JP7812112B2 - 子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法、子宮がんモデル非ヒト動物、および被検物質の評価方法 - Google Patents

Description

本開示は、子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法、子宮がんモデル非ヒト動物、および被検物質の評価方法に関する。

子宮がんは、子宮頚がんと、子宮体がんから構成される。さらに、子宮体がんは、子宮内膜由来の子宮内膜がんと、その他の部位が悪性化した子宮筋腫などが含まれる。子宮内膜がんは、現在婦人科領域で最も多く、特に、近年は若年層の患者が増えている。このため、子宮内膜がんの治療薬の開発が進められている。

子宮がんの治療薬の開発においては、子宮がんモデルマウスが用いられている。前記子宮がんモデルマウスとしては、Ｃｒｅレコンビナーゼ（Ｃｒｅ）－ｌｏｘＰ配列を用いたマウスが存在する（非特許文献１）。前記モデルマウスとしては、子宮組織特異的なプロモーター依存的にＣｒｅ遺伝子を発現するマウスと、子宮がんの原因遺伝子であるＰＴＥＮ（Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10）遺伝子等をｌｏｘＰで挟み込んだマウスとを交雑することで、子宮全体で前記子宮がんの原因遺伝子をノックアウトし、製造されたモデルマウスが存在する。しかしながら、前記子宮がんは、上皮組織から発生しており、かつ、子宮内膜がん等の子宮がんにおいて前記原因遺伝子に変異が生じるのは、性成熟後である。前記子宮がんモデルマウスは、実際の疾患を再現できていないという問題がある。

Takiko Daikoku et.al., "Conditional Loss of Uterine Pten Unfailingly and Rapidly Induces Endometrial Cancer in Mice", 2008, Cancer Res, vol. 68, No. 14, pages 5619-5627

他の子宮がんモデルマウスとしては、ＰＴＥＮ遺伝子等をｌｏｘＰ配列で挟み込んだマウスの子宮内にＣｒｅ遺伝子を発現可能なアデノウイルスベクター（ＡＡＶ）を注入することにより、前記子宮がんの原因遺伝子をノックアウトすることにより製造されたモデルマウスが存在する。しかしながら、ｌｏｘＰ配列により前記子宮がんの原因遺伝子を挟み込んだマウスを事前に準備する必要があり、かつ、通常の子宮がんでは生じない、ＡＡＶによる感染の影響があり、実際の疾患を再現できていないという問題がある。また、現存するいずれのモデルにおいても、モデル動物について、事前にゲノムＤＮＡの改変が必要であり、モデル動物の作成が煩雑である。

そこで、本開示は、野生型の非ヒト動物からも作製可能な子宮がんのモデル非ヒト動物の製造方法の提供を目的とする。

前記目的を達成するため、本開示の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法（以下、「製造方法」という。）は、
非ヒト動物の子宮上皮細胞において、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと核酸編集モジュールとを接触させて、標的遺伝子に機能喪失変異を導入する変異導入工程を含み、
前記標的遺伝子は、ＰＴＥＮ遺伝子および肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）遺伝子を含む。

本開示の子宮がんモデル非ヒト動物（以下、「モデル動物」という。）は、子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体、ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体、およびＴｐ５３遺伝子の機能喪失体を含む。

本開示の被検物質の評価方法（以下、「評価方法」という。）は、被検物質を、子宮がんモデル非ヒト動物に投与する投与工程と、
前記子宮がんモデル非ヒト動物における子宮がんを評価する評価工程とを含み、
前記子宮がんモデル非ヒト動物は、前記本開示の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法により得られた子宮がんモデル非ヒト動物、および／または前記本開示の子宮がんモデル非ヒト動物である。

本開示によれば、野生型の非ヒト動物からも、子宮がんのモデル非ヒト動物を製造できる。

図１は、実施例１におけるｇＲＮＡ＿Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ ＢｂｓＩのベクターマップを示す模式図である。 図２は、実施例１におけるｐＰｙＣＡＧ－ｈＣａｓ９－ＩＰベクターのベクターマップを示す模式図である。 図３は、実施例１におけるエレクトロポレーション法を示す写真である。 図４は、実施例１におけるエレクトロポレーションによる、生体内のゲノム編集法の模式図である。 図５は、実施例１における子宮を観察した写真である。 図６は、実施例１における組織染色による子宮組織の組織写真を示す。 図７は、実施例１における標的遺伝子と、子宮角の重量とを示すグラフである。 図８は、実施例１におけるＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイの結果を示す写真である。 図９は、実施例１における子宮の上皮細胞の蛍光免疫染色の写真を示す。 図１０は、実施例１における子宮のステロイドホルモン受容体の免疫組織化学染色の写真を示す。

＜定義＞
本明細書において、「子宮がん」は、子宮において発生するがんを意味する。前記子宮がんは、子宮内の発生部位によって、さらに分類でき、具体的には、前記子宮の子宮内膜にがんが発生した場合、前記子宮がんは、「子宮内膜がん」ということもでき、前記子宮の子宮頚部にがんが発生した場合、前記子宮がんは、「子宮頚がん」ということもできる。

本明細書において、「動物」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。また、本明細書において、「非ヒト動物」は、ヒト以外の動物を意味する。前記非ヒト動物は、例えば、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。

本明細書において、「ゲノムＤＮＡ」は、真核細胞の細胞核内のゲノムにおけるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味する。

本明細書において、「野生型」は、対象動物のゲノムＤＮＡに、外来性の核酸が導入されていない状態であることを意味する。

本明細書において、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および／または改変ヌクレオチドのポリマーを意味する。前記核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記核酸は、例えば、「核酸分子」ということもできる。

本明細書において、「核酸編集」は、ゲノムＤＮＡにおける核酸配列（塩基配列）を変化させること、またはゲノムＤＮＡにおける核酸配列（塩基配列）の変化が生じうる状態にすることを意味する。前記核酸編集は、前記核酸配列の変化を意味してもよいし、前記ゲノムＤＮＡの一本鎖または切断により、前記核酸配列の変化が生じるうる状態を意味してもよいし、前記ゲノムＤＮＡの塩基の修飾により、前記核酸配列の変化が生じるうる状態を意味してもよい。

本明細書において、「核酸編集モジュール」は、前記核酸配列の変化を誘導可能な分子を意味する。

本明細書において、「ハイブリダイズ」は、ヌクレオチドの相補性、具体的には、ヌクレオチドにおける塩基の相補性により生じる相補的ポリヌクレオチドとのアニーリングを意味する、すなわち、２つのポリヌクレオチドが水素結合を介して非共有結合的に対を形成可能であることを意味する。

本明細書において、「相補性」または「相補的」は、あるポリヌクレオチドと、別のポリヌクレオチドとの間で、ヌクレオチド対、すなわち、塩基対を形成可能であることを意味する。

本明細書において、「タンパク質」または「ペプチド」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸)、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるポリマーを意味する。

本明細書において、「ポリペプチド」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸)、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるポリマーを意味する。前記ポリペプチドは、１０アミノ酸以上の長さを有するペプチドである。

本明細書において、「ドメイン」は、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドにおいて、立体構造または機能的にまとまった領域を意味する。

本明細書において、「遺伝子」は、所望のタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を意味する。前記ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本明細書において、前記遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。

本明細書において、「制御領域」は、ゲノムＤＮＡにおいて遺伝子発現を制御する領域を意味する。

本明細書において、「プロモーター」または「プロモーター領域」は、遺伝子またはポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ領域の上流に存在し、転写因子が結合する、核酸配列（塩基配列）を含む領域であり、前記遺伝子または前記ポリヌクレオチドの転写量を調節する領域を意味する。前記「プロモーター」または「プロモーター領域」は、例えば、「転写調節領域」ということもできる。

本明細書において、「機能喪失」は、例えば、当該遺伝子の本来有する機能が（有意に）低下または失われた状態を意味する。すなわち、本明細書において、「機能喪失変異」（loss of function mutation）は、当該遺伝子の本来有する機能が（有意に）減弱する変異、および完全な機能喪失が生じる変異のいずれの意味で用いてもよい。前記「完全な機能喪失が生じる変異」は、例えば、ヌル変異（null mutation）またはアモルフ（amorph）ということもできる。

本明細書において、「ＰＴＥＮ（Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10）遺伝子」は、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリリン酸（PI(3,4,5)P₃）を主な基質とするフォスファターゼ（脱リン酸化酵素）として知られるタンパク質をコードする遺伝子である。前記ＰＴＥＮは、ＰＩ_３キナーゼ経路を負に制御することが知られている。

本明細書において、「肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１：Liver Kinase B1）遺伝子」は、ＡＭＰキナーゼを主な基質とするキナーゼ（リン酸化酵素）として知られているタンパク質をコードする遺伝子である。前記ＬＫＢ１は、細胞極性およびエネルギー代謝に関与していることが知られている。前記ＬＫＢ１は、ＳＴＫ１１（serine/threonine kinase 11）ともいう。

本明細書において、「Ｔｐ５３（Tumor Protein p53）遺伝子」は、がんにおいて高い頻度で点突然変異や欠失等の異常が生じるがん抑制遺伝子である。

本明細書において、「発現ベクター」または「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを意味する。

本明細書において、「外来性」は、動物を構成する細胞外から細胞内に導入されたことを意味する。

本明細書において、「単離」は、同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「単離」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を得ることにより実施できる。

本明細書において、「標的部位」または「標的領域」は、ゲノムＤＮＡにおいて、所望の効果を誘導することを目的とする部位または領域を意味する。前記所望の効果は、例えば、前記核酸配列の変異（例えば、欠失、置換、挿入および／または付加）である。

本明細書において、「標的化」は、標的領域に結合または集積することを意味する。

本明細書において、「陽性」は、抗原抗体反応を利用して検出される免疫組織化学等の解析方法により、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、高いシグナル等が検出されることを意味する。また、本明細書において、「陰性」は、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、同等またはそれ以下のシグナル等が検出されることを意味する。

以下、本開示について例をあげて説明するが、本開示は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本開示における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。

＜子宮がんのモデル非ヒト動物の製造方法＞
ある態様において、本開示は、野生型の非ヒト動物からも作製可能な子宮がんのモデル非ヒト動物の製造方法を提供する。本開示の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法は、非ヒト動物の子宮上皮細胞において、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと核酸編集モジュールとを接触させて、標的遺伝子に機能喪失変異を導入する変異導入工程を含み、前記標的遺伝子は、ＰＴＥＮ遺伝子および肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）遺伝子を含む。本開示によれば、野生型の非ヒト動物からも子宮がんのモデル非ヒト動物を製造できる。本開示の製造方法によれば、子宮上皮細胞に由来する子宮がんの発生可能性を向上でできる。このため、本開示の製造方法は、例えば、非ヒト動物における子宮上皮細胞に由来する子宮がんの発生を向上するための方法ということもできる。

本開示者らは、鋭意研究の結果、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡを、前記核酸編集モジュールを用いて編集することにより、前記非ヒト動物の子宮上皮細胞由来の子宮がんを誘導できるのではないかとの着想を得た。そして、本発明者らは、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的遺伝子に対して、前記核酸編集モジュールを用いて機能喪失変異を導入することにより、前記子宮上皮細胞由来の子宮がんを誘導できることを見出し、本開示の製造方法を確立するに至った。本開示の製造方法によれば、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡにおける標的遺伝子に機能喪失変異を導入するため、子宮がんを誘導する非ヒト動物に対して、事前のゲノムＤＮＡの改変が不要である。このため、本開示の製造方法によれば、野生型の非ヒト動物からも子宮がんのモデル非ヒト動物を製造できる。また、本開示の製造方法は、特に、野生型の非ヒト動物から子宮内膜がんのモデル非ヒト動物の製造に好適に使用できる。

前記変異導入工程では、非ヒト動物の子宮上皮細胞において、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと核酸編集モジュールとを接触させて、前記標的遺伝子に機能喪失変異を導入する。すなわち、前記変異導入工程では、前記非ヒト動物の子宮上皮細胞の一部または全部について、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡにおける標的遺伝子に機能喪失変異が導入される。具体的には、前記変異導入工程では、例えば、前記子宮上皮細胞内の核酸編集モジュールが、前記子宮上皮細胞の細胞核内に移動し、前記核内のゲノムＤＮＡの標的遺伝子に対して核酸編集を行なうことにより、前記標的遺伝子に対して機能喪失変異が導入される。前記核内への輸送は、例えば、受動的な輸送でもよいし、能動的な輸送でもよい。後者の場合、前記核酸編集モジュールは、核局在化シグナル（核移行シグナル）を含むことが好ましい。前記変異導入工程では、前記核酸編集モジュールは、前記標的遺伝子の１または複数箇所に対して、機能喪失変異を導入する。前記変異導入工程において、導入する変異の数は、例えば、前記機能喪失変異を導入する位置および前記標的遺伝子の機能喪失の程度に応じて決定できる。この結果、前記変異導入工程では、前記標的遺伝子の機能喪失体を有する子宮上皮細胞を含む非ヒト動物が製造できる。

前記非ヒト動物は、野生型の非ヒト動物、すなわち、外来性の核酸がゲノムＤＮＡに導入されていない非ヒト動物であってもよい。前記野生型の非ヒト動物は、前記外来性の核酸をゲノムＤＮＡに含まない非ヒト動物ということもできる。前記野生型の非ヒト動物は、全身または一部の細胞のゲノムＤＮＡが、前記外来性の核酸を含まない。前記一部の細胞のゲノムＤＮＡが前記外来性の核酸を含まない場合、前記一部の細胞は、子宮上皮細胞または子宮体部の上皮細胞、すなわち、子宮内膜上皮細胞であることが好ましい。本開示の製造方法によれば、前述のように、野生型の非ヒト動物においても子宮がんを誘導できる。

前記外来性の核酸は、例えば、ｌｏｘＰ配列、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする配列等があげられる。

前記非ヒト動物は、ゲノムＤＮＡに、外来性のｌｏｘＰ配列を含まなくてもよい。前記ｌｏｘＰ配列は、バクテリオファージＰ１に由来する３４ｂｐの核酸配列（配列番号１）である。前記ｌｏｘＰ配列は、両端に１３ｂｐの核酸配列が対称となるＣｒｅ結合部位の核酸配列と、非対称の中心部の核酸配列とから構成される。前記ｌｏｘＰ配列は、前記バクテリオファージＰ１のバリエーションの配列でもよく、具体例として、ｌｏｘ５１１配列（配列番号２）、ｌｏｘ２２７２配列（配列番号３）、ｌｏｘＦａｓ配列（配列番号４）、ｌｏｘ ＲＥ配列（配列番号５）、ｌｏｘ ＬＥ配列（配列番号６）等があげられる。前記ｌｏｘＰ配列は、バクテリオファージＰ１に由来するＣｒｅレコンビナーゼ（Ｃｒｅ）に認識され、組替えが生じる配列である。前記バリエーションの配列は、例えば、下記参考文献２および３を参照できる。
参考文献２：Robert W Siegel et.al., “Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences”,2001, FEBS Letters, Volume 505, Issue 3, pages 466-466
参考文献３：Kimi Arak et.al., “Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells”, 1997, Nucleic Acids Research, Volume 25, Issue 4, Pages 868-872

