JP7849034B2 - クロマチンの３ｄ構成および転写活性のゲノムスケールイメージング - Google Patents

クロマチンの３ｄ構成および転写活性のゲノムスケールイメージング

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Description

関連出願
本出願は、Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１９年１２月３０日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３Ｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」と題された、米国特許仮出願第６２／９５４，７２０号；およびＺｈｕａｎｇらによる、２０２０年８月４日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３Ｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」と題された、米国特許仮出願第６３／０６０，９４７号の利益を主張する。これらの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
本発明は、全体として、ゲノミクスに関する。一部の実施形態は、転写活性および核構造に関してゲノムの３Ｄ構成をイメージングすることを対象とする。加えて、ある特定の実施形態は、クロマチン構成およびクロマチン－核構造相互作用、ならびにそれらの転写との関係性を対象とする。
ゲノムの三次元（３Ｄ）構成は、遺伝子発現からＤＮＡ複製に及ぶ多くの本質的な細胞機能を制御する。生化学測定法およびイメージング測定法により、広範なスケールに及ぶ複雑なクロマチン構造が明らかになっている。最近、Ｈｉ－Ｃおよび他のシークエンシングベースの方法などのハイスループット染色体コンフォメーションキャプチャー法により、３Ｄゲノム構成の理解が大いに深まり、ゲノムワイドな視点によるループ、ドメイン、および区画などのクロマチン構造が明らかになった。これらの強力なシークエンシングベースの手法には限界もある。例えば、これらの方法は、クロマチン遺伝子座の対間の接触情報を提供するが、これらの遺伝子座についての直接的な空間的位置情報は提供しない。さらに、クロマチン構成についてのほとんどのゲノムワイドな洞察は、１００万個の細胞に及ぶ集団平均の接触マップについて構築される。単一細胞Ｈｉ－Ｃ法の連続的な改善にもかかわらず、これらの方法の単一細胞および／または細胞スループットにおけるクロマチン接触のキャプチャー効率は、比較的低いままであり、それゆえ、単一細胞における３Ｄゲノム構成の調査は、困難な課題のままである。加えて、例えば、相互作用タンパク質、核構造、またはＤＮＡ修飾に関してクロマチン接触を特徴付けるために、Ｈｉ－Ｃを他の測定様式と組み合わせる方法が出現しているが、シークエンシングによる多様式測定法は困難なままである。注目すべきことに、同じ細胞においてクロマチン構成および転写活性の両方のゲノムスケールの測定を可能にする方法は出現していないが、クロマチン構成がどのように転写を制御し、そして今度は転写がどのようにクロマチン構成に影響を及ぼすかを理解することは決定的に重要であるため、そのような方法が非常に求められている。
他方で、イメージングベースの手法は、個々の細胞におけるクロマチン遺伝子座の空間的位置の、高い検出効率での直接的測定を提供する。特に、蛍光インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）は、固定した細胞におけるクロマチン遺伝子座の高度に特異的な検出を可能にし、ごく最近では、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）システムにより、生細胞において特定のクロマチン遺伝子座をイメージングする私たちの能力は大きく向上している。また、クロマチンイメージングは、ＲＮＡおよびタンパク質イメージングと組み合わせて、クロマチン構成と転写活性または相互作用タンパク質因子との間の相互関係を明らかにすることができる。しかしながら、現在のイメージング法は、配列空間におけるスループットに限られており、伝統的に一度に数個の異なるゲノム遺伝子座のみを研究することが可能である。ゲノムスケールイメージングは、個々の細胞においてイメージングされるゲノム遺伝子座の数の著しい増加を必要としうる。したがって、新しい改善が必要である。
本発明は、全体として、ゲノミクスに関する。一部の実施形態は、配列空間においてハイスループットにより、ゲノムまたはゲノムの部分の３Ｄ構成をイメージングすることを対象とする。一部の実施形態は、転写活性および核構造に関して、ゲノムまたはゲノムの部分の３Ｄ構成をイメージングすることを対象とする。加えて、ある特定の実施形態は、クロマチン構造、３Ｄクロマチン構成、染色体トランス相互作用、およびクロマチン－核構造相互作用、ならびにそれらの転写との関係性などを対象とする。本開示の対象物は、場合によって、相互に関連した製品、特定の問題に対する代替的な解決法、および／または１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは品目の、複数の異なる使用を伴う。
ある特定の態様は、全体として、例えば細胞において、クロマチンをイメージングするために、マルチプレックス化ＦＩＳＨを使用するシステムおよび方法、一部の場合にはマルチプレックス化エラー－ロバストＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ＦＩＳＨ：ＭＥＲＦＩＳＨ）を使用するシステムおよび方法を対象とする。加えて、ある特定の態様は、全体として、単一の細胞内の少なくとも１００個または少なくとも５００個の別個のゲノム遺伝子座をイメージングおよび／または決定するシステムおよび方法を対象とする。一部の態様は、全体として、例えば細胞において、クロマチンをイメージングするために、ＦＩＳＨを使用するシステムおよび方法を対象とする。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けることであって、符号語が、いくつかの位置および各位置についての値を含む、関連付けること；ゲノムを含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露すること；複数個の核酸プローブの各核酸プローブについて、試料中の核酸プローブの結合を決定すること；試料中の複数個の核酸プローブの結合に対応する符号語を創出すること；ならびに割り当てられた符号語に基づき、核酸標的の識別を決定することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、核内の新生ＲＮＡの位置を決定すること；ＲＮアーゼを、核へ適用すること；および核内のＤＮＡの位置を決定することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、細胞内のクロマチンをイメージングするためにＭＥＲＦＩＳＨを使用することを含む。実施形態の別のセットにおいて、方法は、単一の細胞内の少なくとも１００個または少なくとも５００個の別個のゲノム遺伝子座をイメージングすることを含む。
実施形態の１つのセットに従って、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けること；ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリードアウト配列を含む第２の部分とを含み、各リードアウト配列が、複数の符号語内の位置の値を表す、曝露すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターへと曝露することであって、各アダプターが、リードアウト配列のうちの１つに実質的に相補的な第１の部分と、１つの同定配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数の同定配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、各リードアウトプローブが、同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターおよび１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、１つまたは複数の別個のシグナル発生実体が、ラウンドの各々において使用される、反復すること；試料中のシグナル発生実体を決定することに基づき、位置における符号語を決定すること；ならびに符号語に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態のまた別のセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けること；ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリードアウト配列を含む第２の部分とを含み、各リードアウト配列が、複数の符号語内の位置の値を表す、曝露すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターへと曝露することであって、各アダプターが、リードアウト配列のうちの１つに実質的に相補的な第１の部分と、１つの同定配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数の同定配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、各リードアウトプローブが、同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターおよび１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、シグナル発生実体のうちの少なくとも１つが、１ラウンドを超えるラウンドにおいて使用される、反復すること；試料中のシグナル発生実体を決定することに基づき、位置における符号語を決定すること；ならびに符号語に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリードアウト配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターへと曝露することであって、各アダプターが、リードアウト配列のうちの１つに実質的に相補的な第１の部分と、１つの同定配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数の同定配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、各リードアウトプローブが、同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のアダプターおよび１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、１つまたは複数の別個のシグナル発生実体が、ラウンドの各々において使用される、反復すること；各ラウンドにおいて決定されるシグナル発生実体に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリードアウト配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数のリードアウト配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、各リードアウトプローブが、リードアウト配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、１つまたは複数の別個のシグナル発生実体が、ラウンドの各々において使用される、反復すること；各ラウンドにおいて決定されるシグナル発生実体に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態のまた別のセットにおいて、方法は、ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、１ラウンドの複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドの複数個の核酸プローブへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、１つまたは複数の別個のシグナル発生実体が、ラウンドの各々において使用される、反復すること；各ラウンドにおいて決定されるシグナル発生実体に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けることであって、符号語が、いくつかの位置および各位置についての値を含み、符号語が、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成し、複数の核酸標的が、ゲノム内において少なくとも１００，０００ヌクレオチド隔てられている、関連付けること；ゲノムを含有する細胞の核を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリード配列を含む第２の部分とを含み、各リード配列が、符号語内の位置の値を表す、曝露すること；複数個の核酸プローブの各核酸プローブについて、核内の核酸プローブの結合を決定すること；核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する符号語を創出することであって、符号語の数値の値が、核酸プローブ上に存在するリード配列に基づく、創出すること；符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を有効な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、符号語を棄却するか、またはエラー補正を符合語へと適用して有効な符合語を形成し、有効な符号語が、複数の核酸標的に割り当てられた複数の符号語である、マッチさせること；ならびに核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する有効な符号語を使用して、核内の核酸の存在量および／または空間的分布を決定することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けることであって、符号語が、いくつかの位置および各位置についての値を含み、符号語が、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成し、ゲノムの複数の核酸標的が、ゲノムの各染色体が２００を超えない核酸標的を含有するように分布している、関連付けること；ゲノムを含有する細胞の核を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリード配列を含む第２の部分とを含み、各リード配列が、符号語内の位置の値を表す、曝露すること；複数個の核酸プローブの各核酸プローブについて、核内の核酸プローブの結合を決定すること；核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する符号語を創出することであって、符号語の数値の値が、核酸プローブ上に存在するリード配列に基づく、創出すること；符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を有効な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、符号語を棄却するか、またはエラー補正を符合語へと適用して有効な符合語を形成し、有効な符号語が、複数の核酸標的に割り当てられた複数の符号語である、マッチさせること；ならびに核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する有効な符号語を使用して、核内の核酸の存在量および／または空間的分布を決定することを含む。
実施形態の別のセットに従って、方法は、ゲノムの５００～１５００の複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けることであって、符号語が、いくつかの位置および各位置についての値を含み、符号語が、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成する、関連付けること；ゲノムを含有する細胞の核を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリード配列を含む第２の部分とを含み、各リード配列が、符号語内の位置の値を表す、曝露すること；複数個の核酸プローブの各核酸プローブについて、核内の核酸プローブの結合を決定すること；核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する符号語を創出することであって、符号語の数値の値が、核酸プローブ上に存在するリード配列に基づく、創出すること；符号語のうちの少なくとも一部について、符号語を有効な符号語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、符号語を棄却するか、またはエラー補正を符合語へと適用して有効な符合語を形成し、有効な符号語が、複数の核酸標的に割り当てられた複数の符号語である、マッチさせること；ならびに核内の複数個の核酸プローブの結合に対応する有効な符号語を使用して、核内の核酸の存在量および／または空間的分布を決定することを含む。
実施形態のまた別のセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けることであって、符号語が、いくつかの位置および各位置についての値を含み、符号語が、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成し、複数の核酸標的が、ゲノム内において少なくとも１００，０００ヌクレオチド隔てられている、関連付けること；ゲノムを含有する細胞の核を、複数個の核酸プローブへと曝露すること；ならびにエラーチェックおよび／またはエラー補正検出法を使用して核内の複数個の核酸プローブの結合を決定することにより、核内の核酸の存在量および／または空間的分布を決定することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けること；ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリード配列を含む第２の部分とを含み、各リード配列が、複数の符号語内の位置の値を表す、曝露すること；試料を、複数個のアダプターへと曝露することであって、アダプターのうちの少なくとも一部が、リード配列のうちの１つまたは複数に実質的に相補的な第１の部分と、１つまたは複数の同定配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数の同定配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、リードアウトプローブのうちの少なくとも一部が、同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、１０を超えない別個のシグナル発生実体が、全てのラウンドにおいて使用される、反復すること；試料中のシグナル発生実体を決定することに基づき、位置における符号語を決定すること；ならびに符号語に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態のさらに別のセットに従って、方法は、ゲノムの複数の核酸標的を、複数の符号語と関連付けること；ゲノムを含有すると思われる細胞を含有する試料を、複数個の核酸プローブへと曝露することであって、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列を含む第１の部分と、１つまたは複数のリード配列を含む第２の部分とを含み、各リード配列が、複数の符号語内の位置の値を表す、曝露すること；試料を、複数個のアダプターへと曝露することであって、アダプターのうちの少なくとも一部が、リード配列のうちの１つまたは複数に実質的に相補的な第１の部分と、１つまたは複数の同定配列を含む第２の部分とを含む、曝露すること；１つまたは複数の同定配列を決定するために、試料を、１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブへと曝露することであって、リードアウトプローブのうちの少なくとも一部が、同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル発生実体を含む第２の部分とを含む、曝露すること；試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を決定すること；および試料中の少なくとも一部の位置においてシグナル発生実体を不活性化すること；試料を、１ラウンドへと曝露するステップと、シグナル発生実体を決定するステップと、シグナル発生実体を不活性化するステップとを反復することであって、シグナル発生実体のうちの少なくとも１つが、１ラウンドを超えるラウンドにおいて使用される、反復すること；試料中のシグナル発生実体を決定することに基づき、位置における符号語を決定すること；ならびに符号語に基づき、試料中の核酸標的を決定することを含む。
実施形態の別のセットに従って、方法は、核内の新生ＲＮＡの位置を決定すること；核内のＤＮＡの位置を決定すること；および核内の核スペックルの位置を決定することを含む。
実施形態のまた別のセットにおいて、方法は、核内の新生ＲＮＡの位置を決定すること；核内のＤＮＡの位置を決定すること；および核内のタンパク質の位置を決定することを含む。実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、核内の新生ＲＮＡの位置を決定すること；核内のＤＮＡの位置を決定すること；および核内の核酸の位置を決定することであって、核酸が、新生ＲＮＡでもＤＮＡでもない、決定することを含む。
一部の態様は、本明細書において説明される実施形態のうちの１つまたは複数を製造する方法を包含する。また、一部の態様は、本明細書において説明される実施形態のうちの１つまたは複数を使用する方法を包含する。
本開示の他の利点および新規の特徴は、付属の図面と共に検討された場合に、多様な非限定的実施形態についての、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
本発明の非限定的実施形態が、概略的なものであり、縮尺通りに描示されることが意図されない、付属の図面に関して、例を目的として記載される。図において、例示される、同一であるか、またはほぼ同一な、各構成要素は、典型的に、単一の番号により表される。例示が、当業者に、本開示を理解することを可能とするのに必要ではない場合、明確さを目的として、あらゆる構成要素、あらゆる図において表示されるわけでも、本発明の各実施形態の、あらゆる構成要素が示されるわけでもない。
図１Ａ～図１Ｉは、ある特定の実施形態による、ゲノムスケールのクロマチンイメージングを示す。
図２Ａ～図２Ｅは、別の実施形態における、ｔｒａｎｓ染色体接触エンリッチメントを示す。
図３Ａ～図３Ｈは、さらに別の実施形態における、核構造の文脈におけるクロマチンおよび転写活性のゲノムスケールのイメージングを示す。
図４Ａ～図４Ｆは、別の実施形態における、活性クロマチン間のｔｒａｎｓ染色体相互作用を示す。
図５Ａ～図５Ｅは、一実施形態における、飽和性増殖系を例示する。
図６Ａ～図６Ｂは、さらに別の実施形態における、接触頻度マトリックスを示す。
図７Ａ～図７Ｃは、さらに別の実施形態における、ゲノムスケールのイメージングに由来するサブ染色体構造およびアンサンブルＨｉ－Ｃデータとの比較を示す。
図８は、別の実施形態における、反復間のクロマチンイメージング実験の再現性を示す。
図９Ａ～図９Ｂは、ある特定の実施形態における、単一細胞中での異なる空間分布を示す。
図１０Ａ～図１０Ｂは、さらに他の実施形態における、新生ＲＮＡ転写物イメージングを示す。
図１１は、ある特定の実施形態における、コンパートメントＢ遺伝子座と、核ラミナとの会合を示す。
図１２は、一部の実施形態における、コンパートメントＡ遺伝子座と、核スペックルとの会合を示す。
図１３Ａ～図１３Ｃは、さらに別の実施形態における、転写阻害時の核ラミナと核スペックルとの会合の変化を示す。
図１４は、さらに別の実施形態における、それぞれのイメージングされた遺伝子座の近くのｔｒａｎｓ染色体Ａ遺伝子座の局部密度を示す。
図１５Ａ～図１５Ｂは、さらに別の実施形態における、クロマチン遺伝子座間の活性－活性ｔｒａｎｓ染色体相互作用のエンリッチメントを示す。
図１６Ａ～図１６Ｂは、さらに別の実施形態における、活性－活性ｔｒａｎｓ染色体相互作用のエンリッチメントを示す。
図１７Ａ～図１７Ｍは、一実施形態における、単一細胞中でのクロマチンドメインの逐次的ハイブリダイゼーションおよび特性評価による高分解能全染色体トレーシングを示す。
図１８Ａ～図１８Ｉは、別の実施形態における、単一染色体中のコンパートメント構造および転写活性と局部クロマチン含量との関係を示す。
図１９Ａ～図１９Ｈは、さらに別の実施形態における、そのＡ／Ｂ組成およびゲノム距離へのドメイン間相互作用の依存性を示す。
図２０Ａ～図２０Ｈは、さらに別の実施形態における、大規模多重化されたコンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールのクロマチンイメージングを示す。
図２１Ａ～図２１Ｅは、一実施形態による、ｔｒａｎｓ染色体相互作用における活性－活性クロマチン相互作用のエンリッチメントを示す。
図２２Ａ～図２２Ｊは、別の実施形態による、核構造の文脈におけるクロマチンおよび転写活性の多モードのゲノムスケールのイメージングを示す。
図２３Ａ～図２３Ｄは、さらに別の実施形態における、ｔｒａｎｓ染色体活性クロマチンの転写活性と局部エンリッチメントとの相関を示す。
図２４Ａ～図２４Ｎは、さらに別の実施形態における、逐次的ハイブリダイゼーションによる高分解能全染色体トレーシング、およびＨｉ－Ｃと比較した、Ｃｈｒ２１構造特性のアンサンブル統計を示す。
図２５Ａ～図２５Ｇは、さらに別の実施形態における、Ｃｈｒ２１およびＣｈｒ２に関するアンサンブルＡ／Ｂコンパートメント分析を示す。
図２６Ａ～図２６Ｊは、さらに別の実施形態における、ＲＮＡおよびＤＮＡ ＦＩＳＨプローブクロストークの測定を示す。
図２７Ａ～図２７Ｊは、一実施形態における、コンビナトリアルＦＩＳＨ：局在特定エラー、再現性、およびＨｉ－Ｃとの比較によるゲノムスケールのイメージングを示す。
図２８Ａ～図２８Ｂは、別の実施形態による、コンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座が、核内で異なる空間分布を示すことを示す。
図２９Ａ～図２９Ｆは、さらに別の実施形態における、ｔｒａｎｓ染色体クロマチン相互作用に対する転写阻害の効果およびクロマチン遺伝子座の核内構造体会合率を示す。
図３０Ａ～図３０Ｄは、さらに別の実施形態における、異なる核環境でのｔｒａｎｓ染色体活性クロマチン相互作用のエンリッチメントを示す。
本発明は、全体として、ゲノミクスに関する。一部の実施形態は、配列空間においてハイスループットにより、ゲノムまたはゲノムの部分の３Ｄ構成をイメージングすることを対象とする。一部の実施形態は、転写活性および核構造に関して、ゲノムまたはゲノムの部分の３Ｄ構成をイメージングすることを対象とする。加えて、ある特定の実施形態は、クロマチン構造、３Ｄクロマチン構成、染色体トランス相互作用、およびクロマチン－核構造相互作用、ならびにそれらの転写との関係性などを対象とする。加えて、多様な実施形態は、核構造および転写活性に関して、ゲノムまたはゲノムの部分の３Ｄ構成のマッピングを可能にするイメージング法を対象とする。一部の実施形態は、染色体またはゲノムスケールにおいてクロマチン遺伝子座および／または新生ＲＮＡ転写物をイメージングするための大規模マルチプレックス化蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法を対象とする。一部の場合、数百のゲノム遺伝子座の同時イメージングを行うことができる。一部の場合、約１０００ゲノム遺伝子座および／またはこれらの遺伝子座内の約１０００の遺伝子の転写活性の、多様な核構造を伴う同時イメージングを行うことができる。ある特定の場合には、クロマチンドメインおよび区画を観察することができる。ある特定の場合には、転写と相関する様式において活性クロマチン相互作用について富化された広範囲の染色体トランス相互作用を観察することができる。一部の場合、ゲノムにわたる核スペックルおよび核ラミナとの転写依存性クロマチン相互作用を観察することができる。
クロマチンの三次元（３Ｄ）構成は、多くのゲノム機能を制御する。３Ｄゲノム構成の理解は、染色体スケールおよびゲノムスケールにおけるクロマチン構成のそのネイティブ環境下における直接的可視化を可能にするツールがないために妨げられている。したがって、ある特定の実施形態において、例えば各ラウンドが１色または２色または３色イメージングを使用して１つまたは２つまたは３つのゲノム遺伝子座を標的化するような、多数のハイブリダイゼーションラウンドにわたる逐次的イメージングによるマルチプレックス化ＦＩＳＨ手法が説明される。他の実施形態において、多くのクロマチン遺伝子座が各ラウンドにおいて同時にイメージングされ、遺伝子座が出現するラウンドの組合せに基づき遺伝子座の別個の識別が決定される、コンビナトリアルのＦＩＳＨ手法が説明される。これは、全体として、例えば、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号；および「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６３号において論じられるような、ＭＥＲＦＩＳＨおよび他の手法に基づく。手法、例えば本明細書において論じられる手法は、単一の細胞内の別個のクロマチン遺伝子座をイメージングするために使用してもよく、クロマチン構造、それらの転写との関係性、核タンパク質との相互作用などへの洞察を提供するために使用してもよい。
一部の態様は、全体として、例えば細胞において、染色体またはクロマチンをイメージングするために、本明細書において説明される技法を含む、マルチプレックス化ＦＩＳＨまたは他の技法を使用する、一部の場合にはＭＥＲＦＩＳＨを使用するシステムおよび方法を対象とする。加えて、ある特定の実施形態は、全体として、単一の細胞内の少なくとも１００の別個のゲノム遺伝子座、少なくとも５００の別個のゲノム遺伝子座、または少なくとも１，０００の別個のゲノム遺伝子座などをイメージングおよび／または決定するシステムおよび方法を対象とする。一部の場合、細胞の他の部分または核、例えば核内に存在するＲＮＡ、例えば新生ＲＮＡ、核スペックル、核小体、核ラミナ、他の核構造またはタンパク質などが決定されうる。非限定例として、細胞の核について、染色体もしくはクロマチン、新生ＲＮＡ、核スペックル、核小体、および／または核ラミナの位置が決定されうる。
ある特定の実施形態は、細胞培養物、細胞の懸濁液、生物組織、生検、生物などを含みうる試料を決定することを対象とする。試料はまた、無細胞でもありうるが、これにもかかわらず、場合によって核酸を含有する。試料が細胞を含有する場合、細胞は、ヒト細胞または他の任意の適切な細胞、例えば、哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、植物細胞などであってもよい。場合によって、１つを超える細胞が存在する場合もある。
試料中において、決定される標的は、核酸、タンパク質などを含みうる。例えば、これらは、試料中の細胞の核内に存在しうる。ある特定の実施形態において、細胞内のクロマチンが、例えば、核スペックル、核小体、核ラミナ、または核構造もしくは核タンパク質を含む細胞の核構造に対して決定されうる。一部の場合、クロマチン遺伝子座および／またはＲＮＡ転写物が、細胞内において、例えば染色体またはゲノムスケールにおいて決定されうる。
そのような方法の一例をここで論じる。しかしながら、この方法は例として示され、限定ではないことを理解すべきである；また、他の態様および実施形態が、本明細書において論じられる。実施形態の１つのセットにおいて、細胞内の、例えば細胞の核内の、核酸が決定されるべきである。これらは典型的に、ＤＮＡ（例えば、クロマチンの形態において、例えばヒストンなどのタンパク質と共にパッケージングされたクロマチンの形態において、存在しうるゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ（例えば、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される転写相の開始におけるＲＮＡ；核内のこのＲＮＡは新生ＲＮＡと言及されることがある）を含む。細胞内のどこにでも存在しうるＲＮＡを検出する技法とは対照的に、ＤＮＡは細胞の核内に高度に圧縮されており、そのためその構造を決定することが実質的により困難である。例えば、ＤＮＡは、染色体またはクロマチンとして細胞内において圧縮されていることがあり、そのようなＤＮＡは多くの場合、核内において緊密にまとまって、からまっているかまたは圧縮されていることがある。したがって、ある特定の実施形態において、ＤＮＡ標的は、空間的に隔てられているように選択されうる。
一部の場合、試料は、核酸プローブとの複数ラウンドのハイブリダイゼーションに供され、ここで１ラウンドまたは複数ラウンドのラウンドは、１つまたは複数の標的核酸を単色または多色イメージングにより標的化する。一部の場合、標的核酸の識別は、それらがイメージングされるのはどのラウンドおよび／またはどの色チャネルかに基づいて決定される。一部の場合、標的核酸の位置が決定される。一部の場合、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００の標的核酸が決定される。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座である。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座および／または新生ＲＮＡ転写物である。一部の場合、ゲノム遺伝子座の位置は、細胞内のクロマチンの三次元構成またはゲノムの三次元構成を決定するために使用される。
一部の場合、細胞内の、例えば細胞の核内の、核酸を標的化することが可能な一次核酸プローブが設計される。プローブの各々は、標的核酸のうちの１つに結合する標的配列を含有する。また、プローブは、一次核酸プローブの識別および位置を決定するために使用されうる１つまたは複数の「リードアウト配列」を含む部分を含有しうる。一部の実施形態において、一次核酸プローブは、複数のリードアウト配列を含有しうる。これらは、一次核酸プローブのリードアウト配列に結合しうる、リードアウトプローブと称される１ラウンドまたは複数ラウンドの二次核酸プローブを使用して個々に読むことができる。また、リードアウトプローブは、例えば多様な顕微鏡検査技法を使用して決定されうるシグナル発生実体、例えば蛍光実体を含有してもよい。一部の場合、複数ラウンドのリードアウトプローブを、１種類のリードアウトプローブが試料に適用され、試料中の蛍光が決定され、その後リードアウトプローブまたはリードアウトプローブ上のシグナル発生実体が不活性化または除去され、次の種類のリードアウトプローブが適用されるように、逐次的に適用してもよい。一部の場合、試料中の位置を、複数のリードアウトプローブと関連付けてもよく、この情報は分析のために数値化されうる。
一部の場合、複数ラウンドのリードアウトプローブを、１種類を超えるリードアウトプローブが各ラウンドにおいて試料に適用され、かつ／または試料中の蛍光が多色イメージングを使用して決定され、その後リードアウトプローブおよび／またはリードアウトプローブ上のシグナル発生実体が不活性化または除去され、２種類以上のリードアウトプローブの次のセットが適用されるように、逐次的に適用してもよい。一部の場合、試料中の位置を、複数のリードアウトプローブと関連付けてもよく、この情報は分析のために数値化されうる。
一部の場合、一次核酸プローブおよび標的核酸の位置は、１ラウンドまたは複数ラウンドのリードアウトプローブを使用して決定されうる。例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００ラウンドなどのリードアウトプローブが存在しうる。したがって、一部の場合、試料を、複数ラウンドの適用するリードアウトプローブへと曝露し、試料中のプローブを決定し（例えば本明細書において説明されるようにシグナル発生実体を使用して）、二次核酸プローブを除去または不活性化してもよい。
加えて、リードアウトプローブは全てが異なっている必要はないことを理解すべきである。一部の場合、対照などとして、複数ラウンドの核酸または他の化学物質を供給した効果のために、例えば任意の分解および／または移動が試料中において、例えば経時的に、起こったかどうかを決定するために、１ラウンドを超える同一のリードアウトプローブを使用してもよい。
一部の場合、試料は、核酸プローブとの複数ラウンドのハイブリダイゼーションに供され、各ラウンドは、単色または多色イメージングに供される。一部の場合、標的核酸の識別は、それらがイメージングされるのはラウンドおよび／または色チャネルのどの組合せかに基づき決定される。一部の場合、標的核酸の位置が決定される。一部の場合、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００の標的核酸が決定される。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座である。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座および／または新生ＲＮＡ転写物である。一部の場合、ゲノム遺伝子座の位置は、細胞内のクロマチンの三次元構成またはゲノムの三次元構成を決定するために使用される。
一部の場合、細胞内の、例えば細胞の核内の、核酸を標的化することが可能な一次核酸プローブ（符号化プローブとも称される）が設計される。プローブの各々は、標的核酸のうちの１つに結合する標的配列を含む。また、プローブは、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブの識別および位置を決定するために使用されうる１つまたは複数の「リードアウト配列」を含む部分を含有しうる。一部の実施形態において、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブは、複数のリードアウト配列を含有しうる。これらは、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブのリードアウト配列に結合しうる、１ラウンドまたは複数ラウンドのリードアウトプローブを使用して個々に読むことができる。また、リードアウトプローブは、例えば多様な顕微鏡検査技法を使用して決定されうるシグナル発生実体、例えば蛍光実体を含有してもよい。一部の場合、複数ラウンドのリードアウトプローブを、１種類のリードアウトプローブが試料に適用され、試料中の蛍光が決定され、その後リードアウトプローブまたはリードアウトプローブ上のシグナル発生実体が不活性化または除去され、次の種類のリードアウトプローブが適用されるように、逐次的に適用してもよい。一部の場合、試料中の位置を、複数のリードアウトプローブと関連付けてもよく、この情報は分析のために数値化されうる。一部の場合、複数ラウンドのリードアウトプローブを、１種類を超えるリードアウトプローブが各ラウンドにおいて試料に適用され、試料中の蛍光が多色イメージングを使用して決定され、その後リードアウトプローブまたはリードアウトプローブ上のシグナル発生実体が不活性化または除去され、１種類を超えるリードアウトプローブの次のセットが適用されるように、逐次的に適用してもよい。一部の場合、試料中の位置を、複数のリードアウトプローブと関連付けてもよく、この情報は分析のために数値化されうる。
一部の場合、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブおよび標的核酸の位置は、１ラウンドまたは複数ラウンドのリードアウトプローブを使用して決定されうる。例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００ラウンドなどのリードアウトプローブが存在しうる。したがって、一部の場合、試料を、複数ラウンドの適用するリードアウトプローブへと曝露し、試料中のプローブを決定し（例えば本明細書において説明されるようにシグナル発生実体を使用して）、二次核酸プローブを除去または不活性化してもよい。
一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブは、一部の実施形態において、リードアウト配列の各々が独特であることを必ずしも必要とすることなく、試料中の様々な標的がリードアウト配列の様々な組合せを使用して決定可能であるように、設計されうる。非限定例として、４つの可能なリードアウト配列である、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤにより、各核酸標的を標的化する一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブのセットが２つのリードアウト配列のみを含有する場合、例えば、ＡＢ、ＡＤ、ＣＢ、ＣＤ、ＡＣ、およびＤＢに対応する最高で６つの異なる標的が同定されうる。
しかしながら、一部の実施形態において、リードアウト配列の可能な組合せの全てが使用されるわけではない。その代わりに、組合せのうちの一部は、核内の任意の標的に割り当てられなくてもよく、例えば、それらの組合せを有する一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブは使用されない場合がある。一部の場合、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブにおいて使用されるリードアウト配列の有効な組合せは、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成するために配置されうる。そのような方法を使用して、有効な一次核酸プローブに対応しない、試料中のリードアウト配列の決定は、エラーチェックを使用してエラー内にあると決定される場合があり、一部の場合、例えば有効な一次核酸プローブに対応するように、エラー補正を使用してさらに補正してもよい。
そのような方法は、以前に、例えば「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号；および「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６３号において説明されているが、そのような方法は、細胞の核内のより制約された環境においてＤＮＡをイメージングすることに適用されなかった。言及される通り、細胞の残りの部分とは異なり、細胞の核は、細胞のゲノムＤＮＡのほとんど全てを含む非常に大部分の核酸、および典型的に高濃度のＲＮＡ（例えば新生ＲＮＡ）を含有する。
したがって、細胞の核内のＤＮＡにアクセスするために、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブの標的は、核内における結合が空間的に隔てられた様式において起こるように選択されうる。例えば、標的は、それらがゲノム空間において隔てられている、例えばゲノム内において少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも３０，０００ｂｐ、少なくとも１００，０００ｂｐ、少なくとも３００，０００ｂｐ、少なくとも１，０００，０００ｂｐ隔てられているように、またはゲノム空間が１００を超えない、２００を超えない、３００を超えない、５００を超えない、１０００を超えない、５０００を超えない、１０，０００を超えない、５０，０００を超えない、１００，０００を超えない核酸標的を含有するように選択されうる。一部の場合、また、例えば核内においてより多くの標的が決定されることを可能にするために、１種類を超える蛍光プローブまたは「色」を使用してもよい。
一部の実施形態において、また、細胞および／または核は、そのようなプローブが細胞および／または核の中の核酸に到達することを可能にするように改変されうる。例えば、細胞は、核酸プローブの進入を可能にするために透過処理または「固定」されうる。加えて、ＤＮＡは、一部の実施形態において、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブによるＤＮＡへのより容易なアクセスを可能にするために、例えば熱を適用することにより、変性されうる。ＤＮＡが通常、二本鎖である一方で、ＲＮＡは一本鎖であるので、これはＲＮＡ決定には典型的には行われない。加えて、ある特定の実施形態において、ＤＮＡを研究しうる前に、例えばＤＮＡを標的化するプローブがＲＮＡに結合することを防ぐために、核内のＲＮＡを除去および／または不活性化しなければならない。一部の場合、例えば、ＲＮアーゼなどの酵素は、ＲＮＡがＤＮＡ決定と干渉することを防ぐために核へと適用されうる。
