JP7800550B2 - 組成物の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、組成物の評価方法に関する。

近年、ＣＯＶＩＤ１９ウイルス感染症が猛威を振るう中、これまで殆ど前例のなかったｍＲＮＡワクチンが新規開発され、従来型ワクチンを凌ぐ有効率が確認されている。これを契機にｍＲＮＡ製剤は様々な用途に展開され、さらなる発展を遂げると思われる。ただし、ｍＲＮＡは一般に不安定であり、空気中に存在するＲＮＡ分解酵素ＲＮａｓｅによって簡単に分解されてしまう。そこで、ｍＲＮＡワクチンを脂質ナノ粒子等により保護することが、試みられている。しかしながら、長期保存したり、輸送時に環境変化が生じると、脂質ナノ粒子が凝集したり、内包されたｍＲＮＡが漏出して劣化したりすること等がある。そのため、ｍＲＮＡワクチンの保存や運搬は取り扱いが難しい。このようなｍＲＮＡの特性上、品質保証の観点から、使用する直前にワクチンの使用可否判別や劣化度を算出できる簡易検査が求められると予想される。

一般的に、ＲＮＡの検証には、リアルタイムＰＣＲやキャピラリーゲル電気泳動等による測定が用いられるが、ＲＮＡを精製する必要があり、ハンドリング時の分解が懸念される。

一方、臨床分野では、各種分析物の量を、蛍光色素のシグナル強度により定量する方法が知られている。ただし、当該評価方法では、複数の識別子（蛍光色素）の励起波長や極大波長が重複すると、これらの判別が非常に難しい。したがって、一度に使用可能な識別子（蛍光色素）の数に限りがあり、分析物中に多数の成分が混在する場合には、当該方法の適用が難しかった。

ここで、これまでデータ過多で活用が難しかった蛍光指紋技術が人工知能（ＡＩ）の利用によって、帰納的データとして有効活用できるようになってきた。蛍光指紋（または励起・蛍光マトリックス：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ－Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ）計測は、励起光の波長及び観察する蛍光の波長の両方を変化させながら、蛍光の強度を計測する総当たり的な計測である。当該蛍光指紋技術は、食品の品質評価等に使用されている。例えば、食品に元来含まれる各成分が発する多様な蛍光シグナルを解析することで、その品質を評価できる。

近年、当該蛍光指紋技術を、上述の蛍光色素のシグナル強度による定量にも展開することが試みられている。例えば特許文献１及び２には、例えば対象物のみに特異的に作用する蛍光標識物質で、対象物を修飾し、これを蛍光指紋で評価することが記載されている。

一方、対象物に特異的に作用する蛍光標識物質も種々開発されており、例えば隣り合うヌクレオチド間に蛍光発光性基を含むオリゴヌクレオチド標識物質等も開発されている（例えば特許文献３）。当該標識物質は対象物である核酸と相互作用させると、検出可能な蛍光シグナルを発する。

特開２０２０－２０１２０２号公報 特表２０１２－５０７７１０号公報 国際公開第２０１０／００１９０２号

ここで、上記特許文献１や特許文献２に記載されているような蛍光指紋技術を、ｍＲＮＡワクチンの劣化度の評価に適用することが考えられる。しかしながら、特許文献１や特許文献２のように、対象物に特異的に相互作用する標識物質を使用すると、標識物質が劣化物には相互作用しない。したがって、対象物の有無は確認できるものの、その劣化状態まで評価することはできない。一方で、劣化物に特異的に作用する他の標識物質を別途作成することも考えられるが、通常、劣化によって、種々の分解物等が生じるため、各劣化物に対応する標識物質を多数準備する必要がある。つまり、その準備には、多大なコストや時間が必要であり、現実的ではない。さらに、当該方法では、対象物が想定外の構造に変化した場合に、当該成分を検出できない。

本発明は、一種以上の対象物を含む組成物について、対象物を分離することなく、簡便な方法で、組成物の状態を把握可能な、評価方法の提供を目的とする。

本発明は、以下の組成物の評価方法を提供する。
１種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、前記混合物について蛍光指紋を取得する工程と、前記蛍光指紋に基づいて前記組成物の状態を評価する工程と、を含み、前記相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造、及び／又は１種以上の各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有する、組成物の評価方法。

本発明は、以下の組成物の評価方法も提供する。
１種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、前記混合物に、所定の波長の励起光を照射し、前記混合物が発する蛍光を測定する工程と、前記測定の結果から、前記対象物の状態を評価する工程と、を含み、前記標識物質の相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造を有する、及び／又は各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有し、前記励起光の波長は、前記組成物の状態が互いに異なる複数のサンプルを準備し、前記複数のサンプルに前記標識物質をそれぞれ混合して、複数の標準混合物を調製し、前記複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得し、前記各サンプル中の前記組成物の状態及び前記各標準蛍光指紋を機械学習させることによって作成された、状態推定モデルから特定された波長である、組成物の評価方法。