ｌｏｘＰ配列（配列番号１）
5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'
ｌｏｘ５１１配列（配列番号２）
5'-ATAACTTCGTATAGtATACATTATACGAAGTTAT-3'
ｌｏｘ２２７２配列（配列番号３）
5'-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3'
ｌｏｘＦＡＳ配列（配列番号４）
5'-ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3'
ｌｏｘ ＲＥ配列（配列番号５）
5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3'
ｌｏｘ ＬＥ配列（配列番号６）
5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'

前記標的遺伝子は、ＰＴＥＮ遺伝子（Ｐｔｅｎ）およびＬＫＢ１遺伝子（Ｌｋｂ１）である。本開示の製造方法は、前記標的遺伝子として、さらに、Ｔｐ５３遺伝子（Ｔｐ５３）を含むことが好ましい。本開示の製造方法は、前記標的遺伝子として、Ｔｐ５３遺伝子を含むことにより、格段に効率よく、子宮がんモデル非ヒト動物を製造できる。

前記ＰＴＥＮ遺伝子、前記ＬＫＢ１遺伝子、および前記Ｔｐ５３遺伝子は、常染色体上の遺伝子であり、１対の常染色体の両者に各標的遺伝子が座乗している。このため、前記変異導入工程では、前記１対の常染色体の一方の標的遺伝子に機能喪失変異を導入してもよいし、前記１対の常染色体の両方の標的遺伝子に機能喪失変異を導入してもよく、より効率よく、子宮がんモデル非ヒト動物を製造できることから、後者が好ましい。また、前記変異導入工程では、前記複数の標的遺伝子のうち、いずれか１、２、または３つの標的遺伝子は、前記１対の常染色体の一方の標的遺伝子に機能喪失変異が導入され、残部の標的遺伝子は、前記１対の常染色体の両方の標的遺伝子に機能喪失変異が導入されてもよい。

前記非ヒト動物は、前記標的遺伝子であるＰＴＥＮ遺伝子およびＬＫＢ１遺伝子として、それぞれ、正常なＰＴＥＮ遺伝子および正常なＬＫＢ１遺伝子を有することが好ましい。また、前記標的遺伝子として、前記Ｔｐ５３遺伝子を含む場合、前記非ヒト動物は、前記標的遺伝子であるＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子として、それぞれ、正常なＰＴＥＮ遺伝子、正常なＬＫＢ１遺伝子、および正常なＴｐ５３遺伝子を有することが好ましい。各標的遺伝子の正常な標的遺伝子は、例えば、データベースに登録されている核酸配列を参照できる。また、各種動物（特に、哺乳動物）において、各標的遺伝子の正常な標的遺伝子は、ある動物の正常な標的遺伝子の核酸配列に基づき、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。具体例として、目的の動物における対応する標的遺伝子は、対応する標的遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子等）の核酸配列をクエリ配列として用い、目的の動物の核酸配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。下記表１に、マウスの正常ＰＴＥＮ遺伝子（Ｐｔｅｎ）、マウスの正常ＬＫＢ１遺伝子（Ｌｋｂ１）、およびマウスの正常Ｔｐ５３遺伝子（Ｔｐ５３）のゲノムの核酸配列（遺伝子（Genome））、ｃＤＮＡの核酸配列（遺伝子（cDNA））、およびタンパク質のアミノ酸配列のアクセッション番号について、例示する。

前記マウスの正常ＰＴＥＮ遺伝子は、例えば、下記配列番号７の核酸配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、前記正常ＰＴＥＮ遺伝子がコードするタンパク質は、例えば、下記配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。マウスの正常ＰＴＥＮ遺伝子は、前記配列番号８のＰＴＥＮタンパク質の機能的等価物をコードする遺伝子でもよい。

正常ＰＴＥＮ遺伝子の核酸配列（配列番号７、Accession No. 86355519（NM_008960））
5'-GCGGCAGGATACGCGCTTGGGCGTCGGGACGCGGCTGCGCTCAGCTCTCTCCTCTCGGAAGCTGCAGCCATGATGGAAGTTTGAGAGTTGAGCCGCTGTGAGGCCAGGCCCGGCGCAGGCGAGGGAGATGAGAGACGGCGGCGGCCACGGCCCAGAGCCCCTCTCAGCGCCTGTGAGCAGCCGCGGGGGCAGCGCCCTCGGGGAGCCGGCCGGGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGGCCTCGCCTCCTCGTCGTCTGTTCTAACCGGGCAGCTTCTGAGCAGCTTCGGAGAGAGACGGTGGAAGAAGCCGTGGGCTCGAGCGGGAGCCGGCGCAGGCTCGGCGGCTGCACCTCCCGCTCCTGGAGCGGGGGGGAGAAGCGGCGGCGGCGGCCGCGGCTCCGGGGAGGGGGTCGGAGTCGCCTGTCACCATTGCCAGGGCTGGGAACGCCGGAGAGTTGCTCTCTCCCCTTCTCCTGCCTCCAACACGGCGGCGGCGGCGGCGGCACGTCCAGGGACCCGGGCCGGTGTTAAGCCTCCCGTCCGCCGCCGCCGCACCCCCCCTGGCCCGGGCTCCGGAGGCCGCCGGAGGAGGCAGCCGCTGCGAGGATTATCCGTCTTCTCCCCATTCCGCTGCCTCGGCTGCCAGGCCTCTGGCTGCTGAGGAGAAGCAGGCCCAGTCTCTGCAACCATCCAGCAGCCGCCGCAGCAGCCATTACCCGGCTGCGGTCCAGGGCCAAGCGGCAGCAGAGCGAGGGGCATCAGCGACCGCCAAGTCCAGAGCCATTTCCATCCTGCAGAAGAAGCCTCGCCACCAGCAGCTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTCTTCAGCCACAGGCTCCCAGACATGACAGCCATCATCAAAGAGATCGTTAGCAGAAACAAAAGGAGATATCAAGAGGATGGATTCGACTTAGACTTGACCTATATTTATCCAAATATTATTGCTATGGGATTTCCTGCAGAAAGACTTGAAGGTGTATACAGGAACAATATTGATGATGTAGTAAGGTTTTTGGATTCAAAGCATAAAAACCATTACAAGATATACAATCTATGTGCTGAGAGACATTATGACACCGCCAAATTTAACTGCAGAGTTGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCACCACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTCTGTGAAGATCTTGACCAATGGCTAAGTGAAGATGACAATCATGTTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGGGACGGACTGGTGTAATGATTTGTGCATATTTATTGCATCGGGGCAAATTTTTAAAGGCACAAGAGGCCCTAGATTTTTATGGGGAAGTAAGGACCAGAGACAAAAAGGGAGTCACAATTCCCAGTCAGAGGCGCTATGTATATTATTATAGCTACCTGCTAAAAAATCACCTGGATTACAGACCCGTGGCACTGCTGTTTCACAAGATGATGTTTGAAACTATTCCAATGTTCAGTGGCGGAACTTGCAATCCTCAGTTTGTGGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATATATTCCTCCAATTCAGGACCCACGCGGCGGGAGGACAAGTTCATGTACTTTGAGTTCCCTCAGCCATTGCCTGTGTGTGGTGATATCAAAGTAGAGTTCTTCCACAAACAGAACAAGATGCTCAAAAAGGACAAAATGTTTCACTTTTGGGTAAATACGTTCTTCATACCAGGACCAGAGGAAACCTCAGAAAAAGTGGAAAATGGAAGTCTTTGTGATCAGGAAATCGATAGCATTTGCAGTATAGAGCGTGCAGATAATGACAAGGAGTATCTTGTACTCACCCTAACAAAAAACGATCTTGACAAAGCAAACAAAGACAAGGCCAACCGATACTTCTCTCCAAATTTTAAGGTGAAACTATACTTTACAAAAACAGTAGAGGAGCCATCAAATCCAGAGGCTAGCAGTTCAACTTCTGTGACTCCAGATGTTAGTGACAATGAACCTGATCATTATAGATATTCTGACACCACTGACTCTGATCCAGAGAATGAACCTTTTGATGAAGATCAGCATTCACAAATTACAAAAGTCTGATTTTTTTTTTCTTATCAAGAGGGATAAAATACCATGAAAAAAAAAAAACTTGAATAAACTGAAATGGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAATGGCAATAGGACATTGTGTCAGATTGCAGTTATAGGAACAATTCTCTTCTCCTGACCAATCTTGTTTTACCCTATACATCCACAGGGTTTTGACACTTGTTGTCCAGTTAAAAAAAGGTTGTGTAGCTGTGTCATGTATATACCTTTTTGTGTCAAAAGGACATTTAAAATTCAATTAGGATAAATAAAAGATGGCACTTTCCCATTTTATTCCAGTTTTATAAAAAGTGGAGACAGGCTGATGTGTATACGCAGGAGTTTTTCCTTTATTTTCTGTCACCAGCTGAAGTGGCTGAAGAGCTCTGATTCCCGGGTTCACGTCCTACCCCTTTGCACTTGTGGCAACAGATAAGTTTGCAGTTGGCTAAGGAAGTTTCTGCAGGGTTTTGTTAGATTCTAATGCATGCACTTGGGTTGGGAATGGAGGGAATGCTCAGAAAGGAATGTTTCTACCTGGGCTCTGGACCATACACCATCTCCAGCTCCTTAGATGCACCTTTCTTTAGCATGCTCCACTTACTAATCTGGACATCCGAGAGATTGGCTGCTGTCCTGCTGTTTGTTTGTGCATTTTAAAGAGCATATTGGTGCTAGACAAGGCAGCTAGAGTGAGTATATTTGTAGTGGGGTACAGGAATGAACCATCTACAGCATCTTAAGAATCCACAAAGGAAGGGATATAAAAAAAGTGGTCATAGATAGATAAAAGACACAGCAGCAATGACTTAACCATACAAATGTGGAGGCTTTCAACAAAGGATGGGCTGGAAACAGAAAATTTGACAATGATTTATTCAGTATGCTTTCTCAGTTGTAATGACTGCTCCATCTCCTATGTAATCAAGGCCAGTGCTAAGAGTCAGATGCTATTAGTCCCTACATCAGTCAACACCTTACCTTTATTTTTATTAATTTTCAATCATATACCTACTGTGGATGCTTCATGTGCTGGCTGCCAGTTTGTTTTTCTCCTTAAATATTTTATAATTCTTCACAGGAAATTTCAACTTGAGATTCAACAGTAAGCAGGTTTTGTTTTTTTTTTTTCCTAGAGATTGATGATGCGCGTCCTCAGTCCAGTGGCTGTCAGACGTTCAGCCCCTTTGACCTTACACATTCTATTACAATGAGTTTTGCAGTTTTGCACATTTTTTTTAAATGTCATTAACTGTTAGGGAATTTTACTTGAATACTGAATACATATAATGTGTATATTAAAAAAGTCATTGTTTGTGTTAAAAAAGAAATTAGAGTTGCAGTAAATTTACAGCACTGCACGAATAATAAGGCATTGAAGTTTTTCAGTAGAAATTGTCCTACAGATGCTTTATCGACTTGCTATTGGAAGAATAGATCTTCTTAAATGTGCAGTGTTGAGTCACTTCGTTATAGTGGTAGAGTTGGGATTAGGGCTTCAATTTTACTTCTTAAATATCATTCTATGTTTGATATGCCCAGACTGCATACAATTTAAAGCAAGAGTACAACTACTATCGTAATGGTAATGTGAAGATGCTATTACAAAGGATCTCCTCCCAACCCCTCGGGAATTTGGTGTCTTTCAAATTATATCTTGACCTTGACATTTGAATATCCAGCCATTATTAGATTTCTTAATGGTGTGAAGTCCCATTTTCAATAACTTATTGGTGCTGAAATTGTTCACTAGCTGTGGTCTGACCTAGTTAATTTACAAGTACAGATTGCATAGGACCCACTAGAGAAGCATTTATAGTTTGATGGTAAGTAGATTAGGCAGAACGCCATCTAAAATATTCTTAGAAAATAATGTTGATGTATTTTCCATACCTCATCAGTTTCACTCAACCAATAAAGTTTTTAAAATTGTAACAAAGCTCTTAGGATTTACACATTTATATTTAAACATTGATACATGAATATTGACTGACTGTTGATAAAGTCAGAGACAACTTTTCCTGAGATCTCACCATGGAAATCTGTACACCCCCTTGTCTTTCCTAAAAGCTGAAAGTGGCTGACTAAAATGCAAAGCAGCTGTTGATGTTTTGAAGATAGTGATAAACACTGTTCTTTGTTAGTTTTGGGCACAGCATGCTAAACTATAACTTGTATTGTTCCAATATGTAACACAGAGGGCCAGGTCATGAATAATGACATTACAATGGGCTGTTGCACTGTTAATATTTTTCCTTTGGAATGTGAAGGTCTGAATGAGGGTTTTGATTTTGAATGTTTCAGTGTTTTTGAGAAGCCTTGCTTACATTTTATGGTGTAGTCATTGGAAATGGAAAAATGGCATTATATATATATTATATATATATAAATATATATATTATACATACTCTCCTTACTTTATTTCAGTTACCATCCCCATAGAATTTGACAAGAATTGCTATGACTGAAAGGGTTTTGAGTCCTAATTCAAACTTTCTTTATGACAGTATTCACGATTAGCCTGAAGTGCATTCTGTAGGTGATCTCTCCCGTGTTTCTGGAATGCTTTCTTAGACTCTTGGATGTGCAGCAGCTTATGTGTCTGAAATGACTTGAAGGCATCACCTTTAAGAAGGCTTACAGTTGGGCCCCGTACATCCCAAGTCCTCTGTAATTCCTCTTGGACATTTTTGCCATAATTGTAAAAGGGTAGTTGAATTAAATAGCGTCACCATTCTTTGCTGTGGCACAGGTTATAAACTTAAGTGGAGTTTACCGGCAGCATCAAATGTTTCAGCTTTAAAAATAAAAGTAGGTTACAAGTTACATGTTTAGTTTTAGAAAATTTGTGCAATATGTTCATAACGATGGCTGTGGTTGCCACAAAGTGCCTCGTTTACCTTTAAATACTGTTAATGTGTCGTGCATGCAGACGGAAGGGGTGGATCTGTGCACTAAACGGGGGGCTTTTACTCTAGTATTCGGCAGAGTTGCCTTCTACCTGCCAGCTCAAAAGTTCGATCTGTTTTCATATAGAATATATATACTAAAACCATCCAGTCTGTAAAACAGCCTTACCCCGATTCAGCCTCTTCAGATACTCTTGTGCTGTGCAGCAGTGGCTCTGTGTGTAAATGCTATGCACTGAGGATACACAAATATGACGTGTACAGGATAATGCCTCATACCAATCAGATGTCCATTTGTTACTGTGTTTGTTAACAACCCTTTATCTCTTAGTGTTATAAACTCCACTTAAAACTGATTAAAGTCTCATTCTTGTCATTGTGTGGGTGTTTTATTAAATGAGAGTATTTATAATTCAAATTGCTTAAATCCATTAAAATGTTCAGTAATGGGCAGCCACATATGATTACAAAGTTCCTGTGCATTTTTCTATTTTTCCCCCTCCTTGCTATCCTTCCAAGCAAAGCATCTTTCTGTCATCTTGGTAGACACATACCTGTCTACTCATGGTTAAGAAGAGCACTTTAAGCCTTAGTCATCACTTAATAAGTTATTCCAGGCACAGTAAAAAGTTCAAGGTTCTTGGAAAACGGTGCTTATTTCTCTTCTTATAAGCCAGATGTCTGAAGATAGCCCTAACCCCAAGAACGGGCTTGATGTCTCAGGTCTGTTCTGTGGCTTTCTGTTTTTTTTAACACTGCAGTTGGCCATCAGCACATGGGAGGTTTCATCGGGACTTGTCCAGAGTAGTAGGCTCAAATATACTATCTCCTTTCTAATATTCTTAAAGGCTAAGGAGTCCTTTCAATATAACAGTAAGATAACTTGTGATGTTTTAGAAGTAAGCAGACCATTAATGTCAATGTGGAGTCTTAATGTTACATGAAGTTGATAGTTTCTCTGTGACCCATTTAAAAATACAAACCGAGTAGCATGCAATTATGTAAAGAAATATGAAGATTATATGTAGTCACACATTTTCTTTAGAATTCTTAGTTTGGTGAAAACTTGAATATAAAGGTATTTTGATTTATATGACATTTTGATGATATTTGAAAAAAAGGAATTTCCTGACATTTTGCTTTTAGATCATGTCCCCCATTGTGCTGTAATTTAAGCCAACTTGGTTCAGTGAATGCCATCACCATTTCCATTGAGAATTTAAAACTCACCAGTGTTTAACATGCAGGCTTCTGAGGGCTCCCGGAGAATCAGACCTTAAGCCCAGTTGATTTACTTCTAACGTGAAACTTCGAGTTCCTGTATACTTTGCTAGATAATTTGTGGTACATCTAAAGCTTAGTCTTAAGTGGCTTGTGTGTGGATTTTATTCAACATTCTTGTTGCTAGGGTAGAGAGAAATGTTGCTGAGTAGAAACAAGAGTACCCAGTTCAATGTGGTACAGAGAGCAGTCCCTAAAATCTGTACACAGTGTAATGGACCACTTTAGGAGTCAAGAGGCTGATTTTTCCTATGAAATTACATTGCAACAGGAAGCCTTCTAGTATAGTTCCTTTTACTGTTAGAATATGTTTTTATGCATACGCTATAGCTGCTTTCCCATCTTCCAACAACAGGTATCAGGATGTAAGCAAGCTTTAAACAGTGTGAAGATGGCAGGATAGTGTCATCGGTAACAGTCCTCTGACTCTAAATGTAGTTGCTCTGTAACACTTTGTGAATATAACATCACAATTCTCATGTCCTTGGGGGGGGGGGGCATACCCAGTATTAGTATGTTTTAGTGACTAAGCAATCATTTTTCTGTTTACTCATGTACATTTTCTCTTTAAAACTAAAACCTGTACTGTGTATGTCTCCAAAGCCTTTTAGCTTAGTTTTTAGGAAATGAACACTGAATGGATCACTTTTTAGTGTAGCAGGTATGGGATATGTGCATTATAGAGAGACCTTGTCAGCTCTCTGGGCCTATTTGAATGTTTATTGTTGGTGTGAGGATGGTAGGGGAATCAGTAAATACAAGTTACGTTGGTTTAGCAGAGCAAGCTCAGTGTGGGTATTTCTCTTTGAAGCGTGGTGCGTGACGCACTGTGAGTAGAGAATTTGGTCACCCTTTGAGTCCTCTTGCATTTTGCAAACTTGCTCAGCAAATGCGTACCTACCTTGCCCCCTAGGTAAAAGCAGGAACTACTACTGATTTATCTGTCACTCAGCTGTCTTTATATGTGTGCTTCTGTGACTTGTATCACACAAGAATCTTAAAGATTTCACAAATTGTTACCTTTTAGCTCTGAATGTTGAGTATTCTGGTGGGCTAACAACAAGACAAACTCTTGACAGTCATTTGAGAATTTTCATGAAACATTTAGCTGAAAACATTTTATAATTTATGAAAAAAATGTGTTACCTTAAACTTTTACATATGTGGGAGACATTAACTGCCATATTTGAGCATACTGAATTTTAAATTTAAAATAAAGCTGCATATTTTTAAATGAAATGTTTAACAAGGATTCATATTTTTTGTTTTTTAAGATTAAAAATAATTTATGTCTTCTCATGTGGAACCTCATCTGTCACAATGGTTAGATTATACAGAATGGAGCAAGGCTTGTAGTGGTTTAGCTTACAGTAAAATTCTTAATGTTTAGATGTGTTTACTTACTGGCTGTTATGTATACTTTTGAGATTTTCCACCTGTTCTGTGTAGTTTTCTAAATGATACTCCTACTTAAAAACAGCATTTTAGTATCTATTTTCTGTCTCCATTAAATGGTCCTCATTTTCTATTGAGTTTGGAAGTGTGCACATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCACACGTGTGCGCGCCCGTGCGTGTGTCTATTTGTGGAGTTTGTATGGGAGAATTAGTTTTGAAAGTGCTAGAATAGAGATGAAATTTGGTTCAAGTAAAATTTTCCCACTGGGATTTTACAGTTTATTGTAATAAAATGTTAATTTTGGATGACCTTGAATATTAATGAATTTGTTAGCCTCTTGATGTGTGCATTAATGAGATATATCAAAGTTGTATATTAAACCAAAGTTGGAGTTGTGGAAGTGTTTTTATGAAGTTCCGTTTGGCTACCAATGGACATAAGACTAGAAATACCTTCCTGTGGAGAATATTTTTCCTTTAAACAATTAAAAAGGTTCATTATTTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'

