JP7842773B2 - 抗癌治療のためのウイルスベクター由来標的タンパク質及びそれと特異的に結合する結合分子又はその断片 - Google Patents

Description

本発明は、ウイルスベクターに基づいた抗癌治療のための標的タンパク質、及びその標的タンパク質と特異的に結合する結合分子又はその断片に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質Ａ５６の構造的エピトープ、及びその構造的エピトープと特異的に結合する結合分子又はその断片に関する。

癌は、腫瘍とも呼ばれ、体組織の自律過成長により異常に成長した細胞を指す。癌発生率は、現代社会における、高齢化する人口、喫煙人口の増加、アルコール消費の増加、西洋化した食習慣、及び環境汚染により、増加し続けている。

癌を治療する方法には、手術、放射線療法、化学療法などが挙げられる。詳細には、手術は、癌性組織を身体から除去する治療方法であり、初期癌、又は病変がある特定の位置に限定される癌に対して非常に効果的である。しかしながら、病変の周りの組織に浸潤しており、又はリンパ節に転移している癌を除去することは難しく、そのような癌は再発の可能性が高い。この場合、放射線療法又は化学療法が手術と併用して用いられる。放射線療法又は化学療法は、進行性又は末期癌の治療に主に用いられる；しかしながら、この治療もまた、正常細胞に影響し、それゆえに、重篤な有害効果を引き起こす。

その一方で、遺伝子組換え技術の本格的使用を以て、腫瘍選択性及び抗癌効力が増加した腫瘍溶解性ウイルスを用いる臨床研究が、開始された。文献で報告された最初の組換え腫瘍溶解性ウイルスは単純ヘルペスウイルスであった。それ以後、他のウイルスを用いる腫瘍溶解に関する研究は、積極的に行われている。

その中でも、ワクシニアウイルスを用いることにより得られたチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子欠損ワクシニアウイルスに関する研究が行われている；しかしながら、臨床的有用性にもかかわらず、そのウイルスは、狭い治療濃度域のために、それらの臨床効果を最大限にすることに限界がある。ＴＫ欠損ワクシニアウイルスについて、狭い治療濃度域は、高いウイルス用量が高い臨床効力を有するが、ウイルスの毒性による臨床リスクを伴うことがあることを意味する。この問題を克服するために、そのようなウイルスにおいて、ＴＫ遺伝子の欠失と共に、タンパク質Ａ５６などの非必須タンパク質をコードする遺伝子領域を欠失させることにより、治療効果の増加及び毒性の減少を引き起こす研究が行われている（Ｉｚｍａｉｌｙａｎ Ｒ、Ｃｈａｎｇ Ｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００８ Ｏｃｔ；８２（２０）：１００７９～８７）。

最近、免疫細胞治療が癌治療方法として活発に研究されている。免疫細胞治療は、癌細胞を殺害するのに患者の免疫細胞を用いる点で既存の治療方法とは異なる。詳細には、免疫細胞治療は、免疫細胞が患者から取得され、増殖性細胞又は癌細胞を特異的に攻撃するように活性化され、その後、患者の身体へ戻される方法である；そして、この方法は、薬物誘発性有害効果を最小限にしながら抗癌効果を最大限にする。

この５年間にわたって、免疫チェックポイント阻害剤が、癌を治療する免疫療法として活発に研究されてきた。特に、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、及びＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイントに対する阻害剤が研究されてきた。イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ニボルマブ（抗ＰＤ－１）、及びペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１）などの免疫チェックポイント阻害剤が、いくつかの型の癌の治療として規制当局により認可されている。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤は、メラノーマ、肺癌、頭頚部癌、腎臓癌、及び膀胱癌などのある特定の型の癌を有する患者の治療として限定的に使用される。

加えて、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（以下、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、様々な型の血液癌に対して優れた治療効果を示した。しかしながら、固形癌について、ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて臨床的に成功した症例はほとんど報告されていない。それに関係した理由には、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍への輸送及び浸潤の困難、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続及び増殖の問題、並びに治療効果が不適な腫瘍微小環境のために発揮されないＣＡＲ－Ｔ細胞の限界が挙げられる；しかしながら、最も大きい制限は、腫瘍において特異的に発現する適切な標的抗原の欠如によって重篤な安全性の問題が生じることである。実際、固形癌についてのＣＡＲ－Ｔ細胞の臨床開発に用いられる標的抗原の大部分は、腫瘍において過剰発現し、また正常細胞においても低レベルで発現している。この理由により、ＣＡＲ－Ｔ細胞がまた正常細胞と結合し、深刻な毒性問題を引き起こす場合が報告されている。このオンターゲットオフ腫瘍の毒性問題を克服するために、腫瘍特異性、高く且つ均一な適用範囲、及び発現安定性の条件を満たす標的抗原が必要とされる。しかしながら、３つ全ての条件を満たす固形癌標的抗原は、現在、ほとんど存在しない。したがって、安全且つ効果的な様式で固形癌を標的とする能力がある癌細胞標的化方法に関する継続的な研究及び開発の必要性がある。

Ｉｚｍａｉｌｙａｎ Ｒ、Ｃｈａｎｇ Ｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００８ Ｏｃｔ；８２（２０）：１００７９～８７

したがって、本発明者らは、癌、特に、固形癌を安全且つ効果的に標的とするか又は治療する方法を開発するために研究してきた。結果として、本発明者らは、様々な癌腫について、ワクシニアウイルスタンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有するベクターの注射により癌細胞が治療される場合、タンパク質Ａ５６が、癌細胞表面に腫瘍特異的且つ安定的様式で発現していることを見出した。加えて、タンパク質Ａ５６又はその断片と結合する複数の抗体について、本発明者らは、それらのＡ５６との結合を分析した。結果として、本発明者らは、その抗体が、それらのエピトープ配列が完全には同一ではなく、固有であるにもかかわらず、Ａ５６との結合を交差阻害することを見出した。その後、本発明者らは、Ａ５６との結合を決定する構造的エピトープを同定しており、そのような構造的エピトープと結合する結合分子が、癌細胞の負荷を減少させることに優れた効果を発揮することを見出しており、それにより、本発明を完成させた。

本発明の態様において、Ａ５６の構造的エピトープ又はその断片と特異的に結合する結合分子又はその断片であって、構造的エピトープが、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み、（ｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における４４位のアミノ酸から５０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸から５９位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における８５位のアミノ酸から９０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、又は（ｉｖ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における９１位のアミノ酸から９４位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性若しくは求核性アミノ酸をさらに含む、結合分子又はその断片が提供される。

本発明の別の態様において、結合分子又はその断片を対象に投与するステップを含む、対象において癌細胞の負荷を減少させる方法が提供される。

本発明のさらに別の態様において、結合分子又はその断片を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

本発明のなおさらに別の態様において、結合分子又はその断片及び腫瘍溶解性ウイルスを含む、癌を予防又は治療するためのキットが提供される。

本発明のなおさらに別の態様において、癌の治療のための結合分子又はその断片の使用が提供される。

本発明による、Ａ５６の構造的エピトープと結合するＡ５６結合分子又はその断片は、Ａ５６との特異的な構造的結合を形成し、Ａ５６に対する高い親和性を示す。本発明者らは、ワクシニアウイルスに基づいた腫瘍溶解性ウイルスが投与された場合、Ａ５６が様々な癌腫において癌細胞表面に発現していることを見出した。本発明によるＡ５６結合分子又はその断片は、癌細胞表面に特異的に発現しているＡ５６を効果的に標的とし、腫瘍溶解性ウイルスの感染でさえも生き延びている癌細胞についての標的化された治療を可能にし、それにより、効果的な抗癌治療を提供する。例えば、本発明によるＡ５６結合分子はそれ自体、腫瘍溶解性ウイルスの感染でさえも生き延びている癌細胞の効果的な標的化を可能にする。加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療などの癌免疫療法に用いられる場合、Ａ５６結合分子は、Ａ５６を発現する癌細胞に対して特異的に、活性化及び増殖能力の増加を示し、且つその癌細胞へ優れた細胞毒性効果を発揮する。したがって、Ａ５６結合分子は、Ａ５６を発現する癌細胞に対する効果的な抗癌治療を提供することができる。本発明によるＡ５６結合分子を用いる癌免疫療法は、好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスと併用して用いられ、追加として、腫瘍溶解性ウイルスの抗癌効果を増強する能力がある薬物（例えば、ヒドロキシウレア、リンパ球除去を制御するための化学療法剤（例えば、シクロホスファミド及びフルダラビン）、又は免疫治療剤）と併用して用いられてもよい。本明細書で用いられる場合、他に指示がない限り、表現「併用して」は、任意の順序で時間間隔を置いて実施される問題の治療剤／作用物質の投与と、同時に実施される治療剤／作用物質の投与の両方を含む。

ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６）、又はヒトメラノーマ細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－５）を、タンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの感染に供し、その後、各細胞株の細胞表面でのタンパク質Ａ５６の発現の存在又は非存在を免疫蛍光染色で同定することにより得られた結果を示す図である。 ヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６）を、タンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの感染に供し、その後、感染したＨＣＴ－１１６細胞株の細胞表面でのタンパク質Ａ５６の発現の存在又は非存在を免疫蛍光染色で同定することにより得られた結果を示す図である。 ヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６）移植マウスを、タンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの腹腔内投与に供し、その後、各組織の表面でのタンパク質Ａ５６の発現を同定することにより得られた結果を示す図である。 正常なウサギを、タンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの血管内投与に供し、その後、各組織の表面でのタンパク質Ａ５６の発現を同定することにより得られた結果を示す図である。 マウス腎癌細胞株（Ｒｅｎｃａ）移植マウスを、タンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内投与に供し、その後、７日目、１０日目、及び１４日目に腫瘍組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現を同定することにより得られた結果を示す図である。 マウス腎癌細胞株（Ｒｅｎｃａ）移植マウスを、ヒドロキシウレア、及びタンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内投与に供し、その後、７日目、１０日目、及び１４日目に腫瘍組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現を同定することにより得られた結果を示す図である。 マウス腎癌細胞株（Ｒｅｎｃａ）移植マウスを、ヒドロキシウレア、及びタンパク質Ａ５６をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスの２回目の投与に供し、その後、２１日目、２４日目、及び２８日目に腫瘍組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現を同定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６及びその断片についての実施形態を示す図である。 タンパク質Ａ５６又はその断片が細胞内及び細胞表面に発現しているかどうかを同定することにより得られた結果を示す図である。 Ｆｃ融合型Ａ５６融合タンパク質の発現レベルを同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体とＡ５６の間の親和性を測定することにより得られた結果を示す図である。 抗体Ａ５６－０１Ａ０２～Ａ５６－０２Ｂ０６の生産性を同定することにより得られた結果を示す図である。 抗体Ａ５６－０１Ａ０２～Ａ５６－０２Ｂ０６の生産性を示すグラフである。 抗体Ａ５６－０２Ｄ０４～Ａ５６－５９Ｅ１２の生産性を同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において作製された抗Ａ５６抗体を精製し、その後、これらの抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す図である。 ワクシニアウイルス株に依存するタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列の相同性を比較することにより得られた結果を示す図である。 １０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）のタンパク質Ａ５６との結合能力を測定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６を市販の抗Ａ５６抗体と反応させ、その後、ウェスタンブロッティングを実施した後に撮影された写真を示す図であり、その抗体は、抗Ａ５６抗体が構造的エピトープを有するかどうかを決定するための対照として用いられた。 タンパク質Ａ５６を１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）のそれぞれと反応させ、その後、ウェスタンブロッティングを実施した後に撮影された写真を示す図である。 抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１３）を高質量ＭＡＬＤＩで分析することにより得られた結果を示す図である。 抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１６）を高質量ＭＡＬＤＩで分析することにより得られた結果を示す図である。 抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１８）を高質量ＭＡＬＤＩで分析することにより得られた結果を示す図である。 抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ０１）を高質量ＭＡＬＤＩで分析することにより得られた結果を示す図である。 抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１９）を高質量ＭＡＬＤＩで分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６を５つのタンパク質分解酵素（トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びサーモリシン）で処理し、その後、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ（質量分析）分析を実施することにより得られた結果を示す図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）が結合する、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ上のエピトープ位置、及びタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのモデル化構造を示す図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）が結合する、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ上のエピトープ位置、及びタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのモデル化構造を示す図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）が結合する、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ上のエピトープ位置、及びタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのモデル化構造を示す図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）が結合する、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ上のエピトープ位置、及びタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのモデル化構造を示す図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）が結合する、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ上のエピトープ位置、及びタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのモデル化構造を示す図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、４０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における５６位のセリンに対応する）。 ５個の抗体（Ａｂ１３、Ａｂ１６、Ａｂ１８、Ａｂ０１、Ａｂ１９）のタンパク質Ａ５６へのエピトープマッピングの結果を要約することにより得られた図である。ここで示されているようなＡ５６におけるアミノ酸ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。 タンパク質Ａ５６を３Ｄタンパク質構造へモデル化し、その後、その構造をｉＣｎ３Ｄで分析することにより得られた図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）上のパラトープ位置、及びその抗体とタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓの結合により形成されるモデル化構造を示す図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）上のパラトープ位置、及びその抗体とタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓの結合により形成されるモデル化構造を示す図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）上のパラトープ位置、及びその抗体とタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓの結合により形成されるモデル化構造を示す図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）上のパラトープ位置、及びその抗体とタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓの結合により形成されるモデル化構造を示す図である。 抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）上のパラトープ位置、及びその抗体とタンパク質Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓの結合により形成されるモデル化構造を示す図である。 タンパク質Ａ５６におけるＫ９１とＡｂ１３における重鎖のＴ５２との間の水素結合の形成、及び測定された結合距離を示す図である。 タンパク質Ａ５６におけるＳ６２とＡｂ１３における重鎖のＫ５７との間の水素結合の形成、及び測定された結合距離を示す図である。 一次抗体（ＳＡ２０３８、Ａｂ１３、Ａ５６－０２Ａ０２）をＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原固定化バイオセンサー（ＮＴＡ）と飽和状態まで結合させ、９個の抗体での処理を実施し、その後、そのような抗体のバイオセンサーとの追加の結合が起こるかどうかを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法で分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１３との間の結合親和性（Ｋ_Ｄ）をＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡで測定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１６の結合及びその測定された距離を示す図である。 一次抗体（ＳＡ２０４１、Ａｂ１６、Ａ５６－０２Ｂ０８）をＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原固定化バイオセンサー（ＮＴＡ）と飽和状態まで結合させ、９個の抗体での処理を実施し、その後、そのような抗体のバイオセンサーとの追加の結合が起こるかどうかをＳＰＲ方法で分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１６との間の結合親和性（Ｋ_Ｄ）をＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡで測定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６におけるＳ６２とＡｂ１８における重鎖のＲ９８との間の水素結合の形成、及び測定された結合距離を示す図である。 タンパク質Ａ５６におけるＫ９１とＡｂ１８における軽鎖のＹ３２との間の水素結合の形成、及び測定された結合距離を示す図である。 一次抗体（ＳＡ２０４３、Ａｂ１８、Ａ５６－０２Ｃ０６）をＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原固定化バイオセンサー（ＮＴＡ）と飽和状態まで結合させ、９個の抗体での処理を実施し、その後、そのような抗体のバイオセンサーとの追加の結合が起こるかどうかをＳＰＲ方法で分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１８との間の結合親和性（Ｋ_Ｄ）をＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡで測定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ０１の結合、及びその測定された距離を示す図である。 一次抗体（ＳＡ２０２６、Ａｂ０１、Ａ５６－０１Ａ０２）をＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原固定化バイオセンサー（ＮＴＡ）と飽和状態まで結合させ、９個の抗体での処理を実施し、その後、そのような抗体のバイオセンサーとの追加の結合が起こるかどうかをＳＰＲ方法で分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ０１との間の結合親和性（Ｋ_Ｄ）をＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡで測定することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１９の結合、及びその測定された距離を示す図である。 一次抗体（ＳＡ２０４４、Ａｂ１９、Ａ５６－０２Ｃ０７）をＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原固定化バイオセンサー（ＮＴＡ）と飽和状態まで結合させ、９個の抗体での処理を実施し、その後、そのような抗体のバイオセンサーとの追加の結合が起こるかどうかをＳＰＲ方法で分析することにより得られた結果を示す図である。 タンパク質Ａ５６とＡｂ１９との間の結合親和性（Ｋ_Ｄ）をＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡで測定することにより得られた結果を示す図である。 本発明の実施形態において構築されたキメラ抗原受容体の構造の概略図である。 ＨｅＬａ細胞株を５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の単独又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ－４１２）との併用での投与に供した場合に観察された細胞毒性を比較することにより得られた結果を示す図である。 ＮＣＩ－Ｈ５２２細胞株を５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の単独又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ－４１２）との併用での投与に供した場合に観察された細胞毒性を比較することにより得られた結果を示す図である。 ＨＣＴ－１１６細胞株を５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の単独又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ－４１２）との併用での投与に供した場合に観察された細胞毒性を比較することにより得られた結果を示す図である。 ５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定することにより得られた結果を示す図である。 Ａ５４９細胞株又はＨＣＴ－１１６細胞株をＵＴＤ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞の単独又は腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ－４１２）との併用での投与に供した場合に観察された細胞毒性を表す結果を示す図である。 腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ－４１２）に感染したＨＣＴ－１１６細胞株をＵＴＤ及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ）の投与に供し、その後、死細胞の染色を実施した後に撮影された写真を示す図である。 腫瘍溶解性ウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）に感染したＨＣＴ－１１６細胞株をＵＴＤ及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ）の投与に供し、その後、死細胞の染色を実施した後に撮影された写真を示す図である。