加えて、ある特定の実施形態において、核内のＲＮＡもまた決定されうることに留意すべきである。これは、例えば核内のＤＮＡおよびＲＮＡの空間的位置、ならびにそれらがどのように互いに関連するかを研究する場合に、特に有益でありうる。したがって、実施形態の１つのセットにおいて、核内のＲＮＡは、上記に説明されるＲＮＡの除去または不活性化前に、例えばゲノムＤＮＡについて上記に説明されることに類似して、決定されうる。
加えて、ある特定の実施形態において、細胞内の、例えば細胞の核内の、タンパク質もまた決定されうる。例として、核スペックル、核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｉｓ）、またはヒストンタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を決定するための多様な方法を使用することができる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、免疫蛍光アッセイが使用されうる。実施形態の別のセットにおいて、「サンドイッチアッセイ」を使用してもよく、ここで、核タンパク質に特異的に結合することが可能な一次抗体が適用され、その後、一次抗体に特異的に結合することが可能な二次抗体が使用され、二次抗体は蛍光実体などのシグナル発生実体を含有する。そのようなタンパク質の決定は、例えば核内の核酸の決定前または後に、上記と同じ試料または同じ核について行ってもよい。したがって、一部の場合、細胞の核内のタンパク質および核酸は、例えば空間的に、決定されうる。
上記の議論は、細胞の核内においてゲノムＤＮＡおよび／または新生ＲＮＡなどの核酸を決定するために使用されうる一実施形態の非限定例である。しかしながら、他の実施形態もまた可能である。したがって、より全体として、多様な態様は、核酸のための多様なシステムおよび方法を対象とする。
言及される通り、ある特定の実施形態において、細胞内の、例えば細胞の核内の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質のうちの１つ、２つ、またはそれ以上が決定されうる。決定されるべき核内の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、または細胞（もしくは他の試料）内に存在する他の核酸を含んでもよい。核酸は、細胞に内因性の場合もあり、細胞へと付加される場合もある。例えば、核酸は、ウイルス性の場合もあり、人工的に創出される場合もある。場合によって、決定される核酸は、細胞により発現されうる。一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。ＲＮＡは、コードＲＮＡ（ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）および／または非コードＲＮＡの場合がある。例えば、ＲＮＡは、タンパク質をコードしうる。細胞内において研究されうるＲＮＡの非限定例は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなどを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、細胞のゲノムの全てまたは少なくともかなりの部分が決定されうる。決定されたゲノムセグメントは、ゲノム上で、連続であるか、または中断される場合がある。例えば、場合によって、細胞内の、少なくとも４つのゲノムセグメントが決定され、場合によって、細胞内の、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００のゲノムセグメントが決定されうる。
場合によって、細胞の全ゲノムが決定されうる。ゲノムは、全般的に、染色体ＤＮＡだけではなく、細胞内において産生される、全てのＤＮＡ分子を包含することを理解されたい。したがって、例えば、ゲノムはまた、場合によって、例えば、染色体ＤＮＡに加えて（または染色体ＤＮＡではなく）、ミトコンドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなども含みうる。一部の実施形態において、細胞のゲノムの少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％が決定されうる。
加えて、一部の実施形態において、細胞内の、または細胞の核内の、核酸のかなりの部分が研究されうる。例えば、一部の場合、核内のＲＮＡ、例えば新生ＲＮＡが決定されうる。加えて、一部の場合、細胞内に存在するＲＮＡの十分量が、細胞の部分または完全トランスクリプトームを産生するために決定されうる。一部の場合、少なくとも４種類のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、新生ＲＮＡなど）が、細胞内において、または細胞の核内において決定され、一部の場合、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも１２種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも１６種類、少なくとも２０種類、少なくとも２２種類、少なくとも３０種類、少なくとも３１種類、少なくとも３２種類、少なくとも５０種類、少なくとも６３種類、少なくとも６４種類、少なくとも７２種類、少なくとも７５種類、少なくとも１００種類、少なくとも１２７種類、少なくとも１２８種類、少なくとも１４０種類、少なくとも２５５種類、少なくとも２５６種類、少なくとも５００種類、少なくとも１，０００種類、少なくとも１，５００種類、少なくとも２，０００種類、少なくとも２，５００種類、少なくとも３，０００種類、少なくとも４，０００種類、少なくとも５，０００種類、少なくとも７，５００種類、少なくとも１０，０００種類、少なくとも１２，０００種類、少なくとも１５，０００種類、少なくとも２０，０００種類、少なくとも２５，０００種類、少なくとも３０，０００種類、少なくとも４０，０００種類、少なくとも５０，０００種類、少なくとも７５，０００種類、または少なくとも１００，０００種類のＲＮＡが、細胞内において、または細胞の核内において決定されうる。
場合によって、細胞のトランスクリプトームが決定されうる。トランスクリプトームは、全般的に、ｍＲＮＡだけではなく、細胞内において産生される、全てのＲＮＡ分子を包含することを理解されたい。したがって、例えば、トランスクリプトームはまた、ある特定の場合には、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなども含みうる。一部の実施形態において、細胞のトランスクリプトームの少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が決定されうる。加えて、一部の場合、細胞の核のトランスクリプトームが決定されうる。
さらに、一部の実施形態において、決定される他の標的は、核酸、タンパク質などへと連結されている標的を含みうる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、標的を認識することが可能な結合性実体は、核酸プローブへとコンジュゲートされていてもよい。結合性実体は、標的を、例えば、特異的に、または非特異的に認識しうる、任意の実体でありうる。非限定例は、酵素、抗体、受容体、相補性核酸鎖、アプタマーなどを含む。例えば、オリゴヌクレオチドへと連結された抗体は、標的を決定するのに使用されうる。標的は、オリゴヌクレオチドへと連結された抗体に結合することが可能であり、オリゴヌクレオチドは、本明細書において論じられる通りに決定されうる。
細胞内または他の試料中の核酸などの標的の決定は、定性的および／または定量的な場合がある。加えて、決定は、空間的であることが可能であり、例えば、細胞内または他の試料中の、核酸または他の標的の位置が、二次元または三次元において決定されうる。一部の実施形態において、細胞内または他の試料中の、核酸または他の標的の、位置、数、および／または濃度が決定されうる。
言及される通り、実施形態の１つのセットにおいて、細胞の核内のＤＮＡ、例えば細胞のゲノムＤＮＡは、例えばエラー検出符号および／またはエラー補正符号による逐次的イメージングを使用することまたはコンビナトリアルのイメージングを使用することを含む、例えば本明細書において論じられるような核酸プローブを使用して、研究されうる。
ある特定の実施形態において、細胞内の、または細胞の核内の、ＤＮＡ標的またはＤＮＡ標的と関連付けられる符号は、標的がイメージングの各ラウンドにおいて、例えば染色体の、小さくまとまった領域へと構成されるなどのクロマチン構成の知識に基づき、例えばゲノム空間においてまたは物理的空間において、空間的に隔てられるように選択されうる。これは、例えば本明細書において論じられる技法などの技法を使用して、例えば細胞の核の細胞内の様々な標的を同定することを可能にするために有用でありうる。
ゲノム空間内の標的を、任意の適切な技法を使用して、例えばランダムに、または実質的に均一な確率分布などを有して選択してもよい。ある特定の実施形態において、標的は、空間分離を確実にするように個々に選択されうる。加えて、一部の実施形態において、標的は、例えば特定の研究のための、ゲノム内の目的の標的であるように選択されうる。
例えば、一部の実施形態において、標的は、ゲノム空間内において、核がある特定の数を超えない核酸標的を有するように選択されうる。例えば、標的は、ゲノム空間が、１００，０００を超えない、１０，０００を超えない、８，０００を超えない、６，０００を超えない、５，０００を超えない、４，０００を超えない、３，０００を超えない、２，０００を超えない、１，５００を超えない、１，０００を超えない、９００を超えない、８００を超えない、７００を超えない、６００を超えない、５００を超えない、４００を超えない、３００を超えない、２００を超えない、１００を超えない核酸標的、３０を超えない核酸標的、または１０を超えない核酸標的を含有するように選択されうる。加えて、一部の実施形態において、標的は、ゲノム空間が、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００などの核酸標的を含有するように選択されうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、ある特定の実施形態において可能であり、例えば、３０～１００、３，０００～５，０００、５００～１，５００などの核酸標的が存在しうる。そのような標的は、本明細書において論じられる通り、例えば選択的に、ランダムになど、選択されうる。
別の例として、一部の実施形態において、標的は、ゲノム内の染色体がある特定の数を超えない核酸標的（例えばゲノム遺伝子座）を有するように選択されうる。例えば、標的は、各染色体が、１０，０００を超えない、１０００を超えない、５００を超えない、４００を超えない、３００を超えない、２００を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、９０を超えない、８０を超えない、７０を超えない、６０を超えない、５０を超えない、４０を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０を超えない核酸標的を有するように選択されうる。一部の場合、標的は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００などの核酸標的を有するように選択されうる。一部の場合、これらの組合せを選択してもよく、例えば、染色体は、３０～５０、４０～１００、５０～６０、３０～８０などの核酸標的を有しうる。加えて、異なる染色体は、例えば本明細書において説明される範囲を含む、同じまたは異なる数の核酸標的を独立的に有しうる。
そのような標的は、例えば本明細書において論じられる通り、例えば選択的に、ランダムになど、選択されうる。非限定例として、ゲノム内の核酸標的は、特定の構造または機能特性、例えば、特定の核アーキテクチャタンパク質が結合しているプロモーター、エンハンサー、および遺伝子座を有するように選択されうる。一部の場合、核酸標的の一部または全ては、それらの各々の染色体に独特である核酸標的でありうる。
また別の実施形態において、標的は、例えば空間的に隔てられた標的の分布を促進するために、最小のある特定の数のヌクレオチド隔てられているように選択されうる。例えば、標的は、ゲノム内において、どの標的も少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００ヌクレオチドなど隔てられているように選択されうる。加えて、ある特定の実施形態において、標的は、ゲノム内において、どの標的も１０，０００，０００ヌクレオチドを超えない、５，０００，０００ヌクレオチドを超えない、３，０００，０００ヌクレオチドを超えない、１，０００，０００ヌクレオチドを超えない、５００，０００ヌクレオチドを超えない、３００，０００ヌクレオチドを超えない、１００，０００ヌクレオチドを超えない、５０，０００ヌクレオチドを超えない、３０，０００ヌクレオチドを超えない、１０，０００ヌクレオチドを超えないだけ隔てられているように選択されうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、ある特定の実施形態において可能であり、例えば、標的は、３０，０００～１００，０００、３，０００，０００～５，０００，０００、５００，０００～１，０００，０００ヌクレオチドなど隔てられている場合がある。そのような標的は、本明細書において論じられる通り、例えば選択的に、ランダムになど、選択されうる。
加えて、実施形態の１つのセットにおいて、細胞の核内のＲＮＡ、例えば細胞の新生ＲＮＡが、例えば上記に説明される核内のＤＮＡの代わりにまたはそれに加えて、研究されうる。一部の場合、例えば、核内のＲＮＡが決定されることがあり、その後、核内のＤＮＡが決定されうる。
一部の場合、ＲＮＡを決定した後、ＲＮＡは、ＤＮＡを決定する前に除去または不活性化されうる。こうすることにより、例えば、ＤＮＡ決定を複雑化しうるＲＮＡシグナルは存在しないので、ＤＮＡおよびＲＮＡ決定の分離を促進しうる。ＲＮＡを除去または不活性化する方法の例は、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼなどのＲＮアーゼの使用を含む。特定の非限定例として、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＶ、ＰＮＰアーゼ、ＲＮアーゼＰＨ、ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＴ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、エキソリボヌクレアーゼＩＩその他が挙げられる。
しかしながら、他の実施形態において、ＤＮＡがＲＮＡの前に決定されてもよく、かつ／または両方が同時に決定されてもよいことを理解すべきである。例えば、ＤＮＡは、エキソデオキシリボヌクレアーゼまたはエンドデオキシリボヌクレアーゼなどのＤＮアーゼを使用して、決定後に除去または不活性化されうる。例として、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＤＮアーゼＩＩ）、ＤＮアーゼＩＶ、ＵｖｒＡＢＣエンドヌクレアーゼその他が挙げられるが、これらに限定されない。別の例として、ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼへの曝露により分解されうる。多くのそのようなヌクレアーゼは、市販されている。
核内のＲＮＡは、任意の適切な技法を使用して決定することができ、核内のＤＮＡを決定するために使用されるのと同じまたは異なる技法を使用して決定されうる。一実施形態において、ＲＮＡは、ＭＥＲＦＩＳＨを使用して決定することができる。例えば、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号；および「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６３号を参照されたい。別の実施形態において、ＲＮＡは、例えば本明細書において論じられる通り、複数の核酸プローブを使用して決定されうる。例えば、一部の実施形態において、ＲＮＡは、以下に説明される通り、符号化核酸プローブ、一次増幅核酸、二次増幅核酸などの核酸を使用して決定されうる。一部の場合、核酸プローブは、例えば本明細書において論じられる通り、エラー検出および／またはエラー補正符号を規定しうる。
一部の実施形態において、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡは、本明細書において説明される通り、符号化核酸プローブ、一次増幅核酸、二次増幅核酸などの核酸を使用して決定されうる。一部の場合、核酸プローブは、例えば本明細書において論じられる通り、エラー検出および／またはエラー補正符号を規定しうる。
加えて、実施形態の１つのセットにおいて、細胞の核内のタンパク質は、例えば核内に存在する核酸に加えて、上記に説明される技法などの技法を使用して研究されうる。研究されうるタンパク質の例として、核スペックル、核小体、核ラミナ、またはヒストンタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。スペックルは、プレメッセンジャーＲＮＡスプライシング因子が富化されており、哺乳動物細胞の核細胞質のクロマチン間領域に位置しうる構造である。核小体は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードする頻繁に転写されるゲノム遺伝子座の周りに形成される構造であり、ｒＲＮＡおよびそれと会合する転写装置について富化されている場合がある。各ラミナは、核内膜に伴うタンパク質構造であり、中間径フィラメント（ラミン）および転写的に不活性であるクロマチンについて富化されている場合がある。ヒストンは、核内においてＤＮＡを包んでまたは折り畳んで、より小さくまとまった複合体にし、クロマチンを形成するために、使用されるタンパク質である。
タンパク質を決定するための多様な方法を使用することができる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、免疫蛍光アッセイが使用されうる。実施形態の別のセットにおいて、「サンドイッチアッセイ」を使用してもよく、ここで、核タンパク質に特異的に結合することが可能な一次抗体が適用され、その後、一次抗体に特異的に結合することが可能な二次抗体が使用され、二次抗体は蛍光実体などのシグナル発生実体、または例えば蛍光実体に連結される相補的オリゴヌクレオチドを使用して検出されうるオリゴヌクレオチドを含有する。そのようなタンパク質の決定は、例えば核内の核酸の決定前または後に、上記と同じ試料または同じ核について行ってもよい。したがって、一部の場合、細胞の核内のタンパク質および核酸は、例えば空間的に、決定されうる。
言及される通り、本明細書において説明される実施形態などの多様な実施形態において、多様な核酸プローブは、細胞または他の試料中の、例えば細胞の核内の１つまたは複数の標的を決定するために使用することができる。プローブは、核酸（または核酸に、例えば特異的に、ハイブリダイズすることができる実体）、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、および／またはそれらの組合せを含みうる。核酸プローブの例として、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号；および「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６３号が挙げられるが、これらに限定されない。場合によって、例えば、本明細書において論じられる通り、核酸プローブ内には、さらなる構成要素もまた、存在しうる。加えて、任意の適切な方法を使用して、核酸プローブを細胞へと導入する、例えば細胞の核を標的化することができる。
例えば、一部の実施形態において、細胞は、例えば、細胞内の、例えば核内の、核酸または他の標的の位置を保存するために、核酸プローブを導入する前に固定される。細胞を固定するための技法は、当業者に公知である。非限定例として述べると、細胞は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸などの化学物質を使用して固定されうる。一実施形態において、細胞は、Ｈｅｐｅｓ－グルタミン酸緩衝液媒介有機溶媒（ＨＯＰＥ）を使用して固定されうる。
加えて、一部の場合、細胞（または他の試料）は、例えば比較的長い実験の間、１回を超えて固定してもよい。例として、試料は、実験開始後、例えば細胞の核を複数の核酸プローブへと曝露した後に、再固定されうる。例えば、細胞または他の試料は、少なくとも７日毎に１回、少なくとも４日毎に１回、少なくとも２日毎に１回、少なくとも毎日１回、少なくとも１２時間毎に１回、少なくとも６時間毎に１回、少なくとも３時間毎に１回など固定されうる。一部の場合、これは、例えば核酸プローブ（例えば一次または二次核酸プローブ）への曝露などの、多様なラウンドの間において行われうる。一部の場合、試料は、ある特定の回数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、または他の任意の適切な回数固定されうる。多数回の固定が行われる場合、これらは、同じまたは異なる固定技法を独立的に使用しうる。
核酸プローブは、任意の適切な方法を使用して細胞（または他の試料）へと導入されうる。場合によって、細胞は、核酸プローブが、細胞の近傍に核酸プローブを含有する流体により、細胞へと導入されうるように、十分に透過処理されうる。場合によって、細胞は、固定工程の一部として、十分に透過処理される場合もあり、他の実施形態において、細胞は、エタノール、メタノール、Ｔｒｉｔｏｎなど、ある特定の化学物質への曝露により透過処理されうる。加えて、一部の実施形態において、電気穿孔またはマイクロインジェクションなどの技法を使用して、核酸プローブを細胞または他の試料へと導入することができる。
したがって、ある特定の態様は、全般的に、細胞（または他の試料）へと導入される核酸プローブを対象とする。プローブは、適用に応じて、典型的に、ワトソン－クリック型の塩基対合により、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどの核酸と、ハイブリダイズしうる、様々な実体のうちのいずれかを含みうる。核酸プローブは、典型的に、標的、例えば、標的核酸の、少なくとも一部に結合することが可能な標的配列を含有する。場合によって、結合は、特異的結合（例えば、相補的結合を介する）でありうる。細胞または他のシステムへと導入されると、標的配列は、特異的標的（例えば、新生ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは本明細書において論じられる他の核酸）に結合することが可能でありうる。核酸プローブはまた、下記において論じられる、１個または複数個のリードアウト配列も含有しうる。
場合によって、１種類を超える核酸プローブは、試料へと、例えば、逐次的に適用される場合もあり、同時に適用される場合もある。例えば、試料へと、例えば細胞の核を標的化するために細胞へと、適用される、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、少なくとも１，０００個、少なくとも３，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも３０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも３００，０００個、少なくとも１，０００，０００個の識別可能な核酸プローブが存在しうる。場合によって、核酸プローブは、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える核酸プローブは、同時に添加されうる。
核酸プローブは、核酸プローブ内の任意の場所に配置されうる、１つまたは複数の標的配列を含みうる。標的配列は、核内に存在しうる標的、例えば標的核酸の一部に実質的に相補的である領域を含有しうる。例えば、場合によって、部分は、例えば、特異的結合をもたらすように、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。典型的に、相補性は、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合に基づき決定される。
場合によって、標的配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、標的配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、標的配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、細胞または細胞の核内の核酸標的または核酸標的と関連付けられる符号は、標的がイメージングの各ラウンドにおいて、染色体の、小さくまとまった領域へと構成されるなどの以前のクロマチン構成の知識に基づき、例えばゲノム空間においてまたは物理的空間において、空間的に隔てられるように選択されうる。
加えて、一部の場合、核酸プローブの標的配列は、細胞または他の試料中に、例えば細胞の核内に、存在すると思われる標的を参照して決定されうる。例えば、タンパク質に対する標的核酸（例えば、核スペックル、核ラミナなど）は、例えば、タンパク質を形成するように発現される核酸を決定することにより、タンパク質の配列を使用して決定されうる。場合によって、例えば、上記において論じられた長さを有するタンパク質をコードする核酸の一部だけが使用される。
ある特定の実施形態に従って、特定の標的を同定するために使用されうる１つを超える標的配列を使用してもよい。例えば、同じ標的の、同じまたは異なる領域に、逐次的に、かつ／もしくは同時に結合しうるか、またはこれと、逐次的に、かつ／もしくは同時にハイブリダイズしうる、複数のプローブが使用されうる。ハイブリダイゼーションとは、典型的に、相補性の一本鎖核酸が、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合（例えば、グアニン－シトシン間およびアデニン－チミン間の水素結合）を介して会合して、二本鎖核酸を形成する、アニーリング工程を指す。
一部の実施形態において、核酸プローブはまた、１つまたは複数の「リードアウト」配列も含みうる。リードアウト配列は、例えば、下記において論じられる、シグナル発生実体との会合を介して、核酸プローブを同定するのに使用されうる。一部の実施形態において、核酸プローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、２４個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、４８個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリードアウト配列を含みうる。リードアウト配列は、核酸プローブ内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリードアウト配列が存在する場合、リードアウト配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。
リードアウト配列は、任意の長さでありうる。１つを超えるリードアウト配列が使用される場合、リードアウト配列は、独立に、同じまたは異なる場合がある。例えば、リードアウト配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リードアウト配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、リードアウト配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、リードアウト配列は、任意またはランダムでありうる。ある特定の場合に、リードアウト配列は、細胞または他の試料の、他の成分との相同性を低減するか、または最小化するように、例えば、リードアウト配列自体が、細胞内または他の試料中に存在すると思われる他の核酸と結合したり、ハイブリダイズしたりしないように選び出される。場合によって、相同性は、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満でありうる。場合によって、２０塩基対未満、１８塩基対未満、１５塩基対未満、１４塩基対未満、１３塩基対未満、１２塩基対未満、１１塩基対未満、または１０塩基対未満の相同性が存在する場合もある。場合によって、このような塩基対は、連続的である。
加えて、一部の実施形態において、リードアウト配列の一部または全ては、それらが互いへのおよび／または試料中に存在すると思われるゲノムもしくは他の核酸への特異的結合を呈しないように選択されうる。例えば、リードアウト配列の集団は、特異的結合または相補性について「ブラストされる（ｂｌａｓｔｅｄ）」かまたは試験されうる。一部の場合、リードアウト配列は、互いへの特異的結合を呈しない場合があり、かつ／またはそのため、リードアウト配列の集団内のリードアウト配列のいずれも、リードアウト配列の集団内の別のリードアウト配列への５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドなどを超える相補性を有しない。
実施形態の１つのセットにおいて、核酸プローブの集団は、試料中において決定されるべき核酸標的の数と同じでありうる、ある特定の数のリードアウト配列を含有する場合があり、例えば、各独特なリードアウト配列は独特な標的に対応する。実施形態の別のセットにおいて、核酸プローブの集団は、試料中において決定されるべき核酸標的の数未満でありうる、ある特定の数のリードアウト配列を含有しうる。当業者は、１つのシグナル発生実体と、ｎのリードアウト配列が存在する場合、一般に、２ｎ－１の異なる核酸標的が、固有に同定されうることを承知するであろう。しかし、全ての可能な組合せが使用される必要はない。例えば、核酸プローブ集団は、１２の異なる核酸標的をターゲティングしうるが、８個を超えないリードアウト配列を含有しうる。別の例として述べると、核酸プローブ集団は、１４０の異なる核酸標的をターゲティングしうるが、１６個を超えないリードアウト配列を含有しうる。各プローブ内のリードアウト配列の、異なる組合せを使用することにより、異なる核酸標的が、個別に同定されうる。例えば、核酸プローブの集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６などまたはそれよりも多くのリードアウト配列を含有しうる。場合によって、核酸プローブ集団は、各々、同じ数のリードアウト配列を含有しうるが、他の場合には、多様なプローブ上に、異なる数のリードアウト配列が存在しうる。
非限定例として述べると、第１の核酸プローブは、第１の標的配列、第１のリードアウト配列、および第２のリードアウト配列を含有しうるが、第２の、異なる核酸プローブは、第２の標的配列、同じ第１のリードアウト配列を含有しうるが、第２のリードアウト配列ではなく、第３のリードアウト配列を含有しうる。このようなプローブは、こうして、本明細書において論じられる通り、所与のプローブまたは位置に存在するか、またはこれと会合した、多様なリードアウト配列を決定することにより識別されうる。例えば、プローブは、下記において論じられる、「符号語」を使用して、逐次的に同定され、符号化されうる。符号語はまた、エラーの検出および／または補正にかけられてもよい。
別の非限定例として、核酸プローブの第１の集団は、第１の標的配列、第１のリードアウト配列、および第２のリードアウト配列を含有する場合があり、一方で、核酸プローブの第２の異なる集団は、第２の標的配列、同じ第１のリードアウト配列を含有するが、第２のリードアウト配列の代わりに第３のリードアウト配列を含有する場合がある。そのようなプローブは、それによって、本明細書において論じられる通り、所与のプローブまたは位置に存在するかまたはそれと会合する多様なリードアウト配列を決定することによって区別されうる。例えば、プローブの集団は、以下に論じられる通り、「符号語」を使用して逐次的に同定および符号化することができる。また、適宜、符号語は、エラー検出および／または補正に供してもよい。
加えて、ある特定の実施形態において、核酸プローブ集団は、プローブ集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、核酸プローブは、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
一態様において、核酸プローブ上のリードアウト配列は、対応する一次増幅核酸上の認識配列に結合する（例えば、特異的に）ことが可能でありうる。したがって、核酸プローブが、生物学的試料中の標的、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を認識する場合、一次増幅核酸はまた、核酸プローブのリードアウト配列と、対応する、一次増幅核酸上の認識配列との相互作用、例えば、相補性結合により、核酸プローブを介して、標的と会合することも可能である。例えば、認識配列は、標的リードアウト配列を認識することが可能でありうるが、他の非標的リードアウト配列を、実質的に認識しないか、またはこれらに実質的に結合しない。一次増幅核酸はまた、適用に応じて、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、および／またはＰＮＡなどとハイブリダイズすることが可能な、様々な実体のうちのいずれかも含みうる。例えば、このような実体は、認識配列の一部または全部を形成しうる。
場合によって、認識配列は、標的リードアウト配列に対して、実質的に相補性でありうる。場合によって、配列は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。典型的に、相補性は、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合に基づき決定される。標的リードアウト配列の構造は、既に記載されている構造を含みうる。
場合によって、認識配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、認識配列は、５００、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、認識配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、一次増幅核酸はまた、下記において論じられる、二次増幅核酸に結合することが可能な、１個または複数個のリードアウト配列も含みうる。例えば、一次増幅核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリードアウト配列を含みうる。リードアウト配列は、一次増幅核酸内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリードアウト配列が存在する場合、リードアウト配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。一実施形態において、一次増幅核酸は、第１の末端において、認識配列を含み、第２の末端において、複数個のリードアウト配列を含む。
場合によって、一次増幅核酸内のリードアウト配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リードアウト配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、リードアウト配列は、１０～２０ヌクレオチドの間、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一次増幅核酸内には、任意の数のリードアウト配列が存在しうる。例えば、一次増幅核酸内には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはこれを超えるリードアウト配列が存在しうる。一次増幅核酸内に、１つを超えるリードアウト配列が存在する場合、リードアウト配列は、同じまたは異なる場合がある。場合によって、例えば、リードアウト配列は、全て、同一でありうる。
一部の実施形態において、一次増幅核酸の集団は、核酸集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、一次増幅核酸は、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
場合によって、１種類を超える一次増幅核酸は、試料へと、例えば、逐次的にまたは同時に適用される場合がある。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００の識別可能な一次増幅核酸が、試料へと適用されうる。場合によって、一次増幅核酸は、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える一次増幅核酸は、同時に添加されうる。
実施形態の１つのセットにおいて、一次増幅核酸上のリードアウト配列は、対応する二次増幅核酸上の認識配列に結合する（例えば、特異的に）ことが可能でありうる。したがって、核酸プローブが、生物学的試料中の標的、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を認識する場合、二次増幅核酸はまた、一次増幅核酸のリードアウト配列と、対応する二次増幅核酸増幅核酸上の認識配列との相互作用、例えば、相補性結合により、一次増幅核酸を介して、標的と会合することも可能である。例えば、二次増幅核酸上の認識配列は、一次増幅核酸上のリードアウト配列を認識することが可能でありうるが、他の非標的リードアウト配列を、実質的に認識しないか、またはこれらに実質的に結合しない。二次増幅核酸はまた、適用に応じて、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、および／またはＰＮＡなどとハイブリダイズすることが可能な、様々な実体のうちのいずれかも含みうる。例えば、このような実体は、認識配列の一部または全部を形成しうる。
場合によって、二次増幅核酸上の認識配列は、一次増幅核酸上のリードアウト配列に対して、実質的に相補性でありうる。場合によって、配列は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。
場合によって、二次増幅核酸上の認識配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、認識配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、認識配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、二次増幅核酸は、本明細書において論じられる通り、シグナル発生実体を含む場合があり、かつ／またはシグナル発生実体に結合することが可能な１つもしくは複数のリードアウト配列を含む場合がある。例えば、二次増幅核酸は、シグナル発生実体に結合することが可能な、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリードアウト配列を含みうる。リードアウト配列は、二次増幅核酸内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリードアウト配列が存在する場合、リードアウト配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。一実施形態において、二次増幅核酸は、第１の末端において、認識配列を含み、第２の末端において、複数個のリードアウト配列を含む。この構造はまた、一次増幅核酸の構造と、同じまたは異なる場合がある。
場合によって、二次増幅核酸内のリードアウト配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リードアウト配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、二次増幅核酸内のリードアウト配列は、１０～２０ヌクレオチドの間、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
二次増幅核酸内には、任意の数のリードアウト配列が存在しうる。例えば、二次増幅核酸内には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはこれを超えるリードアウト配列が存在しうる。二次増幅核酸内に、１つを超えるリードアウト配列が存在する場合、リードアウト配列は、同じまたは異なる場合がある。場合によって、例えば、リードアウト配列は、全て、同一でありうる。加えて、一次増幅核酸内および二次増幅核酸内には、独立に、同じまたは異なる数のリードアウト配列が存在する場合がある。
ある特定の実施形態において、二次増幅核酸の集団は、核酸集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、二次増幅核酸は、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
場合によって、１種類を超える二次増幅核酸は、試料へと、例えば、逐次的にまたは同時に適用される場合がある。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００の識別可能な二次増幅核酸が、試料へと適用されうる。場合によって、二次増幅核酸は、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える二次増幅核酸は、同時に添加されうる。
加えて、代わりに、ある特定の実施形態において、このパターンが、上記の議論と同様に、例えば、三次増幅核酸、四次増幅核酸などにより、シグナル発生実体の前に繰り返される。したがって、シグナル発生実体は、最終増幅核酸に結合されうる。したがって、非限定例として述べると、標的に、符号化核酸プローブが結合され、これに、一次増幅核酸が結合され、これに、二次増幅核酸が結合され、これに、三次増幅核酸が結合され、これに、シグナル発生実体が結合される場合もあり、または、標的に、符号化核酸プローブが結合され、これに、一次増幅核酸が結合され、これに、二次増幅核酸が結合され、これに、三次増幅核酸が結合され、これに、四次増幅核酸が結合され、これに、シグナル発生実体が結合される場合もあるなどである。したがって、全ての実施形態において、最終増幅核酸は、必ずしも、二次増幅核酸である必要がない。
そのようなシステムの非限定例を図５に例示する。図５Ａ～５Ｅは、可飽和システムの創出を示す。図５Ａは、符号化核酸プローブの一例を示し、符号化核酸プローブ１５は標的ＲＮＡに結合している。図５Ｂは、ある特定の実施形態に従う、使用される一次増幅核酸を示す。図５Ｃは、一次増幅核酸に結合しうる二次増幅核酸を示す。図５Ｄは、複数のシグナル発生実体が二次増幅核酸のリードアウト配列に結合したことを示す。図５Ｅは、増幅が適用されない場合、核酸プローブが、シグナル発生実体を含有する適切な二次核酸プローブへと曝露されうることを示す。
また、ある特定の場合、他の構成要素も、核酸プローブまたは増幅核酸内に存在しうる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、例えば、酵素による増幅を容易とするように、１つまたは複数のプライマー配列が存在しうる。当業者は、増幅（例えば、ＰＣＲまたは他の適切な技法を使用して）などの適用に適するプライマー配列について承知しているであろう。多くのこのようなプライマー配列は、市販されている。一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブ内に存在しうる配列の他の例として、プロモーター配列、オペロン、同定配列、ナンセンス配列その他が挙げられるが、これらに限定されない。
典型的に、プライマーは、核酸合成のための出発点として用いられ、核酸ポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素が、プライマーを伸長させ、相補鎖を複製することを可能とする、一本鎖または部分的に二本鎖の核酸（例えば、ＤＮＡ）である。プライマーは、標的核酸に対して相補性であり、これとハイブリダイズする（例えば、これに対して相補性であり、これとハイブリダイズするようにデザインされる）。一部の実施形態において、プライマーは、合成プライマーである。一部の実施形態において、プライマーは、天然に存在しないプライマーである。プライマーは、典型的に、１０～５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーは、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２５～５０、１５～４０、１５～３０、２０～５０、２０～４０、または２０～３０ヌクレオチドの長さを有しうる。一部の実施形態において、プライマーは、１８～２４ヌクレオチドの長さを有する。