正常ＰＴＥＮ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８、Accession No. 6679523（NP_032986））
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHSQITKV

マウスの正常ＬＫＢ１遺伝子は、例えば、下記配列番号９の核酸配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、前記正常ＬＫＢ１遺伝子がコードするタンパク質は、例えば、下記配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。マウスの正常ＬＫＢ１遺伝子は、前記配列番号１０のＬＫＢ１タンパク質の機能的等価物をコードする遺伝子でもよい。

正常ＬＫＢ１遺伝子の核酸配列（配列番号９、Accession No. 1690504791（NM_011492））
5'-GGCGCGGCGCAGGGCGGTAAACAAGATGGCGGCGGCGTGTCGGTCTAGGAAAGGGGAGGCGGCTCACGGCGTCCGCGAGTGAGGCGCGAGTCGCCGAGGGCGGCGCCGGCGTGGAGTTGTCTCTCGCGGGCAGCATCTTTCTGCCTGGAGTTCGATTCCCCCCTCGCCGCTCCGGCCTCCTGCCTGTCGCGCGGCGGCTAGGCGGCGAGGGGGACGCGCCGCCTGGGGTGGTTTTTTTCCCCCCTCGGTCCCCGGAAGATTTCCTGTCCGGATTTCGTGTCCGCGACTTGCGGGTGTCCCGGTGTCCCGCGTCCGGGTGGAGTCTGCGCCCCGAGAAGTCGTAGAACTAAGGGGCCGCGCGCGGCTTCGGCGCGGGCCGGACATGGACGGCGCGGACCGGCCTCGACGCGGCCGCCTGGGCCCCTGAGCGCGGGGCCCAAGTGGCGAACATGACCTAGCGGCCCGCGCGCCGCGACGGCGGACCGTCGCCTCCGTCGGAAGCAGCGTCCCCGGGGACCCGAATTGGGGGGACGCGAGGGTTGGGGGGGCTCATTGCTTTTTTTTTTTTCATTCTTATTTTCATTTTTTTTCTCCCTGAGCACCTAGAAGAAAAGGGGAAAATCAAAAGTGAAGAATTGGCGCCCAGGAAGCGGACGTGGACCCGGTTGTGGGGACCGGGAGAGTTGTGGAGGTCGTTCCTGTTTTTCCCCGTTCCTTTTTTCCCCTTCTTGGAACATTTGGAAGAAGCGGGTGGGGGGGGGGGAATTCGAACTTGAAAAGAATTGGCGCTCCCGAAGGGGACGAGGACAAAGAGTGGGCCAGGATGGACGTGGCGGACCCCGAGCCGTTGGGCCTTTTCTCCGAGGGCGAGCTGATGTCGGTGGGCATGGACACCTTCATCCACCGCATCGACTCCACCGAGGTAATCTACCAGCCGCGCCGCAAACGCGCCAAGCTCATCGGCAAGTACCTGATGGGGGACCTGCTCGGGGAGGGCTCGTACGGCAAGGTGAAGGAGGTGCTGGACTCCGAGACCTTATGCCGCAGGGCGGTCAAGATCCTCAAGAAGAAAAAGCTGCGCAGGATCCCCAATGGAGAGGCCAACGTCAAGAAGGAGATCCAGCTGCTGCGGCGGCTGCGGCATCGGAATGTGATCCAGCTTGTGGACGTGCTGTACAATGAGGAGAAGCAGAAGATGTATATGGTGATGGAGTACTGCGTATGTGGCATGCAGGAGATGCTGGACAGTGTGCCGGAGAAGCGCTTCCCTGTGTGCCAAGCTCATGGGTACTTCCGCCAGCTGATTGACGGCCTGGAATACCTACACAGCCAGGGCATTGTTCACAAGGACATCAAGCCGGGCAACCTGCTACTCACCACCAATGGCACACTCAAGATCTCCGACCTCGGTGTTGCCGAGGCCCTGCACCCTTTCGCTGTGGATGACACCTGCCGGACAAGCCAGGGCTCCCCGGCCTTCCAGCCTCCTGAGATTGCCAATGGACTGGACACCTTTTCAGGTTTCAAGGTGGACATCTGGTCAGCTGGGGTCACACTTTACAACATCACCACGGGCCTGTACCCATTTGAGGGGGACAATATCTACAAGCTCTTTGAGAACATTGGGAGAGGAGACTTCACCATCCCTTGTGACTGCGGCCCACCACTCTCTGACCTACTCCGAGGGATGTTGGAGTATGAGCCGGCCAAGAGGTTCTCCATCCGACAGATTAGGCAGCACAGCTGGTTCCGGAAGAAACACCCTCTGGCTGAGGCGCTCGTACCTATCCCACCAAGCCCAGACACTAAGGACCGCTGGCGCAGTATGACTGTAGTGCCCTACCTGGAGGACCTGCATGGCCGTGCGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGACTTGTTTGACATTGAGGACGGCATTATCTACACCCAGGACTTCACAGTGCCTGGACAGGTCCTGGAAGAGGAAGTGGGTCAGAATGGACAGAGCCACAGTTTGCCCAAGGCTGTTTGTGTGAATGGCACAGAGCCCCAGCTCAGCAGCAAGGTGAAGCCAGAAGGCCGACCTGGCACCGCCAACCCTGCGCGCAAGGTGTGCTCCAGCAACAAGATCCGCCGGCTCTCGGCCTGCAAGCAGCAGTGACTGAGGCCTACAGTGTGTCATCAGGATCTCTGGGCAGGTGTCCCTGCAAGGCTGGGTTTTCCAGGCCTGCCTGTCCACTCACTTCGGGACGTTGGAGCCGAGGGCGGACCTGCTGCCCCAGAAGCACTTTATGTCGAGACCACTGGCCGGCCTTGCCTGCATGCCGCCCTGCGAGCCTCGCTGTCTTTGGGTTGGTTTCTTTTTTTTTAATAAAACAGGTGGATTTGAGCTATGGCTATGAGGGTGTTTGGAAATATGGAGCAGGCGGGGCACAGGGTGGCCTGCAGAGAAAACCCAGAGCAAACAAATATGCAGAGACATTTATGATTAACCAGACAACACGACCAACCACAGAGGGCGCAGGGCAGGGAGTGGGCAGGCACTCACAGCGAGTCTGCCCTATCTTTTGGCAATAAATAAAGCTTGGGAAACTTGAA-3'

正常ＬＫＢ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０、Accession No. 7106425（NP_035622））
MDVADPEPLGLFSEGELMSVGMDTFIHRIDSTEVIYQPRRKRAKLIGKYLMGDLLGEGSYGKVKEVLDSETLCRRAVKILKKKKLRRIPNGEANVKKEIQLLRRLRHRNVIQLVDVLYNEEKQKMYMVMEYCVCGMQEMLDSVPEKRFPVCQAHGYFRQLIDGLEYLHSQGIVHKDIKPGNLLLTTNGTLKISDLGVAEALHPFAVDDTCRTSQGSPAFQPPEIANGLDTFSGFKVDIWSAGVTLYNITTGLYPFEGDNIYKLFENIGRGDFTIPCDCGPPLSDLLRGMLEYEPAKRFSIRQIRQHSWFRKKHPLAEALVPIPPSPDTKDRWRSMTVVPYLEDLHGRAEEEEEEDLFDIEDGIIYTQDFTVPGQVLEEEVGQNGQSHSLPKAVCVNGTEPQLSSKVKPEGRPGTANPARKVCSSNKIRRLSACKQQ

マウスの正常Ｔｐ５３遺伝子は、例えば、下記配列番号１１の核酸配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。また、前記正常Ｔｐ５３遺伝子がコードするタンパク質は、例えば、下記配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。マウスの正常Ｔｐ５３遺伝子は、前記配列番号１２のＴｐ５３タンパク質の機能的等価物をコードする遺伝子でもよい。

