JP7809342B2

JP7809342B2 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導する方法

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Publication number: JP7809342B2
Application number: JP2022544021A
Authority: JP
Inventors: 眞一郎藤井; 佳奈子清水
Original assignee: RIKEN
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Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2021-08-20
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Description

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導する方法、そのためのペプチドおよび当該ペプチドを含む免疫原性組成物に関する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０２０年に引き起こされたパンデミックの原因となったコロナウイルスである。２０２０年１月７日に世界保健機関（ＷＨＯ）は、このウイルスを２０１９－ｎＣｏＶと暫定的に命名した。また、同年２月１１日に国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）はこのウイルスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と正式に命名した。ＷＨＯは、この新型コロナウイルスによる疾患をＣＯＶＩＤ－１９と命名している。国際ウイルス分類委員会は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、ベータコロナウイルス属に属し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同じ種（又はその姉妹系統）であるとしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ９０８９４７．３として米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に登録されている。

ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍ程度の粒径を有し、一般的なコロナウイルスと同じようにスパイクタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、膜タンパク質、およびエンベロープタンパク質とウイルスゲノムＲＮＡを含む。ヌクレオキャプシドタンパク質がＲＮＡと複合体を形成し、その周囲に脂質と結合したスパイクタンパク質、膜タンパク質、およびエンベロープタンパク質が取り囲んで、ビリオンのエンベロープが形成される。エンベロープの最外表面に位置するスパイクタンパク質は、細胞表面のＡＣＥ２受容体に結合して細胞への感染を促進すると考えられている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しても疾患の症状が現れない者が存在し、これを無症状病原体保有者という。無症状病原体保有者は、その保有するウイルスを他者に感染させる可能性があることが指摘されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染によって、嗅覚および／または味覚が低下するまたは喪失することが指摘されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、重症急性呼吸症候群を生じさせることがある。重症急性呼吸器症候群では、主症状として、４０℃程度の発熱、咳、息切れが報告されている。顕著な合併症は、肺炎である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの開発が進められている。現状においては、多様なワクチンの開発が求められている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関しては、配列相同性や生物情報学的アプローチにより免疫応答を誘導する標的ペプチドの探索がなされている（非特許文献１）。

Ｇｒｉｆｏｎｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，２７（４）：６７１－６８０，２０２０

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導する方法、そのためのペプチドおよび当該ペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。

より具体的には、本発明は以下の発明を提供する。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列または、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質の部分ペプチドを含み、８～３０アミノ酸長を有するペプチド。
（２）上記（１）に記載のペプチドであって、
配列番号８に記載のアミノ酸配列の位置１２０４～１２２６の領域に含まれる、８～２０アミノ酸長の連続したアミノ酸配列、または当該配列に対応する位置のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド。
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる上記（１）または（２）に記載のペプチド。
（４）配列番号１０～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、１５～１８アミノ酸長を有する、上記（１）または（２）に記載のペプチド。
（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載のペプチドを含む、免疫原性組成物。
（６）上記（１）～（４）のいずれかに記載のペプチドを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導することに用いるための医薬組成物。
（７）対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導する方法であって、
上記（１）～（４）のいずれかに記載のペプチド、または上記（５）または（６）に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
（８）対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象である、上記（７）に記載の方法。（９）対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したリスクを有する対象である、上記（７）に記載の方法。
（１０）対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクを有する対象である、上記（７）に記載の方法。