一部の態様において、以前に議論される通り、ある特定の実施形態は、多様な結合事象を符号化し、適宜エラー検出および／または補正を使用して核酸プローブのそれらの標的への結合を決定することができる符号空間を使用する。一部の場合、核酸プローブの集団は、上記に議論される通り、ある特定の増幅核酸に結合しうるある特定の「リードアウト配列」を含有する場合があり、核酸プローブまたは標的の位置は、例えば本明細書において議論される通り、例えばある特定の符号空間内において、増幅核酸と会合するシグナル発生実体を使用して試料中において決定することができる。また、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号および同第ＷＯ２０１６／０１８９６３号も参照されたい。一部の場合、核酸プローブ内のリードアウト配列の集団は、本明細書において議論される通り、例えば比較的少数のリードアウト配列を使用して、比較的多数の異なる核酸プローブを決定することができるように、多様な組合せにおいて組み合わせることができる。
したがって、一部の場合、核酸プローブの集団は、各々ある特定の数のリードアウト配列を含有する場合があり、そのうちの一部は、核酸プローブの集団全体がある特定の数のリードアウト配列を含有しうるように、異なる核酸プローブ間において共有される。核酸プローブの集団は、任意の適切な数のリードアウト配列を有しうる。例えば、核酸プローブ集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個などのリードアウト配列を有しうる。一部の実施形態において、２０を超えるリードアウト配列もまた、可能でありうる。加えて、一部の場合、核酸プローブの集団は、全部で、存在する可能なリードアウト配列のうちの１つまたはそれよりも多く、２つまたはそれよりも多く、３つまたはそれよりも多く、４つまたはそれよりも多く、５つまたはそれよりも多く、６つまたはそれよりも多く、７つまたはそれよりも多く、８つまたはそれよりも多く、９つまたはそれよりも多く、１０またはそれよりも多く、１１またはそれよりも多く、１２またはそれよりも多く、１３またはそれよりも多く、１４またはそれよりも多く、１５またはそれよりも多く、１６またはそれよりも多く、２０またはそれよりも多く、２４またはそれよりも多く、３２またはそれよりも多く、４０またはそれよりも多く、５０またはそれよりも多く、６０またはそれよりも多く、６４またはそれよりも多く、１００またはそれよりも多く、１２８またはそれよりも多くなどを有しうるが、プローブの一部または全ては、本明細書において議論される通り、各々１つを超えるリードアウト配列を含有しうる。加えて、一部の実施形態において、核酸プローブの集団は、１００を超えない、８０を超えない、６４を超えない、６０を超えない、５０を超えない、４０を超えない、３２を超えない、２４を超えない、２０を超えない、１６を超えない、１５を超えない、１４を超えない、１３を超えない、１２を超えない、１１を超えない、１０を超えない、９つを超えない、８つを超えない、７つを超えない、６つを超えない、５つを超えない、４つを超えない、３つを超えない、または２つを超えない存在するリードアウト配列を有しうる。また、これらのうちのいずれの組合せも可能であり、例えば核酸プローブの集団は、全部で１０～１５のリードアウト配列を含みうる。
核酸プローブ内に含有される比較的少数のリードアウト配列から比較的多数の核酸プローブをコンビナトリアルにより同定することへの手法の非限定例として、６つの異なる種類の核酸プローブの集団または６つの異なる核酸プローブ群（例えば、各プローブ群は核酸標的に結合する）であって、核酸プローブの各種類または群が１つまたは複数のリードアウト配列を含む、集団または群において、集団内のリードアウト配列の総数は、４を超えない場合がある。説明を容易にするために４つのリードアウト配列がこの例において使用されるが、他の実施形態において、多数の核酸プローブが、例えば５、８、１０、１６、３２などもしくはそれよりも多くのリードアウト配列、または適用によって本明細書において説明される他の任意の適切な数のリードアウト配列を使用して実現されうることを理解すべきである。例えば、核酸プローブの各々、または核酸プローブの各群が２つの異なるリードアウト配列を含有する場合、４つのそのようなリード配列（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を使用することにより、最大で６つのプローブまたは６つのプローブ群が別々に同定されうる。この例において、核酸プローブまたは核酸プローブ群におけるリードアウト配列の順序は本質的ではない、すなわち、「ＡＢ」と「ＢＡ」とは、同義であるとして処理されうることに留意すべきである（他の実施形態において、リード配列の順序は本質的である場合があり、「ＡＢ」と「ＢＡ」とは必ずしも同義ではない場合があるが）。同様に、核酸プローブの集団において５つのリードアウト配列が使用される場合（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）、最大で１０個のプローブまたは１０個のプローブ群が別々に同定されうる（例えば、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＣＤ、ＣＥ、ＤＥ）。例えば、各プローブまたは各群の群（ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｇｒｏｕｐｓ）におけるｎ個のリードアウト配列を有する集団中のｋ個のリードアウト配列について、リードアウト配列の順序が本質的でないと推定して、最大で
個の異なるプローブが産生される場合があり；なぜなら、プローブの全てまたはプローブ群の全てが同じ数のリードアウト配列を有する必要はなく、かつリードアウト配列の全ての組合せがあらゆる実施形態において使用される必要はなく、また、この数よりも多いかまたは少ない異なるプローブがある特定の実施形態において使用されうることを当業者は理解しうる。加えて、また、各プローブまたは各プローブ群におけるリードアウト配列の数は、一部の実施形態において同一である必要はないことを理解すべきである。例えば、一部のプローブまたは一部のプローブ群は、２つのリード配列を含有しうる一方で、他のプローブまたは他のプローブ群は３つのリード配列を含有しうる。一部の実施形態において、各プローブ群は核酸標的に結合する。
一部の態様において、試料中の核酸プローブの、リードアウト配列および／または結合パターンは、例えば、核酸の誤認またはエラーを低減または防止するように、エラー検出および／またはエラー補正符号を規定するのに使用されうる。したがって、例えば、結合が指し示される（例えば、シグナル発生実体を使用して決定される）場合、位置は、「１」により同定される場合があり；逆に、結合が指し示されない場合、位置は、「０」により同定されうる（または、場合によって、逆も成り立つ）。その後、例えばリードアウト配列に相補的な様々なリードアウトプローブを使用した、複数ラウンドの結合決定を使用して、例えばその空間的位置についての、「符号語」を創出することができる。一部の実施形態において、符号語は、エラー検出および／または補正に供されうる。例えば、符号語は、核酸プローブのリードアウト配列または結合パターンの所与のセットについてマッチが見出されない場合、マッチがエラーとして同定される場合があり、かつ適宜、エラー補正が配列へと適用されて核酸プローブについての正確な標的を決定しうるように構成されうる。一部の場合、符号語は、符号語により符号化される核酸の総数よりも少ない「文字」または位置を有する場合があり、例えばここで各符号語は異なる核酸を符号化する。
このようなエラー検出および／またはエラー補正符号は、様々な形態を取りうる。ゴレイ符号またはハミング符号など、様々なこのような符号は、遠隔通信業界など、他の文脈において、既に開発されている。実施形態の１つのセットにおいて、核酸プローブのリードアウト配列または結合パターンは、あらゆる可能な組合せが割り当てられるとは限らないように割り当てられる。
例えば、４つのリードアウト配列が可能であり、核酸プローブまたは核酸プローブ群が２つのリードアウト配列を含有する場合、最大で６個の核酸プローブまたは６つの核酸プローブ群（例えば、各核酸プローブ群が核酸標的に結合するように）が同定されうる；しかし、使用される核酸プローブの数または核酸プローブ群の数は、６未満でありうる。同様に、各核酸プローブまたは各核酸プローブ群におけるｎ個のリードアウト配列を有する集団中のｋ個のリードアウト配列について、
個の異なるプローブまたは異なるプローブ群が産生される場合があるが、使用される核酸プローブの数または核酸プローブ群の数は、
個よりも多いかまたは少ない任意の数でありうる。加えて、これらは、ランダムに割り当てられるか、またはエラーを検出および／または補正する能力を増大させる、特異的な形において割り当てられる場合がある。
別の例として、複数ラウンドの核酸プローブ（例えば、そのため一次プローブまたは符号化プローブ上のリードアウト配列に結合しうる複数ラウンドのリードアウトプローブ）が使用される場合、ラウンド数は任意に選択されうる。各ラウンド内において、各標的が、検出ありまたは検出なしなど、２つの可能なアウトカムをもたらしうる場合、ｎラウンドのプローブについて、最大において、２ｎ個の異なる標的が可能でありうるが、実際に使用される標的の数は、２ｎ未満の任意の数でありうる。例えば、各ラウンド内において、各標的が、異なる色チャネル内の検出ありなど、２つを超える、可能なアウトカムをもたらしうる場合、ｎラウンドのプローブについて、２ｎ個を超える（例えば、３ｎ、４ｎ、・・・個の）異なる標的が可能でありうる。場合によって、実際に使用される標的の数は、この数未満の任意の数でありうる。加えて、これらは、ランダムに割り当てられるか、またはエラーを検出および／または補正する能力を増大させる、特異的な形において割り当てられる場合がある。
符号語は、多様な符号空間を規定するのに使用されうる。各核酸標的は、符号語と関連付けられる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、符号語は、割当てが、符号語または関連付けられる核酸標的が、異なる、正当な符号語または核酸標的として誤解釈される原因となる、所与のパターン内の、不正確な「リード」の数を測定するハミング距離（Ｈａｍｍｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）だけ隔てられるように、符号空間内に割り当てられうる。ある特定の場合に、ハミング距離は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６などでありうる。加えて、実施形態の１つのセットにおいて、割当ては、ハミング符号、例えば、ハミング（７，４）符号、ハミング（１５，１１）符号、ハミング（３１，２６）符号、ハミング（６３，５７）符号、ハミング（１２７，１２０）符号などとして形成されうる。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、ＳＥＣＤＥＤ符号、例えば、ＳＥＣＤＥＤ（８，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，１１）符号、ＳＥＣＤＥＤ（２２，１６）符号、ＳＥＣＤＥＤ（３９，３２）符号、ＳＥＣＤＥＤ（７２，６４）符号などを形成しうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、割当ては、拡張二元ゴレイ符号、完全二元ゴレイ符号、または三元ゴレイ符号を形成しうる。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、上記において記載した符号のうちのいずれかから取られた、可能な値のサブセットを表しうる。
例えば、エラー補正符号は、固定数または一定数の「１」ビット（または「０」ビット）を含有する二進ワードだけを使用して、標的を符号化することにより形成されうる。例えば、符号空間は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６などの「１」ビット（または「０」ビット）だけを含みうる、例えば、符号の全ては、同じ数の「１」ビットまたは「０」ビットなどを有する。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、非対称のリードアウトエラーに対処する目的のために、上記において記載した符号のうちのいずれかから取られた、可能な値のサブセットを表しうる。例えば、場合によって、「１」ビットの数が、使用される全ての二進ワードについて固定されうる符号は、「０」ビットが、「１」として測定される割合、または「１」ビットが、「０」として測定される割合が異なる場合に、異なる数の「１」による、ワードのバイアス測定を消失させうる。
したがって、一部の実施形態において、符号語が決定されると（例えば本明細書において議論される通り）、符号語は、有効な核酸符号語と比較されうる。マッチが見出される場合、核酸標的は、同定または決定されうる。マッチが見出されない場合、符号語の読取りにおけるエラーが同定されうる。場合によって、適正な符号語を決定し、これにより、核酸標的の適正な識別を結果としてもたらすように、エラー補正もまた適用されうる。場合によって、符号語は、１つのエラーだけが存在すると仮定すると、１つの可能であり適正な符号語だけが利用可能であり、これにより、核酸標的の、１つの適正な識別だけが可能となるように選択されうる。場合によって、これはまた、より大きな符号語間隔またはハミング距離へも一般化される場合があり；例えば、符号語は、２つ、３つ、または４つのエラー（または、場合によって、これを超えるエラー）が存在する場合、１つの可能であり適正な符号語だけが利用可能であり、これにより、核酸標的の、１つの適正な識別だけが可能となるように選択されうる。
エラー補正符号は、二進法のエラー補正符号の場合もあり、他の番号付けシステム、例えば、三進法または四進法のエラー補正符号に基づく場合もある。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、１種類を超えるシグナル発生実体が使用され、エラー補正符号内の異なる数へと割り当てられうる。したがって、非限定例として述べると、第１のシグナル発生実体（または、場合によって、１つを超えるシグナル発生実体）は、「１」として割り当てられ、第２のシグナル発生実体（または、場合によって、１つを超えるシグナル発生実体）は、「２」として割り当てられ（「０」は、シグナル発生実体が存在しないことを指し示す）、符号語は、三進法のエラー補正符号を規定するように分布している。同様に、加えて、四進法のエラー補正符号を作るように、第３のシグナル発生実体が、「３」として割り当てられる場合もあるなどである。
実施形態の１つのセットにおいて、試料中の核酸標的は、符号語に各々割り当てられる。例えば、これらの符号語は、本明細書において説明される符号空間のうちの１つから選択されうる。一部の場合、符号語は、エラー検出および／またはエラー補正符号を形成する。試料は、一部の場合、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブの集団へのハイブリダイゼーションに供されうる。一次プローブまたは符号化プローブの一部または全ては、核酸標的のうちの１つに結合しうる標的配列を含む場合があり、かつ／または１つもしくは複数のリードアウト配列を含む場合もある。各核酸標的に結合する一次プローブまたは符号化プローブの集合におけるリードアウト配列は、核酸標的に割り当てられた符号語に対応する独特な符号語を形成しうる。その後、試料は、リードアウトプローブとの１ラウンドまたは複数ラウンドのハイブリダイゼーションに供される。リードアウトプローブは、リードアウト配列に結合することが可能である場合があり、かつ／またはシグナル発生実体と会合する場合がある。リードアウト配列の集合は、核酸標的と会合する場合があり、それゆえ、核酸標的に割り当てられる符号語は、例えばリードアウトプローブの結合を通して、同定することができる。
一部の場合、多色イメージングを各ラウンドにおいて使用して、異なるシグナル発生実体と会合する多数のリードアウトプローブの同時イメージングおよび同時決定を可能にすることができる。一部の場合、核酸標的の位置が決定される。一部の場合、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００の核酸標的が、このようにして決定される。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座である。一部の場合、標的核酸は、ゲノム遺伝子座および／または新生ＲＮＡ転写物である。一部の場合、ゲノム遺伝子座の位置は、細胞内のクロマチンの三次元構成またはゲノムの三次元構成を決定するために使用される。一部の場合、一次増幅核酸および／または二次増幅核酸および／または三次増幅核酸および／または四次増幅核酸が、各リードアウト配列からシグナルを増幅するために使用される。一部の場合、アダプターは、以下に説明される通りに使用される。
一態様において、複数個のアダプターを使用して試料中の標的の検出を促進することができる。そのようなアダプターは、例えば比較的少数の識別可能なシグナル発生実体が使用されることを可能にする一方で、それでも比較的多数の標的が試料中において決定されることを可能にすることにおいて有用でありうる。例えば、少数のシグナル発生実体、例えば、２０を超えない、１５を超えない、１０を超えない、５つを超えない、４つを超えない、３つを超えない、または２つを超えないシグナル発生実体を使用する一方で、試料中の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００などの標的が決定されうる。
実施形態の１つのセットにおいて、複数個のアダプターが使用されうる。アダプターは、核酸プローブ（例えば一次核酸プローブ）上の１つまたは複数のリードアウト配列に実質的に相補的な第１の部分と、１つまたは複数の同定配列を含む第２の部分とを含みうる。したがって、アダプター配列は、試料中の標的に結合しうる特異的核酸プローブに結合することが可能である。その後、同定配列は、例えば本明細書において論じられるプローブなどのリードアウトプローブまたは二次核酸プローブを介して、結合のために使用可能である。したがって、一部の場合、アダプターは、一次核酸プローブと二次核酸プローブとの間に存在しうる。このことの非限定的な一例を、図２４Ａに示す。
一部の場合、アダプターは、上記に示される通り、比較的少数のシグナル発生実体が使用されることを可能にするように選択されうる。例えば、同定配列は、二次核酸プローブが結合することが可能であるリードアウト配列として作用しうる。１ラウンドの検出において、例えばシグナル発生実体および同定配列のうちの１つに実質的に相補的な配列を含有する、比較的少数の二次核酸プローブが使用される場合があり、シグナル発生実体は、例えば本明細書において論じられる通りに、決定される。その後、二次核酸プローブは、次の検出ラウンドの前に、例えば本明細書において説明される通りに、除去および／または非活性化してもよい。次のおよび後続のラウンドは、例えば異なる同定配列に実質的に相補的な配列を含有する二次核酸プローブ上の、同じまたは異なるシグナル発生実体を使用してもよい。
加えて、一部の実施形態において、コンタミネーションまたは「クロストーク（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ）」を低減するために、以前のラウンドにおいて使用されたアダプターは、一部の様式において非活性化してもよい。例えば、以前の同定配列に実質的に相補的な配列を含有する遮断核酸プローブを、遮断核酸プローブが以前のアダプターに結合することが可能であるように添加してもよく、なぜなら、それらは一般的にシグナル発生実体の存在なしでは検出可能でないためである。したがって、後続の検出ラウンドにおいて、以前のラウンドのためのシグナルは最小限にされうる。
したがって、一部の場合、比較的少数を超えないシグナル発生実体を使用して、比較的多数の同定配列が決定されうる。例えば、２０を超えない、１５を超えない、１０を超えない、５つを超えない、４つを超えない、３つを超えない、または２つを超えないシグナル発生実体を使用して、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００などの同定配列が決定されうる。
同定配列は任意の長さの同定配列でありうる。１つを超える同定配列が使用される場合、同定配列は、同じまたは異なる長さを独立的に有しうる。例えば、同定配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。一部の場合、同定配列は、５００ヌクレオチドを超えない、４５０ヌクレオチドを超えない、４００ヌクレオチドを超えない、３５０ヌクレオチドを超えない、３００ヌクレオチドを超えない、２５０ヌクレオチドを超えない、２００ヌクレオチドを超えない、１７５ヌクレオチドを超えない、１５０ヌクレオチドを超えない、１２５ヌクレオチドを超えない、１００ヌクレオチドを超えない、７５ヌクレオチドを超えない、６０ヌクレオチドを超えない、６５ヌクレオチドを超えない、６０ヌクレオチドを超えない、５５ヌクレオチドを超えない、５０ヌクレオチドを超えない、４５ヌクレオチドを超えない、４０ヌクレオチドを超えない、３５ヌクレオチドを超えない、３０ヌクレオチドを超えない、２０ヌクレオチドを超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれの組合せもまた可能であり、例えば、同定配列は、１０～３０ヌクレオチド、２０～４０ヌクレオチド、５～５０ヌクレオチド、１０～２００ヌクレオチド、または２５～３５ヌクレオチド、１０～３００ヌクレオチドなどの長さを有しうる。
同定配列は、一部の実施形態において、任意またはランダムでありうる。ある特定の場合、例えば同定配列が、細胞または他の試料中に存在すると思われる他の核酸にそれ自体、結合またはハイブリダイズしないように、同定配列は、細胞または他の試料の他の構成要素との相同性を低減または最小限にするように選択される。一部の場合、相同性は、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満でありうる。一部の場合、２０塩基対未満、１８塩基対未満、１５塩基対未満、１４塩基対未満、１３塩基対未満、１２塩基対未満、１１塩基対未満、または１０塩基対未満の相同性が存在しうる。一部の場合、そのような塩基対は、逐次的である。
加えて、一部の実施形態において、同定配列の一部または全ては、それらが互いへのおよび／または試料中に存在すると思われるゲノムもしくは他の核酸、例えばリードアウト配列への特異的結合を呈しないように選択されうる。例えば、同定配列の集団は、特異的結合または相補性について「ブラストされる」かまたは試験されうる。一部の場合、同定配列は、互いへの特異的結合を呈しない場合があり、かつ／またはそのため、同定配列の集団内の同定配列のいずれも、同定配列の集団内のおよび／もしくはリードアウト配列の集団内の別の配列への５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドなどを超える相補性を有しない。
一部の実施形態において、試料は最初に、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブの集団へのハイブリダイゼーションに供される。一次プローブまたは符号化プローブのうちの１個または複数個は、核酸標的のうちの１つに結合しうる標的配列を含み、また１つまたは複数のリードアウト配列を含みうる。その後、試料は、アダプタープローブおよびリードアウトプローブとの複数ラウンドのハイブリダイゼーションに供される。アダプタープローブは、リードアウト配列に結合しうる配列を含む場合があり、また１つまたは複数の同定配列を含む。リードアウトプローブは、同定配列に結合することが可能である場合があり、またシグナル発生実体と会合する。一部の場合、多色イメージングを各ラウンドにおいて使用して、異なるシグナル発生実体と会合する多数のリードアウトプローブの同時イメージングおよび同時決定を可能にすることができる。
本明細書において論じられる通り、ある特定の態様において、シグナル発生実体は、例えば、イメージングして、核酸プローブを決定し、かつ／または符号語を創出することにより決定される。シグナル発生実体の例は、本明細書において論じられるシグナル発生実体を含む。場合によって、試料中のシグナル発生実体は、様々な技法を使用して、例えば、空間的に決定されうる。一部の実施形態において、シグナル発生実体は、蛍光であることが可能であり、蛍光顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、試料中の蛍光を決定するための技法は、細胞内のシグナル発生実体の位置を、空間的に同定するのに使用されうる。場合によって、試料中の実体の位置は、二次元なおまたは三次元において決定される場合もある。加えて、一部の実施形態において、１つを超えるシグナル発生実体は、同時に（例えば、異なる色または発光を伴う、シグナル発生実体）決定される場合もあり、かつ／または逐次的に決定される場合もある。
加えて、一部の実施形態において、同定された標的、例えば核酸標的についての信頼水準が決定されうる。例えば、信頼水準は、正確なマッチの数の、１つまたは複数の１ビットエラーを有するマッチの数に対する比を使用して決定されうる。場合によって、ある特定の値を超える信頼比を有するマッチだけが使用されうる。例えば、ある特定の実施形態において、マッチは、マッチについての信頼比が、約０．０１を超える、約０．０３を超える、約０．０５を超える、約０．１を超える、約０．３を超える、約０．５を超える、約１を超える、約３を超える、約５を超える、約１０を超える、約３０を超える、約５０を超える、約１００を超える、約３００を超える、約５００を超える、約１０００を超えるか、または他の任意の適切な値である場合に限り許容されうる。加えて、一部の実施形態において、マッチは、標的についての信頼比が、内部標準または偽陽性対照を、約０．０１、約０．０３、約０．０５、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約３、約５、約１０、約３０、約５０、約１００、約３００、約５００、約１０００、または他の任意の適切な値を超える場合に限り許容されうる。加えて、一部の実施形態において、マッチは、同定された標的についての信頼比が、内部標準または偽陽性対照を、約０．０１、約０．０３、約０．０５、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約３、約５、約１０、約３０、約５０、約１００、約３００、約５００、約１０００、または他の任意の適切な値超える場合に限り許容されうる。
一部の実施形態において、実体（および、したがって、実体に会合している可能性がある核酸プローブ）の空間的位置は、比較的高分解能において決定されうる。例えば、位置は、約１００マイクロメーターを超える、約３０マイクロメーターを超える、約１０マイクロメーターを超える、約３マイクロメーターを超える、約１マイクロメーターを超える、約８００ｎｍを超える、約６００ｎｍを超える、約５００ｎｍを超える、約４００ｎｍを超える、約３００ｎｍを超える、約２００ｎｍを超える、約１００ｎｍを超える、約９０ｎｍを超える、約８０ｎｍを超える、約７０ｎｍを超える、約６０ｎｍを超える、約５０ｎｍを超える、約４０ｎｍを超える、約３０ｎｍを超える、約２０ｎｍを超える、または約１０ｎｍを超えるなどの空間的分解能において決定されうる。
例えば、蛍光顕微鏡法を使用して、実体の空間的位置を、光学的に決定するか、またはイメージングすることが可能な様々な技法が存在する。一部の実施形態においては、１つを超える色が使用されうる。一部の場合、空間的位置は、超高分解能において、または、光の波長もしくは回折限界を超える分解能において決定される場合がある。非限定例は、ＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＴＥＤ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＮＳＯＭ（Ｎｅａｒ－ｆｉｅｌｄ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、４Ｐｉ顕微鏡法、ＳＩＭ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＭＩ（Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）顕微鏡法、ＲＥＳＯＬＦＴ（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｓａｔｕｒａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｅａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＧＳＤ（Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＳＩＭ（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ－Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＰＤＭ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、蛍光光活性化局在性顕微鏡法（ＦＰＡＬＭ）、ＬＩＭＯＮ（３Ｄ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ Ｎａｎｏｓｉｚｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＯＦＩ（Ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ）、エクスパンション顕微鏡法その他を含む。例えば、各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月２３日において交付され、「Ｓｕｂ－Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１３年１０月２２日において交付され、「Ｓｕｂ－ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、米国特許第７，８３８，３０２号；米国特許第８，５６４，７９２号；または２０１３年６月２０日において公開され、「Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｕａｌ－Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０９０３６０号を参照されたい。
例示的な非限定例として述べると、実施形態の１つのセットにおいて、試料は、高開口数であり、拡大率を１００倍とする、油浸対物レンズと、電子増倍型ＣＣＤカメラ上に集められた光とによりイメージングされうる。別の例において、試料は、高開口数であり、拡大率を４０倍とする、油浸対物レンズと、広視野学術用ＣＭＯＳカメラにより集められた光とによりイメージングされうるであろう。多様な非限定的実施形態において、対物レンズと、カメラとの異なる組合せにより、単一の視野は、１×１ミクロン、１０×１０ミクロン、４０×４０ミクロン、８０×８０ミクロン、１２０×１２０ミクロン、２４０×２４０ミクロン、３４０×３４０ミクロン、または５００×５００ミクロンなどを超えない視野に対応しうる。同様に、一部の実施形態において、単一のカメラピクセルは、１０×１０ｎｍ、２０×２０ｎｍ、４０×４０ｎｍ、８０×８０ｎｍ、１２０×１２０ｎｍ、１６０×１６０ｎｍ、２４０×２４０ｎｍ、または３００×３００ｎｍなどを超えない試料領域に対応しうる。別の例において、試料は、低開口数であり、拡大率を１０倍とするエアレンズと、ｓＣＭＯＳカメラにより集められた光とによりイメージングされうる。さらなる実施形態において、試料は、単一のまたは複数のピンホールを通して集光され、走査ミラーまたは回転ディスクにより生成される、単回または複数回の走査による回折限界の焦点光を介してこれを照射することにより、光学的に分割されうる。別の実施形態において、試料はまた、当業者に公知の、複数の方法のうちの任意の１つを介して生成される、光の薄板を介して照射される場合もある。
一実施形態において、試料は、単一ガウスモードのレーザー光線により照射されうる。一部の実施形態において、照射プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅｄ）は、これらのレーザー光線を、圧電手段または他の機械的手段を介して振動させられた、多重モードファイバーに通すことにより、平板化されうる。一部の実施形態において、照射プロファイルは、単一モードのガウスビームを、πシェイパーなど、様々な屈折ビームシェイパーまたは一連の積層型パウエルレンズに通すことにより、平板化されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、ガウスビームは、場合によって、残留レーザースペックルを除去するように、高速度においてスピニングされうる、グラウンドガラスまたは工学用散光器など、様々な異なる散光要素に通される場合もある。さらに別の実施形態において、レーザー照射は、平板性の照射野を近似する、重複照射画像をもたらすように、一連の小型レンズアレイに通される場合もある。
一部の実施形態において、実体の空間的位置の重心が決定されうる。例えば、シグナル発生実体の重心は、当業者に公知の画像解析アルゴリズムを使用して、画像内において、または一連の画像内において決定されうる。場合によって、アルゴリズムは、試料中の、非重複単一エミッターおよび／または部分重複単一エミッターを決定するように選択されうる。適切な技法の非限定例は、最大尤度アルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、ベイズアルゴリズム、圧縮センシングアルゴリズムなどを含む。場合によって、これらの技法の組合せもまた、使用されうる。
一部の実施形態において、１つまたは複数のシグナル発生実体が決定されうる。例えば、シグナル発生実体は、リードアウトプローブ、または二次増幅核酸（または他の符号化増幅核酸）上の認識実体へと結合されうる。シグナル発生実体の非限定例は、例えば、本明細書において論じられる、蛍光実体（フルオロフォア）またはリン光実体を含む。次いで、シグナル発生実体は、例えば、核酸プローブまたは標的を決定するように決定されうる。場合によって、決定は、空間的であることが可能であり、例えば、二または三次元における決定でありうる。加えて、場合によって、決定は、定量的でありうる、例えば、シグナル発生実体および／または標的の、量または濃度が決定されうる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、二次増幅核酸（または他の最終増幅核酸）へと接合されうる。シグナル発生実体は、試料中の標的への、二次増幅核酸の会合の前に、またはこの後において、二次増幅核酸（または他の最終増幅核酸）へと接合されうる。例えば、シグナル発生実体は、二次増幅核酸へと、最初に接合される場合もあり、二次増幅核酸が、試料へと適用された後において接合される場合もある。場合によって、シグナル発生実体が添加され、次いで、それらを、増幅核酸へと接合するように反応させられる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、シグナル発生実体を放出するように切断されうる結合を介して、ヌクレオチド配列へと接合されうる。例えば、試料中の核酸プローブの分布を決定した後、シグナル発生実体は、核酸プローブおよび／または増幅核酸の別のラウンドの前に、放出または不活性化されうる。したがって、一部の実施形態において、結合は、ジスルフィド結合または光切断型結合など、切断可能な結合でありうる。光切断型結合の例については、本明細書において、詳細に論じられる。場合によって、このような結合は、例えば、還元剤または光（例えば、紫外光）へと曝露されると切断されうる。さらなる詳細については、下記を参照されたい。一部の場合、シグナル発生実体は、光退色させることにより非活性化される。シグナル発生実体を不活化し、かつ／または除去するためのシステムおよび方法の他の例については、本明細書において、詳細に論じられる。
ある特定の実施形態において、一次および二次増幅核酸の使用は、所与の核酸プローブに結合されうるシグナル発生実体の最大数を創出するために使用されうる。例えば、有限数の二次増幅核酸に結合することが可能なシグナル発生実体を有するリードアウトプローブの最大数に起因して、有限数の一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸の最大数に起因して、かつ／または核酸プローブ上の有限数のリード配列に結合することが可能な一次増幅核酸の最大数に起因して、例えば、核酸プローブに結合することが可能なシグナル発生実体には、最大数が存在しうる。各潜在的位置は、シグナル発生実体により、実際に充填される必要はないが、この構造は、それを越えて、偶然に存在しうる、任意のさらなるシグナル発生実体が、核酸プローブまたはその標的と会合することは不可能である、シグナル発生実体の飽和限界が存在することを示唆する。
したがって、ある特定の実施形態は、全般的に、可飽和である、すなわち、どれほどのシグナル発生実体が、核酸プローブまたはその標的と会合しうるのかについての上限である、飽和限界が存在するような、核酸プローブまたはその標的を指し示すシグナルを増幅する、システムおよび方法を対象とする。典型的に、この数は、１を超える。例えば、シグナル発生実体の上限は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００などでありうる。場合によって、上限は、５００未満、４００未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、７５未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満などでありうる。場合によって、上限は、標的に結合する核酸プローブに結合しうる一次増幅核酸の最大数を乗じられた、一次増幅核酸に結合しうる二次増幅核酸の最大数を乗じられた、二次増幅核酸に結合しうるシグナル発生実体の最大数として決定されうる。これに対し、ローリングサークル増幅またはヘアピンアンフォールディングなどの技法は、制御されない形における、シグナルの増幅を可能とする、すなわち、十分な試薬が存在する場合、増幅は、所定の終点または飽和限界を伴わずに持続しうる。したがって、このような技法は、核酸プローブまたはその標的と会合しうるシグナル発生実体の数に関して、理論的上限を有さない。
しかし、核酸プローブまたはその標的に実際に結合したシグナル発生実体の平均数が、実際に、その上限と同じである必要はない、すなわち、シグナル発生実体は、実際には、完全飽和しない場合がある（完全飽和することは可能であるが）ことを理解されたい。例えば、飽和量（または結合しうる最大数と比べた、結合したシグナル発生実体の数）は、９７％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満など、および／または少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％などでありうる。場合によって、結合が生じるための時間を与えること、および／または試薬の濃度を増大させることは、飽和量を増大させうる。
核酸プローブまたはその標的に、実際に結合したシグナル発生実体の数についての潜在的上限のために、試料中に、例えば、空間的に分布した結合イベントは、上記において論じられた制御されない増幅など、制御されない増幅とは対照的に、実質的に均一のサイズおよび／または輝度を提示しうる。例えば、一次増幅核酸に結合しうる、二次増幅核酸の特異的数に起因して、二次増幅核酸は、結合を指し示す、「スポットサイズ」、またはシグナル発生実体からの蛍光の直径を限界づけうる、核酸プローブまたはその標的からの固定距離を超えては見出されえない。
ある特定の実施形態において、結合イベントのうちの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、結合イベントを、非特異的結合、ノイズなど、他のイベントと識別することを容易としうる、実質的に同じ輝度、サイズ（例えば、見かけの直径）、色などを呈しうる。
加えて、場合によって、シグナル発生実体は、不活化されうる。例えば、一部の実施形態において、シグナル発生実体と会合しうる（例えば、増幅核酸を使用する）、第１の二次核酸プローブまたはリードアウトプローブであって、第１のリードアウト配列（例えば、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブ上の）を認識しうる、プローブを、試料へと適用することができ、次いで、例えば、シグナル発生実体と会合しうる（例えば、増幅核酸を使用する）、第２の二次核酸プローブまたはリードアウトプローブが、試料へと適用される前に、シグナル発生実体を不活化することができる。複数のシグナル発生実体が使用される場合、シグナル発生実体を不活化するのに、同じまたは異なる技法が使用される場合があり、複数のシグナル発生実体の一部または全部が、例えば、逐次的にまたは同時に不活化される場合がある。
不活化は、シグナル発生実体の除去（例えば、試料からのまたは核酸プローブからの除去など）により引き起こされる場合もあり、かつ／またはシグナル発生実体を、何らかの形において、化学的に変更することにより引き起こされる場合もある（例えば、シグナル発生実体を光退色させることによるか、シグナル発生実体を退色させることによるか、シグナル発生実体の構造を、例えば、還元により、化学的に変更することなどによる）。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、蛍光シグナル発生実体は、酸化、光退色、化学退色（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）などの、化学的もしくは光学的技法、厳密な洗浄、または酵素による消化もしくは酵素への曝露による反応、シグナル発生実体を、他の構成要素（例えば、プローブ）から解離させること、シグナル発生実体の化学反応（例えば、シグナル発生実体の構造を変更することが可能な反応物）などにより、不活化されうる。例えば、酸素、還元剤への曝露により、退色が生じる場合もあり、シグナル発生実体が、核酸プローブから、化学的に切断され、流体流を介して洗い流される場合もある。
一部の実施形態において、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸を使用して、多様な核酸プローブを、１つまたは複数のシグナル発生実体と会合させうる。１個を超える核酸プローブ（または二次核酸プローブもしくはリードアウトプローブ）が使用される場合、シグナル発生実体は、各々、同じまたは異なる場合がある。ある特定の実施形態において、シグナル発生実体は、発光することが可能な任意の実体である。例えば、一実施形態において、シグナル発生実体は、蛍光実体である。他の実施形態において、シグナル発生実体は、リン光実体、放射性実体、吸光性実体などでありうる。場合によって、シグナル発生実体は、試料中において、比較的高分解能において、例えば、可視光の波長または回折限界を超える分解能において決定されうる、任意の実体である。シグナル発生実体は、例えば、色素、低分子、ペプチド、またはタンパク質などでありうる。シグナル発生実体は、場合によって、単一の分子でありうる。複数の二次核酸プローブまたはリードアウトプローブが使用される場合、核酸プローブは、同じまたは異なる発生実体と会合する場合がある。
シグナル発生実体の非限定例は、蛍光実体（フルオロフォア）またはリン光実体、例えば、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７など）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ａｔｔｏ色素、光切替え可能型色素、光活性化型色素、蛍光色素、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、もしくは「量子ドット」を含む。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、シグナル発生実体を放出するように切断されうる結合を介して、オリゴヌクレオチド配列へと接合されうる。実施形態の１つのセットにおいて、フルオロフォアは、光切断型結合など、切断可能な結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。光切断型結合の非限定例は、１－（２－ニトロフェニル）エチル、２－ニトロベンジル、ビオチンホスホルアミダイト、アクリルホスホルアミダイト、ジエチルアミノクマリン、１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、シクロドデシル（ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、４－アミノメチル－３－ニトロベンジル、［４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル］メチル－Ｓ－アセチルチオ酸エステル、［４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル］メチル－３－（２－ピリジルジチオプロピオン酸）エステル［（４－ｎｉｔｒｏ－３－（１－ｔｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｅｓｔｅｒ］、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１，３－ジオール－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－トリフルオロアセチルカプロアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノ－エチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（Ｎ－（４，４’－ジメトキシトリチル））－ビオチンアミドカプロアミド－メチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、または同様のリンカーを含むがこれらに限定されない。オリゴヌクレオチド配列は、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸など、一次または二次（または他の）増幅核酸でありうる。