正常Ｔｐ５３遺伝子の核酸配列（配列番号１１、Accession No. 187960038（NM_011640））
5'-TTTCCCCTCCCACGTGCTCACCCTGGCTAAAGTTCTGTAGCTTCAGTTCATTGGGACCATCCTGGCTGTAGGTAGCGACTACAGTTAGGGGGCACCTAGCATTCAGGCCCTCATCCTCCTCCTTCCCAGCAGGGTGTCACGCTTCTCCGAAGACTGGATGACTGCCATGGAGGAGTCACAGTCGGATATCAGCCTCGAGCTCCCTCTGAGCCAGGAGACATTTTCAGGCTTATGGAAACTACTTCCTCCAGAAGATATCCTGCCATCACCTCACTGCATGGACGATCTGTTGCTGCCCCAGGATGTTGAGGAGTTTTTTGAAGGCCCAAGTGAAGCCCTCCGAGTGTCAGGAGCTCCTGCAGCACAGGACCCTGTCACCGAGACCCCTGGGCCAGTGGCCCCTGCCCCAGCCACTCCATGGCCCCTGTCATCTTTTGTCCCTTCTCAAAAAACTTACCAGGGCAACTATGGCTTCCACCTGGGCTTCCTGCAGTCTGGGACAGCCAAGTCTGTTATGTGCACGTACTCTCCTCCCCTCAATAAGCTATTCTGCCAGCTGGCGAAGACGTGCCCTGTGCAGTTGTGGGTCAGCGCCACACCTCCAGCTGGGAGCCGTGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGAAGTCACAGCACATGACGGAGGTCGTGAGACGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCCGATGGTGATGGCCTGGCTCCTCCCCAGCATCTTATCCGGGTGGAAGGAAATTTGTATCCCGAGTATCTGGAAGACAGGCAGACTTTTCGCCACAGCGTGGTGGTACCTTATGAGCCACCCGAGGCCGGCTCTGAGTATACCACCATCCACTACAAGTACATGTGTAATAGCTCCTGCATGGGGGGCATGAACCGCCGACCTATCCTTACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGGAACCTTCTGGGACGGGACAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGTGCCTGCCCTGGGAGAGACCGCCGTACAGAAGAAGAAAATTTCCGCAAAAAGGAAGTCCTTTGCCCTGAACTGCCCCCAGGGAGCGCAAAGAGAGCGCTGCCCACCTGCACAAGCGCCTCTCCCCCGCAAAAGAAAAAACCACTTGATGGAGAGTATTTCACCCTCAAGATCCGCGGGCGTAAACGCTTCGAGATGTTCCGGGAGCTGAATGAGGCCTTAGAGTTAAAGGATGCCCATGCTACAGAGGAGTCTGGAGACAGCAGGGCTCACTCCAGCTACCTGAAGACCAAGAAGGGCCAGTCTACTTCCCGCCATAAAAAAACAATGGTCAAGAAAGTGGGGCCTGACTCAGACTGACTGCCTCTGCATCCCGTCCCCATCACCAGCCTCCCCCTCTCCTTGCTGTCTTATGACTTCAGGGCTGAGACACAATCCTCCCGGTCCCTTCTGCTGCCTTTTTTACCTTGTAGCTAGGGCTCAGCCCCCTCTCTGAGTAGTGGTTCCTGGCCCAAGTTGGGGAATAGGTTGATAGTTGTCAGGTCTCTGCTGGCCCAGCGAAATTCTATCCAGCCAGTTGTTGGACCCTGGCACCTACAATGAAATCTCACCCTACCCCACACCCTGTAAGATTCTATCTTGGGCCCTCATAGGGTCCATATCCTCCAGGGCCTACTTTCCTTCCATTCTGCAAAGCCTGTCTGCATTTATCCACCCCCCACCCTGTCTCCCTCTTTTTTTTTTTTTTACCCCTTTTTATATATCAATTTCCTATTTTACAATAAAATTTTGTTATCACTTAAAAAAAAAA-3'

正常Ｔｐ５３遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２、Accession No. 148747262（NP_035770））
MTAMEESQSDISLELPLSQETFSGLWKLLPPEDILPSPHCMDDLLLPQDVEEFFEGPSEALRVSGAPAAQDPVTETPGPVAPAPATPWPLSSFVPSQKTYQGNYGFHLGFLQSGTAKSVMCTYSPPLNKLFCQLAKTCPVQLWVSATPPAGSRVRAMAIYKKSQHMTEVVRRCPHHERCSDGDGLAPPQHLIRVEGNLYPEYLEDRQTFRHSVVVPYEPPEAGSEYTTIHYKYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRDSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKEVLCPELPPGSAKRALPTCTSASPPQKKKPLDGEYFTLKIRGRKRFEMFRELNEALELKDAHATEESGDSRAHSSYLKTKKGQSTSRHKKTMVKKVGPDSD

前記変異導入工程では、前記標的遺伝子に対して、前記標的遺伝子が本来有する機能が（有意に）低下または失われるように変異が導入される。このため、前記標的遺伝子の機能喪失変異は、例えば、当該標的遺伝子のｍＲＮＡもしくは当該遺伝子がコードするタンパク質の発現量が（有意に）低下している状態が生じる変異、または当該遺伝子のｍＲＮＡもしくは当該遺伝子がコードするタンパク質が完全に発現していない状態が生じる変異でもよいし、機能的な当該遺伝子のｍＲＮＡもしくは当該遺伝子がコードするタンパク質の発現量が低下している状態または機能的な当該遺伝子のｍＲＮＡもしくは当該遺伝子がコードするタンパク質が完全に発現していない状態が生じる変異でもよい。

前記機能喪失変異としては、例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、広範囲における塩基の欠失（ラージデリーション）、またはこれらの組合せの変異があげられる。前記機能喪失変異としては、例えば、各標的遺伝子の一部または全部の欠失を生じさせてもよい。前記フレームシフト突然変異は、塩基の欠失または挿入が起こり、三つ組みの読み枠（コドン）がずれた時に生じる変異である。前記フレームシフト突然変異は、塩基対置換の変異と比較して、遺伝子機能に与える影響が非常に大きい。これは、前記フレームシフト突然変異が生じると、当該標的遺伝子において、前記フレームシフト突然変異が導入された箇所以降の遺伝暗号が大幅にずれ、アミノ酸が変わるだけでなく、終止コドン等もずれてしまうためである。

各標的遺伝子の機能喪失体は、例えば、各標的遺伝子の正常な標的遺伝子の核酸配列に対し、１もしくは数個の塩基（以下、「１塩基以上」ともいう）の挿入、欠失、および／または置換等の変異が導入された遺伝子ということもできる。具体例として、前記ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失遺伝子（機能喪失体）は、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子の正常な標的遺伝子の核酸配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異が導入された遺伝子である。前記ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体において、１塩基以上は、例えば、１～１６４４塩基、１～８２２塩基、１～４１１塩基、１～２０５塩基、１～１６４塩基、１～１０２塩基、１～８２塩基、１～５１塩基、１～４１塩基、１～２５塩基、１～２０塩基、１～１２塩基、または１～６塩基である。前記ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体は、例えば、ＬＫＢ１遺伝子の正常な標的遺伝子の核酸配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異が導入された遺伝子である。前記ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体において、１塩基以上は、例えば、１～５１４塩基、１～２５７塩基、１～１２８塩基、１～６４塩基、１～５１塩基、１～３２塩基、１～２５塩基、１～１６塩基、１～１２塩基、または１～８塩基である。前記Ｔｐ５３遺伝子の機能喪失体は、例えば、Ｔｐ５３遺伝子の正常な標的遺伝子の核酸配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異が導入された遺伝子である。前記Ｔｐ５３遺伝子の機能喪失体において、１塩基以上は、例えば、１～３５６塩基、１～１７８塩基、１～８９塩基、１～４４塩基、１～３５塩基、１～２２塩基、１～１７塩基、１～１１塩基、１～８塩基、または１～４塩基である。前記フレームシフト突然変異は、例えば、３ｍ＋１塩基または３ｍ＋２塩基（ｍは、０以上の整数）の挿入または欠失により、生じる。

前記標的遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子の場合、前記ＰＴＥＮ遺伝子における機能喪失変異の導入部位は、例えば、タンパク質のコード領域（コーディングリージョン）、すなわち、エキソン領域またはイントロン領域；プロモーター領域、エンハンサー領域等の制御領域；等があげられ、好ましくは、コード領域である。具体例として、前記標的遺伝子がマウスＰＴＥＮ遺伝子の場合、前記機能喪失変異の導入部位は、例えば、配列番号７の核酸配列における８６９～１３６０番目（配列番号７の核酸配列において下線で示す核酸配列、エキソン１～５に対応）の塩基である。

前記標的遺伝子がＬＫＢ１遺伝子の場合、前記ＬＫＢ１遺伝子における機能喪失変異の導入部位は、例えば、タンパク質のコード領域（コーディングリージョン）、すなわち、エキソン領域またはイントロン領域；プロモーター領域、エンハンサー領域等の制御領域；等があげられ、好ましくは、コード領域である。具体例として、前記標的遺伝子がマウスＬＫＢ１遺伝子の場合、前記機能喪失変異の導入部位は、例えば、配列番号９の核酸配列における８２４～１１１３番目（配列番号９の核酸配列において下線で示す核酸配列、エキソン１に対応）の塩基である。

前記標的遺伝子がＴｐ５３遺伝子の場合、前記Ｔｐ５３遺伝子における機能喪失変異の導入部位は、例えば、タンパク質のコード領域（コーディングリージョン）、すなわち、エキソン領域またはイントロン領域；プロモーター領域、エンハンサー領域等の制御領域；等があげられ、好ましくは、コード領域である。具体例として、前記標的遺伝子がマウスＴＰ５３遺伝子の場合、前記機能喪失変異の導入部位は、例えば、配列番号１１の核酸配列における１５８～７０７番目（配列番号１１の核酸配列において下線で示す核酸配列、エキソン１～５に対応）の塩基である。

前記核酸編集モジュールは、例えば、前記標的遺伝子における標的部位を認識する核酸配列認識ユニットと、前記標的部位の核酸を編集する編集ユニットとを含む。前記核酸配列認識ユニットが、前記編集ユニットの機能を有する場合、前記核酸編集モジュールは、前記核酸配列認識ユニットのみから構成されてもよい。前記核酸編集モジュールでは、例えば、前記核酸配列認識モジュールが前記標的遺伝子の標的部位に結合することにより、前記標的部位に前記編集ユニットをリクルート（標的化または集積）できる。これにより、前記核酸編集モジュールは、例えば、前記標的遺伝子の核酸配列を編集できるため、前記標的遺伝子に対して機能喪失変異を導入できる。

前記核酸配列認識ユニットは、例えば、ＤＮＡの核酸配列を認識するタンパク質、またはタンパク質および核酸の複合体等があげられる。具体例として、前記核酸配列認識ユニットは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）－Ｃａｓシステム、Ｚｉｎｃフィンガーモチーフ、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター、ＰＰＲ（Pentatricopeptide repeat）モチーフ、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡと特異的に結合するタンパク質またはそのＤＮＡ結合ドメイン等があげられ、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｚｉｎｃフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、またはＰＰＲモチーフ、またはそのＤＮＡ結合ドメインである。前記核酸配列認識ユニットは、例えば、前記核酸編集モジュールがゲノムＤＮＡの切断により機能喪失変異を導入する場合、ゲノムＤＮＡの核酸配列の変化の発生の可能性を向上するため、二本鎖ＤＮＡの一方または両方の鎖を切断することが好ましく、より好ましくは、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断することが好ましい。他方、前記核酸配列認識ユニットは、例えば、前記編集ユニットがゲノムＤＮＡの核酸配列を変化させて機能喪失変異を導入する場合、前記ゲノムＤＮＡの切断による前記編集ユニットの編集効率の低下を抑制するために、二本鎖ＤＮＡの一方または両方の鎖を切断しないことが好ましく、ゲノムＤＮＡに対するヌクレアーゼ活性が不活性化されていることがより好ましい。

前記編集ユニットの機能を有する核酸編集モジュールとしては、例えば、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、制限酵素等を使用できる。

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質と、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、かつ標的の核酸配列とハイブリダイズするガイド鎖（ガイドＲＮＡ）とから構成される。前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、例えば、前記ゲノムＤＮＡと接触する際には、前記Ｃａｓ９タンパク質と前記ガイドＲＮＡとが複合体を形成している。

前記Ｃａｓタンパク質は、特に制限されず、例えば、タイプＩ～ＶのＣａｓタンパク質があげられる。具体例として、前記Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１４、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４等があげられる。

前記Ｃａｓタンパク質の由来は、特に制限されない。前記Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９を用いる場合、前記Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）等があげられる。

前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子の核酸配列に対して相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドにより、標的の核酸配列とハイブリダイズ可能なＲＮＡである。前記標的遺伝子の核酸配列は、前記標的遺伝子において、機能喪失変異が導入される部位に応じて適宜設定できる。前記標的遺伝子において、機能喪失変異が導入される部位（標的部位）は、例えば、前記標的遺伝子におけるタンパク質のコード領域（コーディングリージョン）、すなわち、エキソン領域またはイントロン領域；プロモーター領域、エンハンサー領域等の制御領域；等があげられる。前記標的遺伝子の核酸配列において、前記標的部位は、１箇所でもよいし、２箇所異常でもよい。前記核酸配列認識モジュールとして前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、前記ガイドＲＮＡは、例えば、前記標的遺伝子の核酸配列に特異的に結合する核酸配列を含むＲＮＡ分子、すなわち、前記標的遺伝子における標的部位の核酸配列と相補的なポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子である。

前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓタンパク質の種類に応じて適宜設定できる。前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）のみを含んでもよいし、ｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）を含んでもよい。前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質の場合、前記ガイドＲＮＡは、二本のＲＮＡから構成されてもよいし、一本のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から構成されてもよい。前者の場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡから構成され、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが相補的なポリヌクレオチドでハイブリダイズすることにより複合体を形成し、ガイドＲＮＡとして機能する。また、後者の場合、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはこれらがリンカーを介して連結されている。

前記ｃｒＲＮＡは、例えば、５’末端に、前記標的遺伝子の核酸配列に対して相補的なポリヌクレオチドを含むことが好ましい。前記標的の核酸配列として、前記標的領域における核酸配列とすることにより、前記ｃｒＲＮＡは、前記標的領域の核酸配列に、前記Ｃａｓタンパク質をリクルート（標的化または集積）でき、これにより、前記標的領域の核酸配列に、前記核酸編集モジュールをリクルート（標的化または集積）できる。前記相補的なポリヌクレオチドの長さは、例えば、１５～２５塩基長、１８～２２塩基長である。

前記ガイドＲＮＡの長さは、例えば、前記標的遺伝子の核酸配列の長さ、特に、前記標的部位の核酸配列の長さに応じて適宜設定できる。

前記ガイドＲＮＡが標的とする核酸配列、すなわち、前記標的部位は、１箇所でもよいし、２箇所でもよい。すなわち、前記ガイドＲＮＡの種類数は、例えば、前記標的遺伝子の数および前記標的部位の数に応じて設定できる。具体例として、前記標的部位が相対的に多い領域の場合、前記ガイドＲＮＡは、前記標的遺伝子において異なる標的部位の核酸配列と特異的に結合する複数種類のガイドＲＮＡをコードすることにより、複数の標的遺伝子および／または前記標的部位の複数箇所に機能喪失変異を導入できる。

前記核酸編集モジュールが前記核酸配列認識ユニットおよび前記編集ユニットを含む場合、前記核酸配列認識ユニットとしては、例えば、ニッカーゼ活性を有する、またはヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、前記Ｚｉｎｃフィンガーモチーフ、前記ＴＡＬエフェクター、前記ＰＰＲモチーフ、ヌクレアーゼ活性を有さない制限酵素、前記転写因子、前記ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ結合ドメイン等を使用できる。

