JP7828614B2 - Ｔｍ４ｓｆ１９抑制剤及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １９；膜貫通４Ｌ６ファミリーメンバー１９）の発現または活性抑制剤を含む骨疾患、肥満または肥満媒介代謝性疾患、がん、がん転移の予防または治療用組成物、前記疾患治療薬物のスクリーニング方法に関する。

骨は、一生の間に絶えず変化する活動的な組織である。骨は肉眼で外部の皮質骨（緻密骨）と内部の小柱骨（海綿骨、スポンジ骨）に区分するが、皮質骨は物理的な強度が強く身体を保護して支持する役割を果たし、小柱骨は、衝撃を吸収するか、またはカルシウムの変化を一定に維持する役割を果たす。

骨の成長が中断された後も古い骨は破壊されてなくなり（骨吸収）、新しい骨がなくなったところを埋める固定（骨形成）が一生の間繰り返される、このような現象を骨の再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）という。

骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収との間の相互作用がバランスをとって骨の恒常性が維持され、血液中のカルシウム濃度が一定に維持されるが、骨代謝不均衡により骨粗鬆症などの骨関連疾患が発生する。

破骨細胞と骨芽細胞の相互作用で骨吸収と骨形成過程が順次起こり、骨恒常性（ｂｏｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持する現象を骨再形成（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）といい、破骨細胞と骨芽細胞間の活性のバランスによって骨量が決定される。骨再形成の過程は、破骨細胞が骨吸収を進行し、その後、骨芽細胞による骨形成がカップリングされてバランスよく起こる。このような効率的なバランスが崩れると、骨消失が起こる。

破骨細胞は、分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）過程を経て多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）となり、多核破骨細胞により骨吸収が起こる。破骨細胞の機能不全は、骨化石症（ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ）を誘発し、破骨細胞の過活性化による骨吸収の増加は、閉経による骨粗鬆症と炎症性関節炎などを誘発する。これまで、ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）系薬物と抗ＲＡＮＫＬ抗体が破骨細胞の過活性化をターゲットとして開発された薬物であるが、破骨細胞の全般的な抑制は、破骨細胞と骨芽細胞のバランスに影響を与えて骨形成に大きな影響を及ぼし、このような全般的な抑制による副作用も伴う。したがって、より選択的に破骨細胞を抑制できる治療剤の開発が求められる。

破骨細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から由来し、Ｍ－ＣＳＦ（ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）刺激とＲＡＮＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）のリガンド（ＲＡＮＫＬ）による活性化を通じて単核球／マクロファージ系から分化する多核細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ）である。破骨細胞の分化は、破骨細胞前駆体（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）がＴＲＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ単核破骨細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）に分化し、その後、細胞－細胞間融合で多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）に成熟する［図２ｃ参照］。このような成熟（ｍａｔｕｒｅ）、多核破骨細胞は、骨吸収を引き起こす［Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２０ Ａｕｇ ８；２１（１６）：５６８５．］。

肥満は、遺伝的、代謝的、環境的、及び行動学的な複雑な要因の相互作用によって発生する生物学的現象であり、異常または過剰な脂肪の蓄積として定義され、健康に悪影響を及ぼすことがある。特に肥満は、高血圧、２型糖尿病、がん、肝疾患、高脂血症、動脈硬化などの各種の成人病を引き起こす重要な危険因子として知られている。肥満は、カロリー摂取量とエネルギー消費量との間の慢性的な不均衡の結果であって、脂肪組織の代謝、内分泌及び免疫機能の喪失を伴い、代謝異常と主な脂肪貯蔵シグナル伝達ホルモンであるインスリンに対する反応性低下（抵抗性）が発生し、これにより脂肪組織以外の他の代謝器官における脂肪の蓄積を引き起こし、様々な脂肪毒性（ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示す。脂肪毒性の最も代表的な病理現象は炎症反応であり、低い状態の慢性炎症疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）として特徴付けられる。肥満において代謝異常とインスリン抵抗性が現れる前に脂肪組織でマクロファージ（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の活性化が起こり、炎症前段階に入る。このように肥満は、体内に低強度の慢性炎症状態を誘発して各種の代謝性疾患を引き起こす。このように肥満による体内慢性炎症と代謝性合併症の発生において脂肪組織のマクロファージが重要な役割を占めている。

脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）に貯蔵された脂肪は、体内の重要なエネルギー源として使用される。過剰な脂肪細胞の分化と不均衡なエネルギーの過剰供給によって肥満が誘発される。脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）は脂肪細胞だけでなく、脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＡＳＣ）、免疫細胞、内皮細胞など様々な細胞が組織内に存在し、これを間質血管細胞群（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＳＶＦ）と呼ぶ。脂肪組織は、エネルギーを脂質形態で貯蔵するものであるが、体の保温作用をすることもある。栄養素を貯蔵する脂肪である白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ＷＡＴ）と栄養素を消費して熱を発生させる褐色脂肪組織（ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ＢＡＴ）に区分される。また、脂肪組織は、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、レシスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、腫瘍壊死因子－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α、ＴＮＦα）などを作り出すこともある。脂肪細胞分化は、様々なホルモンと様々な転写因子の相互作用を通じて非常に複雑に行われるが、インスリンやインスリン成長因子－１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１）、成長ホルモンなどの刺激によって促進され、この過程でＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質（ＣＣＡＡ Ｔｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ／ＥＢＰ））ファミリー、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ） ｇａｍｍａ）などの転写因子の増加が観察される。これらの転写因子は、脂肪細胞調節因子とともに脂肪細胞の分化を促進し、脂肪酸結合タンパク質であるａＰ２や脂肪酸生合成酵素（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）などの酵素の発現量が増加する。一方、脂肪肝の進行にも過剰な中性脂肪の蓄積が関与していることが報告されている［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９８，１５７５ １５８４（１９９６）．］。

現在、使用されている肥満治療剤としては、スイス・ロシュのゼニカルなどの脂肪吸収抑制剤とアメリカのアボットのメリディアなどの食欲減退剤が多く使用されているが、これらの薬剤は、頭痛、血圧上昇、下痢などの副作用が発生するという問題点がある。したがって、副作用のない新たなターゲットの肥満治療剤の開発が必要であるのが実状である。

がんは、人類の健康を脅かす最大の病気の一つであり、細胞が一連の突然変異過程を経て、無制限で非調節的な方式で増殖し、不死化して発生する疾患である。初期に発見されたがんの場合、手術、放射線治療、化学的療法などの治療法があるが、その副作用が大きな問題として台頭しており、末期がんや転移したがんの場合、特別な治療法なしに時限付きの人生で生を終える状況である。

最近、がんに関連した様々な生化学的メカニズムが究明され、それに伴う治療剤が開発されているが、まだがんに対する根本的な治療方法は提示されていない。これにより、がんに関連した様々な生体内分子を同定し、これを標的とする薬物を開発しようとする研究が活発に進められており、これらの薬物のうち一部を組み合わせてがん治療効果を増進させようとする努力も試みられている。

したがって、がんに関連した標的分子をさらに発掘する努力は、非常に重要であると言える。

一方、ＴＭ４ＳＦ１９は、膜貫通４Ｌ ６ファミリーメンバー１９（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ：ＴＭ４ＳＦ１９）で、大韓民国登録特許第１０－１７８１２００号［大韓民国登録特許第１０－１７８１２００号］では、肥満診断用マーカーとしてのＴＭ４ＳＦ１９の用途について開示したことがある。しかし、これまでＴＭ４ＳＦ１９に関して骨関連疾患治療、肥満または肥満関連代謝性疾患治療、がん治療またはがん転移抑制効果については報告されたことがない。

そこで、本発明者らは、骨疾患、肥満及び肥満に媒介される様々な代謝性疾患、がん治療またはがん転移抑制の根本的な治療を目的として関連した遺伝子を探すために、様々な遺伝子を対象として骨疾患、肥満または肥満媒介代謝性疾患、がんとの関連性について研究を進め、その結果、ＴＭ４ＳＦ１９の様々な機能を確認することで本発明を完成した。

本発明の目的は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、骨疾患疑い検体に骨疾患治療用候補物質を処理する段階、及び対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、骨疾患治療薬物のスクリーニング方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含む肥満または肥満媒介代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、肥満または肥満媒介代謝性疾患疑い検体に肥満または肥満媒介代謝性疾患治療用候補物質を処理する段階、及び対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、肥満または肥満媒介代謝性疾患治療薬物のスクリーニング方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含むがん予防、治療またはがん転移抑制用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、がん予防、治療またはがん転移疑い検体にがん予防、治療またはがん転移抑制用候補物質を処理する段階、及び対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、がん治療またはがん転移治療薬物のスクリーニング方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制用融合タンパク質を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を含む骨疾患の予防または治療用組成物を対象体に投与する段階を含む骨疾患を予防または治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を含む肥満または肥満媒介代謝性疾患予防または治療用組成物を対象体に投与する段階を含む肥満または肥満媒介代謝性疾患を予防または治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を含むがん予防、治療またはがん転移抑制用組成物を対象体に投与する段階を含むがん予防、治療またはがん転移を予防または治療する方法を提供することである。

本発明によるＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤は、骨疾患、肥満、肥満媒介代謝性疾患、がん、がん転移の予防または治療に使用しうる。

また、ＴＭ４ＳＦ１９を阻害する骨疾患、肥満、肥満媒介代謝性疾患、がん、がん転移治療用候補物質をスクリーニングする方法によれば、骨疾患、肥満、肥満媒介代謝性疾患、がん、がん転移を治療できる候補物質を効率的に選別しうる。

