JP7793523B2 - 人工多能性幹細胞を用いたｔ細胞集団の製造方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞を用いたｔ細胞集団の製造方法

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Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０２０年１月７日に出願された同時係属中の合衆国仮特許出願第６２／９５７，９３９号の利益を主張しており、参照することでその全体が本明細書に組み込まれる。
連邦支援の研究又は開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所、国立がん研究所により、プロジェクト番号Ｚ０１ＺＩＡ ＢＣ０１０７６３の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のとおり識別されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表：２０２０年１２月２９日付「７５０９２５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ，」と名付けられた１つの７８４バイト ＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の背景
がん反応性Ｔ細胞を用いた養子細胞療法（ＡＣＴ）は、いくらかのがん患者において肯定的な臨床応答を生じさせる。それにもかかわらず、がんや他の状態の治療に対するＡＣＴの首尾よい使用へのいくつかの障害が依然としてある。例えば、がん反応性Ｔ細胞を製造するのに用いられている現在の方法は、かなりの時間を必要とし、がん標的に結合する望ましいＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を容易に同定できないかもしれない。従って、ＡＣＴのための改善された細胞の単離集団の取得方法が必要とされている。
発明の概要
本発明の一実施態様は、ＡＣＴのための単離されたＴ細胞集団の製造方法を提供する。当該方法は、ａ）患者試料を提供すること、ここで該患者試料は（１）腫瘍を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、（２）感染を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、又は（３）自己免疫状態を有する患者由来のＴ細胞を含む試料であり、該Ｔ細胞は少なくとも１つのＴＣＲを含み、該ＴＣＲはα鎖及びβ鎖の対を含む；
ｂ）ａ）の患者試料の他の細胞からＴ細胞を分離して、分離したＴ細胞を製造すること；
ｃ）ｂ）の分離したＴ細胞を培養してＴ細胞人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造すること；
ｄ）ｃ）のＴ細胞ｉＰＳＣを培養してＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造すること；
ｅ）ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞をスクリーニングして、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含む１以上のＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を同定すること、ここで当該目的の抗原は、（１）がん抗原、（２）病原体抗原、又は（３）自己免疫を引き起こす抗原である；並びに
ｆ）ｅ）において、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含むものとして同定されたダブルネガティブＴ細胞を、ナイーブＴ細胞に分化させ、ナイーブＴ細胞の数を増幅させて養子細胞療法のためのＴ細胞の単離集団を製造すること
を含む。
本発明のさらなる実施態様は、当該方法によって製造されたＴ細胞の単離集団、関連する医薬組成物、並びに患者におけるがん、感染及び自己免疫状態の関連する治療又は予防方法を提供する。
図１は、本発明の方法の一実施態様の模式的描写である。 図２は、ＴＣＲ ＡＶ２１－０１、ＣＡＶＲＰＡＲＱＮＦＶＦ（配列番号１）に関するＣＤ８単独又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）－人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株の産生頻度の割合を示すグラフである。変異ＧＢＡＳペプチドに特異的な、ＴＩＬ由来の２３のｉＰＳＣ株が産生された。産生されたＴＩＬ－ｉＰＳＣ株のすべてが、唯一のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖対の遺伝的再構成を示し、それは細胞ソースのそれと同じであった。 図３は、ＴＣＲ ＢＶ０２－０１＊０１、ＣＡＳＳＥＴＧＷＧＡＦＦ（配列番号２）に関するＣＤ８又はＴＩＬ－ｉＰＳＣ株の産生頻度の割合を示すグラフである。変異ＧＢＡＳペプチドに特異的な、ＴＩＬ由来の２３のｉＰＳＣ株が産生された。産生されたＴＩＬ－ｉＰＳＣ株のすべてが、唯一のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖対の遺伝的再構成を示し、それは細胞ソースのそれと同じであった。 図４は、２３のＴＩＬ－ｉＰＳＣ株のうち５つがインビトロでＴ系列細胞に分化したことを示す代表的な蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データを示す。ゲーティングは図に示したとおりであった。選択された５つのＴＩＬ－ｉＰＳＣ株のすべてが、３５日目にＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞を製造した。 図５は、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋のオープンレパトアｉＰＳＣ（ＯＲ－ｉＰＳＣ）の日ごとの割合を示す折れ線グラフである。 図６は、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋のＴＩＬ－ｉＰＳＣの日ごとの割合を示す折れ線グラフである。 図７は、ヒトＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来の未熟Ｔ細胞（ＴＩＬ－ｉＰＳＣ株＃１５）におけるＴＣＲ複合体の早期発現を示す代表的なＦＡＣＳデータを示す。ゲーティングは図に示したとおりであった。 図８Ａ及び８Ｂは、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来のＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ）Ｔ細胞が腫瘍変異に対して特異性を示さないことを示すグラフである。該ダブルポジティブＴ細胞は、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）刺激により活性化（４－１ＢＢ＋）されたが、ＴＩＬ細胞ソースと比較して変異したペプチドによっては活性化されなかった。「ＷＴ」は野生型ペプチド、「Ｍｕｔ」は変異ペプチドを意味する。図８ＡはＣＤ８単独、図８ＢはＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来ダブルポジティブ細胞である。 図９Ａ及び９Ｂは、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来のダブルネガティブＴ細胞が高い腫瘍抗原特異的反応性を有することを示すグラフである。該ダブルネガティブＴ細胞は、ＰＭＡ刺激により、また、変異ペプチドに応答して活性化（４－１ＢＢ＋）されたが、親ＴＩＬがそうであったように野生型ペプチドには応答しなかった。「ＷＴ」は野生型ペプチド、「Ｍｕｔ」は変異ペプチドを意味する。図９ＡはＣＤ８単独、図９ＢはＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来ダブルネガティブ細胞である。 図１０Ａ－１０Ｃは、ＣＤ８ ＴＩＬクローン（図１０Ａ）と同様に、ＤＮ細胞が変異ペプチドに応答してインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生するが、野生型ペプチドには応答しないこと（図１０Ｂ）、ＤＰ細胞はすべての条件を通じて非特異的なＩＦＮγ産生を示すこと（図１０Ｃ）を示すグラフである。