前記Ｃａｓタンパク質がニッカーゼ活性を有する、またはヌクレアーゼ活性を有さない場合、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を有するドメインに変異が導入されたＣａｓタンパク質を含む。具体的には前記変異が導入されたＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質のＤＮＡ切断ドメイン（切断部位）のうち、少なくとも１つのドメインのヌクレアーゼ活性（ＤＮＡ切断能）が不活性化されていることが好ましい。具体例として、Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ切断ドメインとして、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインを有する。このため、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインの少なくとも一方が不活性化されていることが好ましく、両者が不活性化されていることがより好ましい。前記ヌクレアーゼ活性の不活性化は、例えば、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡにおいて、前記ＤＮＡ切断ドメインをコードする核酸配列に対して、アミノ酸置換、フレームシフト変異、および／またはナンセンス変異を導入することにより、実施できる。具体例として、前記Ｃａｓ９タンパク質がＳｐＣａｓ９の場合、前記ＳｐＣａｓ９のＨＮＨドメインは、例えば、８４０番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）をアラニン残基（Ａｌａ）に置換することにより不活性化できる、すなわち、ガイドＲＮＡと相補鎖の切断能を不活性化できる。また、前記ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣドメインは、例えば、１０番目のアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）をアラニン残基（Ａｌａ）に置換することにより不活性化できる、すなわち、ガイドＲＮＡと相補鎖を形成する鎖の反対側の鎖の切断能を不活性化できる。前記ＳｐＣａｓ９タンパク質は、例えば、８４０番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）がアラニン残基（Ａｌａ）に置換され、８４０番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）をアラニン残基（Ａｌａ）に置換されることにより、ヌクレアーゼ活性が不活性化する（ｄＣａｓ９タンパク質）。前記ガイドＲＮＡとしては、前記ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質の説明におけるガイドＲＮＡと同様のガイドＲＮＡが使用できる。

前記Ｚｉｎｃフィンガーモチーフは、Ｃ_２Ｈ_２（Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２）型の異なるＺｉｎｃフィンガーユニットを複数連結させたものである。１つのＺｉｎｃフィンガーユニットは、約３塩基の核酸配列を認識する。前記複数個は、前記標的領域の核酸配列に応じて適宜設定できるが、一般的には、３～６個である。この場合、前記Ｚｉｎｃフィンガーモチーフは、例えば、約９～１８塩基の核酸配列を認識できる。前記Ｚｉｎｃフィンガーモチーフは、例えば、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法により作製することができる。前記Ｚｉｎｃフィンガーモチーフは、例えば、国際公開第０３／０８７３４１号公報に記載の方法により作製できる。

ＴＡＬエフェクターは、約３４アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、１つのモジュールの１２および１３番目のアミノ酸残基（repeat variable diresidues ：RVD）によって、結合安定性と核酸（塩基）特異性が決定される。各モジュールの独立性は高く、モジュールを連続して配置することにより、標的の核酸配列に特異的なＴＡＬエフェクターを作製することが可能である。前記標的の核酸配列に対するＴＡＬエフェクターは、例えば、REAL法（Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15）、FLASH法（Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465）、Golden Gate法（Nucleic Acids Res (2011) 39： e82）等のオープンリソースを利用して設計できる。前記ＴＡＬエフェクターは、例えば、国際公開第２０１１／０７２２４６号公報に記載の方法により作製できる。

ＰＰＲモチーフは、３５アミノ酸からなり１つの核酸（塩基）を認識するＰＰＲモチーフの連続して配置することにより、特定の核酸配列を認識するように構成される。前記ＰＰＲモチーフでは、各モチーフの１、４、および各モチーフのＣ末端から２番目（ii（-2）番目）のアミノ酸で標的核酸（塩基）を認識する。また、各モチーフの構成に依存性はなく、Ｃ末端側またはＮ末端側のＰＰＲモチーフからの干渉が生じないため、ＰＰＲモチーフを連続して配置することにより、標的の核酸配列に特異的なＰＰＲタンパク質を作製できる。前記ＰＰＲモチーフは、例えば、国際公開第２０１４／１７５２８４号公報に記載の方法により作製できる。

前記制限酵素、前記転写因子、前記ＲＮＡポリメラーゼ、または前記ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合ドメインを用いる場合、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、公知であり、前記ＤＮＡ結合ドメインを、前記核酸配列認識ユニットとして利用できる。

前記核酸編集モジュールが前記核酸配列認識ユニットおよび前記編集ユニットを含む場合、前記編集ユニットとしては、例えば、ヌクレアーゼ；シチジン脱アミノ化酵素、アデニン脱アミノ化酵素の塩基編集酵素；等があげられる。

前記ヌクレアーゼは、例えば、ゲノムＤＮＡの二本鎖の一方または両方の鎖を切断可能なエンドヌクレアーゼがあげられ、具体例として、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（Shengdar Q Tsai et.al., （2014）Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2908）等のタンパク質、またはそのヌクレアーゼドメインがあげられる。

前記塩基編集酵素は、例えば、ＡＩＤ（Activation-Induced (Cytidine) Deaminase）、ＰｍＣＤＡ１（Cytidine deaminase 1）、ＡＰＯＢＥＣ（apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like）、ＡＢＥ（Gaudelli, N. M., et al., Nature, 551, 464-471 （2017））等があげられる。

前記核酸編集モジュールにおいて、前記核酸配列認識ユニットと前記編集ユニットとは、直接または間接的に連結していることが好ましい。前記直接的な連結は、前記核酸配列認識ユニットと前記編集ユニットとが直接連結していることを意味する。前記核酸配列認識ユニットと前記編集ユニットとがタンパク質である場合、前記直接的な連結は、前記核酸配列認識ユニットを構成するタンパク質のＮ末端またはＣ末端に前記編集ユニットを構成するタンパク質が連結していることを意味する。前記間接的な連結は、前記核酸配列認識ユニットと前記編集ユニットとが、リンカーを介して連結していることを意味する。前記核酸配列認識ユニットと前記編集ユニットとがタンパク質である場合、前記核酸配列認識ユニットを構成するタンパク質のＮ末端またはＣ末端に、前記リンカーを介して前記編集ユニットを構成するタンパク質が連結していることを意味する。前記リンカーは、ペプチドリンカーであることが好ましい。

前記リンカーは、前記核酸配列認識ユニットおよび前記編集ユニットの機能を妨げないものであれば、任意の配列を選択できる。前記リンカーは、例えば、グリシンとセリンとの繰り返し配列があげられる。前記リンカーの長さは、例えば、５～１００アミノ酸、５～５０アミノ酸、１０～５０アミノ酸、１５～５０アミノ酸、１５～４０アミノ酸、１７～３０アミノ酸、または２２アミノ酸である。前記リンカーの長さを相対的に長くすると、得られた複合体は、例えば、前記標的領域の核酸配列からより遠い位置のゲノムＤＮＡも改変できる。前記リンカーは、例えば、ＧＳＧＳＧ（配列番号１３）、ＧＳＧＧＳ（配列番号１４）、ＳＧＳＧＳ（配列番号１５）、もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号１６）、またはこれらの２～３回繰り返し配列；ＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１７）；ＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧ（配列番号１８）；等があげられる。

前記核酸編集モジュールは、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記標的遺伝子が複数の場合、前記核酸編集モジュールは、例えば、各標的遺伝子の核酸配列を編集可能な核酸編集モジュールを含む。このため、前記変異導入工程における標的遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子およびＬＫＢ１遺伝子である場合、前記核酸編集モジュールは、前記ＰＴＥＮ遺伝子に機能喪失変異を導入可能な第１の核酸編集モジュールと、前記ＬＫＢ１遺伝子に機能喪失変異を導入可能な第２の核酸編集モジュールとを含むことが好ましい。この場合、前記核酸編集モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、前記Ｃａｓタンパク質は、１または複数種類とし、前記ＰＴＥＮ遺伝子の核酸配列に特異的なガイド鎖と、前記ＬＫＢ１遺伝子の核酸配列に特異的なガイド鎖とを組合わせることで、前記第１の核酸編集モジュールと前記第２の核酸編集モジュールとを構成してもよい。前記変異導入工程における標的遺伝子がＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子である場合、前記核酸編集モジュールは、前記ＰＴＥＮ遺伝子に機能喪失変異を導入可能な第１の核酸編集モジュールと、前記ＬＫＢ１遺伝子に機能喪失変異を導入可能な第２の核酸編集モジュールと、前記Ｔｐ５３遺伝子に機能喪失変異を導入可能な第３の核酸編集モジュールとを含むことが好ましい。この場合、前記核酸編集モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、前記Ｃａｓタンパク質は、１または複数種類とし、前記ＰＴＥＮ遺伝子の核酸配列に特異的なガイド鎖と、前記ＬＫＢ１遺伝子の核酸配列に特異的なガイド鎖と、前記Ｔｐ５３遺伝子の核酸配列に特異的なガイド鎖とを組合わせることで、前記第１の核酸編集モジュールと前記第２の核酸編集モジュールと前記第３の核酸編集モジュールとを構成してもよい。

前記核酸編集モジュールは、例えば、Ｃｒｅレコンビナーゼを含まない。本開示の製造方法は、前記核酸編集モジュールを用いるため、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ配列を用いなくても、前記標的遺伝子を機能喪失体とでき、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ配列を用いて得られる標的遺伝子がノックアウトされた状態と類似の状態とできる。

前記核酸編集モジュールは、核局在化シグナル（核移行シグナル）を含むことが好ましい。この場合、前記核局在化シグナルは、例えば、前記核酸編集モジュールを構成するタンパク質に連結されていることが好ましい。具体例として、前記核酸編集モジュールがＣａｓタンパク質を含む場合、前記核局在化シグナルは、前記Ｃａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端の少なくとも一方に連結されていることが好ましい。

前記変異導入工程では、前記核酸編集モジュールが、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと接触可能なように構成されていればよい。このため、本開示の製造方法は、前記核酸編集モジュールを前記子宮上皮細胞に導入し、導入された核酸編集モジュールと、前記子宮上皮細胞内のゲノムＤＮＡとを接触させてもよい。また、本開示の製造方法は、前記核酸編集モジュールをコードする核酸を前記子宮上皮細胞に導入し、前記核酸編集モジュールをコードする核酸から前記核酸編集モジュールが発現し、発現した核酸編集モジュールと、前記子宮上皮細胞内のゲノムＤＮＡとを接触させてもよい。

本開示の製造方法は、前記変異導入工程に先立ち、前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に、前記核酸編集モジュールを導入する工程（導入工程）を含んでもよい。前記核酸編集モジュールが複数の構成要素から構成される場合、前記導入工程では、各構成要素の一部または全部を別個に、前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に導入してもよいし、全部の構成要素を前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に１度に導入してもよい。また、前記導入工程において複数の構成要素を同時に導入し、かついずれか２つ以上の構成要素が複合体を形成可能な場合、前記導入工程では、各構成要素の一部または全部について、複合体の状態で前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に導入してもよい。具体例として、前記核酸編集モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、前記導入工程では、Ｃａｓタンパク質と、ガイド鎖とを別個に導入してもよいし、同時に導入してもよい。また、後者の場合、前記導入工程では、Ｃａｓタンパク質とガイド鎖との複合体を予め形成し、前記複合体を、前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に導入してもよい。

前記導入工程では、例えば、前記核酸編集モジュールとして、前記核酸編集モジュールをコードする核酸を用いてもよい。この場合、本開示の製造方法は、例えば、さらに前記核酸にコードされた核酸編集モジュールを発現する工程（発現工程）を含んでもよい。

前記核酸編集モジュールとして、前記核酸編集モジュールをコードする核酸から発現された核酸編集モジュールを用いる場合、前記核酸編集モジュールをコードする核酸は、前記核酸が発現可能に発現ベクターに機能的に連結（挿入）されていることが好ましい。前記核酸編集モジュールが複数の分子から構成されている場合、前記核酸編集モジュールを構成する各分子は、同じ発現ベクターに挿入されてもよいし、異なる発現ベクターに挿入されてもよい。具体例として、前記核酸編集モジュールがＣａｓタンパク質とガイド鎖とから構成される場合、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、前記ガイド鎖をコードする核酸は、同じ発現ベクターに挿入されてもよいし、異なる発現ベクターに挿入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記核酸編集モジュールをコードする核酸をコードする核酸を挿入することで作製できる。

前記基本ベクターは、非ヒト動物、すなわち、宿主に応じて適宜選択できる。前記発現ベクターは、例えば、プラスミドベクター等の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターがあげられる。前記動物に対するプラスミドベクターとしては、例えば、pCDM8、pMT2PC、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等があげられる。前記植物に対するプラスミドベクターとしては、T-DNAを含むベクターがあげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクターがあげられる。

前記発現ベクターは、前記核酸編集モジュールの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおける前記調節配列の配置は、特に制限されず、前記核酸編集モジュールの発現を機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。

前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。

前記発現ベクターへの、核酸（ＤＮＡ）の挿入、前記調節配列の挿入、および／または前記選択マーカーのコード配列の挿入は、例えば、制限酵素およびリガーゼを用いた方法で実施してもよいし、市販のキット等を用いてもよい。

前記導入工程において、前記子宮上皮細胞内への導入は、例えば、タンパク質および／または核酸を細胞内に導入する方法により実施でき、具体例として、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いるリポフェクション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、マイクロインジェクション法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法等があげられる。

前記エレクトロポレーション法により、前記核酸編集モジュールを前記子宮上皮細胞に導入する場合、前記エレクトロポレーション法は、例えば、下記参考文献１を参照できる。具体例として、前記エレクトロポレーション法は、例えば、前記核酸編集モジュールを含有する液を前記子宮内に導入および／または充填した状態において、一対の電極を用いて、前記電極間に配置した子宮に電圧印加を行なうことにより実施できる。前記電圧印加では、例えば、第１の電気パルスを印加して前記子宮上皮細胞の細胞膜に穿孔を形成し、つぎに、第２の電気パルスを印加して、前記穿孔から前記核酸編集モジュールを導入する。前記核酸編集モジュールを含有する液における核酸編集モジュールの濃度は、前記核酸編集モジュールの種類に応じて設定でき、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／ｌ、０．１～１０μｍｏｌ／ｌである。

一例として、前記非ヒト動物に対するエレクトロポレーション法は、以下のように、実施できる。まず、前記導入工程では、例えば、前記非ヒト動物から子宮を露出させる。つぎに、前記導入工程では、例えば、前記子宮の頚部を結紮した後、前記核酸編集モジュールを含有する液を露出した子宮内に充填する。前記充填は、例えば、注射器等を用いて実施できる。そして、前記導入工程では、例えば、前記子宮の一端と、他端とに電極を前記子宮と接触するように配置し、この状態で、前記電極に電圧を印加することにより、前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に、前記核酸編集モジュールを導入できる。
参考文献１：Ryosuke KOBAYASHI et.al., “A novel method of gene transduction to the murine endometrium using in vivo electroporation”, 2017, J. Vet. Med. Sci., vol. 79, No. 9, pages 1573-1577

