JP7833271B2

JP7833271B2 - 接着性幹細胞製剤の製造方法

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Publication number: JP7833271B2
Application number: JP2021161288A
Authority: JP
Inventors: 梨緒政安; 清花三好
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2026-03-19
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: JP2023050921A

Description

本発明は、接着性幹細胞製剤の製造方法に関する。

近年、様々な幹細胞を用いた再生医療等製品の開発が進んでいるが、それらを治療用製剤として提供するためには、細胞の品質を長期間にわたって高く安定的に維持できる保存方法が必須である。一般的に、治療用細胞製剤やその中間製品及び原料細胞の保存方法としては、凍結保存が行われているが、細胞を凍結・解凍すると細胞に大きな損傷が加わり、細胞の品質低下を引き起こす。そこで、凍結・解凍による損傷から細胞を保護する作用を有する成分（凍結保護剤）が、凍結時に利用されており、また上記凍結保護剤を含有する溶液が凍結保存液として市販されている。さらに、細胞の保存安定性向上の一例として種々の抗酸化剤を凍結時に添加することも報告されている（特許文献１、特許文献２）。

特表2009-521949公報特表2020-516257公報

抗酸化剤は、活性酸素種等の細胞に有害な物質を取り除く一方で、細胞へダメージを与えることがあり、必ずしもその効果が期待できるとは限らない。実際に、本発明者が、上記特許文献１において抗酸化剤の一つとして例示されているアスコルビン酸を市販の凍結保存液へ添加してその効果を確認したところ、細胞の生存率向上の効果は見られないことが判明した。

そこで本発明では、凍結保存時の保存液の組成を工夫することにより、凍結保存時やその前後における細胞へのダメージを可能な限り低減し、接着性幹細胞製剤の品質を向上させることのできる製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは凍結保存時に使用することで細胞を保護し生存率を向上させることの出来る添加剤の種類と適切な濃度を検討した結果、効果の見られなかったアスコルビン酸の代わりにアスコルビン酸の誘導体を使用し、当該アスコルビン酸誘導体を０．５～７ｍＭの範囲で含有する水溶液を凍結保存液とすることによって、驚くべきことに凍結保存後の細胞の生存率低下が抑制され、さらに、接着性幹細胞の品質が飛躍的に向上することを見出した。すなわち、本発明によれば、以下の方法が提供される。
（１）接着性幹細胞を、０．５～７ｍＭのアスコルビン酸誘導体を含有する溶液中で凍結保存する工程を有する、接着性幹細胞製剤の製造方法。
（２）前記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸リン酸エステルまたはその塩である、（１）に記載の製造方法。
（３）前記溶液中に凍結保護剤をさらに含有する、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記凍結保護剤として、ジメチルスルホキシドを溶液中２～１０体積％含有する、（３）に記載の製造方法。
（５）前記凍結保護剤として、さらにヒドロキシエチルデンプンを溶液中４～１０質量％含有する、（４）に記載の製造方法。
（６）前記凍結保護剤として、さらにヒト血清アルブミンを溶液中０．１～５質量％含有する、（４）または（５）に記載の製造方法。
（７）前記接着性幹細胞が羊膜由来細胞である、（１）～（６）いずれか１項に記載の製造方法。
（８）（１）～（７）いずれか１項に記載の方法により得られる接着性幹細胞製剤を有効成分として含む細胞治療剤。

本発明の製造方法を用いることによって、凍結・解凍後の接着性幹細胞の生存率を高く維持することができ、また凍結・解凍後の細胞の増殖性を高めることができる。従って、本発明は接着性幹細胞を利用する再生医療等製品の品質向上に寄与し、再生医療等製品の利用促進につながることが期待できる。

図１は実施例１～３、比較例１～４の各凍結保存液で保存した細胞の生存率の推移を示すグラフである。図２は実施例４、比較例１、５の各凍結保存液で保存した細胞の比増殖速度を示すグラフである。図３は実施例４、比較例１、５の各凍結保存液で保存した細胞の接着率を示すグラフである。

[１]用語の説明
本明細書における「接着性幹細胞」は下記の定義ｉ）及びｉｉ）を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞 (Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ)」及び「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」も本発明の接着性幹細胞に含まれる。

本明細書における接着性幹細胞の定義
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。ここでいう標準培地とは、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性。

本発明における接着性幹細胞の由来は特には制限されず、胎児付属物（羊膜、臍帯、胎盤等）、骨髄液、脂肪組織、歯髄等に由来するものを用いることができるが、好ましくは羊膜由来である。

本明細書における「増殖能」とは、細胞が細胞分裂を行うことにより、細胞が増加する能力のことをいう。本明細書において、「増殖能が高い」は「増殖性が高い」と区別なく用いることができる。接着性幹細胞集団の増殖能は、比増殖速度、倍加回数、倍加時間、及び/又は継代回数を用いて評価することができる。比増殖速度の測定方法は、本明細書にて後述の通りである。