図１は、マウス骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Β ｌｉｇａｎｄ）を処理して時間別に分化させた後、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子発現をｑＰＣＲで確認した結果である。 図２ａは、野生型（ＷＴ）マウスとＣＲＩＳＰＲノックアウトマウスであるＴＭ４ＳＦ１９ＫＯのマウス骨髄由来細胞をＭ－ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を処理して分化させた後、ＴＲＡＰ染色を行った結果である。 図２ｂは、ＣＲＩＳＰＲを用いたＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスであるＴＭ４ＳＦ１９ＫＯと野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、ＲＡＮＫＬの濃度を１００ｎｇ／ｍｌに固定し、Ｍ－ＣＳＦの濃度を２５、４０、６０ｎｇ／ｍｌと異にした条件で分化させた後、破骨細胞関連マーカーであるＴＲＡＰ染色（Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った結果を示す。 図２ｃは、破骨細胞の分化過程を示す模式図である。 図３は、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯのマウス骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ（Ｍ－ＣＳＦ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌ）を処理して分化させてから４日後、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ、ＯＣ）分化に関連したターゲット遺伝子であるＣｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、及びＮｆａｔｃ１発現をｑＰＣＲで確認した結果である。 図４ａは、野生型とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス骨髄を分化させた後、多核破骨細胞の分化時に形成されるエクチンベルトの形成の有無をＦ－アクチン染色で確認したものである。 図４ｂは、Ｄｅｎｔｉｎ ｄｉｓｃの上にＢＭＭ細胞をプレーティングして分化させた後、ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色で確認したものである。 図５ａは、８週齢の野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ雌マウスにｏｖａｒｙを切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行ってから３１日目に大腿部を固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析した結果である。 図５ｂは、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像分析プログラムで分析して得られた総骨塩密度（ＢＭＤ）、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の比率（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）、骨小柱の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を示したものである。 図６は、８週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯのマウスの大腿骨を固定し、石灰質の除去（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後、ＴＲＡＰ染色した結果である。 図７ａは、野生型（ＷＴ）マウスとＣＲＩＳＰＲでＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ２ （１１６～１６５）をノックアウトさせたＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦ２５ｎｇ／ｍｌまたはＭ－ＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌを処理して分化させた後、ＴＲＡＰ染色を行った結果である。 図７ｂは、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨髄から細胞を抽出し、ＲＡＮＫＬの濃度を１００ｎｇ／ｍｌで固定し、Ｍ－ＣＳＦの濃度を２５ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌで処理して分化させた後、ＴＲＡＰ染色を行った結果である。 図７ｃは、野生型とＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウス骨髄を分化させた後、多核破骨細胞の分化時に形成されるエクチンベルトの形成の有無をＦ－アクチン染色で確認したものである。 図７ｄは、Ｄｅｎｔｉｎ ｄｉｓｃの上に野生型とＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２ΔのＢＭＭ細胞をプレーティングして分化させた後、ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色で確認したものである。 図８は、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスに対して破骨細胞の分化に関連したターゲット遺伝子（Ｃｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、Ｎｆａｔｃ１）の発現をｑＰＣＲで確認した結果である。 図９ａは、８週齢のＷＴとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δ雌マウスにｏｖａｒｙを切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行ってから３１日後に大腿部を固定してｍｉｃｒｏ ＣＴ分析した結果である。 図９ｂは、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像分析プログラムで分析して得られた総骨塩密度（ＢＭＤ）、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の比率（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）、骨小柱の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を示したものである。 図１０は、８週齢の野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δ雌マウスに卵巣を切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ、ＯＶＸ）を行ってから３１日後に大腿部を固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析した結果、骨微細構造指標を示す。 図１１は、８週齢の野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δ雌マウスにｏｖａｒｙを切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行ってから３１日後に大腿部を固定してｍｉｃｒｏ ＣＴ撮影したイメージである。 図１２ａは、ＴＭ４ＳＦ１９の一部の配列を欠失したｈＴｍ４ｓｆ１９変異体（ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１１５－１７５Δ}、ｈＴｍ４ｓｆ１９_{１０５－１８６Δ}、ｈＴｍ４ｓｆ_{１０５－１９６Δ}、ｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１８６Δ}及びｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６Δ}）の構造を模式化した図である。 図１２ｂは、ＴＭ４ＳＦ１９が自己と結合し、細胞間相互作用に関与することを示す結果である。ＴＭ４ＳＦ１９の一部配列を欠失させた変異体のうち、９４－１９６欠失変異体がＴＭ４ＳＦ１９自体と結合しないことを示す結果である。 図１２ｃは、ｈＴｍ４ｓｆ１９のうち、９４－１９６配列のみを残し、残りの配列を欠失させたｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６}（上段）が野生型（ＷＴ）と同様に自己と結合し、細胞間相互作用に関与することを示す結果（下段）である。 図１２ｄは、ＴＭ４ＳＦ１９断片として使用されたｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１９６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～２０９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１９６及びｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１９６の構造とＮ－末端に３ＦｌａｇをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９と前記ＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互結合を免疫沈殿で確認した結果を示す。 図１２ｅは、図１２ｄと同様に、ＴＭ４ＳＦ１９断片として使用されたｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１９６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～２０９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１９６及びｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１９６の構造とＮ－末端に３ＦｌａｇをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９と前記ＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互結合を免疫沈殿で確認した結果を示す。 図１２ｆは、Ｃ末端に３ＨＡをタギングしたインテグリンαｖとＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互結合を免疫沈殿で確認した結果を示す。 図１２ｇは、Ｃ末端に３ＨＡをタギングしたインテグリンβ３とＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互作用を免疫沈殿で確認した結果を示す。 図１２ｈは、２９３Ｔ細胞または破骨細胞前駆体Ｒａｗ２６４．７ ｃｅｌｌにＴＭ４ＳＦ１９と破骨細胞の機能を調節し、多核破骨細胞の形成時に細胞骨格の再配列に関与するタンパク質であるインテグリンαｖまたはインテグリンβ３を過剰発現した後、ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの有無を確認した結果である。また、Ｃ末端に３ＨＡをタギングしたインテグリンαｖまたはインテグリンβ３とＮ末端に３ＦｌａｇをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９とＴＭ４ＳＦ１９ ＥＣ２（１１５－１７５）を欠失させた変異体とのｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの有無を確認した結果である。 図１２ｉは、ＴＭ４ＳＦ１９と破骨細胞の機能の調節に関与し、多核破骨細胞の形成時に細胞骨格の再配列に関与するｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎであるＤＣ－Ｓｔａｍｐとｓｉｇｌｅｃ－１５との相互作用を免疫沈殿で確認した結果を示す。 図１３は、マウス由来乳がん細胞Ｅ０７７１にＴＭ４ＳＦ１９を過剰発現させて細胞増殖、コロニー形成、細胞移動を確認した結果である［ＬＰＣＸ：ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｅｃｔｏｒ名］。 図１４は、マウス由来乳がん細胞Ｅ０７７１を野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウス尾静脈に注入後、肺転移抑制を確認した結果である。 図１５ａは、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスから骨髄を採取し、骨髄由来マクロファージに分化させた後、乳がん細胞と共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）して細胞を移動させた後、細胞移動に関与するターゲット遺伝子（フィブロネクチン、ビメンチン、ＣＤＨ２、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２）の発現（図１５ａ）をｑＰＣＲで確認した結果である。 図１５ｂは、転移関連タンパク質（ビメンチン、ｓｌｕｇ、ｓｎａｉｌ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、β－アクチン）発現をウエスタンブロッティングで確認した結果である［ＢＭＤＭ：ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ］。 図１６は、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＭＳＣ）を脂肪細胞に分化させた後、遺伝子（Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、ＴＭ４ＳＦ１９）発現をｑＰＣＲで確認（上段）し、ウエスタンブロッティングでタンパク質（ＴＭ４ＳＦ１９、ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４）発現を確認した結果（下段）である。 図１７は、正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１６週間高脂肪食（６０％ｆａｔ）を与えて体重増加を確認した結果を示す。 図１８は、正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、インスリン抵抗性をＨＯＭＡ－ＩＲで確認し（Ａ）、肝表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を確認し、肝組織を固定した後にＨ＆Ｅ染色し（Ｂ）、肝臓内のトリグリセリドレベルを測定した結果（Ｃ）を示す。 図１９ａは、正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１８週間高脂肪食を与えて体重増加を確認した図である。 図１９ｂは、各組織の重量を確認した図である。 図１９ｃは、皮下脂肪及び内臓脂肪の重量を確認した図である。 図１９ｄは、精巣上体の白色脂肪（ｅＷＡＴ：ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）のＨ＆Ｅ染色で脂肪の表現型と脂肪周辺の脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）マクロファージを確認した図である。 図１９ｅは、血清内抗肥満サイトカインであるアディポネクチンの分泌を確認した結果である［ｒｔＷＡＴ：ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｅｎａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｓＷＡＴ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉｎｇＷＡＴ：ｉｎｇｕｉｎａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉＷＡＴ：ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉＢＡＴ：ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ］． 図２０は、正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、ｅＷＡＴ（精巣上体の白色脂肪）とｓＷＡＴ（皮下白色脂肪組織）において脂肪分化マーカー（上段）とマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、Ｍ１様マクロファージマーカー（Ｍ１－ｌｉｋｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍａｒｋｅｒ）の発現（下段）を確認した結果である。 図２１は、正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、精巣上体の白色脂肪のＦＡＣＳ分析によりマクロファージ（Ａ）％及び樹状細胞（Ｂ）％を確認した結果である。 図２２－１は、野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスを１２週間高脂肪食を与えた後、精巣上体の白色脂肪において間質血管細胞群（ＳＶＦ：ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）においてマクロファージマーカー遺伝子であるＭＣＰ１及びＦ４／８０の発現、Ｍ１様マクロファージマーカーであるＩＬ６及びＴＮＦα発現及びＭ２様マクロファージマーカーであるＩＬ１０の発現を確認した結果である。 図２２－１の続きである。 図２３は、ｅＷＡＴにおいて炎症、インスリン抵抗性及び脂肪肝に対するＴＭ４ＳＦ１９の役割を示す結果である。 図２４ａは、正常食を与えた６週齢のマウスに高脂肪食を与え始め、１２週間与えた高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいて、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪からベージュまたは褐色脂肪表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）への転換を確認した結果である。 図２４ｂは、高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいて、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの白色脂肪におけるＵｃｐ１発現が増加することを確認した結果である。 図２４ｃは、褐色脂肪分化インビトロモデルの作製プロセスである。 図２４ｄは、褐色脂肪分化インビトロモデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯでＵｃｐ１が増加したことを確認した結果である。 図２４ｅは、ＴＭ４ＳＦ１９が白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞に変えることに関与することを確認した結果である。 図２５ａは、白色脂肪をｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉでｄｉｇｅｓｔｉｏｎした後、遠心分離してａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ、ＳＶＦフラクションに分けた。各ｆｒａｃｔｉｏｎにあるｃｅｌｌの種類に対する模式図である。 図２５ｂは、高脂肪食６０％ｆａｔを２４週間与えたマウスの精巣上体の白色脂肪と皮下白色脂肪において脂肪細胞とＳＶＦを分けてＴＭ４ＳＦ１９発現を確認した結果である。 図２６は、野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの皮下白色脂肪からＳＶＦを抽出し、イソプロパノールで褐色脂肪に分化を誘導し、ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎとベージュ脂肪マーカー遺伝子発現を確認したものである。 図２７は、インビトロモデルで脂肪細胞を分化させた後、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅとｃｏｎｔａｃｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ（右）後、マクロファージ、炎症、アディポネクチンなどのマーカー遺伝子を確認（左）した結果である［対照群：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用する]。 図２８は、野生型（ＷＴ）マウスからＳＶＦを抽出して脂肪を生成させ、ＷＴ骨髄マクロファージに分化させた後、それぞれまたはｃｏｎｔａｃｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅして炎症変化を誘導した結果である［対照群（ｃｔｒｌ）：マクロファージと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用する]。 図２９は、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスからＳＶＦを抽出してａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓさせ、それぞれのマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、ｃｏｎｔａｃｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅして炎症変化を誘導した結果である。 図３０は、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスからＳＶＦを抽出してａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓさせ、それぞれのマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、それぞれまたはｃｏｎｔａｃｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅして炎症変化を誘導した結果である［対照群（ｃｔｒｌ）：マクロファージと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用する］。 図３１は、インビトロインスリン耐性モデルの作製過程（上段）及び脂肪細胞を１２日間分化させた後、ＴＮＦαを２４時間処理した後、脂肪分化マーカーであるＣ／ＥＢＰα、ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｍａｒｋｅｒであるＣ／ＥＢＰβを確認（中央）し、ＴＭ４ＳＦ１９の増加も確認した結果（下段）である。 図３２は、インビトロインスリン耐性モデルで、野生型に比べてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯにおいてｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅが減少することを示す結果である。 図３３は、野生型（ＷＴ）マウスから骨髄を採取してマクロファージの分化させた後、Ｍ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎに関与するマーカーを確認した結果である。 図３４は、野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、Ｍ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎを行い、野生型マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、Ｍ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎに関与するマーカーを確認した結果（下段）である。 図３５は、２９３Ｔ細胞にヒトＴＭ４ＳＦ１９（ｈＴＭ４ＳＦ１９）、ヒトＥＣ２Δ（ｈＴＭ４ＳＦ１９ １１５～１７５Δ）、マウスＴＭ４ＳＦ１９（ｍＴＭ４ＳＦ１９）、マウスＥＣ２Δ（ｍＴＭ４ＳＦ１９ １１６～１６５Δ）を一時的に過剰発現させた後、先に作製したポリクローナルマウスＴＭ４ＳＦ１９抗体で発現を確認するためにウエスタンブロッティングを行った結果を示したものである。 図３６は、野生型マウスから骨髄を採取して破骨細胞に分化させながら、ＴＭ４ＳＦ１９抗体を処理し、ＴＲＡＰ染色により確認した結果である。 図３７は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－ＦｃとマウスＴＭ４ＳＦ１９_{１１６－１６５}－Ｆｃを作製して精製した後、クマシー染色（左、右）及びウエスタンブロッティング（中）結果を示したものである。 図３８ａは、ｍＭ４ＳＦ１９_{１１６－１６５}－Ｆｃを破骨細胞分化過程処理して多核破骨細胞形成の阻害をＴＲＡＰ染色で確認したものである［Ｅ１；Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ）でｅｌｕｔｉｏｎしたｓａｍｐｌｅ．Ｅ１－１；Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）でＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＵＦ／ＤＦ）進行したサンプル（Ｆｃがより安定的である場合がある）］。 図３８ｂは、ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－Ｆｃを破骨細胞分化過程処理して多核破骨細胞形成の阻害をＴＲＡＰ染色で確認したものである。 図３８ｃは、ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－Ｆｃ及びｍＴＭ４ＳＦ１９_{１１６－１６５}－Ｆｃを破骨細胞分化過程処理し、ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－Ｆｃ及びｍＴＭ４ＳＦ１９_{１１６－１６５}－Ｆｃが多核破骨細胞の形成を阻害することをＴＲＡＰ染色で確認した結果である。 図３８ｄは、野生型マウス骨髄を分化させながら、ＩｇＧ－ＦｃとｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ処理した後、多核破骨細胞の分化時に形成されるアクチンベルト形成の有無をＦ－アクチン染色で確認したものである。 図３８ｅは、骨再吸収がｍＴＭ４ＳＦ１９－ＦｃによってｂｌｏｃｋされたことをＴｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色で確認したものである。 図３９ａは、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによる骨損失抑制効果を示すｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージである。 図３９ｂは、図３９ａのｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析して得られた総骨塩密度（ＢＭＤ）、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）は、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標を示したものである。 図３９ｃは、マウス大腿骨組織をＨ＆Ｅ染色を通じて組織病理学的に分析したものである。 図３９ｄは、８週齢のｆｅｍａｌｅマウスにｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ後、ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１３１～１６９）を尾静脈に注射後、骨損失が顕著に抑制されることを確認した。 図４０ａは、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを処理しながら、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ処理する条件で分化した細胞のＣｔｓｋ及びＡｃｐ５のｍＲＮＡ発現をグラフで表したものである。 図４０ｂは、野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬ（Ｍ－ＣＳＦ ２５ｎｇ／ｍｌ、ＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌ）を処理する条件で分化させながら、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを５μｇ／ｍｌで処理した後、破骨細胞分化マーカータンパク質の発現を確認した結果を示す。 図４１は、Ｒａｗ２６４．７細胞の分化前後のｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃとのｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇをＦＡＣＳ分析によって確認したものである。 図４２ａは、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた関節リウマチの予防及び治療を確認するための実験スケジュールを模式化したものである。 図４２ｂは、コラーゲン誘導関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）の誘発後、４２日後にマウスの関節状態を確認した結果を示す。 図４２ｃは、実験期間中に調査されたＣＩＡスコアと腫れた関節の数を分析した結果を示す。 図４２ｄは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの足に発生した炎症と骨損傷がｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理によって容量依存的に抑制されたことを示すｍｉｃｒｏ ＣＴイメージである。 図４２ｅは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの足に発生した炎症と骨損傷がｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理によって用量依存的に抑制されることを示す結果である。 図４２ｆは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルｆｅｍｕｒのｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析し、総骨塩密度（ＢＭＤ）、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を示したものである。 図４２ｇは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの軟骨損傷をｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅで確認した結果である。ｈＩｇＧ１－Ｆｃ処理群に比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理群の軟骨損傷が抑制されたことを示したものである。 図４２ｈは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ３日後にＬＰＳ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎした関節炎誘発マウスモデルにおいてｍＴＭ４ＳＦ１９－ＦｃとｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）のｓｅｍｉ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔをａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅで確認したものである。ｈＩｇＧ１－Ｆｃに比べてＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により、ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｃｏｒｅが低くなり、ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓが減少することを確認した結果である。 図４２ｉは、ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ３日後にＬＰＳ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎした関節炎誘発マウスモデルにおいて、ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｃｏｒｅがｍａｘｉｍｕｍである８日後、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃのｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔを確認したものである。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐに比べてＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理によりａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｃｏｒｅが低くなり、ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓが減少し、ｔｏｌｕｄｉｎｅ ｂｌｕｅで軟骨損傷が抑制されたことで治療効果を確認した結果である。 図４３ａは、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた乳がんの骨転移抑制効果を確認するための実験スケジュールを模式化したものである。 図４３ｂは、生物発光映像分析を通じてがん進行（ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）状態を確認した結果を示す。 図４３ｃは、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節をｍｉｃｒｏ ＣＴスキャンした結果を示す。 図４３ｄは、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節に対してＨ＆Ｅ染色を通じて組織学的分析を行った結果を示したものである。 図４４ａは、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）を用いた乳がんの骨転移抑制効果を確認するための実験スケジュールを模式化したものである。 図４４ｂは、生物発光映像分析を通じてがん進行（ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）状態を確認した結果を示す。 図４４ｃは、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節についてｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ分析を行った結果を示したものである。 図４４ｄは、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節をｍｉｃｒｏ ＣＴスキャンした結果を示す。 図４５は、マウス由来Ｅ０７７１乳がん細胞を野生型マウスの尾静脈に注入して肺転移を誘発した後、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）及びｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１４５－１６９）により肺転移が顕著に抑制されることを確認した結果を示したものである。 図４６ａは、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により高脂肪食による肥満が抑制されることを示す。 図４６ｂは、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により高脂肪食による臓器内の白色脂肪の重量減少及び脂肪肝抑制効果をＯｒｇａｎ ｗｅｉｇｈｔとｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔに対してｏｒｇａｎ ｗｅｉｇｈｔで確認したものである。 図４７は、Ｈ＆Ｅ染色及びＭａｓｓｏｎ ＆ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を通じて確認したｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理による肝組織内の脂肪肝減少効果及び血漿中の中性脂肪の減少効果を示す。 図４８は、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）の処理により脂肪細胞分化が用量依存的に抑制されることをＯｉｌ－ｒｅｄ－Ｏ染色でｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔを染色して確認し、脂肪生成マーカーであるＣ／ＥＢＰαとＰＰＡＲ－γの遺伝子発現で確認した結果である 図４９は、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃで破骨細胞の分化により誘導されたがん細胞移動を抑制することをＣｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．０５％で染色して確認したものである。 図５０ａは、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯで破骨細胞の分化によるがん細胞移動抑制をＣｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．０５％で染色して確認したものである。 図５０ｂは、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δで破骨細胞の分化によるがん細胞移動抑制をＣｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．０５％で染色して確認したものである。 図５１は、３Ｆｌａｇ－ｈＴＭ４ＳＦ１９をＭＧ６３骨肉腫細胞株に安定的に過剰発現させた後、細胞の成長をＭＴＴ分析で確認し、コロニー形成と移動を確認した結果である。 図５２は、３Ｆｌａｇ－ｈＴＭ４ＳＦ１９をＨＯＳ骨肉腫細胞株に安定的に過剰発現させた後、細胞の成長をＭＴＴ分析で確認し、コロニー形成と移動を確認した結果である。 図５３は、１４３ｂ骨肉腫細胞株にＴＭ４ＳＦ１９をＣＲＩＳＰＲでノックアウトさせた後、それぞれ異なるｃｌｏｎｅ（＃４及び＃６）で細胞の成長をＭＴＴ分析で確認し、群集能力をコロニー形成で確認した結果である。 図５４ａは、１４３ｂ骨肉腫細胞にｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）を処理しながら細胞の成長をＭＴＴ分析で確認した結果である。 図５４ｂは、群集能力をコロニー形成で確認した結果である。 図５４ｃは、細胞の成長を細胞計数で確認した結果である。 図５４ｄは、細胞の移動を確認した結果である。 図５５は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）（１０μｇ／ｍｌ）処理によりＵ２ＯＳ、ＭＧ６３骨肉腫コロニーの形成が抑制されることを確認したものである。 図５６は、ＨＯＳ骨肉腫細胞の細胞移動能力が１０μｇ／ｍｌ ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）とｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１４５～１６９ａａ）処理によって抑制されることを確認したものである。 図５７ａは、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０～１６９ａａ）の膵臓がん細胞コロニー形成の抑制を確認したものである。 図５７ｂは、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０～１６９ａａ）の膵臓がん細胞成長抑制を細胞計数で確認したものである。 図５８ａは、本願の実施例に使用されたＴＭ４ＳＦ１９断片及びＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ融合タンパク質配列情報を示す［各図面において、当該ターゲット配列は、ボールド体で表示した部分であり、ＳＥＤ ＩＤ ＮＯｓ：８、１２、１５、１８と表示されており、酵素サイトは、ターゲット配列と免疫グロブリンＦＣ領域の間にある部位であり、免疫グロブリンＦｃ領域は、ハイライトで表示された部分で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と表示されている］。 図５８ｂは、図５８ａと同様に本願の実施例に使用されたＴＭ４ＳＦ１９断片及びＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ融合タンパク質配列情報を示している。 図５８ｃは、図５８ａと同様に本願の実施例に使用されたＴＭ４ＳＦ１９断片及びＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ融合タンパク質配列情報を示している 図５８ｄは、図５８ａと同様に本願の実施例に使用されたＴＭ４ＳＦ１９断片及びＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ融合タンパク質配列情報を示している

以下、本発明を詳細に説明する。

一方、本発明の実施形態は、様々な他の形態に変形されてもよく、本発明の範囲が以下に説明する実施形態に限定されるものではない。また、本発明の実施形態は、当該技術分野において平均的な知識を有する者に本発明をさらに完全に説明するために提供されるものである。さらに、明細書の全体においてある構成要素を「含む」とは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。

本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。

また、本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含む肥満または肥満媒介代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。

また、本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含むがん予防、治療またはがん転移抑制用薬学的組成物に関する。

本発明において、用語の「ＴＭ４ＳＦ１９」は、膜貫通４Ｌ ６ファミリーメンバー１９（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １９；ＴＭ４ＳＦ１９，ＯＣＴＭ４）であり、膜貫通４Ｌ ６スーパーファミリーに属する。これらのスーパーファミリーメンバーは、インテグリンとの相互作用を介して細胞増殖、運動性及び接着を含む様々な細胞プロセスに関与し、肝線維化、がんなどの疾患と関連があることが知られている。しかし、ＴＭ４ＳＦ１９については、その機能に関連してまともに研究されたことがない。

ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）またはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）だけでなく、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの他の哺乳動物でも同じタンパク質が発現されることがある。

ヒト由来のＴＭ４ＳＦ１９は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１３８４６１．４、ＮＭ＿００１２０４８９７．２、ＮＭ＿００１２０４８９８．２それぞれを含むｍＲＮＡからそれぞれＮＰ＿６１２４７０．２、ＮＰ＿００１１９１８２６．１、ＮＰ＿００１１９１８２７．１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に翻訳されてもよい。すなわち、ヒト由来のＴＭ４ＳＦ１９は、３つの転写バリアント（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ）； ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１３８４６１．４ （ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １）、ＮＭ＿００１２０４８９７．２（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２）、ＮＭ＿００１２０４８９８．２ （ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ３）があり、３種のアイソフォーム；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６１２４７０．２（ｉｓｏｆｏｒｍ １）、ＮＰ＿００１１９１８２６．１（ｉｓｏｆｏｒｍ ２）、ＮＰ＿００１１９１８２７．１（ｉｓｏｆｏｒｍ ３）がある。本発明の実施例で使用されたＴＭ４ＳＦ１９は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１３８４６１．４（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １）を含むｍＲＮＡから得られたＮＰ＿６１２４７０．２（ｉｓｏｆｏｒｍ １）である。ｉｓｏｆｏｒｍ １は、マウスＴＭ４ＳＦ１９と相同性が高い。

マウスＴＭ４ＳＦ１９は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５３８７４．１であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表される。

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６１２４７０．２（ｉｓｏｆｏｒｍ １）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］＞
ＭＶＳＳＰＣＴＱＡＳ ＳＲＴＣＳＲＩＬＧＬ ＳＬＧＴＡＡＬＦＡＡ ＧＡＮＶＡＬＬＬＰＮ ＷＤＶＴＹＬＬＲＧＬ ＬＧＲＨＡＭＬＧＴＧ ６０
ＬＷＧＧＧＬＭＶＬＴ ＡＡＩＬＩＳＬＭＧＷ ＲＹＧＣＦＳＫＳＧＬ ＣＲＳＶＬＴＡＬＬＳ ＧＧＬＡＬＬＧＡＬＩ ＣＦＶＴＳＧＶＡＬＫ １２０
ＤＧＰＦＣＭＦＤＶＳ ＳＦＮＱＴＱＡＷＫＹ ＧＹＰＦＫＤＬＨＳＲ ＮＹＬＹＤＲＳＬＷＮ ＳＶＣＬＥＰＳＡＡＶ ＶＷＨＶＳＬＦＳＡＬ １８０
ＬＣＩＳＬＬＱＬＬＬ ＶＶＶＨＶＩＮＳＬＬ ＧＬＦＣＳＬＣＥＫ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１９１８２６．１ （ｉｓｏｆｏｒｍ ２） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２］＞
ＭＶＳＳＰＣＴＱＡＳ ＳＲＴＣＳＲＩＬＧＬ ＳＬＧＴＡＡＬＦＡＡ ＧＡＮＶＡＬＬＬＰＮ ＷＤＶＴＹＬＬＲＧＬ ＬＧＲＨＡＭＬＧＴＧ ６０
ＬＷＧＧＧＬＭＶＬＴ ＡＡＩＬＩＳＬＭＧＷ ＲＹＧＣＦＳＫＳＧＬ ＣＲＳＶＬＴＡＬＬＳ ＧＧＬＡＬＬＧＡＬＩ ＣＦＶＴＳＧＶＡＬＫ １２０
ＤＧＰＦＣＭＦＤＶＳ ＳＦＮＱＴＱＡＷＫＹ ＧＹＰＦＫＤＬＨＲＩ ＩＣＭＴＶＲＳＧＴＰ ＳＡＷＳＰＬＱＬＬＳ ＧＴＣＰＳＳＰＰＦＣ １８０
ＡＳＡＣＳＳＦＳＷＷ ＳＦＭＳＳＴＡＳＷＡ ＦＳＡＡＳＡＲＳＤＲ ＱＮＬＨＬＱＡＷＶＦ ＳＳＳＡＶＬＮＰＦＹ ＫＥＷＶＲＩＩＮＫＬ ２４０
ＰＬ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１９１８２７．１（ｉｓｏｆｏｒｍ ３） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３］＞
ＭＶＳＳＰＣＴＱＡＳ ＳＲＴＣＳＲＩＬＧＬ ＳＬＧＴＡＡＬＦＡＡ ＧＡＮＶＡＬＬＬＰＮ ＷＤＶＴＹＬＬＲＧＬ ＬＧＲＨＡＭＬＧＴＧ ６０
ＬＷＧＧＧＬＭＶＬＴ ＡＬＬＳＧＧＬＡＬＬ ＧＡＬＩＣＦＶＴＳＧ ＶＡＬＫＤＧＰＦＣＭ ＦＤＶＳＳＦＮＱＴＱ ＡＷＫＹＧＹＰＦＫＤ １２０
ＬＨＳＲＮＹＬＹＤＲ ＳＬＷＮＳＶＣＬＥＰ ＳＡＡＶＶＷＨＶＳＬ ＦＳＡＬＬＣＩＳＬＬ ＱＬＬＬＶＶＶＨＶＩ ＮＳＬＬＧＬＦＣＳＬ １８０
ＣＥＫ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１３８４６１．４（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４］＞
１ ａａａｇａｇｔｃｃｔ ｇｇａａａｇａｃａａ ｃｃｔｔｃａｇｇｔｃ ｃａｇｃｃｃｔｇｇａ ｇｃｔｇｇａｇｇａｇ ｔｇｇａｇｃｃｃｃａ
６１ ｃｔｃｔｇａａｇａｃ ｇｃａｇｃｃｔｔｔｃ ｔｃｃａｇｇｔｔｃｔ ｇｔｃｔｃｔｃｃｃａ ｔｔｃｔｇａｔｔｃｔ ｔｇａｃａｃｃａｇａ
１２１ ｔｇｃａｇｇａｔｇｇ ｔｇｔｃｃｔｃｔｃｃ ｃｔｇｃａｃｇｃａｇ ｇｃａａｇｃｔｃａｃ ｇｇａｃｔｔｇｃｔｃ ｃｃｇｔａｔｃｃｔｇ
１８１ ｇｇａｃｔｇａｇｃｃ ｔｔｇｇｇａｃｔｇｃ ａｇｃｃｃｔｇｔｔｔ ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇ ｃｃａａｃｇｔｇｇｃ ａｃｔｃｃｔｃｃｔｔ
２４１ ｃｃｔａａｃｔｇｇｇ ａｔｇｔｃａｃｃｔａ ｃｃｔｇｔｔｇａｇｇ ｇｇｃｃｔｃｃｔｔｇ ｇｃａｇｇｃａｔｇｃ ｃａｔｇｃｔｇｇｇａ
３０１ ａｃｔｇｇｇｃｔｃｔ ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ ｃｃｔｃａｔｇｇｔａ ｃｔｃａｃｔｇｃａｇ ｃｔａｔｃｃｔｃａｔ ｃｔｃｃｔｔｇａｔｇ
３６１ ｇｇｃｔｇｇａｇａｔ ａｃｇｇｃｔｇｃｔｔ ｃａｇｔａａｇａｇｔ ｇｇｇｃｔｃｔｇｔｃ ｇａａｇｃｇｔｇｃｔ ｔａｃｔｇｃｔｃｔｇ
４２１ ｔｔｇｔｃａｇｇｔｇ ｇｃｃｔｇｇｃｔｔｔ ａｃｔｔｇｇａｇｃｃ ｃｔｇａｔｔｔｇｃｔ ｔｔｇｔｃａｃｔｔｃ ｔｇｇａｇｔｔｇｃｔ
４８１ ｃｔｇａａａｇａｔｇ ｇｔｃｃｔｔｔｔｔｇ ｃａｔｇｔｔｔｇａｔ ｇｔｔｔｃａｔｃｃｔ ｔｃａａｔｃａｇａｃ ａｃａａｇｃｔｔｇｇ
５４１ ａａａｔａｔｇｇｔｔ ａｃｃｃａｔｔｃａａ ａｇａｃｃｔｇｃａｔ ａｇｔａｇｇａａｔｔ ａｔｃｔｇｔａｔｇａ ｃｃｇｔｔｃｇｃｔｃ
６０１ ｔｇｇａａｃｔｃｃｇ ｔｃｔｇｃｃｔｇｇａ ｇｃｃｃｔｃｔｇｃａ ｇｃｔｇｔｔｇｔｃｔ ｇｇｃａｃｇｔｇｔｃ ｃｃｔｃｔｔｃｔｃｃ
６６１ ｇｃｃｃｔｔｃｔｇｔ ｇｃａｔｃａｇｃｃｔ ｇｃｔｃｃａｇｃｔｔ ｃｔｃｃｔｇｇｔｇｇ ｔｃｇｔｔｃａｔｇｔ ｃａｔｃａａｃａｇｃ
７２１ ｃｔｃｃｔｇｇｇｃｃ ｔｔｔｔｃｔｇｃａｇ ｃｃｔｃｔｇｃｇａｇ ａａｇｔｇａｃａｇｇ ｃａｇａａｃｃｔｔｃ ａｃｔｔｇｃａａｇｃ
７８１ ａｔｇｇｇｔｇｔｔｔ ｔｃａｔｃａｔｃｇｇ ｃｔｇｔｃｔｔｇａａ ｔｃｃｔｔｔｃｔａｃ ａａｇｇａｇｔｇｇｇ ｔａｃｇａａｔｔａｔ
８４１ ａａａｃａａａｃｔｔ ｃｃｃｃｔｔｔａｇｇ ｔａｔｃｃｃｔｇｇａ ｇｔａａｔａａｔｇａ ｃａａｃａａａａｔｔ ｃａｃｔｇｃａｇｇｔ
９０１ ｃｇｇｔｇｇａａｔｇ ａｔａｇａａｔｇｃａ ｔｔｔｔａａａｔｃａ ｃａｔｔｇｔａａａｃ ｔｔｃｃａｇｇｔｇａ ｔｃｃａｔｇｇａｔａ
９６１ ｇｇａｔａａａｔａａ ｃｔａａｇｔｔａｔｔ ａｔａａｔｔｇｔｔｔ ａｇｇａａｔｔｔａｔ ａｇｔｃｃａｔａａａ ａｔａｔｃｃｔｃｃａ
１０２１ ｇｃｃａｇｇ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００１２０４８９７．２（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ２） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５］＞
１ ａａａｇａｇｔｃｃｔ ｇｇａａａｇａｃａａ ｃｃｔｔｃａｇｇｔｃ ｃａｇｃｃｃｔｇｇａ ｇｃｔｇｇａｇｇａｇ ｔｇｇａｇｃｃｃｃａ
６１ ｃｔｃｔｇａａｇａｃ ｇｃａｇｃｃｔｔｔｃ ｔｃｃａｇｇｔｔｃｔ ｇｔｃｔｃｔｃｃｃａ ｔｔｃｔｇａｔｔｃｔ ｔｇａｃａｃｃａｇａ
１２１ ｔｇｃａｇｇａｔｇｇ ｔｇｔｃｃｔｃｔｃｃ ｃｔｇｃａｃｇｃａｇ ｇｃａａｇｃｔｃａｃ ｇｇａｃｔｔｇｃｔｃ ｃｃｇｔａｔｃｃｔｇ
１８１ ｇｇａｃｔｇａｇｃｃ ｔｔｇｇｇａｃｔｇｃ ａｇｃｃｃｔｇｔｔｔ ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇ ｃｃａａｃｇｔｇｇｃ ａｃｔｃｃｔｃｃｔｔ
２４１ ｃｃｔａａｃｔｇｇｇ ａｔｇｔｃａｃｃｔａ ｃｃｔｇｔｔｇａｇｇ ｇｇｃｃｔｃｃｔｔｇ ｇｃａｇｇｃａｔｇｃ ｃａｔｇｃｔｇｇｇａ
３０１ ａｃｔｇｇｇｃｔｃｔ ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ ｃｃｔｃａｔｇｇｔａ ｃｔｃａｃｔｇｃａｇ ｃｔａｔｃｃｔｃａｔ ｃｔｃｃｔｔｇａｔｇ
３６１ ｇｇｃｔｇｇａｇａｔ ａｃｇｇｃｔｇｃｔｔ ｃａｇｔａａｇａｇｔ ｇｇｇｃｔｃｔｇｔｃ ｇａａｇｃｇｔｇｃｔ ｔａｃｔｇｃｔｃｔｇ
４２１ ｔｔｇｔｃａｇｇｔｇ ｇｃｃｔｇｇｃｔｔｔ ａｃｔｔｇｇａｇｃｃ ｃｔｇａｔｔｔｇｃｔ ｔｔｇｔｃａｃｔｔｃ ｔｇｇａｇｔｔｇｃｔ
４８１ ｃｔｇａａａｇａｔｇ ｇｔｃｃｔｔｔｔｔｇ ｃａｔｇｔｔｔｇａｔ ｇｔｔｔｃａｔｃｃｔ ｔｃａａｔｃａｇａｃ ａｃａａｇｃｔｔｇｇ
５４１ ａａａｔａｔｇｇｔｔ ａｃｃｃａｔｔｃａａ ａｇａｃｃｔｇｃａｔ ａｇａａｔｔａｔｃｔ ｇｔａｔｇａｃｃｇｔ ｔｃｇｃｔｃｔｇｇａ
６０１ ａｃｔｃｃｇｔｃｔｇ ｃｃｔｇｇａｇｃｃｃ ｔｃｔｇｃａｇｃｔｇ ｔｔｇｔｃｔｇｇｃａ ｃｇｔｇｔｃｃｃｔｃ ｔｔｃｔｃｃｇｃｃｃ
６６１ ｔｔｃｔｇｔｇｃａｔ ｃａｇｃｃｔｇｃｔｃ ｃａｇｃｔｔｃｔｃｃ ｔｇｇｔｇｇｔｃｇｔ ｔｃａｔｇｔｃａｔｃ ａａｃａｇｃｃｔｃｃ
７２１ ｔｇｇｇｃｃｔｔｔｔ ｃｔｇｃａｇｃｃｔｃ ｔｇｃｇａｇａａｇｔ ｇａｃａｇｇｃａｇａ ａｃｃｔｔｃａｃｔｔ ｇｃａａｇｃａｔｇｇ
７８１ ｇｔｇｔｔｔｔｃａｔ ｃａｔｃｇｇｃｔｇｔ ｃｔｔｇａａｔｃｃｔ ｔｔｃｔａｃａａｇｇ ａｇｔｇｇｇｔａｃｇ ａａｔｔａｔａａａｃ
８４１ ａａａｃｔｔｃｃｃｃ ｔｔｔａｇｇｔａｔｃ ｃｃｔｇｇａｇｔａａ ｔａａｔｇａｃａａｃ ａａａａｔｔｃａｃｔ ｇｃａｇｇｔｃｇｇｔ
９０１ ｇｇａａｔｇａｔａｇ ａａｔｇｃａｔｔｔｔ ａａａｔｃａｃａｔｔ ｇｔａａａｃｔｔｃｃ ａｇｇｔｇａｔｃｃａ ｔｇｇａｔａｇｇａｔ
９６１ ａａａｔａａｃｔａａ ｇｔｔａｔｔａｔａａ ｔｔｇｔｔｔａｇｇａ ａｔｔｔａｔａｇｔｃ ｃａｔａａａａｔａｔ ｃｃｔｃｃａｇｃｃａ
１０２１ ｇｇ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００１２０４８９８．２（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ３） ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６］＞
１ ａａａｇａｇｔｃｃｔ ｇｇａａａｇａｃａａ ｃｃｔｔｃａｇｇｔｃ ｃａｇｃｃｃｔｇｇａ ｇｃｔｇｇａｇｇａｇ ｔｇｇａｇｃｃｃｃａ
６１ ｃｔｃｔｇａａｇａｃ ｇｃａｇｃｃｔｔｔｃ ｔｃｃａｇｇｔｔｃｔ ｇｔｃｔｃｔｃｃｃａ ｔｔｃｔｇａｔｔｃｔ ｔｇａｃａｃｃａｇａ
１２１ ｔｇｃａｇｇａｔｇｇ ｔｇｔｃｃｔｃｔｃｃ ｃｔｇｃａｃｇｃａｇ ｇｃａａｇｃｔｃａｃ ｇｇａｃｔｔｇｃｔｃ ｃｃｇｔａｔｃｃｔｇ
１８１ ｇｇａｃｔｇａｇｃｃ ｔｔｇｇｇａｃｔｇｃ ａｇｃｃｃｔｇｔｔｔ ｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇ ｃｃａａｃｇｔｇｇｃ ａｃｔｃｃｔｃｃｔｔ
２４１ ｃｃｔａａｃｔｇｇｇ ａｔｇｔｃａｃｃｔａ ｃｃｔｇｔｔｇａｇｇ ｇｇｃｃｔｃｃｔｔｇ ｇｃａｇｇｃａｔｇｃ ｃａｔｇｃｔｇｇｇａ
３０１ ａｃｔｇｇｇｃｔｃｔ ｇｇｇｇａｇｇａｇｇ ｃｃｔｃａｔｇｇｔｇ ｃｔｔａｃｔｇｃｔｃ ｔｇｔｔｇｔｃａｇｇ ｔｇｇｃｃｔｇｇｃｔ
３６１ ｔｔａｃｔｔｇｇａｇ ｃｃｃｔｇａｔｔｔｇ ｃｔｔｔｇｔｃａｃｔ ｔｃｔｇｇａｇｔｔｇ ｃｔｃｔｇａａａｇａ ｔｇｇｔｃｃｔｔｔｔ
４２１ ｔｇｃａｔｇｔｔｔｇ ａｔｇｔｔｔｃａｔｃ ｃｔｔｃａａｔｃａｇ ａｃａｃａａｇｃｔｔ ｇｇａａａｔａｔｇｇ ｔｔａｃｃｃａｔｔｃ
４８１ ａａａｇａｃｃｔｇｃ ａｔａｇｔａｇｇａａ ｔｔａｔｃｔｇｔａｔ ｇａｃｃｇｔｔｃｇｃ ｔｃｔｇｇａａｃｔｃ ｃｇｔｃｔｇｃｃｔｇ
５４１ ｇａｇｃｃｃｔｃｔｇ ｃａｇｃｔｇｔｔｇｔ ｃｔｇｇｃａｃｇｔｇ ｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔ ｃｃｇｃｃｃｔｔｃｔ ｇｔｇｃａｔｃａｇｃ
６０１ ｃｔｇｃｔｃｃａｇｃ ｔｔｃｔｃｃｔｇｇｔ ｇｇｔｃｇｔｔｃａｔ ｇｔｃａｔｃａａｃａ ｇｃｃｔｃｃｔｇｇｇ ｃｃｔｔｔｔｃｔｇｃ
６６１ ａｇｃｃｔｃｔｇｃｇ ａｇａａｇｔｇａｃａ ｇｇｃａｇａａｃｃｔ ｔｃａｃｔｔｇｃａａ ｇｃａｔｇｇｇｔｇｔ ｔｔｔｃａｔｃａｔｃ
７２１ ｇｇｃｔｇｔｃｔｔｇ ａａｔｃｃｔｔｔｃｔ ａｃａａｇｇａｇｔｇ ｇｇｔａｃｇａａｔｔ ａｔａａａｃａａａｃ ｔｔｃｃｃｃｔｔｔａ
７８１ ｇｇｔａｔｃｃｃｔｇ ｇａｇｔａａｔａａｔ ｇａｃａａｃａａａａ ｔｔｃａｃｔｇｃａｇ ｇｔｃｇｇｔｇｇａａ ｔｇａｔａｇａａｔｇ
８４１ ｃａｔｔｔｔａａａｔ ｃａｃａｔｔｇｔａａ ａｃｔｔｃｃａｇｇｔ ｇａｔｃｃａｔｇｇａ ｔａｇｇａｔａａａｔ ａａｃｔａａｇｔｔａ
９０１ ｔｔａｔａａｔｔｇｔ ｔｔａｇｇａａｔｔｔ ａｔａｇｔｃｃａｔａ ａａａｔａｔｃｃｔｃ ｃａｇｃｃａｇｇ