図１は、５名健康なドナー（ＨＤ１～ＨＤ５）のＰＢＭＣからの抗原特異的Ｔ細胞の生成の分析を示す。ＰＢＭＣのサイトカイン産生をＦＡＣＳ分析により解析した。各ペプチドの存在下でＰＢＭＣを２１ｄ培養した後、ＰＢＭＣを収穫し、ＩＦＮ－γ産生について評価した。Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を、ゴルジプラグ（ＢＤ）および各関連ペプチドの存在下で１６時間培養した後、細胞内染色分析により評価した。図２は、Ｃｏｖ２－Ｓ抗原を発現するＨＬＡ－Ａ２４＋標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を示す。ＨＤ５からの培養ＰＢＭＣを各ペプチドと共培養して３週間後に採取した。ペプチドパルス化または非パルス化されたＨＬＡ－Ａ２４＋Ｃ１Ｒに対するＴ細胞の細胞傷害性は、５０：１、２５：１、１２．５：１の比率（Ｅ／Ｔ）で細胞傷害性Ｔ細胞（Ｅ）とＨＬＡ－Ａ２４＋Ｃ１Ｒ細胞（Ｔ）とを共培養することにより評価した。図３は、４名の健常ボランティア（ＨＶ１～５）のＰＢＭＣからの抗原特異的Ｔ細胞の生成の分析を示す。ＰＢＭＣのサイトカイン産生をＦＡＣＳ分析により解析した。各ペプチドの存在下でＰＢＭＣを２１ｄ培養した後、ＰＢＭＣを収穫し、ＩＦＮ－γ産生について評価した。Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を、ゴルジプラグ（ＢＤ）および各関連ペプチドの存在下で１６時間培養した後、細胞内染色分析により評価した。図４は、図３のデータをグラフ化したものである。

発明の具体的な説明

本明細書では、「対象」とは、脊椎動物であり、例えば、ヒトを含む哺乳類、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染する哺乳類（ネコ、フェレット、コウモリ、およびセンザンコウ）であり得る。対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象であり得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した無症状病原体保有者であり得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し、ＣＯＶＩＤ－１９を発症した対象であり得る。対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した可能性（リスク）を有する対象であり得、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する可能性（リスク）を有する対象であり得る。対象は、小児（例えば、幼児（生後１～６年）、学童（生後６～１２年）、青年（生後１２年～）、成人（生後２０年～）であり得る。成人は、３０歳以上、４０歳以上、５０歳以上、６０歳以上、または７０歳以上の成人であり得る。

本明細書では、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、２０２０年に引き起こされたパンデミックの原因となったコロナウイルスである。２０２０年１月７日に世界保健機関（ＷＨＯ）は、このウイルスを２０１９－ｎＣｏＶと暫定的に命名した。また、同年２月１１日に国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）はこのウイルスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と正式に命名した。コロナウイルスは、一般的な風邪から重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）や中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）などの重篤な呼吸器疾患を引き起こしうる。ＷＨＯは、この新型コロナウイルスによる疾患をＣＯＶＩＤ－１９と命名している。国際ウイルス分類委員会は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、ベータコロナウイルス属に属し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同じ種（又はその姉妹系統）であるとしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ９０８９４７．３として米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に登録されている。ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍ程度の粒径を有し、一般的なコロナウイルスと同じようにスパイクタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、膜タンパク質、およびエンベロープタンパク質とウイルスゲノムＲＮＡを含む。ヌクレオキャプシドタンパク質がＲＮＡと複合体を形成し、その周囲に脂質と結合したスパイクタンパク質、膜タンパク質、およびエンベロープタンパク質が取り囲んで、ビリオンのエンベロープが形成される。エンベロープの最外表面に位置するスパイクタンパク質は、細胞表面のＡＣＥ２受容体に結合して細胞への感染を促進すると考えられている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しても疾患の症状が現れない者が存在し、これを無症状病原体保有者という。無症状病原体保有者は、その保有するウイルスを他者に感染させる可能性があることが指摘されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染によって、嗅覚および／または味覚が低下するまたは喪失することが指摘されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、重症急性呼吸症候群を生じさせることがある。重症急性呼吸器症候群では、主症状として、４０℃程度の発熱、咳、息切れが報告されている。顕著な合併症は、肺炎である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の有無は、主にＰＣＲ検査によって判定されている。このＰＣＲ検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的にバンドを増幅するか否かによって、体内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子が存在するか否かを評価するものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス薬（例えば、レムデシビル）、ステロイド系抗炎症薬（例えば、デキサメタゾン）、および炎症性サイトカインの阻害剤（例えば、ＩＬ－６阻害剤、例えば、抗ＩＬ－６抗体、ＴＮＦ－α阻害剤、例えば、エタネルセプト）が挙げられる。

本明細書では、「スパイクタンパク質」は、上記ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ９０８９４７．３として米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に登録されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの２１５６３番目～２５３８４番目にコードされるタンパク質であり得、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。スパイクタンパク質は、Ｓタンパク質とも呼ばれる。