本明細書における「アスコルビン酸」とは、IUPAC名で(R)-3,4-ジヒドロキシ-5-((S)- 1,2-ジヒドロキシエチル)フラン-2(5H)-オンと表記される、L-アスコルビン酸のみならず、その異性体、さらにそれらの塩も含まれる。例えば、アスコルビン酸、rhamno-アスコルビン酸、arabo-アスコルビン酸、gluco-アスコルビン酸、fuco-アスコルビン酸、glucohepto-アスコルビン酸、xylo-アスコルビン酸、galacto-アスコルビン酸、gulo-アスコルビン酸、allo-アスコルビン酸、erythro-アスコルビン酸、6-デスオキシアスコルビン酸などの、L体、D体、あるいはラセミ体、またはこれらの塩である。但し、これらアスコルビン酸の官能基が置換されたものである、後述する「アスコルビン酸誘導体」は含まれない。

本明細書における「アスコルビン酸誘導体」とは、上記「アスコルビン酸」の官能基が、脂肪酸、リン酸、糖、グリセリンなどで置換されたものである。上記アスコルビン酸誘導体としては、特に限定されないが、例えば、エチルアスコルビン酸、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレートなどの脂肪酸エステル、アスコルビン酸－２－リン酸エステル、アスコルビン酸－３－リン酸エステル、アスコルビン酸－６－リン酸エステル、アスコルビン酸－２－ポリリン酸エステル等のリン酸エステル、アスコルビン酸－２－硫酸エステル等のアスコルビン酸エステル類の他、アスコルビン酸－２－グルコシドなどが挙げられる。これらは、L体、D体、あるいはラセミ体のいずれでもよい。また、本明細書におけるアルコルビン酸誘導体にはその塩も含まれる。アスコルビン酸誘導体の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロパノールアミン塩、及びトリイソプロパノールアミン塩等が挙げられる。本発明において、アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸のリン酸エステルまたはその塩が好ましく、アスコルビン酸―２―リン酸エステルまたはその塩がより好ましく、Ｌ－アスコルビン酸―２―リン酸エステルまたはその塩がさらに好ましい。

本明細書における「凍結保護剤」とは、凍結時および解凍時における細胞の傷害を軽減することによって凍結保護プロセスを容易にする化学物質を示す。凍結保護剤は細胞浸透性または非浸透性であり得る。凍結保護剤の例には、脱水剤、浸透圧剤およびガラス化溶質が含まれるが、これらに限定されない。上記の凍結保護剤としては、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、ｌ－アナリン、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸塩、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α－グリセロリン酸塩、グリセロールモノアセタート、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチルウレア類、フェノール、プルロニックポリオール類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジン－Ｎ－オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミンアセタート、ウレア、バリンおよびキシロース等が使用できるが、特に限定されない。

本明細書における「凍結保存液」とは、細胞を凍結保存する際に細胞を懸濁するのに使用される溶液のことをいい、好ましくは水溶液である。なお、「本発明の凍結保存液」は後述するとおり，上記アスコルビン酸誘導体を含有する溶液であるが、単に「凍結保存液」とのみ記載された場合は，本発明の凍結保存液のみならず本発明の凍結保存液ではないものも含まれる。

本発明の「接着性幹細胞製剤」とは、接着性幹細胞を主成分とする製剤であれば特に限定されず、その用途も、治療や予防といった医療用途の他、研究・試験用途であってもよく、またこれら用途に使用される細胞製品を製造するための中間原料（セルストックなど）であってもよい。

[２]本発明の接着性幹細胞の凍結保存工程
本発明は、接着性幹細胞を０．５～７ｍＭのアスコルビン酸誘導体を含有する溶液で凍結保存する工程を少なくとも１回有する接着性幹細胞製剤の製造方法である。すなわち、本発明の製造方法では、０．５～７ｍＭのアスコルビン酸誘導体を含有する溶液を凍結保存液として使用する。本発明の凍結保存液は、０．５～７ｍＭのアスコルビン酸誘導体を含有する溶液であれば特に限定されないが、好ましくは、アスコルビン酸誘導体を水又は水溶液に溶解させたものである。この場合用いられる水溶液としては、例えば、緩衝液、等張液、低張液、高張液などが例示でき、組織へのダメージ低減の観点で、緩衝液や等張液がより好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）やアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）などの平衡塩類溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、生理食塩液などの輸液、培養液などが好ましい例として挙げられる。

