JP7824143B2

JP7824143B2 - 新規リパーゼ

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Publication number: JP7824143B2
Application number: JP2022066572A
Authority: JP
Inventors: 貴大日置; 三佳寺井; 彰人川原
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2026-03-04
Anticipated expiration: 2042-04-13
Also published as: WO2023199946A1; JP2023156914A; EP4509605A1; CN119013407A; US20250320475A1; EP4509605A4

Description

本発明は、新規リパーゼに関する。

リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼはトリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。

現行の洗浄組成物や洗浄環境は、リパーゼの活性や洗浄効果を阻害する様々な成分を含んでおり、そのような条件下で機能するリパーゼが求められている。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。

特表２０１５－５２３０７８号公報国際公開第２０２０／０４６６１３号特表２０１５－５２５２４８号公報

リパーゼは洗浄組成物中に含まれる界面活性剤によってその活性が阻害されることが知られている。実際に本発明者らが検証した限り、洗浄への適性が開示されている公知のリパーゼは、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３９及びＰｖＬｉｐのいずれもが界面活性剤の共存によって大きな活性阻害を受けた。界面活性剤による活性阻害は洗浄用リパーゼ共通の大きな課題である。また、リパーゼは洗浄用途に限らずパルプ処理などの産業用途においても界面活性剤と共に使用されることが多く、界面活性剤による活性阻害は産業用リパーゼ全体の課題でもある。界面活性剤による活性阻害が緩和され、高い洗浄効果を示すリパーゼが求められている。

本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、劇的な洗浄効果を示す新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８を見出した。

すなわち、本発明は、下記１）～６）に係るものである。
１）配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
２）１）に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
５）１）に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
６）５）に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。

本発明のリパーゼは、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄効果を示す。

各リパーゼの界面活性剤溶液中でのリパーゼ活性。各リパーゼの界面活性剤を含むモデル洗浄液中でのリパーゼ活性。各リパーゼの界面活性剤を含むモデル洗浄液中での洗浄力。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸＶｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。

＜１．リパーゼ＞
本発明のリパーゼは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼである。本発明のリパーゼは、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。

配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性、具体的には、９１％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。
少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列には、１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。

配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼは、例えば、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼの人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入（Ｓｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。

本発明のリパーゼは、従来単離又は精製されているリパーゼ及びＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する。従来単離又は精製されているリパーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼＴＬＬ（配列番号１８）、前記特許文献１において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているＣｅｄｅｃｅａｓｐ．－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９（配列番号２）、前記特許文献２において洗浄に好適なリパーゼ変異体群の親酵素として開示されているＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下、ＰｖＬｉｐと称する、配列番号４）、前記特許文献３において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８（配列番号１６）などが挙げられる。また、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質としては、アクセッション番号ＷＰ＿１２３５９８５０７．１のタンパク質（以下、ＰｆＬｉｐと称する、配列番号６）、アクセッション番号ＷＰ＿１１５４５７１９５．１のタンパク質（以下、ＥｔＬｉｐと称する、配列番号８）、アクセッション番号ＷＰ＿１３５４９５６３４．１のタンパク質（以下、ＥｓｐＬｉｐと称する、配列番号１０）、アクセッション番号ＷＰ＿００５１６１３６３．１のタンパク質（以下、ＹｅＬｉｐと称する、配列番号１２）などが挙げられる。当該データベースに登録されているこれらのタンパク質について、その酵素学的性質はこれまでに報告されていない。配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる本発明のリパーゼＫＡＬ－Ａ８は、Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐとそれぞれ７２％、６０％、５９％、６８％、８６％及び７１％のアミノ酸配列同一性を示す。

好ましい一実施形態において、本発明のリパーゼは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである。

＜２．リパーゼの生産方法＞
本発明のリパーゼは、例えば、上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のリパーゼは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のリパーゼが生産される。生産されたリパーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のリパーゼを取得することができる。

本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドであり得る。また本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。

本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、該リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述した本発明のリパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社などより提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニングなどにより増幅することもできる。

またあるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記の手順で合成されたポリヌクレオチドに対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のポリヌクレオチドに公知の方法で突然変異導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させてリパーゼ活性を調べ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することによって、得ることができる。

ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２－８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＭｕｌｔｉＳｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔなどの各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。