本明細書では、「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーを意味する。ポリマーは、通常分岐を有しない。「部分ペプチド」とは、特定のペプチドの一部を意味する。ペプチドおよび部分ペプチドは、当該ペプチドおよび部分ペプチドが表面に露出している限り、他のタンパク質に連結していてもよく、脂質に連結していてもよく、または非荷電親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に連結していてもよい。ペプチドおよび部分ペプチドは、当該ペプチドをコードする核酸から製造され得る。ペプチドおよび部分ペプチドはまた、化学合成され得る。ペプチドおよび部分ペプチドはまた、単離、濃縮、または精製されている。単離とは、ペプチドおよび部分ペプチドを少なくとも他の成分から分離することを意味し、精製とは、ペプチドおよび部分ペプチドを少なくとも選択的に分離することを意味する。濃縮は、ペプチドおよび部分ペプチドの濃度が高まっていることを意味する。

本明細書では、「組成物」とは、１以上の成分の混合物である。組成物は、例えば、部分ペプチドと水性溶媒（例えば、水）を含み得る。組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。本明細書では、免疫原性組成物とは、対象に投与することによって当該対象の体内で免疫反応を惹起することができる組成物である。免疫原性組成物は、対象において免疫反応を誘発することに用いられ得る。免疫原性組成物は、対象において免疫反応を惹起することができるので、ワクチンとして用いることができる。例えば、本発明の免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫反応を誘発することに用いられ得、または、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンとして用いられ得る。

本明細書では、「処置」は、予防的処置および治療的処置を含む。処置は、症状を有する患者または無症状病原体保有者に対してなされ得る。治療的処置は、感染したウイルスに対してなされ得、予防的処置は、将来の感染を予防するため、または将来の感染によりＣＯＶＩＤ－１９が発症するのを遅延させ、もしくは発症したＣＯＶＩＤ－１９の症状を低減するためになされ得る。

本明細書では、「ヒト白血球抗原」（ＨＬＡ）は、ヒトの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）である。ＨＬＡは、免疫細胞への抗原の提示に関与しており、様々なアリル多型が知られている。日本人では、最も頻度高く検出されるアレルがＡ＊２４：０２であり、日本人の約３６％がこのアレルを有する。ＨＬＡに提示されるペプチドはペプチドワクチンとして有用であり得るが、例えば、Ａ＊２４：０２に提示されるペプチドは、日本人の集団においてペプチドワクチンとして有用であり得る。

本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドが提供される。本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列または、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質（例えば、天然のその変種）の部分ペプチドを含むペプチドが提供される。

ある態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ９０８９４７．３として米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に登録されたスパイクタンパク質またはこれと９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一なアミノ酸配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質であり得る。

本開示ではまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質の部分ペプチドを含み、８～３０アミノ酸長（好ましくは、８～１０アミノ酸長、１５～１８アミノ酸長、８～２０アミノ酸長、８～１１アミノ酸長、または９アミノ酸長、もしくは１０アミノ酸長であり得、より好ましくは９アミノ酸長である）を有するペプチドが提供される。ここで、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質のアミノ酸配列を有する部分ペプチドとは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の天然の変種において、上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とアラインメントしたときに対応する位置に並べられるアミノ酸配列を意味する。

本開示ではまた、配列番号８に記載のアミノ酸配列の位置１２０４～１２２６の領域に含まれる、８～２０アミノ酸長（例えば、８～１０アミノ酸長、例えば、９アミノ酸長、または１５～１８アミノ酸長）の連続したアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。ここで、当該ペプチドは、好ましい一態様では、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。

本開示ではまた、配列番号８に記載のアミノ酸配列の位置１２０４～１２２６の領域に含まれる、８～２０アミノ酸長（例えば、８～１０アミノ酸長、例えば、９アミノ酸長、または１５～１８アミノ酸長）の連続したアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される２以上のペプチドを含む、組成物が提供される。この組成物は、Ｔ細胞上に発現するＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）に対して多様なエピトープを提供し得るため、多様な抗原特異性を有するＴ細胞集団を誘導（または活性化）し得ることとなる。