本発明の凍結保存液におけるアスコルビン酸誘導体の濃度は０．５～７ｍＭであれば特に限定されないが、好ましくは１．０ｍＭ以上、より好ましくは１．２ｍＭ以上、さらに好ましくは２ｍＭ以上、さらにより好ましくは３ｍＭ以上であり、上限としては、好ましくは５ｍＭ以下の範囲で細胞の品質がより向上する。

本発明の凍結保存液には、アスコルビン酸誘導体の他に、凍結保護剤をさらに含有するのが好ましい。

上記凍結保護剤としては特に限定されないが、ジメチルスルホキシドが好ましい。本発明の凍結保存液にジメチルスルホキシドを添加する場合の濃度は特に限定されないが、好ましくは２体積％以上、より好ましくは４体積％以上であればより高い凍結保護効果を示し、好ましくは１０体積％以下、さらに好ましくは８体積％以下、より好ましくは６体積％以下であれば細胞毒性をより軽減することができる。

本発明の凍結保存液には、凍結保護剤としてヒドロキシエチルデンプンをさらに添加してもよい。この場合のヒドロキシエチルデンプンの濃度は特に限定されないが、４質量％以上が好ましい。さらに好ましくは１０％質量以下、より好ましくは８質量％以下であれば凍結保存液の粘性を低下させ、操作性を向上することができる。

本発明の凍結保存液には、凍結保護剤としてヒト血清アルブミンをさらに添加してもよい。その濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは３．５質量％以上であり、上限は好ましくは５質量％以下である。この範囲であれば、品質がより向上する。

本発明の製造方法において、接着性幹細胞を、本発明の凍結保存液に懸濁する方法は特に制限されない。アスコルビン酸誘導体や必要に応じて凍結保護剤やその他の成分を含む凍結保存液を調製し、そこに接着性幹細胞を直接に懸濁しても良いし、凍結保護剤などを含有する水溶液とアスコルビン酸誘導体を含む細胞懸濁液を任意の割合で混合することで、本発明の範囲内となる溶液となるよう調整することもできる。なおここで凍結保護剤などを含有する水溶液として、市販の凍結保存液を使用することも出来る。

上記凍結保存液中の細胞濃度（終濃度）は特に制限されないが、好ましくは２×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、より好ましくは５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であれば、本発明の凍結保存液による品質向上効果がより有効に発揮される。また、生産性の効率の観点からは、細胞濃度の下限は５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であるのが好ましい。

本発明の製造方法において、接着性幹細胞を上記凍結保存液に懸濁してから凍結を開始するまでの時間は特に制限されないが、凍結を開始するまでの時間が好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、よりさらに好ましくは６時間以内であれば、解凍後の細胞の品質をより向上させることができる。下限は特に限定されず、製造工程で許容される範囲で短い方が好ましいが、本発明の凍結保存液を使用した場合、０．５時間程度であれば、細胞の生存率や品質を問題ない程度に良好に維持することができる。

本発明の製造方法において、凍結保存は、例えば、プログラムフリーザーによる緩慢凍結法や、ディープフリーザーによる簡易式凍結法により行うことができる。プログラムフリーザーによる緩慢凍結法においては、例えば－１～－３℃／ｍｉｎに計画された速さで冷却を開始することができる。一方、簡易式凍結法においては、例えば、細胞懸濁液を充填したクライオバイアルや凍結バッグを、細胞凍結用容器や発泡スチロール容器に入れた状態でディープフリーザーに入れて緩慢凍結させることができる。また、上記凍結方法で凍結した後に、細胞を液体窒素中に移動させて保存してもよい。。凍結保存するために細胞懸濁液を充填する容器としては、Ｎｕｎｃクライオチューブ１．８ｍＬインナーキャップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、バーコード付き内ネジクライオジェニックバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、フローズチューブＴー１．５（ニプロ社製）、フローズバッグ（ニプロ社製）などを挙げることができるが、特に限定されない。簡易式凍結法に用いる細胞凍結容器としては、例えば、ＢＩＣＥＬＬ（日本フリーザー株式会社製）やＣｏｏｌＣｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いることができる。

なお、本発明の凍結保存液を使用する凍結保存を行った接着性幹細胞は、解凍後にそのまま使用してもよく、また解凍後に１回以上の培養を行った後に接着性幹細胞製剤としてもよく、また凍結した状態で接着性幹細胞製剤として販売または医療機関等に提供しても良い。本発明の目的と効果を十分に発揮する観点においては、本発明の凍結保存液を使用する凍結保存工程は、細胞製剤の製造の中間工程で実施されるのが好ましい。また、本発明の凍結保存液を使用する凍結保存工程は、接着性幹細胞製剤の製造工程において複数回実施してもいい。

