JP7793802B2 - ペプシン消化率に優れた高たんぱく微細藻類バイオマス、培養方法およびその用途 - Google Patents

Description

KCTC KCTC 14345BP

関連出願（ら）との相互引用
本出願は、２０２２年４月１８日付韓国特許出願第１０－２０２２－００４７７２１号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。

本発明は、ペプシン消化率に優れた高たんぱく微細藻類バイオマス、培養方法およびその用途に関するものである。

魚粉（Ｆｉｓｈｍｅａｌ）は、養魚飼料だけでなく、多様な畜種の飼料に幅広く用いられているタンパク質源である。しかし、最近、漁獲量規制、重金属および微細プラスチック問題のような環境汚染に関する問題点が提起されることによって魚粉を代替できる新たなタンパク質源の開発が要求されている。

また、最近は養魚飼料分野で提起されるＦＩＦＯ（Ｆｉｓｈ ｉｎ／Ｆｉｓｈ ｏｕｔ）比（ｒａｔｉｏ）を減らそうとする傾向であり、これと共に政府政策や気候により漁獲量が変わるため、持続可能性の側面から改善されたタンパク質源に対する需要が増加している。

現在まで多様な新規なタンパク質源が魚粉の代替材として提示されてきたが、魚粉に含まれている有効物質であるオメガ－３脂肪酸などを代替できないという問題点があった。また、現在まで提示された緑藻類基盤の全細胞型（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ）のタンパク質は消化率が大きく落ちて飼料の配合比率上、高い比率が含まれるには現実的に難しいという問題点がある。これと関連して韓国登録特許第１５６４８２９号は、微細藻類副産物を含有する魚類養殖用配合飼料組成物について開示している。

そこで、本発明者らは、このような問題点を解決するために研究した結果、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）系の微細藻類の発酵を通じて生産された有用脂肪酸であるオメガ－３脂肪酸を含む新たなタンパク質源を開発した。さらに、ペプシンの消化率に優れた組成物を見つけ出して、持続可能であり、環境にやさしい新たなタンパク質源を提示する。

本出願の一例は、バイオマスの乾燥重量に対して４６％以上の総アミノ酸を含むペプシン消化率に優れたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類由来バイオマスを提供する。

本出願の他の例は、前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスを含む飼料組成物を提供する。

本出願の他の例は、前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスを含む食品組成物を提供する。

本出願のまた他の例は、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類を培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して６％以下に維持される条件で培養する段階；を含む、スキゾキトリウム属微細藻類の培養方法を提供する。

本出願で開示されるそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用され得る。つまり、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合わせは本出願の範疇に属する。また、下記に記述された具体的な叙述により本出願の範疇が制限されるとみることはできない。また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験だけを用いて本出願に記載された本出願の特定の様態に対する多数の等価物を認知したり確認することができる。また、このような等価物は本出願に含まれると意図される。

本出願の一例は、バイオマスの乾燥重量に対して４６重量％以上の総アミノ酸を含むペプシン消化率に優れたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類由来バイオマスを提供する。

本明細書で使用される用語「スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）」は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類を意味する。また、本明細書で使用される用語「スキゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）」は、スラウストキトリアレス目のスラウストキトリアシエ （Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科に属する属名の一つであり、用語「スキゾキトリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）」と混用され得る。また、前記用語「微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」は、肉眼では見ることができず顕微鏡を通じてだけ見ることができる水準の小さい藻類であり、水中で自由に浮遊して生きる生物を意味する。前記微細藻類には多様な種類があり、光合成が不可能で従属栄養だけで生長する菌株まで含む。

前記スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類は、寄託番号ＫＣＴＣ１４３４５ＢＰで寄託されたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＣＤ０１－５００４菌株であってもよいが、これに制限されるのではない。