＜ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５３８７４．１［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７］＞
ＭＬＳＦＳＲＶＶＮＣ ＳＲＴＣＳＲＦＬＧＬ ＳＬＧＴＡＳＬＣＡＡ ＧＡＮＩＡＬＬＦＰＮ ＷＤＶＴＹＬＭＲＧＬ ＩＧＫＨＡＭＬＧＳＧ
ＬＷＧＧＧＬＭＶＬＬ ＡＡＴＬＩＳＭＴＧＳ ＦＳＫＳＡＰＣＬＱＶ ＬＩＡＬＬＳＳＧＬＡ ＬＬＧＡＶＩＣＦＶＴ ＳＧＶＡＬＫＤＧＰＦ
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ＬＬＱＬＬＬＶＡＩＨ ＬＶＮＳＩＬＧＬＦＣ ＳＦＣＥＫＨ

本発明のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤は、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現またはＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の活性を減少させる物質を意味するものである。具体的な形態において、本発明のＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現を抑制する抑制剤は、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子に直接作用するか、またはＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の上位調節子に間接的に作用してＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現を転写レベルで減少させるか、または発現されたＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の分解を増加させるか、またはその活性を妨害することにより、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子の発現レベルまたはその活性を減少させる物質を意味する。具体的には、ＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、及びリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、これに制限されるものではない。

本発明において、用語のアンチセンスヌクレオチドは、特定の遺伝子に相補的であり、ＴＭ４ＳＦ１９ ｍＲＮＡに結合できるＤＮＡ、ＲＮＡ配列を意味する。アンチセンスヌクレオチドは、モノマー単位の長鎖であるため、それらはターゲット遺伝子配列に対して容易に合成されてもよい。

本発明において用語の「ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」とは、特定のｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を介してＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導できる短い二本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、それと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、遺伝子ノックダウン法や遺伝子治療法などに使用される。

本発明において、用語の「ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）」は、一本鎖ＲＮＡとして水素結合により二本鎖部分を形成するステム（ｓｔｅｍ）部分と環状のループ（ｌｏｏｐ）部分に区分され、Ｄｉｃｅｒなどのタンパク質によってプロセシングされてｓｉＲＮＡに変換され、ｓｉＲＮＡと同じ機能を果たすことができる。

本発明において用語の「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」とは、ターゲットＲＮＡの分解を促進させるか、またはそれらの翻訳を抑制させることにより、遺伝子発現を転写後に調節する２１～２３個のノンコーディングＲＮＡをいう。

本発明において、用語の「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」とは、特定の塩基配列を認識して自体的にそれを切断する酵素などの機能を有するＲＮＡ分子を意味する。リボザイムは、ターゲットメッセンジャーＲＮＡ鎖の相補的な塩基配列で、特異性をもって結合する領域とターゲットＲＮＡを切断する領域から構成される。

また、具体的な形態において本発明のＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の活性を抑制する抑制剤は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、融合タンパク質及び抗体からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよく、これに制限されるものではない。

本発明において、用語の「化合物」は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に特異的に結合してその活性を抑制できる任意の化合物をすべて含む。

本発明において、用語の「ペプチド」とは、標的物質に対する結合力が高いという長所を有し、熱／化学処理時には変性を起こさない。また、分子サイズが小さいため、他のタンパク質に付着して融合タンパク質への利用が可能である。具体的には、高分子タンパク質チェーンに付着して利用できるため、診断キット及び薬物伝達物質として利用できる。

本発明において用語の「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の結合ドメインを抑制してＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の活性を抑制するものである。ペプチド模倣体は、ペプチドまたは非ペプチドであってもよく、ｐｓｉ結合などの非ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から構成されてもよい。また、「構造的に強制された（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）」ペプチド、サイクリック模倣体（ｃｙｃｌｉｃ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、少なくとも１つのエキソサイクリックドメイン（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、結合部分（結合アミノ酸）及び活性部位を含むサイクリック模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の二次構造特性と同様に構造化され、抗体または水溶性受容体などの巨大な分子抑制特性を模倣することができ、天然のアンタゴニストと同等の効果として作用できる新規な小分子であってもよい。

本発明において、用語の「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」とは、それ自体が安定した三次構造を有し、また、標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）を意味する。

本発明において、用語の「融合タンパク質」は、互いに異なる２つ以上のタンパク質または同種のタンパク質が結合した形態で作られた新しいタンパク質で、キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）タンパク質ともよく呼ばれる。２つ以上の異種タンパク質が一部と一部、一部と全体、または全体と全体が結合する。多くの場合、必要に応じて一つの遺伝子の配列と他の遺伝子の配列をコドンを合わせて接合してハイブリッド遺伝子を作ってタンパク質として発現させて生産する。

一具現例として、本発明による融合タンパク質は、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に特異的に結合するＴＭ４ＳＦ１９の断片を含んでもよい。

前記断片の他に免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含んでもよい。

前記断片は、ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２、ＥＣ２）由来の断片の全体または一部であってもよい。前記ＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部位は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１２０～１６９番目のアミノ酸部位またはマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１１６～１６５番目のアミノ酸部位であってもよい。前記ＥＣ２の一部に該当するアミノ酸配列部位は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１４５～１６９番目または１３１～１６９番目のアミノ酸部位を含んでもよい。

本発明による好ましい融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。

一具現例として、本発明は、ＴＭ４ＳＦ１９の断片に免疫グロブリンＦｃ領域が結合した融合タンパク質、例えば、ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ）の全体または一部に免疫グロブリンＦｃ領域が結合した融合タンパク質、またはＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループの全体または一部と膜タンパク質の全体または一部に免疫グロブリンＦｃ領域が結合した融合タンパク質を含んでもよい。ここで、ＴＭ４ＳＦ１９の断片に免疫グロブリンＦｃ領域が結合した融合タンパク質は、ＴＭ４ＳＦ１９の断片に免疫グロブリンＦｃ領域が直接的に結合したもの以外に、ＴＭ４ＳＦ１９の断片に免疫グロブリンＦｃ領域が間接的に結合したものを含む。ＴＭ４ＳＦ１９の断片に免疫グロブリンＦｃ領域が間接的に結合する場合、リンカー、スペーサーまたは酵素サイトに該当する１～１０個、例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、例えば、１個のアミノ酸配列が、ＴＭ４ＳＦ１９の断片と免疫グロブリンＦｃ領域の間にさらに存在してもよい。

本発明で使用可能なＴＭ４ＳＦ１９の断片は、これに制限されるものではないが、様々な例（ｈＴｍ４ｓｆ１９ ９４～１９６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１９６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～２０９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１９６及びｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１９６）を含む。一方、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の安定性のために免疫グロブリンＦｃ領域が例示的に使用されたが、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質と結合できる融合パートナーが免疫グロブリンＦｃ領域に限定されるものではない。

これに制限されるものではないが、本発明は、さらにＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２）由来の断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制用融合タンパク質に関する。

前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ，ＥＣ２）由来の断片は、ＥＣ２の全体または一部に該当するアミノ酸配列部位であってもよい。

前記ＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部位は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１２０～１６９番目のアミノ酸部位またはマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１１６～１６５番目のアミノ酸部位であってもよい。

前記ＥＣ２の一部に該当するアミノ酸配列部位は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１４５～１６９番目のアミノ酸部位を含んでもよい。

前記ＥＣ２の一部に該当するアミノ酸配列部位は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１３１～１６９番目のアミノ酸部位を含んでもよい。

本発明による好ましい融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。

前記ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２、ＥＣ２）由来の断片と免疫グロブリンＦｃ領域の間に酵素サイトを含んでもよい。

融合タンパク質の作製のためにＴＭ４ＳＦ１９の断片として使用されたヒトＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２の部位は例示的なものであり、これに制限されるものではない。

本発明において、用語の「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）は含まないタンパク質をいう。それは重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含んでもよい。これに制限されるものではないが、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来のＦｃ領域であってもよい。以下の実施例において、融合タンパク質を作製するために使用されたヒトＩｇＧ１－Ｆｃは、例示的なものであり、これに制限されるものではない。

また、前記「Ｆｃ領域」は、「変形した免疫グロブリンのＦｃ領域」または「Ｆｃ領域変異体」を含んでもよく、これはＦｃ領域のうち一部のアミノ酸が置換されるか、または互いに異なる種類のＦｃ領域を組み合わせて製造されたことを意味する。好ましくは、Ｆｃ受容体との結合力及び／又は補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）との結合力が変形され、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が野生型のＦｃ領域に比べて弱化したＦｃ領域を意味する。このとき、変形した免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＧ４及びこれらの配列の組み合わせからなる群から選ばれてもよい。

本発明において、用語の「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味する。「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を含み、新規抗体の他に、すでに当該技術分野で公知または市販の抗体も含まれる。前記抗体は、ＴＭ４ＳＦ１９に特異的に結合する限り、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む全長の形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。前記抗体分子の機能的な断片は、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、ここには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

ヒトＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２）の全体または一部に特異的な抗ＴＭ４ＳＦ１９抗体に関する。具体的な形態として、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６１２４７０．２のヒトＴＭ４ＳＦ１９の配列番号１１５～１７５の細胞外ループ２領域の全体または一部に特異的な抗ＴＭ４ＳＦ１９抗体に関する。他の具体形態において、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．１３８４６１．４のヒトＴＭ４ＳＦ１９の配列番号１２０～１６９の細胞外ループ２領域の全体または一部に特異的な抗ＴＭ４ＳＦ１９抗体に関する。抗体の作製のために使用されたヒトＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２のターゲット部位は、例示的なものであり、これに制限されるものではない。

本発明の実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質は、セルフバインディング（ｓｅｌｆ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を通じて細胞間相互作用に関与することが明らかになった。

特に、本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ領域をターゲットとし、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質のセルフバインディングを抑制できるＴＭ４ＳＦ１９タンパク質に対する抗体、及びＴＭ４ＳＦ１９の断片（例えば、細胞外ループ領域、細胞外ループ領域及び膜タンパク質）とＦｃを融合した融合タンパク質を作製し、ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質活性抑制剤の効能を評価した。

本発明において用語の「骨疾患」は、代謝性骨疾患、整形外科骨疾患、無形性骨疾患、退行性骨疾患、退行性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬性脊椎炎、老化性骨減少症（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）、骨粗鬆症、骨形成不全、骨軟化症、骨量減少症、骨折、骨欠損及び股関節減少症、くる病、パジェット骨疾患、歯周疾患、がん細胞の骨転移によって引き起こされる骨損傷からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。

本発明において用語の「肥満」とは、異常または過剰な脂肪蓄積がある状態を意味する。

本発明において用語の「肥満媒介代謝性疾患」とは、糖尿病、高血圧、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎及び特定のがんを含み、より広くは、高血圧、糖尿病、インスリン耐性症候群、代謝症候群、肥満関連胃食道逆流性疾患、動脈硬化症、高脂血症、過中性脂肪血症、過コレステロール血症、脂肪異栄養症、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管疾患、多嚢胞性卵巣症候群などを含む。本発明の組成物を用いる場合、前記疾患の治療も同時に行うことができる。また、このような肥満関連疾患の治療対象には、体重を減らすことを望む対象も含まれる。

本発明において用語の「がん（ｃａｎｃｅｒ）」とは、細胞が正常な成長限界を無視し、分裂及び成長する攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）特性、周囲組織に浸透する浸透的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）特性及び体内の他の部位に広がる転移的（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）特性を有する細胞による疾患を総称する意味である。

本発明で使用されるがんの種類に制限はないが、大腸がん、胃がん、結腸がん、乳がん、肺がん、非小細胞性肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部がん、黒色腫、子宮がん、卵巣がん、小腸がん、直腸がん、肛門付近がん、卵管がん腫、子宮内膜がん腫、子宮頸がん腫、膣がん腫、陰門がん腫、食道がん、リンパ腺がん、膀胱がん、胆嚢がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎細胞がん種、腎骨盤がん種、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ、 ＣＮＳ）腫瘍、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、及び脳下垂体腺腫からなる群から選ばれる少なくとも１つであってもよい。

本発明では、「がん」だけでなく、「がん転移」の抑制に関連したＴＭ４ＳＦ１９の用途も含む。

一方、本発明において用語の「予防」とは、本発明の組成物を投与して所望の症状または疾患が発生しないようにするか、またはその発生または発現を遅らせるすべての行為を意味する。

本発明において用語の「治療」とは、本発明の組成物を投与して所望の症状または疾患を好転させるか、または消失させるすべての行為を意味する。

一方、本発明の前記組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよく、担体とともに製剤化されてもよい。

本発明において用語の「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したもので、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使用してもよく、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化してもよい。

本発明のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、それを有効成分として含むいかなる剤形にも適用可能であり、経口用または非経口用剤形として製造してもよく、投与の容易性と投与量の均一化のために単位投与形態で剤形化してもよい。本発明の薬学的剤形は、口腔（ｏｒａｌ）、直腸（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔（ｎａｓａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ；頬及び舌の下を含む）、皮下、膣（ｖａｇｉｎａｌ）または非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ、筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適当な形態又は吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与に適当な形態を含む。本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ｌｏｚｅｎｇｅ、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤として製剤化してもよい。

本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を通じて吸入が可能なエアロゾル剤などのスプレー用として製剤化してもよい。注射用剤形として製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤とともに水で混合して溶液または懸濁液に製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与用として製剤化してもよい。

本発明の組成物は、薬剤学的に有効な量、すなわち、治療学的に有効な量で投与する。本発明において「治療学的に有効な量」とは、疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野で公知の要素に応じて決定されてもよい。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。すなわち、本発明の組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。