本発明の製造方法において凍結保存する期間は、本発明の効果にほとんど影響を与えないことから、工程上所望する任意の凍結保存期間を選択することができる。従って特に限定されないが、例えば１日以上、２日以上、３日以上、１週間以上、１０以上、２０日以上、１ヶ月以上であり、例えば、５年以下、３年以下、２年以下、１年以下、６ヶ月以下である。

本発明の製造方法において、上記凍結保存方法によって凍結保存された接着性幹細胞の解凍方法は、例えば、３５～３７℃に温めた湯浴に、凍結された細胞が充填された容器を入れることによって実施することができる。また、細胞解凍装置を用いて解凍してもよく、細胞解凍装置としては、例えば、ＴｈａｗＳＴＡＲ (ＢＩＯＬＩＦＥＳＯＬＵＴＩＯＮＳ製)、ＶＩＡＴｈａｗＣＢ１０００（ｃｙｔｉｖａ社製）、凍結細胞融解装置ＹＳシリーズ（ストレックス株式会社）を用いることができる。

[３]本発明の接着性幹細胞製剤の製造方法
本発明の接着性幹細胞製剤の製造方法は、前記接着性幹細胞の凍結保存工程を有することを特徴とし、その他の条件および構成は何ら制限されない。例えば、本発明の接着性幹細胞製剤の製造方法は、上述した接着性幹細胞の凍結保存工程以外に任意の工程として、細胞集団取得工程、培養工程等を含むことができる。

本発明の製造方法において、上記細胞集団取得工程は、例えば、羊膜などの胎児付属物や脂肪組織を酵素処理することにより、接着性幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程であってもよい。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。あるいは、上記の細胞集団取得工程は、脂肪組織を生体より吸引または切除して得る工程を含む工程でもよい。さらに、上記の細胞集団取得工程は、接着性幹細胞を含む生体試料を洗浄する工程を含むものでもよい。

本発明における接着性幹細胞を含む細胞集団は、好ましくは胎児付属物から採取した上皮細胞層と接着性幹細胞層とを含む生体試料または脂肪組織を酵素で処理して得た細胞集団である。

例えば、具体的には、胎児付属物から採取した生体試料（好ましくは上皮細胞層と接着性幹細胞層とを含む生体試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。

コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、上限も特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（ＰｒｏｔｅａｓｅＵｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ－ｃｏｌｌａｇｅｎ１ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。

金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、特に限定されないが、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、上限は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（ＰｒｏｔｅａｓｅＵｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。

生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼと金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を処理することが好ましい。さらに好ましくは、前記組み合わせによって胎児付属物を同時一括に処理するのがよい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼの両方を含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、接着性幹細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。

胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、羊膜の細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。スターラー又はシェーカーを用いた場合の撹拌速度の下限は、特に限定されないが、あまりに攪拌速度が遅いと酵素処理効率が低下するため、好ましくは５ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍである。上限は、特に限定されないが、攪拌速度が速すぎると細胞に損傷を与えうるため、好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍである。酵素処理時間の下限は、特に限定されないが、短すぎる場合には十分に羊膜に含まれる接着性幹細胞を分離できないため、好ましくは３０分、さらにより好ましくは４５分である。また、酵素処理時間の上限は、特に限定されないが、長すぎる場合は分離した細胞の生存率が低下する可能性があるため、好ましくは６時間、より好ましくは３時間、さらにより好ましくは９０分である。酵素処理温度の下限は、特に限定されないが、効率よく酵素反応を進行させるために、好ましくは１５℃、より好ましくは２５℃、さらにより好ましくは３５℃である。また、酵素処理温度の上限は、特に限定されないが、温度が高すぎると接着性幹細胞の死滅や、酵素の失活が引き起こされるため、好ましくは４０℃である。

羊膜以外の組織から接着性幹細胞を分離する場合も、上記の方法に準じて，あるいは公知の方法で分離することができる。

本発明の製造方法において、所望により、遊離した接着性幹細胞を含む酵素溶液から、フィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により、遊離した接着性幹細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した接着性幹細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した接着性幹細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、６０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１８０μｍ以下、１６０μｍ以下、１４０μｍ以下、１２０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、接着性幹細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。

メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。

接着性幹細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。

フィルターを通した接着性幹細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、生理食塩液、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。

本発明の接着性幹細胞製剤の製造方法における培養工程は、上記工程で得られた接着性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程であっても良いし、別の方法で得られた接着性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程であっても良い。

上記接着性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程における細胞の播種密度は、特に限定されないが、例えば５００～１０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種することができる。前記播種密度の下限としては、好ましくは５５０細胞／ｃｍ^２、より好ましくは７５０細胞／ｃｍ^２、さらにより好ましくは１，０００細胞／ｃｍ^２である。また、前記播種密度の上限としても、特に限定されないが、好ましくは７，０００細胞／ｃｍ^２、さらにより好ましくは５，０００細胞／ｃｍ^２である。