本明細書で使用される用語「バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）」は、化学的エネルギーで使用可能な植物、動物、微生物などの生物体、つまり、バイオエネルギーのエネルギー源を意味し、生態学的に単位時間および空間内に存在する特定の生物体の重量またはエネルギー量を意味したりもする。また、前記バイオマスは、細胞により分泌される化合物を含むが、これに制限されず、細胞外物質だけでなく、細胞および／または細胞内内容物を含有するものであってもよい。本出願で前記バイオマスは、スキゾキトリウム属微細藻類そのもの、その培養物、その乾燥物、その破砕物、または前記微細藻類を培養したり発酵して生産された産物であってもよく、または前記バイオマスの濃縮物または乾燥物であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類の「培養物」は、前記微細藻類を培養して生成された産物を称するものであり、具体的に微細藻類を含む培養液または前記培養液から微細藻類が除去された培養濾液であってもよいが、これに制限されるのではない。前記スキゾキトリウム属微細藻類培養物の「乾燥物」は、前記微細藻類培養物から水分が除去されたものであり、例えば前記微細藻類の乾燥菌体の形態であってもよいが、これに制限されるのではない。また、前記乾燥物の「破砕物」は、前記微細藻類培養物から水分が除去された乾燥物を破砕した結果物を総称するものであり、例えば乾燥菌体粉末であってもよいが、これに制限されるのではない。前記スキゾキトリウム属微細藻類の培養物は、微細藻類培養培地に前記微細藻類を接種し、当業界に公知の培養方法により製造されてもよく、前記培養物の乾燥物およびその破砕物も当業界に公知の微細藻類または培養液の処理または乾燥方法により製造されてもよい。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、バイオマスの乾燥重量を基準として４６重量％以上、４８重量％以上、４９重量％以上、５０重量％以上、または５２重量％以上、４６～６０重量％、４６～５５重量％、４６～５３重量％、４８～５３重量％、５０～５５重量％、５２～５５重量％、５２～５３重量％、５２．５～５５重量％または５２．５～５３重量％の総アミノ酸を含むものであってもよく、上限値は８０重量％以下、７５重量％以下、７０重量％以下、または６５重量％以下であってもよいが、これに制限されない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、バイオマスの乾燥重量を基準として６０重量％以上、６４重量％以上、６７重量％以上、または７０重量％以上、６０～８５重量％、６０～８０重量％、６４～８０重量％、６４～７８重量％、６７～８０重量％、６７～７８重量％、６７～７５重量％、６７～７０重量％、６９～８０重量％、６９～７８重量％、６５～７０重量％または６９～７０重量％の粗タンパクを含むものであってもよく、上限値は８５重量％以下、８０重量％以下、７８重量％以下であってもよいが、これに制限されない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、バイオマスの乾燥重量を基準として５重量％以上、７重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１４重量％以上、２０重量％以上、１～２０重量％、４～２３重量％、９～２５重量％、９～２３重量％、５～１８重量％、１０～１８重量％、１０～１５重量％、１２～１８重量％、１２～１５重量％または１３～１５重量％の粗脂肪を含むものであってもよい。

本明細書で使用される用語「粗タンパク」は、「粗タンパク質」と混用されてもよく、食品および飼料の一般分析で全体窒素を測定し、これに６．２５（タンパク質の平均窒素含有量の逆数、１／０．１６）を掛けて求めるタンパク質を意味する。

本明細書で使用される用語「粗脂肪」は、食品および飼料の一般分析でソックスレー 抽出機を利用してエーテルで抽出される成分を意味し、「粗脂肪含有量」は、「粗脂肪量」または「総脂質」または「総脂肪酸」と混用されてもよい。

本明細書で使用される用語「ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＤＨＡ）」は、Ｃ_２２Ｈ_３２Ｏ_２の化学式を有する多重不飽和脂肪酸の一つであり、αリノレン酸（α－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ：ＡＬＡ）およびエイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＥＰＡ）と共にオメガ－３脂肪酸に該当し、慣用名はセルボン酸（ｃｅｒｖｏｎｉｃ ａｃｉｄ）であり、略称で２２：６ｎ－３とも表記される。