以下、本発明が詳細に記載される。

本発明の態様において、Ａ５６の構造的エピトープ又はその断片と特異的に結合する結合分子又はその断片であって、構造的エピトープが、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み、（ｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における４４位のアミノ酸から５０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸から５９位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における８５位のアミノ酸から９０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、又は（ｉｖ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における９１位のアミノ酸から９４位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性若しくは求核性アミノ酸をさらに含む、結合分子又はその断片が提供される。

本明細書で用いられる場合、用語「Ａ５６」は、ポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスが宿主細胞に感染した後、該ウイルスの遺伝子においてコードされるＡ５６、Ａ５６Ｒ、又はＨＡで表される遺伝子（例えば、遺伝子ＩＤ：３７０７６５２）から翻訳されたタンパク質を指す。タンパク質Ａ５６又はその断片は、配列番号１～１５から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸は、配列番号１６～３１から選択されるいずれか１つの塩基配列を含み得る。本発明において、タンパク質Ａ５６は、「ＵＴＴＡ」と交換可能に用いられ得る。

詳細には、タンパク質Ａ５６は、野生型タンパク質Ａ５６又はそのバリアントであり得る。野生型タンパク質Ａ５６は、配列番号１又は１２で表されるアミノ酸配列を有し得る。加えて、野生型タンパク質Ａ５６をコードする核酸は、配列番号１６又は２８で表される塩基配列であり得る。

加えて、タンパク質Ａ５６バリアントは、タンパク質Ａ５６のように癌細胞表面に位置し得る限り、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されていてもよい。タンパク質Ａ５６バリアントをコードする塩基配列は、配列番号１又は１５で表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得、最も好ましくは、配列番号１又は１５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得る。特に、タンパク質Ａ５６バリアントは、配列番号１３又は１５で表されるアミノ酸配列を含み得る。タンパク質Ａ５６バリアントをコードする核酸は、配列番号２９又は３１で表される塩基配列を含み得る。

タンパク質Ａ５６断片は、配列番号２～１４から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。加えて、断片をコードする核酸は、配列番号２～１４から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列であり得る。詳細には、配列番号２～１４から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列は、それぞれ、述べられた順序で、配列番号１７～３１により表され得る。

加えて、タンパク質Ａ５６断片をコードする塩基配列は、配列番号２～１４から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得、最も好ましくは、配列番号２～１４から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得る。

本発明による結合分子は、Ａ５６と特異的に結合する能力を有する生物学的分子を指し、その代表的な例には、抗体又はキメラ抗原受容体を挙げることができる。より詳細には、本発明による結合分子は、癌細胞表面に露出したＡ５６と特異的に結合することができ、この能力は、癌細胞の抗癌治療、特に、二次抗癌治療としての、腫瘍溶解性ウイルスの感染でさえも生き延びている癌細胞の効果的な標的化を可能にする。加えて、結合分子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療などの癌免疫療法において用いられる場合、それ自体優れた細胞毒性効果を発揮し、それゆえに、癌の効果的な治療を可能にする。

構造的エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の３次元フォールディングのために隣接していないアミノ酸を含み得る。詳細には、構造的エピトープは、独立空間の３次元構造において、少なくとも２個、５個、８個、１０個、又は１１個のアミノ酸を含み得る。

抗原／抗体結合に関与する抗原のいくつかのアミノ酸残基はエピトープと呼ばれ、エピトープを認識する、抗体の特異的な部分は、パラトープと呼ばれる。どのようにパラトープを結合するかに依存して、エピトープは、約４個～約１２個の連続したアミノ酸の配列からなる線状エピトープ、及び非連続アミノ酸の配列からなる構造的エピトープへ大きく分けられる。構造的エピトープの場合、抗原／抗体結合は、フォールディング構造で３次元的に生じる。したがって、構造的エピトープは、結合に関与するアミノ酸残基の範囲が比較的幅広く且つ複雑である。それゆえに、たとえ抗原の構造又はその部分的配列が知られていても、抗原と３次元的に結合するモノクローナル抗体を予測又は模倣することは難しい。抗原のエピトープが線状であるか又は構造的であるかは、抗原を変性させ、その後、抗体をそれと結合させることにより、ウェスタンブロット分析を通して、同定することができる。線状エピトープの場合、たとえ試料（抗原）が変性されていても、抗体はエピトープと結合することができる。しかしながら、構造的エピトープの場合、抗原が変性されている場合、抗体がそのエピトープと３次元的に結合することは困難又は不可能であり、したがって、予想された分子量に対応するバンドは検出されない。

構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み得、（ｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における４４位のアミノ酸から５０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸から５９位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、（ｉｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における８５位のアミノ酸から９０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、又は（ｉｖ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における９１位のアミノ酸から９４位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性若しくは求核性アミノ酸をさらに含み得る。

配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６は、好ましくは、合計８つのシート（緑色）、４つのヘリックス（赤色）、及び７つのループ（青色）からなる以下の二次構造的配置をとり得る（しかしながら、構造的配置は、このようである必要はない）：
４１位のアミノ酸から４３位のアミノ酸までの領域：ヘリックス１及び２
４４位のアミノ酸から５０位のアミノ酸までの領域：シート３
５１位のアミノ酸から５２位のアミノ酸までの領域：ループ
５３位のアミノ酸から５９位のアミノ酸までの領域：シート４
６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域：ループ
６４位のアミノ酸から６６位のアミノ酸までの領域：シート５
６７位のアミノ酸から７４位のアミノ酸までの領域：ループ
７５位のアミノ酸から７８位のアミノ酸までの領域：シート６
７９位のアミノ酸から８０位のアミノ酸までの領域：ループ
８１位のアミノ酸から８３位のアミノ酸までの領域：ヘリックス３
８４位のアミノ酸：ループ
８５位のアミノ酸から９０位のアミノ酸までの領域：シート７
９１位のアミノ酸から９４位のアミノ酸までの領域：ループ
９５位のアミノ酸から９７位のアミノ酸までの領域：ヘリックス４
９８位のアミノ酸：ループ
９９位のアミノ酸から１０５位のアミノ酸までの領域：シート８
（シート１及び２は示されていない）

求核性アミノ酸は、求電子性側鎖との共有結合性反応を起こしやすい求核性側鎖を有するアミノ酸を指し、例えば、システイン（Ｃ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、又はチロシン（Ｙ）であり得る。塩基性アミノ酸は、側鎖が塩基性を示し、且つアミノ酸が中性ｐＨ領域において解離している場合、側鎖が（＋）電荷を有するアミノ酸を指し、例えば、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、又はリジン（Ｋ）であり得る。

本発明によるＡ５６の構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み得、（ｉｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における８５位のアミノ酸から９０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、及び（ｉｖ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における９１位のアミノ酸から９４位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み得る。

詳細には、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、求核性アミノ酸である６２位のセリン（Ｓ６２）、６６位のチロシン（Ｙ６６）、８７位のスレオニン（Ｔ８７）、９１位のリジン（Ｋ９１）、及び９２位のセリン（Ｓ９２）を含み得る。より詳細には、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、５４位（Ｓ５４）、６２位（Ｓ６２）、６６位（Ｙ６６）、８６位（Ｔ８６）、８７位（Ｔ８７）、９１位（Ｋ９１）、９２位（Ｓ９２）、９４位（Ｔ９４）、９６位（アルギニン、Ｒ９６）、１００位（Ｔ１００）、及び１０１位（Ｙ１０１）のアミノ酸を含み得る。加えて、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、６２位（Ｓ６２）、６６位（Ｙ６６）、７１位（Ｔ７１）、７２位（Ｋ７２）、７６位（Ｓ７６）、８７位（Ｔ８７）、９１位（Ｋ９１）、及び９２位（Ｓ９２）のアミノ酸を含み得る。

加えて、本発明によるＡ５６の構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における６０位のアミノ酸から６３位のアミノ酸までの領域に存在する塩基性又は求核性アミノ酸を含み得、（ｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における４４位のアミノ酸から５０位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸、及び（ｉｉ）タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸から５９位のアミノ酸までの領域に存在する求核性アミノ酸を含み得る。

詳細には、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、求核性アミノ酸である４６位のアミノ酸（Ｓ４６）、５４位（Ｓ５４）、及び６１位（Ｋ６１）を含み得る。より詳細には、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、４６位（Ｓ４６）、５４位（Ｓ５４）、６１位（Ｋ６１）、９１位（Ｋ９１）、及び１００位（Ｔ１００）のアミノ酸を含み得る。加えて、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、４６位（Ｓ４６）、４９位（Ｙ４９）、５４位（Ｓ５４）、６１位（Ｋ６１）、６２位（Ｋ６２）、及び７１位（Ｔ７１）のアミノ酸を含み得る。

加えて、構造的エピトープは、配列番号１で表されるタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列における、６１位（Ｋ６１）及び６２位（Ｓ６２）のアミノ酸を含み得る。

Ａ５６と高親和性で結合する複数の異なる抗体の結合特性に関する分析を実施した。結果として、Ａ５６の６１位又は９１位の塩基性アミノ酸（Ｋ６１、Ｋ９１）が、共通して、結合において重要な役割を果たすことが見出された。詳細には、Ｋ６１又はＫ９１は、各Ａ５６抗体のパラトープに存在する求核性アミノ酸と強い水素結合を形成し、そのような結合が進行するにつれて、抗体の重鎖及び軽鎖は、フォールディングされて、収縮フォールディングを引き起こし、その収縮フォールディングが、残りの抗原－抗体結合を生じさせる。別々には、Ｋ６１又はＫ９１はまた、そのすぐ隣に位置する求核性アミノ酸であるセリン（Ｓ６２、Ｓ９２）に影響を及ぼすことにより、抗原－抗体結合に寄与し得る。詳細には、Ｋ６１又はＫ９１は、そのすぐ隣に位置するＳ６２又はＳ９２のヒドロキシル基を励起させて、静電力を発生させ、したがって、Ｓ６２又はＳ９２もまた、抗体との強い結合に能動的に寄与すると考えられている。

結合分子又はその断片は、Ａ５６との結合について、以下の抗原結合分子のうちの１つ又は複数がＡ５６と結合できないように妨げることにより、競合し得る。そのような競合的結合は、それらがＡ５６についての結合部位（エピトープ）を共有することを意味する。結合分子又はその断片は、Ａ５６との結合について、以下の抗体のうちの１つ又は複数と競合し得る：
配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ１３）；
配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ１６）；
配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ１８）；
配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ０１）；
配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ１９）；
配列番号６２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ０３）；
配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ０８）；
配列番号７４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号７７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ１４）；
配列番号８０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号８３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ５１）；並びに
配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号８９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体（例えば、Ａｂ５５）。