８～１０アミノ酸長（好ましくは９アミノ酸長）のペプチドは、ＨＬＡクラスＩにより直接的に抗原提示され、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞を活性化し得る。これに対して、１５～１８アミノ酸長のペプチドは、細胞に取り込まれて分解され、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩのいずれによっても抗原提示され、ＣＤ４単独陽性Ｔ細胞およびＣＤ８単独陽性Ｔ細胞を活性化し得る。８～１０アミノ酸長（好ましくは９アミノ酸長）のペプチドは、細胞内に取り込まれ、分解されてＨＬＡに抗原提示されるプロセスを経ずに、直接的にＨＬＡにより抗原提示できるために即効性に免疫を活性化できる。これに対して、１５～１８アミノ酸長のペプチドは、ＣＤ４単独陽性Ｔ細胞およびＣＤ８単独陽性Ｔ細胞の両方を活性化し得る。当業者であれば、目的に応じてアミノ酸長を適宜選択してワクチンとして用いることができるであろう。

また、本開示によれば、本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞が提供される。本開示によれば、本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞を含む、医薬組成物が提供される。本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞を含む医薬組成物は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに感染した対象に投与され得、当該対象においてその感染を処置することができる。本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞を含む医薬組成物は、細胞の調製に適した溶液条件を有する。本発明のペプチドによって活性化されたＴ細胞を含む医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。活性化は、ペプチドと抗原提示細胞とＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはターミナルエフェクターＴ細胞）とを培養することによって行うことができる。このときに培養は、サイトカイン存在下（例えば、ＩＬ－２存在下）で行うことができる。Ｔ細胞は、ブレフェルディンＡおよび／またはモネンシン存在下でさらに活性化してもよい。

本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０）によって、デフォルトの設定（但し、Ａ＊２４：０２）で、スコアが０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上または０．７以上であり得る。

本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質の部分ペプチドを含み、当該部分ペプチドは、８～３０アミノ酸長（好ましくは、８～１０アミノ酸長、１５～１８アミノ酸長、８～２０アミノ酸長、８～１１アミノ酸長、または９アミノ酸長、もしくは１０アミノ酸長であり得、より好ましくは９アミノ酸長である）を有するペプチドであり、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０）において、デフォルトの設定（但し、Ａ＊２４：０２）で、スコアが０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上または０．７以上であり得る。

本開示では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一なアミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０）において、デフォルトの設定（但し、Ａ＊２４：０２）で、スコアが０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上または０．７以上であり得る。

本開示による上記ペプチドは、例えば、Ａ＊２４：０２のＨＬＡを有するヒトにおいて、良好にＨＬＡにより抗原提示されうる。また、当該抗原提示は、上記ペプチドに特異的な免疫応答を誘導しうる。したがって、本開示による上記ペプチドは、上記ペプチドに特異的な免疫応答を誘導させることに用いることができる。

本開示による上記ペプチドは、上記ペプチドに特異的なＴ細胞免疫を誘導することができる。したがって、本開示による上記ペプチドは、上記ペプチドに特異的なＴ細胞免疫を誘導することに用いることができる。

本開示による上記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導させることができる。したがって、本開示による上記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導させることに用いることができる。

本開示による上記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞免疫を誘導するができる。したがって、本開示による上記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞免疫を誘導することに用いることができる。