本明細書で使用される用語「エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ：ＥＰＡ）」は、Ｃ_２０Ｈ_３０Ｏ_２の化学式を有する多重不飽和脂肪酸の一つであり、ＡＬＡおよびＤＨＡと共にオメガ－３脂肪酸に該当し、略称で２０：５ｎ－３とも表記される。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、総粗脂肪含有量を基準として３９重量％以上、４０重量％以上、４１重量％以上、４５重量％以上、４９重量％以上、５０重量％以上、３９～６０重量％、３９～５５重量％、３９～５０重量％、４２～５５重量％、４２～５０重量％、４３～５５重量％、４３～５０重量％、４５～５０重量％、４７～５０重量％または４９～５０重量％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含むものであってもよい。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、総粗脂肪含有量を基準として０．５重量％以上、１．０重量％以上、１．５重量％以上、２．０重量％以上、２．１重量％以上、３．５重量％以上、０．５重量％～１５．０重量％、０．５重量％～１０．０重量％、０．５重量％～５．０重量％、０．５重量％～３．０重量％、１．０重量％～３．０重量％、１．９重量％～３．０重量％、１．９重量％～２．５重量％または１．９重量％～２．２重量％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含むものであってもよい。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、総粗脂肪含有量を基準として４１重量％以上、４２重量％以上、５０重量％以上、４２～５５重量％、４２～５２重量％、４３～５５重量％、４３～５２重量％、４９～５５重量％または４９～５２重量％のオメガ－３脂肪酸を含むものであってもよい。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、ペプシン消化率が６８．７％以上、６９％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７７％以上、８０％以上、８３％以上、８９％以上、６９％～９５％、６９％～９０％、７０％～９５％、７０％～９０％、７３％～９５％、または７３％～９０％、７５％～９５％、７５％～９０％、８５％～９５％、８５％～９０％、８７％～９５％、８７％～９０％、８９％～９５％または８９％～９０％であってもよい。

本明細書で使用される用語「ペプシン消化率」は、動物性タンパク質原料の品質分析に用いられるものであり、動物の胃から抽出したペプシンを利用して一定の環境で消化がどの程度行われたのかを比較できる指標を意味する。

前記バイオマスは、一様態によるスキゾキトリウム属微細藻類の培養方法により培養されるものであってもよい。

本出願の他の一様態は、バイオマスの乾燥重量に対して４６重量％以上の総アミノ酸を含むペプシン消化率に優れたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類由来バイオマスを含む組成物を提供する。

前記組成物は、ペプシン消化率に優れたことを特徴とするものであってもよく、食品および／または飼料製造に用いることができる。

本出願の他の一様態は、バイオマスの乾燥重量に対して４６重量％以上の総アミノ酸を含むペプシン消化率に優れたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類由来バイオマスを含む飼料組成物を提供する。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、前述したとおりである。

本明細書で使用される用語「飼料組成物」は、動物に給与されるエサを称する。前記飼料組成物は、動物の生命を維持、または肉、乳などの生産に必要な有機または無機栄養素を供給する物質をいう。前記飼料組成物は、動物の生命維持、または肉、乳などの生産に必要な栄養成分を追加的に含むことができる。前記飼料組成物は、当業界の公知の多様な形態の飼料として製造可能であり、具体的には濃厚飼料、粗飼料および／または特殊飼料が含まれ得る。

本明細書で使用される用語「飼料添加剤」は、栄養素補充および体重減少の予防、飼料内繊維素の消化利用性の増進、乳質改善、繁殖障害の予防および受胎率の向上、夏季の高温ストレスの予防など多様な効果を目的で飼料に添加する物質を含む。本出願の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助飼料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレニウムなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、ビタミンＢ複合体などのビタミン剤、メチオニン、リジンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩などの保護脂肪酸剤、生菌剤（乳酸菌剤）、酵母培養物、かび発酵物などの生菌、酵母剤などが追加的に含まれ得る。