発明の詳細な説明
ａ）腫瘍試料の腫瘍細胞から分離されるＴ細胞に存在するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含み、ｂ）該腫瘍試料の該腫瘍細胞中の腫瘍抗原に対して所望の特異性を有する、多数のＴ細胞を製造する新規な方法が発見されてきた。これらの方法は、多様な利点のうちのいずれか１つ以上を提供し得る。これらの利点は、例えば、腫瘍試料の腫瘍細胞から分離されたＴ細胞に存在する適切なα鎖及びβ鎖対を決定するための予測アルゴリズムや二次スクリーニングを必要としないことを含み得る。さらに、該方法は、腫瘍試料の腫瘍細胞からのＤＮＡ及びＲＮＡの抽出や抽出した配列のシーケンシングを必要としない。該方法は、相当な量の時間を節約し、より多くの患者にＡＣＴが利用可能となり得るかなりのコスト節減を提供し得る。さらに、該方法は、感染（例、ＨＩＶ）を治療するためのウイルス又は細菌抗原に特異的なＴＣＲα鎖及びβ鎖対を同定したり、患者において自己免疫を引き起こす内因性のＴＣＲα鎖及びβ鎖対を同定したりするのに用いることができる。
ｉＰＳＣ技術は、体細胞を、無制限に増幅しかつ任意の種類の体細胞に分化する能力を保持し得る、胚性幹細胞様の段階に初期化することを可能にする。ＴＩＬの腫瘍特異性を提供するＴＣＲは、ゲノム組換えにより産生され、産生したｉＰＳＣ内で受け継がれるので、ＴＩＬの初期化は有益であり得る。ヒトＴＩＬ－ｉＰＳＣのダブルネガティブ未熟Ｔ細胞へのさらなる分化は、標的ペプチドを認識し得るＴＣＲ複合体の早期発現を引き起こす。ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来ダブルネガティブＴ細胞は、以前に産生される他のｉＰＳＣ由来Ｔ細胞（ダブルポジティブ又はＣＤ８シングルポジティブＴ細胞）よりも、標的ペプチドに対して高親和性を示す。それ故、ＴＩＬ－ｉＰＳＣの産生及びダブルネガティブＴ細胞段階におけるそれらのさらなる検証は、ＴＩＬのバルク集団から腫瘍抗原特異的ＴＣＲを見出すための新規なスクリーニング法を開発するのに役立ち得る。これらのＴＣＲは、その後クローン化され、ＡＣＴ治療に用いることができる。
従来法は、反応性Ｔ細胞が少数であるためにシーケンシング効率が制限されることを含めて、いくつかの不利益に見舞われている。この制限は、バルク集団からＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の可能性のある組み合わせを決定するためのアルゴリズムを使用する必要性を引き起こす。従来法はまた。可能性のあるＴＣＲの組み合わせのクローニングと、スクリーニングによるその後のＴＣＲの検証を必要とする。
本発明の一実施態様は、Ｔ細胞の単離集団の製造方法を提供する。当該方法は、腫瘍、感染、又は自己免疫状態を有する患者由来の、Ｔ細胞と細胞を含む患者試料、例えば、（１）がんを有する患者由来のＴ細胞を含む試料、（２）感染を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、又は（３）自己免疫状態を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、を提供することを含み得る。本発明の一実施態様において、がんを有する患者由来のＴ細胞を含む試料は、該患者由来の腫瘍試料である。該腫瘍試料は、シーケンシングのための少なくとも１つのＴＣＲを製造するのに十分な量で存在するＴ細胞を有する、任意の適切な腫瘍試料（液体又は固形）であり得る。該腫瘍試料は、例えば、切除、採血、白血球除去輸血、又は他の適切な手技により得ることができる。
Ｔ細胞は少なくとも１つのＴＣＲを含む。該Ｔ細胞は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、もしくは約１０個、又は前述の数値の任意の範囲（例、約１～約１０、約２～約１０、約１～約９、約２～約９個等）のＴＣＲを含み得る。
ＴＣＲは、一般的に、ＴＣＲのα鎖、ＴＣＲのβ鎖、ＴＣＲのγ鎖、ＴＣＲのδ鎖、又はそれらの組み合わせ等の、２つのポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含む。そのようなＴＣＲのポリペプチド鎖は当該技術分野で公知である。抗原特異的ＴＣＲは、該ＴＣＲが目的の抗原、例えば（１）がｎ抗原、（２）病原体抗原、自己免疫を引き起こす抗原、又はそれらのエピトープに特異的に結合し、免疫学的に認識する限り、任意のアミノ酸配列を含み得る。
当該方法は、患者試料のその他の細胞からＴ細胞を分離してＴ細胞の分離集団と、Ｔ細胞以外の患者試料細胞の分離集団を製造することをさらに含み得る。この分離工程は、任意の適切な技術、例えば、ＦＡＣＳ、磁気的分離（ＭＡＣＳ）、音響的分離、及び動電学的分離を用いて達成することができる。
その他の患者試料細胞から分離されたＴ細胞の集団は、任意の種類のＴ細胞を含み得る。該Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり得る。該Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよいし、また、任意の発生段階のものであってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞（例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔｈ９細胞、ＴＩＬ、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞等が含まれるが、それらに限定されない。該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞であってよい。ナイーブＴ細胞は、それらの周辺内の同種抗原に遭遇していない成熟Ｔ細胞である。ナイーブＴ細胞は、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣ－Ｃケモカイン タイプ７（ＣＣＲ７）表面発現、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４又はＣＤ６９の不存在、メモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの不存在、並びに／あるいは、サブユニットＩＬ－７受容体α、ＣＤ１２７及び共通γ鎖ＣＤ１３２を含む機能的なＩＬ－７受容体の発現により共通して特徴づけられる。好ましい実施態様において、該Ｔ細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
当該方法は、患者試料の他の細胞からＴ細胞を分離して、分離されたＴ細胞を製造することをさらに含み得る。該Ｔ細胞は、任意の適切な技術、例えば、ＦＡＣＳ、磁気的分離（ＭＡＣＳ）、音響的分離、及び動電学的分離を用いて、患者試料の他の細胞から分離することができる。