本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のリパーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；ＪｐｎＪＧｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。

上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド（すなわち本発明のリパーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。

上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。

あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。

上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。

本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。

宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭａｒｂｕｒｇＮｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。

宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。

あるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。

斯くして得られた、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のリパーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。

あるいは、本発明のリパーゼは、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。

上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のリパーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。

＜３．洗浄剤組成物＞
斯くして得られる本発明のリパーゼは、公知のタンパク質に比して、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。
ここで、「高い耐性」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はＮＣＢＩタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い耐性を意味する。界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、リパーゼ溶液と界面活性剤溶液を混合し、該混合液にリパーゼの基質となるオクタン酸４－ニトロフェニル溶液を添加し、４－ニトロフェノールの遊離に伴う４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定し、ブランクとの差分ΔＯＤ／ｍｉｎをリパーゼ活性値（界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値）として求める。さらに、界面活性剤溶液にかえてバッファーを用いた際のリパーゼ活性値（バッファー中のリパーゼ活性値）を求め、界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値をバッファー中のリパーゼ活性値で割って１００を掛けた値を相対活性（％）として求める。相対活性（％）が高い程、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性が高いと判断できる。
本発明のリパーゼは、後記実施例の（３）の条件下、ＳＤＳ溶液（０．１％（ｗ／ｖ））中のリパーゼ相対活性（％）が好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上のリパーゼである。
本発明のリパーゼは、後記実施例の（３）の条件下、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液（０．１％（ｗ／ｖ））中のリパーゼ相対活性（％）が好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上のリパーゼである。
また、「高い洗浄力」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はＮＣＢＩタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い洗浄力、例えば、汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。洗浄力は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の指標物質（例えば、スダンIIIなどの脂肪に対する溶解性の高い染色剤）を含むモデル汚れにリパーゼを含む洗浄液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄液の一部を分取し、洗浄処理により洗浄液に可溶化したモデル汚れ中の指標物質の濃度を、例えば吸光度測定により測定し、ブランクとの差分を洗浄力として求めることができる。

本発明のリパーゼは、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。

洗浄剤組成物中への本発明のリパーゼの配合量は、当該リパーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また０．１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５～５００ｍｇであるのがより好ましい。

洗浄剤組成物は、好ましくは、本発明のリパーゼに加えて、スルホコハク酸エステル又はその塩を含む。スルホコハク酸エステル又はその塩は、洗浄剤組成物に配合される成分として知られている（例えば、特開２０１９－１８２９１１号公報）。スルホコハク酸エステル又はその塩は、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、炭素数１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましい。また、スルホコハク酸エステル又はその塩は、スルホコハク酸ジ分岐鎖アルキルエステル又はその塩であって、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましく、ビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩がさらに好ましい。

塩としては、例えばアルカリ金属塩、アルカノールアミン塩などが挙げられ、アルカリ金属塩又はアルカノールアミン塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、及びモノエタノールアミン塩から選ばれる塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。

スルホコハク酸エステル又はその塩としては、下記式１で表される化合物が挙げられる。

〔式１中、Ｒ^１、Ｒ^２は、それぞれ、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であり、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏは、それぞれ、炭素数２以上４以下のアルキレンオキシ基であり、ｘ１、ｘ２は、平均付加モル数であり、それぞれ、０以上１０以下の数であり、Ｍは陽イオンである。〕

式１中、Ｒ^１、Ｒ^２は、それぞれ、分岐鎖ノニル基、分岐鎖デシル基及び分岐鎖ドデシル基から選ばれる分岐鎖アルキル基が好ましく、分岐鎖デシル基がより好ましい。分岐鎖デシル基は、２－プロピルヘプチル基が好ましい。

式１中、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏは、それぞれ、炭素数２以上４以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは炭素数２又は３のアルキレンオキシ基である。式１中、ｘ１、ｘ２は、Ａ^１Ｏ、Ａ^２Ｏの平均付加モル数を表し、それぞれ、０以上１０以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは６以下、より好ましくは４以下、さらに好ましくは２以下の数であり、０がさらに好ましい。

