７８℃に置き、ｎ－ＢｕＬｉ（１．５当量、３０ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下し、その後、フラスコを０℃に３０分間置いた。次いで、パラホルムアルデヒド（当量、３ｇ）を１つの陽子イオン中に添加し、当該反応物を室温で１４時間撹拌した。当該混合物を０℃に冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加した。Ｅｔ２Ｏで抽出し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗油をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥＰ／Ｅｔ２Ｏ １：０～１：１）にかけて、無色の油として純粋なアルコール２７（３．３ｇ、１５．５ｍｍｏｌ、７７％）を得た。
27: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 4.30 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.07 (s, 21H).
アルコール２７（３．３ｇ、１５．５ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（１．０５当量、３．２９ｇ）を添加した。フラスコを氷浴中に置き、ピリジン（２．５当量、３８．７５ｍｍｏｌ、３．２ｍＬ）を滴下した。その後、室温で１６時間撹拌した後、ジエチルエーテルで希釈し、セライトでろ過し、Ｅｔ２Ｏでリンスした。溶媒を減圧下で留去し、当該粗混合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤ＥＰ／ＣＨＣｌ３ １：０～０：１）に供し、活性炭－ボロン酸塩２８（５．５６ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、９５％）を無色油として得た。
28: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.42 － 8.18 (m, 2H), 7.45 － 7.34 (m, 2H), 4.85 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 1.07 (s, 21H).
無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＮ－メチル－Ｎ’－アリル－アミノメチルピペリジン１９（１．０当量、０．８６８ｍｍｏｌ、２３３ｍｇ）の溶液に、カーボネート２８（１．１当量、０．９６ｍｍｏｌ、３６２ｍｇ）および炭酸カリウム（５当量、４．４ｍｍｏｌ、６２１ｍｇ）を添加した。ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋２９＝５０８．７）によって判定される反応の完了の際に、当該反応混合物を石油エーテルおよびジエチルエーテルの１：１混合物（１５ｍＬ）で希釈し、セライト上で濾過し、セライトを１００ｍＬのＰＥ／Ｅｔ２Ｏ １：１混合物でリンスした。濾液を減圧下で濃縮して、実質的に純粋なカルバメート２９を淡黄色油として生じ、これを次の工程に直接使用した。
粗カルバメート２９を丸底フラスコに入れ、１，３－ジメチルバルビツール酸（３当量、２．６ｍｍｏｌ、４０６ｍｇ）を添加し、続いてＤＣＭ（８ｍＬ）を添加した。当該溶液をアルゴンで１０分間パージし、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１ｍｏｌ％、１０ｍｇ）を添加し、当該混合物を、室温で、アルゴン下で２０～６０分間撹拌した。並行して、実施例３のように、ＥＬＦ－９７（１．３当量、１．１３ｍｍｏｌ、３４７ｍｇ）をトリホスゲン（１．３当量、１．１３ｍｍｏｌ、３３５ｍｇ）およびピリジン（６当量、５ｍｍｏｌ、０．４１ｍＬ）と反応させ、ＤＣＭ中で連続的に蒸発／溶解させた後、氷冷めっき浴中のＤＣＭ（１０ｍＬ）中に置くことによって、ＥＬＦ クロロホルメートを調製した。ＭＳによって判定される脱アリル化反応の完了後、脱アリル化された２９を含有する溶液をＤＣＭ中のＥＬＦクロロホルメートの冷溶液上にカニューレ挿入し、フラスコをＤＣＭ（２＋２ｍＬ）で２回リンスした。当該反応は室温で１４時間撹拌し、氷浴中に置き、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）を添加した。３０をＥｔ２Ｏで抽出し、有機相を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。Ｅｔ３Ｎ－含浸シリカパッド上での最初の濾過を行い、続いてシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ ０：１～１：０）による、実施例３のように、当該粗混合物の精製は、純粋な３０をガラス状の無色固体をもたらした（４５６ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、６７％、３工程）。（Ｍ＋Ｈ＋ ３０＝７９９．３）。
30: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 8.32 － 8.17 (m, 1H), 8.02 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.72 (pseudoq, J = 2.5, 2.1 Hz, 2H), 7.56 － 7.45 (m, 1H), 7.25 － 7.08 (m, 1H), 4.79 － 4.29 (m, 3H), 4.26 － 3.58 (m, 5H), 3.36 － 2.70 (m, 7H), 1.48 (s, 9H), 1.05 (s, 21H).
