JP7798564B2

JP7798564B2 - ＩｇＡ産生促進用組成物

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Publication number: JP7798564B2
Application number: JP2021212241A
Authority: JP
Inventors: 英史小畠; 敏秀冠木
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2026-01-14
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: JP2023096453A

Description

本発明は、ＩｇＡ産生促進用組成物に関する。特に、ラクトバチルス属乳酸菌の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）を含むＩｇＡ産生促進用組成物に関する。

ＩｇＡは自然免疫に働く主要な抗体のひとつである。特に分泌型ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）は粘膜免疫の主役であり、消化管や呼吸器における免疫機構の最前線として機能している。腸管においてＳＩｇＡは粘膜筋板のプラズマ細胞から分泌され、上皮を貫通し、上皮の表面に分泌されて、抗原や病原性細菌を捕捉することでそれらが上皮に接着するのを防止する。これらのことから、ＩｇＡは生体の感染防御に働くことが期待されており、これまでにいくつかのＩｇＡ産生を上昇させるための解決手段が開示されている。

特許文献１は、優れた粘膜免疫賦活作用、生体防御機構の向上作用などを奏することができ、プロバイオティックスとして有用な新しい乳酸菌、およびこれを含む最終製品（発酵乳、乳酸菌飲料などの飲食品）を提供することを目的とし、その解決手段としてＩｇＡ産生促進能を有するラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＯＮＲＩＣｂ０２３９およびラクトバチルス・プランタラムＯＮＲＩＣｂ０２４０からなる群から選択される少なくとも１種である、乳酸菌を開示している。

特許文献２は、高い腸管免疫力増強作用を有する乳酸菌由来の成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供することを課題とし、その解決手段としてＩｇＡ抗体産生向上作用を有するラクトバチルス・プランタラムの細胞壁成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を開示している。

特許文献３は、ＩｇＡ抗体の産生を促進し、自己抗体であるＩｇＧ抗体の産生を抑制することで、感染症の予防と自己免疫疾患の予防の両者の効果をもたらすことができる医薬品、栄養組成物、飲食品および飼料を提供することを課題とし、その解決手段として乳酸菌のラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌、特にラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株を開示している。

特許文献４は、ＪＮＫを活性化させる新規な素材を提供することを課題とし、その課題解決手段としてラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＳＬＰということがある）又は前記ＳＬＰの分解物を有効成分として含有するＪＮＫ活性化組成物、またこれを含むＪＮＫ活性化用飲食品、抗酸化用飲食品、細胞防御用飲食品を開示している。特許文献５は、上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を上昇させ、感染予防効果を有する新規な素材を提供することを課題とし、その課題解決手段としてラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳＬＰ及び前記ＳＬＰの分解物を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物、またこれを含む抗菌ペプチド産生促進用飲食品、感染予防用飲食品を開示している。

しかし、特許文献１，２に記載のラクトバチルス・プランタラムはＳＬＰを有さないことから、本文献に記載のＩｇＡ抗体産生促進作用等は、ラクトバチルス・プランタラムの菌体や細胞壁成分を有効成分とする作用であって、ＳＬＰのＩｇＡ抗体産生促進作用については開示されていないことが明らかである。
また、特許文献３に記載のＩｇＡ抗体の産生促進作用及びＩｇＧ抗体の産生抑制作用は、ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌体又は菌体培養物を有効成分とした作用であり、ＳＬＰのＩｇＡ抗体産生促進作用については開示されていない。
また、特許文献４，５には、ラクトバチルス属のＳＬＰのＩｇＡ産生促進作用については開示されていない。
以上のように、本願の提供する解決手段は上記いずれの文献にも開示も示唆もされていない。

特許第３８１８３１９号公報特開２０１４－１２５４４６号公報特許第６７３９１５５号公報特開２０２０－１５２６５３号公報国際公開２０２０／１１１１７２号パンフレット

本発明の課題は、免疫細胞からのＩｇＡ産生を促進し、感染予防効果を有する新規な素材を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明には以下の構成が含まれる。
〔１〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含むことを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物。
〔２〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、又はラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）である〔１〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔３〕Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）が精製されたものである〔１〕又は〔２〕に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
〔４〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飲食品。
〔５〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用医薬品。
〔６〕〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飼料。

ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＳＬＰということがある））、もしくはＳＬＰを含むラクトバチルス属の乳酸菌菌体およびその培養物などのＩｇＡ産生を誘導する素材を体内に摂取することにより、ＩｇＡ産生促進作用を介して種々の感染に対する防御能の向上が期待できる。

ラクトバチルス・ヘルベティカスの精製したＳＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた結果を示す写真である。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）にＳＬＰを添加し、培養した場合の培養上清中ＩｇＡ濃度を示すグラフである。