本出願の他の一様態は、バイオマスの乾燥重量に対して４６重量％以上の総アミノ酸を含むペプシン消化率に優れたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類由来バイオマスを含む食品組成物を提供する。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、前述のとおりである。

本明細書で使用される用語「食品組成物」は、機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）および食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）などのすべての形態を含み、前記類型の食品組成物は当業界に公知の通常の方法により多様な形態で製造することができる。

本出願の組成物は、穀物、例えば粉砕または破砕された小麦、燕麦、大麦、トウモロコシおよび米；植物性タンパク質飼料、例えば豆およびヒマワリを主成分とする飼料；動物性タンパク質飼料、例えば血粉、肉粉、骨粉および魚粉；糖分および乳製品、例えば各種粉乳および乳清粉末からなる乾燥成分などをさらに含むことができ、その他にも栄養補充剤、消化および吸収向上剤、成長促進剤などをさらに含むことができる。

本出願の組成物は、動物に単独投与したり、食用担体内で他の飼料添加剤と組み合わせて投与することもできる。また、前記組成物は、トップドレッシングとしてまたはこれらを飼料に直接混合したりまたは飼料と別途の経口剤形で容易に動物に投与することができる。前記組成物を飼料と別途に投与する場合、当該技術分野によく知られているように、薬剤学的に許容可能な食用担体と組み合わせて、即時放出または徐放性剤形で製造することができる。このような食用担体は、固体または液体、例えばとうもろこしデンプン、ラクトース、スクロース、豆フレーク、落花生油、オリーブ油、ゴマ油およびプロピレングリコールであってもよい。固体担体が用いられる場合、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤または含糖錠剤または微分酸性形態のトップドレッシングであってもよい。液体担体が用いられる場合、前記組成物は、ゼラチン軟質カプセル剤、またはシロップ剤や懸濁液、エマルジョン剤、または溶液剤の剤形であってもよい。

本出願の組成物は、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、凍結保護剤、または賦形剤などを含有することができる。前記凍結保護剤は、グリセロール、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳およびデンプンからなる群より選択される一つ以上であってもよい。

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物に含まれるスキゾキトリウム属微細藻類の劣化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであってもよい。また、前記凍結保護剤は、前記組成物が乾燥された状態である時、組成物に含まれるスキゾキトリウム属微細藻類の劣化を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであってもよい。

前記組成物は、浸漬、噴霧または混合して動物の飼料に添加して用いることができる。

本出願の組成物は、哺乳類、鳥類、魚類、甲殻類、頭足類、爬虫類および両生類を含む多数の動物食餌に適用することができるが、これに制限されない。例えば、前記哺乳類は、豚、牛、羊、山羊、実験用齧歯動物、またはペットなどを含むことができ、前記鳥類は、家禽類を含むことができ、前記家禽類は、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、キジ、またはウズラなどを含むことができるが、これに制限されない。また、前記魚類は、商業的畜養魚類およびその稚魚類、観賞魚などを含むことができ、前記甲殻類は、エビ、フジツボなどを含むことができるが、これに制限されない。また、前記組成物は、動物性プランクトンであるワムシ（ｒｏｔｉｆｅｒ）の食餌にも適用され得る。

本出願のまた他の一様態は、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類を培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して６％以下に維持される条件で培養する段階；を含む、スキゾキトリウム属微細藻類の培養方法を提供する。

前記スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類は、寄託番号ＫＣＴＣ１４３４５ＢＰで寄託されたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＣＤ０１－５００４菌株であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスは、前述のとおりである。

本明細書で使用される用語「培養」は、前記微細藻類を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は当業界に知られている適当な培地と培養条件により行われ得る。このような培養過程は、選択される微細藻類により当業者が容易に調整して用いることができる。