なお、上記培養する工程は、継代工程を含んでもよいし、異なる培養条件で複数回培養を繰り返す工程を含んでもよい。

上記１回の培養の培養期間としては、例えば２～１５日間を挙げることができ、より具体的には、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または１５日間を挙げることができる。

上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。なお、前記基礎培地に増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えて、さらに添加することにより調製してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加することで調製してもよい。

基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ／ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。好ましい基礎培地としてはαＭＥＭ培地が例示できる。また、市販の各種の無血清培地も使用できる。無血清培地としては、例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰＭＳＣＭｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇｓｔｅｍｇｒｏヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられる。

基礎培地に添加し得る他の成分としては例えば、アルブミン、ウシ血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられ、その中でも血清代替試薬が好ましく、特に血小板溶解物が好ましい。なかでも、血清代替試薬を含み、且つ、アルブミン、ウシ血清及び増殖因子を含まない基礎培地中で培養を行うことが好ましい。血小板溶解物の培地中の濃度の下限としては、例えば、終濃度として１体積％以上、好ましくは２体積％以上、より好ましくは３体積％以上を挙げることができる。また、血小板溶解物の培地中の濃度の上限としては例えば、２０体積％以下、好ましくは１０体積％以下、より好ましくは７体積％以下が好ましい。

接着性幹細胞を含む細胞集団の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ_２濃度、３７℃環境にて、上述したような培地を用いて培養する。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。

上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、細胞剥離手段にて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ_２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回、好ましくは２回である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、２０回、１０回であることが好ましい。上記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を使用することができるが、特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。

本発明の接着性幹細胞製剤の製造方法において、上記培養工程は、任意の回数実施することができる。また本発明の凍結保存液を使用する凍結保存工程との組み合わせについても自由である。例えば、上記細胞集団取得工程で得られた接着性幹細胞の細胞集団を培養した後、本発明の凍結保存液を用いて凍結保存を行い、その後再び培養工程を実施しても良いし、培養工程と凍結保存工程を複数回繰り返しても良い。

[４]細胞治療剤
本発明の製造方法で製造した接着性幹細胞製剤は、難治性疾患に対する治療剤の有効成分として利用が可能である。すなわち本発明の製造方法で製造した接着性幹細胞製剤を有効成分とする細胞治療剤も、本発明の一態様である。なお、本発明の製造方法で製造した接着性幹細胞製剤をさらに培養したものを本発明の細胞治療剤の有効成分として利用することも出来る。

本発明の細胞治療剤は、免疫関連疾患、筋ジストロフィー症、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤として利用することが可能である。

本発明の細胞治療剤は、製薬上許容し得る媒体により希釈したものでもよい。上記の製薬上許容し得る媒体は、患者又は被験者に投与し得る溶液であれば特に限定されない。製薬上許容し得る媒体は、輸液製剤であってもよく、例えば、注射用水、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、アミノ酸液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）、Ｐｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ（登録商標）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

本明細書における「患者又は被験者」とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（カニクイザル、アカゲザル、コモンマーモセット、ニホンザル）、フェレット、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター）等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書における「治療」としては、例えば、患者又は被験者の生命予後、機能予後、生存率、体重減少、貧血、下痢、下血、腹痛、発熱、食欲低下、栄養失調、嘔吐、疲労、発疹、炎症、潰瘍、びらん、瘻孔、狭窄、腸閉塞、内出血、直腸出血、痙攣、疼痛、肝機能低下、心機能低下、肺機能低下、運動機能、筋力低下、又は血液検査項目のうち、少なくとも１つを有意に改善することが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の細胞治療剤は、患者又は被験者の治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。上記の成分としては、例えば、塩類（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩）やそれを含む水溶液（例えば、生理食塩液、リンゲル液、ビカネイト輸液）、多糖類（例えば、ヒドロキシルエチルデンプン、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ジメチルスルホキシド、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明の細胞治療剤は、保存安定性、等張性、吸収性及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。前記増粘剤としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の濃度は、選択される増粘剤によるが、患者又は被験者に投与した場合に安全であり、かつ所望の粘性を達成する濃度の範囲で、任意に設定することができる。

本発明の細胞治療剤は、接着性幹細胞以外に、１つ又は複数の他の医薬成分を含んでもよい。上記の他の医薬成分としては、例えば、抗生物質、アルブミン製剤、ビタミン製剤、抗炎症剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。上記の抗炎症剤としては、５－アミノサリチル酸製剤、ステロイド製剤、免疫抑制剤、生物学的製剤等が挙げられるが、これらに限定されない。上記の５－アミノサリチル酸製剤としては、例えば、サラゾスルファピリジン、メサラジンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記のステロイド製剤としては、例えば、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記の免疫抑制剤としては、例えば、タクロリムス、シクロスポリン、メトトレキサート、アザチプリン、６－メルカプトプリンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記の生物学的製剤としては、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、セクキヌマブ、イキセキズマブ、ブロダルマブ、トシリズマブ、ベドリズマブ、フィルゴチニブ、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴル、アバタセプト、エタネルセプトなどを挙げることができるが、これらに限定されない。