当該方法は、分離されたＴ細胞を培養して、Ｔ細胞ｉＰＳＣを製造することをさらに含み得る。Ｔ細胞を任意の適切な技術を用いて培養し、Ｔ細胞ｉＰＳＣを製造することができる。例えば、分離されたＴ細胞は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体からの刺激を受ける、並びに／あるいは、山中因子（即ち、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（Ｋｌｆ４）、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス遺伝子２（Ｓｏｘ２）、オクタマー結合転写因子３／４（Ｏｃｔ３／４）、及びＭＹＣがん原遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ））及びＳＶ４０の配列を導入（例えば、ベクターを用いて）することができる（例えば、Vizcardo, et al., Cell Stem Cell, 12: 31-36 (2013)を参照）。該Ｔ細胞を、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、又はそれらの２以上の組み合わせの存在下で培養することができる。あるいは、ｉＰＳＣは、ＲＮＡ発現、タンパク質導入、初期化遺伝子の化学的誘導、初期化に必須の遺伝子経路（例、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ等）の上流もしくは下流のターゲッティングによる活性化、又はこれらの技術の任意の組み合わせによって製造することができる。
当該方法は、Ｔ細胞ｉＰＳＣを培養してＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造することをさらに含み得る。ダブルネガティブＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８コレセプターを発現しない。ダブルネガティブＴ細胞を、共通リンパ球前駆（ＣＬＰ）細胞から分化させ、胸腺に移植する。該Ｔ細胞ｉＰＳＣを、任意の適切な技術を用いて培養し、ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造することができる。
当該方法は、ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞をスクリーニングして、目的の抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含む１以上のＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を同定することをさらに含み得る。
当該方法は、目的の抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含むものとして同定されたダブルネガティブＴ細胞を、ナイーブＴ細胞に分化させることをさらに含み得る。該細胞は任意の適切な技術を用いて分化させることができる。
本発明の一実施態様において、当該方法は、該ＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードする配列を得ることを含む。本工程にために、ネステッドＰＣＲ又は適応スクリーニングによるアラインメントを用いることができ、あるいは別の適切な技術を用いることができる。
本発明の一実施態様において、当該方法は、例えば、ベクターを用いて、ナイーブＰＭＢＣに該ＴＣＲのα鎖及びβ鎖対の配列を導入することを含む。例えば、Johnson et al., Blood, 114: 535-546 (2009) に記載されるようなレトロウイルスベクターを用いることができる。あるいは、以下の技術を用いることができる：（１）例えば、Roth et al., Nature, 559: 405-409 (2018) に記載されるようなターゲティッドインテグレーションを用いて；（２）例えば、Peng et al., Gene Ther., 16: 1042-1049 (2009) に記載されるようなトランスポゾンを用いて；並びに（３）例えば、Zhao et al., Mol. Ther., 13: 151-159 (2006) に記載されるような一過的に発現するＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）を用いて、あるいは別の適切な技術を用いて。ＰＢＭＣは異系であってもよいが、好ましい実施態様においては、ＰＢＭＣは患者自身のものである。
ＡＣＴのための細胞の単離集団を提供するのに用いられるＰＢＭＣは、任意の適切なＰＢＭＣ、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、Ｂ細胞、樹状細胞、又はそれらの2以上の組み合わせであり得る。好ましい実施態様においては、ＰＢＭＣはＴ細胞である。
本発明の一実施態様において、当該方法は、患者から患者試料（例、腫瘍試料）を取り出した後、たった約３０日以内に、該患者がＡＣＴのための細胞集団（目的の抗原に特異的な１以上のＴＣＲを有する）を受容することを可能にする。例えば、患者は、該患者から試料を取り出した後、たった約２８日以内、約２６日以内、約２４日以内、約２２日以内、約２０日以内、約１８日以内、約１６日以内、約１５日以内、約１４日以内、約１３日以内、約１２日以内、約１１日以内、約１０日内、約９日以内、約８日以内、約７日以内、約６日以内、約５日以内、約４日以内、約３日内、又は約２日以内に、ＡＣＴのための細胞集団（目的の抗原に特異的な１以上のＴＣＲを有する）を受容し得る。
本発明の一実施態様において、本発明の方法によって同定されたＴ細胞のＴＣＲは、腫瘍細胞の腫瘍（即ち、がん抗原）に対して抗原特異性を有する。本発明のさらなる実施態様において、本発明の方法によって同定されたＴ細胞のＴＣＲは、腫瘍細胞の１以上の腫瘍抗原に特異的に結合する。本明細書において用いられる「がん抗原」及び「腫瘍抗原」なる用語は、該抗原が腫瘍又はがんと関連するように、腫瘍細胞又はがん細胞で専ら又は支配的に発現するか、過剰発現する任意の分子（例、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物等）を意味する。がん抗原は、さらに、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞でも発現し得る。しかし、そのような場合、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞でのがん抗原の発現は、腫瘍又はがん細胞での発現ほど頑強ではない。この点に関し、腫瘍又はがん細胞は該抗原を過剰発現するか、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞での該抗原と比較して、該抗原を有意に高レベルで発現することができる。また、がん抗原は発生又は成熟の異なる段階の細胞でもさらに発現し得る。例えば、がん抗原は、成体宿主内では通常見出されない胚又は胎生段階の細胞でもさらに発現し得る。あるいは、がん抗原は、成体宿主内では通常見出されない幹細胞又は前駆細胞でもさらに発現し得る。一実施態様において、ＴＣＲα鎖及β鎖対はメラノーマ抗原に対して特異性を有する。
がん抗原は、本明細書において記載されるがん及び腫瘍を含む、任意のがん又は腫瘍の任意の細胞で発現する抗原であり得る。がん抗原は、たった１種のがん又は腫瘍のがん抗原であってよく、該がん抗原はたった1種のがん又は腫瘍と関連し、又はそれに特徴的である。あるいは、がん抗原は、２種以上のがん又は腫瘍のがん抗原であってもよい（例えば、それらに特徴的であってもよい）。例えば、がん抗原は、乳がん細胞と前立腺がん細胞の両方で発現してもよいし、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞で全く発現しなくてもよい。がん抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、ＣＸｏｒｆ６１、メソテリン、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＡＧ－３としても知られる）、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３等が挙げられる。