本発明の組成物の評価方法によれば、１種以上の対象物を含む組成物について、対象物を分離することなく、簡便な方法で、組成物の状態を把握可能である。

図１Ａおよび図１Ｂは、いずれも蛍光指紋の例を示すグラフである。 図２は、第１の実施の形態のフローを示す図である。 図３は、第１の実施の形態の変形例のフローを示す図である。 図４は、状態推定モデルを準備する方法のフローを示す図である。 図５は、第２の実施の形態のフローを示す図である。 図６は、第２の実施の形態に使用する所定の波長を決定する際のフローを示す図である。

以下、本発明について、２つの実施の形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施の形態に限定されない。

１．第１の実施の形態
本実施の形態の組成物の評価方法のフローを図２に示す。本実施の形態の組成物の評価方法では、１種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程Ｓ１１（以下、「混合物調製工程」とも称する）と、前記混合物について、蛍光指紋を取得する工程Ｓ１２（以下、「蛍光指紋取得工程」とも称する）と、前記蛍光指紋に基づいて、前記組成物の状態を評価する工程Ｓ１３（以下、「評価工程」とも称する）と、を行う。

本実施の形態では、上記標識物質として、対象物に対して、非特異的に作用する物質を用いる。本明細書において「非特異的に作用する」とは、標識物質が１種の物質だけでなく、複数の物質に対してそれぞれ作用可能であったり、特定の物質の１つの位置だけでなく、複数の位置に作用可能であったりすることをいう。本実施の形態では、標識物質の相互作用部が、複数種の対象物にそれぞれ相互作用可能である核酸構造を有する、もしくは各対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有する。

前述のように、従来、蛍光シグナルを解析する手法では、測定したい物質のみに、特異的に作用する標識物質が用いられてきた。これに対し、本発明者らが鋭意検討したところ、対象物に非特異的に相互作用する標識物質を用いることで、対象物の有無だけでなく、組成物の状態も評価できることが明らかとなった。例えば、標識物質が特定の対象物に相互作用したときと、標識物質が特定の対象物から変化した成分に相互作用したときとでは、標識物質の蛍光発光部の周囲の分子構造や相互作用部の相互作用状態が異なる。したがって、蛍光発光部が発する蛍光波長や蛍光強度が微妙に変化する。また、標識物質が対象物の複数の部位に相互作用可能である場合、対象物の状態が変化すると、状態変化した部位に標識物質が相互作用しなくなったり、相互作用したとしても、その周囲の分子構造が異なるため、蛍光波長や蛍光強度が微妙に変化する。したがって、これらの相違を検出できれば、組成物の状態を評価できる。

ただし、従来の一般的な蛍光シグナルを解析する手法では、これらの違いを特定することが難しい。そこで、本実施の形態では、蛍光指紋を利用し、当該蛍光指紋に基づいて、組成物の状態を特定する。蛍光指紋の取得に際しては、励起光の波長や観察する蛍光の波長を変えながら、網羅的に計測が行われる。したがって、上記変化を検出しやすく、組成物の状態を詳細に特定することが可能となる。

なお、本実施の形態では、図２に示すように、混合物調製工程Ｓ１１、蛍光指紋取得工程Ｓ１２、および評価工程Ｓ１３をそれぞれ一回ずつ行ってもよい。一方で、複数種類の標識物質を用い、標識物質の種類や、標識物質どうしの組み合わせを変えて、混合物調製工程Ｓ１１および蛍光指紋取得工程Ｓ１２を複数回行い、複数の蛍光指紋に基づいて評価工程Ｓ１３を行ってもよい。複数の蛍光指紋に基づいて評価工程Ｓ１３を行ったほうが、組成物の状態をより正確に評価できることから好ましい。以下、各工程について説明する。

（１）混合物調製工程
本実施の形態の混合物調製工程Ｓ１１では、一種以上の対象物を含む組成物と、標識物質とを混合し、混合物を調製する。

本工程で使用する組成物は、標識物質を相互作用させて、その存在や濃度、劣化度等を特定したい対象物を一種以上含んでいればよい。組成物は、本実施の形態の目的および効果を損なわない範囲において、対象物以外の成分を含んでいてもよく、例えば溶媒等を含んでいてもよい。

対象物は、少なくとも一部に、標識物質の相互作用部（核酸構造）と相互作用可能な構造を有していれば、その種類は特に制限されない。対象物の例には、ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸、アミロイドβ等のタンパク質、ワイン中の酒石酸やポリフェノール等、カビ毒や微生物、脂肪酸、繊維(獣毛等)等が含まれる。また、対象物の例には、上記成分の一部または全部が構造変化したものや、上記成分の分解物、凝集物等も含まれる。