純粋な３０（０．４７ｍｍｏｌ、３７６ｍｇ）をフラスコに入れ、工業グレードのＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、氷浴中に置いた。次に、ＴＢＡＦの溶液（１ＭのＴＨＦ溶液、１．０２当量、４７９μＬ）を滴下し、反応物を室温で１６時間撹拌した。フラスコを氷浴中に置き、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍｌ）を滴下した。３１をＥｔ２Ｏで抽出し、水分、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／Ｅｔ２Ｏ ０：１～１：０）による粗混合物の精製は、純粋な３１を無色のガラス状固体（２９４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、９５％）をもたらした。（Ｍ＋Ｈ＋ ３１＝６４４．３）。
31: 1H -NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 8.28 － 8.16 (m, 1H), 8.02 － 7.89 (m, 1H), 7.80 － 7.63 (m, 2H), 7.54 －7.43 (m, 1H), 7.25 － 7.12 (m, 1H), 4.87 － 4.35 (m, 3H), 4.33 － 3.54 (m, 4H), 3.31 － 3.10 (m, 1H), 3.10 － 2.68 (m, 6H), 2.46 － 2.22 (m, 1H), 1.47 (s, 9H).
化合物３１は、Ｐｄ／Ｃｕ共触媒を用いた薗頭カップリングを受けて、実施例３のように、脱保護されることで化合物３２を生じることができる、カップリングされた中間体を与えることができる。

Claims (17)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    ここで：
    －Ｗは－Ｏ－または－ＮＲ１３－であり、Ｒ１３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり；
    －Ｒ１は、フルオレセイン、クマリン、シアニン、フェノキサジンおよびアクリジノンからなる群より選択され；または
    ＷＲ１は式（Ａ１）に記載の芳香族基－ＯＲ１であり：
    ここで：
    －Ｘ２は酸素原子であり、Ｘ１は－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ ６ －Ｃ２４アリール、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－Ｏ－フェニル、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－ＮＨ－フェニル、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、または－Ｓ－（Ｃ ６ －Ｃ２４アリール基）であり、前記アルキル、アリール、アルケニル、およびフェニルの基は任意に置換されているか；
    または、Ｘ２は窒素原子を表し、ＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ１に結合され、任意で置換されているＣ５－Ｃ２４ヘテロアリールを形成しているか、のいずれかであり；
    －
    は任意で置換されたフェニル基、任意で置換されたナフチル基、または
    の中から選択され
    前記基は任意で置換されており；
    Ｘ３はＳ、ＯまたはＮＲｄを表し、Ｒｄは水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキル基を表し；
    －Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は次のいずれかのように定義される：
    ○ Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ４はＣ１－Ｃ４アルキルであるか；
    ○ または、Ｒ３はＣ１－Ｃ４アルキルまたは水素原子であり、Ｒ２とＲ４とが互いに結合され、Ｒ２からＲ４への方向で－（ＣＨ２）ｐ－Ｙｑ－（ＣＨ２）ｒ－鎖を形成し、
    ● ＹはＯ、ＮＲ１４、Ｎ（Ｒ１４）２ ＋またはＳであり、
    ● ｐ＝０、１、２、３、４または５、
    ● ｑ＝０または１、
    ● ｒ＝０、１、２、３、４または５、
    ● ｐ＋ｑ＋ｒ＝３、４、５、または６、
    ● それぞれのＲ１４は、水素原子を表し；
    ○ または、Ｒ２はＣ１－Ｃ４アルキルであり、Ｒ３とＲ４とが互いに結合し、それらが結合する炭素原子と共に脂肪族炭素環を形成し；
    －Ｒ５とＲ６とは同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ ６ －Ｃ１０アリールを表し；
    －Ｒ７は、水素原子、またはＣ１－Ｃ４アルキルおよびＣ１－Ｃ４アルコキシから選択される基であり；
    －Ｒ８は、水素原子を表し；
    －Ｖは、酸素原子または硫黄原子を表し；
    －ｎは０または１であり；
    －Ｚは－Ｓ－、－ＳＯ－、または－ＣＲ９Ｒ１０－であり；Ｒ９およびＲ１０は同一であるか、または異なっており、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－Ｃ４アルキルを表し；
    －ＱはＨ、カチオンまたはＲ１６であり、ここでＲ１６はＣ１－Ｃ６アルキルであり、任意にアリールまたはＯ－（ＣＯ）－Ｒで置換され、Ｒは独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキルおよびＣ３－Ｃ６シクロアルキルから選択され；
    －Ｒ１１は、
    から選択され、
    －Ｘは結合、または
    から選択される基を表す。
  2. 式（Ｉａ）である、請求項１に記載の化合物（Ｉ）：
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、ＸおよびＶは、請求項１に定義されるとおりである。