がんは、急性リンパ球性がん、急性ミエロイド性白血病、骨がん、脳のがん、乳がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性ミエロイド性がん、胆管がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん（例、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、並びに膀胱がんを含む、任意のがんであってよい。ある好適な実施態様において、抗原特異的受容体はメラノーマに対して特異性を有する。
本発明の一実施態様において、がん抗原はがんネオアンチゲンである。がんネオアンチゲンは、がん特異的変異によりコードされる、免疫原性の変異アミノ酸配列である。がんネオアンチゲンは、正常の非がん性細胞では発現せず、患者に特有であり得る。がんネオアンチゲンに対して抗原特異性を有するＴ細胞を用いたＡＣＴは、該患者のための「個別化」治療を提供し得る。
いくつかの実施態様において、腫瘍試料は、がんの抗原もしくはがんに特異的な抗原で免疫された患者に由来する。患者から腫瘍試料を得る前に該患者を免疫することができる。このようにして、腫瘍は、治療すべきがんに対して特異性を有するように誘導されたＴ細胞を含むことができ、がんに特異的な細胞のより高度な集団を含み得る。
本発明の一実施態様において、本発明の方法によって同定されたＴ細胞のＴＣＲは、感染を引き起こす微生物もしくはウイルス（例、ウイルス、細菌、菌類、又は寄生虫）上に存在する抗原に対して抗原特異性を有する。例えば、本発明の方法によって同定されたＴ細胞のＴＣＲは、ウイルス、例えばＨＩＶ上に存在する抗原に対して抗原特異性を有する。
本発明のさらなる実施態様において、発明の方法によって同定されたＴ細胞のＴＣＲは、患者において自己免疫を引き起こす内因性のＴＣＲα鎖及びβ鎖対に対して特異性を有する。
本明細書において用いられる「核酸」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかのポリマー形態を意味する。これらの用語は、当該分子の一次構造を意味し、従って、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、並びに二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。当該用語は、均等物として、ヌクレオチドアナログ及び修飾ポリヌクレオチド（例えば、メチル化及び／又はキャップ化されたポリヌクレオチドが挙げられるが、それらに限定されない）から作製されるＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログを含む。本発明の一実施態様において、核酸は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。
本明細書において用いられる「ヌクレオチド」なる用語は、ヘテロ環塩基、糖、及び１以上のリン酸基からなる、ポリヌクレオチドのモノマーサブユニットを意味する。本発明は、天然に存在する塩基アナログ及び天然に存在しない塩基アナログの使用を含むが、天然に存在する塩基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ））は、プリン又はピリミジンの典型的な誘導体である。本発明は、天然に存在する糖アナログ及び天然に存在しない糖アナログの使用を含むが、天然に存在する糖は、ペントース（５炭糖）であるデオキシリボース（ＤＮＡを形成する）又はリボース（ＲＮＡを形成する）である。多くの他の結合が当該技術分野で知られているが（例、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート等）、核酸は通常、リン酸結合を介して連結され、核酸、即ちポリヌクレオチドを形成する。ポリヌクレオチドの調製方法は当該技術分野における通常の技術の範囲である (Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (4th Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012))。
本明細書に記載される核酸は、組換え発現ベクターの中に組み込むことができる。ここでの目的のために、「組換え発現ベクター」なる用語は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現を可能にする遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの構築物であって、該構築物が該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ベクターが該細胞内で該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で該細胞に接触した場合に、発現が可能となる構築物を意味する。該ベクターは、全体として天然に存在しなくてもよい。しかし、該ベクターの一部は天然に存在するものであり得る。該組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがそれらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含むことができ、それは一本鎖又は二本鎖であってよく、合成されても、部分的に天然のソースから得られてもよく、また、天然、非天然もしくは変化したヌクレオチドを含んでもよい。組換え発現ベクターは、天然に存在する、もしくは非天然のヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含み得る。好ましくは、非天然もしくは変化したヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、該ベクターの転写及び複製を妨げない。本発明の方法に有用であり得る組換え発現ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター（例、１以上のレトロウイルスベクター、γ－レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター）、及びトランスポゾンが挙げられるが、それらに限定されない。該ベクターは、次に、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4thEd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012) に記載されるような、例えば、遺伝子編集、トランスフェクション、形質転換、又は形質導入等の任意の適切な技術によって、細胞内に導入され得る。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で知られており、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム介在性トランスフェクション、タングステン粒子により促進される微粒子衝撃、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿が挙げられる。ファージ又はウイルスベクターを、適切なパッケージング細胞内で感染性粒子を増殖させた後、宿主細胞に導入することができ、それらの多くは市販されている。
本発明の一実施態様において、当該方法は、ナイーブＴ細胞の数を増幅させて、ＡＣＴのためのＴ細胞の単離集団を製造することをさらに含む。この増幅は、（ａ）１以上のサイトカイン及び（ｂ）１以上の非特異的Ｔ細胞刺激の1つ又は両方を用いて行うことができる。非特異的Ｔ細胞刺激の例としては、放射線照射された異系フィーダー細胞、放射線照射された自己フィーダー細胞、抗ＣＤ３抗体（例、ＯＫＴ３抗体）、抗４－１ＢＢ抗体、及び抗ＣＤ２８抗体のうちの１以上が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施態様においては、非特異的Ｔ細胞刺激は、ビーズにコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体であり得る。任意の１以上のサイトカインを本発明の方法に用いることができる。細胞数を増幅するのに有用であり得るサイトカインの例としては、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