「結合について競合する」とは、抗体又は他の抗原結合部分が、標準競合的結合アッセイにおいて、他の抗体又は抗原結合部分の特定の抗原との結合に干渉する能力を有することを意味する。抗体又は他の抗原結合部分が別の抗体又は抗原結合部分の特定の抗原との結合に干渉することができる能力又は程度、及び、したがって、本発明によれば交差競合するということができるかどうかは、標準競合結合アッセイを用いて決定することができる。一つの適したアッセイとして、相互作用のレベルが表面プラズモン共鳴技術を用いて測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術を用いることが挙げられる。交差競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づいたアプローチを用いる。交差競合に基づいて抗体を「エピトープビニング」するためのハイスループット方法は、国際公開第２００３／４８７３１号に記載されている。

Ａ５６抗体は、それらのエピトープ配列が完全には同一ではないにもかかわらず、Ａ５６との結合を交差阻害することが同定された。これは、Ａ５６結合分子とＡ５６との間に形成される特異的な高次構造、すなわち、Ａ５６の構造的エピトープが、Ａ５６との結合にとって重要であることを意味する。特に、抗体Ａｂ１９は、他のＡ５６抗体より相対的に低い程度でＡ５６との結合を阻害する。しかしながら、抗体Ａｂ１９は、それでもなお、他のＡ５６抗体のＡ５６との結合を著しく阻害した。抗体Ａｂ１９とＡ５６との間の結合の分析により、Ａ５６におけるＫ６１及びＳ６２においてのみ強い抗原－抗体結合が示されている。これは、Ａ５６におけるＫ６１及びＳ６２（又は類似した静電気的性質を示すＫ９１及びＫ９２）などのアミノ酸の配列がＡ５６との特異的結合にとって重要であり、他の追加の構造的エピトープが、Ａ５６とのより強い結合に寄与することを示唆する。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、抗原と結合し、且つ抗原の作用に干渉し、又は抗原を除去する免疫タンパク質を指す。５つの型の抗体：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥがあり、それらのそれぞれが、重鎖定常領域遺伝子μ、δ、γ、α、又はεから産生される重鎖を含有する。抗体技術において、ＩｇＧが主に用いられる。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の４つのアイソタイプを含み、そのアイソタイプのそれぞれが、異なる構造的及び機能的性質を有し得る。

ＩｇＧは、２つの重鎖（約５０ｋＤａ）タンパク質及び２つの軽鎖（約２５ｋＤａ）タンパク質から構成される非常に安定なＹ形の構造（分子量：約１５０ｋＤａ）を形成する。抗体は、軽鎖及び重鎖を有し、各鎖は、アミノ酸配列が抗体によって異なる可変領域、及びアミノ酸配列が抗体の間で同じである定常領域へ分けられる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含む。そのドメインのそれぞれは２つのβシートからなり、これらのドメインは、分子内ジスルフィド結合によって連結されている。重鎖及び軽鎖における２つの可変領域は、一緒に会合して、抗原結合部位を形成する。その部位は、Ｙ形上の２つのアームのそれぞれに存在する。Ｙ形において、抗原と結合することができる部分は、抗体結合断片（Ｆａｂ）と呼ばれ、抗原と結合しない部分は、結晶性断片（Ｆｃ）と呼ばれる。Ｆａｂ及びＦｃは、可動性ヒンジ領域によって接続されている。

本明細書で用いられる場合、用語「ＣＤＲ」は、抗原と結合する部位を指し、その部位は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に存在する超可変領域であり、且つその部位のアミノ酸配列は、抗体によって異なる。抗体の３次元構造を見ると、ＣＤＲは、抗体表面にループの形をとる。そして、そのループの下方に、ＣＤＲを構造的に支えるフレームワーク領域（ＦＲ）がある。重鎖及び軽鎖のそれぞれは、３つのループ構造を有し、これらの６つのループ領域構造は、お互いに会合して、抗原と直接接触する。６つのループ領域構造上の抗原結合部位は、便宜上、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５、及びＣＤＲ６と呼ばれる。

加えて、抗体断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）_２、及びＦｖからなる群から選択されるいずれか１つであり得る。その抗体断片は、細胞、補体などへ抗原結合刺激を伝達するエフェクター機能を有する結晶性領域（Ｆｃ領域）を除く、抗原結合ドメインを指し、単一ドメイン抗体又はミニボディなどの第３世代抗体断片を含み得る。

加えて、抗体断片は、以下の利点を有する：抗体断片は、完全な構造を有するＩｇＧよりサイズが小さく、その結果として、組織又は腫瘍への侵入の向上を生じ；かつ抗体断片を、細菌内で産生させることができ、そのことは、製造コストを減少させる。加えて、抗体断片は、Ｆｃをもたず、したがって、細胞、補体などへ抗原結合刺激を伝達する機能が望まれない場合に用いられる。抗体断片は、ヒト身体において短い半減期を有し、したがって、インビボ診断法に適している。しかしながら、抗体を構成するアミノ酸の中にあるいくつかの塩基性、酸性、又は中性アミノ酸の置き換えが、抗体の固有の等電点（ｐＩ）を変化させ得る。抗体のそのような等電点の変化は、抗体のインビボ毒性副作用を減少させること、又は抗体の水溶性を増加させることなどの変化を誘導し得る。したがって、治療用抗体について、完全な構造を有するＩｇＧは、親和性又は構造の形を考慮して、用いることができる。

抗体は、公知のモノクローナル抗体作製技術により容易に作製することができる。モノクローナル抗体を作製する方法は、免疫化動物から取得されたＢリンパ球を用いてハイブリドーマを調製することにより実施され得、又はファージディスプレイ技術を用いることにより実施され得る。しかしながら、本発明は、それらに限定されない。

抗体又はその断片は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部として用いることができる。詳細には、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、抗体又はその断片は、抗原結合ドメインとして用いることができる。

抗原結合ドメインは、抗原と結合する抗体の領域を指す。抗原結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片であり得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗原結合断片であり得る。加えて、抗原結合断片は、抗体内にある１つの重鎖及び１つの軽鎖をジスルフィド結合によって連結することにより形成される、１つの抗原結合部位を有する断片であり得る。抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びＦａｂ’からなる群から選択されるいずれか１つであり得る。好ましくは、抗原結合断片はｓｃＦｖであり得る。すなわち、抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり得る。

膜貫通ドメインは、細胞膜に位置するタンパク質の構造において、抗原が結合するドメインと、細胞内シグナルを伝達するドメインとを接続し、細胞膜を貫通する領域を指す。そして、膜貫通ドメインは、細胞膜に位置するタンパク質を細胞膜に繋ぎ止めることができる。膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、及びＰＤ－１からなる群から選択されるいずれか１つに由来し得る。特に、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来し得る。

細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞表面に存在する抗原受容体（抗原結合ドメイン）が細胞外抗原を認識した場合、シグナルを細胞へ伝達して、細胞活性化、細胞毒性因子放出、サイトカイン産生、及び増殖などの応答を誘導する領域を指す。加えて、一般的に、１つの抗原受容体（抗原結合ドメイン）のみを通して伝達されたシグナルは、細胞活性化には不十分であり、したがって、二次又は共刺激シグナルが必要とされる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン並びに二次シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含み得る。特に、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み得る。

共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される少なくとも１つの分子に由来し得る。特に、共刺激ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来し得る。

一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄに由来し得る。特に、Ｔ細胞について、シグナルは、ＣＤ３の鎖γ、δ、ε、又はζを通して細胞へ伝達される。そして、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を作製する場合、ＣＤ３の鎖γ、δ、ε、又はζが、一次シグナル伝達ドメインとして用いられ得る。特に、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来し得る。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、作製され得る。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られ且つ利用可能な様々な確立された技術のいずれかを用いて、調製され、操作され、発現し、及び送達され得る。Ｔ細胞表面に所望のキメラ抗原受容体を発現するために、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、適切なベクターへ挿入され得る。

ベクターについては、当技術分野において知られた様々なベクターを用いることができる。抗原受容体を産生することを意図された宿主細胞の型に依存して、プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列、膜標的化又は分泌のための配列などが、目的に従って様々な方法で、適切に選択されて、組み合わせられ得る。詳細には、ベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられるが、それらに限定されない。適切なベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーなどの発現制御エレメントに加えて、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、目的に従って様々な方法で構築することができる。

ベクターを免疫細胞へ導入するために、当技術分野において知られた方法を用いることができる。例えば、ベクターは、一過性トランスフェクション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、リン酸カルシウム沈澱法、リポソーム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、若しくは遺伝子銃を用いて、又は核酸を細胞へ導入する他の公知の方法を用いて、細胞へ導入され得る（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３～９６７、１９９２；Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１～１４６２４、１９８８）。しかしながら、本発明はそれらに限定されない。

形質導入された又はトランスフェクトされた免疫細胞は、ベクター導入後、増殖される。実施形態において、トランスフェクトされた免疫細胞は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間、好ましくは、１２～１４日間、インキュベートされることにより増殖され得る。

ベクターが免疫細胞へうまく導入されたかどうかを同定する方法には、例えば、当業者によく知られた分子生物学的アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、及びＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティング）による特定のペプチドの存在又は非存在の検出が挙げられる。

本発明によるＡ５６結合分子又はその断片は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合、約１．０ｎＭ（１×１０^－８）未満のＫ_Ｄ（Ｍ）の結合親和性でタンパク質Ａ５６と結合し得る。詳細には、結合分子又はその断片は、１×１０^－９未満、９×１０^－１０未満、又は８×１０^－１０未満のＫ_Ｄ（Ｍ）の、タンパク質Ａ５６との結合親和性を有し得る。本発明の実施形態において、その実施形態における結合分子は、７．３９×１０^－１０、２．２８×１０^－１０、１．９６×１０^－１０、４．９２×１０^－１０、及び４．３８×１０^－１０のＫ_Ｄ（Ｍ）の結合親和性を有すると決定された。

本発明において、タンパク質Ａ５６の新規の構造的エピトープを同定するために、実施形態におけるタンパク質Ａ５６の抗Ａ５６抗体との結合により形成された複合体の構造は、１．８Åの分解能で結晶化された（図６１Ａ～６５）。結果として、実施形態におけるタンパク質Ａ５６の新規の構造的エピトープ及び抗Ａ５６抗体のパラトープが同定され、表１に示されている。

結合分子又はその断片は、６．５Åの分子間距離内でタンパク質Ａ５６と結合し得る。結合分子又はその断片は、タンパク質Ａ５６とファンデルワールス結合、疎水結合、又は静電結合を形成し得る。

結合分子又はその断片は、腫瘍溶解性ウイルスと一緒に投与されることにより、癌細胞の負荷を減少させるために用いることができる。癌細胞の負荷は、癌細胞の重量、体積、又は数を指し得る。腫瘍溶解性ウイルスの感染でさえも生き延びている癌細胞は、細胞表面にタンパク質Ａ５６を発現する。したがって、本発明による、そのようなＡ５６と特異的に結合する結合分子又はその断片は、二次抗癌治療、又は二次抗癌治療のための標的化を可能にする。

腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスであってもよい。ワクシニアウイルスは、以下のワクシニアウイルス株のうちの１つであり得るが、それに限定されない：ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ニューヨーク市保健局（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ティアンタン（Ｔｉａｎ Ｔａｎ）、ＵＳＳＲ、タシケント（ＴａｓｈＫｅｎｔ）、エバンス（Ｅｖａｎｓ）、国際保健部－Ｊ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ）（ＩＨＤ－Ｊ）、及び国際保健部－ホワイト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ）（ＩＨＤ－Ｗ）。

腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失しているウイルスであり得る。特に、腫瘍溶解性ウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失している組換えワクシニアウイルスであり得る。

本明細書で用いられる場合、用語「チミジンキナーゼ（ＴＫ）」は、チミジンキナーゼと呼ばれ且つヌクレオチド生合成に関与する酵素を指す。ＴＫは、細胞とウイルスの両方においてヌクレオチド生合成に用いられる酵素である。ここで、細胞について、正常細胞はもはや分裂せず、したがって、そこにはＴＫは存在しない。そして、毛包細胞などの急速に分裂する細胞についてさえも、ＴＫは、ウイルスが利用するのに十分な量では存在しない。これらの観点から、ウイルスは、ＴＫ遺伝子を欠失させることにより、ＴＫが存在する癌細胞の存在下でのみ増殖することができ、その結果、癌細胞は選択的に殺害され得る。

腫瘍溶解性ウイルスは、タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有し得る。タンパク質Ａ５６又はその断片は、上記の通りである。タンパク質Ａ５６は、野生型タンパク質Ａ５６、又はそのタンパク質Ａ５６のバリアントであり得る。タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸は、野生型タンパク質Ａ５６又はそのタンパク質Ａ５６のバリアントをコードする核酸であり得る。腫瘍溶解性ウイルスは、ヒドロキシウレアと同時に、逐次的に、又は逆の順序で、同時投与されてもよい。

本発明の別の態様において、結合分子又はその断片を対象に投与するステップを含む、対象において癌細胞の負荷を減少させる方法が提供される。結合分子又はその断片は上記の通りである。

対象は、ヒトを含む哺乳動物であり得、非ヒト動物であってもよい。用語「非ヒト動物」は、任意の脊椎動物を指し、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含み得る。加えて、対象は、癌疾患、又は腫瘍溶解性ウイルスを投与することにより軽減、阻害、若しくは治療することができる状態での疾患を患っている対象を意味する。

結合分子又はその断片の投薬量は、対象の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の型、投与の経路及び期間に依存して異なり、当業者により適切に選択され得る。

結合分子又はその断片は、非経口的に投与することができ、そのような投与は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、節内、又は静脈内の投与などの任意の適切な方法により実施することができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内の投与が好ましくあり得る。

投与経路、投薬量、及び投与の頻度に関して、結合分子又はその断片は、対象の状態及び副作用の存在又は非存在に依存して、様々な方法及び量で対象に投与され得る；そして、そのための最適な投与経路、投薬量、及び投与の頻度は、当業者により適切な範囲内で選択され得る。加えて、結合分子又はその断片は、治療されるべき疾患に対する治療効果が知られている別の薬物若しくは生理学的活性物質と併用して、投与されてもよく、又は他の薬物との複合調製物の形をとって製剤化されてもよい。特に、結合分子又はその断片は、注射液の形で提供することができる。