実施形態の別のセットにおいて、フルオロフォアは、ジスルフィド結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。ジスルフィド結合は、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、ベータ－メルカプトエタノール、ナトリウムホウ化水素、チオレドキシン、グルタルレドキシン、トリプシノーゲン、ヒドラジン、水素化ジイソブチルアルミニウム、シュウ酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、塩化スズ、グルタチオン、チオグリコール酸塩、２，３－ジメルカプトプロパノール、２－メルカプトエチルアミン、２－アミノエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、ビス（２－メルカプトエチル）スルホン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン、３－メルカプトプロピオン酸塩、ジメチルホルムアミド、チオプロピルアガロース、トリ－ｎ－ブチルホスフィン、システイン、硫酸鉄、亜硫酸ナトリウム、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、ホスホロチオエートなど、および／またはこれらのうちのいずれかの組合せなどであるがこれらに限定されない、様々な還元剤により切断されうる。オリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書において論じられるプローブなどの、一次核酸プローブ、符号化核酸プローブ、リードアウトプローブ、一次もしくは二次（または他の）増幅核酸でありうる。
別の実施形態において、フルオロフォアは、硫黄修飾が、架橋酸素および／または非架橋酸素を置き換える、１つまたは複数のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。ある特定の実施形態において、フルオロフォアは、エタノール中に混合されたヨウ素である、ヨードエタノール、硝酸銀、または塩化水銀などであるがこれらに限定されない化合物の添加を介して、オリゴヌクレオチドから切断されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、シグナル発生実体は、還元または酸化を介して、化学的に不活化されうる。例えば、一実施形態において、Ｃｙ５またはＣｙ７などの発色団は、ホウ化水素ナトリウムを使用して、安定的な、非蛍光状態へと還元されうる。実施形態のなおも別のセットにおいて、フルオロフォアは、アゾ結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされる可能性があり、アゾ結合は、２－［（２－Ｎ－アリールアミノ）フェニルアゾ］ピリジンにより切断されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、フルオロフォアは、ＤＮアーゼ、例えば、エクソデオキシリボヌクレアーゼまたはエンドデオキシリボヌクレアーゼへと、適切に曝露されると切断されうる、適切な核酸セグメントを介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。例は、デオキシリボヌクレアーゼＩまたはデオキシリボヌクレアーゼＩＩを含むがこれらに限定されない。実施形態の１つのセットにおいて、切断は、制限エンドヌクレアーゼを介して生じうる。潜在的に適切な制限エンドヌクレアーゼの非限定例は、ＢａｍＨＩ、ＢｓｒＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩ、ＰｓｐＡＩ、ＤｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｎｌＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｈａＩＩ、ＳｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＨｐａＩ、ＡｐａＩ、ＢｃｌＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＴａｑＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨａｅＩＩ、ＤｒａＩＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰａｃＩなどを含む。３０００を超える制限酵素について、詳細に研究されており、これらのうちの６００を超える制限酵素が市販されている。実施形態のさらに別のセットにおいて、フルオロフォアは、ビオチンへとコンジュゲートされる場合があり、オリゴヌクレオチドは、アビジンまたはストレプトアビジンへとコンジュゲートされうる。ビオチンと、アビジンまたはストレプトアビジンとの相互作用は、フルオロフォアを、オリゴヌクレオチドへと結合する一方で、過剰な添加への十分な曝露がなされると、遊離ビオチンは、連結を「凌駕」し、これにより、フルオロフォアのオリゴヌクレオチドからの解離を生じさせうるであろう。加えて、実施形態の別のセットにおいて、プローブは、二次プローブまたはリードアウトプローブと同じ配列のほか、一次プローブまたは符号化プローブに対する相同性を有する、余分な数の塩基（例えば、１つ～２０の余分な塩基、例えば、５つの余分な塩基）を含む、対応する「トーホールドプローブ（ｔｏｅ－ｈｏｌｄ－ｐｒｏｂｅ）」を使用して除去されうる。これらのプローブは、鎖置換相互作用を介して、標識付けされた二次プローブまたはリードアウトプローブを除去しうる。オリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書において論じられるプローブなどの、一次核酸プローブ、符号化核酸プローブ、リードアウトプローブ、一次もしくは二次（または他の）増幅核酸でありうる。
本明細書において使用される、「光」という用語は、全般的に、任意の適切な波長（または、同義に、周波数）を有する、電磁放射線を指す。例えば、一部の実施形態において、光は、光学的または目視可能な範囲の波長（例えば、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの間の波長を有する光、すなわち、「可視光」）、赤外波長（例えば、約３００マイクロメーター～７００ｎｍの間の波長を有する光）、紫外波長（例えば、約４００ｎｍ～約１０ｎｍの間の波長を有する光）などを含みうる。ある特定の場合に、本明細書において論じられる通り、１つを超える実体、すなわち、化学的に異なるまたは顕著に、例えば、構造的に異なる実体が使用されうる。しかし、他の場合に、実体は、化学的に同一であるか、または少なくとも実質的に、化学的に同一でありうる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、「切替え可能型」である、すなわち、実体は、それらのうちの少なくとも１つが、所望の波長を有する光を発する、２つまたはこれを超える状態の間において切り替えられうる。他の状態（複数可）において、実体は、光を発しない場合もあり、異なる波長の光を発する場合もある。例えば、実体は、所望の波長を有する光をもたらすことが可能な、第１の状態へと「活性化」され、同じ波長の光を発することが可能ではない、第２の状態へと「不活化」されうる。実体は、適切な波長の入射光により活性化される場合、「光活性化型」である。非限定例として述べると、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ６４７は、異なる波長の光により、制御された可逆的な形において、蛍光状態と、無光状態との間において切り替えられうる、すなわち、６３３ｎｍ（または６４２ｎｍ、６４７ｎｍ、６５６ｎｍ）の赤色光が、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ６４７を、安定的な無光状態へと切り替えるか、または不活化しうるのに対し、４０５ｎｍの緑色光は、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ６４７を、蛍光状態へと切り替えるか、または戻して活性化させうる。場合によって、実体は、例えば、適正な刺激へと曝露されると、２つまたはこれを超える状態の間において可逆的に切り替えられうる。例えば、第１の刺激（例えば、第１の波長の光）が、切替え可能型実体を活性化させるのに使用されうるのに対し、第２の刺激（例えば、第２の波長の光）は、切替え可能型実体を、例えば、非発光状態へと不活化するのに使用されうる。任意の適切な方法が、実体を活性化させるのに使用されうる。例えば、一実施形態において、適切な波長の入射光は、実体を活性化させて、発光させるのに使用されうる、すなわち、実体は、「光切替え可能型」である。したがって、光切替え可能型実体は、例えば、異なる波長の入射光により、異なる発光状態または非発光状態の間において切り替えられうる。光は、単色（例えば、レーザーを使用してもたらされる）の場合もあり、多色の場合もある。別の実施形態において、実体は、電界および／または磁界により刺激されると活性化されうる。他の実施形態において、実体は、例えば、ｐＨを調整すること、または実体に関与する、可逆的な化学反応を誘導することなどにより、適切な化学的環境へと曝露されると活性化されうる。同様に、任意の適切な方法が、実体を不活化するのに使用される場合があり、実体を活性化させる方法と、実体を不活化する方法とは、同じである必要がない。例えば、実体は、適切な波長の入射光へと曝露されると、不活化される場合もあり、実体は、十分な時間にわたり待機することにより不活化される場合もある。
典型的に、「切替え可能型」実体は、第１の状態にある実体が、励起波長へと曝露されると、その条件下において発光しうる条件を決定し、実体を、第１の状態から、第２の状態へと切り替え、例えば、波長を切り替えた光へと曝露し、次いで、実体が、第２の状態にある場合、励起波長へと曝露されても、もはや発光しない（または強度を低減した光を発する）ことを示すことにより、当業者により同定されうる。
論じられる通り、実施形態の１つのセットにおいて、切替え可能型実体は、光へと曝露されると切り替えられうる。場合によって、切替え可能型実体を活性化させるのに使用される光は、外部の光源、例えば、レーザー光源などの光源、切替え可能型実体に近接する別の発光実体などに由来しうる。場合によって、第２の発光実体は、蛍光実体であることが可能であり、ある特定の実施形態において、第２の発光実体もまた、それ自体、切替え可能型実体でありうる。
一部の実施形態において、切替え可能型実体は、第１の発光部分（例えば、フルオロフォア）と、第１の部分を活性化させるか、または「切り替える」第２の部分とを含む。例えば、光へと曝露されると、切替え可能型実体の第２の部分は、第１の部分を活性化させ、第１の部分に発光させうる。活性化剤部分の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または他の適切な色素を含むがこれらに限定されない。発光部分の例は、Ｃｙ３Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｉＤ、ＤｉＲ、ＹＯＹＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＹＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯＴ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または他の適切な色素を含むがこれらに限定されない。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８３８，３０２号を参照されたい。場合によって、第１の発光部分は、その後、任意の適切な技法により、不活化されうる（例えば、６４７ｎｍ赤色光を、分子のうちのＣｙ５部分へと方向付けることにより）。
一部の実施形態において、異なる配列を有する複数の核酸プローブが使用され、核酸プローブの各々の分布が逐次的に分析され、核酸プローブの各々の結合パターンに基づき、各位置についての「符号語」を創出するために使用される。適切な符号空間を規定する核酸プローブを選択することにより、観察される結合パターンにおける明らかなエラーを同定および／または棄却および／または補正して、正確な符号語を同定することができ、したがって試料中の核酸プローブの正確な標的を同定することができる。このエラーに対するロバストネスおよびエラー補正システムは、ＭＥＲＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）について最初に導入され、次いで多様な関連技法において使用されてきた。例えば、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号および第ＷＯ２０１６／０１８９６３号を参照されたい。
言及される通り、ある特定の実施形態において、そのような技法は、例えばＭＥＲＦＩＳＨまたは他の同様の技法において使用されるように、エラー補正と組み合わせてもよい。例えば、符号語は、一次核酸プローブまたは符号化核酸プローブ上のリードアウト配列に結合しうる複数個のリードアウトプローブの結合（または非結合）に基づく場合があり、一部の場合、符号語は、核酸プローブの誤認を低減または防止するのを補助するためのエラー補正符号を規定しうる。一部の場合、例えば多様なコンビナトリアルの手法を使用することにより、比較的少数のリードアウトプローブを使用して比較的多数の異なる標的が同定されうる。蛍光顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または光シート顕微鏡は、画像取得に使用することができる。また、ＳＴＯＲＭまたは他の超解像度イメージング法などの画像取得技法は、そのような試料をイメージングし、核酸プローブの決定を促進するために使用されうる。ＭＥＲＦＩＳＨなどの技法に関するさらなる詳細については、例えば、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７１２，８０５号もしくは同第１０，０７３，０３５号、または国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９１２９６号もしくは同第ＷＯ２００９／０８５２１８号を参照されたい。一部の場合、また、試料がイメージング前に拡張されるエクスパンション顕微鏡法を使用してもよい。例えば、各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、「Ｍａｔｒｉｘ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｅａｒｉｎｇ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８９４４５号、または「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＭＥＲＦＩＳＨ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と題された国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８９４３８号を参照されたい。
別の態様は、コンピュータ実装法を対象とする。例えば、本明細書において記載される方法のうちのいずれかを、自動的に、かつ／または反復的に実施することが可能な、コンピュータおよび／または自動式システムが提供されうる。本明細書において使用される、「自動式」デバイスとは、ヒトの指示を伴わずに作動することが可能なデバイスを指す、すなわち、自動式デバイスは、任意のヒトが、例えば、工程を開始するための命令を、コンピュータへと入力することにより、機能を推し進めるための任意の措置を取ることを終えた後の時間において、機能を果たしうる。典型的に、自動式装置は、この時点の後に、反復的機能を果たしうる。場合によって、処理工程はまた、コンピュータ読取り型メディアへも記録されうる。
例えば、一部の場合、例えば蛍光顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、光シート顕微鏡、回折限界光学顕微鏡、ＳＴＯＲＭ、または本明細書において説明される技法などの他の超解像度技法を使用する、試料のイメージングを制御するために、コンピュータを使用してもよい。場合によって、コンピュータはまた、画像解析における、ドリフト補正、物理的登録、ハイブリダイゼーション、およびクラスターの位置合わせ、クラスターの復号（例えば、蛍光クラスターの復号）、エラーの検出または補正（例えば、本明細書において論じられる）、ノイズの低減、フォアグラウンド特徴の、バックグラウンド特徴（画像内のノイズまたはデブリなど）からの識別などの操作も制御しうる。一例として、試料中のシグナル発生実体の活性化および／もしくは励起および／もしくは非活性化、ならびに／またはシグナル発生実体の画像の取得を制御するために、コンピュータを使用してもよい。実施形態の１つのセットにおいて、試料は、多様な波長および／または強度を有する光を使用して励起される場合があり、コンピュータを使用すると、試料を励起するのに使用される光の波長のシーケンスは、シグナル発生実体を含有する試料について収集される画像と相関しうる。例えば、コンピュータは、目的の各領域内の、異なるシグナル発生実体の平均数（例えば、位置１つ当たり１つの活性化実体、位置１つ当たり２つの活性化実体など）をもたらすように、多様な波長および／または強度を有する光を、試料へと当てうる。場合によって、この情報は、場合によって、上記において言及された通り、高分解能において、シグナル発生実体についての画像を構築し、かつ／またはシグナル発生実体の位置を決定するのに使用されうる。
一部の態様において、試料は、顕微鏡上に置かれる。一部の場合、顕微鏡は、流体を、試料へとまたは試料から、方向付けるかまたは制御する、流体チャネルまたはマイクロ流体チャネルなどの１つまたは複数のチャネルを含有しうる。例えば、一実施形態において、本明細書において論じられる核酸プローブなどの核酸プローブは、１つまたは複数のチャネルを介して、流体により、試料へと、または試料から、導入および／または除去されうる。場合によって、また、流体を保持するための、例えば、チャネルおよび／または試料と流体連絡した、１つまたは複数のチャンバーまたはレザバーも存在しうる。当業者は、流体を、試料へと、または試料から動かすための、流体またはマイクロ流体チャネルを含むチャネルについて精通しているであろう。
以下の文献：「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｉｍａｇｅ－Ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」と題された、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／２１８１５０号；「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号；「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」と題された、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６３号；「Ｍａｔｒｉｘ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｅａｒｉｎｇ」と題された、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８９４４５号；「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＭＥＲＦＩＳＨ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と題された、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８９４３８号；ならびに「Ｉｍａｇｉｎｇ－Ｂａｓｅｄ Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」と題された、米国特許出願第６２／８３６，５７８号および「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ＭＥＲＦＩＳＨ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題された、米国特許出願第６２／７７９，３３３号は、参照により本明細書に組み込まれる。また、以下の文献：米国特許第２０１７／０２２０７３３号および同第２０１７／０２１２９８６号は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
加えて、「Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３Ｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」と題された、米国特許出願公開第６２／９５４，７２０号および「Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３Ｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」と題された、米国特許出願公開第６３／０６０，９４７号は、各々参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
以下の例は、本発明のある特定の実施形態を例示することを意図するものであり、本発明の全範囲を例示するものではない。
［実施例１］
以下の実施例は、単一細胞中のゲノムスケールでのクロマチンの３Ｄ構成をイメージングするための大規模多重化ＦＩＳＨ法を示し、両方ともゲノムスケールでのクロマチンおよび新生転写物イメージングと、核構造同定とを組み合わせることによって３Ｄゲノム構成をその天然の構造的および機能的文脈に置く能力をさらに証明する。
この第１の実施例は、単一細胞中でのクロマチン構成のゲノムスケールのイメージングを可能にする大規模多重化ＦＩＳＨ手法を報告する。この手法を使用して、単一細胞中のヒトゲノムにわたる１，０００個を超える異なるゲノム遺伝子座（染色体の相同対を総計する約２，０００個のクロマチン遺伝子座）のイメージングおよび同定が示された。さらに、これらのゲノム遺伝子座の同時的イメージングを、核スペックル、核小体および核ラミナを含む、種々の核構造の文脈においてこれらの遺伝子座に存在する１，０００個を超える遺伝子の新生ＲＮＡ転写物を用いて示した。この手法を使用して、単一細胞中でのクロマチン構成、転写活性、および核の文脈の間の関係を探索した。
ゲノムスケールのクロマチンイメージングを達成するために、トランスクリプトームイメージングのために以前に開発された多重化されたエラーロバストＦＩＳＨ法によって着想されたが、クロマチンのポリマー性質（すなわち、ゲノム配列中の隣接する遺伝子座が空間的に近い）と、染色体の領域的構成（すなわち、異なる染色体が別々の空間領域を占有する傾向がある）との両方を考慮することによって、クロマチンイメージングのために具体的にデザインされた大きな改変を含むコンビナトリアルＦＩＳＨ手法を考案した。例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」という表題のＷＯ２０１６／０１８９６０；「Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」という表題のＷＯ２０１６／０１８９６３を参照されたい。コンビナトリアルイメージングを可能とするために、それぞれのゲノム遺伝子座に、２のハミング重みを有するユニークな１００ビットの二進コードを割り当てた。すなわち、それぞれのバーコードは、２個の「１」ビットを含有し、９８個の「０」ビットを含有する（図１Ａ）。これらのバーコード中のビット値は、逐次的イメージングラウンドにわたって各遺伝子座に関するシグナルの存在（１）または非存在（０）を決定した。これらの１００ビットのハミング重み２のバーコードから、同じビットで同時に空間的に近いクロマチン領域をイメージングするのを回避するために、標的ゲノム遺伝子座を符号化するようにサブセットをさらに選択して、同じバーコード位置における「１」ビットを有する遺伝子座がゲノム空間中で最大に隔てられるように、これらのバーコードの割当てを最適化した。この戦略により、近隣のクロマチン遺伝子座に由来する重複シグナルによって引き起こされる検出エラーを最小化することができた。さらに、ありうる１００ビットの二進コードの大多数は無効であった（すなわち、いかなる標的遺伝子座にも割り当てられなかった）ため、このデザインにより、検出エラーを同定および廃棄することができ、さらに、測定精度を改善した。
バーコードを、それぞれ、標的遺伝子座の１つに結合するための４０ｎｔの標的領域と、１００の予めデザインされたリードアウト配列から選択される２０ｎｔのリードアウト配列とを含有する、符号化プローブの高多様性ライブラリーを使用して標的ゲノム遺伝子座上に物理的にインプリントした（図１Ａ）。それぞれのリードアウト配列は、１００ビットの１つに対応し、それぞれのゲノム遺伝子座の符号化プローブセット（遺伝子座あたり約４００のプローブ）は、ただ２つの異なるリードアウト配列を含有し、その遺伝子座に割り当てられたバーコードにおいて「１」として読まれる２つのビットに対応する。符号化プローブ結合の後、クロマチン遺伝子座上にインプリントされたバーコードを、１００のリードアウト配列の１つとそれぞれ相補的な、蛍光標識されたリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーションによって検出した（図１Ａ）。ハイブリダイゼーションラウンドあたり２つの異なるリードアウトプローブを導入し、５０ラウンドのハイブリダイゼーション後に、全部で約１０００個のゲノム遺伝子座がイメージングおよび同定されるように、２色チャネルでイメージングした（図１Ａ～１Ｃ）。対照的に、１０００個のゲノム遺伝子座をイメージングするための直線的逐次的手法はその代わりに、２色イメージングと共に５００ラウンドのハイブリダイゼーションを必要としたであろう。２倍体細胞中の各染色体は２つのホモログを有していたため、イメージングされる遺伝子座のホモログ識別を、それぞれの核において異なる領域を占有する染色体の傾向を活用する、クラスタリングアルゴリズムを使用してさらに割り当てた。
本実施例では、ヒト肺線維芽細胞（ＩＭＲ９０）中の、２２の常染色体およびＸ染色体を均一に包含する、それぞれ約３０ｋｂのサイズの、１，０４１個のゲノム遺伝子座をイメージングのために選択した。また、それぞれの染色体は、少なくとも３０の標的遺伝子座を含有し、したがって、染色体ホモログあたりのイメージングされる遺伝子座の数は、染色体の長さに応じて、３０～８０の範囲であることも必要であった。５つの生物学的反復にわたる約５，４００の個々の細胞中のこれらの１，０４１個のゲノム遺伝子座を、それぞれの遺伝子座について約８０％の検出効率でイメージングしたところ、染色体あたり２つのホモログを考慮して、それぞれの細胞中で約１７００のクロマチン遺伝子座が検出された（図１Ｄ～１Ｅ）。
それぞれの細胞中での、クロマチン構成の集団平均された図を得るために、イメージングされたクロマチン遺伝子座の全ての対の間の空間距離を算出した後、距離の中央値と、遺伝子座の全ての対の間の接触頻度との両方を、全てのイメージングされた細胞にわたって決定した（図１Ｆおよび図６Ａ）。イメージングデータから決定された同じ染色体内のクロマチン遺伝子座の対の間の接触頻度は、アンサンブルＨｉ－Ｃによって検出された接触頻度との高い相関を示し、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は０．９１であった（図６Ｂ）。イメージングデータは、領域中での染色体の構成（図１Ｆおよび図６Ａ）から、染色体アーム内でのＡおよびＢコンパートメントの形成（図７Ａ）までの、複数のスケールでクロマチン構造を捕捉し、アンサンブルＨｉ－Ｃ測定によって同定されたコンパートメントとも良好に一致していた（図７Ｂ～７Ｃ）。さらに、イメージングの結果は、独立した生物学的反復間で高い再現性を示した（図８）。
個々の細胞中でのクロマチン構成を探索することによって、染色体は、それぞれの細胞内の異なる領域を占有しながら（図１Ｆ～１Ｇ）、互いに実質的な重複も示した（図１Ｇ～１Ｈ）。任意の所与の染色体によって占有された、平均で約８０％の凸包体積が、同じ細胞中の他の染色体と共有され（図１Ｉ）、高い程度のｔｒａｎｓ染色体相互作用を示唆していた。これらの相互作用は十分に探索されていなかったため、以下の分析は、これらのｔｒａｎｓ染色体相互作用に焦点を当てた。
図１Ａ～１Ｉは、ゲノムスケールのクロマチンイメージングを示す。図１Ａは、イメージングスキームを示す。標的ゲノム遺伝子座に、エラーロバストバーコード、例えば、２のハミング重みを有する、１００ビットの二進バーコードを割り当てた（すなわち、１００ビットのうちの２つが「１」と読む）。バーコードを、遺伝子座を認識し、２つの異なるリードアウト配列を各遺伝子座と関連付け、遺伝子座に割り当てられたバーコード中で「１」として読まれる２つのビットに対応する符号化オリゴヌクレオチドプローブを用いてゲノム遺伝子座上にインプリントした。各遺伝子座を、合計４００の符号化プローブによって標識したが、４つのみが示される。リードアウト配列と相補的な蛍光リードアウトプローブを逐次添加し、イメージングしたところ、各遺伝子座で「１」として読まれるビットおよびしたがって、その遺伝子座のバーコード識別を決定することができた。約１０００個のゲノム遺伝子座をイメージングした。図１Ｂは、単一細胞の核内での複数のイメージングラウンドからの代表画像を示す。リードアウトプローブからのクロマチン遺伝子座の蛍光シグナルを、明るい方の影で示したが、核マーカーとして使用された、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）のシグナルを、暗い方の影で示す。スケールバーは５マイクロメートルである。図１Ｃは、全てのイメージングラウンドにわたる１つのクロマチン遺伝子座を中心とする小さい空間領域（図１Ｂにおける囲み）の拡大画像である。遺伝子座の識別を、シグナルを与えた２つのリードアウトプローブ（１および１３）に基づいて決定した。スケールバーは３００ｎｍである。図１Ｄは、それらが属する染色体に従ってグレイスケールで示された、単一細胞中の全ての検出されたクロマチン遺伝子座の３Ｄレンダリングである。ゲノム配列中の隣接する遺伝子座は、薄い線で接続される。図１Ｅは、図１Ｄにおけるのと同じ細胞のクロマチン遺伝子座を示すが、示された染色体の２つのホモログが、他の全ての遺伝子座とは異なるグレイスケールで示される。図１Ｆは、約５，４００個の単一細胞から計算された距離中央値マトリックスである。遺伝子座のそれぞれの対について、遺伝子座間の全ての観察された３Ｄ空間距離の中央値が提示される。図１Ｇは、単一細胞中での複数の染色体領域の位置を示す例示的画像を示す。影付きの領域は、それぞれの染色体の周囲の凸包を表し、これは、染色体領域の操作的定義として使用された。図１Ｈは、図１Ｇに示された同じ細胞に関する距離マトリックスを示す。クロマチン遺伝子座のそれぞれの対の間の空間距離が示される。染色体の順序はヒートマップの下に示される通りであり、それぞれの染色体の２つのホモログが別々に示される。図１Ｉは、同じ細胞中で少なくとも１つの他の染色体によって共有されるそれぞれの染色体領域の体積の割合の定量である。中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および５～９５パーセンタイル（ひげ）が示される。ｎ＝１０，９１０コピーの染色体である（５，４５５個の細胞およびそれぞれの染色体について細胞あたり２つの相同コピー）。
図６Ａ～６Ｂは、ゲノムスケールのイメージングに由来する接触頻度マトリックスおよびアンサンブルＨｉ－Ｃデータとの比較を示す。図６Ａは、本実施例においてイメージングされた全部で１０４１個のゲノム遺伝子座に関する接触頻度マトリックスを示す。遺伝子座の対の間の接触頻度を、遺伝子座間の測定距離が５００ｎｍよりも短い発生の数を、２つの遺伝子座間の測定距離の総数で除したものとして算出した。図６Ｂは、５００ｋｂでビンし、標的遺伝子座を中心とする、イメージングデータに由来する染色体内の遺伝子座の対と、アンサンブルＨｉ－Ｃ実験に由来するものとの間の接触頻度に関する相関プロットを示す。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は０．９１であった。
図７Ａ～図７Ｃは、ゲノムスケールのイメージングに由来するサブ染色体構造およびアンサンブルＨｉ－Ｃデータとの比較を示す。図７Ａは、第２２染色体の一方のアームに関するイメージングデータから生成される接触頻度マトリックスを示す。このマトリックスに基づくＡまたはＢコンパートメントへの各遺伝子座の割当ては、マトリックスの下のバーに示される。図７Ｂは、５００ｋｂでビンし、標的遺伝子座を中心とする、Ｈｉ－Ｃデータから計算された、第２２染色体の同じアームの接触頻度マトリックスを示す。マトリックスの下のバーは、図７Ａと同じ手順を使用して割り当てられた、このマトリックスに基づく各遺伝子座のＡおよびＢコンパートメントへの割当てを示す。イメージングデータおよびＨｉ－Ｃデータに由来するＡ／Ｂコンパートメント割当ては同一である。図７Ｃは、イメージングデータに由来する第２２染色体中の遺伝子座対と、アンサンブルＨｉ－Ｃ実験に由来するものとの間の接触頻度に関する相関プロットを示す。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は０．９１であった。
図８は、反復間のクロマチンイメージング実験の再現性を示す。プロットに示されるのは、１０４１個のゲノム遺伝子座のイメージング実験の２つの独立した生物学的反復において観察されたクロマチン遺伝子座間のペアワイズ距離の相関である。反復間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数は、０．９８であった。右上の雲は、ｔｒａｎｓ染色体のペアワイズ距離を表し、左下の雲は、染色体内のペアワイズ距離を表す。
［実施例２］
ｔｒａｎｓ染色体相互作用がクロマチンのエピジェネティック特性にどのように依存するかを、本実施例において試験した。クロマチンが、それぞれ、活性クロマチンおよび不活性クロマチンで強化された、ＡおよびＢコンパートメントに分離されることが、Ｈｉ－Ｃおよびイメージング分析によって以前に示された。異なるメカニズムが、ＨＰ１媒介性ヘテロクロマチン凝縮ならびに転写因子およびコファクター媒介性活性クロマチン凝縮などの、活性－活性および不活性－不活性クロマチン相互作用を媒介しうる。本実施例では、それぞれのイメージングされたゲノム遺伝子座を、公開されたアンサンブルＨｉ－Ｃデータに基づく確立されたコーリング法を使用して、コンパートメントＡおよびＢに分類した。イメージングされた遺伝子座の３８％は、コンパートメントＡに属し、相対的に遺伝子に富み、Ｈ３Ｋ２７Ａｃなどの活性クロマチンマーカーで強化される傾向があったが、６２％はコンパートメントＢに属し、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３などの不活性クロマチンマーカーで強化される傾向があった。ｔｒａｎｓ染色体相互作用の程度が活性および不活性クロマチンについて異なるかどうかを検査するために、ゲノム遺伝子座をｔｒａｎｓ染色体接触頻度マトリックス中で順序付け、全てのＡ遺伝子座を互いに隣に置き、同様に全てのＢ遺伝子座を一緒に置いた。このマトリックスは、コンパートメントＡ遺伝子座が、コンパートメントＢ遺伝子座よりもコンパートメントＡ遺伝子座とｔｒａｎｓ染色体的に相互作用する実質的により強い傾向を有することを示した（図２Ａ～２Ｂ）。対照的に、コンパートメントＢ遺伝子座は、互いに向かって類似するｔｒａｎｓ染色体親和性を示さなかったが、その代わりに、コンパートメントＡクロマチンとｔｒａｎｓ染色体的に相互作用するわずかに高い確率を示した（図２Ａ～２Ｂ）。換言すれば、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用は、Ａ－Ｂ相互作用よりも実質的に強い傾向で現れ、次いで、Ｂ－Ｂ相互作用よりもわずかに強い傾向で現れた。これは、同じ染色体内でのｃｉｓ相互作用と著しく対照的であり、ＡおよびＢコンパートメントは、凝縮する傾向があり、Ａ－Ｂ相互作用よりもＡ－ＡとＢ－Ｂ相互作用の両方のエンリッチメントをもたらした。
次に、ｔｒａｎｓ染色体相互作用のエピジェネティック依存性を、単一細胞レベルで検査した。個々の細胞中で、コンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座は、異なる空間分布を採用し、Ａ遺伝子座は、核においてＢ遺伝子座よりも中心に局在する傾向を示した（図２Ｃおよび図９Ａ～９Ｂ）。また、Ａ遺伝子座とＢ遺伝子座との間に実質的な程度の混合もあった（図２Ｃおよび図９Ａ～９Ｂ）。それぞれの染色体中のそれぞれのイメージングされた遺伝子座について、他の全ての染色体に由来するＡ遺伝子座およびＢ遺伝子座のその局部密度を算出し、これらの２つの密度の比を決定した（本明細書では以後、ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比と称する）（図２Ｃ）。この量は、遺伝子座の近くでのｔｒａｎｓ染色体活性クロマチンの局部エンリッチメントの尺度を提供した。大部分（６２％）のイメージングされた遺伝子座は、コンパートメントＢに属し、Ａ／Ｂ比に関する全体的な偏りは、１よりも小さかった。この偏りについて制御するために、Ａ遺伝子座およびＢ遺伝子座について観察されたｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の分布を、ＡおよびＢ遺伝子座の数を未変化のまま保持しながら、イメージングされた遺伝子座のＡおよびＢ識別がイメージングされた遺伝子座間で無作為にシャッフルされる無作為化対照において得られた分布と比較した。とりわけ、Ａ遺伝子座について観察されたｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比は、Ｂ遺伝子座について観察された値よりも実質的に高く、次いで、無作為化対照に由来する値よりも高く（図２Ｄ）、この傾向は多くの単一細胞中で観察された（図２Ｅ）。これらの単一細胞分析は再度、ｔｒａｎｓ染色体相互作用が活性クロマチン間の相互作用について優先的に強化されるという見解を支持した。
図２Ａ～２Ｅは、ｔｒａｎｓ染色体接触が、活性クロマチン間の相互作用について優先的に強化されることを示す。図２Ａは、正規化されたｔｒａｎｓ染色体接触頻度マトリックスを示す。それぞれのｔｒａｎｓ染色体遺伝子座対（異なる染色体上の遺伝子座の対）の間の接触頻度が示される。コンパートメントＡの遺伝子座が最初に出現し、次いで、コンパートメントＢの遺伝子座が出現するように遺伝子座を並べ替え、したがって、左上のブロックは、Ａ遺伝子座の対の間の相互作用を表し、右下はＢ遺伝子座の対の間の相互作用を表す。マトリックス中のそれぞれのエントリーを、染色体の対の間の相互作用の変化する基本レベルを構成する染色体の同じ対を起源とする全ての遺伝子座対の接触頻度中央値によって正規化する。図２Ｂは、図２Ａに示されたマトリックスに由来する、Ａ遺伝子座の対（ＡＡ、右；ｎ＝７２，７７１の遺伝子座対）、Ｂ遺伝子座の対（ＢＢ、左；ｎ＝１９３，７５３の遺伝子座対）、および１つのＡと１つのＢ遺伝子座を含む対（ＡＢ、ｎ＝２３７，９８６の遺伝子座対）に関するｔｒａｎｓ染色体接触頻度の分布を示す。分布は、ヒストグラムとして上パネルに表され、箱ひげ図として下パネルに表され、中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および５～９５パーセンタイル（ひげ）を示す。図２Ｃは、単一細胞中でのコンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座の分布を示す。左パネルは、単一の核における単一のｚ平面内の全ての検出された遺伝子座の位置を表す。コンパートメントＡ遺伝子座はスケールの上に示されるが、コンパートメントＢ遺伝子座は下に示される。右パネルにおいて、それぞれの遺伝子座の影は、右に示される影のスケールバーに従う、ｔｒａｎｓ染色体ＡおよびＢ遺伝子座の局部密度の比を表す。図２Ｄは、イメージングされたゲノム遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の分布を示す。それぞれの遺伝子座について、全ての細胞にわたるＡ／Ｂ密度比中央値を決定し、異なる遺伝子座の分布を、Ａコンパートメントの遺伝子座（ｎ＝３８２の遺伝子座）およびＢコンパートメントの遺伝子座（ｎ＝６２３の遺伝子座）と共に示す。１０４１のイメージングされた遺伝子座のうちの３６は、この試験において使用された異なるバージョンのゲノムアセンブリーおよびコンパートメントコーリングのために使用されたＨｉ－Ｃデータセットのため、Ａ／Ｂ識別を割り当てられなかった。暗灰色のヒストグラムは、Ａ遺伝子座の総数およびＢ遺伝子座の総数を未変化のまま保持しながら、ＡおよびＢコンパートメントの識別が無作為にシャッフルされる無作為化対照を表す。図２Ｅは、無作為化対照と比較したｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比のエンリッチメントの分布を示す。それぞれのイメージングされた細胞について、全てのＡ遺伝子座にわたるＡ／Ｂ密度比中央値を、図２Ｄに記載のように、無作為化対照のＡ／Ｂ密度比中央値で除算し、全てのイメージングされた細胞にわたるこの値の分布を提示する（ｎ＝５，４５５個の細胞）。Ｂ遺伝子座について同じエンリッチメントの分布を示す（ｎ＝５，４５５個の細胞）。線は、１の値、すなわち、エンリッチメントなしをマークする。
図９Ａ～９Ｂは、コンパートメントＡおよびコンパートメントＢの遺伝子座が、単一細胞中で異なる空間分布を示すことを示す。図９Ａの左パネルは、単一細胞の単一のｚ平面におけるコンパートメントＡ遺伝子座およびコンパートメントＢ遺伝子座を示す例示的画像を示す。右パネルは、これらの単一細胞中でのコンパートメントＡ遺伝子座およびコンパートメントＢ遺伝子座に関する核周縁部までの距離の分布を示す。核周縁部は、全ての検出されたクロマチン遺伝子座の周囲の凸包として同定される。ヒストグラムは、検出されたクロマチン遺伝子座の周囲の凸包内で均一にサンプリングされた点に関する核周縁部からの距離の分布を示す。図９Ｂは、コンパートメントＡ遺伝子座およびコンパートメントＢ遺伝子座に関する核周縁部までの距離の集団平均分布を示す。ｎ＝３８２のＡ遺伝子座；ｎ＝６２３のＢ遺伝子座である。
［実施例３］
クロマチンの３Ｄ構成を、その機能的活性および他の核構造の文脈に置くために、本実施例においてイメージング法を拡張して、いくつかのゲノム遺伝子座ならびに核内のランドマーク構造の転写活性と一緒のクロマチン構成の同時的測定を可能にした。具体的には、１，０４１個のゲノム遺伝子座を、これらの遺伝子座に位置する１，１３７個の遺伝子のそれぞれから転写される新生ＲＮＡと一緒に、また、核スペックルおよび核小体を含む重要な核構造と同時にイメージングした（図３Ａ）。
同じ細胞内でのＤＮＡ、ＲＮＡおよび核構造のイメージングを可能にするために、クロマチンについての上記のものと類似するコンビナトリアルイメージング戦略を採用することによって、１，１３７個の遺伝子のイントロンＲＮＡの多重化イメージングを実施した（図３Ａ）。全ての遺伝子がそれぞれ個々の細胞中で転写されないこと、したがって、転写焦点の密度がクロマチン遺伝子座のものと同じ高さになるはずはないことを考慮して、ＲＮＡを５４ビットのハミング重み２コードで符号化し、クロマチンイメージングのためのバーコードを選択して、同じビット中の空間的に近い遺伝子をイメージングする機会を最小化する方法と同様の方法で、遺伝子を符号化する、１，１３７のありうるバーコードを選択した。ＲＮＡイメージングが完了した後、ＲＮＡ転写物を酵素的に消化し（本発明者らの単一モードクロマチンイメージング実験においても実行される工程）、多重化ＤＮＡ ＦＩＳＨを上記のように実施して、１，０４１個のゲノム遺伝子座をイメージングした（図３Ａ）。ゲノム遺伝子座および新生ＲＮＡ転写物の復号化を、それらが存在するゲノム遺伝子座と共局在する転写物に関する追加の制約の下、概ね独立に実施した。この手順は、ＲＮＡを転写するための検出精度をさらに改善し、それぞれのゲノム遺伝子座での転写バーストの検出効率（約９０％）の見積もりを可能にした。最後に、核スペックルおよび核小体を、これらの構造の公知の分子成分に対する免疫蛍光を使用してイメージングした（図３Ａ）。全てのイメージングされたゲノム遺伝子座を包含する凸包を計算し、凸包の境界を決定することによって、核ラミナの位置を推定した。同時に、これらの多モード測定は、３Ｄゲノム構造、転写活性および核構成の統合された単一細胞ビューを可能にした（図３Ｂ）。これらの多モードイメージング実験を、２回の生物学的反復において、約３７００個の個々の細胞上で実施した。これらの多モード実験からのクロマチンイメージングデータも、３Ｄゲノム構成分析のために上記の５回反復（約５，４００個の細胞）に含有させた。