本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様である。１日投与量としては、非経口投与時に１日に体重１ｋｇ当たり、好ましくは、０．０１μｇ～１００ｍｇ、より好ましくは、１μｇ～５０ｍｇである。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することがあるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。

他の態様として、本発明は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性を抑制する物質を含む骨疾患の予防または治療用組成物を対象体に投与する段階を含む骨疾患を予防または治療する方法に関する。

他の態様として、本発明は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含む肥満または肥満媒介代謝性疾患の予防または治療用組成物を対象体に投与する段階を含む肥満または肥満媒介代謝性疾患を予防または治療する方法に関する。

他の態様として、本発明は、治療学的に有効な量のＴＭ４ＳＦ１９発現または活性抑制剤を有効成分として含むがん予防、治療またはがん転移抑制用組成物を対象体に投与する段階を含む、がん予防、治療またはがん転移を予防または治療する方法に関する。

本発明において用語の「投与」とは、何らかの適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味し、本発明による予防または治療用組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を通じて経口または非経口投与されてもよい。また、本発明による軟骨関連疾患の予防または治療用組成物は、有効成分が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてもよい。

本発明の用語の「対象体」は、本発明による薬学的組成物の投与によって症状が好転できる関連疾患を有するマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌなどの哺乳動物またはヒトを含む。

本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路を通じて投与されてもよく、具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内、吸入、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式により投与されてもよい。

本発明の予防または治療方法は、本発明の組成物を治療的有効量で投与することを含む。前記治療的有効量は、体重減少または脂肪細胞のサイズの減少効果を増進させる量を意味する。適切な１日の総使用量は、正しい医学的判断範囲内で治療医によって決定できることは当業者には自明である。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が使用されるかどうかをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、及び様々な因子と医薬分野で公知の類似因子によって異なる適用が好ましい。したがって、本発明の目的に適した薬学的組成物の有効量は、前述した事項を考慮して決定することが好ましい。また、場合によっては、本発明の組成物とともに公知の関連疾患治療剤を併用投与して治療効果を増大させることができる。

他の態様として、本発明は、骨疾患疑い検体に骨疾患治療用候補物質を処理する段階、及び
対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、骨疾患治療薬物のスクリーニング方法に関する。

他の態様として、本発明は、肥満または肥満媒介代謝性疾患疑い検体に肥満または肥満媒介代謝性疾患治療用候補物質を処理する段階、及び
対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、肥満または肥満媒介代謝性疾患治療薬物のスクリーニング方法に関する。

他の態様として、本発明は、がん予防、治療またはがん転移疑い検体にがん予防、治療またはがん転移抑制用候補物質を処理する段階、及び
対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較する段階を含む、がんまたはがん転移治療薬物のスクリーニング方法に関する。

本発明において用語の「検体」とは、関連疾患治療用候補物質をスクリーニングするために使用される個体または試料を意味し、これはイヌ、ウシ、ブタ、ウサギ、ニワトリ、マウス、ヒトを含む哺乳動物を制限なく含み、前記個体から分離された全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、細胞、組織などの試料などを含む。

本発明において、用語の「対照群」とは、候補物質を処理していない検体を意味する。また、本発明で使用される用語の「候補物質」とは、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性変化をテストする薬剤を意味し、ＴＭ４ＳＦ１９発現レベルまたは活性を直接または間接的に変化させることにより、関連疾患を予防または治療できる能力を測定する対象としては、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小型有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド及び広範囲な化合物など任意の分子を含む。そのような候補物質は、天然物質だけでなく合成物質をすべて含む。

本発明において用語の「治療薬物」とは、関連疾患を予防または治療する物質を意味する。

本発明のスクリーニング方法は、関連疾患疑い個体に治療用候補物質を処理した後、候補物質を処理していない対照群とＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを比較し、対照群に比べてＴＭ４ＳＦ１９遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少させる物質を関連疾患治療剤と判断して行ってもよい。ｍＲＮＡレベルを測定するための分析方法としては、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、ＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されるものではない。

タンパク質レベルを測定するための分析方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これに制限されるものではない。

また、本発明の一実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９発現が破骨細胞の分化過程で増加することを確認した。ＴＭ４ＳＦ１９欠乏モデル（ＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ及びＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ２（１１６～１６５）ノックアウトマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２△）の場合、破骨細胞の分化過程で単核破骨細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）を形成させる反面、多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の形成は抑制することを確認した。多核破骨細胞に分化できなかった破骨細胞は、破骨細胞としての表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、そのまま有しており、低レベルの骨吸収活性を維持する。すなわち、多核破骨細胞の形成を選択的に抑制できる本発明のＴＭ４ＳＦ１９抑制剤は、骨吸収機能を完全に消滅させるのではなく、骨吸収をより選択的に調節できるので、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの単核破骨細胞の形成段階から抑制する治療剤に比べて副作用を著しく低下させる。また、ＴＭ４ＳＦ１９欠乏モデルは、卵巣切除術による骨損失を予防することを確認した。さらに、抗マウスＴＭ４ＳＦ１９ポリクローナル抗体及びマウスＴＭ４ＳＦ１９ ＥＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５３８７４．１の１１６－１６５）－Ｆｃ融合タンパク質、ヒトＴＭ４ＳＦ１９ ＥＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿６１２４７０．２（ｉｓｏｆｏｒｍ １）の１２０－１６９）－Ｆｃ融合タンパク質を破骨細胞の分化過程に処理した結果、このような阻害剤が破骨細胞の分化過程で単核破骨細胞は形成させる反面、多核破骨細胞の形成は抑制することを確認した。したがって、ＴＭ４ＳＦ１９発現を阻害する物質またはＴＭ４ＳＦ１９の活性を阻害する物質は、骨疾患の予防または治療に効果的であることが分かる。

また、本発明の一実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９発現は、ｈＡＤＭＳＣ（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞）の脂肪細胞分化過程で増加した。ＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスでは、高脂肪食誘導肥満モデルにおいて体重増加が抑制されたことを確認し、肥満により生じる脂肪組織関連マクロファージ量が減少し、ＴＭ４ＳＦ１９は、脂肪細胞分化とマクロファージを含む炎症反応に作用することを確認した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスでは、高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいてインスリン抵抗性を低下させ、脂肪肝を抑制することを確認した。したがって、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性を抑制する物質は、肥満、肥満媒介代謝性疾患の予防または治療に効果的であることが分かる。

また、本発明の一実施例によれば、ＴＭ４ＳＦ１９過発現は、マウス由来乳がん及びヒト骨肉腫細胞増殖、移動及びコロニー形成を増加させ、ＴＭ４ＳＦ１９欠乏は、乳がん細胞の肺転移を抑制し、骨肉腫細胞増殖、移動及びコロニー形成を抑制し、乳がん細胞の骨転移抑制効果を確認したので、ＴＭ４ＳＦ１９発現または活性を阻害する物質ががん、がん転移の予防及び治療に効果的であることが分かる。

また、本発明の一実施例によれば、ヒトＴＭ４ＳＦ１９ ＥＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６１２４７０．２（ｉｓｏｆｏｒｍ １）の１２０－１６９）－Ｆｃ融合タンパク質処理により膵臓がん細胞の成長、群集能力が抑制され、骨肉腫細胞増殖、移動、コロニー形成抑制効果を確認した。したがって、ＴＭ４ＳＦ１９発現を阻害する物質またはＴＭ４ＳＦ１９の活性を阻害する物質ががん、がん転移の予防及び治療に効果的であることが分かる。

本発明の利点及び特徴、ならびにそれらを達成する方法は、詳細に後述する実験例及び製造例を参照すれば、明確になるだろう。しかし、本発明は、以下に開示される実験例及び製造例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態で具現され、単に本発明の開示が完全になるようにし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に
発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。

［実施例］
実施例１：破骨細胞の形成（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）におけるＴＭ４ＳＦ１９の役割
図１は、マウス骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Β ｌｉｇａｎｄ）を処理して破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ、ＯＣ）への分化を誘導した後、分化誘導時間によるＴＭ４ＳＦ１９のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲで確認した結果である。図１に示すように、ＴＭ４ＳＦ１９発現が破骨細胞の分化の進行によって増加したことを確認した。破骨細胞の分化関連遺伝子であるＡＣＰ５ ＣＴＳＫ発現も破骨細胞の分化の進行によって増加した。

実施例２：ＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスを用いたＴＭ４ＳＦ１９の役割の確認
（１）ＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトと多核化した破骨細胞形成抑制の確認
ＣＲＩＳＰＲを用いたＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスであるＴＭ４ＳＦ１９ＫＯと野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦ ２５ｎｇ／ｍｌ＋ＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌを処理して分化させた後、破骨細胞関連マーカーであるＴＲＡＰ染色（Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。

図２ａに示すように、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス骨髄細胞を破骨細胞に分化誘導するとき、単核破骨細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）には分化するが、多核破骨細胞（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）には分化が進行しなかった。

同じ方法でＣＲＩＳＰＲを用いたＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスであるＴＭ４ＳＦ１９ＫＯと野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、ＲＡＮＫＬの濃度を１００ｎｇ／ｍｌに固定し、Ｍ－ＣＳＦの濃度を２５、４０、６０ｎｇ／ｍｌに異にした条件で分化させた後、破骨細胞関連マーカーであるＴＲＡＰ染色（Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。

図２ｂに示すように、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス骨髄細胞を破骨細胞に分化誘導したとき、高濃度のＭ－ＣＳＦ処理によっても多核細胞形成の障害は、回復しないことが確認された。

図２ｃは、破骨細胞の分化過程を示す模式図である。図２ｃに示すように、破骨細胞前駆体が先にＴＲＡＰ陽性単核破骨細胞に分化した後、細胞－細胞間融合と不完全な細胞質分裂（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）を通じて巨大な多核細胞に成熟する。成熟した、多核化した多核破骨細胞は、骨吸収の活性が高いのに対し、多核破骨細胞に分化されなかった破骨細胞は、破骨細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）はそのまま有し、ＴＲＡＰ及びカデプシンＫなどの破骨細胞関連マーカーを発現するが、低レベルの骨吸収活性を維持することが報告されている。

したがって、ＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトが破骨細胞の分化過程で多核破骨細胞への分化及び成熟を防ぐという点は、ＴＭ４ＳＦ１９の阻害を通じて骨損失関連疾患の予防または治療を試みることができることを示唆する。特に、ＴＭ４ＳＦ１９抑制剤は、多核破骨細胞の形成を選択的に抑制することができ、これは破骨細胞の骨吸収機能を完全に消滅させるのではなく、骨吸収をより選択的に調節することができ、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの単核破骨細胞の形成段階から抑制する治療剤に比べて副作用を著しく低下させることができる。

（２）ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスにおける破骨細胞の分化に関与する遺伝子の発現抑制の確認
ＣＲＩＳＰＲを用いたＴＭ４ＳＦ１９ノックアウトマウスであるＴＭ４ＳＦ１９ＫＯと野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを処理するか、または処理していない条件で分化させてから４日後、破骨細胞の分化に関与する遺伝子であるＣｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、及びＮｆａｔｃ１の発現をｑＰＣＲを通じて確認した。

図３は、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを処理するか、または処理しない条件で分化した細胞におけるＣｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、及びＮｆａｔｃ１のｍＲＮＡ発現をグラフで表したものである。

図３に示すように、破骨細胞の分化に関与する遺伝子の発現が、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス由来骨髄細胞の破骨細胞への分化時、対照群（ＷＴ）に比べて有意に抑制された。

（３）アクチンベルトの形成及び骨吸収抑制の確認
野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス骨髄を分化させた後、多核破骨細胞の分化時に形成されるアクチンベルト形成の有無をＦ－アクチン染色で確認した。野生型（ＷＴ）は正常なアクチンベルトを形成した反面、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯは、アクチンベルトを形成しなかった（図４ａ）。

Ｄｅｎｔｉｎ ｄｉｓｃの上にＢＭＭ細胞をプレーティングして分化させた後、ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを確認した。野生型（ＷＴ）では、骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が確認されたが、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯでは、骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）がｂｌｏｃｋされたことを確認した（図４ｂ）。

（４）ＯＶＸによる骨損失抑制の確認
８週齢の野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ雌マウスにｏｖａｒｙを切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行ってから３１日目にｆｅｍｕｒを固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析した。

さらに、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析し、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を得た。

ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスにおいて卵巣切除術による骨損失が抑制されることを確認した（図５）。

卵巣切除術に関係なく、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの骨密度は、野生型（ＷＴ）マウスに比べて高い。

（５）大腿骨ＴＲＡＰ染色による破骨細胞形成の確認
８週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの大腿骨を固定し、石灰質を除去（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、ＴＲＡＰ染色を行った。

その結果、図６に示すように、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの大腿骨のＴＲＡＰ染色により多核破骨細胞形成の欠乏が確認された。

実施例３－１：ＴＭ４ＳＦ１９細胞外ループ２（ＥＣ２）欠乏マウスの多核破骨細胞形成の損傷の確認
（１）多核破骨細胞形成の損傷の確認
野生型（ＷＴ）マウスとＣＲＩＳＰＲでＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ２（１１６～１６５）をノックアウトさせたＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２ Ｄｅｌ（ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δとも表示）のマウス骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦ ２５ｎｇ／ｍｌとＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌを処理するか、または処理せずに分化させた後、ＴＲＡＰ染色を行った。

その結果、図７ａに示すように、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨髄を破骨細胞に分化するとき、単核破骨細胞には分化するが、多核破骨細胞には分化しないことを確認した。

図７ｂは、野生型（ＷＴ）マウスとＣＲＩＳＰＲでＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ２（１１６～１６５）をノックアウトさせたＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δのマウス骨髄から細胞を抽出し、ＲＡＮＫＬの濃度を１００ｎｇ／ｍｌに固定し、Ｍ－ＣＳＦの濃度を２５ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌで処理して分化させた後、ＴＲＡＰ染色した結果である。ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨髄を破骨細胞に分化したとき、高濃度のＭ－ＣＳＦ処理によっても多核破骨細胞形成の損傷は回復しなかった。

実施例３－２：ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δによる細胞骨格再配列の影響
（１）アクチンベルト形成及び骨吸収抑制の確認
破骨細胞の分化過程中に多核破骨細胞（成熟破骨細胞）が形成されると、ポドソーム（ｐｏｄｏｓｏｍｅ）からなるアクチンベルト（ａｃｔｉｎ ｂｅｌｔ）が形成され、ポドソームが骨に付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）されて骨再吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が行われる。

野生型マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨髄から細胞を抽出し、ＭＣＳＦ ６０ｎｇ／ｍｌ、ＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌで分化させた後に細胞を固定し、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ ＦＩＴＣ染色して共焦点顕微鏡（４００ｘ）でＦ－アクチンベルト形成の有無を確認した。

ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δが多核波骨細胞の形成を阻害し、インテグリンシグナル関連細胞骨格の再配列（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）に影響を与えることを確認した。図７ｃに示すように、野生型の場合、多核破骨細胞の分化によりアクチンベルトが形成されるが、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δでは形成されないことを確認した。

Ｄｅｎｔｉｎ ｄｉｓｃの上にＢＭＭ細胞をプレーティングして分化させた後、ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを１％ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色で確認した。その結果、野生型（ＷＴ）ではｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎが確認されるが、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δでは、ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎがｂｌｏｃｋされたことを確認した（図７ｄ）。

（２）破骨細胞関与遺伝子発現抑制の確認
野生型（ＷＴ）マウスとＣＲＩＳＰＲでＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ２（１１６～１６５）をノックアウトさせたＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δのマウスに対して破骨細胞の分化に関連したターゲット遺伝子（Ｃｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、Ｎｆａｔｃ１）の発現を確認するためにｑＰＣＲを行った。

図８に示すように、破骨細胞の分化に関与する遺伝子（Ｃｔｓｋ、Ａｃｐ５、ｃ－Ｆｏｓ、Ｎｆａｔｃ１）の発現が、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの破骨細胞の分化時、対照群に比べて有意に抑制された。

（３）骨損失抑制の確認
８週齢の野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δ雌マウスにｏｖａｒｙを切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行ってから３１日目にｆｅｍｕｒを固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析した。

さらに、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析し、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を得た。

ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスにおいて卵巣切除術による骨損失が抑制されることを確認した（図９）。

８週齢の野生型（ＷＴ）マウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウス（いずれも雌）から卵巣を切離せずに開放するか（ｓｈａｍ）、卵巣切除術（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ，ＯＶＸ）を行ってから３１日後に大腿部を固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴ（μＣＴ）分析を行った。

図１０は、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元画像分析プログラムで分析して得られた骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）、骨小柱の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を示したものである。

図１１は、ｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを示す。

その結果、図１０及び図１１に示すように、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスが卵巣切除術によって誘導される骨損失を抑制することを確認し、卵巣切除術（ＯＶＸ）を行っていないｓｈａｍ群においてもＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの骨密度が野生型（ＷＴ）に比べて高いことを確認した。