細胞数の増幅は、例えば、合衆国特許第８，０３４，３３４号、合衆国特許第８，３８３，０９９号、及び合衆国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号に記載されるような当該技術分野で公知の多くの方法のいずれかにより達成することができる。例えば、細胞数の増幅は、ＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例、放射線照射した異系ＰＢＭＣ）とともに細胞を培養することにより実施することができる。
本発明の一実施態様は、本明細書に記載される本発明の方法のいずれかにより製造されたＴ細胞の単離又は精製された集団をさらに提供する。本発明の方法により製造されたＴ細胞の集団は、多くの利点のうちのいずれか１つ以上を提供し得る。
本発明の方法に従って製造された細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞、例えば、Ｔ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて、本明細書に記載された細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、本発明の方法により製造された細胞集団は、主として本明細書に記載された細胞、例えば、Ｔ細胞を含む実質的に均一な集団であり得る。該集団はまた、集団のすべての細胞が単一の細胞、例えば、Ｔ細胞のクローンであるクローン化された細胞集団であり得る。本発明の一実施態様において、該細胞集団は、本明細書に記載された抗原特異的受容体をコードする組換え発現ベクターを含む細胞、例えば、Ｔ細胞を含むクローン化された集団である。
本発明の方法に従って製造された本発明の単離又は精製された細胞集団は、例えば、医薬組成物等の組成物中に含まれ得る。この点に関し、本発明の一実施態様は、本明細書に記載された単離又は精製された細胞集団及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
好ましくは、該担体は医薬上許容される担体である。医薬組成物に関して、担体は、細胞の投与のために従来より使用されているいかなるものであってよい。そのような医薬上許容される担体は当業者にとって周知であり、公衆に容易に利用可能である。医薬上許容される担体は、使用する条件下で有害な副作用又は毒性を有しないものであることが好ましい。
担体の選択は、部分的には、細胞集団を投与するのに用いられる特定の方法により決定されるだろう、従って、本発明の医薬組成物の種々の適切な処方がある。適切な処方には、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、又は腹腔内投与のための処方のいずれかが挙げられる。１以上の経路を用いて細胞集団を投与することができ、ある例では、特定の経路は、他の経路よりもより早急かつより有効な応答を提供し得る。
好ましくは、該細胞集団は、注射（例、静脈内）により投与される。注射用の細胞のための適切な医薬上許容される担体としては、例えば、通常の食塩水（水中約０．９０％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ電解液（Abbott, Chicago, IL）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Baxter, Deerfield, IL）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液のような任意の等張の担体が挙げられる。一実施態様において、医薬上許容される担体はヒト血清アルブミンで補充される。
患者に投与されるＴ細胞は、患者にとって他家でも自家でもよい。「自家」投与法では、細胞を患者から取り出し、保存し（及び任意で修飾し）、同じ患者に戻す。「他家」投与法では、患者は、遺伝的に類似するが、同一ではないドナーから細胞を受容する。好ましくは、Ｔ細胞は患者にとって自家である。自家細胞は、有利なことに、例えば、移植片対宿主病のような異系細胞を標的化し得る望ましくない免疫応答を軽減又は回避することができる。
Ｔ細胞が患者にとって自家である例では、患者は、該患者からの試料の単離に先立って、免疫学的にナイーブでも、感作されていてもよく、又は他の状態にあってもよい。いくつかの例では、当該方法は患者からの試料の単離に先立って、目的の抗原で該患者を免疫感作することを含むのが好ましい。
本発明の一実施態様によれば、がん患者を、ワクチンによる免疫を含めて、そのがん由来であるか、それに関連する抗原で治療的に免疫することができる。いかなる特定の理論又は機序に縛られることを望まないが、該ワクチン又は免疫原は、腫瘍内に存在するがん抗原に対する患者の免疫応答を増強するために提供される。そのような治療的免疫としては、養子免疫療法の一部として治療的にワクチンとして使用され得る、組換え又は天然のがんタンパク質、ペプチド、又はそのアナログ、あるいは修飾されたがんペプチド、又はそのアナログの使用が挙げられるが、それらに限定されない。該ワクチン又は免疫原は、細胞、細胞ライセート（例、組換え発現ベクターでトランスフェクトされた細胞由来）、組換え発現ベクター、又は抗原性タンパク質もしくはポリペプチドであり得る。あるいは、該ワクチン又は免疫原は、部分的にもしくは実質的に精製された組換えがんタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はそのアナログ、あるいは、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はそのアナログであり得る。該タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、リポタンパク質とコンジュゲートするか、リポソームの形態又はアジュバントとともに投与され得る。好ましくは、該ワクチンは、（ｉ）抗原特異的受容体が抗原特異性を有するがん抗原、（ｉｉ）該抗原のエピトープ、及び（ｉｉｉ）該抗原もしくは該エピトープをコードするベクターの1以上を含む。
本発明の目的のために、用量、例えば、投与される細胞数は、患者において、合理的な時間枠にわたって効果、例えば、治療もしくは予防効果を発揮するのに十分であるべきである。例えば、投与される細胞数は、投与時から約2時間以上の期間、例えば、１２～２４時間以上、目的の抗原に結合するか、がん、感染、及び／又は自己免疫状態を治療もしくは予防するのに十分であるべきである。ある実施態様において、該期間はさらに長くてもよいだろう。投与される細胞数は、投与されるべき特定の細胞集団の効力、及び動物（例、ヒト）の状態、並びに治療されるべき動物（例、ヒト）の体重によって決定されるだろう。
投与される細胞数を決定する多くの方法が当該技術分野で知られている。本発明の目的のために、、各々異なる数の細胞、例えばＴ細胞を与えられた一連の患者群の中の患者に、所定数のそのような細胞を投与することによって、標的細胞が溶解する、あるいは、例えばＩＦＮ－γやＩＬ－２のような１以上のサイトカインが分泌する程度を比較することを含むアッセイを用いて、患者に投与すべき開始の数を決定することができるだろう。ある数の投与によって、標的細胞が溶解する、あるいは、例えばＩＦＮ－γやＩＬ－２のようなサイトカインが分泌する程度は、当該技術分野で公知の方法により圧制することができる。例えばＩＬ－２のようなサイトカインの分泌はまた、Ｔ細胞製剤の品質（例、表現型及び／又は有効性）の指標を提供する。
投与される細胞数はまた、特定の細胞集団の投与に付随し得る任意の不利な副作用の存在、性質及び程度によって決定されるだろう。通常、主治医は、年齢、体重、一般的な健康状態、食事、性別、投与経路、及び治療すべき病態の重篤度のような種々の要素を考慮に入れて、個々の患者を治療する細胞数を決定する。一例としてであって本発明を限定しようとするものではないが、投与される細胞、例えばＴ細胞の数は、１点滴あたり約１０ｘ１０６～約１０ｘ１０１１細胞、１点滴あたり約１０ｘ１０９細胞～約１０ｘ１０１１細胞、又は１点滴辺り１０ｘ１０７～約１０ｘ１０９細胞であり得る。