  3. 式（Ｉｂ）である、請求項１に記載の化合物（Ｉ）：
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、ＸおよびＶは、請求項１に定義されるとおりである。
  4. －ＯＲ１はアリールオキシ種であり、以下の構造（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）の１つに対応する、請求項１に記載の化合物（Ｉ）：
    －
    ここで、
    ○ Ｔは－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）－または－Ｎ（Ｃ ６ －Ｃ２４アリール）－であり；
    ○ Ｒｅは水素原子または－ＣＮもしくは－ＣＯＯＲｈからなる群から選択される基であり、ＲｈはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲｅは－ＣＯＮＲｉＲｊであり、ＲｉおよびＲｊは、同一であるか、または異なっており、ＲｉおよびＲｊは水素原子もしくはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲｅは－ＣＦ３、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、またはヘテロアリールであり、前記ヘテロアリールおよびアルケニルは任意に置換されており；
    ○ Ｒｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素またはフッ素原子、－ＯＨ、－ ＮＨ２、－ＮＲｋＲＩ、－ＮＨＲｋまたは－ＯＲｋであり、ＲｋおよびＲＩは、同一であるか、または異なっており、ＲｋおよびＲＩは、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ４アルキル基を表し；
    ○ または、ＲｅおよびＲｆは、それぞれ互いに結合して、４または５員を含む炭化水素鎖を形成し、飽和または不飽和であり、置換されているか、または非置換であり、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって隔てられていてもよく；
    －
    ここで、
    ○ Ｔ’は－ＮＨ２、－ＯＨ、Ｃ ６ －Ｃ２４アリール基、Ｃ１－Ｃ４アルキル基、－ＳＨ、－ＮＨＲ’ｇ、－ＯＲ’ｇ、－ＮＲ’ｇＲｈ’、－ＳＲ’ｇ、または任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルケニル基、またはヘテロアリールであり、Ｒ’ｇおよびＲｈ’は同一であるか、または異なっており、Ｃ１－Ｃ４アルキル基またはＣ ６ －Ｃ２４アリール基を表し；
    ○ Ｒ’ｅは水素原子または－ＣＮもしくは－ＣＯＯＲ’ｉからなる群から選択される基であり、Ｒ’ｉはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ’ｅは－ＣＯＮＲ’ｊＲ’ｋであり、Ｒ’ｊおよびＲ’ｋは、同一であるか、または異なっており、水素原子、もしくはＣ１－Ｃ４アルキル基を表すか、またはＲ’ｅは－ＣＦ３、もしくは２－オキサゾリル、２－チアゾリル、２－イミダゾリル、２－ベンゾイミダゾリル、４－ピリミジノン－２－イルもしくはキナゾリノン－２－イル基である；
    ○ Ｒ’ｆは水素原子、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素原子、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＲ’ＩＲ’ｍ、またはＯＲ’Ｉであり、Ｒ’ＩおよびＲ’ｍは、同一であるか、または異なっており、Ｃ１－Ｃ４アルキル基を表し；
    ○ またはＲ’ｅおよびＲ’ｆはそれぞれ互いに結合して、４または５員を含む炭化水素鎖を形成し、飽和または不飽和であり、置換されているか、または非置換であり、Ｎ、ＳおよびＯの中から選択される１つ以上のヘテロ原子によって隔てられていてもよく；
    －
    ここで、
    －Ｘ’２は酸素原子であり、Ｘ’１は－ＮＨ２、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ ６ －Ｃ２４アリール、Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｏ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－Ｏ－フェニル、－ＮＨ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、－ＮＨ－フェニル、－Ｓ－（Ｃ１－Ｃ２０アルキル）、または－Ｓ－（Ｃ ６ －Ｃ２４アリール基）であり、前記アルキル基、アリール基、アルケニル基、およびフェニル基は、任意に置換されているか；
    または、Ｘ’ ２は窒素原子を表し、ＣＨ、Ｏ、Ｓ、ＮまたはＮＨを表すＸ’ １に結合され、任意で置換されているＣ５－Ｃ２４ヘテロアリールを形成しているか、のいずれかであり；
    －
    は、任意で置換されているＣ ６ －Ｃ１０アリールまたはＣ５－Ｃ１０ヘテロアリールを表す。
  5. 式（Ｉｃ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    ここで、Ｒ１、Ｒ１１、Ｚ、Ｑ、Ｘおよびｎは請求項１～４のいずれか１項に定義されるとおりであり、Ｙは－ＣＨ２－、－ＮＲ１４－、または－Ｎ（Ｒ１４）２ ＋－を表し、それぞれのＲ１４は、水素原子を表す。
  6. 式（Ｉｄ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    ここで、Ｒ１、Ｒ１１、ＸおよびＱは前記請求項１から５のいずれか１項に定義されるとおりであり、Ｙは請求項５に定義されるとおりである。
  7. 式（Ｉｅ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）：
    ここで、Ｒ１、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、ＸおよびＱは請求項１～５のいずれか１項に定義されるとおりであり、Ｙは請求項５に定義されるとおりである。