本発明のさらに別の態様において、結合分子又はその断片を含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。結合分子又はその断片は上記の通りである。医薬組成物はヒドロキシウレアをさらに含んでもよい。

医薬組成物は、生理学的に許容される担体をさらに含んでもよい。加えて、医薬組成物は、医薬組成物の調製に一般的に用いられる適切な賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。加えて、医薬組成物は、通常の方法に従って、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、懸濁液、乳剤、シロップなどの経口用調製物、及びエアロゾル、外用調製物、坐剤、又は注射液の形に製剤化され、用いられてもよい。特に、抗癌剤は、注射液の形をとり得る。当技術分野において知られた適切な製剤は、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５）に開示された製剤であり得る。

医薬組成物は、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳癌、頭頚部癌、食道癌、皮膚癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫、及びそれらの組合せからなる群から選択される癌を予防又は治療するために意図され得る。

加えて、医薬組成物について、担体、賦形剤、及び希釈剤の例には、塩化ナトリウム、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどを挙げることができる。抗癌剤が製剤化される場合、その調製物は、一般的に用いられる、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、及び界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて作製され得る。

医薬組成物について、非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液、非水性溶媒、懸濁液、乳剤、凍結乾燥調製物、坐剤などを挙げることができる。非水性溶媒及び懸濁液について、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを用いることができる。坐剤の基剤として、ウイテプゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

癌は固形癌又は血液癌であり得る。詳細には、固形癌は、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳癌、頭頚部癌、食道癌、皮膚癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであり得る。加えて、血液癌は、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫、及びそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つであり得る。

本発明のなおさらに別の態様において、結合分子又はその断片及び腫瘍溶解性ウイルスを含む、癌を予防又は治療するためのキットが提供される。結合分子又はその断片及び腫瘍溶解性ウイルスは上記の通りである。キットは、ヒドロキシウレアをさらに含んでもよい。

腫瘍溶解性ウイルスの投薬量は、対象の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の型、投与の経路及び期間に依存して異なり、当業者により適切に選択され得る。投薬量は、患者が１×１０^５～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）における腫瘍溶解性ウイルスを受け取るような量であり得る。詳細には、投薬量は、患者が１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位、又はプラーク形成単位における腫瘍溶解性ウイルスを受け取るような量であり得、その上記で述べられた数値の間の様々な数値及び範囲もまた、それに含まれ得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与され得る。より好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０^５ｐｆｕ以上で且つ１×１０^９ｐｆｕ未満の用量で投与され得る。

腫瘍溶解性ウイルスは、非経口的に投与することができ、そのような投与は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、節内、又は静脈内の投与などの任意の適切な方法により実施することができる。これらの中でも、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内の投与が好ましくあり得る。

投与経路、投薬量、及び投与の頻度に関して、腫瘍溶解性ウイルスは、対象の状態及び副作用の存在又は非存在に依存して、様々な方法及び量で対象に投与され得る；そして、それらについての最適な投与経路、投薬量、及び投与の頻度は、当業者により適切な範囲内で選択され得る。加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、治療されるべき疾患に対する治療効果が知られている別の薬物若しくは生理学的活性物質と併用して、投与されてもよく、又は他の薬物との複合調製物の形をとって製剤化されてもよい。特に、腫瘍溶解性ウイルスは、注射液の形で提供することができる。

本発明のなおさらに別の態様において、癌の治療のための結合分子又はその断片の使用が提供される。

以下、本発明は、次の実施例を用いて、より詳細に記載される。しかしながら、次の実施例は、例証のみを目的とし、本発明の範囲はその実施例に限定されない。

Ｉ．タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有するベクターの構築、及びタンパク質Ａ５６の腫瘍細胞表面での発現の同定
調製１．１．タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有するベクターの構築
野生型タンパク質Ａ５６及びその断片をコードするプラスミドを構築するために、特定の領域を除去するためのプライマーを調製し、ＧＦＰと重複する領域を形成することにより、重複ＰＣＲを実施した。

調製１．２．タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの作製
タンパク質Ａ５６を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを作製するために、ＨｅＬａＳ３（ＡＴＣＣ）細胞株を、６ウェルプレートにウェルあたり４×１０^５個の細胞で播種し、その後、１０％のウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地中で調製した。ワイス株及びウェスタンリザーブ株の野生型ワクシニアウイルスのそれぞれでの処理を０．０５のＭＯＩで実施した。２時間後、培地を、２％のウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地と交換し、その後、レポーター遺伝子及び挿入のための遺伝子を含有するベクターを、その細胞へ、Ｘｆｅｃｔ試薬バッファーを用いて、トランスフェクトした。培養を４時間、実施した。引き続いて、培地を、２％のウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地と交換し、その後、細胞を７２時間、さらに培養した。最後に、感染した細胞を収集し、その後、凍結と解凍を３回、繰り返した。細胞を、超音波処理により溶解し、ショ糖クッション方法を用いて、タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する遊離腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２、ＷＯＴＳ－４１８）を得た。

参考例１．それぞれのワクシニアウイルス株についてのタンパク質Ａ５６の配列の比較
それぞれＴＫ領域が欠失したワクシニアウイルスであるワイス株のＯＴＳ－４１２及びウェスタンリザーブ株のＷＯＴＳ－４１８における膜タンパク質Ａ５６の遺伝子シーケンシングをＭａｃｒｏｇｅｎへ依頼した。ＯＴＳ－４１２及びＷＯＴＳ－４１８におけるタンパク質Ａ５６についてのそれぞれの配列に関して、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ及びＵｎｉｐｒｏｔを通してアライメントを実施した。結果として、１００％の同一配列は見出されなかった；特に、２４５～２５０位におけるアミノ酸が欠失していることが同定された。高い配列相同性を有する４つの他の株との比較を実施した。

実験的実施例１．癌細胞表面でのタンパク質Ａ５６の発現
調製実施例１．２において作製されたタンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いて、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６）、又はヒトメラノーマ細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－５）を感染させて、タンパク質Ａ５６が癌細胞表面に発現しているかどうかを同定した。

詳細には、Ａ５４９（肺癌腫、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）、ＨＣＴ－１１６（結腸直腸癌腫、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）、又はＳＫ－ＭＥＬ－５（ヒトメラノーマ、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）細胞株を、１２ウェルプレートのカバーグラス上にウェルあたり３．５×１０^４個の細胞で播種した。引き続いて、０．１のＭＯＩで腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを細胞に感染させ、その後、３７℃及び５％のＣＯ_２の条件で３０時間、インキュベートした。インキュベートされた細胞株のそれぞれを、収集した。その後、４％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、１％（ｖ／ｖ）のＢＳＡ、１：５００の比で希釈した抗Ａ５６一次抗体（カタログ番号ＡＢＩＮ１６０６２９４、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅ）、及び１：２００の比で希釈された二次抗体（Ａｌｅｘａ ５９４、カタログ番号Ａ２１２０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での処理を実施した。ＤＡＰＩ染色を実施した。その後、各細胞株の試料を、スライドグラス上に置き、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００）を用いて観察した。

結果として、タンパク質Ａ５６が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに感染したＡ５４９及びＨＣＴ－１１６細胞株の細胞表面に発現していることが同定された（図１及び２）。

実験的実施例２．マウス腫瘍組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現の同定（Ｉ）
癌誘導性マウスモデルを、調製実施例１．２において作製された、タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腹腔内投与に供して、タンパク質Ａ５６が組織表面に発現しているかどうかを同定した。

詳細には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＨＣＴ－１１６結腸直腸癌細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ、ＫＣＬＢ）を６．３×１０^６個の細胞を皮下移植し、癌を誘導した。平均腫瘍体積が１５０ｍｍ^３～２００ｍｍ^３に達した時、マウスを、調製実施例１．２において作製された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの２×１０^７ｐｆｕの用量での腹腔内投与に供した。その後、４日目、マウスを屠殺し、腫瘍組織、並びに脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、肝臓、及び脾臓組織をマウスから収集した。

タンパク質Ａ５６についての免疫蛍光染色を、実験的実施例１と同じ方法で実施した。ＤＡＰＩ染色を実施した。その後、各組織の試料を、スライドグラス上に置き、蛍光顕微鏡を用いて観察した。

結果として、タンパク質Ａ５６が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されたマウスにおいて腫瘍組織表面に発現していることが同定された。他方、脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、肝臓、及び脾臓組織においてタンパク質Ａ５６が発現していないことが同定された（図３）。これらの結果から、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与後、腫瘍組織表面に発現したタンパク質Ａ５６を標的とする結合分子が産生される場合、この抗体が抗癌免疫療法として利用できることが同定された。

実験的実施例３．ウサギ組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現の同定
調製実施例１．２において作製されたタンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの静脈内投与に正常ウサギを供して、タンパク質Ａ５６が組織表面に発現しているかどうかを同定した。このようにして、毒性リスクを分析した。

詳細には、ニュージーランドウサギを、調製実施例１．２において作製された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの１×１０^８ｐｆｕ又は１×１０^９ｐｆｕの用量での血管内投与に供した。その後、３週間目又は８週間目、ウサギを屠殺し、脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、肝臓、及び脾臓組織をウサギから収集した。

タンパク質Ａ５６についての免疫蛍光染色を、実験的実施例１と同じ方法で実施した。ＤＡＰＩ染色を実施した。その後、各組織の試料を、スライドグラス上に置き、蛍光顕微鏡を用いて観察した。

結果として、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されたウサギの心臓、肺、筋肉、腎臓、肝臓、及び脾臓組織においてタンパク質Ａ５６が発現していないことが同定された。

他方、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されたウサギの脳組織において蛍光反応が検出された。検出された蛍光反応が抗Ａ５６抗体の非特異的反応であるかどうかを同定するために、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されなかった正常ウサギの脳組織を、上記と同じ方法での免疫蛍光染色に供し、その後、脳組織における蛍光反応を、蛍光顕微鏡を用いてチェックした。

結果として、蛍光反応は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されなかったウサギの脳組織においてさえも検出された。この結果から、そのような蛍光反応は非特異的反応であることが同定された（図４）。

加えて、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを投与されなかった正常ヒトの脳組織（Ｐｕｓａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｙａｎｇｓａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｋｏｒｅａ）を上記と同じ方法での免疫蛍光染色に供した場合、蛍光顕微鏡を用いて、弱い蛍光反応が検出された。しかしながら、抗体が血液脳関門を通過しないという観点から、抗Ａ５６抗体は、その抗体が脳室中へ直接投与されない限り、非特異的反応を引き起こさないだろうことが決定される。

実験的実施例４．マウス腫瘍組織表面でのタンパク質Ａ５６の発現の同定（ＩＩ）
癌誘導性マウスモデルを、調製実施例１．２において作製された、タンパク質Ａ５６又はその断片をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルス及びヒドロキシウレアの同時投与に供して、タンパク質Ａ５６が組織表面に発現しているかどうかを同定した。

詳細には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、６．３×１０^６個のＲｅｎｃａ癌細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を皮下移植し、癌を誘導した。平均腫瘍体積が１５０ｍｍ^３～２００ｍｍ^３に達した時、マウスを、調製実施例１．２において作製された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの２×１０^７ｐｆｕの用量での腫瘍内投与、及びヒドロキシウレアの３０ｍｇ／ｋｇの用量での投与に供した。

作製された腎癌細胞移植マウスを、３つの群（ｎ＝４）へ分けた。食塩水の腫瘍内投与を受ける群を対照群として設定し、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（１×１０^７ｐｆｕ）単独の投与を受ける群、及び腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（１×１０^７ｐｆｕ）とヒドロキシウレア（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群を、実験群として設定した。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、０日目及び１４日目に２回、腫瘍内に投与し、ヒドロキシウレアを、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１日前から腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与後２１日目まで、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが投与される日を除いて、週６回、腹腔内に投与した。

腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの最初の投与後７日目、１０日目、及び１４日目にマウスを屠殺し、そのマウスから腫瘍組織を収集した。また、マウスを、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの２回目の投与後２１日目、２４日目、及び２８日目に屠殺し、そのマウスから腫瘍組織を収集した。タンパク質Ａ５６についての免疫蛍光染色を、実験的実施例１と同じ方法で実施した。ＤＡＰＩ染色を実施した。その後、各組織の試料をスライドグラス上に置き、蛍光顕微鏡を用いて観察した。

結果として、タンパク質Ａ５６が、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの最初の投与後７日目、１０日目、及び１４日目までに、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのみの投与を受けた群及び腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとヒドロキシウレアの同時投与を受けた群のマウスの腫瘍表面に明らかに発現していることが同定された（図５及び６）。

実験的実施例５．細胞表面でのタンパク質Ａ５６又はその断片の発現
タンパク質Ａ５６又はその断片をコードするプラスミドを用いて、ＨｅＬａ細胞株を処理して、タンパク質Ａ５６が細胞表面に発現しているかどうかを同定した。タンパク質Ａ５６の断片について、野生型タンパク質Ａ５６から特定の領域を除去するためのプライマーを調製し、ＧＦＰと重複する領域を形成することにより、重複ＰＣＲを実施した。

詳細には、ＨｅＬａ（子宮頚癌細胞、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）細胞株を、１２ウェルプレートのカバーグラス上にウェルあたり３．５×１０^４個の細胞で播種した。引き続いて、Ｘｆｅｃｔ反応バッファー及びＸｆｅｃｔポリマーと混合することにより希釈されたＡ５６断片についてのプラスミドを、ＨｅＬａ細胞株と共に、３７℃及び５％のＣＯ_２の条件で３０時間、インキュベートした。各インキュベートされた細胞株を収集した。その後、４％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、１％（ｖ／ｖ）のＢＳＡ、１：５００の比で希釈された抗Ａ５６抗体（カタログ番号ＡＢＩＮ１６０６２９４、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅ）、及び１：２００の比で希釈された二次抗体（Ａｌｅｘａ ５９４、カタログ番号Ａ２１２０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での処理を実施した。核をＤＡＰＩで染色し、ゴルジ装置を蛍光色素で染色した。その後、細胞株の試料をスライドグラス上に置き、共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００）を用いて観察した。その結果は、図８及び９並びに表２に示されている。