また、上記の他の医薬成分は、投与可能な他の細胞であってもよい。投与可能な他の細胞としては、血液由来細胞（白血球、赤血球、単核球等）、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周皮細胞、血管壁細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞、上皮細胞、間質細胞、成熟脂肪細胞等が挙げられるが、特に限定されない。

本発明の細胞治療剤のｐＨは、中性付近のｐＨ、例えば、ｐＨ５．５以上、６．５以上又はｐＨ７．０以上とすることができ、またｐＨ１０．５以下、ｐＨ９．５以下、ｐＨ８．５以下又はｐＨ８．０以下とすることができるが、これらに限定されない。

本発明の細胞治療剤における接着性幹細胞の濃度としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の濃度である。具体的な細胞濃度は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。本発明の細胞治療剤の細胞濃度の下限は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０^５個／ｍＬ以上、１．０×１０^６個／ｍＬ以上、１．２×１０^６個／ｍＬ以上、１．４×１０^６個／ｍＬ以上、１．６×１０^６個／ｍＬ以上、１．８×１０^６個／ｍＬ以上、２．０×１０^６個／ｍＬ以上、３．０×１０^６個／ｍＬ以上、４．０×１０^６個／ｍＬ以上、５．０×１０^６個／ｍＬ以上、６．０×１０^６個／ｍＬ以上、７．０×１０^６個／ｍＬ以上、８．０×１０^６個／ｍＬ以上、９．０×１０^６個／ｍＬ以上、９．５×１０^６個／ｍＬ以上、又は１．０×１０^７個／ｍＬ以上である。本発明の細胞治療剤の細胞濃度の上限は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０^１０個／ｍＬ以下、１．０×１０^９個／ｍＬ以下、８．０×１０^８個／ｍＬ以下、６．０×１０^８個／ｍＬ以下、４．０×１０^８個／ｍＬ以下、２．０×１０^８個／ｍＬ以下、又は１．０×１０^８個／ｍＬ以下である。

本発明の細胞治療剤は、好ましくは液剤であり、より好ましくは注射用液剤である。注射用液剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／０４３１３６号公報、特開２０１３－２５６５１０号公報などにおいて、注射に適した液体調製物が知られている。本発明の細胞治療剤も、上記文献に記載されている注射用液剤とすることができる。

また、上記液剤は細胞の懸濁液でもよく、細胞が液剤中に分散した液体調製物でもよい。さらに前記液剤に含まれる細胞の形態は特に限定されないが、例えばシングルセルでもよいし、細胞凝集塊でもよい。なお、上記液剤は、言うまでもなく、塗布用や貼付用や噴霧用としても使用できる。

また、本発明の一態様によれば、本発明の細胞治療剤は、移植用製剤であってもよい。移植用製剤は、固体状またはゲル状の製剤であり、例えば、固体状の移植用製剤としては、シート状構造またはペレット構造の移植用製剤が挙げられる。また、ゲル状構造の移植用製剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１７／１２６５４９号公報において、分離された細胞を接着剤（例えば、フィブリノーゲン）により接着させることにより得られるゲルを含む移植用製剤が知られている。また、本発明の一態様によれば、本発明の細胞治療剤は、細胞と任意のゲルを混合したゲル製剤であってもよい。ゲル製剤としては、例えば、特表２０１７－５２９３６２号公報において、接着性幹細胞－ヒドロゲル組成物より構成される細胞治療剤が知られている。本発明の細胞治療剤も、例えば上記文献に記載されている方法を用いることにより、ゲル製剤とすることができる。

また、シート状構造の移植用製剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２００６／０８０４３４号公報、特開２０１６－５２２７２号公報などにおいて、温度応答性培養皿（例えば、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（セルシード社製））を用いて培養することにより得られる細胞シートや、シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体、細胞懸濁液をシート状の基材に塗布した細胞塗布シートなどが知られている。本発明の細胞治療剤も、例えば上記文献に記載されている方法を用いることにより、各種のシート状構造の移植用製剤とすることができる。