  8. 以下の工程を含む、β－ラクタマーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法：
    －分析する試料を請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）に接触するように置くこと、
    －Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
    －蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
    －蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中のβ－ラクタマーゼの有無と相関させる。
  9. 以下の工程を含む、抗生物質耐性菌をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出するための方法：
    －分析する試料を請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）に接触するように置くこと、
    －Ｃ（＝Ｖ）とＮＲ７との間の共有結合を開裂させ、続いて－Ｃ（Ｏ）－ＷＲ１を開裂させて、結合し、ＨＷＲ１の放出をもたらすことによる蛍光沈殿物の形成を可能にするために、適切な条件を適用すること、
    －蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析、
    －蛍光沈殿物の定量的分析または定性的分析を試料中の抗生物質耐性細菌の有無と相関させる。
  10. 請求項１～７に記載の化合物を含む、β－ラクタマーゼを検出するためのキット。
  11. 請求項１～７に記載の化合物を含む、β－ラクタマーゼを検出するための装置。
  12. ヒトにおけるβ－ラクタマーゼのｉｎ ｖｉｖｏ検出のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）。
  13. 式（ＩＩ）の化合物：
    ここで：
    －Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１１、Ｚ、ｎ、Ｑ、ＸおよびＶは請求項１から７のいずれか１項に定義されるとおりであり、
    －Ｒ１２は、水素原子またはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、フルオロフェニルメトキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、および２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基からなる群から選択される基を表す。
  14. 以下の工程を含む、請求項１～７に記載の式（Ｉ）の化合物の調製方法：
    －Ｒ１２は水素原子を表す、請求項１３に記載の化合物（ＩＩ）を、式（ＩＩＩ）の化合物と反応させること
    ここで、Ｒ１は請求項１から７のいずれか１項に定義されるとおりであり、Ｍは、ハロゲン原子、イミダゾリル基、トリアゾリル基、およびパラ－ニトロフェノキシから選択される基を表す：
    －前記化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＩＩ）への付加反応によって化合物（Ｉ）を得ること。
  15. Ｘは
    であり、以下の工程を含む、請求項１～７に記載の式（Ｉ）の化合物の調製方法：
    －次の式の化合物（ＶＩＩ）：
    を式（ＶＩＩＩ）の化合物と反応させること
    －および、前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＶＩＩＩ）との反応によって化合物（Ｉ）を得ること、
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ、およびｎは請求項１～７のいずれか１項に定義されるとおりであり、ＬＧは、ハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナートから選択される基を表す。
  16. Ｘは
    であり、以下の工程を含む、請求項１～７に記載の式（Ｉ）の化合物の調製方法：
    －次の式の化合物（ＶＩＩ）：
    を式（ＩＸ）の化合物の実施と反応させること
    －および、前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（ＩＸ）との反応によって化合物（Ｉ）を得ること、
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ、およびｎは請求項１～７のいずれか１項に定義されるとおりであり、ＬＧは、ハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート）から選択される基を表し、Ｒ１５はＯＨを表し、または各Ｒ１５が互いに結合し、それらが結合するＢ原子と共に、５～１０個の環原子を有する複素環を形成する。
  17. Ｘは
    であり、以下の工程を含む、請求項１～７に記載の式（Ｉ）の化合物の調製方法：
    －次の式の化合物（ＶＩＩ）：
    を式（Ｘ）の化合物と反応させること
    －前記化合物（ＶＩＩ）と化合物（Ｘ）とを反応させて化合物（Ｉ）を得ること、
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｖ、Ｒ１１、Ｑ、Ｗ、Ｚ
    、およびｎは請求項１～１０のいずれか１項に定義されるとおりであり、ＬＧは、ハロゲンおよびトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート）から選択される基を表し、Ｒ１５はＯＨを表し、または各Ｒ１５が互いに結合し、それらが結合するＢ原子と共に、５～１０個の環原子を有する複素環を形成する。
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