これらの多モード実験の新生ＲＮＡ転写物測定から、遺伝子を活発に転写する細胞の比率としての転写バースト頻度（図３Ｃ）と、ＲＮＡイントロンシグナルの明るさに由来するバーストサイズ中央値（図３Ｄ）との両方を、それぞれの遺伝子について定量した。これらの尺度は、反復実験にわたって高い相関を示した（図１０Ａ～１０Ｂ）。バースト頻度は、二様式の挙動を示し、高いバースト頻度の遺伝子は、主にコンパートメントＡに存在し、低いバースト頻度の遺伝子は両方のコンパートメントに存在していた（図３Ｃ）。さらに、２５０ｎｍのカットオフ空間距離を使用して、特定のクロマチン遺伝子座が、核内構造体と会合するかどうかを推定したところ、コンパートメントＢ遺伝子座と核ラミナとの会合頻度がより高く（図１１）、コンパートメントＡ遺伝子座と核スペックルとの会合頻度がより高い（図１２）ことが見出された。これらの結果は、それぞれ、ラミナおよび核スペックルとの、不活性および活性クロマチンの優先的会合の以前の観察と一致していた。個々の遺伝子座について、その局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比は、ラミナ会合頻度との負の相関を示し（図３Ｅ）、核スペックル会合頻度との正の相関を示した（図３Ｆ）。最後に、核小体は、セントロメア、ある特定の染色体のテロメア、およびリボソームをコードする遺伝子を含有する染色体との優先的会合を示した（図３Ｇ）。これらの生物学的結果は、多モード測定に対するさらなる正当性を提供した。
とりわけ、本質的に全てのイメージングされた遺伝子座について、ラミナ会合は観察される転写活性を低下させたが（図３Ｈ）、核スペックル会合は多くのイメージングされた遺伝子座について、より高い転写活性と相関していた（図３Ｈ）。加えて、転写を阻害するためのアルファ－アマニチンによる処理時に、ラミナとの会合率は、ほぼ全ての遺伝子座について全体的に増大したが、核スペックルとの会合率は全体的に減少した（図１３Ａ～１３Ｃ）。これらの結果は、転写活性化または阻害時の単一の、またはいくつかのゲノム領域の核再配置に関する以前のイメージング試験から発展し、転写活性と、核構造との相互作用との関係のゲノムスケールでのビューを提供した。
図３Ａ～図３Ｈは、核構造の文脈におけるクロマチンおよび転写活性のゲノムスケールのイメージングを示す。図３Ａは、核構造および機能的活性の文脈におけるクロマチン構成の統合ビューを生成するためのクロマチン（左パネル）、新生ＲＮＡ転写物（中央パネル）および核内構造体（右パネル）のイメージングを組み合わせる多モードイメージングスキームの図である。約１０００個のゲノム遺伝子座、標的遺伝子座中の約１１００個の遺伝子の新生ＲＮＡ転写物、および２つの型の核内構造体（核スペックルおよび核小体）がイメージングされる。以下は、それぞれのイメージングモダリティーに関する代表的な生画像である。複数のイメージングラウンドにわたるクロマチン遺伝子座（左）、複数のイメージングラウンドにわたる新生ＲＮＡ転写物（中央）および核内構造体（右：核スペックル；左：核小体）。スケールバーは５マイクロメートルである。図３Ｂは、単一細胞中でのクロマチン遺伝子座、転写バーストおよび核内構造体の３Ｄレンダリングである。左：全ての検出されたクロマチン遺伝子座は、染色体によってグレイスケールで示される（以下に示される染色体指数に基づく）。中央：全ての検出されたイントロンＲＮＡは球体として示され、影は、イメージングされた遺伝子の識別を示し、球体のサイズは転写バーストのサイズを表す。クロマチン遺伝子座はバックグラウンドに示される。右：検出された核内構造体の体積充填表示。核小体および核スペックルは、異なる影付きで示される。核ラミナは、全ての検出されたクロマチン遺伝子座の周囲の凸包の表面として同定される。図３Ｃ～３Ｄは、コンパートメントＡ遺伝子座（ｎ＝４９４個の遺伝子）およびコンパートメントＢ遺伝子座（ｎ＝６２５個の遺伝子）中に存在する遺伝子に関する、転写バースト頻度の分布（図３Ｃ）およびバーストサイズ（図３Ｄ）である。図３Ｅ～３Ｆは、遺伝子座が核ラミナ（図３Ｅ）および核スペックル（図３Ｆ）と会合すると見出される頻度の関数としてのそれぞれのイメージングされたゲノム遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の散布図である。遺伝子座は、核構造までのその測定距離が２５０ｎｍよりも小さい場合、その構造と会合していると考えられる。プロットに示されるｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の値は、全てのイメージングされた細胞にわたる中央値である。図３Ｇは、ゲノム位置によって順序付けられた、全てのイメージングされたゲノム遺伝子座に関する核小体との会合頻度を示す。縦の線は、セントロメアの位置であり、括弧はリボソームをコードする遺伝子（ｒＤＮＡ）を含有する染色体を強調する。図３Ｈは、転写に対する核構造会合の効果を示す。丸は、遺伝子座がラミナと会合する／ラミナと会合しない（左）と、スペックルと会合する／スペックルと会合しない（右）との細胞の集団を比較する場合の各遺伝子座に関する転写バースト頻度の倍数変化である。点線は、変化なしを強調し、実線は、それぞれの場合における倍数変化中央値を表す。
図１０Ａ～１０Ｂは、反復間の新生ＲＮＡ転写イメージング実験の再現性を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、それぞれの遺伝子のバースト頻度（図１０Ａ）およびバーストサイズ（図１０Ｂ）に関するＲＮＡイメージングの反復間の相関を示す。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、それぞれ、０．９４および０．８１であった。
図１１は、コンパートメントＢ遺伝子座と核ラミナとの優先的会合を示す。コンパートメントＡ遺伝子座（ｎ＝３８２の遺伝子座）およびコンパートメントＢ遺伝子座（ｎ＝６２３の遺伝子座）と核ラミナとの会合率の分布が示される。遺伝子座は、核周縁部までのその距離が２５０ｎｍよりも小さい場合、ラミナと会合していると操作的に定義される。
図１２は、コンパートメントＡ遺伝子座と核スペックルとの優先的会合を示す。コンパートメントＡ遺伝子座（ｎ＝３８２の遺伝子座）およびコンパートメントＢ遺伝子座（ｎ＝６２３の遺伝子座）と核スペックルとの会合率の分布が示される。遺伝子座は、最も近いスペックルまでのその距離が２５０ｎｍよりも小さい場合、スペックルと会合していると操作的に定義される。
図１３Ａ～図１３Ｃは、転写阻害時の核ラミナと核スペックルとの会合の変化を示す。図１３Ａ～１３Ｂは、未処理の細胞（図１３Ａ）および転写阻害剤であるアルファ－アマニチンで処理した細胞（図１３Ｂ）について示される、イメージングされたクロマチン遺伝子座、核小体、および核スペックルを含む個々の核の代表画像を示す。図１３Ｃは、アルファ－アマニチンによる転写阻害時の各遺伝子座と、ラミナ（左）および核スペックル（右）との会合の率の倍数変化を示す。それぞれのゲノム遺伝子座に関するデータ点を丸で示し、実線はそれぞれの場合における全ての遺伝子座の倍数変化中央値であり、点線は変化なしを表す。
［実施例４］
本実施例では、これらの多モード単一細胞測定を使用して、転写活性および核構造の文脈におけるｔｒａｎｓ染色体相互作用をさらに特徴付けた。ｔｒａｎｓ染色体相互作用がコンパートメントＡ遺伝子座間の相互作用について優先的に強化されたという観察を考慮して、これらの相互作用がクロマチンの転写活性と相関するかどうかを試験した。このために、他の染色体に由来するＡおよびＢクロマチンの局部密度ならびにｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比を、それぞれの細胞中のそれぞれの遺伝子座について算出し、細胞の２つの集団：（ｉ）検討中の遺伝子座が転写活性（すなわち、ＲＮＡバーストシグナル）を示す細胞、および（ｉｉ）遺伝子座が少なくとも一瞬、転写的にサイレントに見える細胞に関するこれらの量の中央値を決定した（図４Ａ）。とりわけ、コンパートメントＡ遺伝子座がコンパートメントＢ遺伝子座よりも高い局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比を示した観察に加えて（図２Ｄ～２Ｅ）、遺伝子座が活発に転写される場合、同じ遺伝子座についても、より高いｔｒａｎｓ染色体Ａ密度およびＡ／Ｂ密度比について一貫した傾向が観察された（図４Ｂおよび図１４）。転写活性とｔｒａｎｓ染色体相互作用との間で観察されたこの相関は、以下の解釈の両方：クロマチン遺伝子座のより高いエピジェネティックもしくは転写活性がｔｒａｎｓ染色体相互作用のその率を増大させること、または活性クロマチンで強化された環境中での遺伝子座の配置がその転写活性を増強することと一致していた。
図４Ａ～４Ｆは、活性クロマチン間の優先的なｔｒａｎｓ染色体相互作用が、転写と相関し、凝縮物形成を乱す処理時に破壊されることを示す。図４Ａは、クロマチン遺伝子座および転写活性の単一細胞画像である。左：単一の核に由来する単一のｚ平面における全てのイメージングされたコンパートメントＡ（スケールの上部）およびＢ（下部）遺伝子座の位置。中央：グレイスケールのスケールバーに基づく、同じ遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比。右：中央パネルと同じであり、検出された転写バーストを重ね合わせ、丸印として示した。図４Ｂは、転写状態とサイレント状態でのそれぞれの遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の比較を示す。少なくとも１つのイメージングされた遺伝子を含有するそれぞれのゲノム遺伝子座について、ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比を、それが活発に転写される細胞（転写と指定される）およびそれが転写されない細胞（サイレントと指定される）について算出した。細胞にわたる中央値を、それぞれの状態について示す。サイレント状態でのそのＡ／Ｂ密度比によって遺伝子座を順序付け、Ａ／Ｂ密度比をサイレント状態と転写状態との両方についてプロットした。図４Ｃは、転写を阻害するためにアルファ－アマニチンで処理された細胞に関する正規化されたｔｒａｎｓ染色体接触頻度マトリックスを示す。マトリックスを順序付け、図２Ａに記載されるように正規化する。図４Ｄは、図２Ｂに記載されるような、箱ひげ図として示されるＡＡ、ＢＢおよびＡＢ接触頻度の分布を示す。ＡＡについてはｎ＝７２，７７１の遺伝子座対、ＢＢについてはｎ＝１９３，７５３の遺伝子座対、およびＡＢについてはｎ＝２３７，９８６の遺伝子座対である。図４Ｅ～４Ｆは、図４Ｃ～４Ｄと同じであるが、１，６－ヘキサンジオールで処理した細胞に関するものである。
図１４は、遺伝子座が活発な転写状態またはサイレント状態にある場合のそれぞれのイメージングされた遺伝子座の近くのｔｒａｎｓ染色体Ａ遺伝子座の局部密度を示す。それぞれの遺伝子座について、遺伝子座が活発に転写されるか、またはサイレントであるかどうかに応じて、細胞を２つの群に分けた。Ａ遺伝子座の局部密度中央値を、これらの２群の細胞（転写およびサイレント）について示す。遺伝子座は、サイレント状態でのその局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ遺伝子座密度に基づいて順序付けられる。
核スペックルは、活発に転写される遺伝子座を集中させる最も顕著な核内構造体の１つであるため、核スペックルとの会合は、ｔｒａｎｓ染色体的な活性－活性クロマチン相互作用の観察される優先的発生のための単純な説明を提供しうる。興味深いことに、分析が核スペックルと会合していない遺伝子座に限定された場合、ｔｒａｎｓ染色体接触間のＡ－ＢおよびＢ－Ｂ相互作用と比較したＡ－Ａのエンリッチメントに関する同じ傾向（図１５Ａ）ならびにサイレントな遺伝子座と比較して高い局部Ａ／Ｂ密度比を示す活発に転写する遺伝子座に関する同じ傾向（図１５Ｂ）が観察された。顕著には、これらの傾向は、ラミナと会合し、かくして、コンパートメントＢのクロマチンで強化された環境中にある遺伝子座のみを考慮した場合にも観察された（図１６Ａ～１６Ｂ）。この後者の結果はまた、活性－活性ｔｒａｎｓ染色体相互作用に関する観察されたエンリッチメントが、単に、活性クロマチンが核の中心に向かってより集中するという事実によって構成されえないことも示していた。
図１５Ａ～１５Ｂは、核スペックルと会合していないクロマチン遺伝子座間の活性－活性ｔｒａｎｓ染色体相互作用のエンリッチメントを示す。図１５Ａは、両方の遺伝子座が核スペックルと会合していない細胞のみを考慮する、Ａ遺伝子座対（ＡＡ）、Ｂ遺伝子座対（ＢＢ）、および１つのＡと１つのＢ遺伝子座を含む対（ＡＢ）の間のｔｒａｎｓ染色体接触頻度を示す。接触頻度を、図２Ａについて記載されたように正規化した。分布は、図２Ｂに記載されたように、箱ひげ図として表される。ＡＡについてはｎ＝７２，７７１の遺伝子座対（左）、ＢＢについてはｎ＝１９３，７５３の遺伝子座対（右）、およびＡＢについてはｎ＝２３７，９８６の遺伝子座対（中央）である。比較のために、スペックル会合状態とは関係なく、全データの中央値を三角として示す。図１５Ｂは、核スペックルと会合していない遺伝子座に関する転写状態とサイレント状態との間の局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の倍数変化を示す。それぞれのゲノム遺伝子座について、遺伝子座が核スペックルと会合していない細胞のみを考慮して、遺伝子座の転写状態とサイレント状態との間の局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の倍数変化を計算した。それぞれの状態（転写またはサイレント）におけるＡ／Ｂ密度比中央値を、それぞれの遺伝子座について決定し、２つの状態の間の倍数変化を、左に示す（それぞれの丸はゲノム遺伝子座に対応する）。遺伝子座の核スペックル会合状態とは関係なく全データに由来する対応する倍数変化を、比較のために右に示す。いずれの場合も、点線は、変化なしを表し、実線は、全ての遺伝子座にわたる倍数変化中央値を表す。
図１６Ａ～１６Ｂは、核ラミナと会合したクロマチン遺伝子座間の活性－活性ｔｒａｎｓ染色体相互作用のエンリッチメントを示す。図１６Ａは、ラミナと会合した（２５０ｎｍ以内）遺伝子座の対のみを考慮した、Ａ遺伝子座対（ＡＡ）、Ｂ遺伝子座対（ＢＢ）、および１つのＡと１つのＢ遺伝子座とを含む対（ＡＢ）の間のｔｒａｎｓ染色体接触頻度を示す。接触頻度を、図２Ａについて記載されたように正規化した。分布を、図２Ｂに記載されたように、箱ひげ図として表す。ＡＡについてはｎ＝７２，７７１の遺伝子座対（左）、ＢＢについてはｎ＝１９３，７５３の遺伝子座対（右）、およびＡＢについてはｎ＝２３７，９８６の遺伝子座対（中央）である。比較のために、ラミナ会合状態とは関係なく、全データの中央値を三角として示す。比較的小さい比率の遺伝子座のみがラミナと会合するため、これらの場合において分散は比較的大きいが、それにも拘わらず、異なる型の対ＡＡ、ＢＢおよびＡＢの間の差異は統計的に有意である（Ｐ値＜１０－１０）。図１６Ｂは、核ラミナと会合した遺伝子座に関する転写状態とサイレント状態との間の局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の倍数変化を示す。それぞれのゲノム遺伝子座について、遺伝子座が核ラミナと会合した細胞のみを考慮して、遺伝子座の転写状態とサイレント状態との間の局部ｔｒａｎｓ染色体Ａ／Ｂ密度比の倍数変化を計算した。それぞれの状態（転写またはサイレント）におけるＡ／Ｂ密度比中央値を、それぞれの遺伝子座について決定し、２つの状態の間の倍数変化を、左に示す（それぞれの丸は遺伝子座に対応する）。外れ値（提示されたスケールの上の３３の遺伝子座および下の１８の遺伝子座）を省略して、倍数変化中央値のより明確な可視化を可能にした。ラミナ会合状態に関係なく、全データに由来する倍数変化を、比較のために右に示す。いずれの場合も、点線は、倍数変化なしを表し、実線は、全ての遺伝子座にわたる倍数変化中央値を表す。
結果は、ｔｒａｎｓ染色体相互作用が活性クロマチン遺伝子座間で優先的に起こること、およびこの挙動が複数の異なる核環境にわたって一貫して観察されることを示していた。次に探索されたのは、何がこの優先的な、幅広い活性－活性クロマチン相互作用を潜在的に引き起こしうるのかであった。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）は低複雑度ドメイン（ＬＣＤ）を含有し、凝縮物を形成しうるため、ＰｏｌＩＩの解離および分解を引き起こす転写阻害薬であるアルファ－アマニチンを使用することによって、Ｐｏｌ ＩＩによる転写がこれらの優先的なｔｒａｎｓ染色体相互作用を担いうるかどうかを試験した。転写を無効化し、核構造およびクロマチンとのその会合を変更させるにも拘わらず（図１３Ａ～１３Ｃ）、アルファ－アマニチンによる処理は、活性クロマチン間の優先的なｔｒａｎｓ染色体相互作用を実質的に減少させなかった（図４Ｃ～４Ｄ）が、これは、さらなる、または他の活性クロマチン結合因子がこれらのｔｒａｎｓ染色体相互作用に関与したことを示唆している。活性クロマチンと会合した複数の他のタンパク質は、凝縮物形成を潜在的に媒介しうるＬＣＤを含有することが示された。したがって、目的は、より一般的には、ＬＣＤ間の疎水性相互作用を破壊することが知られる薬物である１，６－ヘキサンジオールを使用することによって凝縮物形成を乱すことであった。とりわけ、ｔｒａｎｓ染色体接触における活性クロマチン相互作用に関する優先的エンリッチメントは、２％の１，６－ヘキサンジオールで４５分間の細胞の処理時に大きく無効化されたが（図４Ｅ～４Ｆ）、これは、これらの相互作用の確立または維持における凝縮物形成の潜在的な役割を示唆している。
まとめると、これらの実施例は、単一細胞中のゲノムスケールでのクロマチンの３Ｄ構成をイメージングするための大規模多重化ＦＩＳＨ法を開発し、両方ともゲノムスケールでのクロマチンおよび新生転写物イメージングと、核構造同定とを組み合わせることによって３Ｄゲノム構成をその天然の構造的および機能的文脈に置く能力をさらに証明した。これは、単一細胞中での核構成の統合ビューを提供する。ここで全ての染色体にわたって均一に標的遺伝子座を選択して、全体の３Ｄゲノム構成の偏りのないビューを提供したが、この方法を使用して、プロモーター、エンハンサー、および特定の核構造タンパク質が結合している遺伝子座などの、特定の構造的および機能的特性を有するゲノム遺伝子座を標的とし、これらの遺伝子座間の相互作用ならびに転写および他のクロマチン機能とのその関係を試験することもできる。ゲノム構成と関連する様々な疑問へのこの手法の幅広い適用は、クロマチン構成を支配するメカニズムと、ゲノム機能の調節におけるクロマチン構造の役割との両方を明らかにすることができる。
［実施例５］
本実施例は、上記実施例において使用可能な種々の材料および方法を例示する。
標的ゲノム領域。クロマチンイメージングのために、ゲノム遺伝子座を以下の方法でのイメージングのために選択した。それぞれのヒト常染色体およびＸ染色体について、約３Ｍｂ毎の間隔の３０ｋｂのセグメントを選択した。この間隔により、所与の染色体上で３０未満の選択された遺伝子座が得られた場合、全ての染色体が少なくとも３０の選択された遺伝子座を有するまで、その染色体について間隔を減少させた。これは、イメージングのために合計１，０４１個の標的ゲノム遺伝子座をもたらし、個々の染色体における遺伝子座の数は３０～８０の範囲であった。次いで、コンビナトリアルＦＩＳＨイメージングのために、それぞれの３０ｋｂセグメントのために符号化プローブをデザインした（約４００のオリゴヌクレオチドプローブ）。
新生ＲＮＡ転写物のイメージングのために、標的ゲノム遺伝子座と完全または部分的に重複する全てのイントロン含有遺伝子を選択した。次いで、それぞれのＲＮＡが約２０の符号化プローブを有し、符号化プローブのターゲティング配列が転写開始部位（ＴＳＳ）の可能な限り近くに保持されるように、全てのこれらのＲＮＡのイントロンのための符号化プローブをデザインした。合計１，１３７個の遺伝子を標的とした。
コンビナトリアルＦＩＳＨイメージングのためのバーコードデザイン。１，０４１のゲノム遺伝子座をイメージングするための二進バーコードを、以下の様式で選択した。最初に、２のハミング重みを有する全てのありうる１００ビットの二進バーコード（すなわち、それぞれのバーコードは、２の「１」ビットおよび９８の「０」ビットを含有する）を生成し、この一覧から１，０４１のバーコードを無作為に選択した。次いで、選択されたバーコードを、最初に１０４１のゲノム遺伝子座に任意に割り当てた。次に、使用されたコードプールと使用されなかったコードプールとの間、ならびに異なる染色体に由来する遺伝子座の間で、バーコードを無作為に交換して、それぞれの染色体について、異なるビットにわたって出現する（すなわち、「１」として読まれる）遺伝子座の数の分散を最小化した。これにより、それぞれの染色体についてビットあたりにイメージングされるほぼ等しい数の遺伝子座が得られた。それぞれの染色体内の遺伝子座へのバーコードの関連付けを最適化するために、同じ染色体内の遺伝子座をバーコード交換させ、同じコード位置で「１」として読まれるバーコードを有する遺伝子座間の最大の最小ゲノム距離について最適化した。同一の最小ゲノム距離のコード割当てを比較する場合、ゲノム距離の変動の係数を最小化したものを選択した（ゲノム距離が、より大きい平均と、より小さい標準偏差との両方を有するように）。
１，１３７個の遺伝子の新生ＲＮＡ転写物をイメージングするためのバーコードを、同様だが、１００ビットの、ハミング距離２のコードの代わりに、５４ビットの、ハミング距離２のコードを使用して選択した。
符号化プローブのデザイン。クロマチンイメージングのための符号化プローブを、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したオリゴヌクレオチドのプールから合成した。このプール中の各オリゴは、以下のサブ配列を使用した（５’から３’に向かって）：
１．ＰＣＲ増幅および逆転写（ＲＴ）のための２０ヌクレオチド（ｎｔ）のフォワードプライミング領域
２．プローブによって標的化されるゲノム遺伝子座がイメージングされるビットの１つに対応する２０ｎｔのリードアウト配列
３．単一の標的ゲノム遺伝子座にユニークに結合するようにデザインされた、４０ｎｔの標的配列
４．上記の２０ｎｔのリードアウト配列のさらなるコピー
５．ＰＣＲ増幅のための２０ｎｔのリバースプライミング配列。
フォワードおよびリバースプライミング配列を、ＰＣＲのために最適化された無作為の２０ｎｔ配列の以前に生成された一覧から選択した。
リードアウト配列を、以下のプロセスにより選択した。最初に、ヒトゲノムとの最小限の相同性を示す３０ｎｔの配列の一覧を創出した。次いで、これらの配列のサブセットを、観察されたシグナルノイズ比（ＳＮＲ）によって順位付け、上位１００個を、ＤＮＡリードアウトプローブとして選択した。最後に、これらの配列のそれぞれの最後の２０ｎｔを逆補完することによって、リードアウト配列を選択した。
４０ｎｔの標的配列を同様に選択した。略述すると、目的のそれぞれのゲノム領域について、以下の手順を繰り返した（上の「標的ゲノム領域」の議論を参照されたい）。最初に、目的のゲノム領域と相補的な全ての４０ｎｔの配列の一覧を創出した（標的領域中のそれぞれのありうる塩基で開始する）。次いで、それらが融点およびＧＣ含量の規定の範囲内にあることを要求することによって、配列をフィルタリングした。次いで、ヒトゲノム、ヒトトランスクリプトームおよび反復配列を含有するデータベースとの相同性の許容される程度を制限することによって、残りの配列をさらにフィルタリングした。全てのありうる１７ｎｔの配列およびそれらが標的データベース（例えば、ヒトゲノム、ヒトトランスクリプトーム）中に出現する回数の表を創出し、所与の候補配列がそれと共に有する正確な１７ｎｔのマッチの総数を算出することによって、相同性を決定した。最後に、ゲノム重複が標的配列の任意の対の間で存在しないような最後のフィルタリング工程の後、残りの配列から標的配列を選択した。
完全長プローブを生成するために、それぞれの標的ゲノム遺伝子座に関する選択された４０ｎｔの標的配列のそれぞれを、全標的遺伝子座に及ぶ２つの群に交互に割り当てた。これらの群のそれぞれを、遺伝子座がイメージングされる２つのビットのうちの１つに対応する単一のリードアウト配列と関連付けた。次いで、それぞれの標的配列を、その群に割り当てられた２つの同一のコピーのリードアウト配列に連結した後、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマーに連結した。
ＲＮＡイメージングのためのプローブが、１つは標的領域の５’末端の、２つは３’末端の、プローブ毎に３コピーの同一のリードアウト配列を含有することを除いて、それらを同様にデザインした。ＲＮＡイメージングのためのリードアウト配列は、ＤＮＡイメージングのために使用されるものと直交し、試験したリードアウト配列の同じ順位付けられた一覧から選択された。
符号化プローブ合成。符号化プローブを、上記の鋳型ライブラリーから増幅した（上の「符号化プローブデザイン」を参照されたい）。これを、以下の工程を含む増幅プロトコールを使用して行った：
１．初期のオリゴプールを、約２０サイクルにわたる限定サイクルＰＣＲを使用して拡大した。この工程において使用されたリバースプライマーはまた、プライマー伸長によってＴ７プロモーター配列を導入した。
２．得られた生成物は、カラム精製によって精製され、高収率インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写反応によってさらに増幅およびＲＮＡへの変換を受けた。
３．ＲＮＡ生成物を、逆転写反応によって一本鎖ＤＮＡに変換し戻した。
４．以前の工程の生成物を、アルカリ加水分解にかけ（残留するＲＮＡおよびプライマーＤＮＡを除去するため）、カラム精製した。
５．必要に応じて、以前の工程の生成物を、減圧下で乾燥し、水中に再懸濁して、所望の濃度の一次プローブを達成した。
全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。
細胞培養および符号化プローブのハイブリダイゼーション。細胞の調製を以下のように行った。ＩＭＲ－９０細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８６）から購入し、推奨されたプロトコールに従って増殖させた。クロマチン構造の潜在的な変更を回避するために、この試験における全ての細胞を、以下に特定される密度で培養開始の６週間以内に播種した。
ＤＮＡイメージングについて準備するために、細胞を、４０ｍｍの丸い＃１．５のカバースリップ（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０４２０－０３２３－２）上に、カバースリップあたり約５００，０００個の密度で播種した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で集密まで約２日間増殖させた。転写阻害実験において、細胞培地を、細胞固定の６時間前に、１００マイクログラム／ｍＬのアルファ－アマニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２２６３）を含有する新鮮な培地と交換した。１，６－ヘキサンジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２４０１１７）を用いた実験のために、細胞播種の前に１０マイクログラム／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１１４１）でカバースリップを被覆し、培地を、４５分にわたって２％ｗ／ｖの１，６－ヘキサンジオールを含有する新鮮な培地と交換した。次いで、培養物を、室温で１０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定し、ＰＢＳ中で２～３回洗浄した。次いで、細胞を２つの工程で透過処理した：最初に、それらを室温で１０分間、ＰＢＳ中の０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ８７８７）で処理した。次いで、細胞を、室温で５分間、０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）で処理し、ＰＢＳ中で２～３回洗浄した。ＨＣｌ処理後、細胞を、３７℃で３０～４５分間、ＰＢＳ中に溶解した０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥＮ０５３１）の溶液で処理して、ＲＮＡへのオフターゲット結合の潜在的な供給源を除去した。この処理の後、細胞を、２ｘ塩水－クエン酸ナトリウム緩衝剤（ＳＳＣ；Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９７６３）および５０％ホルムアミド（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９３４２）からなるプレハイブリダイゼーション緩衝剤中で約１０分間インキュベートした。次に、細胞カバースリップを反転させ、６０ｍｍのペトリ皿中、５０マイクロリットルのハイブリダイゼーション緩衝剤（１０マイクログラムのヒトＣｏｔ－１ ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５２７９０１１）を含む、または含まない約２５マイクロモルの合計濃度で符号化プローブの混合物を含有する、２ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８９０６））の液滴上に置いた。皿を、約９０℃で３分間、水浴中に部分的に浸し、加湿チャンバー中、１６～３６時間にわたって４７℃でインキュベートした。符号化プローブと共にインキュベートした後、試料を２ｘＳＳＣおよび４０％ホルムアミド中で３０分間洗浄し、室温で１０分間、２ｘＳＳＣ中の４％ＰＦＡで後固定した。次いで、試料を、２ｘＳＳＣ中の標準ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆ８８０５またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆ８７９２のいずれか）と共に２～３分間インキュベートし、５～１０分間、２ｘＳＳＣ中の１マイクロモルの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄ１３０６）で染色した後、イメージングまで２ｘＳＳＣ中で保存した。
ＲＮＡイメージングを含む実験のために、全ての緩衝剤は、ＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ Ｍ０３１４またはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎ２６１５のいずれか）の１：１０～１：１，０００希釈液を含有する細胞を固定した点から使用した。ＲＮＡ染色のための処理は、ＨＣｌを用いた処理まで上記のプロトコールと同一であった。この工程の後、細胞を、プレハイブリダイゼーション緩衝剤中で１０分間インキュベートした後、細胞カバースリップを反転させ、ＤＮＡ染色について記載されたように、約１マイクロモルの合計濃度でＲＮＡイントロンを標的とする符号化プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝剤の液滴上に置いた。この場合、しかしながら、９０℃の熱変性を実施せず、細胞を、加湿チャンバー中、１６～３６時間にわたって４７℃ですぐにインキュベートした。符号化プローブと共にインキュベートした後、試料を、ホルムアミド溶液中で洗浄し、上でＤＮＡについて記載されたようにＰＦＡで後固定した。次いで、それを標準ビーズと共にインキュベートし、１マイクロモルのＤＡＰＩで染色した後、イメージングまで２ｘＳＳＣ中で保存した。ＲＮＡイメージング後、試料を顕微鏡から取り出し、細胞をＲＮａｓｅ Ａで処理した後、ＲＮＡイメージングを用いずにＤＮＡイメージングについて上に記載されたのと同じ様式でＤＮＡハイブリダイゼーションを開始した。
ＦＩＳＨイメージングのためのリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーション。プロトコールのこの部分における全ての液体交換を、ＦＣＳ２フローチャンバー（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０６０３１９－２）中にマウントされたカバースリップと共に、特注の流体システムの使用によって達成した。流体システムは、３～４個のコンピュータ制御された八方弁（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＶＰおよびＨＶＸＭ８－５）およびコンピュータ制御された蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ、ＭＩＮＩＰＬＵＳ３）を使用した。まとめると、これらの構成要素は、任意の所与の時間での流体流動の速度と、流体流動の種類との両方の制御を可能にした。
各ラウンドのハイブリダイゼーションは、以下の工程を使用した：
１．以下に記載されるような、各ラウンドに特異的なオリゴヌクレオチドプローブのセットと共にハイブリダイゼーション緩衝剤中で流す
２．室温で１０分間インキュベートする
３．洗浄緩衝剤を流す
４．約２００秒間インキュベートする
５．イメージング緩衝剤を流す。
６０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０％ｗ／ｖのグルコース、１％のグルコースオキシダーゼ酸素スカベンジャー溶液（約１００ｍｇ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ２１３３）およびカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ３１５５）の１：３希釈液を含有する）、０．５ｍｇ／ｍＬの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２３８８１３）および５０マイクロモルのＴｒｏｌｏｘ Ｑｕｉｎｏｎｅ（Ｔｒｏｌｏｘ溶液のＵＶ照射によって生成される）を含むイメージング緩衝剤を調製した。Ｔｒｏｌｏｘを、メタノールに溶解した後、溶液に添加した。調製後、イメージング緩衝剤を、約０．５ｃｍの厚さの鉱物油層によって被覆して、酸素への曝露を防止した。
ハイブリダイゼーション緩衝剤および洗浄緩衝剤は、それぞれ、２ｘＳＳＣ中、３５％および３０％のホルムアミドから構成され、ハイブリダイゼーション緩衝剤はまた、０．０１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含有していた。ハイブリダイゼーション緩衝剤は、それぞれのハイブリダイゼーションラウンドのために別々に保持され、２または３（それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのため）セットのリードアウトプローブを含有した。蛍光シグナルを２つの方法のうちの１つで導入した：
１．ＤＮＡイメージングのために、各ラウンドのハイブリダイゼーション緩衝剤は、一方はＣｙ５またはＡｌｅｘａ６４７で標識され、他方はＡｌｅｘａ７５０で標識された、２つの蛍光リードアウトプローブを含んでいた。蛍光リードアウトプローブは、１）１００ｎＭの濃度で添加された、所与のビット中でイメージングされた全ての符号化プローブに共通するリードアウト配列と相補的な蛍光標識されたオリゴ、または２）全てのアダプターに共通し（より正確には、それぞれのカラーチャネル中の全てのアダプターに共通する）、他の全ての使用されるリードアウト配列と直交する、さらなるリードアウト配列（二次リードアウト配列と称される）に連結された、リードアウト配列と相補的な配列を有するアダプターオリゴと、この二次リードアウト配列と相補的な蛍光標識されたオリゴプローブとの組合せのいずれかを使用した。アダプターおよび二次リードアウトプローブを、１：１．５の比で予め混合し、約１００ｎＭの最終濃度で添加した。いくつかの実験について、アダプターとリードアウトプローブとを、逐次的に試料にハイブリダイズさせた。これは、より低濃度のより高価な二次リードアウトプローブの使用を可能にした。
２．ＲＮＡイメージングのために、それぞれのラウンドのハイブリダイゼーション緩衝剤は、それぞれ、異なるリードアウト配列に結合し、それぞれ、さらなる二次リードアウト配列を含有する、３つのアダプターオリゴ（３つの異なるカラーチャネルで検出される）を含有していた。同じカラーチャネルに対応する全てのアダプターは、同じ二次リードアウト配列を共有した。各ラウンドは、２つの個別のハイブリダイゼーション工程を含んでいた：最初に、アダプターを、ハイブリダイズさせて流し、過剰の材料を洗浄した。次いで、それぞれ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＡｌｅｘａ７５０で標識された、アダプター上の二次リードアウト配列と相補的な、３つの蛍光リードアウトプローブを、逐次的に流した。ＲＮＡイメージングのために使用された蛍光リードアウトプローブは、フルオロフォアを二次オリゴに連結するジスルフィド結合を含有し、ラウンド間のシグナルの効率的な除去を可能にした。蛍光リードアウトをハイブリダイズさせた後、イメージング緩衝剤を流し、シグナルを収集した。
次のラウンドのリードアウトプローブまたはアダプタープローブハイブリダイゼーションの前に、現在のラウンドにおけるリードアウトプローブまたは二次リードアウトプローブからの蛍光シグナルを、以下の「ハイブリダイゼーションラウンド間のシグナル除去」に記載されるように除去した。
第１ラウンドのハイブリダイゼーションの前に、イメージングのラウンドを実施して、ＤＡＰＩシグナルを獲得し、核境界を同定した。次いで、１，０４１のゲノム遺伝子座の全セットを、５０ラウンドのハイブリダイゼーションおよびラウンドあたり２のカラーチャネルにおいてイメージングした。各ラウンドにおいて、ゲノム遺伝子座を、ｚ次元にステージをステップすることによって３Ｄでイメージングした。１，１３７個の遺伝子に関する新生ＲＮＡ転写物を同様に、３色で１８ラウンドにおいて３Ｄでイメージングした。さらなるラウンドを使用して、ゲノム遺伝子座のセットを再標識し、カラーチャネル間の色収差および裏抜けを評価した。合計約１，０００～２，０００個の細胞を含有する約６０の視野のイメージングには、約３日かかった。
３～４つの弁のシステムは、最大で２０～３０の異なるハイブリダイゼーション溶液のローディングを可能にした。結果として、全ての流体システムのチャネルを使い果たした後、試料チャンバーをバイパスし、ハイブリダイゼーションのために使用された全てのチャネルを、水中の３０％ホルムアミドで洗浄した。次に、チャンバーを再接続して、次のセットのハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドを実施した。
抗体の標識化およびイメージング。抗体イメージングを、ＲＮＡまたはＤＮＡイメージングの直後に実施した。上記のプロトコールによるイメージングの完了後、試料は以下の工程を受けた：
１．試料を、ブロッキング溶液（０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ９４１６）および１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ００１－０００－１６２）を含むＰＢＳ）と共に、３０分間インキュベートした。
２．試料を、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体と共に、１時間インキュベートした。
３．試料を、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中で３回、それぞれ５分間洗浄した。
４．蛍光タグ付き二次抗体のために、工程２および３を繰り返した。
全ての緩衝液交換を、上記のマイクロ流体システムを使用して、顕微鏡上で行った。Ｃｙ５カラーチャネルをイメージングのために使用し、光退色を使用して逐次的抗体標識化間のシグナルを消滅させた。
一次および二次抗体の以下のセットを使用した：
１．核スペックルをイメージングするために、ストックからの１：２００の希釈率の、核スペックルのマーカーとして一般的に使用されるスプライシング因子であるＳＣ３５に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８２６）およびストック濃度から１：１，０００に希釈されたＣｙ５色素によって標識されたロバ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７１５－１７５－１５０）を使用した。
２．核小体をイメージングするために、ストックからの１：２００の希釈率の抗フィブリラリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５８２１）、およびストック濃度から１：１，０００に希釈された、Ａｌｅｘａ６５７色素によって標識されたロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－６０５－１５２）を使用した。
ハイブリダイゼーションラウンド間のシグナル除去。各ラウンドのイメージングの前に、前のラウンドからのシグナル（または第１ラウンドの場合、内因性バックグラウンド）を消滅させた。これを、シグナルの光退色によって達成した。緩衝剤を２ｘＳＳＣに変更し、６４７および７５０のレーザーの最大利用可能出力（ならびにＲＮＡをイメージングする場合、５６０のレーザー）でそれぞれの視野を１０秒間照射することによって、光退色を実施した。ＲＮＡイメージング実験において、退色のために使用された緩衝剤はまた、フルオロフォアをリードアウトプローブに接続するジスルフィド結合を切断するために、５０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４７０６）も含有した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝剤中の高いホルムアミド濃度の結果として、ＤＡＰＩシグナルは消滅した。
画像獲得。特注の顕微鏡システムを使用して、画像獲得を実施した。Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｕ顕微鏡本体を中心に、開口数を１．４とする、Ｎｉｋｏｎ ＣＦＩ Ｐｌａｎ Ａｐｏ Ｌａｍｂｄａ ６０倍油浸対物レンズと共に、システムを構築した。照射は、２つの選択肢のうちの１つに基づくものであった：
１．以下の波長：４０５ｎｍ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｏｂｉｓ ４０５ｎｍ ＬＸ ２００ｍＷ）、５６０ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－２０００－５６０－Ｂ１Ｒ）、６４７ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－１５００－６４７－Ｂ１Ｒ）および７５０ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－７５０－Ｂ１Ｒ）を有する固体状態の単一モードレーザー。この場合、５６０ｎｍ、６４７ｎｍおよび７５０ｎｍのレーザーの出力は、音響光学チューナブルフィルター（ＡＯＴＦ）によって制御したが、４０５ｎｍのレーザーは、そのレーザー制御ボックスによって直接制御した。特注ダイクロイックフィルター（Ｃｈｒｏｍａ、ｚｙ４０５／４８８／５６１／６４７／７５２ＲＰ－ＵＦ１）および発光フィルター（Ｃｈｒｏｍａ、ＺＥＴ４０５／４８８／４６１／６４７－６５６／７５２ｍ）を使用して、励起照射と放出照射とを分離した。
２．以下の波長：４０５ｎｍ、４４６ｎｍ、４７７ｎｍ、５２０ｎｍ、５４６ｎｍ、６３８ｎｍおよび７４９ｎｍを有するＬｕｍｅｎｃｏｒ ＣＥＬＥＳＴＡ光エンジン（繊維に結合した固体状態のレーザーベースの照射システム）。このシステムを、ペンタバンドパスダイクロイック（ＩＤＥＸ、ＦＦ４２１／４９１／５６７／６５９／７７６－Ｄｉ０１－２５ｘ３６）およびペンタバンドバスフィルター（ＩＤＥＸ、ＦＦ０１－４４１／５１１／５９３／６８４／８１７－２５）と共に使用した。