本発明の細胞治療剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射、局所への直接注射、直接貼付、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。本発明の一態様によれば、注射用液剤を注射器に充填して、注射針やカテーテルを通じて静脈内、動脈内、心筋内、間節腔内、肝動脈内、筋肉内、硬膜外、歯肉、脳室内、皮下、皮内、腹腔内、門脈内に投与することができるが、これらに限定されない。細胞治療剤の投与方法については、例えば、特開２０１５－６１５２０号公報、ＯｎｋｅｎＪＥ，ｔａｌ．ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ２００６ＬａｓＶｅｇａｓ，ＮＶ，Ａｂｓｔｒａｃｔ１２１．、Ｇａｒｃｉａ－ＯｌｍｏＤ，ｅｔａｌ．ＤｉｓＣｏｌｏｎＲｅｃｔｕｍ２００５；４８：１４１６－２３．などにおいて、静脈内注射、点滴静脈注射、局所への直接注射、局所への直接移植などが知られている。本発明の細胞治療剤も、上記文献に記載されている各種方法により投与することができる。

本発明の細胞治療剤の用量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な用量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、特に限定されないが、例えば、１×１０^４個／ｋｇ体重以上、１×１０^５個／ｋｇ体重以上、５×１０^５個／ｋｇ体重以上、１×１０^６個／ｋｇ体重以上、２×１０^６個／ｋｇ体重以上、４×１０^６個／ｋｇ体重以上、６×１０^６個／ｋｇ体重以上、又は８×１０^６個／ｋｇ体重以上である。また、ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、特に限定されないが、例えば、１×１０^１２個／ｋｇ体重以下、１×１０１１個／ｋｇ体重以下、１×１０１０個／ｋｇ体重以下、１×１０^９個／ｋｇ体重以下、５×１０^８個／ｋｇ体重以下、１×１０^８個／ｋｇ体重以下、８×１０^７個／ｋｇ体重以下、６×１０^７個／ｋｇ体重以下、４×１０^７個／ｋｇ体重以下、又は２×１０^７個／ｋｇ体重以下である。

本発明の細胞治療剤が注射用液剤である場合、注射用液剤のヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、疾患に対する治療効果を高める観点から、１×１０^５個／ｋｇ体重以上、５×１０^５個／ｋｇ体重以上、１×１０^６個／ｋｇ体重以上、２×１０^６個／ｋｇ体重以上、４×１０^６個／ｋｇ体重以上、６×１０^６個／ｋｇ体重以上、又は８×１０^６個／ｋｇ体重以上であることが好ましい。また、注射用液剤のヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、注射用液剤の調製と投与を容易にする観点から、１×１０^９個／ｋｇ体重以下、５×１０^８個／ｋｇ体重以下、１×１０^８個／ｋｇ体重以下、８×１０^７個／ｋｇ体重以下、６×１０^７個／ｋｇ体重以下、４×１０^７個／ｋｇ体重以下、又は２×１０^７個／ｋｇ体重以下であることが好ましい。

本発明の細胞治療剤の投与頻度は、患者又は被験者に投与した場合に、疾患に対して治療効果を得ることができるような頻度である。具体的な投与頻度は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができるが、例えば、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回である。

本発明の細胞治療剤の投与期間は、患者又は被験者に投与した場合に、疾患に対して治療効果を得ることができるような期間である。具体的な投与期間は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができるが、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、又は８週間である。

本発明の細胞治療剤を患者又は被験者に投与するタイミングは、特に限定されないが、例えば、発症直後、発症からｎ日以内（ｎは１以上の整数を示す）、診断直後、診断からｎ日以内（ｎは１以上の整数を示す）、寛解の前、寛解の間、寛解の後、再燃の前、再燃の間、再燃の後などが挙げられる。

以下の実施例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（比較例１）
＜工程1：羊膜の酵素処理及び接着性幹細胞の回収＞
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦から、羊膜を含む卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した後に、２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて６０分間、１０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、接着性幹細胞を含む細胞懸濁液を回収した。

＜工程２：接着性幹細胞の培養、回収＞
工程１で得られた、接着性幹細胞を含む細胞集団を培養容器の７５ｃｍ^２Ｕ字型カントネック細胞培養フラスコ（ベントキャップ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種し、終濃度が５体積％のヒト血小板溶解物を含むαＭＥＭを用いて培養した。細胞がサブコンフルエントに達するまで培養を行ったのちに、トリプシンーＥＤＴＡ溶液を用いて細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を生理食塩水で洗浄した。

＜工程３：凍結保存液への細胞の懸濁＞
工程２で得た接着性幹細胞を生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。１０体積％ジメチルスルホキシド、１２質量％ヒドロキシエチルデンプン、８質量％ヒト血清アルブミンを含む溶液（Ａ）を別途調製し、細胞懸濁液と１：１の割合で混合した。