式１中、Ｍは陽イオンである。Ｍは水素イオン以外の陽イオンが好ましい。Ｍとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオン、トリメチルアンモニウムイオン、モノメチルアンモニウムイオンなどの有機アンモニウムイオンなどが挙げられる。
Ｍは、水への分散性の観点から、アルカリ金属イオン、アルカノールアンモニウムイオンが好ましく、ナトリウムイオン、カリウムイオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがさらに好ましい。

スルホコハク酸エステル又はその塩は、下記式１－１で表される化合物が好ましい。式１－１の化合物は、式１中のｘ１、ｘ２がそれぞれ０の化合物である。

〔式１－１中、Ｒ^１、Ｒ^２は、それぞれ、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であり、Ｍは陽イオンである。〕
式１－１中のＲ^１、Ｒ^２、Ｍの具体例や好ましい例は式１と同じである。
好ましい一実施形態において、スルホコハク酸エステル又はその塩は、ビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩である。

洗浄剤組成物中へのスルホコハク酸エステル又はその塩の配合量は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．０質量％以下である。また０．０１～２．０質量％であるのが好ましく、０．１～１．０質量％であるのがさらに好ましい。

洗浄剤組成物は、本発明のリパーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼなどである。このうち、本発明のリパーゼとは異なるリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどが好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、ＰｒｏｇｒｅｓｓＵｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、などが挙げられる。
セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）などが挙げられる。
アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、ＳｔａｉｎｚｙｍｅＰｌｕｓ、ＡｍｐｌｉｆｙＰｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、などが挙げられる。
リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）などが挙げられる。

洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。

（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。

洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、上記のスルホコハク酸エステル又はその塩以外の、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。

陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。

非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシドなどのアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。

（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。

（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。

（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。

（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。

（６）蛍光剤
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。

（７）その他の成分
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。

洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のリパーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。

斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄における使用が挙げられる。

本発明の洗浄剤組成物を用いることで、汚れの除去を必要とする被洗浄物（例えば、衣類、食器、硬質表面、排水管、義歯、医療器具など）を洗浄すること、すなわち汚れを除去することができる。斯かる洗浄方法は、汚れの除去を必要とする被洗浄物と本発明の洗浄剤組成物とを接触させることを含む。好ましくは、汚れとは、皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである。

本発明の洗浄方法において、被洗浄物と洗浄剤組成物とを接触させるには、該洗浄剤組成物を溶かした水に、該被洗浄物を漬け置きしてもよく、また該洗浄剤組成物を、該被洗浄物に直接塗布してもよい。本発明の方法においては、該漬け置き又は洗剤組成物の塗布後の被洗浄物をさらに手洗い、洗濯機などで洗ってもよいが、必ずしもその必要はない。

上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
＜２＞配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる、＜１＞に記載のリパーゼ。
＜３＞＜１＞又は＜２＞に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
＜４＞＜３＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜５＞＜４＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜６＞微生物である、＜５＞に記載の形質転換細胞。
＜７＞大腸菌又はバチルス属細菌である、＜５＞又は＜６＞に記載の形質転換細胞。

＜８＞＜１＞又は＜２＞に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
＜９＞スルホコハク酸エステル又はその塩、好ましくは炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは炭素数１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩をさらに含有する、＜８＞に記載の洗浄剤組成物。
＜１０＞スルホコハク酸ジエステル又はその塩、好ましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらにこのましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくはビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩をさらに含有する、＜８＞に記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１２＞粉末又は液体である、＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１３＞低温で使用される、＜８＞～＜１２＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１４＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜１３＞に記載の洗浄剤組成物。

＜１５＞＜８＞～＜１４＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
＜１６＞被洗浄物と＜８＞～＜１４＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物とを接触させることを含む、＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、＜１５＞又は＜１６＞に記載の方法。

＜１８＞洗浄剤組成物の製造のための配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜１９＞リパーゼが配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、＜１８＞に記載の使用。
＜２０＞洗浄剤組成物が衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１８＞又は＜１９＞に記載の使用。
＜２１＞洗浄剤組成物が粉末又は液体である、＜１８＞～＜２０＞のいずれかに記載の使用。
＜２２＞洗浄剤組成物が低温で使用されるものである、＜１８＞～＜２１＞のいずれかに記載の使用。
＜２３＞洗浄剤組成物が４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用されるものである、＜２２＞に記載の使用。