例えば、ｍＲＮＡワクチンの劣化度を測定する場合、劣化したワクチン（組成物）中には、ｍＲＮＡや、ｍＲＮＡの分解物といった対象物が含まれる。

一方、本工程で組成物と混合する標識物質は、対象物と相互作用可能な核酸構造を含む相互作用部と、励起光の照射によって発光可能な蛍光発光部と、を有していればよく、これら以外の構造を含んでいてもよい。標識物質は、例えば対象物への相互作用に寄与しない核酸構造（以下、「その他の核酸構造」とも称する）や、蛍光発光部の蛍光を制御するための消光部、人工核酸構造、光応答性基等をさらに有していてもよい。なお、本工程では、組成物に標識物質を１種のみ混合してもよく、２種以上の標識物質を組み合わせて混合してもよい。

標識物質の相互作用部は、対象物に非特異的に相互作用可能な核酸構造を有する。相互作用部と対象物との相互作用の例には、核酸どうしの水素結合（ハイブリダイゼーション）、酵素や腫瘍マーカー等生体物質中のタンパク質アミド基やアミノ酸との水素結合、酸との水素結合、形成した立体構造の形状による相互作用等が含まれる。

相互作用部の核酸構造は、対象物の構造等に合わせて適宜選択され、対象物が核酸の場合、当該核酸構造は、対象物が有する一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有することが好ましい。また、当該核酸構造の相補的配列は比較的短い塩基配列で構成されることが好ましい。核酸構造（塩基配列）が短いと、一種の対象物の核酸構造だけでなく、複数種の対象物の核酸構造にも相互作用しやすくなる。また、対象物が、同一または類似の塩基配列を複数含む場合、これらにそれぞれ相互作用しやすくなる。ただし、核酸構造内の相補的配列中の塩基の個数が過度に少ないと、対象物の多くの構造に作用してしまい、蛍光指紋が非常に複雑になる。そこで、相互作用部の核酸構造中の相補的な塩基の個数は、５個以上２０個以下程度が好ましく、７個以上１０個以下がより好ましい。塩基の個数が当該範囲であると、標識物質が対象物と適度に相互作用しやすくなる。標識物質は、このような相互作用部（核酸構造）を、分子内に１つ、または複数含む。

一方、標識物質が含む蛍光発光部の構造や位置は特に制限されず、例えば、その他の核酸構造を介して、上記相互作用部と離れた位置に配置されていてもよい。ただし、蛍光発光部が相互作用部と近い位置に配置されているほうが好ましく、相互作用部の端部、または相互作用部の核酸構造の塩基間に配置されていることが好ましい。蛍光発光部と相互作用部との距離が近いと、相互作用部と対象物等との相互作用状態に応じて、蛍光発光部が発する蛍光の波長や強度が変化しやすくなる。

また、標識物質が含む蛍光発光部の数は特に制限されず、１つであってもよく、複数であってもよい。標識物質が蛍光発光部を複数有する場合、蛍光発光部同士を作用させて、標識物質が対象物と相互作用していないときに自己消光させたり、標識物質が対象物と相互作用したときに発光強度を高めたりすること等が可能となる。

蛍光発光部が含む色素の種類は特に制限されず、その例には一般的な蛍光色素（例えばシアニン系色素、メロシアニン系色素、アクリジン系色素、クマリン系色素、エチジウム系色素、フラビン系色素、縮合芳香環系色素、キサンテン系色素等）が含まれる。

また、標識物質は、核酸構造の塩基間に、人工核酸構造を有していてもよい。人工核酸構造とは、天然核酸に非天然部を導入又は非天然部のみで合成した核酸構造をいう。人工核酸構造は、通常、自然界には存在しない、完全に人工的に合成された分子である。そのため、空気中に存在する核酸分解酵素等に認識されにくく、分解されにくいという特長をもつ。このような人工核酸構造を、相互作用部内に挿入することで、標識物質を安定化したり、蛍光発光部の蛍光強度を高めたりすること等が可能となる。人工核酸構造の例には、ａｃｙｃｌｉｃ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ａＴＮＡ）、Ｓｅｒｉｎｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｇｌｙｃｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＧＮＡ）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等が含まれるが、これらに限定されない。

また、標識物質は、相互作用部の核酸構造の塩基間に、蛍光発光部の蛍光強度を高めるためのインスレーターを含んでいてもよい。標識物質がインスレーターを含むと、他の蛍光発光部等への電子移動が抑制され、蛍光発光部の蛍光強度が高まりやすくなる。インスレーターは、通常、蛍光発光部に隣接して配置される。インスレーターは、例えば、非平面構造の環状体等とすることができ、その例には、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクヘプタン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘプテン、これらの誘導体等由来の構造が含まれる。