前記電圧印加の条件は、例えば、前記電極間の距離および前記核酸編集モジュールの導入量に応じて設定できる。前記電圧印加における電圧値は、例えば、－１００～１００Ｖである。前記電圧印加は、連続的な電圧の印加でもよいし、パルス電圧の印加でもよいが、後者が好ましい。前記パルス電圧を印加する場合、前記導入工程では、電圧値の異なるパルス電圧を印加してもよい。この場合、前記導入工程では、第１の電気パルス（poring pulse）を印加して、前記子宮上皮細胞の細胞膜に穿孔を形成する工程と、第２の電気パルス（positive transfer pulse）を印加して、前記穿孔から前記核酸編集モジュールを導入する工程と、および第３の電気パルス（negative transfer pulse）を印加して前記穿孔から前記核酸編集モジュールを導入する工程とを含むことが好ましい。各電気パルスは、１回でもよいし複数回でもよい。前記第１の電気パルスの電圧値は、例えば、１０～５０Ｖ、好ましくは、１０～３０Ｖである。前記第２の電気パルスの電圧値は、例えば、０Ｖを超え、１０Ｖ以下、好ましくは、５～１５Ｖである。前記第３の電気パルスの電圧値は、例えば、０Ｖ未満であり、－３０Ｖ以上、好ましくは、－１５～－５Ｖである。各パルス電圧（電気パルス）の印加時間は、例えば、１～２００ｍ秒である。

前記ポリエチレングリコール法、前記リン酸カルシウム法、または前記リポフェクション法により、前記核酸編集モジュールを前記子宮上皮細胞に導入する場合、前記導入工程は、例えば、前記核酸編集モジュールを含有する液を前記子宮内に導入または充填した状態とし、前記状態を所定時間維持することにより実施できる。前記所定時間は、例えば、１～７２時間、６～４８時間である。そして、前記導入工程では、例えば、前記維持後に、前記核酸編集モジュールを含有する液を前記子宮から除去してもよい。

本開示の製造方法は、前記導入工程後、前記標的遺伝子に機能喪失変異が導入された非ヒト動物を選抜する工程（選抜工程）を含んでもよい。この場合、前記選抜工程は、例えば、前記非ヒト動物に対して、下記（ａ）および（ｂ）の工程を実施することにより選抜できる。
（ａ）前記被非ヒト動物の前記標的遺伝子が機能喪失しているかを検出する検出工程
（ｂ）前記標的遺伝子が機能喪失している場合、前記非ヒト動物を、子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜する変異体選抜工程

前記選抜工程が前記（ａ）工程および（ｂ）工程を含む場合、前記選抜工程は、例えば、各標的遺伝子の核酸配列を指標に実施してもよいし、各標的遺伝子の発現量を指標に実施してもよい。

各標的遺伝子の核酸配列を指標とする場合、前記（ａ）工程において、前記各標的遺伝子の機能喪失の検出は、例えば、前記非ヒト動物の各標的遺伝子の核酸配列を解読し、対応する正常な標的遺伝子の核酸配列と比較することにより、実施してもよい。前記核酸配列の解読は、例えば、シークエンサーを用いて実施できる。そして、前記（ｂ）工程では、例えば、前記非ヒト動物の各標的遺伝子の核酸配列が、それぞれ、対応する正常な標的遺伝子の核酸配列に対して、機能喪失変異が導入された核酸配列である場合、前記子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜する。前記選抜の条件については、後述する。前記正常な標的遺伝子の核酸配列は、前述の各標的遺伝子の核酸配列を参照できる。前記核酸配列の比較は、例えば、核酸配列の解析ソフト（例えば、前述のＢＬＡＳＴ等）により実施できる。前記（ｂ）工程において、核酸配列を比較する領域は、各標的遺伝子のイントロン領域でもよいし、各標的遺伝子のエキソン領域でもよいが、好ましくは、後者である。また、前記各標的遺伝子の機能喪失が、それぞれ、対応する正常な標的遺伝子の核酸配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異を導入することにより引き起こされる場合、前記（ａ）工程では、例えば、少なくとも１つの変異を検出可能なプライマーセット、プローブ、またはこれらの組合せを用いて、実施してもよい。前記プライマーセットおよびプローブは、例えば、前記変異の種類に基づき、公知の設計方法を用いて設計できる。

前記（ｂ）工程では、例えば、各標的遺伝子の正常な標的遺伝子に対して、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換されている場合、前記標的遺伝子を機能喪失遺伝子と判断してもよい。また、前記（ｂ）工程では、例えば、各遺標的伝子の正常な標的遺伝子に対して、フレームシフト突然変異が導入されている場合、前記標的遺伝子を機能喪失遺伝子と判断してもよい。さらに、前記（ｂ）工程では、例えば、各標的遺伝子の正常な標的遺伝子が部分欠失または完全欠失している場合、前記標的遺伝子を機能喪失遺伝子と判断してもよい。

前記（ｂ）工程では、さらに、各標的遺伝子の遺伝子型に基づき、選抜してもよい。具体例として、前記（ｂ）工程では、前記各標的遺伝子の遺伝子型が、各標的遺伝子の機能喪失体のヘテロ接合体（接合型）またはホモ接合体（ホモ接合型）に該当する場合、前記子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。具体例として、前記（ｂ）工程では、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子およびＬＫＢ１遺伝子について、それぞれ、機能喪失体をヘテロ接合体またはホモ接合体で有する場合、前記非ヒト動物を、子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。また、前記（ｂ）工程では、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子について、それぞれ、機能喪失遺伝子をヘテロ接合体またはホモ接合体で有する場合、前記非ヒト動物を、子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。

各標的遺伝子の発現量を指標とする場合、前記（ａ）工程において、前記各標的遺伝子の機能喪失の検出は、例えば、前記非ヒト動物の各標的遺伝子のｍＲＮＡまたは各標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を検出することにより実施してもよい。さらに、前記（ａ）工程において、前記各標的遺伝子の機能喪失の検出は、例えば、前記非ヒト動物における各標的遺伝子もしくは各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現の有無、または各標的遺伝子もしくは各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を検出することにより実施してもよい。

前記選抜工程において、前記各標的遺伝子もしくは各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現に基づき、判断する場合、前記（ａ）工程では、例えば、前記非ヒト動物の生体試料における各標的遺伝子および各標的遺伝子がコードするタンパク質の少なくも一方の発現量を測定する。そして、前記（ｂ）工程において、前記非ヒト動物の生体試料における各標的遺伝子および各標的遺伝子がコードするタンパク質の少なくも一方の発現量と、基準値とに基づき、前記各標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物を選抜する。具体的には、前記（ｂ）工程では、前記非ヒト動物において、前記各標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物の選抜は、例えば、前記非ヒト動物の生体試料における各標的遺伝子および各標的遺伝子がコードするタンパク質の少なくも一方の発現量と、前記基準値とを比較することにより実施できる。

前記非ヒト動物の生体試料は、特に制限されず、例えば、前記非ヒト動物の子宮および前記子宮由来の試料のいずれでもよい。前記（ａ）工程で使用する生体試料の種類は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。

前記（ａ）工程において、各標的遺伝子の発現量は、例えば、半定量的ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、デジタルPCR、RNAシークエンス解析（RNAseq）等により測定できる。また、前記（ａ）工程において、各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量は、例えば、紫外吸収法、ビシンコニン酸法等の分光光度計を用いた方法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等のタンパク質の定量方法により、測定できる。

前記基準値は、例えば、正常な標的遺伝子を有する非ヒト動物における各標的遺伝子または各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量、対象とする各標的遺伝子と対応する正常な標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物（例えば、ＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、および／またはＴｐ５３遺伝子を完全欠失した非ヒト動物）における各標的遺伝子または各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量等があげられる。前記基準値として、前記各標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物における各標的遺伝子の発現量を用いる場合、前記各標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物は、例えば、一対の染色体上のそれぞれに座乗する２つのＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、および／またはＴｐ５３遺伝子のうち、いずれか一方の標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物でもよいし、両方の標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物でもよい。前記基準値とする各標的遺伝子または各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量は、例えば、前記非ヒト動物の生体試料と同じ条件で採取した生体試料における各標的遺伝子または各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を、前記非ヒト動物の生体試料と同様の方法で測定することにより、得ることができる。前記基準値は、例えば、予め測定してもよいし、前記非ヒト動物の生体試料と同時に測定してもよい。

この場合、前記（ｂ）工程において、前記非ヒト動物における各標的遺伝子について、機能喪失体かの評価方法は、特に制限されず、前記基準値の種類によって、適宜決定できる。具体例として、前記非ヒト動物の生体試料における各標的遺伝子の発現量が、対応する正常な標的遺伝子を有する非ヒト動物における対応する遺伝子の発現量より低い場合、前記標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物における前記標的遺伝子の発現量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または前記標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物における遺伝子の発現量より低い場合、前記非ヒト動物は、例えば、前記標的遺伝子は、機能喪失体であると評価できる。また、前記非ヒト動物の生体試料における各標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量が、対応する正常な標的遺伝子を有する非ヒト動物における対応する遺伝子がコードするタンパク質の発現量より低い場合、前記非ヒト動物は、例えば、前記標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物における前記標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または前記標的遺伝子の機能喪失体を有する非ヒト動物における遺伝子がコードするタンパク質の発現量より低い場合、前記非ヒト動物は、例えば、前記標的遺伝子の機能喪失体を有すると評価できる。そして、前記（ｂ）工程では、例えば、前記ＰＴＥＮ遺伝子およびＬＫＢ１遺伝子、または前記ＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子について、機能喪失体を有すると評価された非ヒト動物を、前記子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜する。

前記（ｂ）工程では、例えば、各標的遺伝子の発現量に基づき、各標的遺伝子の遺伝子型を評価してもよく、具体例として正常な標的遺伝子のホモ接合体か、正常な標的遺伝子と機能喪失体のヘテロ接合体か、機能喪失体のホモ接合体かを評価してもよい。この場合、前記基準値として、それぞれ、正常な標的遺伝子を有する非ヒト動物（正常な非ヒト動物）、一対の染色体上のそれぞれに座乗する２つの遺伝子のうち、一方が、正常な標的遺伝子であり、他方が、機能喪失体である非ヒト動物（ヘテロ接合体の非ヒト動物）、および／または、一対の染色体上のそれぞれに座乗する２つの遺伝子の両者が機能喪失体である非ヒト動物（機能喪失体のホモ接合体非ヒト動物）を用いることにより実施できる。具体的には、前記（ｂ）工程において、非ヒト動物における標的遺伝子の発現量が、正常な非ヒト動物、ヘテロ接合体の非ヒト動物、または機能喪失体のホモ接合体非ヒト動物における標的遺伝子の発現量と同等である場合、前記非ヒト動物は、例えば、同等の発現量を有する非ヒト動物と同様の遺伝子型であると評価できる。

さらに、前記（ｂ）工程では、得られた各標的遺伝子の遺伝子型の評価に基づき、選抜してもよい。具体例として、前記（ｂ）工程では、前記各標的遺伝子の遺伝子型が、前述の遺伝子型の組合せに該当する場合、前記子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。具体例として、前記（ｂ）工程では、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子およびＬＫＢ１遺伝子について、機能喪失体をヘテロ接合体またはホモ接合体で有する場合、前記非ヒト動物を、子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。また、前記（ｂ）工程では、例えば、ＰＴＥＮ遺伝子、ＬＫＢ１遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子について、機能喪失体をヘテロ接合体またはホモ接合体で有する場合、前記非ヒト動物を、子宮がんの候補非ヒトモデル動物として選抜してもよい。

本開示の製造方法は、前記変異導入工程後、得られた非ヒト動物を生育し、子宮がんを形成させる工程（形成工程）を含んでもよい。前記形成工程の期間は、子宮がんが形成されうる期間であればよく、例えば、１４日～４ヶ月、２～３ヶ月等があげられる。前記形成工程における非ヒト動物の飼育条件は、前記非ヒト動物の条件に応じて設定できる。本開示の製造方法により得られる非ヒト動物の子宮がんは、女性ホルモン受容体が陽性でもよいし、陰性でもよい。前記女性ホルモン受容体は、例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体等があげられる。前記子宮がんは、例えば、プロゲステロン受容体陰性および／またはエストロゲン受容体陽性である。

本明細書に記載のタンパク質、融合タンパク質、またはそれをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列情報は、Protein Data Bank、UniProt、またはGenBank等から入手可能である。また、ＲＮＡの核酸配列は、適宜配列変換ソフト等を用い、対応するＤＮＡの核酸配列からも入手可能である。本明細書に記載の核酸編集モジュールをコードするＤＮＡをコードするＤＮＡは、分子生物学的方法により、ｍＲＮＡからクローニングすることにより取得してもよいし、前記配列情報に基づき、化学的にＤＮＡを合成することにより、取得してもよい。また、前記ＤＮＡの取得に当たっては、前記核酸を導入する非ヒト動物（宿主）にあわせて、コドン最適化を実施してもよい。これにより、前記核酸は、例えば、宿主におけるタンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば、（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いてもよいし、各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。

＜子宮がんのモデル非ヒト動物＞
別の態様において、本開示は、子宮がんが発生する可能性を有する子宮がんモデル非ヒト動物を提供する。本開示の子宮がんモデル非ヒト動物は、子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体、ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体、およびＴｐ５３遺伝子の機能喪失体を含む。本開示のモデル動物によれば、子宮上皮細胞に由来する子宮がんを発生する可能性を有する。本開示のモデル動物は、例えば、子宮がんの治療薬候補物質のスクリーニングに好適に使用できる。

前記モデル動物は、ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体、ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体、およびＴｐ５３遺伝子の機能喪失体を有すればよく、各遺伝子の遺伝子型は、一対の染色体上の一方が、正常な遺伝子であり、他方が、機能喪失体であるヘテロ接合体でもよいし、一対の染色体上のそれぞれに座乗する２つの遺伝子の両者が機能喪失体であるホモ接合体でもよく、好ましくは、各遺伝子が後者である。

前記モデル動物は、例えば、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡが、ｌｏｘＰ配列を含まないことが好ましい。

前記モデル動物において、前記子宮上皮細胞は、子宮体部の上皮細胞、すなわち、子宮内膜上皮細胞であることが好ましい。この場合、本開示の子宮がんモデル非ヒト動物は、子宮内膜がんモデル非ヒト動物ということもできる。

前記モデル動物における子宮がんの由来する組織は、例えば、組織学的染色、上皮細胞マーカーを用いた免疫組織学的染色等を用いて評価できる。

本開示の非ヒト動物は、前記Ｔｐ５３遺伝子の機能喪失体を含まないでもよい。

＜被検物質の評価方法＞
別の態様において、本開示は、被検物質が子宮がんの予防または治療用の候補物質となりうるかを評価する方法を提供する。本開示の被検物質の評価方法は、被検物質を、子宮がんモデル非ヒト動物に投与する投与工程と、前記非ヒト動物における子宮がんを評価する評価工程とを含み、前記子宮がんモデル非ヒト動物は、前記本開示の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法により得られた子宮がんモデル非ヒト動物、および／または前記本開示の子宮がんモデル非ヒト動物である。本開示の評価方法によれば、被検物質について、子宮がんの予防または治療用の候補物質となりうるかを評価できる。