本明細書で使用される用語「培養液」は、微細藻類を培養する培地を意味し得、微細藻類を培養する培地に微細藻類および／または微細藻類が生産する産物をさらに含むものを意味し得る。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で培養条件は、具体的に、培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、または２％以下に維持される条件で行われ得る。

具体的に、本出願のスキゾキトリウム属微細藻類の培養は、従属栄養の条件下で行われるものであってもよいが、これに制限されるのではない。

本明細書で使用される用語「従属栄養」は、エネルギー源または栄養源を体外から得た有機物に依存する栄養方式であって、独立栄養に対応する用語であり、用語「暗培養」と混用され得る。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われ得る。本出願の微細藻類の培養に用いられる培地およびその他培養条件は、通常の微細藻類の培養に用いられる培地であれば特別な制限なしにいずれも用いることができる。具体的に、本出願の微細藻類を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸および／またはビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

具体的に、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ５～８）を調節することができるが、これに制限されるのではない。

本出願のスキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で用いられる培地は、ＭＪＷ０１培地であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で用いられる培地に含まれる炭素源は、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、アラビノース、キシロースおよびグリセロールからなる群より選択されるいずれか一つ以上であってもよく、具体的にグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）およびスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）からなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で用いられる培地に含まれる窒素源は、尿素（ｕｒｅａ）、アンモニア水、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酵母抽出物、ペプトン（ｐｅｐｔｏｎｅ）、硝酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ、ＮａＮＯ_３）からなる群より選択される１種以上を含むものであってもよいが、微細藻類を培養することに用いられる窒素源であればこれに制限されない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で用いられる培地に、リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別的に含むかまたは混合して含むことができるが、これに制限されない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する段階で用いられる培地は、酵母抽出物０．０１～５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．０～３．０ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ５～２０ｇ／Ｌを含むものであってもよいが、これに制限されない。

また、培養温度は２０～４５℃または２５～４０℃を維持することができ、約１０～７０時間培養することができるが、これに制限されるのではない。

前記スキゾキトリウム属微細藻類を培養する方法は、培養液内の残留炭素源濃度を培養液全体に対して最大６％以下の範囲に維持されるように供給して微細藻類バイオマスの乾燥重量に対して総アミノ酸含有量を増加させてペプシン消化率を高めることができる。

本発明は、微細藻類基盤の発酵工程を通じて魚粉を代替できる代替タンパク質源を開発した。本発明で提示する組成物は、単にタンパク質含有量だけが高いのではなく、魚粉と同様に有用脂肪酸であるオメガ－３脂肪酸まで含有しており、飼料配合の際に魚粉を直接的に代替することができる。さらに、本発明で提示する高たんぱく微細藻類バイオマスは、ペプシン消化率分析法で分析した結果、７０％以上の高いペプシン消化率を示すため、飼料内配合比率が高くなっても全体消化率に否定的な影響を与えず、微細藻類を基盤として生産されるタンパク質源であるため、環境汚染の問題点がなく、外部環境の影響を最小化して安定的に生産が可能であるという長所がある。

培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率とバイオマス内の粗脂肪含有量との間の相関係数を示した図面である（平均±標準偏差、ｎ＝４）。 培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率とバイオマス内の粗タンパク含有量との間の相関係数を示した図面である（平均±標準偏差、ｎ＝４）。 培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率とバイオマス内粗脂肪重量に対するオメガ－３脂肪酸含有量との間の相関係数を示した図面である（平均±標準偏差、ｎ＝４）。 培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率とバイオマス内の総アミノ酸含有量との間の相関係数を示した図面である（平均±標準偏差、ｎ＝４）。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従い、本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に自明である。