学術用ＣＭＯＳカメラ（単一分子のイメージングのために工場で較正した、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＬＡＳＨ４．０またはＨａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１３４４０）を、画像獲得のために使用した。三次元における試料位置を、ＸＹＺステージ（Ｌｕｄｌ）を使用して制御した。特注のオートフォーカスシステムを使用して、長時間にわたって一定の焦点面を維持した。これを、ガラス－液体界面から反射した２つのＩＲレーザー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＬＰ９８０－ＳＦ１５）ビームの相対位置を比較することによって達成し、別々のＣＭＯＳカメラ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ｕｃ４８０）上でイメージングした。
それぞれの実験について、細胞がまばらである領域を避けて、イメージングのために約６０の視野（ＦＯＶ）を選択した（本発明者らは、典型的には、ＦＯＶあたり１０～５０個の細胞を同定した）。それぞれのカメラのＦＯＶは、イメージング面におけるそれぞれの次元において１５３ｎｍに対応するカメラピクセルを有する、１，０００ｘ１，０００ピクセル、またはイメージング面におけるそれぞれの次元において１０８ｎｍに対応するカメラピクセルを有する、２０４８ｘ２０４８ピクセルを有していた。
各ラウンドのハイブリダイゼーション後（上の「ＦＩＳＨイメージングのためのリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーション」を参照されたい）、それぞれのＦＯＶのｚスタック画像を、３または４色で獲得した：６４７ｎｍおよび７５０ｎｍの照射（またはＤＮＡとＲＮＡイメージングとを組み合わせる場合、ＲＮＡイメージングのために５６０ｎｍ、６４７ｎｍ、および７５０ｎｍの照射）を使用して、ＦＩＳＨ画像を獲得し、５６０ｎｍの照射（またはＲＮＡとＤＮＡイメージングとを組み合わせる場合、４０５ｎｍの照射）を使用して、標準ビーズをイメージングした。第１ラウンドのイメージングのために、４０５ｎｍの照射を使用して、ＤＡＰＩシグナルをイメージングしたが、抗体イメージングのためには、６４７ｎｍの励起チャネルを、ＲＮＡまたはＤＮＡイメージング後に使用した。連続ｚ切片を、全てのイメージングされた細胞の全ての核体積を包含する、８５、１００または１５０ｎｍにより分離した。それぞれのｚ位置で、画像を全てのチャネルで獲得した後、ステージを動かし、画像を約１０Ｈｚの速度で獲得した。
画像分析ならびにＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのためのスポット適合化。以下の分析パイプラインを、それぞれのイメージングされたＦＯＶに適用して、目的の全ての遺伝子座の三次元（３Ｄ）位置を得た：
１．基準を、全てのラウンドのイメージングにおいて適合させ、画像の整列のために使用した。
２．第１のイメージングラウンド（第１ラウンドのハイブリダイゼーションに先行する）において、個々の核の境界を同定するために、ならびにＲＮＡとＤＮＡイメージングとの間の画像登録のために、ＤＡＰＩシグナルを使用した。
３．それぞれの同定された核内の回折限定スポットを、３Ｄガウス関数に適合させて、局部バックグラウンドを超える質量および明るさのその中心を同定した。
４．適合されたスポットを、全ラウンドのハイブリダイゼーションにわたって同じ核内の他の局在と比較して、特注アルゴリズムおよびソフトウェア（「適合させたＤＮＡスポットのための復号化アルゴリズム」および「適合させたＲＮＡスポットのための復号化アルゴリズム」の節に詳細に記載されている）を使用して、それらが生じた遺伝子座を同定した。
ＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのためのスポット適合化。個々のＦＩＳＨイメージングラウンドからのシグナルを、３Ｄガウス分布を使用して適合させた。分析をより管理可能にするために、１２５に復号化するために保持される画像あたりの適合されたスポットの数を固定した（ノイズがないと予想される異なる遺伝子座の数よりも約３倍多い）。
ドリフト補正。標準ビーズスポット適合化を、上記と同じように実施した。次いで、標準ビーズ位置のセットを、ハイブリダイゼーションラウンド間で比較し、厳正な形質転換を適用して、ビーズの相対位置の平方差の和を最小化した。
色効果の補正。多色イメージングに関する裏抜けおよび色収差を、それぞれのイメージングチャネル中の同じセットのゲノム遺伝子座を独立に標識化し、それぞれ、異なるチャネル中の同じ遺伝子座のシグナルを比較することによって実施した。
核のセグメント化。第１ラウンドのイメージングからのＤＡＰＩ画像を使用して、個々の核の体積を同定し、細胞セグメント化を可能にした。これを、畳み込みニューラルネットワークにより達成し、構築および訓練し、インプットとしてのｘｙ平面上へのＤＡＰＩ画像の最大投射を取った。
さらなる画像分析：ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録。ＤＮＡとＲＮＡとの両方のイメージングを含む実験において、２Ｄ画像補正により２セットの画像にわたる大まかな画像登録（カメラピクセル精度への）のために、最初にＤＡＰＩシグナルを使用した（それぞれのセット内の全画像を、標準ビーズを使用してＤＡＰＩ画像に対して整列させた）。ＲＮＡ復号化の初期ラウンドを行った後（以下の「適合されたＲＮＡスポットのための復号化アルゴリズム」を参照されたい）、新生ＲＮＡ局在と、それらが存在するＤＮＡ遺伝子座との変位が、ある視野中の全てのイメージングされた遺伝子および細胞にわたって考慮した場合、平均でゼロになるはずであると仮定することによって、より微細なアラインメントを算出した。したがって、さらなる厳正な形質転換を算出して、イメージングされた新生ＲＮＡと、その対応するＤＮＡ遺伝子座との平均変位を最小化し、これを最終的なアラインメントとして使用した。
免疫蛍光イメージングからの核内構造体の同定。核内構造体（核スペックルおよび核小体）の位置を、免疫蛍光シグナルの強度に対して閾値を適用し、高い免疫蛍光シグナルを同定するピクセル化されたマスクを得ることによって、免疫蛍光シグナルから抽出した。次いで、これを、核内構造体を「含有」するピクセル化されたセットの位置として処理した。
適合されたＤＮＡスポットのための復号化アルゴリズム。それぞれのゲノム遺伝子座の同定および３Ｄ局在特定を、以下の工程によって達成した：
１．各ラウンドのイメージングにおいて全ての同定されたスポットのドリフト補正および収差補正された位置について、一覧を生成した。
２．全てのイメージングラウンドにおけるそれぞれの検出されたスポットについて、他のラウンドに由来する全てのスポットが、その位置からの設定されたカットオフ距離（ｘ、ｙおよびｚにおいて約１５０ｎｍ）内にあることが見出された。スポット対によって産生されたバーコード（それらが出現するラウンドおよびカラーチャネルに基づく）が、正当なバーコード（ゲノム遺伝子座に割り当てられたバーコード）に対応するかどうかに関係なく、全てのそのようなスポット対を、さらなる分析のために保持した。
３．それぞれのスポット対について、３つの品質測定基準を算出した：
Ａ．２つのスポットの３Ｄ局在間の変位
Ｂ．２つのスポット間の明るさの差異
Ｃ．２つのスポットの明るさの平均。
それぞれのスポットの明るさを、対応するビット中の全スポットの明るさの中央値によって正規化した。
４．次いで、スポット対を、それらが正当なバーコード（したがって、潜在的には、ゲノム遺伝子座）に対応するかどうかに基づいて、２つの群に分離した。各群内で、品質測定基準の分布を算出した。便宜上、無効なバーコードからのスポット対品質測定基準の分布を、「無効な分布」と称し、全ての正当なバーコードからのものを「正当な分布」と称した。
５．それぞれのスポット対について、工程３における３つの品質測定基準を、工程４における「正当な分布」に対する全ての候補スポット対に関する合わせたＦｉｓｈｅｒのｐ値を算出することによって、単一の尺度に合わせた。これを、それぞれのスポット対の全体的な品質スコアと考え、以下のように対あたりで算出した：３つの測定基準のそれぞれについて、「正当な分布」における他のスポット対の比率を、より低い品質測定基準を用いて算出し、これらの比率を一緒に乗算した。次いで、期待値最大化手順を使用して、それぞれの標的化されたクロマチン遺伝子座に対応する最も高い品質スコアを有する２つのスポット対を逐次的に選択し、「正当な分布」を再アップデートし、この最適化手順を収束まで繰り返した。収束後、それぞれクロマチン遺伝子座に対応する、最後のセットのスポット対を使用して、遺伝子座の３Ｄ空間位置を決定した。
６．工程５の後、改変型Ｋ平均アルゴリズムを使用して、同じ染色体に属するクロマチン遺伝子座を２つのホモログに分離した。点を２つの群に分け、各群内の回転半径を最小化する標準的なＫ平均クラスタリングアルゴリズムとは反対に、点を、群間で進行的に切り替えて、最初にそれぞれのホモログ中の割り当てられた点の比率を最大化した後、それぞれのホモログの回転半径を最小化した。
７．２つのホモログを分離した後、工程２からのそれぞれのスポット対のその質量中心および距離を、その親染色体の質量中心に対して算出した。染色体中心までの距離を、工程３において考慮した３つの測定基準に加えて別の品質測定基準として加え、工程３～６を繰り返した。
８．最後に、工程７からのスポット対をフィルタリングして、品質スコアが「無効な分布」と依然として類似する対を除去した。
工程８後の残りのスポット対を使用して、クロマチン遺伝子座の最終的な位置を決定し、クロマチン構造を追跡した。
適合されたＲＮＡスポットのための復号化アルゴリズム。ＲＮＡイメージングラウンドからのシグナルを、以下の手順を使用して復号化した。
１．各ラウンドのイメージングにおいて全ての同定されたスポットのドリフト補正および収差補正された位置について、一覧を生成した。
２．全てのイメージングラウンドにおけるそれぞれの検出されたスポットについて、他のラウンドからの全てのスポットが、その位置からの設定されたカットオフ距離内にあることが見出され、これらのスポット対を、それらが正当なバーコードを形成した場合、候補ＲＮＡバーストとして保持した。
３．次いで、これらの候補ＲＮＡバーストのそれぞれの位置を、初期の画像登録（ＤＡＰＩ画像に基づく）ならびにドリフト補正および収差補正後に、関連遺伝子を有するＤＮＡ遺伝子座の位置と比較し、それらが設定された閾値距離内にある場合、保持した。
４．ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の登録を、上の「ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録」の節に記載されたように、初期の復号化されたＲＮＡ局在（工程３からの）と、それらを有するＤＮＡ遺伝子座の位置との間の変位に基づいて精緻化した。
５．全ての候補ＲＮＡバーストの位置を、今回、精緻化された画像登録を用いて、それらが復号化する遺伝子を有するＤＮＡ遺伝子座の位置と再度比較した。新生ＲＮＡ局在がこの段階でそれが存在するＤＮＡ遺伝子座からのカットオフ距離内にあった場合、それを、検出された転写バーストと考えた。
さらなる分析：核ラミナの同定。所与の細胞中の全ての復号化されたクロマチン遺伝子座の位置の周囲に最小の３Ｄ凸包を生成することによって（Ｐｙｔｈｏｎのｓｃｉｐｙパッケージを使用する）、核ラミナの位置を推定した。
空間距離。任意の遺伝子座対間の空間距離を、物理的距離に対するカメラピクセルおよびｚステップに関する適切な比率を乗じた、その適合された３Ｄガウス分布中心間のユークリッド距離として単純に算出した。核内構造体までの距離の場合、全ての同定された核内構造体の「位置」までの最小ユークリッド距離または核ラミナを規定する凸包の表面までの最小距離を算出した。
イメージングからの接触頻度マトリックス。任意の所与の対の遺伝子座間の接触頻度を算出するために、設定された閾値よりも小さいその遺伝子座対間の測定距離の数を計数した。次いで、この数を、その遺伝子座対について測定された距離の総数で除算した。
局部密度分析。それぞれの復号化された位置でのコンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座のｔｒａｎｓ染色体局部密度を算出するために、それぞれの細胞に関するクロマチン遺伝子座のそれぞれの対の間の空間距離を算出した。それぞれの遺伝子座について、局部Ａ／Ｂ密度比を、以下のように算出した：
１．それぞれの他の遺伝子座の密度の寄与を、２つの遺伝子座間の距離で５００ｎｍ（細胞サイズの変動を説明するように調整される）の標準偏差を用いてガウス関数値を評価することによって、異なる染色体から算出した。
２．次いで、遺伝子座での合計Ａ密度を、全てのｔｒａｎｓ染色体Ａ遺伝子座にガウス関数値の和として計算し、合計Ｂ密度を同様の方法で計算した。
３．ｔｒａｎｓ染色体コンパートメントＡ遺伝子座の合計密度を、ｔｒａｎｓ染色体コンパートメントＢ遺伝子座の密度で除算して、その遺伝子座でのＡ／Ｂ密度比を見出した。
多重化ＲＮＡイメージングにおける検出効率の推定。転写バースト事象の検出効率の推定を、以下のように実施した：
１．ＲＮＡイントロンがイメージングされる遺伝子を有する全ての標的ゲノム遺伝子座を考慮した。これらのゲノム遺伝子座のいずれかについて、その対応するＲＮＡシグナルは、遺伝子が転写される場合に２つの予め定義されたビットで出現した。これらの２つのビットのそれぞれが検出されない率（ｐ）を知ることは、ＲＮＡの検出効率の誘導を可能にした。その対応する遺伝子の２つの予想されるビットのうちの少なくとも１つにＲＮＡシグナルと共に局在する（約１５０ｎｍ以内）ゲノム遺伝子座のセットを同定した。
２．工程１で同定されたクロマチン遺伝子座の合計セットから、その遺伝子の対応するビット（両方のビットではない）の正確に１つから、ＲＮＡシグナルと共局在する遺伝子座の比率（ｆ）を決定した。
に等しいはずである、測定されたｆ（８．４％）から、ｐ（４．４％）が推定された。
３．両方のビットにおける共局在シグナルを検出するための全体的な検出効率を、式：
を使用して算出したところ、約９２％であることがわかった。
Ｈｉ－Ｃデータ分析。ＩＭＲ－９０細胞に関するＨｉ－Ｃデータを入手し、ｓｔｒａｗを使用してロードした。個々の染色体におけるＡ／Ｂコンパートメントの同定のために、確立され公開されたプロトコールに従った。イメージングデータに由来する接触頻度のＨｉ－Ｃとの比較のために、標的領域を中心とするビンを創出し、これらのビンに関するＨｉ－Ｃデータを、より高い分解能のＨｉ－Ｃデータにおけるリード数を合計することによって入手した。
［実施例６］
クロマチンの三次元（３Ｄ）構成は、多くのゲノム機能を調節する。しかしながら、３Ｄゲノム構成の理解は、その天然の文脈でクロマチンコンフォメーションを直接的に視覚化するための手段がないことによって妨げられる。本明細書で報告されるのは、高いゲノムスループットで単一細胞中で複数のスケールにわたってクロマチン構成を視覚化するためのイメージングプラットフォームである。最初に、逐次的ハイブリダイゼーションによって数百個のゲノム遺伝子座の多重化イメージングを示し、全染色体の高分解能コンフォメーショントレーシングを可能にした。次に、ゲノムスケールのクロマチントレーシングのためのコンビナトリアルイメージング方法を開発し、ランドマーク核構造と一緒に、１０００を超えるゲノム遺伝子座および１０００を超える遺伝子の新生転写物の同時的イメージングを示した。このプラットフォームを使用して、単一細胞中でのクロマチンドメイン、コンパートメント、およびｔｒａｎｓ染色体相互作用、および転写とのその関係を特徴付けた。その天然の構造的および機能的文脈においてクロマチン構成の統合ビューを提供する、この高効率、マルチスケールおよび多モードのイメージング技法の幅広い適用がある。
ゲノムの３Ｄ構成は、遺伝子発現からＤＮＡ複製に及ぶ多くの必須の細胞機能を調節する。生化学的測定およびイメージング測定は、様々な規模にわたって複雑なクロマチン構造を解明してきた。特に、Ｈｉ－Ｃおよび他のシーケンシングベースの方法などの、高効率染色体コンフォメーション捕捉法は、ゲノムワイドビューと共に、ドメインおよびコンパートメントなどのクロマチン構造を明らかにしてきた。とりわけ、クロマチンは、Ｈｉ－Ｃ接触マップ上でブロック様構造として出現する、トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）と呼ばれる、自己相互作用が増強されたゲノム領域に分割される。サイズが数百キロベース（ｋｂ）から数メガベース（Ｍｂ）の範囲のこれらのＴＡＤは、同時に調節される遺伝子を有することが多く、調節エピジェネティックエレメントと一致する境界を有する。より大きな規模では、クロマチンは、クロマチンの遺伝子が多い、および遺伝子が少ないセグメントが空間的に分離する傾向があるという以前のイメージングベースの観察と一致して、Ｈｉ－Ｃマップにおける交互の「格子縞」パターンによって示されるように、それぞれ、活性クロマチンおよび不活性クロマチンについて強化される、ＡおよびＢコンパートメントと呼ばれる２つの主要なコンパートメントに分割される。最近のイメージング実験は、コンパートメントＡおよびコンパートメントＢのクロマチンが実際に、単一細胞中で空間的に分離する傾向があることを示している。Ａ／Ｂコンパートメント化の生理学的意義は、開発中の、および細胞型間のその変化によって暗示される。
全体として、高効率のシーケンシングベースの手法は、３Ｄゲノム構成の知識を大きく強化してきた。それにも拘わらず、これらの強力な手法はまた、制限も有する。例えば、これらの方法は、クロマチン遺伝子座の対に関する接触情報を提供するが、これらの遺伝子座に関する直接的な空間位置情報は提供しない。さらに、クロマチン構成に関する多くの洞察は、数百万個の細胞にわたって集団平均化された接触マップ上で構築される。単一細胞Ｈｉ－Ｃ法の継続的な改善にも拘わらず、単一細胞中でのクロマチン接触の捕捉効率および／またはこれらの方法の細胞スループットは依然として低いままであり、したがって、単一細胞中での３Ｄゲノム構成の精査は依然として課題の多い仕事である。さらに、例えば、相互作用タンパク質、核構造、またはＤＮＡ改変の文脈におけるクロマチン接触の特徴付けを提供するために、Ｈｉ－Ｃと他の測定モダリティーとを組み合わせる方法が出現したが、シーケンシングによる多モード測定は依然として課題が多い。とりわけ、同じ細胞中でクロマチン構成と転写活性との両方のゲノムスケールでの測定を可能にする方法は、クロマチン構成がどのように転写を調節するか、次いで、転写がどのようにクロマチン構成に影響するかをさらに理解するためのそのような方法に関する要求にも拘わらず、出現していない。
他方で、イメージングベースの手法は、高い検出効率と共に、個々の細胞中のクロマチン遺伝子座の空間位置の直接的な尺度を提供する。特に、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、固定された細胞中のクロマチン遺伝子座の非常に特異的な検出を可能にし、より最近では、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）システムは、生きた細胞中で特定のクロマチン遺伝子座をイメージングする能力を実質的に増強した。また、クロマチンイメージングを、ＲＮＡおよびタンパク質イメージングと組み合わせて、クロマチン構成と、転写活性または相互作用タンパク質因子との相互作用を精査することもできる。しかしながら、現在のイメージング方法は、ゲノム（配列）空間におけるスループットを制限し、伝統的には、一度にほんのわずかな異なるゲノム遺伝子座の試験を可能にする。それぞれのラウンドが、１色または２色イメージングを使用して１つまたは２つのゲノム遺伝子座を標的とする、逐次的ラウンドのＦＩＳＨイメージングによるクロマチントレーシング手法が、最近開発された。この手法は、単一細胞中での数十個の異なるクロマチン遺伝子座のイメージングを可能にし、クロマチン構造および転写とのその関係における洞察を提供するために使用されてきた。しかしながら、個々の細胞中で同時にイメージングすることができるゲノム遺伝子座の数は依然として限られているため、個々の細胞中でのクロマチン構成のゲノムスケールでのビューは言うまでもなく、単一細胞中での全染色体の高分解能ビューも依然として得られていない。
単一細胞中で様々な分解能およびゲノムカバレッジで数百個から１，０００個を超える異なるゲノム遺伝子座の同時的イメージングを可能にするマルチスケールの多重化されたＦＩＳＨイメージングプラットフォームが、本明細書で報告される。最初に、逐次的イメージング手法を実質的に進化させて、数百個のゲノム遺伝子座のイメージングを可能にし、この方法を適用して、全染色体の高分解能ビューを提供し、単一細胞中でのクロマチンドメインおよびコンパートメント構造、互いとのその関係、ならびにクロマチン構成と転写との関係を解明した。次に、大規模多重化ＦＩＳＨ手法を、はるかに少ないハイブリダイゼーションラウンドを用いてより多くのゲノム遺伝子座をイメージングすることができる、コンビナトリアル標識化およびイメージングに基づいて開発した。この手法を使用して、個々の細胞中での１，０００個を超えるゲノム遺伝子座の同時的イメージング、ならびにこれらの遺伝子座および核スペックルおよび核小体を含む、ランドマーク核構造に存在する１，０００個を超える遺伝子の新生ＲＮＡ転写物と一緒のこれらのゲノム遺伝子座の同時的イメージングを示し、クロマチン構成を、その天然の構造的および機能的文脈に置くのを可能にした。この手法を使用して、単一細胞中でのｔｒａｎｓ染色体相互作用、転写活性および核構造の間の関係を探索した。
複数のスケールにわたるクロマチン構造の体系的なビューを可能にするために、特注の顕微鏡および流体工学設定（実施例１９を参照されたい）を使用する、イメージングプラットフォームを、ゲノムスケールまでの、配列空間において例外的に高効率でのクロマチンの直接的視覚化のために開発した。このプラットフォームは、２つの相補的な手法を含んでいた（図１７Ａ）。第１に、そこに含まれる異なる遺伝子座が、任意の単一の画像中で分解するのが困難であるような、比較的小さいものであったクロマチン構造のイメージングのために、以前に報告された逐次的イメージング戦略を拡大して、単一細胞中での数百個のクロマチン遺伝子座のトレーシングを可能にした。この手法では、クロマチンを、多くのイメージングラウンドにわたって、一度に１個の遺伝子座（または２～３色のイメージングを用いて一度に２～３個の遺伝子座）についてイメージングした（図１７Ａ、左）。この手法は、それを使用して、高分解能で単一の細胞中で全染色体のコンフォメーションを追跡することによって実証された。第２に、核全体にわたって広がる構造などの、回折限界分解能よりも実質的に大きい領域にわたって分散したクロマチン構造をイメージングするために、多くのクロマチン遺伝子座がそれぞれのラウンドにおいて同時にイメージングされ、その異なる識別が、それらが出現する異なる組合せのラウンドに基づいて決定される、より効率的な、コンビナトリアル戦略を開発した（図１７Ａ、右）。この後者の手法により、はるかにより少ないイメージングラウンドでの多数のゲノム遺伝子座のイメージングが可能になった。この手法を使用して、単一細胞中での、転写活性および重要な核構造の文脈におけるクロマチン構造のゲノムスケールでのビューを提供した。
図１７Ａ～図１７Ｍは、単一細胞中でのクロマチンドメインの逐次的ハイブリダイゼーションおよび特性評価による高分解能全染色体トレーシングを示す。図１７Ａは、マルチスケールでのクロマチントレーシングプラットフォームの概略図を示す。左：逐次的ハイブリダイゼーションおよびイメージングによる全染色体のクロマチントレーシングの概略図。標的クロマチン構造が、回折限界分解能と同等であるか、またはそれよりも小さい場合、単一のクロマチン遺伝子座は、イメージングラウンドあたりそれぞれのカラーチャネルにおいてイメージングされる。イメージングの全ラウンド後、クロマチントレースを、標的染色体の各コピーについて３Ｄで生成することができる。右：コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのイメージングの概略図。遺伝子座が核全体に分散している場合など、標的遺伝子座が、回折限界分解能よりも実質的に大きい空間中に広がっていると予想される場合、それぞれのラウンドにおいて複数の遺伝子座をイメージングおよび分解することができ、各遺伝子座の識別を、遺伝子座が検出されるイメージングラウンドの組合せに基づくバーコードから誘導することができる。この手法は、逐次的イメージング手法と比較して、同じ数の遺伝子座をイメージングするのに必要とされるラウンド数を有意に減少させる。
［実施例７］
全染色体の高分解能クロマチントレーシング。この節では、逐次的イメージング手法による高分解能全染色体トレーシングが記載される（図１７Ａ、左；図２４Ａ）。ヒト第２１染色体（Ｃｈｒ２１）に最初に焦点を合わせ、染色体の非繰り返し部分（Ｃｈｒ２１：１０．４～４６．７Ｍｂ）を、それぞれ５０ｋｂの長さの、６００個を超える連続セグメント（すなわち、６００個を超えるゲノム遺伝子座）に分割した。染色体にハイブリダイズするための可変標的配列および５０ｋｂの遺伝子座のそれぞれにとってユニークであるリードアウト配列をそれぞれ含有する、一次オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーをデザインした（図２４Ａ）。特定の５０ｋｂの遺伝子座に結合した全ての一次プローブは、同じリードアウト配列を共有し、したがって、そのリードアウト配列を使用して、蛍光色素で標識された相補的リードアウトプローブのハイブリダイゼーションによってそれぞれの遺伝子座を同定することができた（図２４Ａ）。しかしながら、６００個を超える異なる蛍光リードアウトプローブを用いたこれらのゲノム遺伝子座の同定は、色素標識されたオリゴヌクレオチドの高い費用のため、法外に高価である。この課題を克服するために、それぞれの遺伝子座特異的リードアウト配列を、３つの共通のリードアウト配列のうちの１つに変換する非標識アダプタープローブによって媒介される、３つの色素標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（リードアウトプローブと呼ばれ、それぞれのカラーチャネルについて１つのリードアウトプローブである）の共通のセットを用いて異なるリードアウト配列を検出する２工程の標識化戦略を考案した（図２４Ａ）。この戦略を使用して、ヒト肺線維芽細胞（ＩＭＲ－９０）中のＣｈｒ２１中の６００個を超えるクロマチン遺伝子座を、それぞれのラウンドにおける３色イメージングと共にアダプターおよびリードアウトプローブの２００ラウンドを超えるハイブリダイゼーションを使用して、逐次的にイメージングした。そのような多数のハイブリダイゼーションラウンドにわたる安定なイメージングを可能とするために、イメージングプロトコールを、以下のようにさらに最適化した：（ｉ）試料の完全性および一次プローブの結合安定性を維持するために、イメージングの過程中に定期的に試料をホルムアルデヒドで再固定した；（ｉｉ）それぞれのイメージングラウンド後の蛍光シグナルの完全な除去を確保し、数百回の標識化ラウンドにわたる残留シグナルの蓄積を最小化するために、化学的切断と光退色化手法との組合せを使用して、リードアウトプローブの蛍光シグナルを除去し、未標識のリードアウトプローブを添加して、それぞれのラウンドのイメージング後にアダプタープローブ上の占有されていない結合部位を遮断した；（ｉｉｉ）摂動および実験時間を最小化するために、それぞれのハイブリダイゼーションラウンドの持続期間および流体システムの流速を最適化した。
イメージング後、それぞれのクロマチン遺伝子座の質量中心位置を３Ｄで決定し、それぞれの細胞中のＣｈｒ２１のそれぞれの相同なコピーのコンフォメーションを再構築した（図１７Ｂ）。多くのハイブリダイゼーションラウンドにわたって試料およびイメージング機器がどれぐらい安定であったのかを推定するために、異なる数のハイブリダイゼーション／イメージングラウンド後に、同じクロマチン遺伝子座を再イメージングし、元の遺伝子座の位置と、対応する再イメージングされた遺伝子座のものとの変位を、測定精度の尺度として使用した。元の遺伝子座と再イメージングされた遺伝子座との間の変位中央値は、１１ラウンドのハイブリダイゼーションが２つのイメージング例を分離した場合の約７０ｎｍから、初期および再イメージング例を約２５０ラウンドのハイブリダイゼーションにより分離した場合の約１２０ｎｍまで増大し（図２４Ｂ～２４Ｃ）、再イメージングの際により大きい変位を示した遺伝子座は、より低い蛍光シグナル強度をも有していた（図２４Ｄ）。変位エラー中央値は、２５０を超えるラウンドのハイブリダイゼーション後であっても、近隣のクロマチン遺伝子座の間の距離中央値（約２５０ｎｍ）よりも実質的に小さかったことがわかった（図２４Ｂ）。さらに、イメージングされた遺伝子座間のペアワイズ距離中央値は、生物学的反復間で高度に再現性があった（図２４Ｅ）。これらの実験におけるクロマチン遺伝子座の検出効率は、９０％を超えていた（すなわち、９０％を超える標的クロマチン遺伝子座がそれぞれの染色体中で検出された）。
Ｃｈｒ２１のクロマチンコンフォメーションの集団平均ビューを得るために、イメージングされた遺伝子座間のペアワイズ相互作用を、約３，５００個のイメージングされた細胞にわたって、その空間距離中央値および遺伝子座が近くに来る確率を算出することによって定量した（図１７Ｃおよび図２４Ｆ～２４Ｉ）。Ｃｈｒ２１中に存在する全ての長さ規模にわたって、イメージングデータからのペアワイズ距離中央値と、以前に公開されたＨｉ－Ｃデータとの高い相関（０．８９のＰｅａｒｓｏｎ相関；図２４Ｆ～２４Ｇ）が観察され、より短いゲノム距離について特に高いことと一致していた（０．９７のＰｅａｒｓｏｎ相関；図２４Ｈ～２４Ｉ）。２つの遺伝子座が近接していると考えられたものより下のカットオフ距離を選択するために、カットオフ距離の範囲にわたって、Ｈｉ－Ｃデータと、イメージングデータに由来する接近頻度（すなわち、２つの遺伝子が近接している例の比率）との間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数を算出した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、幅広いカットオフ距離について高いままであったが、カットオフ距離が約４００～５００ｎｍであった場合、０．８８でピークに達した（図２４Ｊ）。かくして、この作業を通して接近頻度マップを生成するために、カットオフ距離として５００ｎｍを選択した（カットオフ距離の選択に関するより詳細な根拠については、実施例１９を参照されたい）。
距離中央値と接近頻度マップとの両方とも、ブロック様ＴＡＤ構造を示した（図１７Ｃおよび図２４Ｆおよび図２４Ｈ）。イメージングデータからの距離と接近頻度マップとの両方から同定されたＴＡＤ境界は、アンサンブルＨｉ－Ｃデータから決定されたものと非常に類似していた（図２４Ｋ）。さらに、クロマチントレースにおける遺伝子座局在特定エラー（約１００ｎｍ）は、ドメイン境界の同定およびその精度に対する効果がほとんどないことが確認された（図２４Ｋ）。
図１７Ｂは、逐次的ハイブリダイゼーション手法によってイメージングされた、単一のＩＭＲ９０細胞中での２コピーのＣｈｒ２１の３Ｄ構造レンダリングおよび空間距離マトリックスを示す。左：単一細胞中の２コピーのＣｈｒ２１を、核のＤＡＰＩ画像上に重ね合わせる。スケールバーは５マイクロメートルである。右上：染色体間のそのゲノム候補による２つのＣｈｒ２１コピーにおける全ての検出されたクロマチン遺伝子座（球体）の３Ｄレンダリング（ゲノム位置を右に示す）。可撓性の線は隣接するクロマチン遺伝子座を接続する。スケールバーは１マイクロメートルである。右下：上に示された染色体コピーに対応するペアワイズ空間距離マトリックス（適切な参照ゲノムを含まない、または高度に反復性の配列を含有するゲノム領域はイメージングされない）。
図１７Ｃは、Ｃｈｒ２１のアンサンブル接近頻度マトリックスおよびＣＴＣＦ／ＲＡＤ２１結合部位での単一細胞ドメイン境界の優先的配置を示す。上：イメージングデータに由来するＣｈｒ２１の接近頻度マトリックス。それぞれのマトリックスエレメントは、遺伝子座対間の測定距離が５００ｎｍのカットオフ距離よりも短い頻度と定義される。中央：Ｃｈｒ２１の１０Ｍｂ部分に関する接近頻度マトリックスのズームインバージョン。下：イメージングされた５０ｋｂのゲノムセグメントのそれぞれでの単一細胞ドメイン境界形成の確率。三角形は、ＣＴＣＦおよびＲＡＤ２１のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを示す。
図２４Ａ～図２４Ｎは、逐次的ハイブリダイゼーションによる高分解能全染色体トレーシング、およびＨｉ－Ｃと比較した、Ｃｈｒ２１構造特性のアンサンブル統計を示す。図２４Ａは、アダプタープローブとの逐次的ハイブリダイゼーションのための標識化およびイメージングスキームを示す。第１に、標的ゲノム遺伝子座への特異的結合を可能にする標的配列およびリードアウト配列をそれぞれ含有する、試料を、一次プローブとハイブリダイズさせる。それぞれの遺伝子座を、合計３５０～５００の一次プローブによって標識するが、１つのみを示す。それぞれの標的ゲノム遺伝子座に、遺伝子座に結合する全ての一次プローブに共通のユニークなリードアウト配列（種々の色で示される）を割り当てる。次いで、逐次的ラウンドのハイブリダイゼーションを使用して、リードアウト配列を検出する。それぞれのラウンドのハイブリダイゼーション中に、標的遺伝子座に対応するリードアウト配列（３つのカラーチャネル、Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ６４７、およびＣｙ３のそれぞれについて１つ）を、それぞれ２つの部分：遺伝子座特異的リードアウト配列と相補的なセグメントおよびカラーチャネル特異的な共通のリードアウト配列を含有するセグメントからなるオリゴヌクレオチドアダプタープローブで標識する。それぞれのカラーチャネルは、同じカラーチャネルで視覚化された全てのアダプターによって共有されるユニークな共通リードアウト配列を含有する。次いで、共通リードアウト配列を、対応するカラーチャネルにおいて色素コンジュゲートされた相補的リードアウトプローブにハイブリダイズさせる。この手順により、それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションの間に３つのカラーチャネルにおいて３つのゲノム遺伝子座をイメージングすることができる。それぞれのラウンドのイメージングの後、ジスルフィド結合によってリードアウトプローブに接続される蛍光色素を、ＴＣＥＰによって共通リードアウトプローブから切断し、アダプター上の占有されていないリードアウト配列を、未標識の共通リードアウトプローブで遮断して、ハイブリダイゼーションラウンド間のクロストークを防止する。このプロセスを、全てのリードアウト配列、したがって、全てのゲノム遺伝子座の検出が完了するまで数百ラウンドにわたって反復する。
図２４Ｂは、単一の実験の過程にわたる遺伝子座の変位を示す。Ｃｈｒ２１中の９００ｋｂの領域内の連続する５０ｋｂのセグメント（ｃｈｒ２１：３２．４５～３３．３５Ｍｂ）を、２５０ラウンドを超えるハイブリダイゼーションによって分けられた、実験の開始時および終了時の両方においてイメージングした。再イメージングされたスポットと、その元のイメージングされた対応物との間の変位の分布を示す。比較のために、元のイメージングラウンドにおいて測定された同じ９００ｋｂの領域中の隣接する５０ｋｂのセグメント間の距離の分布を示す。
図２４Ｃは、異なる数のハイブリダイゼーションラウンドによって分けられた、元のイメージングラウンドと、再イメージングラウンドとの間のクロマチン遺伝子座の変位の箱ひげ図を示す。 中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および１０～９０パーセンタイル（ひげ）が示される。
図２４Ｄは、２５０ラウンドを超えるハイブリダイゼーションによって分けられた、元のイメージングと再イメージング実験との間で低い（５００ｎｍ未満）および高い（５００ｎｍを超える）変位エラーを示すクロマチン遺伝子座の蛍光シグナルの箱ひげ図を示す。中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および１０～９０パーセンタイル（ひげ）が示される。
図２４Ｅは、２つの反復実験間の遺伝子座間空間距離中央値の比較を示す。イメージングされたクロマチン遺伝子座の対の間の空間距離中央値を、Ｃｈｒ２１の２つの生物学的反復実験のために別々に算出し、互いに対してプロットした。２回反復において測定したデータ間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数は、ρ＝０．９８である。
図２４Ｆは、イメージングに由来する空間距離中央値マトリックス（左）、イメージングに由来する接近頻度マトリックス（中央）、およびＣｈｒ２１に関するアンサンブルＨｉ－Ｃ接触マトリックス（右）の比較を示す。イメージングデータのために、２つのクロマチン遺伝子座は、２つの遺伝子座間の空間距離が５００ｎｍのカットオフ距離よりも小さい場合、近接していると考えられる。Ｈｉ－Ｃ接触マトリックスは、５０ｋｂでビンされ、標的領域を中心とする。
図２４Ｇは、アンサンブルＨｉ－Ｃに由来する接触回数およびクロマチン遺伝子座の個々の対に関するイメージングに由来するペアワイズ距離中央値の対数－対数散布図を示す。直線は、データの線形回帰を表す（勾配＝－４．４３）。イメージングと、Ｈｉ－Ｃデータとの間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数は、ρ＝０．８９である。
図２４Ｈは、図２４Ｆと同じであるが、Ｃｈｒ２１中の３Ｍｂの領域についてのものである（ｃｈｒ２１：３０．３０～３３．３８Ｍｂ）。ＴＡＤ境界は、直線でマーキングされる。
図２４Ｉは、図２４Ｈと同じであるが、（Ｈ）に示される３Ｍｂの領域についてのものである。勾配＝－４．５１、ρ＝０．９７である。
図２４Ｊは、Ｈｉ－Ｃ接触マップと、変化するカットオフ距離を用いて生成されたイメージング由来接近頻度マップとの間のＰｅａｒｓｏｎ相関を示す。接近頻度マップを生成するために、カットオフ距離を選択し、このカットオフ値よりも小さい距離を有する２つの遺伝子座を、近接していると考える。次いで、遺伝子座の対の間の接近頻度を、遺伝子座間の測定距離がカットオフ距離よりも短い発生の数を２つの遺伝子座間の測定距離の総数で除したものとして算出した。
図２４Ｋは、１）イメージングからのペアワイズ距離中央値（上）、２）イメージングからの接近頻度（中央）、および３）Ｈｉ－Ｃ接触リード（下）から算出されたＣｈｒ２１上のゲノム位置の関数としての正規化された絶縁スコアを示す。絶縁スコアを算出するために、目的の位置の上流の固定された長さ（２５０ｋｂ）のゲノムセグメントおよび下流の同じ長さのセグメントを最初に選択した。次いで、正規化された絶縁スコアを、セグメント間ペアワイズ距離中央値とセグメント内ペアワイズ距離中央値との差異をこれらの２つの距離中央値の和によって正規化したものと定義する。ＴＡＤ境界は、標準的なピークコーリングアルゴリズムによって同定された、染色体に沿った正規化された絶縁スコアの局部最大値と定義される（実施例１９を参照されたい）。縦の点線は、Ｈｉ－ＣデータからコーリングされたアンサンブルＴＡＤ境界である。また、推定された局在測定エラーと同等の、１００ｎｍの標準偏差を示す３Ｄガウスノイズ項で遺伝子座の位置を乱した後、距離中央値（黒線、上パネル）および接近頻度（黒線、中央パネル）を、上および中央のパネルに示す。
図２４Ｌは、２つの例示的な単一細胞中のＣｈｒ２１の１０Ｍｂ領域（ｃｈｒ２１：２８．２～３８．１Ｍｂ）中のクロマチンドメインを示す。単一細胞中のＣｈｒ２１の２つの個々のコピーからのペアワイズ距離（上、中央）を、全てのイメージングされた細胞に由来する集団ペアワイズ距離中央値（下）と一緒に示す。
［実施例８］
単一の染色体中のクロマチンドメイン。単一細胞レベルで、染色体は単一細胞空間距離マトリックス中にブロック様特性として現れるドメインに分割されることが観察された（図２４Ｌ）。これらのドメインおよび遺伝子座間距離は、単一細胞Ｈｉ－Ｃデータにおいて観察されるクロマチン接触における実質的な細胞間変動性と一致して、細胞間で高い変動性を示した（図２４Ｌ～２４Ｍ）。類似する分解能で染色体の小さい（約２Ｍｂ）の領域をイメージングする場合、単一細胞中の類似するドメイン構造が以前に観察された。しかしながら、これらの以前に測定された小さい領域内で、かなり多い比率の細胞は、明確な単一細胞ドメイン境界を示さず、ドメインがこれらの細胞内で形成するかどうか、または全てのイメージングされた領域が単一ドメイン内にあるかどうかは依然として不明確であった。さらに、これらの以前にイメージングされた領域のサイズが小さいため、多くのドメインは、イメージングされたゲノム領域の末端で人工的にトランケートされ、かくして、その物理的サイズおよびゲノムサイズなどの、ある特定の基本的なドメイン特性の正確な特徴付けを妨げた。この試験における高いゲノムスループットは、これらの単一細胞ドメイン構造の全染色体ビューを提供し、本質的には全てのイメージングされた細胞において全染色体にわたってその顕著な存在を示し、かくして、より体系的な様式でその特性の特徴付けを可能にした。
これらの単一細胞ドメインの境界のゲノム位置を最初に同定し、それぞれ５０ｋｂのゲノム遺伝子座での境界形成の確率を定量した。境界形成の非ゼロ確率は全てのイメージングされたゲノム遺伝子座で観察されたが、ドメイン境界は、ＣＴＣＦおよびコヘシンの結合部位の近くに優先的に配置された（図１７Ｃ～１７Ｄ）。
ドメイン境界の位置における細胞間変動に加えて、ドメインの物理的サイズから、ドメイン間の絶縁または相互作用の程度までに及ぶ、これらの単一細胞ドメインの他の特徴における実質的な異種性が観察された（図１７Ｅ～１７Ｈ）。具体的には、単一細胞ドメインは、そのゲノムサイズ（図１７Ｉ）と、回転半径によって測定されるその物理的サイズ（図１７Ｅおよび図１７Ｊ）との両方において可変的であることが観察された。これらのドメインのゲノムサイズの分布も、物理的サイズの分布も、約１００ｎｍの推定遺伝子座局在特定エラーに対して感受性ではなかった（図１７Ｉ～１７Ｊ）。とりわけ、同じゲノム領域が境界となっている、または同じゲノムサイズを有するドメインは、細胞間でのその物理的サイズにおいてかなり変動した（図１７Ｅおよび図２４Ｎ）。興味深いことに、相互作用するＣＴＣＦ／コヘシン結合部位が境界となっているドメインは、そのようなゲノム遺伝子座が境界となっていないドメインよりも物理的サイズにおいて小さい傾向があった（図１７Ｋ）。加えて、近隣のドメイン間の物理的分離の程度も、実質的に変化し（図１７Ｆおよび図１７Ｌ）、いくつかの近隣のドメインは、完全に分離され、リンカー領域によって接続されるに過ぎなかったが、その他は部分的な重複およびあまり鮮明でない境界を示した（図１７Ｆ）。さらに、その近隣のドメインから完全に分離されたドメインであっても、空間中で部分的に重複することができたが、非近隣のドメインは、小さい、または大きいゲノム距離によって隔てられた（図１７Ｇ）。最後に、これらの単一細胞ドメインの末端の２つのクロマチン遺伝子座も、互いに変動する距離を示し、ドメインがＣＴＣＦ／コヘシン結合部位が境界となっているかどうかに関係なく、ドメインの内部における類似するゲノム距離によって隔てられたクロマチン遺伝子座と比較して、互いにより近くになる傾向を示さなかったことが観察された（図１７Ｈおよび図１７Ｍ）。
図１７Ｄは、ＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１結合部位またはアンサンブルＴＡＤ境界（灰色）を中心とするゲノム位置での単一細胞中でのドメイン境界形成の確率を平均したものである。
図１７Ｅは、物理的空間において大きい（上）または小さい（下）体積を占有する、同一のゲノム配位を有する２つの単一細胞クロマチンドメインの例である。左：クロマチンドメインの３Ｄレンダリングであり、緑色の球はドメイン内のイメージングされたゲノム遺伝子座を表し、可撓性リンカーはゲノム配列中の隣接する遺伝子座を接続する。灰色のスポットは、残りの染色体中のイメージングされた遺伝子座を表す。スケールバーは１マイクロメートルである。右：隣接領域と共に、左に示されたクロマチンドメインのペアワイズ距離マトリックス（線でマーキングされる）である。
図１７Ｆは、高い（上）および低い（下）絶縁スコアを有するクロマチンドメインの２つの対の例を示す。左：図１７Ｅと同様の、クロマチンドメインの３Ｄレンダリングである。スケールバーは２５０ｎｍである。右：対応する色でマーキングされたレンダリングされたドメインと共に、左に示されたクロマチンドメインのペアワイズ距離マトリックスである。
図１７Ｇは、部分的に重複する体積を有するクロマチンドメイン間の長距離接触の２つの例を示す。左：（Ｅ）と同様の、クロマチンドメインの３Ｄレンダリングである。影は異なるドメインを表す。スケールバーは２５０ｎｍである。右：対応する色でマーキングされたレンダリングされたドメインと共に、クロマチンドメインのペアワイズ距離マトリックスである。灰色の空間は、２２．８５Ｍｂのゲノム距離におけるギャップを示す。
図１７Ｈは、ＣＴＣＦ結合部位によって挟まれたクロマチンドメインの例を示し、ＣＴＣＦ部位間の小さい（上）および大きい（下）距離を示す。左：（Ｅ）と同様であるが、ドメインの末端にＣＴＣＴ部位の遺伝子座を有する、クロマチンドメインの３Ｄレンダリングである。スケールバーは２５０ｎｍである。右：ドメインおよびそれに応じてマーキングされた境界ＣＴＣＦを有するクロマチンドメインのペアワイズ距離マトリックスである。
図１７Ｉは、単一細胞中のＣｈｒ２１におけるクロマチンドメインの測定されたゲノムサイズの分布を示す。１００ｎｍの局在特定エラーを考慮するシミュレートされたデータに由来する、単一細胞中のＣｈｒ２１におけるクロマチンドメインのゲノムサイズの分布が、黒色の線で示される。このシミュレーションでは、イメージングされた遺伝子座の位置は、本発明者らの測定エラーと同様、１００ｎｍの標準偏差を有する３Ｄガウスノイズで乱される。