実施例４：ＴＭ４ＳＦ１９のｓｅｌｆ－ｂｉｎｄｉｎｇ及びインテグリンとの相互結合の確認
（１）ＴＭ４ＳＦ１９－ＴＭ４ＳＦ１９間のｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの確認
ＴＭ４ＳＦ１９が細胞相互間の結合（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）に関与するかどうかを確認するために、ＨＡとｆｌａｇをそれぞれタギングしたＴＭ４ＳＦ１９を作製した。２９３Ｔ細胞にＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３ＨＡをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９とＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３Ｆｌａｇをタギングした野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）とＴＭ４ＳＦ１９ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔをｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを行い、ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎで結合するかどうかを確認した。ＴＭ４ＳＦ１９ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔは、図１２ａに示すように作製した。図１２ａに示したＴＭ４ＳＦ１９の一部配列を欠失させたｈＴｍ４ｓｆ１９変異体（ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１１５－１７５}Δ、ｈＴｍ４ｓｆ_{１０５－１８６}Δ、ｈＴｍ４ｓｆ１９_{１０５－１９６}Δ、ｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１８６}Δ及びｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６}Δ）についても３Ｆｌａｇをそれぞれタギングした後、細胞相互間の結合をｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎで分析した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９がｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに関与し、自己と結合することを確認した（図１２ｂ）。しかし、ＴＭ４ＳＦ１９のｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ３（ＴＭ３）とｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ２（ＥＣ２）とｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４（ＴＭ４）を欠失させたｍｕｔａｎｔ（ｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６}Δ）は、ｓｅｌｆ ｂｉｎｄｉｎｇをしないことを確認した。これらの結果から、ＴＭ４ＳＦ１９のｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ３－ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ２－ｔｒａｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｒｅｇｉｏｎがＴＭ４ＳＦ１９ ｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに重要であり、ＴＭ４ＳＦ１９の９４～１９６番の位置が特にＴＭ４ＳＦ１９－ＴＭ４ＳＦ１９間のｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに重要な領域であることを確認した。

（２）ＴＭ４ＳＦ１９－ＴＭ４ＳＦ１９間のｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに関与する領域の確認
ＴＭ４ＳＦ１９の９４～１９６番位置がＴＭ４ＳＦ１９－ＴＭ４ＳＦ１９間のｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに重要な領域であることを検証するために、今回は３Ｆｌａｇ－ｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６Δ}と異なり、ｈＴｍ４ｓｆ１９のうち９４－１９６配列のみを残し、残りの配列を欠失させたｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６}をＴＭ４ＳＦ１９ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔとして作製した（図１２ｃの上段）。前述した方法と同様に、２９３Ｔ ｃｅｌｌにＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３ＨＡをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９とＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３Ｆｌａｇをタギングした野生型とＴＭ４ＳＦ１９ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔをｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎしてｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎで結合するかどうかを確認した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１９のｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ３とＥＣ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ２）とｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４を発現したｍｕｔａｎｔ（ｈＴｍ４ｓｆ１９_{９４－１９６}）が野生型（ＷＴ）と同様にｓｅｌｆ－ｂｉｎｄｉｎｇすることを確認した（図１２ｃの下段）。これらの結果から、ＴＭ４ＳＦ１９の９４～１９６ａａ領域がＴＭ４ＳＦ１９－ＴＭ４ＳＦ１９ ｓｅｌｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎに重要な部位であることを再確認した。

（３）ＴＭ４ＳＦ１９及びＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ相互結合
２９３Ｔ細胞にＮ末端に３ＦｌａｇをタギングしたＴＭ４ＳＦ１９とＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互結合を前記のような方法を用いて免疫沈殿で確認した。ＴＭ４ＳＦ１９断片としては、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１６９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８０、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１８６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～１９６、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １２０～２０９、ｈＴｍ４ｓｆ１９ １３１～１９６及びｈＴｍ４ｓｆ１９ １４５～１９６領域を使用した（図１２ｄの上段）。その結果、図１２ｄの下端及び図１２ｅに示すように、ｈＴｍ４ｓｆ１９の１６０～１６９ａａ領域が結合に重要な役割を果たすことが確認でき、また、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃの１４５～１９６領域がＴＭ４ＳＦ１９との結合を増加させるのに重要な役割を果たすことが確認できた。

（４）インテグリンαｖ－ＴＭ４ＳＦ１９間のｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの確認
破骨細胞の分化に重要な役割を果たすインテグリンαｖとＴＭ４ＳＦ１９間のｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを確認した。ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃがインテグリンαｖ－ＴＭ４ＳＦ１９に結合する重要結合領域（ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を確認するために、２９３Ｔ ｃｅｌｌにＣ末端に３ＨＡをタギングしたインテグリンαｖとＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互作用を免疫沈殿で確認した（図１２ｆ）。

（５）インテグリンβ３－ＴＭ４ＳＦ１９間のｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの確認
破骨細胞の分化に重要な役割を果たすインテグリンβ３とＴＭ４ＳＦ１９間のｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを確認した。ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃがインテグリンβ３－ＴＭ４ＳＦ１９に結合する重要な結合領域（ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を確認するために、２９３Ｔ細胞にＣ末端に３ＨＡをタギングしたインテグリンβ３とＴＭ４ＳＦ１９断片のｈＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質間の相互作用を免疫沈殿で確認した（図１２ｇ）。

図１２ｈは、２９３Ｔ細胞または破骨細胞前駆体Ｒａｗ２６４．７細胞にＴＭ４ＳＦ１９と破骨細胞の機能を調節し、ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔの形成時、細胞骨格再配列に関与するタンパク質であるインテグリンαｖまたはインテグリンβ３を過剰発現した後、 ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎの有無を確認した結果である。ＴＭ４ＳＦ１９がインテグリンαｖと結合し、インテグリンβ３とも結合することを確認した結果である。

ＴＭ４ＳＦ１９は、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ｆａｍｉｌｙであり、これらのｆａｍｉｌｙの ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ２（Ｌａｒｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ）が他のｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒとの結合に重要な役割を果たすことが知られている。ＴＭ４ＳＦ１９のｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎがｐａｒｔｎｅｒとｉｎｔｅｒａｃｔするのに必須的であるかを確認するために、ＴＭ４ＳＦ１９ ｗｔまたは ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ２である１１５～１７５がｄｅｌｅｔｉｏｎされたタンパク質とインテグリンαｖまたはインテグリンβ３との相互結合を免疫沈殿で確認した結果である。ＴＭ４ＳＦ１９ ｗｔは、それらとの相互作用が確認される反面、ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１１５～１７５Δ}との結合は行われないことを確認した結果である。

図１２ｉは、ＴＭ４ＳＦ１９と破骨細胞機能の調節に関与し、ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔの形成時、細胞骨格の再配列に関与する膜タンパク質であるＤＣ－Ｓｔａｍｐとｓｉｇｌｅｃ－１５との相互作用を免疫沈殿で確認した結果を示す。ＴＭ４ＳＦ１９は、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ３ＨＡタギングであり、ＤＣ－Ｓｔａｍｐは、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３Ｆｌａｇをタギングし、Ｓｉｇｌｅｃ－１５は、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓに３Ｆｌａｇをタギングして２９３Ｔに発現させた後、免疫沈殿で相互作用を確認した結果である。

実施例５：ＴＭ４ＳＦ１９の過剰発現によるがん細胞の増殖、コロニー形成、移動増加の確認
マウス由来の乳がん細胞Ｅ０７７１にＴＭ４ＳＦ１９を過剰発現（ｈＴＭ４ＳＦ１９）した後、時間による細胞増殖とコロニー形成アッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）と細胞移動アッセイ（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。

図１３ａは、ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現により２４、４８、７２時間後、乳がん細胞Ｅ０７７１の細胞増殖が有意に増加することをグラフで表したものである。図１３ｂは、乳がん細胞Ｅ０７７１にＴＭ４ＳＦ１９過剰発現した細胞と対照群細胞１０００個をプレーティングした後、コロニー形成能力を確認したもので、ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現によりコロニー形成が増加することを示す。図１３ｃは、乳がん細胞Ｅ０７７１にＴＭ４ＳＦ１９過剰発現した細胞と対照群細胞を移動チャンバー（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）にプレーティングした後、時間による細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）能力を評価したもので、ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現により細胞移動が増加することを示す。

実施例６：ＴＭ４ＳＦ１９欠乏のがん細胞転移抑制の確認
（１）ＴＭ４ＳＦ１９欠乏の乳がん細胞肺転移抑制の確認
野生型（ＷＴ）マウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウス尾静脈に乳がん細胞Ｅ０７７１を注入し、１２日後に犠牲にした後、肺をＩｎｄｉａｎ ｉｎｋで染色して肺転移を確認した。

野生型（ＷＴ）マウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス、ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスの乳がん細胞の肺転移表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を確認し、肺に生じたｎｏｄｕｌｅの数を測定した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δマウスが野生型（ＷＴ）マウスに比べて乳がん細胞の肺転移が有意に抑制されることを確認した（図１４）。

（２）ＴＭ４ＳＦ１９欠乏の乳がん細胞転移関連遺伝子及び蛋白質発現抑制の確認
がん細胞の周辺環境は、がん転移の重要な因子として作用し、そのうちマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）から出る抗腫瘍因子（ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｆａｃｔｏｒ）によって転移程度が変わることがある。ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウス（ＴＭＫＯ）と野生型（ＷＴ）マウスから骨髄を得て骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＢＭＤＭ）に分化させた後、移動チャンバー（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）の下部に入れ、上のチャンバーには乳がん細胞を入れて共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、移動した細胞において細胞移動に関与するターゲット遺伝子（フィブロネクチン、ビメンチン、ＣＤＨ２、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２）の発現をｑＰＣＲで確認し、転移関連タンパク質（ビメンチン、ｓｌｕｇ、ｓｎａｉｌ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、β－アクチンの発現を確認するためにウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスマクロファージとの共培養により細胞移動に関与するターゲット遺伝子（フィブロネクチン、ビメンチン、ＣＤＨ２、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２）の発現が抑制され（図１５ａ）、転移に関連したタンパク質（ビメンチン、ｓｌｕｇ、ｓｎａｉｌ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、β－アクチン）発現が抑制されることを確認した（図１５ｂ）。これはＴＭ４ＳＦ１９の欠乏によってがん細胞転移関連遺伝子及びタンパク質の発現が抑制されることを示す。

実施例７：ＴＭ４ＳＦ１９のヒトＡＤＭＳＣ脂肪分化関与の確認
ヒト脂肪由来の中間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，ｈＡＤＭＳＣ）を１０μｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ、１ｎＭ ３，３’，５－Ｔｒｉｉｏｄｏ－Ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１μＭ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅを入れたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で育てながら脂肪細胞に分化させた後、０日、１４日、２１日目に遺伝子（Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγ）発現をｑＰＣＲで確認し、ウエスタンブロッティングでタンパク質（ＰＰＡＲγ、ＦＡＢＰ４）発現を確認した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９発現量がヒトＡＤＭＳＣ脂肪分化により増加することが確認された（図１６）。

実施例８：ＴＭ４ＳＦ１９の肥満及び代謝疾患関連役割の確認
（１）ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯに高脂肪食を与えて体重増加を確認する
正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１６週間高脂肪食（６０％ｆａｔ）を与えて体重増加を確認した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスは、高脂肪食にもかかわらず肥満が抑制された（図１７）。

（２）インスリン及び脂肪肝耐性の確認
野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに高脂肪食を与えた後、インスリン耐性をＨＯＭＡ－ＩＲで確認し（Ａ）、肝表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を確認し、肝組織を固定した後、Ｈ＆Ｅ染色し（Ｂ）、肝内のトリグリセリドレベルを測定（Ｃ）した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスは、高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいてインスリン耐性を低下させ、脂肪肝の形成を抑制した。したがって、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスは（正常食餌を与えた６週齢のマウスに１２週間高脂肪食を与えた）、高脂肪食に誘導されたインスリン耐性と脂肪肝に耐性があることを確認した（図１８）。

（３）高脂肪誘導肥満耐性の確認
正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１８週間高脂肪食を与えて体重増加（図１９ａ）を確認し、１８週後にマウスを犠牲にして各組織の重量（図１９ｂ）を確認し、皮下脂肪及び内臓脂肪の重量（図１９ｃ）を確認し、精巣上体の白色脂肪（ｅＷＡＴ：ｅｐｉｄｉｄｉｍａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）のＨ＆Ｅ染色でｆａｔの表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）とｆａｔ周辺の脂肪組織マクロファージを確認（図１９ｄ）し、血清中の抗肥満サイトカインであるアディポネクチンの分泌も確認した（図１９ｅ）［ｒｔＷＡＴ：ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｓＷＡＴ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉｎｇＷＡＴ：ｉｎｇｕｉｎａｌ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉＷＡＴ：ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｉＢＡＴ：ｉｎｔｅｒｓｃａｐｕｌａｒ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ］。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスは、高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいても肥満が抑制され、血清中のアディポネクチン分泌量も増加した。したがって、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスは、高脂肪誘導肥満（１８週）に耐性があることを確認した（図１９）。

（４）脂肪分化及びマクロファージマーカー、Ｍ１様マクロファージマーカーの発現確認
正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、ｅＷＡＴ（精巣上体の白色脂肪）とｓＷＡＴ（皮下白色脂肪組織）において脂肪分化マーカー（上）とマクロファージ、Ｍ１様マクロファージマーカーの発現（下）をｑＰＣＲで確認した。

その結果、高脂肪食にもかかわらず、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスのｅｐｉｄｉｄｙｍａｌとｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ白色脂肪における脂肪分化マーカーとマクロファージマーカー、Ｍ１様マクロファージマーカーの発現が減少した（図２０）。

（５）脂肪組織関連マクロファージの量の確認
正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、精巣上体の白色脂肪のＦＡＣＳ分析によりマクロファージ（Ａ）及び樹状細胞（Ｂ）の白色脂肪での％を確認した。

その結果、高脂肪食にもかかわらず、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪における％マクロファージと樹状細胞が減少し、肥満によって引き起こされる脂肪組織関連マクロファージの量がＴＭ４ＳＦ１９ＫＯで減少した（図２１）。

（６）白色脂肪組織の間質血管細胞群においてマーカー遺伝子の発現
正常食を与えた６週齢の野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスに１２週間高脂肪食を与えた後、精巣上体の白色脂肪において間質血管細胞群（ＳＶＦ：ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）においてロファージマーカー遺伝子の発現を確認するためにｑＰＣＲを行った。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪からＳＶＦ（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離してマクロファージマーカーであるＭＣＰ１及びＦ４／８０（図２２ａ）と、Ｍ１様マクロファージマーカーであるＩＬ６及びＴＮＦａの発現が減少し（図２２ｂ）、Ｍ２様マクロファージマーカーであるＩＬ１０の発現が増加することを確認した（図２２ｃ）。

（７）ｅＷＡＴにおける炎症、インスリン抵抗性及び脂肪肝に対するＴＭ４ＳＦ１９の役割の確認
ｅＷＡＴにおいて炎症、インスリン抵抗性及び脂肪肝に対するＴＭ４ＳＦ１９の役割を確認するために、高脂肪食誘導肥満マウスモデル実験を行った。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９は、脂肪細胞分化とマクロファージを含む炎症反応に作用し、これによりＴＭ４ＳＦ１９の欠乏がインスリン抵抗性を低下させ、脂肪肝を抑制することを確認した（図２３）。

（８）ＴＭ４ＳＦ１９欠乏による白色脂肪細胞からベージュ脂肪細胞への転換確認
（正常食を与えた６週齢のマウスに高脂肪食を与え始めてから１２週間与えた）高脂肪食誘導比肥満マウスモデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪からベージュまたは褐色脂肪表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）への転換を確認した。また、１２週間の高脂肪食誘導肥満マウスモデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの白色脂肪におけるＵｃｐ１発現が増加することを確認し、褐色脂肪分化インビトロモデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯでＵｃｐ１が増加したことを確認することにより、ＴＭ４ＳＦ１９が白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞に変えるのに関与することを確認した（図２４）。

図２４ａは、高脂肪食誘導肥満ＷＴまたはＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪においてベージュまたは褐色脂肪のｐｈｅｎｏｔｙｐｅとｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒの形成をＨ＆Ｅｓｔａｉｎｉｎｇにより確認した。

図２４ｂは、高脂肪食誘導肥満ＷＴまたはＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの精巣上体の白色脂肪とｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ脂肪における褐色脂肪マーカーであるＵｃｐ１のｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを確認した結果である。ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯの白色脂肪においてＵｃｐ１の発現が増加することを確認した。

図２４ｃは、白色脂肪のｂｅｉｇｅ／ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ方法を示す模式図である。ＷＴとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの白色脂肪から抽出したａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌをＤＭＥＭ／Ｆ－１２ ｍｅｄｉａにＴ３とｉｎｓｕｌｉｎを入れて育てながら、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔした状態になってから２日後、ＤＭＩとｉｎｄｏｍｅｔａｃｉｎを処理して分化を開始し、ｄａｙ ２からｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅを処理しながら、ｄａｙ ７～ｄａｙ ８まで培養し、ｂｅｉｇｅ／ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎを誘導した。