＜２４＞汚れの洗浄のための配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜２５＞リパーゼが配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、＜２４＞に記載の使用。
＜２６＞汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、＜２４＞又は＜２５＞に記載の使用。
＜２７＞洗浄が低温での洗浄である、＜２４＞～＜２６＞のいずれかに記載の使用。
＜２８＞洗浄が４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での洗浄であるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での洗浄である、＜２７＞に記載の使用。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

（１）リパーゼ発現プラスミドの構築
リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＫＡＬ－Ａ８、Ｌｉｐｒ１３８（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３９、ｐＨＹ－ＰｖＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｔＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ、ｐＨＹ－ＫＡＬ－Ａ８、ｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３８を構築した。プラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３９のＬｉｐｒ１３９遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｎ末端側に枯草菌ａｍｙＥ由来シグナル配列（配列番号１９のポリヌクレオチド、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする）が連結されたリパーゼＴＬＬ遺伝子（配列番号１７のポリヌクレオチド、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする）の人工合成遺伝子をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって載せ替えることでｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＴＬＬを構築した。

（２）リパーゼ溶液の調整
リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、２日間培養した後、リパーゼを含む培養上清を遠心分離により回収した。透析によって培養上清を１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンド強度からリパーゼ濃度を定量した。

（３）界面活性剤溶液中での活性測定
オクタン酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を基質として用いた。リパーゼの作用による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭオクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）添加したものを界面活性剤溶液として用いた。２ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液５μＬと界面活性剤溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とした。各リパーゼについて、界面活性剤溶液の代わりに２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた際の活性値（バッファー中での活性）で界面活性剤溶液中での活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた（図１）。
ＴＬＬ、特許文献１、２及び３において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐは、ＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００の存在下で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００による活性阻害に対して高い耐性を示した。

（４）モデル洗浄液中での活性測定
２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭオクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。モデル洗浄液として、表１の水性媒体を用いた。４ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液２μＬと試験液（モデル洗浄液又は２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。３１～５００μＭの４－ニトロフェノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１０μＬを各試験液１００μＬと混合し、４０５ｎｍの吸光度を測定し検量線を作成した。各試験液の検量線とΔＯＤ／ｍｉｎの値から、一分間あたりの４－ニトロフェノールの遊離速度（μＭ／ｍｉｎ）を活性値として算出した。
各リパーゼについて、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を試験液とした際の活性値（バッファー中での活性）で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた（図２）。
ＴＬＬ、特許文献１、２及び３において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐは、モデル洗浄液中で著しく活性が阻害された。一方、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はモデル洗浄液中での活性阻害に対して高い耐性を示した。

（５）モデル洗浄液中での洗浄評価
牛脂（ＳＩＧＭＡ，０３－０６６０）とナタネ油（ＳＩＧＭＡ，２３－０４５０）を重量比９：１で混合し、３倍量のクロロホルムに溶解した後に０．２ｗｔ％のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとした。ポリプロピレン製の９６穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを１０μＬずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとした。
表１記載のモデル洗浄液に、１／１００容量の２４０ｐｐｍのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とした。汚れプレートに洗浄液を３００μＬずつ緩やかに添加し、室温（約２２℃）で１５分間静置して浸漬洗浄を行った。底部の汚れに触れないように洗浄液を１００μＬずつ分取し、新しい９６穴プレートに移した。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、５００ｎｍの吸光度（Ａ５００）を測定した。洗浄後のＡ５００から洗浄前のＡ５００を差し引いた値ΔＡ５００は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。各リパーゼの洗浄力ΔＡ５００を図３に示した。
特許文献１において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９は、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３８、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐと比較して、モデル洗浄液中で高い洗浄力を示した。一方、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はモデル洗浄液中でＬｉｐｒ１３９を含む他のリパーゼと比較して顕著に高い洗浄力を示した。

Claims

配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
請求項１に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
請求項３に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
微生物である、請求項４に記載の形質転換細胞。
請求項１に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項６に記載の洗浄剤組成物。
粉末又は液体である、請求項７に記載の洗浄剤組成物。
低温で使用される、請求項７又は８に記載の洗浄剤組成物。
５～４０℃の温度で使用される、請求項９に記載の洗浄剤組成物。
請求項６に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。