野生型Ａ５６（Ａ５６－Ｇ）及びＡ５６の６つの領域の部分的短縮により得られたＡ５６の断片を、細胞表面に発現させた。結果として、野生型Ａ５６（Ａ５６－Ｇ）、及びＩｇＶ様ドメインが短縮されているＡ５６－１２１のみが、細胞表面に達し、そこで発現していることが同定された。ＩｇＶ様ドメインが排除されているＡ５６バリアントの中で、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、ストーク領域、及びタンデムリピート領域が個々に又は組み合わせて短縮されているバリアントが、細胞膜に発現していないことが同定された。加えて、ＩｇＶ様ドメインを含む場合、膜貫通ドメインのみを含むバリアントでさえも細胞膜に発現していないことが同定された。すなわち、ＩｇＶ様ドメインが排除され、且つ５つの領域を含むバリアントが、細胞膜に発現していることが同定された。

ＩＩ．タンパク質Ａ５６又はその断片と結合する抗体の作製
調製実施例２．タンパク質Ａ５６の精製及び製造
ベクターＤＮＡ（Ｎ２９３Ｆ－Ａ５６－Ｃ－ＨＩＳ）を増幅し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞へ導入し、その細胞内で過剰発現させた。引き続いて、アフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ）により一次精製を実施し、その後、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により二次精製を実施した。このようにして、Ａ５６－Ｃ－ＨＩＳタンパク質が最終的に製造された（図１０）。

調製実施例３．タンパク質Ａ５６又はその断片と結合する抗体の作製（Ｉ）
タンパク質Ａ５６又はそのバリアント若しくは断片と特異的に結合する抗Ａ５６抗体の作製をＹｂｉｏｌｏｇｉｃｓに依頼した。ファージライブラリー技術を用いて６１個の抗体が作製され、そのＣＤＲを分析した。ファージライブラリーを、Ａ５６抗原でコーティングされたチューブへ加え、バイオパニングを実施して、結合ヒットを見出した。平均して３回の洗浄を実施することにより、特異的な結合を有するファージを選択した。３回のパニング工程を実施した。その後、親和性試験を実施し、高い親和性を示すコロニーを少量、採取して、コロニーが、実際の抗原に対して親和性を示すかどうかを同定した。相対的に高いヒット数を有するセットを選択し、採取及びヒット選択のために自動システムを用いた。

このようにして作製された抗Ａ５６抗体のそれぞれとタンパク質Ａ５６との間の親和性を測定した。その結果は図１１～１６に示されている。加えて、各抗Ａ５６抗体の生産性は図１７Ａ～１７Ｃに示されている。加えて、図１８～３４は、作製された抗Ａ５６抗体のそれぞれをＳＤＳ－ＰＡＧＥを通して同定することにより得られた結果を示す。

実験的実施例６．抗Ａ５６抗体についての親和性測定
イムノチューブの各ウェルを、タンパク質Ａ５６でコーティングし、その後、ブロッキング工程を実施した。ブロッキング工程後、１００ｎＭから開始する３倍段階希釈に供した抗体と、各ウェルを室温で所定時間、反応させた。その後、ＰＢＳでの洗浄を３回、実施し、その後、二次抗体での処理もまた、室温で所定時間、実施した。引き続いて、各抗Ａ５６抗体のタンパク質Ａ５６に対する親和性を、それぞれの濃度において測定した。

実験的実施例７．それぞれのワクシニアウイルス株についてのタンパク質Ａ５６の間でのアミノ酸配列相同性の比較
ワクシニアウイルス株、すなわち、コペンハーゲン、アンカラ（Ａｎｋａｒａ）、ウェスタンリザーブ（ＷＲ）、国際保健部－Ｊ（ＩＨＤ－Ｊ）、ティアンタン、及びワイス（ニューヨーク市保健局；ＮＹＣＢＯＨ）についてのタンパク質Ａ５６の間でのアミノ酸配列相同性の比較。結果として、図３５に示されているように、全ての株のタンパク質Ａ５６のアミノ酸配列において、３０位のアミノ酸から９０位におけるアミノ酸が同一であることが同定された。

ＩＩＩ．タンパク質Ａ５６の構造的エピトープの同定
実施例１．タンパク質Ａ５６上の線状エピトープと構造的エピトープとの区別
線状エピトープと構造的エピトープを区別するために、Ａ５６と結合する１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）についてウェスタンブロット分析を実施した。ヒトファージライブラリーから代表的な抗体として選択され、且つタンパク質Ａ５６と特異的に結合する６１個の抗体の中から、結合親和性に基づいて上位１０個の抗体を選択することにより１０個の抗Ａ５６抗体を得た（図３６）。

詳細には、ＨｅＬａ細胞株をＯＴＳ－４１２に感染させた；そして、２４時間後、Ｈｅｌａ細胞を、収集し、溶解して、全タンパク質を抽出した。そのタンパク質を、変性工程に供し、その後、電気泳動のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に負荷した。電気泳動後、そのタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写して、一次抗体である１０個の抗Ａ５６抗体、それぞれと反応させた。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ：Ｄｏｎｇｉｎｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、ツイーン２０：Ｓｉｇｍａ）での洗浄を実施した。引き続いて、そのタンパク質を、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ交差吸着処理済み、ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８６２４））と反応させた。再び、ＰＢＳＴでの洗浄を実施した。その後、発光試薬（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での処理を実施し、同定のためにイメージングシステム（化学発光イメージングシステム）を用いた。ここで、組換えタンパク質Ａ５６（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ、１．５６ｍｇ／ｍＬ）及び市販の抗Ａ５６抗体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号ＩＴ－０１２－００６Ｍ１）を、陽性対照群として用いた。

結果として、まず、図３７に示されているように、陽性対照群について、タンパク質Ａ５６が、８５ｋＤ～１００ｋＤのバンドに対応する分子量を有し、一方、１０個の抗Ａ５６抗体のほとんどは、陽性対照群より弱いバンドサイズ又は強度を有することが見出された（図３８）。特に、Ａｂ０３、Ａｂ０８、Ａｂ１３、Ａｂ１９、Ａｂ５１、Ａｂ５５、及びＡｂ１６について、小さいサイズを有する多くの弱いバンドが観察され、又はバンドが観察されなかった。バンドの欠如、又はサイズ及び強度が大きくないバンドは、エピトープが３次元的に形成されていることを意味する。

さらに、７個の抗Ａ５６抗体に関するエピトープマッピングについて、Ａｂ１８、Ａｂ１３、及びＡｂ１６を優先的にマッピングし、その後、２個の高結合性抗体（Ａｂ０１及びＡｂ１９）についてのエピトープを同定した。

実施例２．タンパク質Ａ５６、及び抗Ａ５６抗体のインタクトタンパク質の分析、並びに結合複合体の特徴づけ
エピトープマッピングの前に、それぞれの試料（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ、３個の抗体（Ａｂ１３、Ａｂ１６、Ａｂ１８）、及び抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１３、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１６、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１８）を、試料の完全性及び結合複合体の凝集の程度を分析するように特徴づけした。

詳細には、対照群のインタクト質量分析について、タンパク質Ａ５６及び抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３、Ａｂ１６、Ａｂ１８）のそれぞれを、各５μｌの量で混合した。その後、ＭＡＬＤＩプレート（ＳＣＯＵＴ ３８４）上に置かれた再結晶化シナピン酸マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）中で、混合物の１０μｌのうちの１μｌを、１：１比のアセトニトリル／水及び０．１％のＴＦＡ（Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ Ｋｉｔ）と混合し、室温で結晶化した。その後、分子量測定を、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（質量分析計）により３回、実施した。

ここでは、複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／抗Ａ５６抗体）の質量分析を、架橋高質量マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ、Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析計、Ｂｒｕｋｅｒ）により実施した。インタクト質量分析を実施した後に残っていた抗原－抗体結合複合体の９μｌを、架橋試薬（Ｋ２００安定剤、２ｍｇ／ｍｌ）の１μｌと混合し、室温で１８０分間、反応させた。その後、ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳを、標準窒素レーザーを用いて実施した（ＭＳ：リニア及びポジティブモード、イオン源１：２０ＫＶ、２：１７ｋＶ、レンズ：１２ｋＶ、パルスイオン抽出：４００ｎｓ；ＨＭ４：ゲイン電圧：３．１４ｋＶ、加速電圧：２０ｋＶ）。

結果として、対照群のピーク値とほとんど類似している分子量が、架橋により同定された試料において検出され（表３）、非共有結合性複合体は検出されなかった。したがって、分析のために用いられる試料が塊になっていないか、又は損傷していないことが同定された。

さらに、抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１３、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１６、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１８、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ０１、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１９）を、非共有結合性タンパク質複合体の架橋のための専用試薬での処理により安定させ、その後、高質量ＭＡＬＤＩ分析を実施した。結果として、２つの型のピークが観察された。これらのデータを、複合体トラッカーソフトウェアで評価して、Ａ５６・Ａｂ複合体及び２Ａ５６・Ａｂ複合体の存在を同定した（図３９～４３）。加えて、それぞれの試料及び複合体の分子量は表４に示されている。

実施例３．５個の抗Ａ５６抗体に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
実施例３．２～３．７及びそこで言及された図面に示されているようなＡ５６におけるアミノ酸配列ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。

実施例３．１．タンパク質Ａ５６のシーケンシング
タンパク質Ａ５６のエピトープマッピングについて、タンパク質Ａ５６の配列をまず、同定した。タンパク質Ａ５６を、５つのタンパク質分解酵素（トリプシン、キモトリプシン、ＡＳＰ－Ｎ、エラスターゼ、及びサーモリシン）での処理によりペプチドへ断片化した。その後、消化されたペプチドについて、マスフィンガープリント情報を、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ（質量分析）により得て、その情報が既存のタンパク質Ａ５６の配列情報と一致するかどうかに関して比較分析を実施した。

結果として、図４４に示されているように、タンパク質Ａ５６のトリプシンでの消化により得られたアミノ酸断片は３８．７６％の配列カバレッジを有した；タンパク質Ａ５６のキモトリプシンでの消化により得られたアミノ酸断片は６６．２８％の配列カバレッジを有した；タンパク質Ａ５６のＡＳＰ－Ｎでの消化により得られたアミノ酸断片は４３．８０％の配列カバレッジを有した；タンパク質Ａ５６のエラスターゼでの消化により得られたアミノ酸断片は９４．５７％の配列カバレッジを有した；及びタンパク質Ａ５６のサーモリシンでの消化により得られたアミノ酸断片は８３．３３％の配列カバレッジを有した。５つのタンパク質分解酵素により同定された全ての配列を考慮すると、それらの配列が、配列情報に関して、既存のタンパク質Ａ５６と９９．６１％同一であることが同定された。

実施例３．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１３）の試料を、重水素化架橋と様々なタンパク質分解酵素での併用処理に供し、その結果、試料は、アルキル化及び還元を起こした。引き続いて、それらから、高質量ＭＡＬＤＩ ＭＳ及びｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いて、分子量データを得て、その後、ソフトウェア（ＸＱｕｅｓｔ、Ｓｔａｖｒｏｘ）を用いて分析した。

結果として、タンパク質Ａ５６と各抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）がお互いに直接接触している部位の配列が、架橋を用いて同定された。これに基づいて、表５に示されているようなエピトープ及びパラトープが以下の通り、同定された。

表５に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）が結合する部位上のエピトープはＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３８位、４６位、５０位、７０位、７１位、７５位、７６位、７８位、８０位、８４位、及び８５位にあることが同定された。

詳細には、図４５に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位のアミノ酸残基から９０位のアミノ酸残基のエピトープ位置は、赤色（３８位、４６位、５０位、７０位、７１位、７５位、７６位、７８位、８０位、８４位、８５位）で示されている；そして、（アミノ酸配列における２～１４８位での）Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのタンパク質構造がＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌソフトウェアを用いてインシリコで表された場合、Ａｂ１３とＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓが結合する部位は青色で示されている。Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列の中で、結合部位として同定された部位が、３８～５０位（ＳＩＩＬＬＡＡＫＳＤＶＬＹ）及び７０～８５位（ＴＴＩＴＩＫＳＬＴＡＲＤＡＧＴＹ）に対応することが同定された。

実施例３．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１６）の試料を、重水素化架橋と様々なタンパク質分解酵素での併用処理に供し、その結果、試料は、アルキル化及び還元を起こした。引き続いて、それらから、高質量ＭＡＬＤＩ ＭＳ及びｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いて、分子量データを得て、その後、ソフトウェア（ＸＱｕｅｓｔ、Ｓｔａｖｒｏｘ）を用いて分析した。

タンパク質Ａ５６と各抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）がお互いに直接接触している部位の配列を、架橋を用いて同定した。これに基づいて、表６に示されているようなエピトープ及びパラトープが以下の通り、同定された。

表６に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）が結合する部位上のエピトープはＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位、３３位、３８位、４５位、４６位、５５位、５６位、５８位、及び６０位にあることが同定された。

詳細には、図４６に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位のアミノ酸残基から９０位のアミノ酸残基のエピトープ位置は、赤色（３０位、３３位、３８位、４５位、４６位、５５位、５６位、５８位、６０位）で示されている；そして、（アミノ酸配列における２～１４８位での）Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのタンパク質構造がＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌソフトウェアを用いてインシリコで表された場合、Ａｂ１６とＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓが結合する部位は青色で示されている。Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列の中で、結合部位は、３０～４６位（ＳＡＷＹＫＥＰＮＳＩＩＬＬＡＡＫＳ）及び５５～６０位（ＴＫＤＫＩＳ）に対応することが同定された。

実施例３．４．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１８）の試料を、重水素化架橋と様々なタンパク質分解酵素での併用処理に供し、その結果、試料は、アルキル化及び還元を起こした。引き続いて、それらから、高質量ＭＡＬＤＩ ＭＳ及びｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いて、分子量データを得て、その後、ソフトウェア（ＸＱｕｅｓｔ、Ｓｔａｖｒｏｘ）を用いて分析した。

タンパク質Ａ５６と各抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）がお互いに直接接触している部位の配列を、架橋を用いて同定した。これに基づいて、表７に示されているようなエピトープ及びパラトープが以下の通り、同定された。