本発明は、新規なＩｇＡ産生促進用組成物を提供するものである。
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物について以下に詳細に説明する。
（ＩｇＡ産生促進用組成物）
本発明のＳ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎは種々の細菌の細胞壁外層で認められ、規則的な結晶構造を呈することを特徴とするタンパク質である。ＳＬＰは細胞壁成分に非共有的に結合していることから、塩化リチウムなどのカオトロピック試薬によって菌体から抽出される。また、抽出されたＳＬＰはカオトロピック試薬を除くことで規則的な結晶構造を再形成する。この特徴を利用し、菌体からの精製が可能となる。
乳酸菌の中ではラクトバチルス属においてＳ－ｌａｙｅｒを発現していることが見出されており、向井らの報告（ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＬａｃｔｉｃＡｃｉｄＢａｃｔｅｒｉａ，１９（１）：２１－２９，２００８）ではラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループ乳酸菌をはじめとする１３菌種でＳＬＰの発現が確認もしくは推定されている。これらの乳酸菌が発現しているＳＬＰには、等電点が９～１０の塩基性タンパク質であること、Ｎ末端領域に２３～３０アミノ酸残基からなるシグナルペプチド配列を持つことといった共通点がある。一方で、乳酸菌が産生するＳＬＰの分子量は菌種間で大きな開きがあり、さらにその遺伝子構造は同一菌種内においても多様性に富むことが示されている。
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物に用いるＳＬＰは、ラクトバチルス属に由来し、Ｓ－ｌａｙｅｒを発現している菌種のうち、当該作用を有するものであればどのようなものでも用いることができる。ＳＬＰもしくはＳＬＰ様タンパク質を発現している菌種としてはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・キタサトニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・パラケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）が挙げられ、このうちでもラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルス・ブレビス、又はラクトバチルス・ヘルベティカスがより好ましい。
また、本発明のＳＬＰは、菌体から必ずしも精製されたものである必要はなく、ＳＬＰを含む菌体自体や培養物としても用いることができるが、精製したＳＬＰがより好ましい。菌体自体は、生菌体でも死菌体でもよい。

（ＩｇＡ産生促進用組成物の製造方法）
本発明の有効成分であるＳＬＰは以下の方法に従って乳酸菌菌体より精製することができる。ＳＬＰの精製は種々の公知の精製法を利用すればよく、典型的な方法を以下に示す。対象とするラクトバチルス属乳酸菌をＭＲＳ液体培地などの液体培地、もしくは脱脂乳で十分に培養した後に菌体を回収し、必要に応じて洗浄を行う。菌体は、寒天培地などに生育させたコロニーから回収してもよい。得られた菌体をそのまま、もしくは凍結乾燥した後に、塩化リチウム、尿素、塩酸グアニジンなどのカオトロピック試薬溶液で懸濁、攪拌して菌体表層のＳＬＰを可溶化する。可溶化したＳＬＰを含む溶液から固形物を除いた後、透析などによってカオトロピック試薬を除き、ＳＬＰを析出させる。析出したＳＬＰを回収後、必要に応じて洗浄を行い、本発明に用いる精製ＳＬＰとすることができる。さらに純度を高めたい場合にはクロマトグラフィー等でさらに精製することが好ましい。
なお、精製したＳＬＰではなく、ＳＬＰ含有率の高い画分を得る場合は、菌体を破砕して不溶性画分のみを回収することにより菌体よりも高い濃度のＳＬＰ画分を得ることができる。
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物に用いるＳＬＰは加熱してもＩｇＡ促進作用が維持されることから加熱されたものであってもよい。

（ＳＬＰを含む飲食品、医薬品、飼料）
本発明の上記製造方法により得られたＳＬＰは、そのまま飲食品の素材、原材料として用いることができ、ＳＬＰを含む組成物を添加すること以外は、各食品の定法により製造すればよい。
したがって、本発明の有効量のＳＬＰはどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のＳＬＰを含む飲食品は、ＩｇＡ産生促進用飲食品として提供される。

本発明の上記製造方法により得られたＳＬＰは、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、ＳＬＰを添加すること以外は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明のＳＬＰを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、ＳＬＰをそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、ＩｇＡ産生促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のＳＬＰを含む医薬品は、ＩｇＡ産生促進用医薬品として提供される。

本発明の上記製造方法により得られたＳＬＰは、そのまま飼料の原材料として用いることができ、ＳＬＰを添加すること以外は、飼料の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＳＬＰは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のＳＬＰを含む飼料は、ＩｇＡ産生促進用飼料として提供される。