本発明の方法に従って製造されたＴ細胞集団は、患者におけるがんの治療又は予防方法に使用し得ることが期待される。この点に関し、本発明の一実施態様は、患者におけるがんの治療又は予防に有効な量で、（ｉ）本明細書に記載されたいずれかの方法に従って製造された細胞を患者に投与するか、あるいは（ｉｉ）本明細書に記載されたいずれかの単離された細胞集団もしくは医薬組成物を患者に投与することを含む、該患者におけるがんの治療又は予防方法を提供する。
本発明の一実施態様において、がんの治療又は予防方法は、細胞又は医薬組成物を、患者における転移を低減するのに有効な量で該患者に投与することを含み得る。例えば、本発明の方法は転移結節を低減し得る。
本発明の方法に従って製造されたＴ細胞集団はまた、患者における感染の治療又は予防方法に使用し得ることが期待される。この点に関し、本発明の一実施態様は、患者における自己免疫状態の治療又は予防に有効な量で、（ｉ）本明細書に記載されたいずれかの方法に従って製造された細胞を患者に投与するか、あるいは（ｉｉ）本明細書に記載されたいずれかの単離された細胞集団もしくは医薬組成物を患者に投与することを含む、該患者における自己免疫状態の治療又は予防方法を提供する。
本発明の方法に従って製造されたＴ細胞集団はさらに、患者における自己免疫状態の治療又は予防方法に使用し得ることが期待される。この点に関し、本発明の一実施態様は、患者における感染の治療又は予防に有効な量で、（ｉ）本明細書に記載されたいずれかの方法に従って製造された細胞を患者に投与するか、あるいは（ｉｉ）本明細書に記載されたいずれかの単離された細胞集団もしくは医薬組成物を患者に投与することを含む、該患者における感染の治療又は予防方法を提供する。
１以上のさらなる治療剤を患者に共投与することができる。本明細書における「共投与」の使用は、１以上のさらなる治療剤と単離された細胞集団とを、単離された細胞集団が１以上のさらなる治療剤の効果を増強し得る（逆もまた同様）ように、時間的に十分近く投与することを意味する。この点に関し、単離された細胞集団を最初に投与し、１以上のさらなる治療剤を2番目に投与することができ、その逆もまた同様である。あるいは、単離された細胞集団と１以上のさらなる治療剤とを同時に投与することもできる。単離された細胞集団の機能を増強し得るさらなる治療剤としては、例えば、１以上のサイトカイン又は１以上の抗体（例、ＰＤ－１の機能を阻害する抗体）が挙げられる。単離された細胞集団と共投与され得る治療剤の例はＩＬ－２である。いかなる理論や機序に縛られることなく、ＩＬ－２は、細胞、例えばＴ細胞の単離集団の治療効果を増強し得ると信じられている。
本発明の一実施態様は、単離された細胞集団に投与に先立って、患者のリンパ球を枯渇させることをさらに含む。リンパ球枯渇化の例としては、非骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身放射線照射等が挙げられるが、それらに限定されない。
「治療する」及び「予防する」並びにそれらから派生する用語は、本明細書において用いられるように、必ずしも１００％又は完全な治療又は予防を意味しない。むしろ、当業者が可能性のある利益又は治療効果を有すると認識する治療又は予防の程度は変動する。この点に関し、本発明の方法は、患者における任意のレベルの任意の量のがんの治療又は予防を提供し得る。さらに、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防すべき疾患、例えばがん、の１以上の状態もしくは症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、疾患、又はその症状もしくは状態の発症又は再発の遅延を包含し得る。
本明細書において用いられる「単離された」なる用語は、その天然の環境から取り出されたことを意味する。本明細書において用いられる「精製された」なる用語は、純度が増大したことを意味し、ここで「純度」は相対的な用語であって、必ずしも絶対的な純度を解釈すべきではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であってよく、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％より大きくてもよく、あるいは約１００％であってもよい。
特にことわらない限り、本明細書で用いられる「患者」なる用語は、任意の哺乳動物を意味し、ウサギ等のウサギ目、ネコ及びイヌを含む食肉目、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目の哺乳動物が挙げられるが、それらに限定されない。該哺乳動物は非ヒト霊長類、例えば、霊長目、セボイド目（Ceboids）又はサイモイド目（Simoids）（サル）あるいは類人目（ヒトおよび類人猿）であることが好ましい。いくつかの実施態様においては、哺乳動物はマウスやハムスター等の齧歯目であり得る。別の実施態様においては、哺乳動物はマウスではない。好ましくは、哺乳動物は非ヒト霊長類又はヒトである。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
本発明の方法に関して、がんは任意のがんであってよく、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたいずれかのがんが挙げられる。
本開示の非限定的態様の例
実施態様を含む、本明細書に記載された本主題の態様は、単独で、あるいは１以上の他の態様又は実施態様と組み合わせて有益であり得る。先行する記載を限定することなく、（１）～（２０）の番号をつけた本開示のある非限定的な態様を以下に示す。本開示に接した当業者に明らかなように、個々に番号づけられた態様は、先行する、又はその後の個々に番号づけられた態様とともに使用され、又は組合され得る。これは、すべてのそのような態様の組み合わせに対するサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
（１）養子細胞療法のためのＴ細胞の単離集団の製造方法であって、
ａ）患者試料を提供すること、ここで該患者試料は（１）腫瘍を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、（２）感染を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、又は（３）自己免疫状態を有する患者由来のＴ細胞を含む試料であり、該Ｔ細胞は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、該ＴＣＲはα鎖及びβ鎖の対を含む；
ｂ）ａ）の患者試料の他の細胞からＴ細胞を分離して、分離したＴ細胞を製造すること；
ｃ）ｂ）の分離したＴ細胞を培養してＴ細胞人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造すること；
ｄ）ｃ）のＴ細胞ｉＰＳＣを培養してＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造すること；
ｅ）ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞をスクリーニングして、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含む１以上のＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を同定すること、ここで当該目的の抗原は、（１）がん抗原、（２）病原体抗原、又は（３）自己免疫を引き起こす抗原である；並びに
ｆ）ｅ）において、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含むものとして同定されたダブルネガティブＴ細胞を、ナイーブＴ細胞に分化させ、ナイーブＴ細胞の数を増幅させて養子細胞療法のためのＴ細胞の単離集団を製造すること