表７に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）が結合する部位上のエピトープはＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における４６位、５０位、５５位、５６位、６０位、７１位、７５位、及び７６位にあることが同定された。

詳細には、図４７に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位のアミノ酸残基から９０位のアミノ酸残基のエピトープ位置は、赤色（４６位、５０位、５５位、５６位、６０位；７１位、７５位、７６位）で示されている；そして、（アミノ酸配列における２～１４８位での）Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのタンパク質構造がＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌソフトウェアを用いてインシリコで表された場合、Ａｂ１８とＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓが結合する部位は青色で示されている。Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列の中で、結合部位として同定された部位は、４６～６０位（ＳＤＶＬＹＴＫＤＫＩＳ）及び７１～７６位（ＴＩＴＩＫＳ）に対応することが同定された。

実施例３．５．抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ０１）の試料を、重水素化架橋と様々なタンパク質分解酵素での併用処理に供し、その結果、試料は、アルキル化及び還元を起こした。引き続いて、それらから、高質量ＭＡＬＤＩ ＭＳ及びｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いて、分子量データを得て、その後、ソフトウェア（ＸＱｕｅｓｔ、Ｓｔａｖｒｏｘ）を用いて分析した。

タンパク質Ａ５６と各抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）がお互いに直接接触している部位の配列を、架橋を用いて同定した。これに基づいて、表８に示されているようなエピトープ及びパラトープが以下の通り、同定された。

表８に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）が結合する部位上のエピトープはＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位、３８位、４５位、７５位、及び８４位にあることが同定された。

詳細には、図４８に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位のアミノ酸残基から９０位のアミノ酸残基のエピトープ位置は、赤色（３０位、３８位、４５位、７５位、８４位）で示されている；そして、（アミノ酸配列における２～１４８位での）Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのタンパク質構造がＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌソフトウェアを用いてインシリコで表された場合、Ａｂ０１とＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓが結合する部位は青色で示されている。Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列の中で、結合部位として同定された部位は、３０～４５位（ＳＡＷＹＫＥＰＮＳＩＩＬＬＡＡＫ）及び７５～８４位（ＫＳＬＴＡＲＤＡＧＴ）に対応することが同定された。

実施例３．６．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピング
抗原－抗体結合複合体（Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ／Ａｂ１９）の試料を、重水素化架橋と様々なタンパク質分解酵素での併用処理に供し、その結果、試料は、アルキル化及び還元を起こした。引き続いて、それらから、高質量ＭＡＬＤＩ ＭＳ及びｎＬＣ－ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いて、分子量データを得て、その後、ソフトウェア（ＸＱｕｅｓｔ、Ｓｔａｖｒｏｘ）を用いて分析した。

タンパク質Ａ５６と各抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）がお互いに直接接触している部位の配列を、架橋を用いて同定した。これに基づいて、表９に示されているようなエピトープ及びパラトープが以下の通り、同定された。

表９に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）が結合する部位上のエピトープはＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における４５位及び４６位にあることが同定された。

詳細には、図４９に示されているように、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列における３０位のアミノ酸残基から９０位のアミノ酸残基のエピトープ位置は、赤色（４５位、４６位）で示されている；そして、（アミノ酸配列における２～１４８位での）ＵＴＴＡ－Ｃ－Ｈｉｓのタンパク質構造がＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌソフトウェアを用いてインシリコで表された場合、Ａｂ１９とＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓが結合する部位は青色で示されている。Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓのアミノ酸配列の中で、結合部位として同定された部位は、４５位及び４６位（ＫＳ）に対応することが同定された。

実施例３．７．抗Ａ５６抗体（Ａｂｌ３、Ａｂ１６、Ａｂ１８、Ａｂ０１、Ａｂ１９）に対するタンパク質Ａ５６のエピトープマッピングの比較
実施例３．２～３．６におけるエピトープマッピングにより得られた結果を比較し、図５０及び５１に示した。結果として、タンパク質Ａ５６のアミノ酸配列において、エピトープは、ＩｇＧ様ドメイン領域に対応する３０～８５位にマッピングされることが同定された。

加えて、タンパク質Ａ５６のＩｇＧ様ドメインを、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、ｉＣｎ３Ｄを用いて、構造的に分析した。結果として、そのドメインが、合計で８つのシート（緑色）、４つのヘリックス（赤色）、及び７つのループ（青色）からなることが同定された。特に、ヘリックス１及び２は、ヘリックス３のすぐ隣で構造的にフォールディングされていることが同定された。

抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３、Ａｂ１６、Ａｂ１８、Ａｂ０１、Ａｂ１９）との結合に関与するＡ５６のエピトープの構造分析により、エピトープが、正電荷を有する塩基性アミノ酸残基であるリジン（Ｋ／Ｌｙｓ）及びアルギニン（Ｒ／Ａｒｇ）、求核性アミノ酸残基であるセリン（Ｓ／Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔ／Ｔｈｒ）、並びに芳香族であるチロシン（Ｙ／Ｔｙｒ）からなることが示されている。塩基性アミノ酸は、正に帯電した側鎖により水素結合を容易に形成し、求核性アミノ酸及び芳香族アミノ酸は、すぐ隣に位置するアミノ酸によって部分的に負に帯電されて、水素結合を形成し得る。タンパク質Ａ５６と抗Ａ５６抗体において架橋するアミノ酸残基の主な物理化学的性質が要約されている。

実施例４．５個の抗Ａ５６抗体についてのタンパク質Ａ５６のパラトープの分析
実施例４．１～４．５及びそこで言及された図面に示されているようなＡ５６におけるアミノ酸配列ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。

実施例４．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）についてのタンパク質Ａ５６のパラトープ分析
Ａｂ１３を、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬソフトウェアを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、結合に関与するアミノ酸の構造分析を、ｉＣｎ３Ｄを用いて、実施した。結果として、求核性であるアミノ酸セリン（Ｓ／Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔ／Ｔｈｒ）並びに芳香族であるチロシン（Ｙ／Ｔｙｒ）が、重鎖の末端露出部分に分布し、したがって、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷を有するリジン（Ｋ９１）及びアルギニン（Ｒ９６）との強い結合親和性を有すること；並びに、強い正電荷を有するリジン（Ｋ２６）が軽鎖のＣＤＲ１に位置し、リジン（Ｋ５７）がシート５（Ｓ５）とシート６（Ｓ６）の間のループに位置し、そして、タンパク質Ａ５６における求核性アミノ酸セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ／Ｔｙｒ）が、リジン（Ｋ２６、Ｋ５７）との結合親和性を有することが分析された（図５２）。

実施例４．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）についてのタンパク質Ａ５６のパラトープ分析
Ａｂ１６を、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬソフトウェアを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、結合に関与するアミノ酸の構造分析を、ｉＣｎ３Ｄを用いて、実施した。結果として、重鎖の末端露出部分である、シート５（Ｓ５）とシート６（Ｓ６）の間のループに位置するＣＤＲ２内のアルギニン（Ｒ５６）及びリジン（Ｋ５８）が、その２つのアミノ酸の間に位置する求核性アミノ酸セリン（Ｓ５７）のために、より強い正電荷（図５８における青色のマッシュ（ｍａｓｈ））を有し、そのことは、タンパク質Ａ５６における、求核性アミノ酸であるセリン（Ｓ４６、Ｓ５４）との結合が優先的に進行する点で有利であること；並びに、この抗体が、軽鎖のＦＲ３のシート６（Ｓ６）に位置する強い正電荷を有するリジン（Ｋ６０）及び求核性アミノ酸セリン（Ｓ）のために、タンパク質Ａ５６における求核性アミノ酸セリン（Ｓ６２）及びリジン（Ｋ６１）との高レベルの結合親和性を有することが分析及び予測された（図５３）。

実施例４．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）についてのタンパク質Ａ５６のパラトープ分析
Ａｂ１８を、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬソフトウェアを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、結合に関与するアミノ酸の構造分析を、ｉＣｎ３Ｄを用いて、実施した。結果として、求核性であるアミノ酸セリン（Ｓ／Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｓ／Ｓｅｒ）並びに芳香族であるチロシン（Ｙ／Ｔｙｒ）が、重鎖のＣＤＲ１ヘリックス露出部分に分布するため、この部分は、相対的に負の電荷を有し、したがって、タンパク質Ａ５６における強い正電荷を有するリジン（Ｋ７２）と結合することが予測された；そして、強い正電荷を有するアルギニン（Ｒ９８）がＣＤＲ３中に位置することが同定された。加えて、軽鎖のＣＤＲ１中の求核性アミノ酸セリン（Ｓ３０）が、タンパク質Ａ５６における強い正電荷を有するリジン（Ｋ９１）と結合し、且つシート５（Ｓ５）とループの間に位置するリジン（Ｋ５０）が、タンパク質Ａ５６におけるチロシン（Ｙ／Ｔｙｒ、Ｔ７１）と結合することが分析された（図５４）。

実施例４．４．抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）についてのタンパク質Ａ５６のパラトープ分析
Ａｂ０１を、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬソフトウェアを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、結合に関与するアミノ酸の構造分析を、ｉＣｎ３Ｄを用いて、実施した。結果として、求核性であるアミノ酸セリン（Ｓ／Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔ／Ｔｈｒ）並びに芳香族であるチロシン（Ｙ１０６）が、重鎖の末端露出部分に分布し、したがって、タンパク質Ａ５６における強い正電荷を有するリジン（Ｋ９１）との結合親和性を有すること；並びに、求核性アミノ酸セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ１０２）が、主に軽鎖のＣＤＲ中に位置し、特に、スレオニン（Ｔ１０２）が、タンパク質Ａ５６における強い正電荷を有するリジン（Ｋ６１）との結合親和性を有することが分析された（図５５）。

実施例４．５．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）についてのタンパク質Ａ５６のパラトープ分析
Ａｂ１９を、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬソフトウェアを用いて、一次３Ｄタンパク質構造についてモデル化し、結合に関与するアミノ酸の構造分析を、ｉＣｎ３Ｄを用いて、実施した。結果として、この抗体が、セリン（Ｓ９３、Ｓ９４）により引き起こされる単純な水素結合のために、相対的に低い結合親和性を有すること、及びタンパク質Ａ５６におけるシート４（Ｓ４）とシート５（Ｓ５）の間に位置するループに存在する結合部位（Ｋ６１、Ｓ６２）により、この抗体は、エピトープに関して、他の抗Ａ５６抗体と重複し得ないことが分析された（図５６）。

実施例５．抗Ａ５６抗体とタンパク質Ａ５６の結合の分析
実施例５．１．１～５．５．３及びそこで言及された図面に示されているようなＡ５６におけるアミノ酸配列ナンバリングは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からＮ末端アミノ酸１～１６を排除することにより得られる配列に基づいて行われている（例えば、３０位のセリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４６位のセリンに対応する）。

実施例５．１．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力を分析するために、高分子中及びその周囲における静電ポテンシャル及び対応する静電エネルギーを計算する科学的アプリケーションであるＤｅｌＰｈｉポテンシャルを用いた。ＤｅｌＰｈｉポテンシャルは、タンパク質又は他の高分子の表面に沿った静電変化を可視化するために、及び様々なエネルギーの静電成分を計算するために一般的に用いられる分析方法であり、ＤｅｌＰｈｉポテンシャルにおいて、３次元格子ボックスにおける有限数のポイントにおいてポアソンボルツマン方程式を評価することにより、イオン強度媒介性スクリーニングの効果が組み込まれている。ここで、青色及び赤色は、それぞれ、正電位及び負電位を示し、力線は、そのタンパク質を囲む静電力の方向及び強度を示す。

詳細には、タンパク質Ａ５６における、強いＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルの正電荷を有する塩基性アミノ酸リジン（Ｋ９１）が、そのリジンのすぐ隣の残基であるセリン（Ｓ９２）のヒドロキシル基を励起し、その結果、静電力が発生し、相対的に低いレベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、強く正に帯電した。その時、Ａｂ１３における軽鎖のＫ２６及びＫ５７について、その周りの負に帯電したＤ２５及びＤ５５により、相対的に強く正に帯電したＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、形成された。

加えて、Ａｂ１３における重鎖のＴ５２及びＴ５８は、すぐ隣の疎水性残基Ｉ５１（イソロイシン）、及び芳香族であり且つ親水性反応基を含まないＦ５４（フェニルアラニン）のために、外側へ高度に露出し、Ｔ５２及びＴ５８の高レベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルは、負に帯電したＤ５６のために、強く負に帯電した。

結果として、表１０に示されているような静電的性質が同定された。

この表において、最も右の列に示された、アミノ酸位置の数字に続く文字（Ｈ又はＬ）は、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）を意味する。

実施例５．１．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離を分析するために、タンパク質Ａ５６のＡｂ１３との構造的アライメントを、Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（４．１．０）を用いて推測し、活性部位又は他の関連部分を比較して、原子間のＨ結合、角度、及び距離を予測した。

結果として、ＮＨ残基、すなわち、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷で正になっているＫ９１の末端官能基が、Ａｂ１３における重鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっているＴ５２のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、４．８８Åであると測定された（図５７Ａ）。加えて、ＮＨ残基、すなわち、Ａｂ１３における重鎖の、強い正電荷で正になっているＫ５７の末端官能基が、タンパク質Ａ５６における、適切なレベルの負電荷で負になっているＳ６２のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、３．７３Åであると測定された（図５７Ｂ）。

２つの水素結合が進行するにつれて、タンパク質Ａ５６における、負になっているＹ６６のＯ－は、Ａｂ１３における軽鎖の強い正電荷で正になっているＫ２６と結合するだろうと予測された。加えて、２つの水素結合が進行するにつれて、重鎖及び軽鎖は、収縮フォールディングを起こして、その結果、残りの結合（Ｓ５４（Ａ５６）⇔（抗体における重鎖）及びＲ９６（Ａ５６）⇔（抗体における重鎖））が静電的に形成されると予測された。

実施例５．１．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）とタンパク質Ａ５６の結合の競合アッセイ：ビニング試験
１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）がタンパク質Ａ５６について同じエピトープを有するか又は異なるエピトープを有するかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法により分析を実施した。