また、標識物質は、相互作用部の核酸構造の塩基間に、特定波長の光の照射により構造が変化する光応答性基を有していてもよい。相互作用部の核酸構造の塩基間に光応答性基が存在すると、特定の光の照射によって、標識物質（相互作用部）と対象物との相互作用状態が変化する。その結果、蛍光発光部が発する蛍光の波長や強度がより細かく調整される。上記光応答性基の例には、特定の光の照射によって、平面的な構造から立体的な構造に変化する基等が含まれる。具体的には、トランス型からシス型へ変化する基や、メロシアニン型からスピロピラン型に変化する基が含まれる。また特に、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベン、またはこれらの誘導体由来の構造であると、特定の波長の光の照射によって、可逆的に構造が変化するため、好ましい。

ここで、標識物質は、ステム構造およびループ構造を有していてもよい。標識物質が蛍光発光部と消光部を有する場合、ステム構造には、蛍光発光部と、当該蛍光発光部に対応する消光部とが対向するように配置することができる。つまり、通常の状態では、消光部と蛍光発光部とが相互作用して、蛍光発光部の発光が抑制される。一方で、標識物質が対象物等と相互作用すると、ステム構造が開いて、消光部による消光抑制が解除され、蛍光発光部が蛍光を発する。消光部は、蛍光発光部と作用して、その発光を抑制可能なものであれば特に制限されず、例えばアゾベンゼンやその誘導体由来の構造等とすることができる。

なお、標識物質がステム構造およびループ構造を有する場合、相互作用部は、ループ構造内に配置されていてもよく、ステム構造内に配置されてもよく、これら両方にわたって配置されていてもよい。

対象物がＲＮＡワクチンである場合等には、ステム構造の一方の鎖がポリＵ配列であり、ステム構造の他方の鎖がポリＡ配列であり、ループ構造が相互作用部である標識物質等を用いてもよい。このような標識物質では、通常の状態では、ポリＵ配列およびポリＡ配列によって、ステムが形成される。一方で、対象物と混合した際にはその末端（例えばポリＡ配列）と標識物質（ここでは相補的であるポリＵ配列）とが近づくことで、その他の相補的塩基配列部分も近接し、ステムが開く。ハイブリダイゼーションが起こりやすくなり、効率向上に繋がる。また、ステム構造の一方が蛍光発光部であり、ステム構造の他方に消光部がある標識物質等を用いてもよい。通常の状態では、蛍光発光部と消光部とが近接して、蛍光発光部の発光が抑制される。一方で対象物と混合した際にはステムが開くことで消光部が離れ、蛍光発光部が蛍光を発することが可能となる。

なお、上記標識物質は、直接組成物と混合してもよいが、ゼラチンナノ粒子や、脂質ナノ粒子等の粒子に内包された標識物質を組成物と混合してもよい。標識物質が、ゼラチンナノ粒子や、脂質ナノ粒子等に内包されていると、標識物質内の核酸構造部等が、大気中の酵素等の影響を受けにくい。したがって、標識物質の分解等を防ぐことができ、安定性が向上し、長期保存も可能となる。本実施形態の非特異的に作用する標識物質は測定対象ごとに調整する必要が無いため、予め標識物質を複数種類用意して保存することで、新たな測定対象にも迅速に対応することができる。

なお、標識物質がゼラチンナノ粒子や、脂質ナノ粒子等に内包されている場合には、通常、そのままでは対象物と相互作用することはできない。そこで、粒子から標識物質を放出させる必要があるが、界面活性剤を添加したり混合物の液性を酸性にすることで簡単に標識物質を放出させることが可能である。また、対象物がＲＮＡワクチンである場合には、通常、前述のように脂質ナノ粒子等により保護されているため、同様に内包されたｍＲＮＡを放出させ測定を行う。

（２）蛍光指紋取得工程
蛍光指紋取得工程Ｓ１２では、上述の混合物から、蛍光指紋を取得する。蛍光指紋は、通常、混合物に照射する励起光の波長、励起光を照射された混合物（上記蛍光発光部位）が発する蛍光の波長、およびその強度の３次元データとすることが好ましい。蛍光指紋は、例えば図１Ａおよび図１Ｂに示すようなグラフで表すことができる。なお、図１Ａは、特定の樹脂の蛍光指紋であり、図１Ｂは、当該樹脂を加熱し、変性させた後の蛍光指紋である。

ここで、上記混合物の蛍光指紋を取得する方法としては、以下の通りである。まず、上記混合物に励起光源から、特定の波長の励起光を照射する。そして、当該励起光を照射したときに、混合物が発する蛍光の波長および強度を測定する。次いで、励起光の波長を、所望の幅（例えば１０ｎｍ）ずらし、同様に蛍光の波長および強度を測定する。これらを繰り返し行う。これにより、所望の波長範囲の励起光に対応する、蛍光波長および蛍光強度のデータが得られる。そして、これらを３次元データ化することで、蛍光指紋を取得する。