を含む、方法。
（２）ＴＣＲのα鎖及びβ鎖対をコードする配列を得ることをさらに含む、態様（１）に記載の方法。
（３）ナイーブ末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）にＴＣＲのα鎖及びβ鎖対の配列を導入し、養子細胞療法のための単離された細胞集団を製造することをさらに含む、態様（２）に記載の方法。
（４）ａ）のＴ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、態様（１）～（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）又はそれらの２以上の組み合わせの存在下で、ｃ）のＴ細胞を培養することをさらに含む、態様（１）～（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）目的の抗原ががん抗原である、態様（１）～（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）ＴＣＲα鎖及びβ鎖対ががん抗原に対して特異性を有する、態様（１）～（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）１以上のベクターを用いて、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖対の配列をナイーブＰＭＢＣに導入する、態様（３）～（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）ベクターがウイルスベクターである、態様（８）に記載の方法。
（１０）ベクターがレトロウイルスベクター、γ-レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである、態様（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）ＰＭＢＣが末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、Ｂ細胞、樹状細胞、又はそれらの２以上の組み合わせである、態様（３）～（１０）のいずれか一項に記載の方法。
（１２）態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により製造されたＴ細胞の単離集団。
（１３）態様（１２）に記載のＴ細胞の単離集団及び医薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
（１４）患者におけるがんの治療又は予防方法であって、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造し、該単離されたＴ細胞集団を、該患者におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で、該患者に投与することを含む、方法。
（１５）患者における感染の治療又は予防方法であって、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造し、該単離されたＴ細胞集団を、該患者における感染を治療又は予防するのに有効な量で、該患者に投与することを含む、方法。
（１６）患者における自己免疫状態の治療又は予防方法であって、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造し、該単離されたＴ細胞集団を、該患者における自己免疫状態を治療又は予防するのに有効な量で、該患者に投与することを含む、方法。
（１７）患者におけるがんの治療又は予防に使用するための、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団、又は態様（１３）に記載の組成物。
（１８）患者における感染の治療又は予防に使用するための、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団、又は態様（１３）に記載の組成物。
（１９）患者における自己免疫状態の治療又は予防に使用するための、態様（１）～（１１）のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団、又は態様（１３）に記載の組成物。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、いずれにせよ、それらが本発明の範囲を限定すると解すべきでないことは言うまでもない。
実施例１
本実施例は、ｉＰＳＣを用いて、ＡＣＴのためのＴ細胞の単離集団を首尾よく製造し得ることを実証する。
まず、腫瘍試料は、α鎖及びβ鎖対を含むＴＣＲを有するＴ細胞を含む患者から提供された。次に、ＦＡＣＳを用いて、該Ｔ細胞を腫瘍細胞から分離した。次に、該Ｔ細胞を標準的な技術を用いて培養し、Ｔ細胞ｉＰＳＣを製造した。次に、該Ｔ細胞ｉＰＳＣを標準的な技術を用いて培養し、ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造した。次に、該ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブＴ細胞をスクリーニングして、目的のα鎖及びβ鎖対を含むＴＣＲ（該患者の腫瘍細胞に対して抗原特異性を有するもの）を有するＴ細胞を同定した。次に、目的のＴ細胞をナイーブＴ細胞に分化させ、増幅させてナイーブＴ細胞の大集団を製造した。本方法を図１に図説する。
実施例２
本実施例は、ｉＰＳＣ技術を用いて、体細胞を胚性幹細胞様の段階に初期化することができ、任意の種類の体細胞に分化する能力を保持しつつ、その数を無限に増幅させ得ることを実証する。
変異ＧＢＡＳペプチドに特異的なＴＩＬから２３のｉＰＳＣ株を製造した。生成したＴＩＬ－ｉＰＳＣ株はすべて、ＴＣＲα鎖及びβ鎖対の唯一の遺伝的再構成を示し、それは細胞ソースのそれと同一であった。図２は、ＴＣＲ ＡＶ２１－０１に関するＣＤ８単独又はＴＩＬ－ｉＰＳＣ株での産生頻度の割合を示す。図３は、ＴＣＲ ＢＶ０２－０１＊０１に関するＣＤ８単独又はＴＩＬ－ｉＰＳＣ株での産生頻度の割合を示す。
２３のｉＰＳＣ株のうち５つがインビトロでＴ系列細胞に分化した。図４は、当該分化を説明するＦＡＣＳデータを示す。選択されたＴＩＬ－ｉＰＳＣ株のすべてが、35日目までにＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞を産生した。図５は、ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋のオープンレパトアｉＰＳＣ（ＯＲ－ｉＰＳＣ）の日ごとの割合を示す。ＣＤ３＋ＴＣＲａｂ＋のＴＩＬ－ｉＰＳＣの日ごとの割合を示す。
図７は、ヒトＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来の未熟Ｔ細胞（ＴＩＬ－ｉＰＳＣ株＃１５）におけるＴＣＲ複合体の早期発現を説明するＦＡＣＳデータを示す。
実施例３
本実施例は、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来のＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ）Ｔ細胞は、腫瘍の変異に対して特異性を示さないが、ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来のＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞は高い腫瘍抗原特異的な反応性を示すことを実証する。