図２４ｄ及び図２４ｅは、ｂｅｉｇｅ／ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ後、Ｕｃｐ１のｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎとｐｒｏｔｅｉｎの発現を確認した結果である。

（９）ＴＭ４ＳＦ１９発現を白色脂肪の脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）と間質血管細胞群（ＳＶＦ）において確認
高脂肪食を２４週間与えたマウスの精巣上体の白色脂肪と皮下白色脂肪において脂肪細胞とＳＶＦを分けてＴＭ４ＳＦ１９発現を確認した。

高脂肪食誘導（正常食を与えた６週齢マウスに高脂肪食を与え始めてから２４週間与えた）マウスのｅＷＡＴ及びｓＷＡＴで脂肪組織とマクロファージを含むＳＶＦの両方でＴＭ４ＳＦ１９発現を確認することにより、ＴＭ４ＳＦ１９が脂肪細胞での機能だけでなく、マクロファージと単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を含むＳＶＦでの機能もあることを意味する（図２５）。

図２５ａは、白色脂肪をｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ Ｉでｄｉｇｅｓｔｉｏｎした後、遠心分離してａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ、ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ、ＳＶＦ ｆｒａｃｔｉｏｎに分けた。各ｆｒａｃｔｉｏｎにあるｃｅｌｌの種類に対する模式図である。

図２５ｂは、高脂肪食６０％ｆａｔを２４週間与えたマウスの精巣上体の白色脂肪と皮下白色脂肪において脂肪細胞とＳＶＦを分けてＴＭ４ＳＦ１９発現を確認した結果である。

（１０）ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ及び野生型マウスのｓＷＡＴから分離された間質血管細胞群（ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ， ＳＶＦ）のイソプロテレノール処理による褐色脂肪分化の誘導
野生型（ＷＴ）とＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスの皮下白色脂肪からＳＶＦを抽出し、イソプロテレノールで褐色脂肪に分化を誘導し、ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎとベージュ脂肪マーカー遺伝子の発現を確認するためにｑＰＣＲを行った。

ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスＳＶＦにおいてｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ遺伝子の発現とベージュ脂肪マーカーの発現が増加し、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスが白色脂肪の茶色またはベージュ脂肪化に関与できることを示唆した（図２６）。

（１１）マクロファージと３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞の共培養においてＴＭ４ＳＦ１９発現
高脂肪食による肥満において、３Ｔ３－Ｌ１脂肪組織とマクロファージ間の相互作用が重要な役割を果たす。

図２７の右図のように、インビトロモデルに脂肪細胞を分化させた後、マクロファージと接触共培養（ｃｏｎｔａｃｔ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）をした後、マクロファージ、炎症、抗肥満などのマーカー遺伝子［Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍａｋｅｒ；ＭＣＰ－１，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｍａｒｅｋｒ；ＴＮＦα，ＩＬ６，ＭＭＰ３，ａｎｔｉ－ｏｂｅｓｉｔｙ ｍａｒｋｅｒ；ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ］の発現をｑＰＣＲで確認した。対照群としては、マクロファージと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用した。

３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞とマクロファージ共培養によって炎症に関連した遺伝子であるＭＭＰ３の発現が増加し、ＴＭ４ＳＦ１９も増加した。

（１２）接触システムにおいて脂肪細胞とマクロファージの共培養による炎症変化の誘導
野生型（ＷＴ）マウスからＳＶＦを抽出し、ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓさせた後、野生型（ＷＴ）骨髄をマクロファージに分化させた後、それぞれまたは接触共培養して炎症変化を誘導した。対照群としては、マクロファージと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用した。

ＳＶＦの脂肪細胞分化と骨髄のマクロファージの分化後のｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅによってＴＭ４ＳＦ１９が増加した（図２８）。

野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスからＳＶＦを抽出し、脂肪を生成させ、それぞれのマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、接触共培養して炎症変化を誘導した。

その結果、図２９に示すように、ＷＴ分化脂肪細胞＋マクロファージの分化共培養に比べてＴＭ４ＳＦ１９ＫＯの分化脂肪細胞＋マクロファージの分化においてＭＣＰ１とＩＬ６が減少した。

野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスからＳＶＦを抽出し、脂肪を生成させ、それぞれのマウスから骨髄を採取してマクロファージに分化させた後、ｃｔｒｌ ｃｕｌｔｕｒｅまたはｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅして炎症変化を誘導した。対照群（ｃｔｒｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）としては、マクロファージと脂肪細胞をそれぞれ育てた後、ＲＮＡを抽出して合わせた後に使用した。

ＳＶＦの脂肪細胞の分化と骨髄のマクロファージの分化後の共培養モデルにおいて、ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ ＢＭＤＭは、炎症反応マーカーの発現を減少させ、ｗｔ脂肪細胞－ｗｔマクロファージよりＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ脂肪細胞－ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマクロファージｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅにおいて炎症反応が減少した（図３０）。

分化した脂肪細胞とＢＭＤＭをｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅする場合、炎症シグナルが増加した。

（１３）インビトロインスリン耐性モデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９の確認
インビトロインスリン耐性モデルを作製した。

３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞を１２日間分化し、ＴＮＦαを２４時間処理した後、脂肪分化マーカーであるＣ／ＥＢＰα、インスリン抵抗性インビトロモデルマーカーであるＣ／ＥＢＰβ及びＴＭ４ＳＦ１９をｑＰＣＲで確認した。

ＴＮＦαは、炎症を誘導することで、インビボで肥満が誘導されたとき、周囲にｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌが増加することをｍｉｍｉｃしたモデルである。

野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスからＳＶＦを抽出して脂肪分化させ、ＴＮＦαを２４時間処理した後、脂肪分化マーカーであるＣ／ＥＢＰα、インスリン抵抗性インビトロモデルマーカーであるＣ／ＥＢＰβ及びＴＭ４ＳＦ１９をｑＰＣＲで確認した。その結果、インビトロインスリン抵抗性モデルにおいてＴＭ４ＳＦ１９が増加することを確認した（図３１、図３２）。ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯは、インスリン抵抗性が減少することを確認した（Ｃ／ＥＢＰβは、ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒである）。

（１４）マクロファージの分化及び分極化においてＴＭ４ＳＦ１９の役割
野生型（ＷＴ）マウスとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯマウスから骨髄を採取し、マクロファージに分化させた後、Ｍ１ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎに関与するマーカーを確認した。Ｍ１マクロファージは、全－炎症シグナリングに関与する。

野生型（ＷＴ）マウス骨髄由来Ｍ１マクロファージの分化により炎症マーカー及びＴＭ４ＳＦ１９が増加し（図３３）、骨髄由来Ｍ１マクロファージ分化マーカーがＴＭ４ＳＦ１９ＫＯにおいて減少する（図３４）ことを確認した。

製造例１：ＴＭ４ＳＦ１９抗体の作製及び検証
（１）ポリクローナルマウスＴＭ４ＳＦ１９抗体の作製
抗体免疫原性を予測して可能なターゲットを決めた後、マウスＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２の１４１～１５９ａａ部位をターゲットに対するポリクローナルマウスＴＭ４ＳＦ１９抗体を作製した。（マウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質についてはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を参照。）

（２）ＴＭ４ＳＦ１９抗体の検証
２９３Ｔ細胞にヒトＴＭ４ＳＦ１９（ｈＴＭ４ＳＦ１９）、ヒトＥＣ２Δ（ｈＴＭ４ＳＦ１９ １１５～１７５Δ）、マウスＴＭ４ＳＦ１９（ｍＴＭ４ＳＦ１９）、マウスＥＣ２Δ（ｍＴＭ４ＳＦ１９ １１６～１６５Δ）を一時的に過剰発現させた後、先に作製したポリクローナルマウスＴＭ４ＳＦ１９抗体で発現を確認するために、ウエスタンブロッティングを行った。

ポリクローナルマウスＴＭ４ＳＦ１９抗体は、ヒトＴＭ４ＳＦ１９とマウスＴＭ４ＳＦ１９を認識した。しかし、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔは、認識できなかった（図３５）。

実施例９：ＴＭ４ＳＦ１９抗体を用いたＴＭ４ＳＦ１９の役割の検証
（１）ＴＭ４ＳＦ１９抗体の破骨細胞の分化抑制確認
野生型（ＷＴ）マウスから骨髄を採取し、破骨細胞に分化させながらＴＭ４ＳＦ１９抗体を処理し、ＴＲＡＰ染色で確認した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９抗体は、用量依存的に破骨細胞多核化を阻害した（図３６）。

製造例２：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃの作製
ＴＭ４ＳＦ ｆａｍｉｌｙに対する配列情報と系統樹情報を用いて、ヒトＴＭ４ＳＦ１９とマウスＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ２に対するＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ融合タンパク質を作製した。

ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃは、ヒトＴＭ４ＳＦ１９またはマウスＴＭ４ＳＦ１９ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ ｌｏｏｐ２のｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓにヒトＩｇＧ１－Ｆｃが融合した形態である。

マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６－１６５）は分泌がよいので、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎしてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｅｓｔを行った。

ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１５－１７５）は、分泌がよくないので、新しいｒｅｇｉｏｎ（１２０－１６９）に対するＦｃを作製した。

マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃは、分泌がよいので、精製した。

マウスＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２－Ｆｃ（１１６－１６５）を作製して精製し、それを以後の実験に使用した。

ヒトＴＭ４ＳＦ１９－ＥＣ２－Ｆｃ（１１５－１７５）は、発現がよくないので、マウスＴＭ４ＳＦ１９－ＥＣ２－Ｆｃと保存されたｓｅｑｕｅｎｃｅで再作製して発現を確認した。ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）は、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２（１１５－１７５）に比べてｍｅｄｉａでｓｅｃｒｅｔｉｏｎが多く行われ、これを以後の実験に使用した（図３７）。

本発明による実施例で使用した融合タンパク質は、図５８に示した。

以下、「ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ」とは、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）融合タンパク質を意味する。「ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ」とは、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５ａａ）融合タンパク質を意味する。

実施例１０：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いたＴＭ４ＳＦ１９の役割の検証
ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、ｈＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－Ｆｃ及びｍＴＭ４ＳＦ１９_{１１６－１６５}－Ｆｃを破骨細胞の分化過程で処理した。破骨細胞の分化のために骨髄由来細胞にＭＣＳＦ ６０ｎｇ／ｍｌ及びＲＡＮＫＬ １００ｎｇ／ｍｌを処理した後、ＴＲＡＰ染色を行った。

その結果は、図３８ａ～図３８ｃに示す通りである。精製されたｍＴＭ４ＳＦ１９ ＥＣ２－Ｆｃを破骨細胞の分化過程で処理して多核破骨細胞形成の阻害を確認した［Ｅ１．Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ）でｅｌｕｔｉｏｎしたｓａｍｐｌｅ．Ｅ１－１；Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（５０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）でＵＦ／ＤＦ（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行ったサンプル（Ｆｃがより安定的である場合がある）］。また、精製されたｈＴＭ４ＳＦ１９_{１２０－１６９}－Ｆｃを処理してｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ阻害を確認した。

野生型マウス骨髄を分化させながら、ＩｇＧ－ＦｃとｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ処理した後、多核破骨細胞の分化時に形成されるアクチンベルト形成の有無をＦ－アクチン染色で確認した。ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによりアクチンベルトの形成が抑制され、マウスＴＭ４ＳＦ１９抗体でＴＭ４ＳＦ１９がアクチンベルトにｌｏｃａｌｉｚｅされることを確認した（図３８ｄ）。

Ｄｅｎｔｉｎ ｄｉｓｃの上にＢＭＭ細胞をプレーティングした後、分化させながらＩｇＧ－ＦｃとｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ処理した後、ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを１％ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ染色で確認した。図３８ｅに示すように、骨再吸収がｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによってｂｌｏｃｋされたことを確認した。

実施例１１：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた骨損失回復の確認
８週齢の雌マウスに卵巣切除術を行ってから１週間後から１週間に１回、３週間マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを尾静脈を通じて注射し、最後の注射後、１週間後に犠牲にして大腿骨を固定した後、ｍｉｃｒｏ ＣＴを測定した。マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ濃度は、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇを使用した。

図３９ａは、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによる骨損失回復を示すｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージである。

図３９ａのｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析し、総骨塩密度（ＢＭＤ）、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を得た（図３９ｂ）。

図３９ｂに示すように、総ＢＭＤ（Ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）、％ＢＶ／ＴＶ（ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｖｏｌｕｍｅ）、Ｔｂ．Ｎ（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）が卵巣切除術により減少し、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃにより用量依存的に増加することを確認した。一方、Ｔｂ．Ｓｐ（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃにより減少することを確認した。これらの結果から、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃが卵巣切除術によって誘発された骨損失（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）が回復（ｒｅｓｃｕｅ）されたことが確認できる。

さらに、マウス大腿骨組織をＨ＆Ｅ染色を通じて組織病理学的に分析した。その結果、図３９ｃに示すように、卵巣切除術により骨小柱（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）の数が減少し、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により容量依存的に骨小柱の数の減少が回復することが確認できる。

また、８週齢の雌マウスに卵巣切除術を行った後、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１３１～１６９）をｉｖ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎした。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐに比べてヒトとマウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによって骨損失が顕著に抑制されることを確認した（図３９ｄ）。マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）は、１０ｍｇ／ｋｇ、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１３１～１６９）は、２５ｍｇ／ｋｇ処理した。

ヒトＴＭ４ＳＦ１９ ｒｅｇｉｏｎは、１３１～１６９を含む領域が卵巣切除術によるｂｏｎｅ ｌｏｓｓをｒｅｓｃｕｅできる。

以上の結果は、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃの骨粗鬆症治療剤としての開発可能性を示唆する。

実施例１２：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いたＴＭ４ＳＦ１９の役割の検証
（１）破骨細胞の形成（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）
野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを処理する条件で分化させながら、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを１０μｇ／ｍｌ処理（対照群は、バッファー処理）した後、破骨細胞の分化に関与する遺伝子であるＣｔｓｋ及びＡｃｐ５の発現をｑＰＣＲを通じて確認した。

図４０は、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを処理する条件で分化した細胞におけるＡｃｐ５及びＣｔｓｋのｍＲＮＡ発現をグラフで表したものである（ＷＴ１、２、３、４、５は、野生型マウス５匹のそれぞれから得られた骨髄細胞を破骨細胞に分化して得られた結果を意味する；Ｍ－ＣＳＦのみを処理した群は、分化していない群を意味する）。

図４０ａに示すように、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により破骨細胞の分化に関与する遺伝子の発現が対照群（ＷＴ）に比べて有意に抑制された。

同様に、野生型（ＷＴ）マウスの骨髄から細胞を抽出し、Ｍ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬを処理する条件で分化させながら、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを５μｇ／ｍｌ処理した後、破骨細胞分化マーカータンパク質の発現を確認した結果、図４０ｂに示すように、対照群（ＷＴ）に比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃの処理により有意に破骨細胞の分化マーカータンパク質の発現が抑制されることを確認した。

（２）ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃとのｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃが破骨細胞の多核化を遮断する理由が分化過程中に表面に結合する能力が高くなって可能であると判断し、Ｒａｗ２６４．７細胞の分化前後にｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃとの表面結合をＦＡＣＳ分析を通じて行った。図４１に示すように、分化前のｃｏｎｔｒｏｌであるＩｇＧ１（淡い灰色のｇｒａｐｈ）とｍｏｕｓｅＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（濃い灰色のｇｒａｐｈ）間の表面結合の差はほとんどないが、分化後のｃｏｎｔｒｏｌであるＩｇＧ１（淡い灰色のｇｒａｐｈ）に比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（濃い灰色のｇｒａｐｈ）が右側に移動したもので、実際に分化後にｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃとの表面結合が増加することを確認した。

図４１に示すように、分化後のｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃとの結合が増加することが確認された。

実施例１３：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた関節リウマチの予防及び治療
図４２ａの実験スケジュールによって、コラーゲン誘導関節炎マウスモデル（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）においてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃのｓｅｍｉ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔを確認した。

ＤＢＡ／１マウスを１４日間純化させた後、ｃｈｉｃｋｅｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩをＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）と混合して注射を行った後、１８日後にＣｈｉｃｋｅｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩをＩＦＡ（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合してブースト注射（ｂｏｏｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った。ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃは、最初の注射後、１５日目に投与を開始し、週２回１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．投与した。マウスを犠牲にする６３日までに、週２回ＣＩＡスコアを確認した。