なお、蛍光指紋の取得に使用する励起光の波長は、標識物質が有する蛍光発光部の種類や、対象物の種類等に応じて適宜選択される。例えば、対象物がＲＮＡワクチン等である場合には、可視光とすることができる。また、励起光の照射に用いる光源は特に制限されないが、スーパーコンティニューム光源（光ファイバーの非線形効果を利用して非常に広い波長範囲にわたって、位相の揃った強い光を出す広帯域パルス光源であり、「ＳＣ光源」とも呼ばれる。）やＬＥＤとすることができる。これらの光源によれば、光量を大きくでき、良好な蛍光指紋を取得しやすい。なお、複数の光源を組み合わせてもよい。

一方、混合物が発する蛍光の波長および強度の測定は、分光蛍光光度計等が含まれる。測定は、複数の分光蛍光光度計を用いて行ってもよい。

また、励起光の波長、蛍光の波長、および蛍光強度の３次元データ化は、一般的なパソコン等によって行うことができる。

（３）評価工程
評価工程Ｓ１３では、組成物の状態を評価する。本明細書における組成物の状態とは、組成物が含む対象物の濃度や組成物の組成、特定の対象物の変質状態や劣化状態等をいい、例えば当該評価工程Ｓ１３では、対象物の劣化度や、凝集度等、対象物の化学的または物理的な変化の度合い、組成物の真偽の評価や、組成物の使用可否の評価等が含まれる。

特に、従来の方法では、対象物の劣化度を特定することが難しかった。そこで、対象物の劣化度を評価することが特に好ましい。一般的に対象物が劣化した場合、対象物と劣化物を分離することが困難であったり、違いが微小すぎて判別できなかったりすることが多い。これに対し、本実施の形態の方法では、これらの微小な差を検出でき、かつ定性的に精度よく評価できる。

ここで、組成物の状態の評価は、上述の蛍光指紋取得工程Ｓ１２で得られた蛍光指紋と、対象物の理想的な状態（例えば劣化していない対象物）の蛍光指紋とを比較して、状態変化度を特定してもよい。また、対象物が状態変化した後の蛍光指紋を取得しておき、当該蛍光指紋と比較して、状態変化度を特定してもよい。これらの比較は、上述のパソコンにより行ってもよい。

また、蛍光指紋取得工程Ｓ１２で得られた蛍光指紋を、統計解析処理によって、より低次元にすると共に、組成物の状態ごとの特徴を端的に表すようにパラメータ化して、組成物を評価してもよい。統計解析処理方法の例には、多変量解析やデータマイニングが含まれる。その具体例には、データ構造分析、判別分析、パターン分類、多元データ解析、回帰分析、及び機械学習等が含まれる。

上記データ構造分析としては、主成分分析、因子分析、対応分析及び独立成分分析が挙げられる。上記判別分析としては、線形判別分析又は非線形判別分析が挙げられる。線形判別分析としては、正準判別分析が挙げられ、非線形判別分析としては、決定木が挙げられる。

上記パターン分類としては、クラスター分析、多次元尺度法が挙げられる。上記回帰分析としては、線形回帰及び非線形回帰が挙げられる。ここで、線形判別分析としては、Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅ（ＰＬＳ）回帰、単回帰分析、重回帰分析及び主成分回帰が挙げられ、非線形判別分析としては、ロジスティック回帰及び回帰木が挙げられる。

上記機械学習としては、ニューラルネットワーク、自己組織化マップ、集団学習及び遺伝的アルゴリズムが挙げられる。統計解析処理は、組成物の状態を最も的確に解析できる手法であれば、どの分析方法を用いてもよい。

また、本工程は、図３のフローに示す変形例のように、組成物の状態を評価する際、状態推定モデルを予め準備する工程Ｓ１００を行い、蛍光指紋取得工程Ｓ１２で得られた蛍光指紋について、対象物の状態を評価する工程Ｓ１３０としてもよい。状態推定モデルを利用することで、容易に評価を行うことができる。なお、状態推定モデルは、予め作成したものを利用することができ、毎回作成する必要はない。また、図３のフローでは、状態推定モデルを準備する工程Ｓ１００を混合物調製工程Ｓ１１の前に記載しているが、状態推定モデルを準備する工程Ｓ１００は、蛍光指紋取得工程Ｓ１２の前や後に行ってもよい。

状態推定モデルは、例えば以下のように作成できる。状態推定モデルの作成フローを図４に示す。まず、組成物の状態が互いに異なる複数のサンプルを準備する（Ｓ１０１）。このとき、対象物の劣化率等、細かく評価したい場合等には、組成物中の対象物の劣化率を調整したサンプルを複数準備してもよい。一方で、組成物の状態を細かく調整することが難しく、定性的な評価を行う場合には、状態変化が大きいサンプル、状態変化が中程度のサンプル、状態変化が少ないサンプル、等を準備してもよい。