詳細には、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原をバイオセンサー（ＮＴＡ）上に固定化し、一次抗体（ＳＡ２０３８、Ａｂ１３、Ａ５６－０２Ａ０２）を、その抗原と飽和状態まで結合させ、残りの９個の抗体を二次抗体としてその抗原とさらに結合させた。ここで、それらの抗体が同じエピトープを有する場合、競合が生じ、追加の結合は生じるのが困難である；それらの抗体が異なるエピトープを有する場合、追加の結合が生じるだろう。加えて、二次抗体及び一次抗体のＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原との結合順序が逆転される追加の実験を実施することにより、結果を再びチェックした。

結果として、図５８Ａに示されているように、追加の結合は生じなかったことが同定され、それらの抗体が同じエピトープを有することを示した。

加えて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて２次元構造における結合親和性をチェックするためにウェスタンブロッティングを実施し、直鎖状であるタンパク質Ａ５６に関して、結合は生じないことが同定された。これらの結果から、抗Ａ５６抗体（Ａｂ１３）は、タンパク質Ａ５６の３次元構造のみを認識及び結合することが同定された。加えて、ＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡにより計算された結合親和性（Ｋ_Ｄ）値は図５８Ｂに示されている。

実施例５．２．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力を分析するために、ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを用いた。詳細には、タンパク質Ａ５６における、強いＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルの正電荷を有する塩基性アミノ酸リジン（Ｋ６１）が、そのリジンのすぐ隣の残基であるセリン（Ｓ６２）のヒドロキシル基を励起し、その結果、静電力が発生し、相対的に低いレベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、強く正に帯電した。ここで、Ａｂ１６における軽鎖のＳ５９及びＫ６０について、正に帯電したＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、タンパク質Ａ５６の物理化学的性質により形成された。

加えて、Ａｂ１６における重鎖の末端露出部分である、シート５（Ｓ５）とシート６（Ｓ６）の間のループに位置するＣＤＲ２内のアルギニン（Ｒ５６）及びリジン（Ｋ５８）が、その２つのアミノ酸の間に位置する求核性アミノ酸セリン（Ｓ５７）のために、より強い正電荷を有し、その結果、タンパク質Ａ５６における求核性アミノ酸であるセリン（Ｓ４６、Ｓ５４）との結合が優先的に進行することが予測された；表１１に示されているような静電的性質が同定された。

この表において、最も右の列に示された、アミノ酸位置の数字に続く文字（Ｈ又はＬ）は、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）を意味する。

実施例５．２．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離を分析するために、タンパク質Ａ５６のＡｂ１６との構造的アライメントを、Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（４．１．０）を用いて推測し、活性部位又は他の関連部分を比較して、原子間のＨ結合、角度、及び距離を予測した。

結果として、図５９に示されているように、ＮＨ残基、すなわち、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷で正になっているＫ６１の末端官能基が、Ａｂ１６における軽鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっているＳ５９のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、４．７８Åであると測定された。同時に、ＮＨ残基、すなわち、Ａｂ１６における軽鎖の、強い正電荷で正になっているＫ６０の末端官能基が、タンパク質Ａ５６における、適切なレベルの負電荷で負になっているＳ６２のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、５．０７Åであると測定された。

２つの水素結合が進行するにつれて、タンパク質Ａ５６における、負になっているＳ４６／Ｓ５４のＯ－は、Ａｂ１６における重鎖の強い正電荷で正になっているＲ５６／Ｋ５８と結合するだろうと予測された。加えて、結合が進行するにつれて、重鎖及び軽鎖は、収縮フォールディングを起こして、その結果、残りの結合が強く静電的に形成されると予測された。

実施例５．２．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１６）とタンパク質Ａ５６の結合の競合アッセイ：ビニング試験
１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）がタンパク質Ａ５６について同じエピトープを有するか又は異なるエピトープを有するかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法により分析を実施した。

詳細には、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原をバイオセンサー（ＮＴＡ）上に固定化し、一次抗体（ＳＡ２０４１、Ａｂ１６、Ａ５６－０２Ｂ０８）を、その抗原と飽和状態まで結合させ、残りの９個の抗体を二次抗体としてその抗原とさらに結合させた。ここで、それらの抗体が同じエピトープを有する場合、競合が生じ、追加の結合は生じるのが困難である；それらの抗体が異なるエピトープを有する場合、追加の結合が生じるだろう。加えて、二次抗体及び一次抗体のＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原との結合順序が逆転される追加の実験を実施することにより、結果を再びチェックした。

結果として、図６０Ａに示されているように、追加の結合は生じなかったことが同定され、それらの抗体が同じエピトープを有することを示した。

加えて、ＰＡＧＥを用いて２次元構造における結合親和性をチェックするためにウェスタンブロッティングを実施し、線状の複数のバンドが同定された。これは、タンパク質Ａ５６における２次元構造上の単純な直鎖状アミノ酸配列に対して特異的な１対１の結合がなく、したがって、識別されなかったことを示している。加えて、ＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡにより計算された結合親和性（Ｋ_Ｄ）値は図６０Ｂに示されている。

実施例５．３．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力を分析するために、ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを用いた。詳細には、タンパク質Ａ５６における、強いＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルの正電荷を有する塩基性アミノ酸リジン（Ｋ６１）が、そのリジンのすぐ隣の残基であるセリン（Ｓ６２）のヒドロキシル基を励起し、その結果、静電力が発生し、相対的に低いレベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、強く正に帯電した。ここで、Ａｂ１８における重鎖のＲ９８が、すぐ隣のＡ９７、及び芳香族であり且つ親水性反応基を含まないＷ９９（トリプトファン）の、短い残基であるメチル基（ＣＨ３）のために、外側へ高度に露出し、そのＲ９８の高レベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが強く正に帯電した。加えて、Ａｂ１８における軽鎖のＫ５０について、そのＫ５０の周りの負に帯電したＹ４９及びＳ５２により、相対的に強く正に帯電したＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが形成された。

結果として、表１２に示されているような静電的性質が同定された。

この表において、最も右の列に示された、アミノ酸位置の数字に続く文字（Ｈ、Ｌ、又はＵ）は、重鎖（Ｈ）、軽鎖（Ｌ）、又はＵＴＴＡ（又はＡ５６）（Ｕ）を意味する。

実施例５．３．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離を分析するために、タンパク質Ａ５６のＡｂ１８との構造的アライメントを、Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（４．１．０）を用いて推測し、活性部位又は他の関連部分を比較して、原子間のＨ結合、角度、及び距離を予測した。

結果として、ＮＨ残基、すなわち、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷で正になっているＫ９１の末端官能基が、Ａｂ１８における軽鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっているＹ３２Ｌと水素結合を形成し、それらの間の距離は、３．４６Åであると測定された（図６１Ｂ）。加えて、Ａｂ１８における軽鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっているＳ３０を静電力で引くことによりその構造がフォールディングを起こすだろうと予測された。加えて、ＮＨ残基、すなわち、Ａｂ１８における重鎖の、強い正電荷で正になっているＲ９８の末端官能基が、タンパク質Ａ５６における、適切なレベルの負電荷で負になっているＳ６２のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、３．７７Åであると測定された（図６１Ａ）。

２つの水素結合が進行するにつれて、Ａｂ１８における軽鎖の、強い正電荷で正になっているＫ５０が、フォールディングを起こし、タンパク質Ａ５６における、負になっているＳ３０のＯ－と結合するだろうと予測された。

実施例５．３．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８）とタンパク質Ａ５６の結合の競合アッセイ：ビニング試験
１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）がタンパク質Ａ５６について同じエピトープを有するか又は異なるエピトープを有するかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いるＳＰＲ方法により分析を実施した。

詳細には、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原をバイオセンサー（ＮＴＡ）上に固定化し、一次抗体（ＳＡ２０４３、Ａｂ１８、Ａ５６－０２Ｃ０６）を、その抗原と飽和状態まで結合させ、残りの９個の抗体を二次抗体としてその抗原とさらに結合させた。ここで、それらの抗体が同じエピトープを有する場合、競合が生じ、追加の結合は生じるのが困難である；それらの抗体が異なるエピトープを有する場合、追加の結合が生じるだろう。加えて、二次抗体及び一次抗体のＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原との結合順序が逆転される追加の実験を実施することにより、結果を再びチェックした。

結果として、図６２Ａに示されているように、追加の結合は生じなかったことが同定され、それらの抗体が同じエピトープを有することを示した。

加えて、ＰＡＧＥを用いて２次元構造における結合親和性をチェックするためにウェスタンブロッティングを実施し、線状の複数のバンドが同定された。これらの結果から、この抗体が、タンパク質Ａ５６における２次元構造のアミノ酸配列だけでなく、タンパク質Ａ５６における３次元モチーフもまた、認識及び結合することが同定された。加えて、ＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡにより計算された結合親和性（Ｋ_Ｄ）値は図６２Ｂに示されている。

実施例５．４．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力を分析するために、ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを用いた。詳細には、タンパク質Ａ５６における、強いＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルの正電荷を有する塩基性アミノ酸リジン（Ｋ６１）が、そのリジンのすぐ隣の残基であるセリン（Ｓ６２）のヒドロキシル基を励起し、その結果、静電力が発生し、相対的に低いレベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、強く正に帯電した。その時、Ａｂ０１における軽鎖のＳ３２及びＴ１０２について、それらのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルは、適切なレベルで相対的に負に帯電した。

加えて、Ａｂ０１における重鎖のＳ１０３及びＹ１０６は、そのすぐ隣の疎水性残基Ｌ１０７、及び芳香族であり且つ親水性反応基を含まないＦ１０１のために、外側へ高度に露出し、その高レベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルは、求核性アミノ酸Ｓ１０３のために強く負に帯電した。

結果として、表１３に示されているような静電的性質が同定された。

この表において、最も右の列に示された、アミノ酸位置の数字に続く文字（Ｈ又はＬ）は、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）を意味する。

実施例５．４．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離を分析するために、タンパク質Ａ５６のＡｂ０１との構造的アライメントを、Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（４．１．０）を用いて推測し、活性部位又は他の関連部分を比較して、原子間のＨ結合、角度、及び距離を予測した。

結果として、図６３に示されているように、ＮＨ残基、すなわち、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷で正になっているＫ６１の末端官能基が、Ａｂ０１における軽鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっているＴ１０２のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は、３．６９Åであると測定された。加えて、ＮＨ残基、すなわち、タンパク質Ａ５６における、強い正電荷で正になっているＫ９１の末端官能基は、Ａｂ０１における重鎖の、適切なレベルの負電荷で負になっている、Ｙ１０６のＯ－と水素結合を形成し、それらの間の距離は３．１２Åであると測定された。

２つの水素結合が進行するにつれて、タンパク質Ａ５６におけるＳ５４が、Ａｂ０１における重鎖のＴ５７、Ｔ１００、Ｓ１０３及び軽鎖のＳ３２と結合することが予測された。加えて、２つの水素結合が進行するにつれて、重鎖及び軽鎖は、収縮フォールディングを起こして、その結果、残りの結合が静電的に形成されると予測された。

実施例５．４．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ０１）とタンパク質Ａ５６の結合の競合アッセイ：ビニング試験
１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）がタンパク質Ａ５６について同じエピトープを有するか又は異なるエピトープを有するかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いるＳＰＲ方法により分析を実施した。

詳細には、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原をバイオセンサー（ＮＴＡ）上に固定化し、一次抗体（ＳＡ２０２６、Ａｂ０１、Ａ５６－０１Ａ０２）を、その抗原と飽和状態まで結合させ、残りの９個の抗体を二次抗体としてその抗原とさらに結合させた。ここで、それらの抗体が同じエピトープを有する場合、競合が生じ、追加の結合は生じるのが困難である；それらの抗体が異なるエピトープを有する場合、追加の結合が生じるだろう。加えて、二次抗体及び一次抗体のＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原との結合順序が逆転される追加の実験を実施することにより、結果を再びチェックした。

結果として、図６４Ａに示されているように、追加の結合は生じなかったことが同定され、それらの抗体が同じエピトープを有することを示した。

加えて、ＰＡＧＥを用いて２次元構造における結合親和性をチェックするためにウェスタンブロッティングを実施し、線状の単一のバンドが同定された。加えて、ＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡにより計算された結合親和性（Ｋ_Ｄ）値は図６４Ｂに示されている。

実施例５．５．１．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）とタンパク質Ａ５６の結合の静電力を分析するために、ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを用いた。詳細には、タンパク質Ａ５６における、強いＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルの正電荷を有する塩基性アミノ酸リジン（Ｋ６１）が、そのリジンのすぐ隣の残基であるセリン（Ｓ６２）のヒドロキシル基を励起し、その結果、静電力が発生し、相対的に低いレベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルが、強く正に帯電した。ここで、Ａｂ１９における軽鎖の９０位のアミノ酸から９５位のアミノ酸（ＤＳＳＳＤ）の中で、９３位及び９４位のセリン（Ｓ９３、Ｓ９４）について、それらのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルは、負電荷を有する酸性アミノ酸であるアスパラギン酸残基（Ｄ９０及びＤ９５）の強い負電荷のために、相対的に強く負に帯電した。

加えて、Ａｂ１９における重鎖Ｙ３２は、そのすぐ隣の疎水性アミノ酸Ｖ（バリン）及びＬ（ロイシン）、並びに芳香族であり且つ親水性反応基を含まないＦ（フェニルアラニン）のために、外側へ高度に露出し、その低レベルのＤｅｌＰｈｉ表面静電ポテンシャルは、求核性アミノ酸Ｓ（セリン）のために、低レベルで負に帯電した。

結果として、表１４に示されているような静電的性質が同定された。

実施例５．５．２．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離の分析
抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）とタンパク質Ａ５６の間の結合距離を分析するために、タンパク質Ａ５６のＡｂ１９との構造的アライメントを、Ｓｗｉｓｓ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（４．１．０）を用いて推測し、活性部位又は他の関連部分を比較して、原子間のＨ結合、角度、及び距離を予測した。