＜工程４：凍結＞
工程４で調製した細胞懸濁液と溶液（Ａ）の混合液を１ｍＬずつＮｕｎｃクライオチューブ１．８ｍＬインナーキャップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に充填した。その後すぐに、上記混合液を充填したクライオバイアルをＣｏｏｌＣｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に入れた状態で、－８０℃のディープフリーザーに２４時間静置して凍結した。凍結後は液体窒素保管容器内に細胞を移し、液体窒素液相中で１０日間保存した。

（比較例２）
工程３において接着性幹細胞を２ｍＭのＬーアスコルビン酸ナトリウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（比較例３）
工程３において接着性幹細胞を８ｍＭのＬーアスコルビン酸ナトリウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（比較例４）
工程３において接着性幹細胞を１０ｍＭのＬーアスコルビン酸ナトリウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（比較例５）
工程３において接着性幹細胞を０．４ｍＭのＬーアスコルビン酸ー２ーリン酸エステルマグネシウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（実施例１）
工程３において接着性幹細胞を２ｍＭのＬーアスコルビン酸ー２ーリン酸エステルマグネシウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（実施例２）
工程３において接着性幹細胞を８ｍＭのＬーアスコルビン酸ー２ーリン酸エステルマグネシウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（実施例３）
工程３において接着性幹細胞を１０ｍＭのＬーアスコルビン酸ー２ーリン酸エステルマグネシウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

（実施例４）
工程３において接着性幹細胞を４ｍＭのＬーアスコルビン酸ー２ーリン酸エステルマグネシウム塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）を含有する生理食塩水に懸濁して、細胞濃度２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製する以外は、比較例１と同様の操作を行った。

下記の表１には各凍結保存液に添加した抗酸化剤の種類とその終濃度を記載した。

（凍結保存液の生存率評価）
上記の実施例１～３及び比較例１～４の凍結保存後の接着性幹細胞を、３７℃湯浴にて解凍し、解凍後２２℃温度条件下に静置し、解凍後０、３、２０、２６時間における各接着性幹細胞の生存率を測定した。０時間の生存率を１００％とした際の解凍後３、２０、２６時間の相対生存率について表２および図１に示した。表２及び図１に示すように、実施例１～３では２６時間経過後においても生存率の低下が１～４％の範囲に抑えられていたが、比較例１～４では９％以上の生存率の低下がみられた。この結果より、実施例の凍結保存液は比較例と比べて毒性の低い凍結保存液であることが示された。

（増殖性評価）
上記の実施例４及び比較例１、５の凍結保存液を用いて凍結した接着性幹細胞の解凍後の比増殖速度を評価した。具体的には、まず凍結した接着性幹細胞を３７℃の湯浴で解凍し、Ｕ型フラスコ７５ｃｍ^２カントネックベントキャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１０００生細胞／ｃｍ^２の密度で細胞用培地を用いて播種した。１４８時間培養後に、フラスコ内に接着している接着性幹細胞を回収し、回収細胞数を測定し、下記の式を用いて比増殖速度を求めた（ｎ＝３）。

比増殖速度（ｈ^－１）＝ＬＮ（回収細胞数／播種生細胞数）／総培養時間

得られた結果を図２に示す。図２の＊は比較例１に対して有意水準０．０５で有意差があることを示し、図２の結果より、実施例４の凍結保存液で凍結した接着性幹細胞の増殖性は、比較例１の凍結保存液で凍結した接着性幹細胞の増殖性よりも高いことが示された。

（接着性評価）
上記の実施例４及び比較例１、５の凍結保存液を用いて凍結した接着性幹細胞の解凍後の接着率を評価した。具体的には、まず凍結した接着性幹細胞を３７℃の湯浴で解凍し、１５ｃｍディッシュに４×１０^６生細胞／ディッシュで細胞用培地を用いて播種した。２２時間培養後に、ディッシュに接着している接着性幹細胞を回収し、回収細胞数を測定し、下記の式を用いて接着率を求め、得られた結果を表３と図３に示した。

接着率（％）＝回収細胞数／（４×１０^６生細胞）×１００

表３及び図３に示すように、実施例４の凍結保存液で凍結した接着性幹細胞の接着率は、比較例１、５の凍結保存液で凍結した接着性幹細胞の接着率よりも高いことが示された。

Claims

接着性幹細胞を、０．５～７ｍＭのアスコルビン酸誘導体及び２～１０体積％のジメチルスルホキシドを含有する溶液中で凍結保存する工程を有する、接着性幹細胞製剤の製造方法。
前記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸リン酸エステルまたはその塩である、請求項１に記載の製造方法。
前記溶液中に、さらにヒドロキシエチルデンプンを４～１０質量％含有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
前記溶液中に、さらにヒト血清アルブミンを０．１～５質量％含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
前記接着性幹細胞が羊膜由来細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法により得られる接着性幹細胞製剤を有効成分として含む、細胞治療剤。