そして、組成物の状態が異なる複数のサンプルに、上述の混合物調製工程と同様に、それぞれ標識物質を混合し、標準混合物を調製する（Ｓ１０２）。そして、これらの複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得する（Ｓ１０３）。標準蛍光指紋の取得方法は上述の蛍光指紋取得工程と同様である。その後、得られた標準蛍光指紋と、組成物の状態と、を機械学習させて状態推定モデルを得る（Ｓ１０４）。なお、状態推定モデルを作成する際には、一種類（もしくは一つの組み合わせ）の標識物質だけでなく、異なる種類の標識物質を使用して、多くの標準蛍光指紋を取得することが好ましい。例えば、サンプルが５つ、標識物質の種類が１０種である場合には、５個×１０種の蛍光指紋を機械学習させることになる。

機械学習の方法は公知の方法を利用することができる。例えば、特定のサンプルに対して、標準蛍光指紋を説明変数、状態の変化度を目的変数として、多変量解析を行い、類似度指標を求める。類似度指標は、コサイン類似度、ピアソンの相関係数、偏差パターン類似度、ユークリッド距離類似度、モリシタの類似度指数、標準ユークリッド距離類似度、マハラノビス距離類似度、マンハッタン距離類似度、チェビシェフ距離類似度、ミンコフスキー距離類似度、ジャッカード係数類似度、ダイス係数類似度、および、シンプソン係数類似度等から選択することができる。

類似度指標計算工程において、目的変数である状態変化度と測定対象物の蛍光指紋の類似度指標には相関があるという前提の下、予め用意したある状態変化度のサンプルに対して、蛍光指紋の類似度指標を計算する。これを状態変化度が異なる複数のサンプルに対して行い、算出された類似度指標と用意したサンプルの状態変化度の誤差が小さくなるように繰り返し実行し最適化を行うことで、推定モデルを作成することができる。

なお、多くの解析手法は２次元データを対象に開発されている。一方、上述の蛍光指紋は、励起光の波長、蛍光の波長、および蛍光強度の３次元データである。そこで、３次元データを２次元に展開して、多変量解析を行ってもよい。例えば、蛍光指紋測定結果を、各標識物質に、波長条件（励起波長と蛍光波長の組み合わせ）と蛍光強度との２次元データに展開し、多変量解析を行ってもよい。また、２次元に展開した蛍光指紋情報に対して、中心化（ｍｅａｎｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）、規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、標準化（ａｕｔｏｓｃａｌｅ）、２次微分（２ｎｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ベースライン補正（ｂａｓｅｌｉｎｅｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、および平滑化（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）等の処理を行ってもよい。これにより、各データに含まれている情報の強調、異なるサンプルのデータの尺度を合わせることができる。一方で、３次元データのまま多変量解析を行ってもよい。

また、必要に応じて、得られた類似度指標から、推定に重要な（組成物の状態によって変化が顕著）なマーカーシグナル（励起波長および蛍光の組み合わせ等）を検出することもできる。このとき、多変量解析として主成分回帰、クラスター分析、判別分析、ＳＩＭＣＡ、重回帰分析、ＰＬＳ回帰分析、ＰＬＳ判別、ＳＶＭ回帰、ＳＶＭ判別、ＲＦ回帰、および／またはＲＦ判別を行い、マーカーシグナルを検出してもよい。また、多変量解析で得られる回帰係数、因子負荷量、ローディング、ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｒａｔｉｏ、ｖａｒｉａｂｌｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ、変数重要度、ｏｕｔｏｆｂａｇｅｒｒｏｒの１または複数の回帰・判別への寄与率を示す指標に基づき、マーカーシグナルを検出してもよい。

そして、上記類似度指標を求めたサンプルとは異なる組成物のサンプルについて、マーカーシグナルの数値を推定する。その後、推定によって算出されたデータと、実際のデータとを比較し、これらの誤差が小さくなるように繰り返し最適化を行う。これらの作業により、蛍光指紋データ等から、組成物の状態を特定可能な状態推定モデルを得てもよい。

そして、当該状態推定モデルに、上記蛍光指紋取得工程で得られた蛍光指紋を当てはめることで、組成物の状態を評価できる。

（効果）
本実施の形態では、対象物に非特異的に相互作用する標識物質を用い、さらに蛍光指紋を取得する。本実施の形態の方法によれば、組成物中の対象物等を分離することなく、簡便な方法で、組成物の状態を把握できる。また、当該方法では、対象物が複数あったとしても、対象物ごとに、標識物質を準備する必要がなく、標識物質の準備に必要なコストや時間が少ない。さらに、対象物が予想外の構造に変化した場合にも、標識物質によって検出できる可能性が高い。したがって、例えばｍＲＮＡワクチン等について、非常に簡便な工程で評価な特定を行うことができる。