前記投与工程において、前記被検物質は、例えば、前記子宮がんの誘導前に投与してもよいし、誘導後に投与してもよい。

前記評価工程では、例えば、前記モデル動物の病態を評価することにより子宮がんを評価できる。具体例として、前記評価工程において、前記子宮がんの発生の有無または程度、前記子宮がんの拡大もしくは縮小の有無または程度、前記子宮がんの増大を評価する。そして、前記評価工程では、例えば、前記子宮がんの発生を抑制する、前記子宮がんを縮小する、および／または、前記子宮がんの増大を抑制する、前記被検物質を、子宮がんの予防または治療薬候補物質として選抜する選抜工程を含む。

前記被検物質の種類は、予防または治療薬の候補になり得るものであればよい。前記被検物質は、例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸分子、糖鎖、脂質、有機低分子化合物、無機低分子化合物、細菌放出物質、醗酵生産物、細胞抽出液、胞培養上清、植物抽出液、動物組織抽出液等があげられる。前記被検物質は、１種類でもよいし、複数種類でもよい。

本開示の評価方法は、前記投与工程に先立ち、前記本開示の製造方法により、前記子宮がんモデル非ヒト動物を作製する作製工程を含んでもよい。

以下、実施例を用いて本開示を詳細に説明するが、本開示は実施例に記載された態様に限定されるものではない。なお、特に示さない限り、市販の試薬およびキット等は、そのプロトコルに従い使用した。

［実施例１］
本開示の製造方法により、子宮がんを誘導できることを確認した。

ゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）と、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション技術とを用いて、野生型マウスの標的遺伝子に対して機能喪失変異を導入することにより、から子宮内膜がんを誘導できることを確認した。

（１）ゲノム編集技術
ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの配列の設計は、ＣＲＩＳＰＲＤｉｒｅｃｔ（https://crispr.dbcls.jp/）と、ＣＲＩＳＰＯＲ（http://crispor.tefor.net/）とを用いた。具体的には、Ｐｔｅｎ、Ｔｐ５３、およびＬｋｂ１を標的遺伝子とした。前記各標的遺伝子から選択したｇＲＮＡ標的配列を、図１に示すｇＲＮＡ＿Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ ＢｂｓＩ（Addgene、Cat.No:128433）に、それぞれクローニングした。ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの前記標的配列を表２に示す。ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびHigh fidelity SpCas9（S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3）は、Integrated DNA Technologies社から購入したものを使用した。

各前記標的配列について、それぞれ等量のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを、デュプレックスバッファ（Integrated DNA Technologies社製）内で混合し、９５℃、５分間の条件下で加熱した。前記加熱後、室温（約２５℃、以下同様。）、１０分間の条件下で静置し、複合体（以下、「ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ」という）を得た。

図２に示すＣａｓ９を発現するプラスミド、ｐＰｙＣＡＧ－ｈＣａｓ９－ＩＰは、ｐＰｙＣＡＧ－ＢｓｔＸＩ－ＩＰベクター（ＲＩＫＥＮから分譲）のＢｓｔＸＩサイトに、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９（ｈＣａｓ９）を挿入して構築した。

（２）ＲＮＰ法を用いた、子宮がんモデルマウスの作製
ＲＮＰ法を用いた、子宮がんモデルマウスには、６週齢以降の処女雌マウス（系統：ＩＣＲ、販売元：日本エスエルシー社）を使用した。前記マウスに３種類の麻酔薬を腹膜内投与した。前記麻酔薬としては、メデトミジン塩酸塩、ミダゾラム、およびブトルファノール酒石酸塩を使用した。前記麻酔後、子宮角を外面化させた後、注射する試薬の漏出を防ぐために、頸部を縫合糸で縛った。つぎに、Ｃａｓ９タンパク質を含む液(５００ｎｇ／μｌ)と、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含む液（各々３μｍｏｌ／ｌ）とを等量混合し、得られた混合液（ゲノム編集液）５μｌ（Ｃａｓ９：２５０ｎｇ／μｌ、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ：各々１．５μｍｏｌ／ｌ）を、輸卵管側から子宮内膜腔に注射した。なお、前記ゲノム編集液では、前記混合により、Ｃａｓ９タンパク質とｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体（ＲＮＰ）が形成される。前記注射直後、図３に示すように、前記子宮角をプラチナ平板電極（ＣＵＹ６５０Ｐ５、ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ社製）に挟んだ。コントロール群（Control）では、前記ゲノム編集溶液に代えて、等量のOptiMEM培地を用いた以外は同様にして実施した。

図４に、エレクトロポレーションによる、生体内のゲノム編集法の模式図を示す。図４（Ａ）に示すように、前記子宮角をプラチナ平板電極に挟んだ後、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレータ（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ社製）を用いて、電気パルスを３セット印加した。前記電気パルス後、電極の方向を変更し、電気パルスをさらに３セット印加することより、図４（Ｂ）に示すように、子宮の上皮層にＲＮＰを導入し、Ｐｔｅｎ、Ｌｋｂ１およびＴｐ５３に機能喪失変異を導入した。前記電気パルスにおける各々のパルスセットは、ポアリングパルス（ＰＰ）とトランスファパルス（ＴＰ）とから構成した。前記ＰＰの条件は、電圧２０Ｖ、パルス長３０ｍｓ、パルスインターバル５０ｍｓ、パルス数３、減衰率１０％、極性＋で行った。前記ＴＰの条件は、電圧１０Ｖ、パルス長５０ｍｓ、パルスインターバル５０ｍｓ、パルス数３、減衰率４０％、極性＋／－で行った。すなわち、前記エレクトロポレーションでは、ポアリングパルス（ＰＰ）を１セットと、正の電圧のトランスファパルス（ＴＰ）１セットと、負の電圧のトランスファパルス（ＴＰ）１セットとを実施した。また、コントロールは、前記ゲノム編集液に代えて、生理的食塩水を用いた以外は、同一のマウスの子宮の別の部位にエレクトロポレーション法を実施した。なお、本願発明者らは、ＧＦＰを発現可能なベクターを用いて、エレクトロポレーション法により、子宮内に前記ベクターを導入したところ上皮層でのみＧＦＰの発現が見られ、間質および筋組織では、ＧＦＰの発現が見られないことを確認している。これは、エレクトロポレーション法では、前記発現ベクターが、上皮層の基底膜を超えて、間質および筋組織に移動できないためと推定された。

（３）プラスミド法を用いた子宮がんモデルマウスの作製
プラスミド法を用いた子宮がんモデルマウスの作製は、前記Ｃａｓ９とｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡとを含むゲノム編集液に代えて、下記条件（１）または（２）のゲノム編集液として用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、子宮がんモデルマウスを作製した。
条件（１）：
ｐＰｙＣＡＧ－ｈＣａｓ９－ＩＰ：３５２μｍｏｌ／ｌ
各標的遺伝子に対するｇＲＮＡベクター：１１７μｍｏｌ／ｌ
条件（２）：
ｐＰｙＣＡＧ－ｈＣａｓ９－ＩＰ：７６μｍｏｌ／ｌ
各標的遺伝子に対するｇＲＮＡベクター：２０８μｍｏｌ／ｌ

（４）子宮における腫瘍の有無の観察
前記実施例１（２）および（３）で得られたマウスについて、電気パルスの処置時を基準として、４か月後に、子宮に腫瘍が生じているか検討した。具体的には、処置を行ったマウスを解剖し、腫瘍の有無を観察した。前記実施例１（２）で得られたマウスの結果を、図５に示す。

図５は、子宮を観察した写真である。図５に示すように、ゲノム編集液を注射し、前記注射後、エレクトロポレーションを行った箇所に腫瘍が形成されることがわかった。また、生理的食塩水を注射し、前記注射後、エレクトロポレーションを行った箇所には腫瘍が形成されていなかった。また、前記実施例１（３）で得られたマウスについても同様であった。これらの結果から、Ｐｔｅｎ、Ｌｋｂ１およびＴｐ５３の３遺伝子にゲノム編集法およびｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション法を組合わせて機能喪失変異を導入することにより、エレクトロポレーション法を行なった箇所に限局して外部核酸を導入でき、かつ腫瘍形成を誘導できることがわかった。

（５）子宮における腫瘍の由来する組織の検討
前記実施例１（４）の子宮に形成された腫瘍が、上皮組織由来の腫瘍であるかを確認した。具体的には、前記子宮体部の腫瘍を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。前記固定後、前記子宮体部をパラフィンに包埋し、厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を調製した。得られたパラフィン包埋切片について、常法によりＨＥ染色を実施した。前記染色後、各切片について、光学顕微鏡（BZ-9000、キーエンス社製）を用いて、子宮体の病理学的診断を行った。これらの結果を、図６に示す。

図６は、組織染色による子宮組織の組織写真を示す。図６に示すように、コントロール群（Control）では、腫瘍は形成されていなかった。他方、ゲノム編集液を注射し、前記注射後、エレクトロポレーションを行ったマウス（Tumor (Pten + Tp53 + Lkb1)）では、腫瘍が認められた。さらに、病理学的診断によって、前記腫瘍が、上皮組織由来であることがわかった。

以上の結果から、本開示の生体子宮内エレクトロポレーション法は、マウスの子宮内膜上皮細胞に限局して、外部核酸を導入でき、かつ子宮上皮細胞のＰｔｅｎ、Ｌｋｂ１およびＴｐ５３の３遺伝子に機能喪失変異を導入することにより、腫瘍を誘導できることがわかった。

（６）腫瘍形成効率の検討
ゲノム編集を行なう核酸編集モジュールの導入方法として、ＲＮＰ法と、プラスミド法とが知られている。前記ＲＮＰ法は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体を形成し、これを細胞内に導入してゲノム編集を行なう方法である。他方、前記プラスミド法は、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミドと、ガイドＲＮＡをコードするプラスミドとを細胞内に導入してゲノム編集を行なう方法である。そこで、いずれの方法が、機能喪失変異の導入効率が高いかを検討した。具体的には、実施例１（２）のＲＮＰ法と、実施例１（３）のプラスミド法とを行ったマウスについて、処置３か月後に、子宮内膜に腫瘍が生じている割合を検討した。これらの条件と結果を、下記表３に示す。

前記表３は、導入方法、条件、サンプル数、腫瘍形成数、および腫瘍形成の割合を示す。前記表３に示すように、プラスミド法を用いた条件（１）では子宮内膜がんの形成率は、１０％であり、プラスミド法を用いた条件（２）では子宮内膜がんの形成率は、５０％であった。これに対して、ＲＮＰ法を用いた条件（３）では、子宮内膜がんの形成率は、７０％であり、プラスミド法を用いた条件（１）および（２）と比較し、子宮内膜がんの形成率は、高かった。これらの結果から、本開示の製造方法においては、核酸編集モジュールの導入方法として、ＲＮＰ法は、プラスミド法と比較して、機能喪失変異をゲノムＤＮＡにより効率よく導入できることがわかった。

（７）標的遺伝子の検討
子宮内膜がんの誘導に必要な標的遺伝子の組合せを検討した。具体的には、異なる標的遺伝子の組合せに対するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの混合液を調製した。そして、前記混合液を用いてゲノム編集液を調製することにより、子宮内膜がんの誘導に必要な標的遺伝子の組合せを探索した以外は、実施例１（２）のＲＮＰ法と同様にマウスを処置した。そして、各マウスについて、前記処置の３か月後に子宮内膜に肉眼病変、子宮内膜がん、または扁平（重層）上皮化が生じているかを評価することにより、腫瘍が生じている割合を検討した。

３ヶ月後のマウスから子宮角を採取後、子宮角の重量を測定した。つぎに、前記子宮角は、４％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で固定した。前記固定後の子宮角は、２～４枚に切り分けた後、パラフィンブロックに包埋し、厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を調製した。得られた切片を、ＨＥ染色し、組織学的解析を行った。組織学的解析では、各サンプルにつき１２個の切片を解析して評価した。各切片は、少なくとも１００μｍの距離で分けて配置した。前記肉眼病変の評価は、解剖時に腫瘍形成を確認できた数を評価した。

前記子宮内膜がんは、正常な子宮内膜構造が著しく破壊され、子宮筋層に浸潤しているかを確認することにより評価した。前記子宮内膜がんの評価は、組織切片上で、前記子宮筋層浸潤を伴う腫瘍形成を確認できた数を評価した。各切片を免疫染色分析に供するために、前記切片を脱パラフィン処理後、得られた切片を１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の存在下で、オートクレーブ処理（１２１℃、５分）して抗原を活性化した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した３％ウシ血清アルブミンＰＢＳを用いてブロッキングした後、一次抗体希釈液を塗布し、４℃で一晩（約８～１０時間）インキュベートした。前記一次抗体は、ＰＧＲ（1：400希釈、ab101688、abcam社製）、およびESR（1：100希釈、ab75635、abcam社製）を用いた。つぎに、前記インキュベート後の切片をHistofine Simple Stain MAX-PO（登録商標）（Nichirei社製）と室温、３０分の条件下で反応させた。シグナルは、3-3'-ジアミノベンジジン（3-3’-diaminobenzidine）で発色させた。カウンター染色は、ＨＥ染色とした。前記扁平上皮化は、上皮が重層化しているかによって評価した。前記扁平上皮化の評価は、組織切片上で、扁平上皮化を確認できた数を評価した。これらの条件と結果とを、下記表４および図７に示す。

前記表４は、標的遺伝子の組合せ、サンプル数、種類毎の腫瘍形成数、および腫瘍形成の割合を示す。前記表４に示すように、前記標的遺伝子の組合せが１遺伝子の場合、Ｌｋｂ１の場合のみ、腫瘍形成率は、２０％であり、その他の遺伝子の場合、腫瘍形成率は、０％であった。また、前記標的遺伝子の組合せが２遺伝子の場合、前記組合せが、ＰｔｅｎとＬｋｂ１の場合のみ、腫瘍形成率は、肉眼病変の形態が４４％、子宮内膜がんの形態が５６％、扁平上皮化が２２％であり、前記組合せ以外の場合は、腫瘍形成率は、０％であった。他方、前記標的遺伝子の組合せが３遺伝子の場合、腫瘍形成率は、肉眼病変の形態が７０％、子宮内膜がんの形態が９０％、扁平上皮化が５０％であった。

図７は、標的遺伝子と、子宮角の重量とを示すグラフである。図７において、横軸は、標的遺伝子の種類を示し、縦軸は、子宮角の重量を示す。図７に示すように、ＰｔｅｎとＬｋｂ１とが標的遺伝子の場合、子宮角の重量が増加する個体が見られ、ＰｔｅｎとＬｋｂ１と、Ｔｐ５３とが標的遺伝子の場合、子宮角の重量が増加する個体がさらに増加した。また、図７に示すように、子宮角の重量が増加すると、子宮内膜の重層化する個体が増加した。

これらの結果から、前記標的遺伝子の組合せが、ＰｔｅｎとＬｋｂ１とした場合、子宮内膜がんを効率よく誘導でき、さらに、Ｔｐ５３を標的遺伝子とすることにより、より効率よく子宮内膜がんを誘導できることがわかった。また、３つの遺伝子を標的遺伝子とすることにより、子宮がんとしてより悪性度合いが進んだ、子宮がんを誘導できることが分かった。