（摂取量）
本発明のＩｇＡ産生促進用組成物の摂取量については、摂取するヒトや動物においてＩｇＡ産生促進作用を期待できる有効量であれば特に制限しないが、概算でＳＬＰとして０．１ｍｇ／日～１０ｍｇ／日が挙げられ、０．５ｍｇ／日～５ｍｇ／日が好ましく、０．７ｍｇ／日～１．２ｍｇ／日がさらにいっそう好ましく、１ｍｇ／日が最も好ましい。

本発明のＩｇＡ産生促進用組成物の摂取の対象は、生体内におけるＩｇＡ産生促進を必要とするヒト又は動物であり、例えば、下記の評価方法によりＩｇＡの産生量が基準値よりも低い対象に摂取することで本発明の効果が期待できる。また、ＩｇＡ産生促進作用を介して種々の感染に対する予防を必要とするヒト又は動物である。
本発明のラクトバチルス属乳酸菌のＳＬＰを有効成分とする作用は、ＩｇＡの産生促進作用であり、これまでに当該ＳＬＰについてすでに報告されている抗菌ペプチド産生促進作用とは異なる。ディフェンシン等の抗菌ペプチドは細菌の細胞膜に直接作用し、細胞膜を破壊する等して細菌に対して殺菌作用を示す。一方でＩｇＡは細菌だけでなく細菌が産生する毒素等にも結合することが可能であり、感染時には病原体や病原毒素に結合してこれらが体内に侵入することを防いでいる。
加えて、ＩｇＡは病原体の排除に働くだけでなく、宿主と常在細菌との共生関係の維持にも働いている（化学と生物，５５（９）：５９６－６０１，２０１７）。そのため、ＩｇＡ産生の増加によって腸内菌叢が改善すると示唆されている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４１，１５２－１６５，２０１４）。腸内菌叢の乱れは便秘や肌荒れ等様々な不調につながることが知られており、ＩｇＡ産生を促進して腸内菌叢を改善することで、こうした不調を改善することが可能である。

（評価方法）
本発明のＳＬＰによるＩｇＡ産生促進作用は、ヒトや動物にＳＬＰを投与した場合と非投与の場合における唾液、腸管、腸の内容物、または糞便中のＩｇＡ量を比較し、非投与よりもＳＬＰ投与の方が増加した場合に本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。
また、ｅｘｖｉｖｏにおけるＩｇＡ測定試験においては、例えば、ＩｇＡ産生細胞を含む免疫細胞をプレートに播種し、培地中にＳＬＰを添加した場合と非添加の場合における培地中のＩｇＡ濃度を比較し、非添加よりもＳＬＰ添加の方がＩｇＡ濃度が高い場合に、本発明のＩｇＡ産生促進作用があると評価することができる。

以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ＳＬＰの調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。得られた菌体はｃＯｍｐｌｅｔｅ^TM ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１ＭＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで懸濁し、室温で３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。沈殿はｃＯｍｐｌｅｔｅ^TMＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５ＭＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで再懸濁し、室温で再度３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液は遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。回収した上清をまとめ、０．２μｍフィルターを通した後にＳｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＧ２１０Ｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）で滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析することでＳＬＰを析出させた。透析後の溶液を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、析出したＳＬＰを回収した。回収したＳＬＰは滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄後、１ＭＬｉＣｌ溶液５００μＬに懸濁し、適宜攪拌しながら氷上で１５分間保持した。遠心分離によってＬｉＣｌ溶液を除き、再度滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁して凍結乾燥したものを精製ＳＬＰとした。

精製後のＳＬＰは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって目的サイズの４３ｋＤａ付近にバンドが認められることを確認した（図１）。また、得られたＳＬＰは３ｍｇであった。
また、同様な方法でラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＴ１０９６６、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ１１３８０、ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０Ｔ、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６Ｔ、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５Ｔから調整したＳＬＰは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により目的サイズの４３～５５ｋＤａ付近にバンドが認められた（図示せず）。

〔試験例１〕ＳＬＰのＩｇＡ産生促進効果の検討
１．試験方法
凍結保存されたＨｕｍａｎＰＢＭＣ（ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌ：末梢血単核細胞）（Ｌｏｔ．４６６１ＭＡ２０：ＡＳＴＲＡＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を３７℃の水浴で溶解し、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－０９３：Ｇｉｂｃｏ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．４２Ｑ３７８０Ｋ：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭＶｉｔａｍｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１×）（１１１２００５２：Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭＮｏｎ－ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＳｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１×）（１１１４００５０：Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｏｄｉｕｍＰｙｒｕｖａｔｅ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１ｍＭ）（１１３６００７０：Ｇｉｂｃｏ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）２－ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌＳｏｌｕｔｉｏｎ（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．０．０５ｍＭ）（１９８－１５７８１：Ｗａｋｏ）を添加した培地で洗浄した後に５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６ｗｅｌｌプレートに播種した。播種した細胞に各乳酸菌株から精製したＳＬＰを２０μｇ／ｍＬ含む培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加（ｆｉｎａｌｃｏｎｃ．１０μｇ／ｍＬ）して５％ＣＯ_２インキュベーターにて３７℃で７日間培養した。培養後の９６ｗｅｌｌプレートから培地を回収し、遠心分離（１，５００×ｇ、４℃、５分間）によって細胞を除去してＩｇＡ濃度測定用サンプルとした。試料を添加しない水準をＣｏｎｔｒｏｌ（ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ）、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＩＬ－６（ＡＦ－２００－０６：Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した水準をＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌとした。試験はｎ＝６で実施した。