ＣＩＡ ｓｃｏｒｅは、以下の方法で評価される：Ｓｃｏｒｅ ０（ｎｏｒｍａｌ ｐａｗ），Ｓｃｏｒｅ １（ｏｎｅ ｏｒ ｔｗｏ ｔｏｅｓ ｉｎｆｌａｍｅｄ ａｎｄ ｓｗｏｌｌｅｎ），Ｓｃｏｒｅ ２（３＋ｔｏｅｓ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｗ／ｎｏ ｐａｗ ｓｗｅｌｌｉｎｇ，ｏｒ ｍｉｌｄ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｅｎｔｉｒｅ ｐａｗ），Ｓｃｏｒｅ ３（ｅｎｔｉｒｅ ｐａｗ ｉｎｆｌａｍｅｄ ａｎｄ ｓｗｏｌｌｅｎ），Ｓｃｏｒｅ ４（ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｓｗｏｌｌｅｎ ｐａｗ ａｎｄ ａｌｌ ｔｏｅｓ，ｏｒ ａｎｋｙｌｏｓｅｄ ｐａｗ ａｎｄ ｔｏｅｓ）

ＣＩＡ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）誘発後、４２日後にマウスの関節状態を確認した結果、図４２ｂに示すように、何も処理していないＳｈａｍ ｇｒｏｕｐに比べてＩｇＧ１を処理した対照群では、足の指と足の甲がすべて腫れたが、１０ｍｇ／ｋｇのｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを処理した群では、足の指と足の甲の浮腫が多少抑制され、２５ｍｇ／ｋｇによっては浮腫現象がはっきりと抑制されることが確認できた。

一方、図４２ｃのグラフは、実験期間中に調査されたＣＩＡスコアと腫れた関節の数を分析した結果を示す。ＩｇＧ１を処理した対照群に比べて、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理群は用量依存的にＣＩＡスコアと浮腫を減少させることが確認された。

さらに、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルｆｅｍｕｒの足をｍｉｃｒｏ ＣＴ撮影し、そのイメージを分析した。

図４２ｄは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの足に発生した炎症と骨損傷がｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理によって用量依存的に抑制されたことを示すｍｉｃｒｏ ＣＴイメージである。コラーゲン誘導関節炎によって足指が曲がり、足指の節や足首に炎症による骨損傷が発生したが、対照群であるｈＩｇＧ１－Ｆｃを処理したマウスに比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを処理したマウスの関節部分の炎症と骨損傷が用量依存的に抑制された。

図４２ｅは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの足に発生した炎症と骨損傷がｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処置によって用量依存的に抑制され、同じＲＡスコアを有するマウスを比較したとき、対照群であるｈＩｇＧ１－Ｆｃを処理したマウスに比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを処理したマウスの骨損傷が抑制されることが確認できた。

さらに、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルｆｅｍｕｒのｍｉｃｒｏ ＣＴの撮影イメージを３次元映像解析プログラムで分析し、ＢＭＤ、骨の体積（ＢＶ）、組織の体積に対する骨の体積の割合（％ＢＶ／ＴＶ）、骨小柱の平均数（Ｔｂ．Ｎ）、骨小柱の間隙（Ｔｂ．Ｓｐ）を含む３次元ｍｉｃｒｏ ＣＴ指標（骨微細構造指標）を得た。

図４２ｆは、コラーゲン誘導関節炎によってＢＭＤ（Ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）とＴｂ．Ｎ（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）がｓｈａｍ群に比べて減少するが、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによって骨損失が抑制されることを示す。

図４２ｇは、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの軟骨損傷をトルイジンブルーで確認した結果である。ｈＩｇＧ１－Ｆｃ処理群に比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理群の軟骨損傷が抑制されたことを示したものである。

また、コラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおいて、ｍＴＭ４ＳＦ１９－ＦｃとｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）のｓｅｍｉ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔを関節炎スコアで確認した。Ｂａｌｂｃマウスにコラーゲン抗体を投与してから３日後、ＬＰＳをｉｎｊｅｃｔｉｏｎして関節炎を誘発した。対照群に比べて、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ ２５ｍｇ／ｋｇとｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）２５ｍｇ／ｋｇにおいて関節炎抑制効果が現れた（図４２ｈ）。ｈＩｇＧ１－Ｆｃに比べてＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により関節炎疾患スコアが低くなり、足の厚みが減少することを確認した。

また、コラーゲン誘導関節炎マウスモデルにおいて、コラーゲン抗体投与３日後、ＬＰＳをｉｎｊｅｃｔｉｏｎして関節炎を誘発した後、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃのｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔを関節炎スコアで確認した。

コラーゲン抗体投与３日後にＬＰＳをｉｎｊｅｃｔｉｏｎして関節炎を誘発した後、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃの治療効果を確認するために関節炎疾患スコアが最も高く確認される８日からｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを５０ｍｇ／ｋｇ処理し、９日から１９日までに関節炎疾患スコアを２日ごとに確認した。

Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐに比べてｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により関節炎スコアが低くなり、足の厚みが減少し、トルイジンブルーで確認した軟骨損傷が抑制されることを確認した（図４２ｉ）。すなわち、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃにおいて関節炎の治療効果が現れた。

実施例１４：ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた乳がんの骨転移の抑制
図４３ａの実験スケジュールにより、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ６週齢の雌マウスの尾にＭＤＡ－ＭＢ２３１－ｌｕｃ乳がん細胞（イメージングのためにＭＤＡ－ＭＢ２３１にルシパレイズを発現させた細胞株）をＣＡ（ｃａｕｄａｌ ａｒｔｅｒｙ）注射して骨転移を誘導した。骨転移の誘導後、ｈＩｇＧ１またはｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを静脈注射した。ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃは、がん細胞注射の２日後から静脈注射を開始し、週に２回ずつ１０ｍｐｋまたは２５ｍｐｋ投与した。生物発光映像分析（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じてがんの進行（ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）状態を確認した。

がん細胞注射後、４５日目に生物発光映像分析（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて骨転移の有無を確認した。図４３ｂ（左）に示すように、対照群であるｈＩｇＧ１投与群に比べてｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ投与群の骨転移が抑制されていることを確認した。４５日目にルシフェリンの注射後にマウスを犠牲にして足を切り取って発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）分析を行った結果、図４３ｂ（右）に示すように、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により骨転移が抑制されることを確認した。

図４３ｃは、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節をｍｉｃｒｏ ＣＴスキャンした結果を示す。ｍｉｃｒｏ ＣＴ分析の結果によれば、乳がんの骨転移により骨損傷が起こり、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により用量依存的に骨損傷が修復されることを確認した。

さらに、乳がんの骨転移が起こったマウスの関節についてＨ＆Ｅ染色を通じて組織学的分析を行った。その結果、図４３ｄに示すように、乳がん骨転移と腫瘍成長がｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により用量依存的に抑制されることが確認できた。

図４４ａの実験スケジュールにより、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ６週齢の雌マウスの尾にＭＤＡ－ＭＢ２３１－ｌｕｃ乳がん細胞（イメージングのためにＭＤＡ－ＭＢ２３１にルシフェラーゼを発現させた細胞株）をＣＡ（ｃａｕｄａｌ ａｒｔｅｒｙ）注射して骨転移を誘導した。誘導後、３０日以後から、ｃｏｎｔｒｏｌ ｈＩｇＧ１またはｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを５０ｍｇ／ｋｇ ｉｖ投与を開始した。

Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ後、２１日まで７日間隔で生物発光映像分析し、骨転移がｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）によって抑制されることを確認した（図４４ｂ）。ルシフェリン注射後に犠牲にして足を切り取ってｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ分析した結果、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により骨転移が抑制されることを確認した（図４４ｃ）。ｍｉｃｒｏ ＣＴにより乳がんの骨転移により骨破壊が起こり、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理にｒｅｓｃｕｅされることを確認した（図４４ｄ）。

実施例１５：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを用いた乳がんの肺転移の抑制
マウス由来のＥ０７７１乳がん細胞を野生型マウスの尾静脈に注入して肺転移を誘発させた。ｈＩｇＧ１－Ｆｃ、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１４５～１６９）をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ ｉｖ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎした後、乳がん細胞の肺転移抑制の有無をＩｎｄｉａｎ ｉｎｋで染色した後、肺に生じたｎｏｄｕｌｅ数を数えて確認した。図４５に示すように、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）、ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１４５～１６９）により肺転移が著しく抑制されることが確認できた。

実施例１６：ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理による高脂肪食誘導肥満の抑制及び脂肪肝抑制効果
６週齢のマウスに７週間高脂肪食を与えたマウスを購入し、１週間高脂肪食を与えて純化させた後、９週間高脂肪食を与えながらマウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃを週に２回ずつ皮下注射または静脈注射を通じて投与した。その結果、図４６ａに示すように、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ投与により高脂肪食による肥満が抑制されることが確認できた。

マウスを犠牲にして臓器内の白色脂肪の分布を分析した結果、図４６ｂに示すように、ｍＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により白色脂肪の重量が減少することを確認し、明確な脂肪肝抑制効果も確認できた。

また、肝組織をＨ＆Ｅ染色及びマッソン＆トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ ａｎｄ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を通じて観察した結果、図４７（左）に示すように、ｈＩｇＧ１－Ｆｃを処理した対照群に比べて脂肪肝減少効果がはっきりしていた。また、血漿中で中性脂肪が減少することが確認できた（図４７（右））。

実施例１７：ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理による脂肪細胞分化抑制効果
精製したマウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１５～１６５）をＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に処理して、脂肪細胞分化が用量依存的に抑制されることを確認した（図４８）。

対照群には分化誘導因子を処理せず、実験群には分化誘導因子（デキサメタゾン１μＭ、ＩＢＭＸ ５００μＭ、インスリン４μｇ／ｍｌ（ＤＭＩ）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ５μＭで脂肪細胞分化時に処理）とともにマウスＴＭ４ＳＦ１９_{１１５－１６５}－Ｆｃを０ｎｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌで処理して脂肪細胞分化を観察した。

さらに、脂肪細胞分化の主なマーカーであるＣ／ＥＢＰアルファとＰＰＡＲ－ガンマの発現を確認した結果、分化を誘導していない群（ｎｏ ＤＭＩ）に比べてＤＭＩを処理した群の発現が増加し、マウスＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１１６～１６５）処理により発現が抑制されることを確認した。

実施例１８：破骨細胞の分化によって誘導されたがん細胞の移動抑制効果
（１）ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ
破骨細胞の分化によって誘導されたがん細胞の移動がｍＴＭ４ＳＦ１９－ＦｃまたはｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）によって抑制されることに対して、クリスタルバイオレットソリューション０．０５％で染色して確認した。骨髄由来マクロファージを１２ｗｅｌｌにプレーティングした後、ＭＣＳＦとＲＮＡＫＬに分化誘導しながら、ｍＴＭ４ＳＦ１９－ＦｃまたはｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ １０μｇ／ｍｌを処理するか、またはＲＮＡＫＬを入れないため分化させず、移動チャンバーの上にがん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１またはＰＣ３Ｍを入れて移動を行った。移動したがん細胞をクリスタルバイオレットで染色した。

その結果、図４９に示すように、破骨細胞の分化により誘導されたがん細胞の移動がＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃによって抑制されたことを確認した。

（２）ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯ
ＴＭ４ＳＦ１９ＫＯにおいて破骨細胞の分化によるがん細胞の移動抑制を確認したもので、ｗｔとＴＭ４ＳＦ１９ＫＯから抽出した骨髄由来マクロファージにＭＣＳＦを入れ、ＲＡＮＫＬを入れて分化させるか、または入れないため分化させず、移動チャンバーの上にがん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１またはＰＣ３Ｍを入れて移動を行った。移動したがん細胞をクリスタルバイオレットで染色した。

その結果は、図５０ａにＴＭ４ＳＦ１９ＫＯにおいて破骨細胞の分化によるがん細胞移動抑制を示した。

（３）ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δ
ＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δにおいて破骨細胞の分化によるがん細胞移動抑制を確認したもので、ｗｔとＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δから抽出した骨髄由来マクロファージにＭＣＳＦを入れ、ＲＡＮＫＬを入れて分化させるか、または入れないため分化させず、移動チャンバーの上にがん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１またはＰＣ３Ｍを入れて移動を行った。移動したがん細胞をクリスタルバイオレットで染色した。

その結果は、図５０ｂにＴＭ４ＳＦ１９ＥＣ２Δにおいて破骨細胞の分化によるがん細胞移動抑制を示した。

実施例１９：骨肉腫細胞増殖、移動及びコロニー形成の確認
（１）ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現
３Ｆｌａｇ－ｈＴＭ４ＳＦ１９をＭＧ６３、ＨＯＳ骨肉腫細胞株に安定的に過剰発現させた後、細胞の成長をＭＴＴ分析し、コロニー形成と移動を確認した。その結果、ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現により骨肉腫細胞の増殖、移動、コロニー形成が増加することを確認した（図５１、図５２）。

また、１４３ｂ骨肉腫細胞株にＴＭ４ＳＦ１９をＣＲＩＳＰＲでノックアウトさせた後、それぞれ異なるクローン（＃４と＃６）で細胞の成長をＭＴＴ分析で確認し、コロニー形成を確認した。

その結果、ＴＭ４ＳＦ１９発現抑制により骨肉腫細胞１４３ｂの増殖コロニー形成が抑制されることを確認した（図５３）。

ＴＭ４ＳＦ１９過剰発現は、骨肉腫細胞増殖及び移動を増加させる。ＴＭ４ＳＦ１９発現抑制は、骨肉腫細胞の増殖及びコロニー形成を抑制させる。

（２）ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理
１４３ｂ骨肉腫細胞株ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）を処理しながら、細胞の成長をＭＴＴ分析と細胞計数で確認し、群集能力をコロニー形成で確認し、細胞の移動を確認した。

ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により１４３ｂ骨肉腫細胞の成長が抑制されることをＭＴＴ分析（図５４ａ）と細胞計数で確認（図５４ｃ）し、群集能力をコロニー形成で確認し（図５４ｂ）、細胞移動（図５４ｄ）を確認した。

ヒトＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）（１０μｇ／ｍｌ）処理により、Ｕ２ＯＳ、ＭＧ６３骨肉腫細胞コロニー形成が抑制されることを確認した（図５５）。

ＨＯＳ骨肉腫細胞の細胞移動能力が１０μｇ／ｍｌ ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９ａａ）とｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１４５～１６９ａａ）処理によって抑制されることを確認した（図５６）。

これは少なくとも１４５～１６９ａａを含むｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃが活性を示すものと判断できる。

実施例２０：膵臓がん細胞増殖、コロニー形成抑制の確認
膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ－１及びＭＩＡ－ＰａＣａ２に１００μｇ／ｍｌのｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）を処理し、細胞の群集能力をコロニー形成エッセイで確認した。その結果、図５７ａに示すように、ｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）により膵臓がん細胞株の群集能力が抑制されることを確認した。さらに、膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ－１、ＭＩＡ－ＰａＣａ２、ＡｓＰＣ－１に６２．５μｇ／ｍｌまたは１２５μｇ／ｍｌのｈＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ（１２０－１６９）を処理し、細胞計数を通じて細胞成長抑制を確認した（図５７ｂ）。その結果、ＴＭ４ＳＦ１９－Ｆｃ処理により膵臓がん細胞の成長、群集能力が抑制されることを確認した。

Claims (6)

1. ＴＭ４ＳＦ１９（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １９）タンパク質の細胞外ループ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ ２）由来の断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、ＴＭ４ＳＦ１９の発現または活性を抑制する活性を有する融合タンパク質を有効成分として含む、骨疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、
   前記ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２に由来の断片が、ヒトまたはマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質のＥＣ２の全体または一部に該当し、
   ＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部位がヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１２０～１６９番目のアミノ酸部位であり、かつ前記ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２由来の断片がヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１４５～１６９番目のアミノ酸部位を必ず含むまたはＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部位がマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１１６～１６５番目のアミノ酸部位であり、並びに
   前記ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列で表され、かつ前記マウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列で表され、
   前記骨疾患が破骨細胞の機能不全、骨化石症、関節炎、骨減少症及び骨損傷からなる群から選択される一つ以上である、
   骨疾患の予防または治療用薬学的組成物。
2. 前記ヒトＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２由来の断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列によって表され、
   前記マウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２由来の断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列によって表される、
   請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記融合タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列によって表される、請求項１に記載の薬学的組成物。
4. ＴＭ４ＳＦ１９（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １９）タンパク質の細胞外ループ２由来の断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、ＴＭ４ＳＦ１９の発現または活性を抑制する活性を有する融合タンパク質であって、
   前記ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２由来の断片が、ヒトまたはマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質のＥＣ２の全体または一部に該当し、
   前記ＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部分が、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１２０～１６９番目のアミノ酸部位であり、前記ＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２由来の断片が、ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１４５～１６９番目のアミノ酸部位を必ず含む、または前記ＥＣ２の全体に該当するアミノ酸配列部位が、マウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の１１６～１６５番目のアミノ酸部位であり、
   ヒトＴＭ４ＳＦ１９タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列で表され、かつマウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列で表される、
   ＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２由来の断片及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＴＭ４ＳＦ１９の発現または活性を抑制する活性を有する融合タンパク質。
5. 前記ヒトＴＭ４ＳＦ１９の細胞外ループ２由来の断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列によって表され、
   前記マウスＴＭ４ＳＦ１９タンパク質の細胞外ループ２由来の断片がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列によって表される、
   請求項４に記載の融合タンパク質。
6. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。