ダブルポジティブＴ細胞は、図８Ａ（ＣＤ８単独）及び８Ｂ（ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来ダブルポジティブ細胞）にみられるように、ＰＭＡ刺激により活性化（４－１ＢＢ＋）されたが、ＴＩＬ細胞ソースと比較して、変異ペプチドによっては活性化されなかった。ダブルネガティブＴ細胞は、図９Ａ（ＣＤ８単独）及び９Ｂ（ＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来ダブルネガティブ細胞）にみられるように、親のＴＩＬがそうであるのと同様、ＰＭＡ刺激により活性化（４－１ＢＢ＋）され、変異ペプチドに応答したが、野生型ペプチドには応答しなかった。
実施例４
本実施例は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ）Ｔ細胞はＩＦＮγ産生によるスクリーニングには使用できないが、ダブルネガティブ細胞はそのようなスクリーニングに使用できることを実証する。
３７日目のＴＩＬ－ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ、ＤＮ）及びＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ、ＤＰ）マーカーによりソーティングした。これらの集団、並びに元のＣＤ８ ＴＩＬクローンを、変異ペプチド、野生型ペプチド又はＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）でパルスした他家Ｂ細胞と共培養した。ポジティブコントロールはＰＭＡ／イオノマイシンであった。共培養６時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞内サイトカイン産生のために染色した。ダブルネガティブ細胞は、ＣＤ８ ＴＩＬクローンと同様、変異ペプチドに応答してＩＦＮγ産生を示したが、野生型ペプチドには応答しなかった（図１０Ｂ）。ＤＰ細胞はすべての条件を通じて非特異的なＩＦＮγ産生を示した（図１０Ｃ）。フローサイトメトリー解析は、生存リンパ球、ＣＤ３＋でゲーティングした。ＣＤ８ ＴＩＬクローンについてはＮ＝１、ＤＮ及びＤＰについてはＮ＝２。すべての実験についてｎは３であった。
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１の」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１の」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１の」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項（Ａ若しくはＢ）から選択された１の事項又は列挙した事項（Ａ及びＢ）のうち２以上の任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

Claims (15)

  1. 養子細胞療法のためのＴ細胞の単離集団の製造方法であって、
    ａ）患者試料を提供すること、ここで該患者試料は（１）腫瘍を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、（２）感染を有する患者由来のＴ細胞を含む試料、又は（３）自己免疫状態を有する患者由来のＴ細胞を含む試料であり、該Ｔ細胞は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、該ＴＣＲはα鎖及びβ鎖の対を含む；
    ｂ）ａ）の患者試料の他の細胞からＴ細胞を分離して、分離したＴ細胞を製造すること；
    ｃ）ｂ）の分離したＴ細胞を培養してＴ細胞人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造すること；
    ｄ）ｃ）のＴ細胞ｉＰＳＣを培養してＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を製造すること；
    ｅ）ＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞をスクリーニングして、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含む１以上のＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブ）Ｔ細胞を同定すること、ここで当該目的の抗原は、（１）がん抗原、（２）病原体抗原、又は（３）自己免疫を引き起こす抗原である；並びに
    ｆ）ｅ）において、目的の抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲα鎖及びβ鎖対を含むものとして同定されたダブルネガティブＴ細胞を、ナイーブＴ細胞に分化させ、ナイーブＴ細胞の数を増幅させて養子細胞療法のためのＴ細胞の単離集団を製造すること
    を含む、方法。
  2. ＴＣＲのα鎖及びβ鎖対をコードする配列を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. ナイーブ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にＴＣＲのα鎖及びβ鎖対の配列を導入し、養子細胞療法のための単離された細胞集団を製造することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. １以上のベクターを用いて、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖対の配列をナイーブＰＢＭＣに導入する、請求項３に記載の方法。
  5. ベクターがウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
  6. ベクターがレトロウイルスベクター、γ-レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである、請求項４又は５に記載の方法。
  7. ＰＢＭＣが末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、Ｂ細胞、樹状細胞、又はそれらの２以上の組み合わせである、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ａ）のＴ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）又はそれらの２以上の組み合わせの存在下で、ｃ）のＴ細胞を培養することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 目的の抗原ががん抗原である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＴＣＲα鎖及びβ鎖対ががん抗原に対して特異性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 医薬の製造方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造するステップ、及び単離されたＴ細胞集団を医薬に製剤化するステップを含む、方法。
  13. 患者におけるがんの治療又は予防に使用するための医薬の製造のための方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造するステップ、及び単離されたＴ細胞集団を医薬に製剤化するステップを含む、方法。
  14. 患者における感染の治療又は予防に使用するための医薬の製造のための方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造するステップ、及び単離されたＴ細胞集団を医薬に製剤化するステップを含む、方法。
  15. 患者における自己免疫状態の治療又は予防に使用するための医薬の製造のための方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法により単離されたＴ細胞集団を製造するステップ、及び単離されたＴ細胞集団を医薬に製剤化するステップを含む、方法。
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