２．第２の実施の形態
本実施の形態の組成物の評価方法のフローを図５に示す。本実施の形態の組成物の評価方法では、一種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程Ｓ２１（以下、「混合物調製工程」とも称する）と、前記混合物に、所定の励起光を照射し、蛍光を測定する工程Ｓ２２（以下、「蛍光測定工程」とも称する）と、当該測定の結果から、組成物の状態を評価する工程Ｓ２３（以下、「評価工程」とも称する）と、を行う。本実施の形態においても、上記標識物質として、第１の実施の形態と同様に、対象物に対して、非特異的に作用する物質を用いる。

また、本実施形態の蛍光測定工程で照射する励起光の波長は、予め状態推定モデルから所定の波長決定する工程（Ｓ２００）等を行って決定される。つまり、本実施の形態では、組成物の状態が変化したときに、混合物の発光波長や発光強度等がどのように変化するか、予め分析したうえで、状態の変化の検出に適した励起光の波長が選択されている。したがって、蛍光測定工程で、所定の波長の励起光によって生じる蛍光波長や蛍光強度を測定し、これを基準値等と比較することで、容易に組成物の状態を評価することが可能である。なお、図５に示すフローでは、励起光の波長を決定する工程Ｓ２００が、混合物調製工程Ｓ２１の前に記載されている。しかしながら、一度、励起光の波長を決定する工程Ｓ２００を行っておけば、毎回波長を決定する工程Ｓ２００を行う必要はない。したがって、すでに励起光の波長が決定されていれば、混合物調製工程Ｓ２１、蛍光測定工程Ｓ２２、および評価工程Ｓ２３のみを行う。なお、本実施の形態の混合物調製工程Ｓ２１は、上述の第１の実施の形態の混合物調製工程Ｓ１１と同様であるため、蛍光測定工程および評価工程について説明する。

（１）蛍光測定工程
蛍光測定工程Ｓ２２では、上述の混合物調製工程Ｓ２１で得られた混合物に、所定の励起光を照射し、当該混合物が発する蛍光を測定する。本工程で照射する所定の波長の励起光は、上述のように、状態推定モデルを作成して特定された励起光である。本工程では、１種のみ励起光を照射し、混合物が発する蛍光を測定してもよいが、複数の波長の励起光を順に照射し、それぞれについて混合物が発する蛍光を測定することが、より正確な評価が可能であるとの観点で好ましい。

なお、本工程における励起光の光源は、励起光の波長に応じて適宜選択され、ＳＣ光源やＬＥＤ等とすることができる。また、蛍光の測定装置は、分光蛍光光度計や、一次元ラインセンサ等とすることができる。

ここで、本工程で混合物に照射する、励起光の波長を決定するための、状態推定モデルの作成方法は、上述の第１の実施の形態の評価工程Ｓ１３で説明した方法と略同様である。図６に、励起光の波長を決定するフローを示す。まず、組成物の状態が異なる複数のサンプルを準備する（Ｓ２０１）。そして、当該複数のサンプルに、上述の混合物調製工程Ｓ２１と同様に、それぞれ標識物質を混合し、標準混合物を調製する（Ｓ２０２）。そして、これらの複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得する（Ｓ２０３）。そして、得られた標準蛍光指紋と、組成物の状態と、を機械学習させる（Ｓ２０４）。その後、標準蛍光指紋および組成物の状態に基づいて算出される類似度指標から、推定に重要な（組成物の状態変化によって変化が顕著）なマーカーシグナル（例えば励起波長と蛍光波長との組み合わせ）を１つ以上検出する（Ｓ２０５）。そして、当該マーカーシグナルにおける励起光の波長を、１つ、または２つ以上選択し、これを蛍光測定工程Ｓ２２における励起光の波長とする。

（２）評価工程
評価工程Ｓ２３では、上述の蛍光測定工程Ｓ２２で得られたデータに基づき、組成物の状態を評価する。たとえば、状態推定モデルから、励起波長λ１において、波長λ２の蛍光が検出される場合には、組成物中の対象物の劣化度が高い、との情報や、励起波長λ３において、蛍光波長λ４の強度が高いと、組成物の劣化が高い等、の情報を予め取得しておく。そして、蛍光測定工程で測定された蛍光の波長および強度のデータと、これらの情報とを比較し、組成物の状態を評価することができる。また、蛍光測定工程Ｓ２２で得られたデータを、上述の所定の波長の決定の際に作成した状態推定モデルにあてはめ、組成物の状態を評価してもよい。

（３）効果
本実施の形態では、対象物に非特異的に相互作用する標識物質を用いる。さらに、予め状態推定モデルに基づいて決定された励起波長を照射して、蛍光測定を行う。そのため、本実施の形態では、測定に際し、全波長範囲を測定する必要がなく、短時間の測定で、目的とする組成物の状態を簡単に評価することができる