本開示による上記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンとして用いることができる。

本開示による上記ペプチドは、免疫原性組成物中に含まれうる。したがって、本開示によれば、本開示による上記ペプチドを含む免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物は、免疫補助剤（アジュバント）をさらに含んでいてもよい。アジュバントとしては、沈降性アジュバントおよび油性アジュバントが挙げられる。沈降性アジュバントとしては、水酸化ナトリウム、アルミニウム化合物アジュバント、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、ミョウバン、ペペス、およびカルボキシビニルポリマーが挙げられる。油性アジュバントとしては、流動パラフィン、ラノリン、フロイントが挙げられる。アジュバントとしては、不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバントが挙げられる。他のアジュバントとしてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドや抗原提示細胞も使用し得る。ＴＬＲリガンドは、少なくとも１つのＴＬＲに結合し、ＴＬＲの活性化、すなわち、ＴＬＲ媒介性細胞シグナル伝達の活性化をもたらす分子である。ＴＬＲリガンドは、例えば、ＴＬＲ１リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ６リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、またはＴＬＲ９リガンドであり得、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストであり得、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、スレオニルームラミルジペプチド（ｔ－ＭＤＰ）、ＯＭ－１７４、フラジェリン、一本鎖ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、イミダゾキノリンアミン（例えば、イミキモド（Ｒ－８３７））、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびその誘導体（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４などのトリアシル化リポペプチド、リポアラビノマンナン、リポマンナンなどのリポグリカン）、ザイモサン、モノホスホリピドＡ、ＦＳＬ－１、ロキソリビン、ブロピリミン、ｓｓポリＵ、レシキモド（Ｒ－８４８）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、ＣｐＧ病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ポリイノシン酸ポリシチジル酸（ＰｏｌｙＩＣ）、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸－ポリＬ－リジン（Ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ）、非メチル化ＣｐＧアイランドを含む核酸、ウイルスもしくは細菌起源のＤＮＡ、ホスホロチオエート含有分子（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチドアナログ）、ホスホロチオエート骨格を有する核酸、ＳＴＩＮＧリガンド、およびグランザイムＡなどが挙げられる。抗原提示細胞としては、樹状細胞マクロファージ、Ｂ細胞などがある。ある態様では、免疫原性組成物は、ヒトに投与される。

免疫原性組成物は、無菌性である。ある態様では、免疫原性組成物は、発熱原を含まない。免疫原性組成物は、ｐＨ６～８（例えば、ｐＨ７～７．４）に調整される。免疫原性組成物は、注射用に製剤化され得る。免疫原性組成物はまた、吸入投与用に製剤化され得る。免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、生理食塩水、ｐＨ緩衝剤、等張化剤、保存剤、および酸化防止剤が挙げられる。免疫原性組成物は、例えば、非経口投与、例えば、筋肉内投与、または静脈内投与され得る。

本開示によれば、対象において抗原特異的な免疫を誘導する方法であって、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。本開示によれば、対象において抗原特異的なＴ細胞免疫を誘導する方法であって、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。本開示によれば、対象において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法であって、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。本開示によれば、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導する方法であって、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。

本開示によれば、対象において抗原特異的な免疫を誘導することに用いるための医薬の製造における、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の使用が提供される。本開示によれば、対象において抗原特異的なＴ細胞免疫を誘導することに用いるための医薬の製造における、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の使用が提供される。本開示によれば、対象において抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することに用いるための医薬の製造における、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の使用が提供される。本開示によれば、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導することに用いるための医薬の製造における、当該対象に本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物の使用が提供される。

対象において抗原特異的な免疫を誘導したかいなかは、対象の末梢血中の細胞傷害性Ｔ細胞におけるＩＮＦ－γの産生量の増加により決定することができる。細胞傷害性Ｔ細胞におけるＩＮＦ－γの産生量が、有意に増加した場合には、対象において抗原特異的な免疫を誘導したと決定することができる。細胞傷害性Ｔ細胞におけるＩＮＦ－γの産生量は、例えば、投与前と比較して１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、または１０倍以上となり得る。したがって、細胞傷害性Ｔ細胞におけるＩＮＦ－γの産生量が上記のような倍率で増えた場合には、対象において抗原特異的な免疫を誘導したと決定することができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＩＬ－２存在下で培養してから上記決定のための測定に供することができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、フローサイトメトリーで当業者に周知の方法で単離することができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、ＣＤ３およびＣＤ８の発現を指標として単離することができる。

本開示によれば、表３のＮｏ．１～Ｎｏ．１２のいずれかに記載のＴＲＡ（α鎖）と、表３のＮｏ．１～Ｎｏ．１２のいずれかに記載のＴＲＢ（β鎖）を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供される。本開示によればまた、表３のＮｏ．１～Ｎｏ．１２のいずれかに記載のＴＲＡとＴＲＢを含むＴＣＲが提供される。本開示によれば、表４のＮｏ．１～Ｎｏ．２１のいずれかに記載のＴＲＡと、表４のＮｏ．１～Ｎｏ．２１のいずれかに記載のＴＲＢを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供される。本開示によればまた、表４のＮｏ．１～Ｎｏ．２１のいずれかに記載のＴＲＡとＴＲＢを含むＴＣＲが提供される。