＜微細藻類菌株の種菌培養＞
スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）系微細藻類に属する寄託番号ＫＣＴＣ１４３４５ＢＰで寄託されたスキゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）ＣＤ０１－５００４菌株を利用した。前記菌株を滅菌されたＭＪＷ０１培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ ３０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ３．０ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物９．０ｇ／Ｌ、ＭＳＧ・１Ｈ_２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ_３ １．０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２ ０．５ｇ／Ｌ、ビタミン混合溶液１０ｍｌ／Ｌ）が含まれている２５０ｍＬフラスコ（ｆｌａｓｋ）で２６℃、２００ｒｐｍ条件で３０時間培養した。

比較例１．菌株を培養液に対する炭素源濃度を７～９％（ｗ／ｖ比率）条件で培養したバイオマスの製造
前記種菌培養した菌株を滅菌されたＭＪＷ０１培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ ３０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ３．０ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ＭＳＧ・１Ｈ_２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ_３ ５．０ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２ ０．５ｇ／Ｌ、ビタミン混合溶液１０ｍｌ／Ｌ）が入っている５Ｌ培養器（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）に分注して２８℃、３００ｒｐｍ、０．６ｖｖｍ、ｐＨ６．８条件で培養を行った。培養が行われる間（４５時間）に培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して７～９％（ｗ／ｖ比率）範囲に維持されるように供給した。培養を開始した直後から培養終了時点まで窒素源を供給しながら培養を持続した。適正窒素源濃度維持のために窒素源の供給はｏｎ／ｏｆｆを繰り返しながら培養液に供給した。前記炭素源はグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）が用いられ、窒素源は硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）を用いた。培養終了後、菌体培養液を凍結乾燥またはドラム乾燥（Ｄｒｕｍ ｄｒｙ）して対照群である比較例１の乾燥バイオマス（ｄｒｙ ｂｉｏｍａｓｓ）を確保した。

実施例１．菌株を培養液に対する炭素源濃度を０～２％（ｗ／ｖ比率）条件で培養したバイオマスの製造
前記比較例１の培養条件（ｃｏｎｔｒｏｌ条件、対照群）ＭＪＷ０１培地の組成を維持した状態で培養が持続する間（４５時間）に培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して０～２％（ｗ／ｖ比率）範囲に維持されるように供給した。残りの培養条件は、比較例１と同様な方法で培養して実施例１の乾燥バイオマス（ｄｒｙ ｂｉｏｍａｓｓ）を確保した。

実施例２．菌株を培養液に対する炭素源濃度を最大２～５％（ｗ／ｖ比率）条件で培養したバイオマスの製造
前記比較例１の培養条件（ｃｏｎｔｒｏｌ条件、対照群）でＭＪＷ０１培地の組成を維持した状態で培養が持続する間（４５時間）に培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して２～５％（ｗ／ｖ比率）範囲に維持されるように供給した。残りの培養条件は比較例１と同様な方法で培養して実施例３の乾燥バイオマス（ｄｒｙ ｂｉｏｍａｓｓ）を確保した。

実施例３．菌株を培養液に対する炭素源濃度を最大４～７％（ｗ／ｖ比率）条件で培養したバイオマスの製造
前記比較例１の培養条件（ｃｏｎｔｒｏｌ条件、対照群）でＭＪＷ０１培地の組成を維持した状態で培養が持続する間（４５時間）に培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して４～７％（ｗ／ｖ比率）範囲に維持されるように供給した。

実験例１．培養条件別微細藻類乾燥バイオマスの成分分析

１－１．微細藻類乾燥バイオマスの粗脂肪含有量および脂肪酸含有量の分析
前記比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスの粗脂肪含有量および脂肪酸含有量を分析するために下記のような実験を行った。