結果として、図６５に示されているように、タンパク質Ａ５６におけるＫ６１及びＳ６２の末端官能基であるＫ６１及びＳ６２は、イオン化されて、ＮＨ＋（Ｋ６１）及びＯ－（Ｓ６２）を形成し、Ａｂ１９における軽鎖のＳ９３及びＳ９４は、そのすぐ隣のアスパラギン酸残基（Ｄ９１及びＤ９５）のために、強い負電荷をもつＯ－（Ｓ９３、Ｓ９４）の静電表面ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを有し、その結果、結合が形成されると予測された。タンパク質Ａ５６における９．９Åの間隔を置いたＮＨ２＋（Ｋ６１）及びＯ－（Ｓ６２）は、Ａｂ１９における１９．５Åの間隔を置く軽鎖のＯ－（Ｓ９３）と重鎖のＹ３２のＯ－との間に位置し、その結果、タンパク質Ａ５６におけるＫ６１はＡｂ１９におけるＳ９３と結合し、その結合距離は、４．５９Åであると測定された（ピンク色の円により示された）。Ａｂ１９におけるＹ３２と結合したタンパク質Ａ５６におけるＳ６２の結合距離は、６．０８Åであると測定された（白色の円により示された）。

加えて、タンパク質Ａ５６とＡｂ１９の結合は、その２つの分子が水平方向に結合することを示している。したがって、その結合部位以外の特定のパラトープを有する別の抗体が相補的な静電表面ＤｅｌＰｈｉポテンシャルを有する場合、タンパク質Ａ５６上の異なるエピトープの存在により、複数の結合が可能であろうと予測された。

実施例５．５．３．抗Ａ５６抗体（Ａｂ１９）とタンパク質Ａ５６の結合の競合アッセイ：ビニング試験
１０個の抗Ａ５６抗体（Ａｂ１８、Ａｂ１９、Ａｂ０１、Ａｂ１３、Ａｂ１４、Ａｂ０８、Ａｂ０３、Ａｂ５１、Ａｂ５５、Ａｂ１６）がタンパク質Ａ５６について同じエピトープを有するか又は異なるエピトープを有するかを決定するために、Ｏｃｔｅｔ装置を用いるＳＰＲ方法により分析を実施した。

詳細には、Ａ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原をバイオセンサー（ＮＴＡ）上に固定化し、一次抗体（ＳＡ２０４４、Ａｂ１９、Ａ５６－０２Ｃ０７）を、その抗原と飽和状態まで結合させ、残りの９個の抗体を二次抗体としてその抗原とさらに結合させた。ここで、それらの抗体が同じエピトープを有する場合、競合が生じ、追加の結合は生じるのが困難である；それらの抗体が異なるエピトープを有する場合、追加の結合が生じるだろう。加えて、二次抗体及び一次抗体のＡ５６－Ｃ－Ｈｉｓ抗原との結合順序が逆転される追加の実験を実施することにより、結果を再びチェックした。

結果として、図６６Ａに示されているように、二次抗体が結合するステップにおいて、２個の抗体（ＳＡ２０４１（Ａｂ１６）、ＳＡ２０４３（Ａｂ１８））の追加の結合がわずかではあるが生じたと分析された。これらの結果から、その２個の抗体（ＳＡ２０４１（Ａｂ１６）及びＳＡ２０４３（Ａｂ１８））がＡｂ１９のエピトープ以外のエピトープを有することが同定された。

加えて、ＰＡＧＥを用いて２次元構造における結合親和性をチェックするためにウェスタンブロッティングを実施し、線状の単一のバンドが同定された。加えて、ＯＣＴＥＴ（ＳＰＲ）及びＥＬＩＳＡにより計算された結合親和性（Ｋ_Ｄ）値は図６６Ｂに示されている。

実験的実施例８．抗Ａ５６抗体の抗原結合領域を用いるＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
実験的実施例８．１．キメラ抗原受容体の構造的デザイン
キメラ抗原受容体の構造を、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むようにデザインした。例として、図６７に示されているように、キメラ抗原受容体を、抗原結合ドメイン（抗ＵＴＴＡ ｓｃＦｖ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン（Ｈ＋ＴＭ）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（４－１ＢＢ及びＣＤ３Ｚ）を含むようにデザインした。

実験的実施例８．２．キメラ抗原受容体をコードするベクターの構築
ベクターとして、ｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター（Ｓｐｅｌ／Ｎｏｔｌ）を用いた。そのベクターへ、シグナルペプチド（ｓｐ）、Ａ５６と特異的に結合する一本鎖可変断片（抗ＵＴＴＡ ｓｃＦｖ）、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン（Ｈ＋ＴＭ）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ）を含むキメラ抗原受容体をコードする遺伝子を挿入した。

本実験に用いられるキメラ抗原受容体のアミノ酸配列及び塩基配列は表１５に示されている。

実験的実施例８．３．ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
ヒト由来材料研究下でのＩＲＢの承認を以て、ＭＡＣＳ細胞分離システムを用いて、Ｐｕｓａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｙａｎｇｓａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｋｏｒｅａ）により提供された血液からＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を分離することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。その後、ＣＤ３＋ Ｔ細胞（≧９７％）を、ＭＡＣＳ Ｐａｎ Ｔ細胞Ａｂを用いて分離した。引き続いて、１×１０^６個のＣＤ３＋ Ｔ細胞を２０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２及びＴｒａｎｓＡｃｔ（ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニスト）を含有する培地中で２４時間、培養して、Ｔ細胞活性化を誘導した。

実験的実施例８．２において構築されたベクターへとクローニングされた２つの型のレンチウイルスのそれぞれで、５０のＭＯＩにおいて、活性化されたＴ細胞を処理し、４８時間、培養した。その後、Ｔ細胞を、２０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を含有する培地中に１×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。その培地を細胞増殖のためにｒｈＩＬ－２を含有する新しい培地と交換しながら、その細胞を２日又は３日ごとにカウントした。ここで、Ａｂ１６の抗原結合ドメインに対するレンチウイルスを用いて作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、「１６ ＣＡＲ－Ｔ」と名付けられ、Ａｂ１８の抗原結合ドメインに対するレンチウイルスを用いて作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、「１８ ＣＡＲ－Ｔ」と名付けられた。加えて、いかなるＣＡＲも形質導入されなかったＴ細胞（ＵＴＤ、非形質導入型）を対照群として用いた。

実験的実施例９．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果の同定
ＵＴＤ細胞及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果を、蛍光に基づいた細胞イメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてリアルタイムで細胞死を測定することにより分析した。

詳細には、３つの癌細胞株ＨｅＬａ（３×１０^３個の細胞／ウェル）、ＮＣＩ－Ｈ５２２（６×１０^３個の細胞／ウェル）、及びＨＣＴ－１１６（９×１０^３個の細胞）を、９６ウェルプレートに播種した。その後、３７℃の温度でのインキュベーションを実施しながら、細胞を、０．０５のＭＯＩでの、調製実施例１．１のＯＴＳ－４１２（１．５５×１０^８ｐｆｕ／ｍｌ）の感染に供し、その結果、タンパク質Ａ５６が癌細胞表面に発現した。２時間後、培地を、２％のＦＢＳを含有する培地と交換した。４時間後、ＵＴＤ細胞及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ）のそれぞれを、Ｔ細胞：癌細胞の比が３：１であるように投与した。Ｔ細胞を、赤色蛍光染色試薬を含有する培地（１０％のＦＢＳ）と共に投与した。その後、細胞死イメージデータを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムを用いて、５日間、３０分間隔で取得し、ソフトウェアを通して分析した。

結果として、ＯＴＳ－４１２に感染したＨｅＬａ細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群と比較した場合、５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞、それぞれで処理された群は、統計的に有意な特異的な細胞毒性効果を示した（図６８；＊は、ＵＴＤ群に対してｐ＜０．０３３、＊＊はｐ＜０．００２、及び＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、＃＃は、同じｓｃＦｖ Ｃａｒ－Ｔ群におけるＴ細胞単独での処理に対してｐ＜０．００２を示す）。特に、これらの中でも、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ及びＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＯＴＳ－４１２に感染していない群の細胞毒性と比較して、タンパク質Ａ５６特異的細胞毒性において統計的有意差を示した。

ＯＴＳ－４１２に感染したＮＣＩ－Ｈ５２２細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群と比較した場合、５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の中でも、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、及びＡｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ、それぞれで処理された群は、統計的に有意な特異的な細胞毒性効果を示した（図６９；＊は、ＵＴＤ群に対してｐ＜０．０３３、＊＊はｐ＜０．００２、及び＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、＃＃は、同じｓｃＦｖ Ｃａｒ－Ｔ群におけるＴ細胞単独での処理に対してｐ＜０．００２を示す）。特に、これらの中でも、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＯＴＳ－４１２に感染していない群の細胞毒性と比較して、タンパク質Ａ５６特異的細胞毒性において統計的有意差を示した。

ＯＴＳ－４１２に感染したＨＣＴ－１１６細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群と比較した場合、５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞、それぞれで処理された群は、統計的に有意なＣＡＲ－Ｔ細胞特異的細胞毒性効果を示した（図７０；＊は、ＵＴＤ群に対してｐ＜０．０３３、＊＊はｐ＜０．００２、及び＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、＃＃は、同じｓｃＦｖ Ｃａｒ－Ｔ群におけるＴ細胞単独での処理に対してｐ＜０．００２を示す）。特に、これらの中でも、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、及びＡｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＯＴＳ－４１２に感染していない群の細胞毒性と比較して、タンパク質Ａ５６特異的細胞毒性において統計的有意差を示した。

さらに、５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合、Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、及びＡｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞について、異なるピークが観察された；他方、Ａｂ０１ ＣＡＲ及びＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞について、陰性ピークとは異なるピークが、Ｔ細胞表面に発現したＣＡＲの低い強度のために、明瞭には観察されず、その形質導入効率も低かったと思われる（図７１）。５つのＣＡＲ－Ｔの間での形質導入効率の差は、異なる年齢及び性別の対象に由来した血液と類似した。形質導入効率は、Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、及びＡｂ１９ ＣＡＲ－Ｔにおいて、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ及びＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔより一貫して高かった；これらの中でも、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔの形質導入効率が一貫して最も高かった。

実験的実施例１０．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果の同定
ＵＴＤ細胞及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果を、蛍光に基づいた細胞イメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてリアルタイムで細胞死を測定することにより、分析した。

詳細には、４つの癌細胞株Ａ５４９（１×１０^４個の細胞）及びＨＣＴ－１１６（３×１０^４個の細胞）を、９６ウェルプレートに播種した。その後、３７℃の温度でのインキュベーションを実施しながら、細胞を、０．０５のＭＯＩでの、調製実施例１．１のＯＴＳ－４１２（１．５５×１０^８ｐｆｕ／ｍｌ）の感染に供し、その結果、タンパク質Ａ５６が癌細胞表面に発現した。２時間後、培地を、２％のＦＢＳを含有する培地と交換した。４時間後、ＵＴＤ細胞、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞のそれぞれを、Ｔ細胞：癌細胞の比が３：１であるように投与した。Ｔ細胞を、赤色蛍光染色試薬を含有する培地（１０％のＦＢＳ）と共に投与した。その後、細胞死イメージデータを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムを用いて、５日間、３０分間隔で取得し、ソフトウェアを通して分析した。

結果として、図７３に示されているように、ＯＴＳ－４１２に感染したＡ５４９及びＨＣＴ－１１６細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群より、それぞれがＡｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ又はＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理された群において、より多くの死細胞が染色されたことが同定された。加えて、ＯＴＳ－４１２に感染したＡ５４９及びＨＣＴ－１１６細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群と比較して、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ及びＡｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ細胞、それぞれで処理された両方の群は、統計的に有意なＣＡＲ－Ｔ細胞特異的細胞毒性効果を示した（図７２）。

実験的実施例１１．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２、ＷＯＴＳ－４１８）及びＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果の同定
ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌効果を、蛍光に基づいた細胞イメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてリアルタイムで細胞死を測定することにより、分析した。

詳細には、癌細胞株ＨＣＴ－１１６（１×１０^４個の細胞）を、９６ウェルプレートに播種した。その後、３７℃の温度でのインキュベーションを実施しながら、細胞を、０．０５のＭＯＩでの、調製実施例１．１のＯＴＳ－４１２及びＷＯＴＳ－４１８のそれぞれの感染に供し、その結果、タンパク質Ａ５６が癌細胞表面に発現した。２時間後、培地を、２％のＦＢＳを含有する培地と交換した。４時間後、ＵＴＤ細胞及び５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ）のそれぞれを、Ｔ細胞：癌細胞の比が３：１であるように投与した。Ｔ細胞を、赤色蛍光染色試薬を含有する培地（１０％のＦＢＳ）と共に投与した。その後、細胞死イメージデータを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムを用いて、５日間、３０分間隔で取得し、ソフトウェアを通して分析した。

結果として、ＯＴＳ－４１２又はＷＯＴＳ－４１８に感染したＨＣＴ－１１６細胞株について、ＵＴＤ細胞で処理された群より、５つの型のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ａｂ１３ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１６ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１８ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ０１ ＣＡＲ－Ｔ、Ａｂ１９ ＣＡＲ－Ｔ）、それぞれで処理された群において、より多くの死細胞が染色されたことが同定された（図７３及び７４）。

Claims (9)

1. タンパク質Ａ５６と特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片であって、
   （ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
   （ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
   （ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
   （ｉｖ）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；又は
   （ｖ） 配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
   を含む、抗体又はその抗原結合断片。
2. Ａ５６との結合について、以下の抗体のうちの１つ又は複数と競合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片：
   配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号６２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号７４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号７７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号８０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号８３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号８９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体。
3. Ａ５６との結合について、以下の抗体のうちの１つ又は複数と競合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片：
   配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体；
   配列番号５６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体。
4. 腫瘍溶解性ウイルスと一緒に投与されることにより、癌細胞の負荷を減少させるために用いられる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. 腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. ワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルスウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ニューヨーク市保健局（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、ティアンタン（Ｔｉａｎ Ｔａｎ）、ＵＳＳＲ、タシケント（ＴａｓｈＫｅｎｔ）、エバンス（Ｅｖａｎｓ）、国際保健部－Ｊ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ）（ＩＨＤ－Ｊ）、又は国際保健部－ホワイト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ）（ＩＨＤ－Ｗ）である、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、癌を予防又は治療するための組成物。
8. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片；及び
   腫瘍溶解性ウイルス
   を含む、癌を予防又は治療するためのキット。
9. 癌を予防又は治療する医薬の製造のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。