ＩｇＡ濃度の測定はＥＬＩＳＡ法にて実施した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＧｏａｔＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＩｇＡ，α ＣｈａｉｎＳｐｅｃｉｆｉｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．０５ＭＣａｒｂｏｎａｔｅ－ＢｉｃａｒｂｏｎａｔｅＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）（Ｃ３０４１：Ｓｉｇｍａ）で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ｗｅｌｌＥＩＡ／ＲＩＡｐｌａｔｅ）（３５９０：Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して４℃で一晩静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１４ＭＮａＣｌ，１％ＢＳＡ）３００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で１時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１４ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０倍希釈したサンプル５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、Ｄｉｌｕｅｎｔで０．１６μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＧｏａｔＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＩｇＡ，αＣｈａｉｎＳｐｅｃｉｆｉｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間静置した。静置後のプレートから液体を除き、ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ３００μＬ／ｗｅｌｌで４回洗浄した。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＭ）ＴＭＢＳｏｌｕｔｉｏｎ（００－４２０１－５６：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で十分な発色が認められるまで静置した後に１ＮＨＣｌ１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮＦＬＡＳＨ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。測定結果は、ＯＤ４５０の値からＯＤ６２０の値を引いて補正した。測定は１サンプル当たり２ｗｅｌｌ実施し、２ｗｅｌｌの値の平均を測定値として採用した。また、ＩｇＡｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｅｒｕｍを標品として検量線を作成し、各サンプルの測定値からＩｇＡ濃度を算出した。

２．試験結果
評価の結果、ラクトバチルス属乳酸菌由来ＳＬＰを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した水準の多くで、Ｃｏｎｔｒｏｌ水準と比較して有意なＩｇＡ濃度の増加が認められた（図２）。Ｃｏｎｔｒｏｌ水準（１４．５ｎｇ／ｍＬ）と比較して、ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２株添加水準（５４．２ｎｇ／ｍＬ）では約３．７倍、ラクトバチルス・ブレビスSＢＴ１０９６６株添加水準（５８．８ｎｇ／ｍＬ）では約４．１倍、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ１１３８０株添加水準（４６．１ｎｇ／ｍＬ）では約３．２倍、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１株添加水準（３６．７ｎｇ／ｍＬ）では約２．５倍、ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０Ｔ株添加水準（３９．０ｎｇ／ｍＬ）では約２．７倍、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６Ｔ株添加水準（４７．１ｎｇ／ｍＬ）では約３．３倍、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５Ｔ株添加水準（５４．８ｎｇ／ｍＬ）では約３．８倍のＩｇＡ濃度が認められた。この結果より、ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳＬＰはＩｇＡ産生促進作用を示すと考えられた。図中、＊、＊＊、＊＊＊の記号はそれぞれＣｏｎｔｒｏｌ水準との間で有意な差（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）があることを示す。

（サプリメントの製造例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ１０ｍｇに、脱脂粉乳３０ｇ、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のＩｇＡ産生促進用サプリメントを製造した。

（飼料の製造例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ２ｇを３９９８ｇの脱イオン水に懸濁し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫＩＩ１６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇのＳＬＰ溶液を得た。このＳＬＰ溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２．３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明のＩｇＡ産生促進用飼料１０ｋｇを製造した。

（医薬品の製造例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ１０ｍｇに、脱脂粉乳４０ｇを加えて混合した。この混合物１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明のＩｇＡ産生促進用錠剤を調製した。

本発明によれば、ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳＬＰを有効成分とするあらたなＩｇＡ産生促進用組成物、及びラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳＬＰを有効成分とするＩｇＡ産生促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。

Claims

ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）を有効成分として含むことを特徴とするＩｇＡ産生促進用組成物であって、
前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）又はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）である前記ＩｇＡ産生促進用組成物。
Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）が精製されたものである請求項１に記載のＩｇＡ産生促進用組成物。
請求項１又は請求項２に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飲食品。
請求項１又は請求項２に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用医薬品。
請求項１又は請求項２に記載のＩｇＡ産生促進用組成物を含むＩｇＡ産生促進用飼料。