具体的に、比較例１、実施例１～実施例３の各微細藻類乾燥菌体２ｇに８．３Ｍ塩酸溶液を加えて８０℃で加水分解反応を行った。その後、エチルエーテル（Ｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）３０ｍＬと石油エーテル（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ）２０ｍＬを添加した後、３０秒間混合して遠心分離する過程を３回以上繰り返した。分離された溶媒層を予め重量を測定したラウンドフラスコに移した後、窒素パージングを通じて溶媒および残余水分を除去した容器に入れて乾燥した。溶媒を乾燥させて残ったオイルの重量を測定して総オイル含有量を計算し、オイル中に含まれているオメガ－３（ＤＨＡおよびＥＰＡ）含有量はメタノール性０．５ＮのＮａＯＨおよび１４％トリフルオロボランメタノール（ＢＦ_３）で前処理を行った後、気体クロマトグラフィー法で測定した。

１－２．微細藻類乾燥バイオマスの粗タンパク含有量の分析
前記比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスの粗タンパク含有量を分析するためにケルダール自動分析機を活用して下記のような実験を行った。

具体的に、比較例１、実施例１～実施例３で確保された各微細藻類乾燥バイオマス試料をケルダール装置（Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｊｅｌｔｅｃ２１００）分析用チューブに入れ、硫酸および触媒剤を入れて分解器で分解後、分解チューブをオートサンプラーに装着した。ケルダール装置内で苛性ソーダとスチームで加熱蒸留して発生する気体アンモニアを冷却捕集した後、これを塩酸で滴定して自動的に窒素含有量を計算する方式で微細藻類乾燥バイオマス（ｄｒｙ ｂｉｏｍａｓｓ）の粗タンパク含有量を測定した。

１－３．微細藻類乾燥バイオマスのアミノ酸含有量の分析
前記比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスのアミノ酸含有量を分析するために下記のような実験を行った。

具体的に、比較例１、実施例１～実施例３の各微細藻類乾燥菌体０．５～１ｇを酸加水分解した後、液体クロマトグラフィーを利用してトータルアミノ酸分析を行った。個別アミノ酸の分析結果は、用いられた微細藻類乾燥菌体量で標準化して乾燥菌体内の個別アミノ酸の含有量比を算出し、分析結果で検出されたすべてのアミノ酸の含有量比を合算して菌体内の総アミノ酸含有量比を計算した。

１－４．培養条件別微細藻類乾燥バイオマスの成分分析結果
前記実験例１－１～実験例１－３の方法で比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスの構成成分を分析した結果を下記の表１に示した。

その結果、表１に示すように、比較例１と実施例１を比較すると、実施例１は、培養過程で培養液内の残留炭素源濃度を０～２％の低い範囲に維持させることによって微細藻類バイオマス内の総アミノ酸含有量を増加させることができたが、粗脂肪含有量が増加することを確認した。

実施例２では、培養が行われる間に培養液内に残留する炭素源濃度の範囲を２～５％に調整した。比較例１および実施例２の構成成分含有量を比較すると、実施例２で炭素源濃度を２～５％範囲に維持する場合、粗タンパク含有量が７０％水準に維持され、粗脂肪含有量は比較例１と実施例１の中間範囲を示すことを確認した。特に、バイオマス内の総アミノ酸含有量が５２．７８％で、培養条件のうち最も高い値を示すことが示された。

実施例３では、培養が行われる間に培養液内に残留する炭素源濃度を４～７％範囲に維持させた。実施例３で炭素源濃度を４～７％範囲に維持する場合、粗タンパク含有量が７７．２０％、総アミノ酸含有量が５２．１８％、粗脂肪含有量が１２．２０％を示して、培養条件のうち最も高い粗タンパク含有量を示すことを確認した。

実験例２．培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率の分析
飼料および食品として微細藻類バイオマスを用いるためにはタンパク質の消化率が重要な指標であるため、ペプシン消化率分析法により分析を行った。培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率を分析するために、前記比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスのペプシン消化率をＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ， １９９０， Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ９７１．０９に記載された方法で測定して下記計算式１を利用してペプシン消化率を導き出した。