本開示によれば、上記のＴＣＲからなる群から選択される１以上のＴＣＲを細胞表面に発現した細胞が提供される。本開示によれば、上記のＴＣＲからなる群から選択される１以上のＴＣＲを細胞表面に発現した細胞を含む、医薬組成物が提供される。当該細胞は、例えば、免疫細胞であり得、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδ Ｔ細胞、およびＭＡＩＴ細胞からなる群から選択される１以上の細胞であり得る。また、当該医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスの感染を処置することに用いることができる。本開示によればまた、上記ペプチドに対して応答して活性化するＴ細胞（例えば、ＩＮＦ－γまたはＴＮＦ－αを産生するＴ細胞）が提供される。このようなＴ細胞は、上記のペプチドのいずれか１以上により誘導され得る。本開示によればまた、上記ペプチドに対して応答して活性化するＴ細胞を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスの感染を処置することに用いることができる。本開示によればまた、上記ペプチドに対して応答して活性化するＴＣＲを有する細胞（特に、免疫細胞）を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスの感染を処置することに用いることができる。

本開示による上記ペプチドまたは免疫原性組成物は、対象に単回または複数回で投与することができる。投与は、例えば、週１回の頻度で投与することができる。

実施例１：ペプチドの合成と当該ペプチドに対する免疫誘導
１．材料と方法
１．１ヒトのサンプルと準備
ＰＢＭＣは、理化学研究所の健康な５人のドナー（ＨＤ１～ＨＤ５）から取得し、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ^ＴＭＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア）密度遠心によって分離した。ＰＢＭＣはＰＢＳで２回洗浄し、使用するまで液体窒素中で保存した。

１．２．試薬と抗体
ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－３）は、塩野義製薬株式会社から購入した。以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した：抗ヒトｍＡｂ；ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８、ＡＰＣコンジュゲート抗ＩＦＮ－ｇｍＡｂ。Ｔｏｐｏ－Ｐｒｏ－３およびカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

１．３．Ｔ細胞培養
ＰＢＭＣを１０％ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌのｈＩＬ－２を添加したＲＰＭＩで培養し、下記表１に記載の各ペプチド（１０μＭ、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）で刺激し、２１日間、毎週同じペプチドで再刺激した。ペプチド刺激により、ペプチドに結合親和性を有するＴ細胞が生き残ると考えられる。表１に記載されたペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドまたはスパイクタンパク質中に存在するＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性と予想されるペプチドである。予想は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０を用いて行われた。表１のペプチドは、８～１０アミノ酸長となるように設計され、ＨＬＡクラスＩと結合してＴ細胞に刺激を加えられた場合には、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞を生存させ得る。

１．４．フローサイトメトリー
上記の通りにペプチドで刺激したＴ細胞は、それだけではＩＦＮ－γ産生能を有しない。そこで、ＩＦＮ－γ細胞内染色のために、各ペプチドの有および無の条件下で、ブレフェルディンＡおよびモネンシンと共に１６時間、細胞を培養して、Ｔ細胞からのＩＮＦ－γの産生の誘導を試みた。この実験操作により、ペプチド特異的なＴＣＲを有するＴ細胞は、ＩＮＦ－γを産生すると考えられる。表面抗原ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８で表面染色した後、細胞を固定し、細胞内サイトカイン染色のためにＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ^ＴＭ（ＢＤ）で透過させた。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析した。

１．５．細胞傷害性アッセイ
３週間後、培養ＣＴＬ株をエフェクター細胞として採取した。Ｔ細胞細胞傷害性アッセイを、以下の標的細胞を用いて実施した。ＣＦＳＥで標識したＡ２４－ＣＩＲ細胞を、指示されたペプチドまたはＤＭＳＯで２時間パルスし、２回洗浄した。エフェクター細胞を、１２．５、２５および５０のエフェクター／標的細胞比で１×１０^４個の標的細胞と一緒に６時間培養し、６時間後、細胞を分析の直前にＴｏ－ＰＲＯ３で染色し、死細胞を識別した。自発的標的細胞死（ＳＤ）は、単独で培養した標的細胞の標識によって決定した。全細胞傷害性（ＴＤ）のポジティブコントロールとして、標識した標的細胞をＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎｔ）で透過させた。特異的な溶解は、以下の式を用いて計算した：（サンプル－ＳＤ／ＴＤ－ＳＤ）×１００。細胞をフローサイトメトリーで分析した。