図１７Ｊは、単一細胞中のＣｈｒ２１におけるクロマチンドメインの、回転半径により定義される、測定された物理的サイズの分布を示す。図１７Ｉと同様、１００ｎｍの局在特定エラーを考慮するシミュレートされたデータに由来する、単一細胞中のＣｈｒ２１におけるクロマチンドメインの物理的サイズの分布が、黒色の線で示される。
図１７Ｋは、相互作用ＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１部位を含有する境界遺伝子座を含む、およびＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１部位を含有する境界遺伝子座を含まない、クロマチンドメインのゲノムサイズの関数としての回転半径中央値を示す。エラーバーは、再サンプリングによって誘導された９５％信頼区間を示す。
図１７Ｌは、ＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１結合部位および非ＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１結合部位に存在するドメイン境界を有する近隣ドメイン間の絶縁スコアの分布を示す。
図１７Ｍは、相互作用ＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１部位を含有する境界遺伝子座を含む、およびＣＴＣＦ／Ｒａｄ２１部位を含有する境界遺伝子座を含まない、クロマチンドメインのゲノムサイズの関数としてのドメインの正規化された末端間距離の中央値を示す。正規化された末端間距離は、同じゲノム距離によって隔てられたが、単一ドメインの内部にある同様の遺伝子座対の間の距離中央値で除算した、ドメインの末端間距離と定義される。エラーバーは、再サンプリングによって誘導された９５％信頼区間を示す。
図２４Ｍは、Ｃｈｒ２１に関する遺伝子座間空間距離の標準偏差マトリックスを示す。領域のそれぞれの対について、全ての単一の染色体コピー中の対応する遺伝子座対間の距離の標準偏差が示される。
図２４Ｎは、回転半径によって測定された、Ｃｈｒ２１における異なるゲノムサイズのクロマチンドメインの物理的サイズの箱ひげ図を示す。それぞれのゲノムサイズについて、中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および１０～９０パーセンタイル（ひげ）が示される。
［実施例９］
単一の染色体中のクロマチンコンパートメント。次に、全染色体の高分解能ビューを使用して、ＡおよびＢコンパートメント中のクロマチン遺伝子座が単一細胞中でどのように配置されるかを検査した。第１に、以前に記載されたアルゴリズム（図１８Ａ；図２５Ａ）を使用して、イメージングデータから誘導された、Ｃｈｒ２１に関する接近頻度マップのＰｅａｒｓｏｎ補正マトリックスの主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、アンサンブルＡ／Ｂコンパートメント境界を決定した。イメージングデータから得られたコンパートメント境界は、以前に公開されたアンサンブルＨｉ－Ｃデータから決定されたものと非常に類似していた（図２５Ａ）。以下では、アンサンブル接近頻度マップから得られたコンパートメント境界を使用して、個々の細胞中の個々の遺伝子座についてＡ／Ｂ識別を割り当てた。
以前の試験と比較した分解能の１０倍を超える増大は、単一の染色体におけるコンパートメントＡ遺伝子座およびコンパートメントＢ遺伝子座の構成の詳細なビューを可能にした。ＡおよびＢ遺伝子座の配置の高い程度の変動が、細胞間で個々の染色体コピー間で観察された（図１８Ｂ）。一部の染色体においては、ＡおよびＢ遺伝子座は、本質的には非重複空間領域中に分離されたが、他の染色体は、Ａ遺伝子座とＢ遺伝子座との間で実質的な空間重複を示した。興味深いことに、同じ染色体中のコンパートメントＡ遺伝子座が、複数の「マイクロコンパートメント」に分離されることもあった（図１８Ｂ）。
個々の染色体におけるＡおよびＢ遺伝子座の空間的分離の程度を定量するために、局部密度に基づく手法を考案し、それぞれのイメージングされた遺伝子座について、他のＡおよびＢ遺伝子座の局部密度を計算した（図２５Ｂ）。予想通り、コンパートメントＡ遺伝子座は、平均して、Ａ遺伝子座によって囲まれる傾向があり、同じことはＢ遺伝子座にも当てはまった（図２５Ｃ）。Ａ／Ｂ分離スコアを、ＡまたはＢ遺伝子座の大部分を有する空間体積中で観察された遺伝子座の純度に基づいて、それぞれ個々の染色体についてさらに定義した（図１８Ｃ）。ＡおよびＢ遺伝子座の完全な物理的分離は、１の分離スコアをもたらし、ＡおよびＢ遺伝子座の完全な混合は、０．５の分離スコアをもたらすと予想された（実施例１９を参照されたい）。細胞中のＣｈｒ２１コピーの大部分について、分離スコアは、０．５を中心とする無作為化対照のスコア（コンパートメントサイズを未変化のまま保持しながらゲノム軸に沿ってコンパートメント境界を無作為にシフトさせることによって得られる）よりもかなり高いことが観察されたが（図１８Ｃ）、これは、ＡおよびＢ遺伝子座が単一細胞中で空間的に分離する傾向を示している。また、ＡおよびＢ遺伝子座の空間的分離が不完全であることが多かったことも注目に値する（図１８Ｃ）。これは、活性および不活性クロマチンの不完全な空間的分離を潜在的に反映したが、部分的には、アンサンブルＡ／Ｂコンパートメント識別を、単一細胞中での活性／不活性クロマチン描写に関する不完全な代理にしうる、エピジェネティック改変の細胞間変動性によっても引き起こされうる。とりわけ、Ａ／Ｂ分離の程度は、細胞周期依存的であることがわかった：Ａ／Ｂ分離は、Ｇ１期の細胞と比較して、Ｇ２／Ｓ期の細胞についてより強力であり（図２５Ｄ）、細胞周期の間のＡ／Ｂコンパートメントの段階的確立の以前の知見と一致していた。
Ｃｈｒ２１は、最も小さい染色体の１つであり、そのサイズはわずかに約４８Ｍｂであり、少数の連続するＡおよびＢ領域のみに分割されることが知られていた。この知見をより大きい染色体に拡張し、それらがどれぐらい一般的であるかを精査するために、そのゲノム配列に沿ってＡおよびＢコンパートメントの間で多数の遷移（約５０の遷移）を示す、最も大きい染色体の１つである第２染色体（Ｃｈｒ２）をイメージングした。具体的には、そのゲノム配列に沿って２５０ｋｂの間隔で５０ｋｂのセグメントを標識およびイメージングすることによって、Ｃｈｒ２を追跡した。上記と同じ手法を使用して、イメージングデータに基づいて染色体のｐおよびｑアーム中にＡおよびＢコンパートメントをコールし（図１８Ｄ；図２５Ｅ）、以前に公開されたアンサンブルＨｉ－Ｃデータから決定されたＡおよびＢコンパートメントとの定量的一致を観察した（図２５Ｆ～２５Ｇ）。単一染色体レベルで、ＡおよびＢ遺伝子座の間のほぼ完全な空間的分離から、実質的な空間的重複に及ぶ、ＡおよびＢ遺伝子座の様々な空間配置を再度観察した（図１８Ｅ）。興味深いことに、一部の染色体は、おそらく、Ｂ遺伝子座と、細胞核の上および下の近くの核ラミナとの優先的会合に起因して、Ａ遺伝子座が２層のＢ遺伝子座の間に配置される「サンドイッチ」形状を示した。定量的には、Ｃｈｒ２の個々のコピーにわたるＡ／Ｂ分離スコア分布は再度、無作為化対照と比較して、ＡおよびＢ遺伝子座が個々の染色体において分離する全体的傾向を示した（図１８Ｆ）。空間的分離の程度は、Ｃｈｒ２１よりもＣｈｒ２においてより小さいように見えた（図１８Ｃおよび図１８Ｆ）。
図１８Ａ～図１８Ｉは、単一染色体中のコンパートメント構造および転写活性と局部クロマチン含量との関係を示す。図１８Ａは、本発明者らのイメージングデータに由来するＣｈｒ２１のゲノム距離で正規化された接近頻度に関するＰｅａｒｓｏｎ相関マトリックスを示す。２つの遺伝子座は、その距離が５００ｎｍのカットオフ距離よりも小さい場合、近接していると考えられる。下の２つのバーは、接近頻度マトリックス（ＡコンパートメントおよびＢコンパートメントについて示される）および染色体中のそれぞれのゲノム遺伝子座のＧバンディングに由来するＡ／Ｂコーリングを示す。
図１８Ｂは、単一細胞中でのＣｈｒ２１の個々のコピーの３Ｄレンダリングを示し、ＡおよびＢ遺伝子座は球として示される。可撓性の線は、ゲノム配列中の隣接する遺伝子座を接続する。下にあるバーは、接近頻度マトリックスに由来する染色体中のそれぞれのゲノム遺伝子座のＡ／Ｂコーリングを示す。スケールバーは１マイクロメートルである。
図１８Ｃは、Ｃｈｒ２１の個々のコピーのＡ／Ｂ分離スコアの分布を示す。Ａ／Ｂ分離スコアを算出するために、Ａ（またはＢ）遺伝子座の２／３が体積内に含まれるように局部Ａ（またはＢ）密度を閾値化することによって、Ａ（またはＢ）高密度体積をそれぞれの染色体について定義する（ＡおよびＢ高密度体積はＡおよびＢ遺伝子座の間で空間的重複を示す染色体について重複してもよいことに留意されたい）。染色体のＡ（またはＢ）高密度体積中の遺伝子座の純度を、体積内の全遺伝子座がＡ（またはＢ）遺伝子座である比率と定義し、染色体コピーのＡ／Ｂ分離スコアを、ＡおよびＢ体積の平均純度と定義した。ヒストグラムは、無作為化対照に関するＡ／Ｂ分離スコアの分布を表し、ここで、連続するＡおよびＢ領域の間の境界は、ＡおよびＢ領域の数およびサイズを未変化のまま保持しながら、ゲノム配列に沿って無作為にシフトする。ｎ＝約７，５００の染色体である。
図１８Ｄは、図１８Ａと同様の、本発明者らのイメージングデータに由来するＣｈｒ２のｐおよびｑアームに関するゲノム距離で正規化された接近頻度のＰｅａｒｓｏｎ相関マトリックス、ならびに対応するＡ／ＢコーリングおよびＧバンディングを示す。
図１８Ｅは、図１８Ｂと同様の、Ｃｈｒ２の個々のコピーの３Ｄレンダリングを示す。 スケールバーは１マイクロメートルである。
図１８Ｆは、図１８Ｃと同様の、単一細胞中のＣｈｒ２に関するＡ／Ｂ分離スコアの分布を示す。ｎ＝約３，１００の染色体である。
図２５Ａ～２５Ｇは、Ｃｈｒ２１およびＣｈｒ２に関するアンサンブルＡ／Ｂコンパートメント分析を示す。図２５Ａは、Ｃｈｒ２１に関する主成分分析に基づくコンパートメントコーリングを示す。イメージング（上）およびアンサンブルＨｉ－Ｃ（下）実験に由来するゲノム距離で正規化された接近頻度からＰｅａｒｓｏｎ相関マトリックスのために算出された第１の主成分（ＰＣ１）を示し、０より大きいＰＣ１値は、コンパートメントＡに対応し、０より小さいＰＣ１値はコンパートメントＢに対応する。
図２５Ｂは、コンパートメントＡ遺伝子座（Ａ遺伝子座）およびコンパートメントＢ遺伝子座（Ｂ遺伝子座）の３Ｄレンダリング、ならびにＣｈｒ２１の単一コピー中のＡ／Ｂ密度比を示す。左：Ｃｈｒ２１の代表的なコピーのＡおよびＢ遺伝子座である。イメージングに由来するアンサンブル接近頻度マップからのＡおよびＢコンパートメントコーリングを、下のバーに示す。右：同じ染色体であるが、それぞれの遺伝子座がその局部Ａ／Ｂ密度比で色付けされる。
図２５Ｃは、全てのイメージングされた細胞にわたって平均化されたＣｈｒ２１中のそれぞれのイメージングされた遺伝子座に関する平均ＡおよびＢ密度スコアを示す。下パネルは、イメージングに由来する接近頻度マップからのそれぞれの遺伝子座のＡまたはＢコンパートメントコーリングを表す。
図２５Ｄは、細胞周期のＧ１およびＧ２／Ｓ期における細胞中のＣｈｒ２１の個々のコピーに関するＡ／Ｂ分離スコアの分布のヒストグラムを示す。
図２５Ｅは、Ｃｈｒ２に関する、イメージングに由来する接近頻度マトリックス（左）およびアンサンブルＨｉ－Ｃ接触マトリックス（右）を示す。Ｈｉ－Ｃ接触マトリックスは５０ｋｂでビンされるが、イメージングされたセグメントからの接触のみ（２５０ｋｂ間隔で選択される）が示される。
図２５Ｆは、図２５Ａと同様の同じＰＣ分析を示すが、Ｃｈｒ２のｐアーム（上）およびｑアーム（下）に関するものである。
図２５Ｇは、図２５Ｃと同様の同じ平均ＡおよびＢ密度分析を示すが、Ｃｈｒ２に関するものである。
［実施例１０］
転写と、局部Ａ／Ｂクロマチン含量との関係。クロマチンコンパートメント化が単一の染色体における活発な転写と相関するかどうかを試験するために、Ｃｈｒ２１中に存在する８６個の遺伝子の最初のイントロンを標的とするオリゴヌクレオチドプローブをデザインし、逐次的ラウンドのハイブリダイゼーションを行って、これらの遺伝子の新生ＲＮＡ転写物をイメージングした後、クロマチントレーシングを行った。さらに、遺伝子の空間位置をより正確に検出するために、それぞれの標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を中心とする５ｋｂのゲノム遺伝子座をイメージングした。ＲＮＡプローブがゲノムＤＮＡに結合する、およびその逆を防止するために、ＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、二本鎖ゲノムを熱変性することなく行った後、クロマチントレーシングを行う前に、ＲＮａｓｅ処理（クロマチンをイメージングする場合にも単独で含まれる工程）を使用してＲＮＡ分子を消化した。ＲＮＡシグナルとＤＮＡシグナルとのクロストークは、この戦略を使用する場合、無視できる程度であることが確認された（図２６Ａ～２６Ｊ）。
典型的には、イメージングされた遺伝子のサブセットは、任意の個々の細胞中で転写活性を示した（図１８Ｇ）。転写活性がどのように局部クロマチン環境と相関するかを検査した。局部Ａ／Ｂクロマチン含量を特徴付けるために、ＡおよびＢ遺伝子座の近くでの局部密度を、それぞれの遺伝子について算出し、その比（本明細書では以後、Ａ／Ｂ密度比と称する）を、活性クロマチンの局部エンリッチメントのための測定基準として使用した。試験した遺伝子の約８０％について、遺伝子が活発に転写している場合、そのＴＳＳでの局部Ａ／Ｂ密度比は、遺伝子が発火していない場合よりも高いことが見出された（図１８Ｈ）。当然の結果として、遺伝子の発火率もまた、遺伝子のＴＳＳがより高い局部Ａ／Ｂ密度比を有していた場合の細胞中よりも高い傾向があった（図１８Ｉ）。これらの結果は、同じ遺伝子が、その遺伝子の近隣において、より高いＡ遺伝子座のエンリッチメントおよび／またはＢ遺伝子座の脱エンリッチメントを示す細胞中でより高い転写活性を有する傾向があることを示していた。転写活性のこの増大は、転写機構の局部エンリッチメントおよび／またはサイレンシング因子の脱エンリッチメントに潜在的に起因しうる。あるいは、転写機構と会合した、活発に転写するクロマチンは、転写機構およびコファクターが凝縮物を形成しうることを考慮すると、他の活性クロマチンと相互作用するより強い傾向を有することもあり得た。これらの２つのありうるメカニズムは相互に排他的ではないが、協調的に動作して互いに強化しうることがわかった。
図１８Ｇは、測定された遺伝子の転写バーストと一緒に示される単一コピーのＣｈｒ２１の３Ｄレンダリングを示す。球は、この染色体における全ての検出された新生ＲＮＡバーストを表す。スケールバーは５００ｎｍである。
図１８Ｈは、活発に発火している状態と、発火していない状態との間のイメージングされた遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）でのＡ／Ｂ密度比の変化（対数差で測定される）を示す。各遺伝子について、遺伝子が発火している染色体およびそれが発火していない染色体中のそのＴＳＳで、Ａ／Ｂ密度比中央値を計算する。Ｃｈｒ２１上でイメージングされた８４個の遺伝子に関するこれらの値の対数差を、そのＡ／Ｂ密度比中央値の変化の規模に従って順位付ける。イメージングされた遺伝子の７９％が、発火していない場合と比較して、それらが活発に発火している場合にＡ／Ｂ密度比の増加を示した。
図１８Ｉは、遺伝子のＴＳＳの局部環境が低い（下位四分の一）Ａ／Ｂ密度比から高い（上位四分の一）Ａ／Ｂ密度比へと変化する時の、イメージングされた遺伝子の発火率の変化（対数差として測定される）を示す。Ｃｈｒ２１上のイメージングされた８４個の遺伝子に関する発火率の対数差を、発火率の規模に従って順位付ける。イメージングされた遺伝子の７９％は、そのＴＳＳが、Ａ／Ｂ密度比の、下位四分の一と比較して、上位四分の一にある場合、より高い発火率を示した。
図２６Ａ～２６Ｊは、ＲＮＡおよびＤＮＡ ＦＩＳＨプローブクロストークに関する測定を示す。図２６Ａは、例示的な細胞と、ＤＡＰＩによってマーキングされたその核（上）および遺伝子（ＢＲＷＤ１）の新生ＲＮＡを標的とするＦＩＳＨプローブの蛍光シグナル（下）を示す。
図２６Ｂは、図２６Ａと同じであるが、異なる遺伝子（ＳＣＡＦ４）に関するものである。図２６Ａおよび図２６Ｂの染色は、実施例１９の「細胞培養物の調製および一次／符号化プローブハイブリダイゼーション」の節に記載されるＲＮＡ ＦＩＳＨプロトコールに記載されるプロトコールに従う。
図２６Ｃおよび図２６Ｄは、ＲＮＡ ＦＩＳＨプロトコールを、追加のＲＮａｓｅ処理工程を含むように改変して、ＦＩＳＨプローブの添加前に細胞ＲＮＡを除去したことを除いて、それぞれ、図２６Ａおよび図２６Ｂと同じである。図２６Ｃおよび図２６Ｄにおける細胞を、図２６Ａおよび図２６Ｂと同様の照射条件下でイメージングしたが、その蛍光シグナルを、図２６Ａおよび図２６Ｂと同じコントラストで表示する。
図２６Ｅは、５つの測定された遺伝子にわたる未処理の細胞およびＲＮａｓｅ処理された細胞に関する３を超えるシグナルノイズ比を有する細胞あたりのスポット数を示す。
図２６Ｆは、例示的な細胞と、ＤＡＰＩによってマーキングされたその核（上）およびゲノム遺伝子座（ｃｈｒ２１：１５．２Ｍｂ－１５．２５Ｍｂ）を標的とするプローブの蛍光シグナル（下）を示す。
図２６Ｇは、図２６Ｆと同じであるが、異なる遺伝子座（ｃｈｒ２１：１４．９５Ｍｂ－１５Ｍｂ）に関するものである。図２６Ｆおよび図２６Ｇの染色は、実施例１９の「細胞培養物の調製および一次／符号化プローブハイブリダイゼーション」の節に記載されるＤＮＡ ＦＩＳＨプロトコールに記載されるプロトコールに従う。
図２６Ｈおよび図２６Ｉは、ＤＮＡ ＦＩＳＨプロトコールを、熱変性工程を省略し、したがって、接近可能なゲノムＤＮＡ部位を除去するように改変したことを除いて、それぞれ、図２６Ｆおよび図２６Ｇと同じである。図２６Ｈおよび図２６Ｉにおける細胞を、図２６Ｆおよび図２６Ｇと同様の照射条件下でイメージングし、その蛍光シグナルを、図２６Ｈおよび図２６Ｉと同じコントラストで表示する。
図２６Ｊは、熱変性工程で処理した細胞およびこの工程を省略した細胞に関する、３を超えるシグナルノイズ比を有する細胞あたりのスポット数を示す。
［実施例１１］
単一の染色体中でのクロマチンドメインとコンパートメントとの関係。次に、単一細胞クロマチンドメイン間の相互作用およびこれらの相互作用がコンパートメント識別とどのように相関するかを精査した。Ｃｈｒ２のサイズは大きく、その中のコンパートメントの分割の数が大きいため、Ｃｈｒ２上での分析は、より多くの洞察を提供することが予想され、かくして、この染色体に焦点を合わせた。
Ｃｈ２中の単一細胞ドメインの大部分は、ＡまたはＢ遺伝子座のいずれかの全部を含む「純粋な」ドメインであったが、実質的な比率の単一細胞ドメインは、アンサンブルＡ／Ｂ境界を横断し、Ａ遺伝子座とＢ遺伝子座との両方を含んでいた（図１９Ａ～図１９Ｃ）。これらの「混合」ドメインの存在は、単一細胞中でのドメイン形成は、コンパートメント識別を決定するクロマチン特性と強く関連しないが、エピジェネティック改変の細胞間変動性が一部の単一細胞中で活性／不活性クロマチン境界のシフトを引き起こすこともありうることを示唆していた。
次に、ドメイン間相互作用がどのようにドメインのＡおよびＢ組成、ならびにドメイン間のゲノム距離に依存するかに焦点を合わせて、ドメインがどのように互いに相互作用するかを検査した。ドメインは、短いゲノム分離と長いゲノム分離との両方で接触し、そのような接触は、個々の染色体の空間距離マップにおける非対角ボックス特徴として現れた。そのような接触パターンは、実質的に細胞間で異なっていた（図１９Ｄ）。この異種性にも拘わらず、ドメイン－ドメイン相互作用は、その基礎となるクロマチンのＡ／Ｂ組成によってモジュレートされると考えられた（図１９Ｅ）：主にＢ遺伝子座を含有するドメイン間の接触頻度は、平均すると、主にＡ遺伝子座を含有するドメイン間のものよりも高く、次いで、異なるＡ／Ｂ識別のクロマチンに偏っているドメイン間の接触頻度よりも高かった。この平均写真は、Ｈｉ－Ｃによって測定されたＡ／Ｂコンパートメント化のクロマチン構造モデリングならびにイメージングによって測定されたＡおよびＢ遺伝子座の全体的配置に基づいて最近提唱されたＡおよびＢクロマチン相互作用強度のヒエラルキーと一致していた。
ゲノム距離の関数としてのドメイン接触頻度のさらなる検査は、より複雑な写真を示した。簡単にするために、単一のコンパートメント識別の遺伝子座を含有する「純粋な」Ａおよび「純粋な」Ｂドメインに焦点を合わせた。予想通り、接触頻度は、全ての組成物のドメイン対に関するゲノム距離と共に低下した（図１９Ｆ）。しかしながら、Ｂドメイン対（Ｂ－Ｂ）間の接触頻度は、より短いゲノム距離（Ｃｈｒ２について最大で約７５Ｍｂ）ではＡドメイン対（Ａ－Ａ）間のものよりも高かったが、Ａ－Ａドメインの接触は、より大きいゲノム分離ではＢ－Ｂドメインの接触よりも優位であった（図１９Ｆ）。この結果は、最近のアンサンブルＨｉ－Ｃ試験において報告されたＡ－ＡとＢ－Ｂクロマチン相互作用間のゲノム距離依存性と一致しており、単一細胞ドメイン間の優先的相互作用がどのようにこれらのアンサンブル傾向を生じうるかに関するさらなる洞察を提供した。とりわけ、比較的大きいゲノム距離では、Ｂ－Ｂドメイン接触確率は、ＡドメインとＢドメインとの間（Ａ－Ｂ）の接触確率と同様のレベルまで低下したが、Ａ－Ａドメイン接触確率は、大きいゲノム分離であってもＡ－Ｂドメイン接触確率よりも依然として高かった（図１９Ｆ）。これは、大きいゲノム距離でのＡ－Ａドメイン相互作用の明確な優位をもたらした（図１９Ｇ）。加えて、接触ドメイン対はまた、異なる程度の空間的重複を示し、一部のドメイン対は、比較的表面的な接触を示したが（図１９Ｆの差し込み図）、他の対は強力な混合を示した（図１９Ｈの差し込み図）。興味深いことに、Ａ－Ａドメイン対と比較して、Ｂ－Ｂドメインは、そのような混ざり合った小球を形成する、実質的により強い傾向を示した（図１９Ｈ）。
全体として、これらの結果は、優先的なＡ－ＡおよびＢ－Ｂドメイン相互作用が、クロマチンコンパートメントの空間的分離を生じさせること、ならびにＡ－ＡおよびＢ－Ｂドメイン相互作用の性質が異なることを示唆していた。これらの相互作用の性質における差異は、Ａ－ＡおよびＢ－Ｂ会合に関与する異なる分子的因子に起因しうる。例えば、ＨＰ１などのヘテロクロマチン因子は、Ｂ－Ｂ相互作用に関与すると考えられるが、転写活性化因子またはＢＲＤ４およびＭｅｄｉａｔｏｒなどのコアクチベーターは、活性クロマチン相互作用に関与しうる。これらの異なる分子的因子が、Ａ－ＡおよびＢ－Ｂドメイン相互作用間のゲノム距離依存性における観察された差異および混合するその傾向の原因となるかどうかは、さらなる精査を待っている。
図１９Ａ～図１９Ｈは、そのＡ／Ｂ組成およびゲノム距離へのドメイン間相互作用の依存性を示す。図１９Ａ、左は、単一細胞中のＣｈｒ２のコピーにおけるＢ遺伝子座のみを含む「純粋な」ドメインによって挟まれた、Ａ遺伝子座とＢ遺伝子座との両方を含有する「混合」クロマチンドメインの３Ｄレンダリングである。スケールバーは５００ｎｍである。右：同じ領域のペアワイズ距離マトリックスを左に示した。下のバーおよびマトリックスの左は、遺伝子座のＡおよびＢコーリングを示し、輪郭線はクロマチンドメインの境界を強調する。Ａ／Ｂコーリングは、Ｃｈｒ２のアンサンブル接近頻度マップから決定される。
図１９Ｂは、図１９Ａと同じであるが、混合ドメインの代わりに、１つが完全にＡ遺伝子座を含み、１つが完全にＢ遺伝子座を含む、２つの純粋なドメインに関するものである。
図１９Ｃは、Ｃｈｒ２中の単一細胞クロマチンドメインにおいて遺伝子座がＡ遺伝子座である比率の分布である。
図１９Ｄは、Ｃｈｒ２の２つの例示的コピーの単一細胞空間距離マトリックスである。第１および第３のパネルは、２つの全染色体に関するマトリックスを示すが、第２および最後のパネルは、それぞれ、第１および第３のパネルにおいて黄色で強調された領域に関する拡大されたマトリックスを示す。サイドバーは、アンサンブル接近頻度マップに由来するＡ／Ｂコンパートメントコーリングを示す。
図１９Ｅは、Ｃｈｒ２中の異なるＡ／Ｂ組成のドメインに関するドメイン接触確率を示す。ＸおよびＹ軸は、ドメイン内の遺伝子座がＡ遺伝子座である比率を表す（０％は純粋なＢドメインに対応し、１００％は純粋なＡドメインに対応する）。２つのドメインは、その絶縁スコアが２未満である場合、接触していると定義される。絶縁スコアの算出については、実施例１９を参照されたい。
図１９Ｆは、２つの相互作用ドメイン間のゲノム距離の関数としてプロットした、Ｃｈｒ２中での、２つの純粋なＡドメイン（Ａ－Ａ）間、２つの純粋なＢドメイン（Ｂ－Ｂ）間、および１つの純粋なＡドメインと１つの純粋なＢドメイン（Ａ－Ｂ）との間のドメイン接触確率を示す。差し込み図は、絶縁スコア＝２を有する長距離相互作用を示す例示的なドメイン対の３Ｄレンダリングを含む。スケールバーは５００ｎｍである。
図１９Ｇは、図１９Ｅと同じであるが、８０Ｍｂよりも大きいゲノム距離を有するドメイン対に関するものである。
図１９Ｈは、図１９Ｆと同じであるが、高い程度の混合を示すドメイン対（１未満の低い絶縁スコアによって定義される）に限定されたものである。差し込み図は、高い程度の混合（絶縁スコア＝１）を有する長距離相互作用を示す例示的なドメイン対の３Ｄレンダリングを含む。スケールバーは５００ｎｍである。
［実施例１２］
ゲノムスケールでのクロマチンイメージング。上記の逐次的イメージング手法により、個々の染色体中でのクロマチンの高分解能ビューを得ることが可能になった。この直線的逐次的イメージング手法は、回折限界分解と同等であるか、またはそれよりも小さいクロマチン構造をイメージングするのに非常に適している。しかしながら、イメージングされたゲノム遺伝子座の数は、この手法におけるイメージングラウンドの数と共に直線的にのみ増加した。ゲノムスケールでのクロマチンイメージングについては、多くのゲノム遺伝子座が同時に分解され、核中に局在特定されうるため、イメージングラウンドの数と共にイメージングされた遺伝子座の数のはるかにより効率的な、非線形的なスケーリングが可能であろうと推論された。
この目標を達成するために、トランスクリプトームイメージングのために以前に開発された多重化されたエラーロバストＦＩＳＨ法によって着想されたが、クロマチンのポリマー性質（すなわち、ゲノム配列中の隣接する遺伝子座が空間的に近い）と、染色体の領域的構成（すなわち、異なる染色体が別々の空間領域を占有する傾向がある）との両方を考慮することによって、クロマチンイメージングのために具体的にデザインされた大きな改変を含む、コンビナトリアルＦＩＳＨ手法を考案した。コンビナトリアルイメージングを可能とするために、それぞれのゲノム遺伝子座に、２のハミング重みを有するユニークな１００ビットの二進バーコードを割り当てた。すなわち、それぞれのバーコードは、２個の「１」ビットを含有し、９８個の「０」ビットを含有する（図２０Ａ）。これらのバーコード中のビット値（「１」または「０」）は、逐次的イメージングラウンドにわたって各遺伝子座に関するシグナルの存在または非存在を決定した。これらの１００ビットのハミング重み２のバーコードから、同じビットで同時に空間的に近いクロマチン領域をイメージングするのを回避するために、標的ゲノム遺伝子座を符号化するようにサブセットをさらに選択して、同じバーコード位置における「１」ビットを有する遺伝子座がゲノム空間中で最大に隔てられるように、バーコードの割当てを最適化した（実施例１９を参照されたい）。この戦略により、近隣のクロマチン遺伝子座に由来する重複シグナルによって引き起こされる検出エラーを最小化することができた。さらに、ありうる１００ビットの二進コードの大多数は無効であった（すなわち、いかなる標的遺伝子座にも割り当てられなかった）ため、このデザインにより、検出エラーを同定および廃棄し、測定精度をさらに改善することができた。
バーコードを、それぞれ、標的遺伝子座の１つに結合するための標的領域と、１００の予めデザインされたリードアウト配列から選択されるリードアウト配列とを含有する、符号化プローブの高多様性ライブラリーを使用して標的ゲノム遺伝子座上に物理的にインプリントした（図２０Ａ）。それぞれのリードアウト配列は、１００ビットの１つに対応し、それぞれのゲノム遺伝子座の符号化プローブセット（遺伝子座あたり約４００のプローブ）は、ただ２つの異なるリードアウト配列を含有し、その遺伝子座に割り当てられたバーコードにおいて「１」として読まれる２つのビットに対応する。符号化プローブ結合の後、クロマチン遺伝子座上にインプリントされたバーコードを、１００のリードアウト配列の１つとそれぞれ相補的な、蛍光標識されたリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーションによって検出した（図２０Ａ）。一部の場合、高分解能全染色体トレーシングについて記載されたアダプタープローブ戦略を、ここでも使用した。ハイブリダイゼーションラウンドあたり２つの異なるアダプター／リードアウトプローブを導入し、２ビットがそれぞれのハイブリダイゼーションラウンドにおいて読み出されるように、２つのカラーチャネルでイメージングした。これにより、わずか５０ラウンドのハイブリダイゼーションを用いて、約１０００のゲノム遺伝子座をイメージングし、同定することができた（図２０Ａ～図２０Ｃ）。これは、同じ数のカラーチャネルを用いた同じ数の遺伝子座の逐次的イメージングと比較して、約１０分の１のハイブリダイゼーションラウンド、かくして、１０分の１の短い実験時間を表していた。２倍体細胞中の各染色体は２つのホモログを有するため、イメージングされる遺伝子座のホモログ識別を、それぞれの核において異なる領域を占有する染色体の傾向を活用する、クラスタリングアルゴリズムを使用してさらに割り当てた。
この作業では、ＩＭＲ－９０細胞中の、２２の常染色体およびＸ染色体を均一に包含する、それぞれ約３０ｋｂのサイズの、１，０４１個のゲノム遺伝子座をイメージングのために選択した。別の要件は、それぞれの染色体が、少なくとも３０の標的遺伝子座を含有し、したがって、染色体ホモログあたりのイメージングされる遺伝子座の数が、染色体の長さに応じて、３０～８０の範囲であることであった。５つの生物学的反復にわたる約５，４００の個々の細胞中のこれらの１，０４１個のゲノム遺伝子座を、それぞれの遺伝子座について約８０％の検出効率でイメージングしたところ、それぞれの細胞中で約１７００のクロマチン遺伝子座が検出された（図２０Ｄ～図２０Ｅ）。コンビナトリアルイメージングプロセスの終わりに、小さいサブセットのゲノム遺伝子座について、一度に１つの遺伝子座を逐次的イメージングを用いて再イメージングした。コンビナトリアルイメージングによって決定された遺伝子座の位置と、逐次的イメージングによって決定された再イメージングされた位置との間の変位は、わずか約５０ｎｍであったが（図２７Ａ）、これは、コンビナトリアルイメージング手法の高い復号化精度と、イメージングの過程中の最小限の試料分解／変形との両方を示す。
クロマチン構成の集団平均ビューを得るために、イメージングされたクロマチン遺伝子座の対毎の間の空間距離をそれぞれの細胞において算出した後、全てのイメージングされた細胞にわたって遺伝子座の対毎の距離中央値と、接近頻度との両方を決定した（図２０Ｆ；図２７Ｂ）。イメージングデータから決定された同じ染色体内のクロマチン遺伝子座の対の間の接近頻度は、アンサンブルＨｉ－Ｃによって検出された接触頻度との高い相関を示し、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は０．８９であった（図２７Ｃ）。さらに、イメージングの結果は、独立した生物学的反復間で高い再現性を示した（図２７Ｄ）。
個々の細胞中でのクロマチン構成を探索することによって、染色体は、各細胞内で異なる領域を占有する傾向を有するが（図２０Ｆ～図２０Ｇ）、互いに実質的な重複も示すことがわかった（図２０Ｇ～図２０Ｈ）。これらの結果は、より早いイメージング試験からの観察と一致し、それから発展した。この観察は、高い程度のｔｒａｎｓ染色体相互作用を示唆したため、さらなる分析を、それらの探索に焦点を合わせた。
図２０Ａ～図２０Ｈは、大規模多重化コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンイメージングを示す。図２０Ａは、イメージングスキームを示す。標的ゲノム遺伝子座に、エラーロバストバーコード、例えば、２のハミング重みを有する、１００ビットの二進バーコードのサブセットを割り当てた（すなわち、１００ビットのうちの２つが「１」と読む）。バーコードを、遺伝子座を認識し、２つの異なるリードアウト配列を各遺伝子座と関連付け、遺伝子座に割り当てられたバーコード中で「１」として読まれる２つのビットに対応する符号化オリゴヌクレオチドプローブを用いてゲノム遺伝子座上にインプリントする。それぞれのビットは、リードアウト配列をユニークに割り当てられる。各遺伝子座を、合計４００の符号化プローブによって標識するが、４つのみが示される。リードアウト配列と相補的な蛍光リードアウトプローブを逐次添加し、イメージングしたところ、各遺伝子座で「１」として読まれるビットおよびしたがって、その遺伝子座のバーコード識別を決定することができる。
図２０Ｂは、単一細胞の核内での複数のイメージングラウンドからの代表画像を示す。リードアウトプローブからのクロマチン遺伝子座の蛍光シグナルおよび核マーカーとして使用される、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）のシグナルを示す。スケールバーは５マイクロメートルである。
図２０Ｃは、全てのイメージングラウンドにわたる１つのクロマチン遺伝子座を中心とする小さい領域の拡大画像（Ｂにおける白い囲み）を示す。遺伝子座の識別を、シグナルを与える２つのリードアウトプローブ（１および１３）に基づいて決定する。スケールバーは３００ｎｍである。
図２０Ｄは、それらが属する染色体に従って色分けされた、単一のＩＭＲ－９０細胞中の全ての検出されたクロマチン遺伝子座（球体）の３Ｄレンダリングである（染色体に関する指標を画像の下に示す）。ゲノム配列中の隣接する遺伝子座は、可撓性の線で接続される。約１０００個のゲノム遺伝子座をイメージングする。
図２０Ｅは、図２０Ｄと同じ細胞のクロマチン遺伝子座を示すが、示された染色体の２つのホモログを強調する。
図２０Ｆは、約５，４００個の単一細胞から計算された距離中央値マトリックスを示す。遺伝子座のそれぞれの対について、全ての細胞にわたる遺伝子座間の観察された３Ｄ空間距離の中央値が提示される。
図２０Ｇは、単一細胞中での複数の染色体領域の位置を示す例示的画像を示す。染色体は示されるように符号化され、影付きの領域は全てのイメージングされた遺伝子座の周囲の凸包を表す。明確にするために、染色体あたりただ１つのホモログが示される。
図２０Ｈは、図２０Ｇに示された同じ細胞に関する空間距離マトリックスを示す。クロマチン遺伝子座のそれぞれの対の間の空間距離が示される。染色体の順序はマトリックスの下に示される通りであり、それぞれの染色体の２つのホモログが別々に示される。
図２７Ａ～図２７Ｊは、コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのイメージング：局在特定エラー、再現性、およびＨｉ－Ｃとの比較を示す。図２７Ａは、コンビナトリアルイメージング実行において測定されたゲノム遺伝子座の局在と、コンビナトリアルイメージングを完了した後の逐次的ハイブリダイゼーションを使用して個別に再イメージングされた同じ遺伝子座のものとの変位の分布を示す。Ｃｈｒ６中の１０個のゲノム領域を、約２０００個の細胞にわたって再イメージングした。変位中央値は約５０ｎｍである。
図２７Ｂは、コンビナトリアルＦＩＳＨによってイメージングされた全部で１，０４１個のゲノム遺伝子座に関する接近頻度マトリックスを示す。遺伝子座の対の間の接近頻度を、遺伝子座間の測定距離が５００ｎｍのカットオフ距離よりも小さい発生の数を、２つの遺伝子座間の測定距離の総数で除したものとして算出した。
図２７Ｃは、５００ｋｂでビンし、標的遺伝子座を中心とする、本発明者らのイメージングデータに由来する染色体内の遺伝子座の対と、アンサンブルＨｉ－Ｃ実験に由来する接触の数との間の接近頻度に関する相関プロットを示す。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は０．９１である。ＩＭＲ９０細胞に関する利用可能なＨｉ－Ｃデータは、ｔｒａｎｓ染色体接触に関してわずかであり、本発明者らのイメージングデータと、Ｈｉ－Ｃデータとの間のｔｒａｎｓ染色体相互作用の信頼できる比較を不可能にする。
図２７Ｄは、ゲノムスケールでのイメージング実験の２つの独立した生物学的反復において観察されたクロマチン遺伝子座間のペアワイズ距離の相関を示す。反復間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数は、０．９８である。右上の雲は、ｔｒａｎｓ染色体のペアワイズ距離を表し、左下の雲は、染色体内のペアワイズ距離を表す。
［実施例１３］
ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のエンリッチメント。次に、ｔｒａｎｓ染色体相互作用がどのようにクロマチンのＡ／Ｂコンパートメント識別に依存したかを試験した。イメージングされたゲノム遺伝子座のそれぞれを、公開されたアンサンブルＨｉ－Ｃデータに基づいてコンパートメントＡおよびＢに分類した。ゲノムスケールでのイメージングデータはまた、かなり正確なＡ／Ｂコンパートメントコーリングを可能にし、Ｈｉ－Ｃデータに基づくコーリングと約８０％一致していたが（図２７Ｅ）、アンサンブルＨｉ－Ｃデータのゲノム分解能がより高いため、イメージングされた遺伝子座のＡ／Ｂコンパートメント識別を分類するために、Ｈｉ－Ｃコーリングを使用した。３８％のイメージングされた遺伝子座がコンパートメントＡに属していたが、６２％がコンパートメントＢに属していた。ｔｒａｎｓ染色体相互作用の程度が活性および不活性クロマチンについて異なるかどうかを検査するために、ｔｒａｎｓ染色体接近頻度マトリックス中のゲノム遺伝子座を再配置し、全てのＡ遺伝子座を互いに隣に置き、次いで、全てのＢ遺伝子座を置いた。このマトリックスは、コンパートメントＡ遺伝子座が、個々のコンパートメントＢ遺伝子座よりも、別のコンパートメントＡ遺伝子座とｔｒａｎｓ染色体的に相互作用する傾向が平均してより強いことを示し（図２１Ａ～図２１Ｂ）、活性クロマチン間のｔｒａｎｓ染色体相互作用の以前の観察と一致していた。対照的に、コンパートメントＢ遺伝子座は、コンパートメントＡ遺伝子座に対してよりも、互いに対して、同等か、またはより低いｔｒａｎｓ染色体親和性を示した（図２１Ａ～図２１Ｂ）。換言すれば、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用は、Ａ－Ｂ相互作用よりも実質的に強い傾向で現れ、次いで、Ｂ－Ｂ相互作用よりもわずかに強い傾向で現れた。接近頻度マップを構築するために使用される様々なカットオフ距離についても同様の傾向が観察されたが、但し、十分な数の細胞が分析に含まれていた（図２７Ｆ～図２７Ｈ）。とりわけ、これは、同じ染色体内でのｃｉｓ相互作用に関する全体的なヒエラルキーとは著しく対照的であり、Ｂ－Ｂ相互作用は、Ａ－Ａ相互作用よりも形成される傾向がより強く、次いで、Ａ－Ｂ相互作用よりも形成される傾向がより強かった（図１９Ｅ）。しかしながら、興味深いことに、ｔｒａｎｓ染色体相互作用に関する観察された傾向（Ａ－Ａ＞Ａ－Ｂ≒Ｂ－Ｂ）は、高分解能のＣｈｒ２データにおいて大きいゲノム距離でｃｉｓ染色体相互作用について観察されたものと同様であった（図１９Ｆ～図１９Ｇ）。この傾向はまた、全てのイメージングされた染色体にわたって合計された、ゲノムスケールでのデータにおける長距離ｃｉｓ染色体相互作用についても観察された（図２１Ｃ）。
次に、単一細胞レベルでのｔｒａｎｓ染色体相互作用と、クロマチンコンパートメント識別との関係を検査した。個々の細胞中で、ＡおよびＢ遺伝子座は、異なる空間分布を採用し、Ａ遺伝子座は、予想通り、核においてＢ遺伝子座よりも中心に局在する傾向を示した（図２１Ｄ；図２８）。クロマチン相互作用をｔｒａｎｓにさらに特徴付けるために、ｔｒａｎｓ染色体相互作用のみをここで考慮したことを除いて、以前に提示されたものと同様の密度ベースの手法を、高分解能全染色体トレーシングのために採用した。略述すると、それぞれの染色体中のそれぞれのイメージングされた遺伝子座について、同じ細胞中の他の全ての染色体に由来するＡ遺伝子座およびＢ遺伝子座の局部密度を算出し、これらの２つの密度の比を決定した（本明細書では以後、ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比と称する）（図２１Ｄ～図２１Ｅ）。この量は、遺伝子座の近くでのｔｒａｎｓ染色体活性クロマチンの局部エンリッチメントの尺度を提供した。大部分（６２％）のイメージングされた遺伝子座は、コンパートメントＢに属し、Ａ／Ｂ比に関する全体的な偏りは、１よりも小さいことがわかった。この偏りについて制御するために、Ａ遺伝子座およびＢ遺伝子座について観察されたｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の分布を、ＡおよびＢ遺伝子座の数を未変化のまま保持しながら、イメージングされた遺伝子座のＡおよびＢ識別がイメージングされた遺伝子座間で無作為にシャッフルされる無作為化対照において得られた分布と比較した。とりわけ、Ａ遺伝子座について観察されたｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比は、Ｂ遺伝子座について観察された値よりも実質的に高く、次いで、無作為化対照に由来する値よりも高かった（図２１Ｅ）。これらの単一細胞分析はさらに、ｔｒａｎｓ染色体相互作用が活性クロマチン間の相互作用について優先的に強化されるという見解を支持した。
ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のエンリッチメントが転写を必要するかどうかをさらに問うた。これに対処するために、アルファ－アマニチン処理によって転写を阻害したところ、この処理がｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用についてのエンリッチメントの実質的な低減をもたらさないことが見出された（図２９Ａ～図２９Ｃ）。この観察は以前の試験と一致し、それから発展し、活性化されたベータグロビン遺伝子座と、他の活性クロマチン遺伝子座との長距離およびｔｒａｎｓ染色体相互作用が転写阻害によって阻害されないことを示していた。
図２１Ａ～図２１Ｅは、ｔｒａｎｓ染色体相互作用における活性－活性クロマチン相互作用のエンリッチメントを示す。図２１Ａは、正規化されたｔｒａｎｓ染色体接近頻度マトリックスを示す。それぞれのｔｒａｎｓ染色体遺伝子座対（異なる染色体上の遺伝子座対）の間の接近頻度を示し、その距離が５００ｎｍのカットオフ距離よりも小さい場合、遺伝子座対は接近していると考えられる。コンパートメントＡの遺伝子座が最初に出現し、次いで、コンパートメントＢの遺伝子座が出現するように遺伝子座を並べ替え、したがって、左上のブロックは、Ａ遺伝子座の対の間の相互作用を表し、右下はＢ遺伝子座の対の間の相互作用を表す。マトリックス中のそれぞれのエントリーを、染色体の対の間の相互作用の変化する基本レベルを構成する染色体の同じ対を起源とする全ての遺伝子座対の接近頻度中央値によって正規化する。
図２１Ｂは、図２１Ａに示されたマトリックスに由来する、Ａ遺伝子座の対（Ａ－Ａ；ｎ＝７２，７７１の遺伝子座対）、Ｂ遺伝子座の対（Ｂ－Ｂ；ｎ＝１９３，７５３の遺伝子座対）、および１つのＡと１つのＢ遺伝子座を含む対（Ａ－Ｂ；ｎ＝２３７，９８６の遺伝子座対）に関するｔｒａｎｓ染色体接近頻度の分布を示す。分布は、ヒストグラムとして上パネルに表され、箱ひげ図として下パネルに表され、中央値（中心線）、２５～７５パーセンタイル（囲み）および５～９５パーセンタイル（ひげ）を示す。
図２１Ｃは、全染色体にわたって同じゲノム距離によって分離された遺伝子座の対について平均化された、そのゲノム距離の関数としての同じ染色体内のクロマチン遺伝子座の対の間の接近頻度中央値を示す。接触頻度中央値を、Ａ遺伝子座の対（Ａ－Ａ）、Ｂ遺伝子座の対（Ｂ－Ｂ）およびＡ遺伝子座とＢ遺伝子座との混合対（Ａ－Ｂ）について示す。
図２１Ｄは、２個の単一細胞中でのコンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座の分布を示す。左パネルは、単一の核における単一のｚ平面内の全ての検出された遺伝子座の位置を、コンパートメントＡ遺伝子座およびコンパートメントＢ遺伝子座と共に表す。右パネルにおいて、それぞれの遺伝子座の影は、右に示されるスケールバーに従う、ｔｒａｎｓ染色体ＡおよびＢ遺伝子座の局部密度の比、すなわち、ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を表す。
図２１Ｅは、イメージングされたゲノム遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の分布を示す。それぞれの遺伝子座について、全細胞にわたるｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比中央値を決定したが、Ａ遺伝子座についてのｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を示し（ｎ＝３８２の遺伝子座）、Ｂ遺伝子座についてのものを示す（ｎ＝６２３の遺伝子座）。１０４１のイメージングされた遺伝子座のうちの３６は、この試験において使用された異なるバージョンのゲノムアセンブリーおよびコンパートメントコーリングのために使用されたＨｉ－Ｃデータセットのため、Ａ／Ｂ識別を割り当てられなかった。暗灰色のヒストグラムは、Ａ遺伝子座の総数およびＢ遺伝子座の総数を未変化のまま保持しながら、ＡおよびＢコンパートメントの識別が無作為にシャッフルされる無作為化対照を表す。