具体的に、各乾燥バイオマス試料１ｇに、４２～４５℃に予め加熱した０．２％ペプシン塩酸溶液１５０ｍＬを加え、４５℃抗温水槽で振とうしながら１６時間消化させた後、Ｎｏ．２Ａろ過紙でろ過した。フッ素化物を温水で洗浄した後、フッ素化物とろ過紙の粗タンパク質含有量をケルダール分析法で求め、その結果を下記表２に示した。

計算式１のケルダール窒素含有量は、実験例１－３のケルダール自動分析機活用粗タンパク分析に記載された方法で行って求めた。

［計算式１］
ペプシン消化率（％）＝１００＊（Ａ－Ｂ）／Ａ
＊Ａ：％原サンプルのケルダール窒素の含有量（Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓａｍｐｌｅ）
＊Ｂ：％酸性ペプシン溶液に不溶性であるケルダール窒素の含有量（Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｉｎ ａｃｉｄ ｐｅｐｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）

その結果、表２に示すように、比較例１の微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率は６８．６％と比較的低い方であると示された。しかし、培養条件を変更してバイオマスの構成成分比を変更させた結果、実施例１の微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率は７３．４０％、実施例２の微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率は８９．６２％、実施例３の微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率は８３．２０％および高いペプシン消化率を示すことを確認した。

実験例３．培養条件別微細藻類乾燥バイオマスのペプシン消化率と総アミノ酸含有量との相関関係の確認
前記実験例２で培養条件の変化を通じてバイオマスの構成成分比を変更させた結果、ペプシン消化率が高くなることを確認したため、バイオマスの構成成分のうち、いずれの指標がペプシン消化率と相関関係を有するのかを確認した。

具体的に、比較例１、実施例１～実施例３で確保された各乾燥バイオマスの粗脂肪含有量、粗タンパク含有量、オメガ－３脂肪酸／粗脂肪含有量および総アミノ酸含有量とペプシン消化率間の相関係数を導き出し、その結果を図１～図４に示した。

その結果、図１～図３に示すように、バイオマスの構成成分のうち、粗脂肪含有量、粗タンパクおよび粗脂肪重量に対するオメガ－３脂肪酸含有量は、ペプシン消化率と有意味な相関関係がないと示された。反面、図４に示すように、バイオマス内の総アミノ酸含有量とペプシン消化率間には有意味な相関関係があることが明らかになった（Ｒ^２＝０．９５２７）。一般に総アミノ酸は粗タンパク含有量内に含まれる概念であるため、粗タンパク含有量と総アミノ酸は比例して変動する値と知られているが、本発明で記載されたように、粗タンパク含有量が類似しても発酵条件により総アミノ酸含有量を変化させることができ、バイオマス内の総アミノ酸含有量が増加することによってペプシン消化率が増加することを確認できる。

［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号：ＫＣＴＣ１４３４５ＢＰ
受託日付：２０２０１０２６

Claims (6)

1. 寄託番号ＫＣＴＣ１４３４５ＢＰで寄託されたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微細藻類を培養液内の残留炭素源濃度が培養液全体に対して７％以下に維持される条件で培養する段階；を含む、スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。
2. 前記炭素源は、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）およびスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載のスキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。
3. 前記培養は、窒素源として尿素（ｕｒｅａ）、アンモニア水、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、酵母抽出物、ペプトン（ｐｅｐｔｏｎｅ）および硝酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）からなる群より選択される１種以上を含む培地で行うものである、請求項１に記載のスキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。
4. 前記培養は、酵母抽出物０．０１～５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．０～３．０ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ５～２０ｇ／Ｌを含む培地で行うものである、請求項１に記載のスキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。
5. 前記培養は、１０～７０時間行われる、請求項１に記載のスキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。
6. 前記スキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマスのペプシン消化率は、７０％以上である、請求項１に記載のスキゾキトリウム属微細藻類由来バイオマス製造方法。