２．結果
フローサイトメトリーにより、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞中における細胞内ＴＮＦ－γの発現が、表１に記載の各抗原ペプチドによって誘導されるかを確認した。陰性対照としては、ペプチドによる刺激を経験しないＰＢＭＣを用いた。データは、健常者ドナー（ＨＤ１～ＨＤ５）毎にペプチドによる刺激の有無で比較された。結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、ｐｅｔ＃４のペプチドが、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）に対して強いＩＦＮ－γの誘導を示した。

健常者ドナーＨＤ－５のＰＢＭＣをＩＬ－２存在下、ｐｅｐ＃４ペプチドでパルスして、ＰＢＭＣの培養物を得た。その後、得られたＰＢＭＣ培養物から細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を単離した。ＣＦＳＥで標識したＡ２４－ＣＩＲ細胞に対してｐｅｐ＃４ペプチドでパルスして、Ｃ１Ｒ細胞表面のＨＬＡにｐｅｐ＃４ペプチドを提示させた。その後、得られたＡ２４－Ｃ１Ｒ細胞に対して上記ＣＴＬを作用させて、抗原特異的なＣＴＬが誘導されたかを確認した。陰性対照としては、ｐｅｐ＃４ペプチドでパルスしないＡ２４－Ｃ１Ｒ細胞を用いた。Ｅ／Ｔは、ＣＴＬ数／Ａ２４－Ｃ１Ｒ細胞数の比を示す。結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、ＣＴＬは、ｐｅｐ＃４ペプチドでパルスされたＡ２４－Ｃ１Ｒ細胞に対して抗原特異的な殺傷作用を示した。このことから、ｐｅｐ＃４ペプチドは、抗原特異的なＣＴＬを誘導することが明らかとなった。

実施例２：１５アミノ酸長のペプチドの合成とＴ細胞誘導
表１の＃４のペプチド（９アミノ酸長）を中心として１５アミノ酸長の４種類のペプチドを合成した。４種類のペプチドのアミノ酸配列は以下の通りであった。

上記の通り１５ｍｅｒ－１ペプチドは、９アミノ酸のＣ末端の２つを削り、Ｎ末端側に８アミノ酸を延長して、１５ｍｅｒの連続した部分ペプチドとしたものである。１５ｍｅｒ－２～－４ペプチドは、４アミノ酸ずつＣ末端側にずらして作製した１５ｍｅｒの連続した部分ペプチドである。

実施例１と同様に、ＩＬ－２およびペプチド存在下で２１日間培養し、ブレフェルディンおよびモネシン存在下で、さらにペプチドで刺激してＩＮＦ－γの産生を調べた。具体的には、ＨＬＡ－Ａ２４０２の４人の健常者（ＨＶ）のＰＢＭＣｓに１５ｍｅｒのペプチドの混合物を各々のペプチドが１０μｇ／ｍｌになるように添加し、ＩＬ－２存在下で培養した。これにより、接触したペプチドに結合親和性を有するＴ細胞が生き残る。１週間毎に自家ＰＢＭＣに１５ｍｅｒのペプチド混合物をパルスし、４０Ｇｙ照射して、上記培養物に対してフィーダーとして加えた。１４日目および２１日目に、さらに１５ｍｅｒペプチド混合物を添加した。その後、得られた培養物に対して、各々の１５ｍｅｒのペプチドをパルスし、ブレフェルディンおよびモネシン存在下で、１６時間培養し、ＩＮＦ－γの産生を誘導した。細胞内サイトカイン（抗ＩＦＮ－ｇ－ＡＰＣ，抗ＴＮＦ－ａ－ＰＥ）染色を行い、ペプチド特異的サイトカイン産生ＣＤ８Ｔ細胞を解析した。

結果は、図３および４に示される通りであった。図３に示されるように、１５ｍｅｒ－２、１５ｍｅｒ－３，および１５ｍｅｒ－４による再刺激に反応してＣＤ８単独陽性Ｔ細胞がＩＮＦ－γおよびＴＮＦ－αの産生を増加させた。このことは、Ｔ細胞がペプチドにより傷害性を高めたことを意味する。図４は、図３のうち、ＩＮＦ－γ陽性、ＴＮＦ－α陽性のＣＤ８Ｔ細胞の割合をグラフ化したものである。１５ｍｅｒペプチドの中では、１５ｍｅｒ－３ペプチドが最も良好にＴ細胞を刺激した。