また、当該方法では、対象物ごとに、標識物質を準備する必要がなく、標識物質の準備に必要なコストや時間が少ない。さらに、対象物が予想外の構造に変化した場合にも、標識物質によって検出できる可能性が高い。したがって、例えばｍＲＮＡワクチン等について、非常に簡便な工程で評価な特定を行うことができる。

３．その他
上述のいずれの実施の形態においても、混合物調製工程等において、組成物と標識物質とを混合する方法は特に制限されない。例えば、複数の凹部を有し、各凹部に異なる標識物質を入れたプレートを準備し、上記凹部にインクジェット法で組成物を所定量ずつ、注入してもよい。そして、当該プレートを用いて、蛍光指紋取得工程や、蛍光測定工程を行ってもよい。当該方法によれば、簡便に複数の混合物や標準混合物を調製できる。

本出願は、２０２１年８月２日出願の特願２０２１－１２６６６８号に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の組成物の評価方法では、対象物を分離することなく、簡便な方法で、組成物の状態を把握することが可能である。したがって、各種薬品や食品の劣化度を測定したり、各種医療分野での検査等に有用である。

Claims (10)

1. １種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、
   前記混合物について蛍光指紋を取得する工程と、
   前記蛍光指紋に基づいて前記組成物の状態を評価する工程と、
   を含み、
   前記相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造、及び／又は１種以上の各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有し、
   前記状態を評価する工程において、前記組成物の劣化度を評価する、
   組成物の評価方法。
2. １種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、
   前記混合物について蛍光指紋を取得する工程と、
   前記蛍光指紋に基づいて前記組成物の状態を評価する工程と、
   を含み、
   前記相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造、及び／又は１種以上の各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有し、
   前記相互作用部は、前記核酸構造の塩基間に、特定波長の光の照射により構造が変化する光応答性基を有する、
   組成物の評価方法。
3. 互いに異なる前記相互作用部を有する、複数種類の前記標識物質を用いる、
   請求項１または２に記載の組成物の評価方法。
4. 前記状態を評価する工程で、状態推定モデルに基づき、前記対象物の状態を評価し、
   前記状態推定モデルは、
   前記組成物の状態が互いに異なる複数のサンプルを準備し、
   前記複数のサンプルに前記標識物質をそれぞれ混合して、複数の標準混合物を調製し、
   前記複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得し、
   前記各サンプル中の前記組成物の状態及び前記各標準蛍光指紋を機械学習させることによって作成されたものである、
   請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物の評価方法。
5. 前記相互作用部は、人工核酸構造を含む、
   請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物の評価方法。
6. 前記標識物質は、前記相互作用部の塩基間に前記蛍光発光部を有する、
   請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物の評価方法。
7. 前記標識物質は、ループ構造及びステム構造を有し、
   前記ステム構造内で、前記蛍光発光部及び前記蛍光発光部に対応する消光部が対向して配置される、
   請求項６に記載の組成物の評価方法。
8. 前記標識物質が、粒子に内包されている、
   請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物の評価方法。
9. １種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、
   前記混合物に、所定の波長の励起光を照射し、前記混合物が発する蛍光を測定する工程と、
   前記測定の結果から、前記対象物の状態を評価する工程と、
   を含み、
   前記対象物の状態を評価する工程において、前記組成物の劣化度を評価し、
   前記標識物質の相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造を有する、及び／又は各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有し、
   前記励起光の波長は、
   前記組成物の状態が互いに異なる複数のサンプルを準備し、
   前記複数のサンプルに前記標識物質をそれぞれ混合して、複数の標準混合物を調製し、
   前記複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得し、
   前記各サンプル中の前記組成物の状態及び前記各標準蛍光指紋を機械学習させることによって作成された、状態推定モデルから特定された波長である、
   組成物の評価方法。
10. １種以上の対象物を含む組成物、並びに相互作用部及び蛍光発光部を有する標識物質を混合し、混合物を調製する工程と、
    前記混合物に、所定の波長の励起光を照射し、前記混合物が発する蛍光を測定する工程と、
    前記測定の結果から、前記対象物の状態を評価する工程と、
    を含み、
    前記標識物質の相互作用部は、複数種の前記対象物にそれぞれ相互作用可能な核酸構造を有する、及び／又は各前記対象物の複数の位置に相互作用可能な核酸構造を有し、かつ前記核酸構造の塩基間に、特定波長の光の照射により構造が変化する光応答性基を有し、
    前記励起光の波長は、
    前記組成物の状態が互いに異なる複数のサンプルを準備し、
    前記複数のサンプルに前記標識物質をそれぞれ混合して、複数の標準混合物を調製し、
    前記複数の標準混合物について、それぞれ標準蛍光指紋を取得し、
    前記各サンプル中の前記組成物の状態及び前記各標準蛍光指紋を機械学習させることによって作成された、状態推定モデルから特定された波長である、
    組成物の評価方法。