（８）標的遺伝子への機能喪失変異の導入の確認
子宮がんが発生した個体について、腫瘍の標的遺伝子に、機能喪失変異が導入されているか検討した。具体的には、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイを用いて、腫瘍の標的遺伝子に、変異が導入されているか検討した。前記実施例１（２）または（３）で作製した子宮内膜がんモデルマウスから、処置３か月後に解剖し、子宮内膜がんを取得した。前記子宮内膜がんのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによりゲノム編集の標的部位を増幅させた。得られたＰＣＲ産物（１００ｎｇ）を、９５℃、５分間の条件下で変性させた。前記変性後、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ２（ＮＥＢ社製）内で変性させたＰＣＲ産物を徐々に冷却し、前記ＰＣＲ産物を再アニールさせた。前記再アニールされたＰＣＲ産物について、３７℃、１５分間の条件下で、Ｔ７ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ （ＮＥＢ社製）の５ユニットを用いて消化した。前記消化後、２５０ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ ０．７５μｌを反応液に添加することで、前記消化反応を停止させた。前記ＰＣＲ産物の消化パターンは、キャピラリーとマイクロチップ電気泳動（ＭＣＥ－２０２ ＭｕｌｔｉＮＡ、島津製作所社製）を用いて評価した（Ｔｕ）。コントロールは、生理的食塩水を用いた以外は同様にして評価した（Ｗｔ）。これらの結果を、図８に示す。

図８は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイの結果を示す写真である。図８に示すように、コントロール（Wild-type tissue）では、Ｔｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子において、消化バンドは認められなかった。他方、子宮内膜がん（Tumor）では、Ｔｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子において、消化バンドが検出された。

以上の結果から、核酸編集モジュールを生体子宮内エレクトロポレーション法によって、子宮上皮細胞に導入することにより、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡに機能喪失変異が導入され、その結果、子宮がんが発生することが分かった。

（９）三重変異体の子宮内膜がんにおける組織像の検討
前記実施例１（７）における子宮に形成された腫瘍が、上皮組織由来の腫瘍であるかを検討するために、蛍光免疫染色を実施した。前記腫瘍は、Ｔｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子に機能喪失変異が導入された個体由来の腫瘍を用いた。具体的には、前記子宮体部の腫瘍を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。前記固定後、前記子宮体部をパラフィンに包埋し、厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を調製した。前記切片を脱パラフィン処理後、得られた切片を１０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）内で、１２１℃で５分の条件下で、オートクレーブ処理をして抗原を活性化した。その後、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロッキングを行った。前記ブロッキング後、４℃で一晩の条件下で、１次抗体を反応させ、２３℃で１時間の条件下で、２次抗体で染色を行った。前記１次抗体として、上皮細胞の染色には、ラット抗ＣＫ８抗体（５０倍希釈、Troma-I、アイオワ大学から分譲）を、平滑筋細胞の染色には、マウス抗αＳＭＡ抗体（１０００倍希釈、Cat.No:ab7817, アブカム社製）を使用した。前記２次抗体には、Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ラット IgG(H + L)（５００倍希釈、Cat.No:ab150157、アブカム社製）と、Alexa Fluor 594標識ヤギ抗マウス IgG(H + L)（５００倍希釈、Cat.No:ab150116、アブカム社製）とを用いた。核の染色は、VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI （Vector Laboratories）を使用した。前記染色後、各切片について、光学顕微鏡（BZ-9000、キーエンス社製）、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、子宮体の病理学的診断を行った。これらの結果を、図９に示す。

図９は、子宮の上皮細胞の蛍光免疫染色の写真である。図９において、スケールバーは、１００μｍを示す。図９において、白色の破線は、子宮内膜間質と平滑筋層との境界線を示す。図９に示すように、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、上皮マーカーは、子宮内膜間質側に認められたが、平滑筋層には認められなかった。他方、子宮内膜がん（Ｔｕｍｏｒ）では、上皮マーカーは、子宮内膜間質側だけでなく平滑筋層側にも認められた。以上のことから、本開示の方法によって得られた子宮がんモデルマウスにおける子宮内膜がんでは、上皮細胞が、平滑筋層に浸潤していることがわかった。

以上の結果から、本開示のＴｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子に機能喪失変異が導入された三重変異体の子宮内膜がんにおいて、上皮組織由来の腫瘍であることがわかった。

（１０）三重変異体の子宮内膜がんにおけるホルモン受容体の検討
前記実施例１（７）における子宮に形成された腫瘍における性ステロイドホルモン受容体の発現を確認するため、ホルモン受容体であるプロゲステロン受容体（ＰＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）に関する免疫組織化学染色を行なった。前記腫瘍は、Ｔｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子に機能喪失変異が導入された個体由来の腫瘍を用いた。具体的には、前記子宮体部の腫瘍を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。前記固定後、前記子宮体部をパラフィンに包埋し、厚さ３μｍのパラフィン包埋切片を調製した。前記切片を脱パラフィン処理後、得られた切片を１０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）内で、１２１℃、５分の条件下で、オートクレーブ処理をして抗原を活性化した。その後、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロッキングを行った。前記ブロッキング後、４℃で一晩の条件下で、１次抗体を反応させた。前記１次抗体として、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の染色には、ウサギ抗ＰＲ抗体（４００倍希釈、Cat.No: ab101688、アブカム社製）を、エストロゲン受容体（ＥＲ）の染色には、ウサギ抗ＥＲ抗体（１００倍希釈、Cat.No: ab75635、アブカム社製）を用いた。その後、前記染色後、室温、３０分の条件下で、ヒストファイン シンプルステインMAX-PO（ニチレイ社製）を反応させた。前記反応後、3,3'-ジアミノベンジジンを用いて発色を行い、ヘマトキシリンを用いて対比染色を行った。前記染色後、光学顕微鏡（BZ-9000、キーエンス社製）を用いて、子宮体の病理学的診断を行った。これらの結果を、図１０に示す。

図１０は、子宮のホルモン受容体の免疫組織化学染色の写真である。図１０において、各列の写真において、上段の写真は、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の染色画像を示し、下段写真は、エストロゲン受容体（ＥＲ）の染色画像を示す。図１０において、スケールバーは、１００μｍを示す。図１０に示すように、コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、ＰＲとＥＲとが両方発現しているのが確認できた。他方、子宮内膜がん（Ｔｕｍｏｒ）では、ＥＲの発現は認められたものの、ＰＲの発現は認められなかった。以上のことから、本開示の方法で得た子宮内膜がんは、ＰＲの発現が消失していることがわかった。

一般的に、ヒト子宮内膜がんでは、ＰＲおよび／またはＥＲの発現が認められなくなる症例がある。また、ＰＲ発現陰性がんは、プロゲステロンホルモン療法への感受性が悪いことが知られている。以上のことから、本開示のＴｐ５３、Ｐｔｅｎ、およびＬｋｂ１の全ての標的遺伝子に機能喪失変異が導入された三重変異体の子宮内膜がんは、ヒトのがんと同様に、ホルモン療法に効果が期待できないモデルであることが示唆された。

以上、実施形態および実施例を参照して本開示を説明したが、本開示は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本開示の構成や詳細には、本開示のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願等の参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法＞
（付記１）
非ヒト動物の子宮上皮細胞において、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと核酸編集モジュールとを接触させて、標的遺伝子に機能喪失変異を導入する変異導入工程を含み、
前記標的遺伝子は、ＰＴＥＮ遺伝子および肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）遺伝子を含む、子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法。
（付記２）
前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に、前記核酸編集モジュールを導入する導入工程を含む、付記１に記載の製造方法。
（付記３）
前記導入は、エレクトロポレーション法により実施される、付記２に記載の製造方法。
（付記４）
前記核酸編集モジュールは、第１の核酸編集モジュールと、第２の核酸編集モジュールとを含み、
前記第１の核酸編集モジュールは、前記ＰＴＥＮ遺伝子に機能喪失変異を導入可能であり、
前記第２の核酸編集モジュールは、前記ＬＫＢ１遺伝子に機能喪失変異を導入可能である、付記１から３のいずれかに記載の製造方法。
（付記５）
前記核酸配列編集モジュールは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、
前記標的遺伝子の核酸配列に特異的に結合する核酸配列を含むガイド鎖と、
Ｃａｓタンパク質と、
を含み、
前記ガイド鎖と、前記Ｃａｓタンパク質とは、複合体を形成している、付記１から４のいずれかに記載の製造方法。
（付記６）
前記核酸編集モジュールは、前記核酸編集モジュールをコードする核酸であり、
前記核酸にコードされた前記核酸編集モジュールを発現する発現工程を含む、付記１から４のいずれかに記載の製造方法。
（付記７）
前記核酸配列編集モジュールは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、
前記標的遺伝子の核酸配列に特異的に結合する核酸配列を含むガイド鎖と、
Ｃａｓタンパク質と、
を含む、付記６に記載の製造方法。
（付記８）
前記標的遺伝子は、Ｔｐ５３遺伝子を含む、付記１から７のいずれかに記載の製造方法。
（付記９）
前記核酸編集モジュールは、第３の核酸編集モジュールを含み、
前記第３の核酸編集モジュールは、前記Ｔｐ５３遺伝子に機能喪失変異を導入可能である、付記８に記載の製造方法。
（付記１０）
前記子宮上皮細胞は、子宮内膜上皮細胞であり、
前記子宮がんは、子宮内膜がんである、付記１から９のいずれかに記載の製造方法。
（付記１１）
前記核酸編集モジュールは、Ｃｒｅレコンビナーゼを含まない、付記１から１０のいずれかに記載の製造方法。
（付記１２）
前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ｌｏｘＰ配列を含まない、付記１から１１のいずれかに記載の製造方法。
（付記１３）
前記核酸編集モジュールは、ウイルスベクターを含まない、付記１から１２のいずれかに記載の製造方法。
（付記１４）
前記子宮がんは、プロゲステロン受容体陰性である、付記１から１３のいずれかに記載の製造方法。
（付記１５）
前記子宮がんは、エストロゲン受容体陽性である、付記１から１４のいずれかに記載の製造方法。
＜子宮がんモデル非ヒト動物＞
（付記１６）
子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体、ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体、およびＴｐ５３遺伝子の機能喪失体を含む、子宮がんモデル非ヒト動物。
（付記１７）
前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ｌｏｘＰ配列を含まない、付記１６に記載の非ヒト動物。
（付記１８）
前記子宮上皮細胞は、子宮内膜上皮細胞であり、
前記子宮がんは、子宮内膜がんである、付記１６または１７に記載の非ヒト動物。
（付記１９）
前記子宮上皮細胞由来の腫瘍が形成されている、付記１６から１８のいずれかに記載の非ヒト動物。
（付記２０）
前記子宮がんは、プロゲステロン受容体陰性である、付記１６から１９のいずれかに記載の非ヒト動物。
（付記２１）
前記子宮がんは、エストロゲン受容体陽性である、付記１６から２０のいずれかに記載の非ヒト動物。
＜被検物質の評価方法＞
（付記２２）
被検物質を、子宮がんモデル非ヒト動物に投与する投与工程と、
前記子宮がんモデル非ヒト動物における子宮がんを評価する評価工程とを含み、
前記子宮がんモデル非ヒト動物は、付記１から１５のいずれかに記載の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法により得られた子宮がんモデル非ヒト動物、および／または付記１６から２１のいずれかに記載の子宮がんモデル非ヒト動物である、被検物質の評価方法。
（付記２３）
前記評価工程において、前記子宮がんの発生を抑制する、前記子宮がんを縮小する、および／または、前記子宮がんの増大を抑制する、被検物質を、子宮がんの治療薬候補物質として選抜する選抜工程を含む、付記２２に記載の評価方法。

以上のように、本開示によれば、野生型の非ヒト動物からも、子宮がんのモデル非ヒト動物を製造できる。また、本開示によれば、子宮上皮細胞由来の子宮がんを有する子宮がんモデル非ヒト動物を製造できる。このため、本開示は、例えば、生命科学分野および医薬分野等において極めて有用である。

Claims (13)

1. 非ヒト動物の子宮上皮細胞において、前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡと核酸編集モジュールとを接触させて、標的遺伝子に機能喪失変異を導入する変異導入工程を含み、
   前記標的遺伝子は、ＰＴＥＮ遺伝子、肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）遺伝子、およびＴｐ５３遺伝子を含む、プロゲステロン受容体陰性である子宮がんのモデル非ヒト動物の製造方法。
2. 前記子宮上皮細胞外から前記子宮上皮細胞内に、前記核酸編集モジュールを導入する導入工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記導入は、エレクトロポレーション法により実施される、請求項２に記載の製造方法。
4. 前記核酸編集モジュールは、第１の核酸編集モジュールと、第２の核酸編集モジュールとを含み、
   前記第１の核酸編集モジュールは、前記ＰＴＥＮ遺伝子に機能喪失変異を導入可能であり、
   前記第２の核酸編集モジュールは、前記ＬＫＢ１遺伝子に機能喪失変異を導入可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記核酸編集モジュールは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、
   前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、
   前記標的遺伝子の核酸配列に特異的に結合する核酸配列を含むガイド鎖と、
   Ｃａｓタンパク質と、
   を含み、
   前記ガイド鎖と、前記Ｃａｓタンパク質とは、複合体を形成している、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 前記核酸編集モジュールは、前記核酸編集モジュールをコードする核酸であり、
   前記核酸にコードされた前記核酸編集モジュールを発現する発現工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記核酸編集モジュールは、第３の核酸編集モジュールを含み、
   前記第３の核酸編集モジュールは、前記Ｔｐ５３遺伝子に機能喪失変異を導入可能である、請求項６に記載の製造方法。
8. 前記子宮上皮細胞は、子宮内膜上皮細胞であり、
   前記子宮がんは、子宮内膜がんである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
9. 子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ＰＴＥＮ遺伝子の機能喪失体、ＬＫＢ１遺伝子の機能喪失体、およびＴｐ５３遺伝子の機能喪失体を含む、プロゲステロン受容体陰性である子宮がんのモデル非ヒト動物。
10. 前記子宮上皮細胞のゲノムＤＮＡは、ｌｏｘＰ配列を含まない、請求項９に記載の非ヒト動物。
11. 前記子宮上皮細胞は、子宮内膜上皮細胞であり、
    前記子宮がんは、子宮内膜がんである、請求項９または１０に記載の非ヒト動物。
12. 被検物質を、子宮がんモデル非ヒト動物に投与する投与工程と、
    前記子宮がんモデル非ヒト動物における子宮がんを評価する評価工程とを含み、
    前記子宮がんモデル非ヒト動物は、請求項１から８のいずれか一項に記載の子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法により得られた子宮がんモデル非ヒト動物、および／または請求項９から１１のいずれか一項に記載の子宮がんモデル非ヒト動物である、被検物質の評価方法。
13. 前記評価工程において、前記子宮がんの発生を抑制する、前記子宮がんを縮小する、および／または、前記子宮がんの増大を抑制する、被検物質を、子宮がんの治療薬候補物質として選抜する選抜工程を含む、請求項１２に記載の評価方法。