次に、得られたＴ細胞が有するＴＣＲレパトリーを調べた。
表１のペプチド＃４または１５ｍｅｒのペプチドに対して、自家ＰＢＭＣをフィーダーとして、２～３回再刺激することにより樹立したＣＴＬ株を表１のペプチド＃４（１０μＭ）存在下または非存在下で抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１を加え６時間培養し、抗ヒトＣＤ８－ＰＥおよびＡｑｕａで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａによりペプチド特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋細胞をプレートソーティングにより、９６ウェル丸底プレートに１細胞／ウェルとなるようにソートした。１５ｍｅｒペプチドについてはペプチド混合物（各ペプチド１０μｇ／ｍｌ）存在下または非存在下で抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＢＶ４２１を加え１６時間培養し、抗ヒトＣＤ８－ＰＥおよびＡｑｕａで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａによりｐｅｐｔｉｄｅ特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋細胞をプレートソーティングにより、９６ウェル丸底プレートに１細胞／ウェルとなるようにソートした。各ウェルのＴ細胞のＴＣＲを分析した。結果は、表３および４に示される通りであった。

表３および４に示されるように、９ｍｅｒのペプチドにより生存したＴ細胞のＴＣＲのαおよびβ遺伝子は１２通りの多様性を示したが、１５ｍｅｒのペプチド混合物により生存したＴ細胞のＴＣＲのαおよびβ遺伝子は２１通りの多様性を示した。推定通りに、エピトープの多様性によって、活性化されるＴ細胞が有するＴＣＲの多様性が増加することが示された。このことは、ペプチド混合物は、多様な抗原特異性を有するＴ細胞を誘発し、これによりウイルス等の外敵を様々な多様性を有するＴ細胞が攻撃できることを意味する。すなわち、ウイルスの一部分において変異が生じた場合でも、より広い多様性を有するＴ細胞によりウイルスが引き続き攻撃されうることを示唆するものである。更に、上記ＴＣＲのデータからＴＣＲ遺伝子導入細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδ Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞）もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞を殺傷しうる治療薬として使用できることが示唆される。

理論上は、１５ｍｅｒのペプチドは、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩの両方に提示され得、ＣＤ４単独陽性Ｔ細胞およびＣＤ８単独陽性Ｔ細胞の活性化を引き起こし得る。本実施例では、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞について確認したところ、１５ｍｅｒのペプチドのうちの３つは、ＣＤ８単独陽性Ｔ細胞によるサイトカイン産生を活性化させることができた。このことから、１５ｍｅｒのペプチドは、ＣＤ４単独陽性Ｔ細胞も同様に活性化するものと期待される。

また、１５ｍｅｒペプチドは、細胞内に取り込まれて断片化され、約９ｍｅｒの部分ペプチドとしてＨＬＡに提示される。このときに９ｍｅｒの部分ペプチドの可能な生成パターンに多様性が生じ、より多様性の高いＴＣＲに働き、Ｔ細胞の活性化を引き起こすと考えられる。

Claims

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列または、当該配列に対応する位置のスパイクタンパク質の部分ペプチドを含み、８～３０アミノ酸長を有し、かつスパイクタンパク質に対する特異的なＴ細胞免疫を誘導することができるペプチドを含む、対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞傷害性Ｔ細胞免疫を誘導することに用いるための免疫原性組成物。
請求項１に記載の免疫原性組成物であって、
前記部分ペプチドが、配列番号８に記載のアミノ酸配列の位置１２０４～１２２６の領域に含まれる、８～２０アミノ酸長の連続したアミノ酸配列、または当該配列に対応する位置のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を有する、免疫原性組成物。
請求項１または２に記載の免疫原性組成物であって、
前記ペプチドが、配列番号４または１１に記載のアミノ酸配列からなる、免疫原性組成物。
前記ペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、１５～１８アミノ酸長を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したリスクを有する対象である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクを有する対象である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
対象が、ヒトである、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。