図２７Ｅは、Ａ／Ｂコンパートメント割当てが、それぞれのヒト常染色体に関するゲノムスケールでのイメージングデータと、Ｈｉ－Ｃデータとの間で一致する遺伝子座のパーセンテージに関する棒グラフである。平均で、それぞれの染色体中の約８１％の遺伝子座が、本発明者らのイメージングデータと、Ｈｉ－Ｃデータとの間のＡ／Ｂ割当てにおいて一致を示した。
図２７Ｆは、接近性を評価するために使用されるカットオフ距離の関数としての、正規化されたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ、Ａ－Ｂ、およびＢ－Ｂ接近頻度中央値（図２１Ａおよび図２１Ｂと同様に定義される）を示す。正規化された接近性は、約５，４００個のＩＭＲ－９０細胞から算出される。また、図２７Ａに示されるような、推定局在測定エラーと同等の、５０ｎｍの標準偏差を有する３Ｄガウスノイズ項を用いて遺伝子座の位置を乱した後の正規化されたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ、Ａ－Ｂ、およびＢ－Ｂ接近頻度中央値も示される。
図２７Ｇは、図２７Ｆと同じであるが、アルファ－アマニチン処理された細胞に由来する追加データを未処理の細胞と共にプールする場合のものである（合計約９，５００個の細胞について）。アルファ－アマニチン処理された細胞は、Ａ－ＢおよびＢ－Ｂ接近頻度を超えるｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａの、未処理の細胞と類似するエンリッチメントを示した（図２９Ａ、図２９Ｂ）。このプール化の結果は、図２７Ｆにおけるより低いカットオフ距離で観察されたＡ－Ａ相互作用に関するより低いエンリッチメントが、おそらく、より少ない細胞数についてのより乏しい統計量の結果であることを示唆する。
図２７Ｈは、分析に含まれた細胞数の関数としての、正規化されたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ、Ａ－Ｂ、およびＢ－Ｂ接近頻度中央値を示す。細胞を、イメージングされた約５，４００個の未処理のＩＭＲ－９０細胞から無作為にサブサンプリングし、接近カットオフ距離を５００ｎｍに固定した。
図２９Ａ～図２９Ｆは、ｔｒａｎｓ染色体クロマチン相互作用に対する転写阻害の効果およびクロマチン遺伝子座の核内構造体会合率を示す。図２９Ａは、図２１Ａと同様、正規化されたｔｒａｎｓ染色体接近頻度マトリックスを示すが、転写を阻害するためにアルファ－アマニチンで処理した細胞に関するものである。
図２９Ｂは、図２１Ｂと同様、箱ひげ図として示される正規化されたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ、Ｂ－ＢおよびＡ－Ｂ接近頻度の分布を示すが、アルファ－アマニチンで処理した細胞に関するものである。比較のために、図２１Ｂに由来する未処理の細胞に関する正規化されたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ、Ｂ－ＢおよびＡ－Ｂ接近頻度がここで再現される。
図２９Ｃは、図２１Ｅと同様、イメージングされたＡおよびＢ遺伝子座にわたる局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の分布を示すが、アルファ－アマニチンで処理した細胞に関するものである。ヒストグラムは、Ａ遺伝子座の総数およびＢ遺伝子座の総数を未変化のまま保持しながら、ＡおよびＢコンパートメントの識別が無作為にシャッフルされる無作為化対照を表す。
［実施例１４］
クロマチン、新生ＲＮＡおよび核構造の多モードイメージング。クロマチンの３Ｄ構成をその機能的活性および他の核構造の文脈に置くために、コンビナトリアルイメージング法を拡大して、イメージングされたゲノム遺伝子座の転写活性、ならびに単一細胞中での核ランドマークと共に、クロマチン構成の同時的測定を可能にした。具体的には、上記の１，０４１個のゲノム遺伝子座を、これらの遺伝子座に位置する１，１３７個の遺伝子のそれぞれから転写される新生ＲＮＡと一緒に、また、核スペックルおよび核小体を含む重要な核構造と同時にイメージングした（図２２Ａ）。
同じ細胞内でのＤＮＡ、ＲＮＡおよび核構造のイメージングを可能にするために、クロマチンについての上記のものと類似するコンビナトリアルイメージング戦略を採用することによって、１，１３７個の遺伝子のイントロンＲＮＡの多重化イメージングを実施した（図２２Ａ）。全ての遺伝子がそれぞれ個々の細胞中で転写されないこと、したがって、転写焦点の密度がクロマチン遺伝子座のものと同じ高さになるはずなないことを考慮して、ＲＮＡを５４ビットのハミング重み２コードで符号化し、クロマチンイメージングのためのバーコードを選択して、同じビット中の空間的に近い遺伝子をイメージングする機会を最小化する方法と同様の方法で、遺伝子を符号化する、１，１３７のありうるバーコードを選択した。ＲＮＡイメージングが完了した後、ＲＮＡ転写物を酵素的に消化し（単一モードクロマチンイメージング実験においても実行される工程）、多重化ＤＮＡ ＦＩＳＨを上記のように実施して、１，０４１個のゲノム遺伝子座をイメージングした（図２２Ａ）。ゲノム遺伝子座および新生ＲＮＡ転写物の復号化を、それらが存在するゲノム遺伝子座と共局在する転写物に関する追加の制約の下、概ね独立に実施した（実施例１９を参照されたい）。この手順はさらに、ＲＮＡ転写物に関する検出精度を改善し、それぞれのゲノム遺伝子座での転写バーストの検出効率（約９０％）の推定を可能にした（実施例１９を参照されたい）。最後に、核スペックルおよび核小体を、これらの構造の公知の分子成分に対する免疫蛍光を使用してイメージングした（図２２Ａ）。核スペックルおよび核小体に関する蛍光シグナルは、免疫蛍光染色をＤＮＡ ＦＩＳＨ後に実施した場合であっても、高いシグナルノイズ比（２５を超える）を示した。核ラミナの位置を、全てのイメージングされたゲノム遺伝子座を包含する凸包表面を計算することによって推定した。同時に、これらの多モード測定は、３Ｄゲノム構造、転写活性および核構成の統合された単一細胞ビューを可能にした（図２２Ｂ）。これらの多モードイメージング実験を、２回の生物学的反復において、約３７００個の個々の細胞上で実施した。これらの多モード実験からのクロマチンイメージングデータも、３Ｄゲノム構成分析のために上記の５回反復および約５，４００個の細胞に含有させた。
これらの多モード実験の新生ＲＮＡ転写物測定から、遺伝子を活発に転写する細胞の比率としての転写バースト頻度（図２２Ｃ）と、ＲＮＡイントロンシグナルの明るさに由来するバーストサイズ中央値（図２２Ｄ）との両方を、それぞれの遺伝子について定量した。これらの尺度は、反復実験にわたって高い相関を示した（図２７Ｉ～図２７Ｊ）。バースト頻度は、二様式の挙動を示し、高いバースト頻度の遺伝子は、主にコンパートメントＡに存在し、低いバースト頻度の遺伝子は両方のコンパートメントに存在していた（図２２Ｃ）。さらに、２５０ｎｍの空間距離カットオフを使用して、特定のクロマチン遺伝子座が核内構造体と会合するかどうかを推定したところ、Ｂ遺伝子座と核ラミナとの会合頻度がより高く（図２２Ｅ）、Ａ遺伝子座と核スペックルとの会合頻度がより高いことが観察された（図２２Ｆ）。これらの結果は、それぞれ、ラミナおよび核スペックルとの、不活性および活性クロマチンの優先的会合の以前の観察と一致していた。個々の遺伝子座について、その局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比中央値は、ラミナ会合頻度との負の相関を示し（図２２Ｇ）、核スペックル会合頻度との正の相関を示した（図２２Ｈ）。核小体はさらに、以前に示されたように、セントロメア、ある特定の染色体のテロメア、およびリボソームをコードする遺伝子を含有する染色体との優先的会合を示した（図２２Ｉ）。これらの生物学的結果は、多モード測定に対するさらなる正当性を提供した。
とりわけ、多くのイメージングされた遺伝子座について、ラミナ会合はより低い転写活性と相関したが、核スペックル会合はより高い転写活性と相関した（図２２Ｊ）。これらの結果は、最近の単一細胞シーケンシング試験と一致したが、ラミナ会合が単一細胞中での遺伝子発現と負に相関することを示している。さらに、転写阻害剤であるアルファ－アマニチンを用いた処理は、イメージングされた遺伝子座の、核スペックルを乱し、核スペックル会合率を低下させ、ラミナ会合率を増大させることが観察された（図２９Ｄ～図２９Ｆ）。まとめると、これらの結果は、転写活性化または阻害時の単一の、またはいくつかのゲノム遺伝子座の核再配置に関する以前のイメージング試験から発展し、転写活性と、核構造との相互作用との関係のゲノムスケールでのビューを提供した。
図２２Ａ～図２２Ｊは、核構造の文脈におけるクロマチンおよび転写活性の多モードのゲノムスケールのイメージングを示す。図２２Ａ、上：核構造および機能的活性の文脈におけるクロマチン構成の統合ビューを生成するためのクロマチン（左パネル）、新生ＲＮＡ転写物（中央パネル）および核内構造体（右パネル）のイメージングを組み合わせる多モードイメージングスキームの図である。約１０００個のゲノム遺伝子座、標的遺伝子座中の約１１００個の遺伝子の新生ＲＮＡ転写物、および２つの型の核内構造体（核スペックルおよび核小体）がイメージングされる。下：それぞれのイメージングモダリティーに関する代表的な生画像－複数のイメージングラウンドにわたるクロマチン遺伝子座（左）、複数のイメージングラウンドにわたる新生ＲＮＡ転写物（中央）および核内構造体（右：抗ＳＣ３５抗体を使用してイメージングされた核スペックル；および抗フィブリラリン抗体を使用してイメージングされた核小体）。スケールバーは５マイクロメートルである。
図２２Ｂは、単一細胞中でのクロマチン遺伝子座、転写バーストおよび核内構造体の３Ｄレンダリングである。左：染色体によって符号化された、全ての検出されたクロマチン遺伝子座（以下に示される染色体指数に基づく）。中央：全ての検出されたイントロンＲＮＡは色付きの球体として示され、影は、イメージングされた遺伝子の識別を示し、球体のサイズは転写バーストのサイズを表す。右：検出された核内構造体の体積充填表示。核ラミナは、全ての検出されたクロマチン遺伝子座の周囲の凸包の表面として同定される（影付きの灰色の領域）。
図２２Ｃおよび図２２Ｄは、イメージングされたコンパートメントＡ遺伝子座（ｎ＝５５８個の遺伝子）およびコンパートメントＢ遺伝子座（ｎ＝５６９個の遺伝子）中に存在する遺伝子に関する、転写バースト頻度の分布（図２２Ｃ）およびバーストサイズ（図２２Ｄ）を示す。
図２２Ｅおよび図２２Ｆは、Ａ遺伝子座（ｎ＝３８２の遺伝子座）およびＢ遺伝子座（ｎ＝６２３の遺伝子座）と、核ラミナ（図２２Ｅ）および核スペックル（図２２Ｆ）との会合率の分布を示す。クロマチン遺伝子座は、核周縁部または最も近いスペックルまでの遺伝子座の距離が２５０ｎｍ未満である場合、核ラミナまたは核スペックルと会合していると考えられる。
図２２Ｇおよび図２２Ｈは、遺伝子座が核ラミナ（図２２Ｇ、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数＝－０．８７）および核スペックル（図２２Ｈ、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数＝０．６６）と会合していると見出される頻度の関数としての、それぞれのイメージングされたゲノム遺伝子座の局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の散布図を示す。示されるｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の値は、全てのイメージングされた細胞にわたる中央値である。
図２２Ｉは、ゲノム位置によって順序付けられた、全てのイメージングされたゲノム遺伝子座に関する核小体との会合頻度を示す。黒色の縦の線は、セントロメアの位置であり、括弧はリボソームをコードする遺伝子（ｒＤＮＡ）を含有する染色体を強調する。
図２２Ｊは、転写と、核構造会合との相関を示す。丸は、遺伝子座がラミナと会合する／ラミナと会合しない（左）と、スペックルと会合する／スペックルと会合しない（右）との細胞の集団を比較する場合の個々のゲノム遺伝子座に関する転写バースト頻度の倍数変化である。点線は、変化なしを強調し、実線は、それぞれの場合における倍数変化中央値を表す。
図２７Ｉおよび図２７Ｊは、それぞれの遺伝子のバースト頻度（図２７Ｉ）およびバーストサイズ（図２７Ｊ）に関するＲＮＡイメージングの反復間の相関を示す。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、それぞれ、０．９４および０．８１である。
図２９Ｄおよび図２９Ｅは、未処理の細胞（図２９Ｄ）およびアルファ－アマニチンで処理された細胞（図２９Ｅ）について示される、クロマチン遺伝子座、核小体、および核スペックルがイメージングされた個々の核の代表画像を示す。
図２９Ｆは、アルファ－アマニチン処理時のそれぞれの遺伝子座と、ラミナ（左）および核スペックル（右）との会合の率の倍数変化を示す。それぞれのゲノム遺伝子座に関するデータ点を丸で示し、実線はそれぞれの場合における全ての遺伝子座の倍数変化中央値であり、点線は変化なしを表す。核体積および核スペックルのサイズおよび数はまた、アルファ－アマニチンを用いた処理時に変化し、これらのものは核内構造体会合の変化に部分的に寄与しうることがわかる。
［実施例１５］
種々の核内容物におけるｔｒａｎｓ染色体相互作用の検査。同じ細胞中でのクロマチン構成とランドマーク核構造との同時的イメージングにより、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用に関する観察されるエンリッチメントがどのように核内容物に依存するかの検査がさらに可能になった。核スペックルは活発に転写される遺伝子座に集中する最も顕著な核内構造体の１つであるため、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用に関する観察されたエンリッチメントが、単に核スペックルでのこの局部的収集の結果であるのかどうかを推測した。この疑問に対処するために、分析を、核スペックルと会合していない遺伝子座に限定した。すなわち、それぞれの遺伝子座対について、いずれの遺伝子座も核スペックルと会合していない細胞のみを考慮した。興味深いことに、同じ傾向は、この制約の下でのＡ－ＢおよびＢ－Ｂ相互作用を超えたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のエンリッチメントについてさらに観察されたが（図３０Ａ～図３０Ｂ）、核スペックルとの会合が、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用の観察されたエンリッチメントを説明するには不十分なものであったことを示している。
次に、局部集中効果に起因する相対的に取るに足りないシナリオを考慮した：コンパートメントＡ遺伝子座は、ラミナから枯渇し、核の内部領域により集中していたため（図２８Ａ～図２８Ｂ）、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のエンリッチメントが単に、核内部におけるコンパートメントＡクロマチンの局部エンリッチメントによって引き起こされるかどうかを推測した。これを試験するために、両方の遺伝子座が核ラミナと会合していた細胞のみを、それぞれの遺伝子座対について考慮した。とりわけ、Ａ－ＢおよびＢ－Ｂ相互作用を超えたｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のエンリッチメントは、ラミナが不活性のコンパートメントＢのクロマチンについて強化された環境であるという事実にも拘わらず、これらのラミナと会合した遺伝子座についても観察された（図３０Ｃ～図３０Ｄ）。
全体として、これらの結果は、活性クロマチン間の観察されたｔｒａｎｓ染色体相互作用に関する取るに足りないものではない分子メカニズムを示唆していた。以前に記載した通り、Ａ－ＢおよびＢ－Ｂ相互作用を超えたＡ－Ａに関するエンリッチメントはまた、大きいゲノム距離でのｃｉｓ染色体相互作用についても観察された（図１９Ｆ～図１９Ｇおよび図２１Ｃ）。長距離ｃｉｓＡ－Ａ相互作用は、ｔｒａｎｓ染色体Ａ－Ａ相互作用のものと共通の基礎となるメカニズムを有することがありうる。どの分子的因子がこれらの活性クロマチン相互作用を生じさせるかは、依然として未解決の問題である。
図２８Ａ～図２８Ｂは、コンパートメントＡおよびコンパートメントＢの遺伝子座が、核において異なる空間分布を示すことを示す。図２８Ａにおいて、左パネルは、単一細胞の単一のｚ平面におけるＡ遺伝子座およびＢ遺伝子座を示す例示的画像を示す。右パネルは、これらの単一細胞中でのＡ遺伝子座およびＢ遺伝子座に関する核周縁部までの距離の分布を示す。核周縁部は、全ての検出されたクロマチン遺伝子座の周囲の凸包として同定される。
図２８Ｂは、Ａ遺伝子座（ｎ＝３８２）およびＢ遺伝子座（ｎ＝６２３）に関する核周縁部までの距離のｐ平均分布を示す。
図３０Ａ～図３０Ｄは、異なる核環境におけるｔｒａｎｓ染色体活性クロマチン相互作用のエンリッチメントを示す。図３０Ａは、図２１Ａと同様、正規化されたｔｒａｎｓ染色体接近頻度マトリックスを示すが、核スペックルと会合していない遺伝子座のみを考慮したものである。それぞれの遺伝子座対について、いずれの遺伝子座も核スペックルと会合していない細胞のみが考慮される。
図３０Ｂは、図２１ ５Ｂと同様、Ａ遺伝子座の対（Ａ－Ａ）、Ｂ遺伝子座の対（Ｂ－Ｂ）、および１つのＡ遺伝子座と１つのＢ遺伝子座とを含む対（Ａ－Ｂ）に関するｔｒａｎｓ染色体接近頻度を示すが、いずれの遺伝子も核スペックルと会合していない細胞のみを考慮したものである。
図３０Ｃは、図３０Ａと同じであるが、ラミナと会合した遺伝子座の対に関するものである。それぞれの遺伝子座対について、両方の遺伝子座が核ラミナと会合している細胞のみが考慮される。
図３０Ｄは、図３０Ｂと同じであるが、ラミナと会合した遺伝子座の対に関するものである。それぞれの遺伝子座対について、両方の遺伝子座が核ラミナと会合している細胞のみが考慮される。
［実施例１６］
ｔｒａｎｓ染色体相互作用と、転写活性との相関。次に、これらの多モード単一細胞測定を使用して、個々のクロマチン遺伝子座の転写活性と、ｔｒａｎｓ染色体寄与によって定義されるその局部クロマチン環境との関係を特徴付けた。この目的のために、ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を算出し、この量の中央値を、２つの細胞集団：（ｉ）検討中の遺伝子座が転写活性を示した細胞、および（ｉｉ）遺伝子座が転写的にサイレントに見える細胞について決定した（それぞれのゲノム遺伝子座について独立に決定した）（図２３Ａ）。とりわけ、遺伝子座が活発に転写された場合、より高いｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比に関する一貫した傾向が観察された：８６％のイメージングされた遺伝子座が、サイレント状態と比較して、活発に転写している状態にある場合、より高いｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を示した（図２３Ｂ）；同様に、８９％の遺伝子座が、より高いｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を有する場合、より高い転写発火率を示した（図２３Ｃ）。転写活性と、局部コンパートメントＡクロマチンエンリッチメントとのこの正の相関は、相関がスペックルと会合した遺伝子座についてより弱かったが、核スペックルと会合した遺伝子座、核ラミナと会合した遺伝子座、および核スペックルまたはラミナのいずれかと会合していない遺伝子座の場合を含む、複数の異なる核環境にわたって観察された（図２３Ｄ）。
これらの観察は、染色体内での転写活性と、ｃｉｓ Ａ／Ｂ密度比との関係に関する上記の結果から発展し（図１８Ｇ～図１８Ｉ）、同時に、その局部環境における遺伝子の転写活性と、活性クロマチンのエンリッチメントとの幅広い正の相関を示した。
図２３Ａ～図２３Ｄは、ｔｒａｎｓ染色体活性クロマチンの転写活性と局部エンリッチメントとの相関を示す。図２３Ａは、クロマチン遺伝子座および転写活性の単一細胞画像を示す。左：単一の核に由来する単一のｚ平面における全てのイメージングされたＡおよびＢ遺伝子座の位置。中央：スケールバーに基づいて符号化された、同じ遺伝子座に関する局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比。右：中央パネルと同じであり、検出された転写バーストを重ね合わせ、丸印として示した。スケールバーは３マイクロメートルである。
図２３Ｂは、活発に発火している状態と、発火していない状態との間のそれぞれのイメージングされた遺伝子座のｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の変化（対数差で測定される）を示す。少なくとも１つのイメージングされた遺伝子を含有するそれぞれのゲノム遺伝子座について、ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を、ゲノム遺伝子座が活発に転写される細胞（転写と指定される）およびそれが転写されない細胞（サイレントと指定される）について算出した。それぞれのイメージングされた遺伝子座のこれらの値の中央値の対数差を、変化の規模に従って順位付けた。イメージングされた遺伝子の８６％が、発火していない場合と比較して、それらが活発に発火している場合にＡ／Ｂ密度比の増加を示した。
図２３Ｃは、遺伝子を有する遺伝子座でのｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比が、低いもの（下位四分の一）および高いもの（上位四分の一）から変化する細胞間の、イメージングされた遺伝子の発火率の変化（対数差で測定される）を示す。イメージングされた全ての遺伝子に関する発火率の対数差を、発火率の規模に従って順位付けた。イメージングされた遺伝子の８９％は、それらが存在する遺伝子座が、ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の、下位四分の一と比較して、上位四分の一にある場合、より高い発火率を示した。
図２３Ｄは、核内構造体会合状態に関して条件付けた、イメージングされた遺伝子含有遺伝子座に関する転写状態とサイレント状態との間の局部ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比の倍数変化を示すスウォームプロットを示す。それぞれのゲノム遺伝子座について、それぞれ、左から右に向かって、全ての細胞、遺伝子座が核スペックルと会合している細胞のみ、遺伝子座がラミナと会合している細胞のみ、および遺伝子座が核スペックルとも、ラミナとも会合していない細胞のみ（空の丸印）を考慮して、遺伝子座の転写状態と、サイレント状態とのｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比における倍数変化を計算した。それぞれの状態（転写またはサイレント）におけるｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比中央値を、それぞれの遺伝子座およびそれぞれの会合状態について決定し、２つの状態の間の倍数変化のｌｏｇ２を示す。いずれの場合も、点線は、変化なしを表し、実線は、全ての遺伝子座にわたる倍数変化中央値を表す。一部の外れ値を省略して、倍数変化中央値の明確な視覚化を可能にした（スペックル会合データについては提示されるスケールの上の５個の遺伝子座および下の９個の遺伝子座、ラミナ会合データについては上の３７個の遺伝子座および下の１７個の遺伝子座ならびに非ラミナ会合および非スペックル会合データについては上の１個の遺伝子および下の２個の遺伝子）。
［実施例１７］
染色体ワイドおよびゲノムスケールでのクロマチンイメージング。単一細胞中での複数の規模のゲノム構成にわたってクロマチンの３Ｄコンフォメーションを決定するための大規模多重化クロマチンイメージングが、本明細書で報告される。数千個の個々の細胞中で１０００個を超えるゲノム遺伝子座をイメージングする能力が証明された。さらに、この手法によって、クロマチントレーシングと、新生転写物および核構造イメージングとを組み合わせることによって、３Ｄクロマチン構成を、その天然の機能的および構造的文脈に置くことが可能になり、１０００個を超えるゲノム遺伝子座、これらの遺伝子座に存在する１０００個を超える遺伝子の転写活性、ならびに核スペックルおよび核小体を含むランドマーク核構造を同時にイメージングする能力が証明された。
具体的には、高効率クロマチントレーシングのための２つの補完的戦略が証明された。第１に、逐次的ハイブリダイゼーションに基づく以前に報告された多重化ＦＩＳＨ技法の能力が拡大され、数百ラウンドのハイブリダイゼーションおよび多色イメージングを用いた数百個のゲノム遺伝子座のイメージングが示された。この手法の能力は、全染色体のコンフォメーションの高分解能ビュー、ならびにクロマチンドメイン、コンパートメントおよび単一細胞中での転写とクロマチン構成との関係の体系的特徴付けを提供することによって証明された。第２に、回折限界分解能よりも実質的に大きい、したがって、それぞれのイメージングラウンドにおいて多くの遺伝子座を分解することができる空間に広がる構造について、イメージングラウンドの数と共にイメージングされた遺伝子座の数のはるかにより迅速な、非直線的な増加を可能にするクロマチンイメージングのためのコンビナトリアル標識化戦略が開発された。この後者の手法の力は、わずか数十回のハイブリダイゼーションラウンドを用いて、個々の細胞中で１０００個を超えるゲノム遺伝子座および１０００個を超える遺伝子の新生転写物を同時にイメージングする、クロマチン構成と転写との両方のゲノムスケールでのイメージングを実施することによって証明された。これらのデータは、ゲノムワイドのｔｒａｎｓ染色体相互作用、ならびに核構造および転写とのその関係を示した。このコンビナトリアルイメージング手法を、数百ラウンドのハイブリダイゼーションおよびイメージングを実施する証明された能力と結びつけると、単一細胞中でのクロマチン構造の高分解能全ゲノムビューを提供するために１０，０００個を超えるゲノム遺伝子座を同時にイメージングすることが可能なはずである。
［実施例１８］
本実施例で示される高効率イメージング技法は、クロマチン構成を試験するためのいくつかの利点を有する。第１に、クロマチン構造を推測するために接近情報に依拠する高効率シーケンシングベースの手法と比較して、この方法は、クロマチン構成の直接的視覚化、ならびに核の文脈での個々のイメージングされた遺伝子座の空間位置およびイメージングされた遺伝子対の間の物理的距離の直接的測定を提供する。第２に、方法は、本質的には単一細胞手法であり、個々の細胞中での詳細なクロマチン構造を示すことができる。イメージング方法による個々のクロマチン遺伝子座の高い（ほぼ１００％）検出効率は、ペアワイズクロマチン相互作用の高い捕捉率を可能にし、単一細胞中でのクロマチン構造の高解像度ビューを提供することができる。前記方法によって測定される多数の細胞は、細胞にわたる共通の構造的構成ならびに細胞間変動のロバストな統計分析を可能にする。第３に、クロマチントレーシング技法は、他のイメージングモダリティーと容易に組み合わせることができる。これは、この試験において証明されるような多重化された転写イメージングおよび核構造イメージングを含むが、エピジェネティック改変のイメージングまたはクロマチン近接性の程度などの他のモダリティーを含むようにさらに拡大させることもできる。そのような多モードイメージングは、クロマチン構造、核構成、および転写活性の間の関係における重要な洞察を提供することができる。
本明細書で報告される高効率クロマチンイメージング法の多くのありうる適用が存在する。現在の作業では、全体的な３Ｄ染色体およびゲノム構成の偏りのないビューを提供するために遺伝子座を染色体にわたって均一に標的化したが、この方法を使用して、特定の構造的および機能的特性を有するゲノム遺伝子座を標的とすることもできる。興味深い目標は、特定の遺伝子もしくは調節配列を含有するか、またはＣＴＣＦもしくはコヘシンなどの特定の核構造タンパク質が結合している遺伝子座を標的として、これらの遺伝子座間の相互作用および転写とのその関係を試験することである。より具体的な例として、大きいセットの潜在的なプロモーターおよびエンハンサーを標的とし、同じ細胞中でプロモーターによって支配される遺伝子の転写活性を同時にイメージングしながら、それらの相互作用を試験することができる。これは、どのエンハンサーがどのプロモーターを制御するかを推測するのを可能にし、プロモーターとエンハンサーのネットワークがどのように示差的に相互作用して、転写を調節するかを支配する規則を示す。別の目標では、非コードＲＮＡと共に、多くの転写因子および関連タンパク質が、核内でクロマチンを構成する物理的凝縮物に参加し、次いで、遺伝子発現調節にとって重要でありうると報告された。これらの因子によって、また、転写アウトプットと一緒に形成される構造と同時にクロマチン構成をイメージングすることは、クロマチン構造、多成分アセンブリー、凝縮物形成および転写調節の間の関係を解読するための有望な手段を提供するであろう。さらに、異なる細胞型は、部分的には、３Ｄゲノム構成によって調節されうる異なる遺伝子発現プロファイルを示す。かくして、組織中の個々の細胞の遺伝子発現プロファイルと一緒にクロマチン構成をイメージングすることは、細胞型特異的遺伝子発現パターンにとって重要であるクロマチン構成における重要な洞察を提供するのに有望である。
［実施例１９］
本実施例は、上記実施例の一部において使用されたある特定の実験モデルおよび対象の詳細を例示する。
分析において使用された細胞培養物および細胞株。細胞を、以前の試験と同様に調製した。ＩＭＲ－９０細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８６）から購入し、推奨されたプロトコールに従って増殖させた。
オリゴヌクレオチドプローブのデザイン：標的ゲノム領域の選択。逐次的ハイブリダイゼーションによる高分解能全染色体イメージングのために、標的染色体を最初に５０ｋｂのセグメントに分割した。５０ｋｂのセグメントあたり１００個未満のユニークなプローブをデザインすることができる反復エレメントおよび領域をスクリーニングした後、合計６５１個の標的ゲノム遺伝子座を、Ｃｈｒ２１のために保持し、４，５００個の標的ゲノム遺伝子座をＣｈｒ２のために保持した。次いで、一次プローブを、それぞれの５０ｋｂのセグメントのためにデザインし（約５００個のオリゴヌクレオチドプローブ）、セグメントあたり３５０個の最も中心に位置するプローブを、逐次的イメージングのために保持した。Ｃｈｒ２１のイメージングのために、６５１個全てのゲノム遺伝子座をイメージングした。Ｃｈｒ２のイメージングのために、２５０ｋｂのゲノム分解能を目的とし、したがって、５つの５０ｋｂセグメント毎に１つの一次プローブのみをデザインした。
Ｃｈｒ２１上で新生ＲＮＡ転写物をイメージングするために、５０個を超える一次プローブ（以下の「一次／符号化プローブデザイン」の節を参照されたい）を、Ｃｈｒ２１上の全てのタンパク質コード遺伝子からその最初のイントロン上でデザインすることができる遺伝子を選択した。Ｃｈｒ２１にわたって散在する合計８６個の遺伝子を選択した。転写開始事象の空間位置の正確な検出を容易にするために、それぞれの遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の周囲の５ｋｂセグメントのＤＮＡを標的とするプローブをデザインした。
コンビナトリアルイメージング戦略によるゲノムスケールでのクロマチンイメージングのために、以下の方法でのイメージングのためにゲノム遺伝子座を選択した。それぞれのヒト染色体（Ｙ染色体を除く）について、約３Ｍｂ毎の間隔の３０ｋｂのセグメントを選択した。この間隔により、所与の染色体上で３０未満の選択された遺伝子座が得られた場合、全ての染色体が少なくとも３０の選択された遺伝子座を有するまで、その染色体について間隔を減少させた。これは、イメージングのために合計１，０４１個の標的ゲノム遺伝子座をもたらし、個々の染色体における遺伝子座の数は３０～８０の範囲であった。次いで、コンビナトリアルＦＩＳＨイメージングのために、それぞれの３０ｋｂセグメントのために符号化プローブをデザインした（約４００のオリゴヌクレオチドプローブ）。
ゲノムスケールでのイメージングにおける新生ＲＮＡ転写物のイメージングのために、１，０４１個の標的ゲノム遺伝子座と完全に、または部分的に重複する全てのイントロン含有遺伝子を選択した。それぞれのＲＮＡが約２０の符号化プローブを有し、符号化プローブのターゲティング配列が転写開始部位の可能な限り近くに保持されるように、全てのこれらのＲＮＡのイントロンのための符号化プローブを選択した。合計１，１３７個の遺伝子を標的とした。
コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのイメージングのためのバーコードデザイン。１，０４１のゲノム遺伝子座をイメージングするための二進バーコードを、以下の様式で選択した。最初に、２のハミング重みを有する全てのありうる１００ビットの二進バーコード（すなわち、それぞれのバーコードは、２の「１」ビットおよび９８の「０」ビットを含有する）を生成し、この一覧から１，０４１のバーコードを無作為に選択した。次いで、選択されたバーコードを、最初に１０４１のゲノム遺伝子座に任意に割り当てた。次に、使用されたコードプールと使用されなかったコードプールとの間、ならびに異なる染色体に由来する遺伝子座の間で、バーコードを無作為に交換して、それぞれの染色体について、異なるビットにわたって出現する（すなわち、「１」として読まれる）遺伝子座の数の分散を最小化した。これにより、それぞれの染色体についてビットあたりにイメージングされるほぼ等しい数の遺伝子座が得られた。それぞれの染色体内の遺伝子座へのバーコードの関連付けを最適化するために、同じ染色体内の遺伝子座をバーコード交換させ、同じコード位置で「１」として読まれるバーコードを有する遺伝子座間の最大の最小ゲノム距離を最適化した。同一の最小ゲノム距離のコード割当てを比較する場合、ゲノム距離の変動の係数を最小化したものを選択した（ゲノム距離が、より大きい平均と、より小さい標準偏差との両方を有するように）。
１，１３７個の遺伝子の新生ＲＮＡ転写物をイメージングするためのバーコードを、同様だが、１００ビットの、ハミング距離２のコードの代わりに、５４ビットの、ハミング距離２のコードを使用して選択した。
一次／符号化プローブのデザイン。クロマチンイメージングのための一次／符号化プローブを、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したオリゴヌクレオチドのプールから合成した。このプールにおけるそれぞれのオリゴは、以下のサブ配列（５’から３’に向かって）を使用した：ＰＣＲ増幅および逆転写（ＲＴ）のための２０ヌクレオチド（ｎｔ）または１９ｎｔのフォワードプライミング領域、逐次的イメージングの場合のプローブまたはコンビナトリアルイメージングの場合にプローブによって標的とされるゲノム遺伝子座がイメージングされるビットの１つによって標的とされるゲノム遺伝子座に対応する２０ｎｔのリードアウト配列、単一の標的ゲノム遺伝子座に対してユニークに結合するようにデザインされた、４２ｎｔまたは４０ｎｔの標的配列（それぞれ、逐次的イメージングまたはコンビナトリアルイメージングのための）、さらに１～２コピーの上記の２０ｎｔのリードアウト配列、およびＰＣＲ増幅のための２０ｎｔまたは１９ｎｔのリバースプライミング配列。
新生ＲＮＡイメージングのためには、少し改変した同様のデザインを使用した。フォワードおよびリバースプライミング配列を、以前に記載されたように、ＰＣＲのために最適化された無作為の２０ｎｔ配列の以前に生成された一覧から選択した。
リードアウト配列を、以下のプロセスにより選択した。最初に、以前に記載されたように、ヒトゲノムとの最小限の相同性を示す３０ｎｔの配列の一覧を創出した。次いで、これらの配列のサブセットを、観察されたシグナルノイズ比（ＳＮＲ）によって順位付け、上位１００個を、ＤＮＡリードアウトプローブとして選択した。逐次的イメージングのためには、より多い数のハイブリダイゼーションラウンドに起因して、実質的により多くのリードアウト配列が必要であった。したがって、以前に概略された同じ手順に従って、約１，２００個の候補リードアウト配列を選択した。次いで、これらの候補をフィルタリングして、４０～６０％のＧＣ含量および５７～６７℃の融点を確保した。リードアウト配列が１７より大きい、またはそれに等しいＨＳＰスコアを有するヒットを有しないように、ＢＬＡＳＴを使用してこれらの配列をさらにフィルタリングした。最後に、これらの配列のそれぞれの最後の２０ｎｔを逆補完することによって、リードアウト配列を選択した。
４２ｎｔまたは４０ｎｔの標的配列を、以前に記載された手順と同様に選択した。略述すると、目的のそれぞれのゲノム領域について、以下の手順を繰り返した（上の「標的ゲノム領域」の節を参照されたい）。最初に、目的のゲノム領域と相補的な全ての４２ｎｔまたは４０ｎｔの配列の一覧を創出した（標的領域中のそれぞれのありうる塩基で開始する）。次いで、それらが融点およびＧＣ含量の規定の範囲内にあることを要求することによって、配列をフィルタリングした。次いで、以前と同じ手順を使用して、ヒトゲノム、ヒトトランスクリプトームおよび反復配列を含有するデータベースとの相同性の許容される程度を制限することによって、残りの配列をさらにフィルタリングした。逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために使用された配列は、それぞれの標的配列が意図されるゲノム遺伝子座と確実にユニークにマッチするＢＬＡＳＴを使用する追加のフィルタリング工程を有していた。最後に、ゲノム重複が標的配列の任意の対の間で存在しないような最後のフィルタリング工程の後、残りの配列から標的配列を選択した。
逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために、それぞれの標的ゲノム遺伝子座に関する４２ｎｔ標的配列の全部を、その遺伝子座と会合するユニークなリードアウト配列とマッチさせた。一次プローブ配列を生成するために、それぞれの標的配列を、割り当てられた２つの同一コピーのリードアウト配列に連結した後、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマーに連結した。コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのイメージングのための完全長符号化プローブを生成するために、それぞれの標的ゲノム遺伝子座について選択された４０ｎｔの標的配列のそれぞれを、標的遺伝子座全体に及ぶ２つの群に交互に割り当てた。これらの群のそれぞれを、遺伝子座がイメージングされる２つのビットのうちの１つに対応する単一のリードアウト配列と関連付けた。次いで、それぞれの標的配列を、その群に割り当てられた２つの同一のコピーのリードアウト配列に連結した後、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマーに連結した。
ＲＮＡイメージングのためのプローブが、１つは標的領域の５’末端の、２つは３’末端の、プローブ毎に３コピーの同一のリードアウト配列を含有することを除いて、それらを同様にデザインした。ＲＮＡイメージングのためのリードアウト配列は、ＤＮＡイメージングのために使用されるものと直交し、試験したリードアウト配列の同じ順位付けられた一覧から選択された。
実験系の概説。これらの実験を実施するために使用された物理的設定は、いくつかの構成要素を使用した。特注の蛍光顕微鏡を使用して画像を獲得したが、特注の流体システムを使用して、顕微鏡ステージ上で緩衝液交換を自動的に実施した。特注のソフトウェアを使用して、種々の構成要素を同期させ、制御し、多くの実験工程を自動化した。以下は、これらの要素のそれぞれの詳細な説明である。
画像獲得のための顕微鏡設定。特注の顕微鏡システムを使用して、画像獲得を実施した。Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｕ顕微鏡本体を中心に、開口数を１．４とする、Ｎｉｋｏｎ ＣＦＩ Ｐｌａｎ Ａｐｏ Ｌａｍｂｄａ ６０倍油浸対物レンズと共に、システムを構築した。照射は、２つの選択肢のうちの１つに基づくものであった：以下の波長：４０５ｎｍ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｏｂｉｓ ４０５ｎｍ ＬＸ ２００ｍＷ）、５６０ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－２０００－５６０－Ｂ１Ｒ）、６４７ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－１５００－６４７－Ｂ１Ｒ）および７５０ｎｍ（ＭＰＢ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－７５０－Ｂ１Ｒ）を有する固体状態の単一モードレーザー。この場合、５６０ｎｍ、６４７ｎｍおよび７５０ｎｍのレーザーの出力は、音響光学チューナブルフィルター（ＡＯＴＦ）によって制御したが、４０５ｎｍのレーザーは、そのレーザー制御ボックスによって直接制御した。特注ダイクロイックフィルター（Ｃｈｒｏｍａ、ｚｙ４０５／４８８／５６１／６４７／７５２ＲＰ－ＵＦ１）および発光フィルター（Ｃｈｒｏｍａ、ＺＥＴ４０５／４８８／４６１／６４７－６５６／７５２ｍ）を使用して、励起照射と放出照射とを分離した。または、以下の波長：４０５ｎｍ、４４６ｎｍ、４７７ｎｍ、５２０ｎｍ、５４６ｎｍ、６３８ｎｍおよび７４９ｎｍを有するＬｕｍｅｎｃｏｒ ＣＥＬＥＳＴＡ光エンジン（繊維に結合した固体状態のレーザーベースの照射システム）。このシステムを、ペンタバンドパスダイクロイック（ＩＤＥＸ、ＦＦ４２１／４９１／５６７／６５９／７７６－Ｄｉ０１－２５ｘ３６）およびペンタバンドバスフィルター（ＩＤＥＸ、ＦＦ０１－４４１／５１１／５９３／６８４／８１７－２５）と共に使用した。多くの実験において、反射ビームシェイパー（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｏｐｔｉｃｓ、ＧＢＳ－ＡＲ１４）または振動光ファイバー（Ｅｒｒｏｌ、カスタムＡｌｂｅｄｏユニット）を使用して、照射を平坦化した。
学術用ＣＭＯＳカメラ（単一分子のイメージングのために工場で較正した、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＬＡＳＨ４．０またはＨａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１３４４０）を、画像獲得のために使用した。三次元における試料位置を、ＸＹＺステージ（Ｌｕｄｌ）を使用して制御した。特注のオートフォーカスシステムを使用して、長時間にわたって一定の焦点面を維持した。これを、ガラス－液体界面から反射した２つのＩＲレーザー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＬＰ９８０－ＳＦ１５）ビームの相対位置を比較することによって達成し、別々のＣＭＯＳカメラ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ｕｃ４８０）上でイメージングした。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎカード（ＮＩ ＰＣＩｅ－６３５３）および特注のソフトウェア（以下の「実験構成要素を制御するためのソフトウェア」を参照されたい）を使用して、異なる構成要素を同期させ、制御した。
流体システムの構成。流体システムは、いくつかの主な構成要素：ポンプ、直列に接続された弁のセット、試料をマウントするフローチャンバー、ならびにチューブおよびコネクターを使用した。蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ、ＭＩＮＩＰＬＵＳ３）を使用して、システムにおける流動を生成した。ポンプを、直列に接続された、８方弁（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＶＰおよびＨＶＸＭ８－５）のアレイに接続した。この試験では、そのような様式で接続された３～５個の弁を使用した。それぞれの弁の最後の接続は、直列での次の弁の入力として使用したが（最後の１つを除く）、残りは１ラウンドのハイブリダイゼーションのための緩衝剤を含有する管に接続した。固定されたサブセットの弁を、イメージング、退色および洗浄緩衝剤のために使用した（「実験手順およびプロトコール」の節を参照されたい）。この弁システムを使用して、試料を入れるフローチャンバー（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０６０３１９－２）中に種々の緩衝剤を流した。チャンバーの出力を廃液収集容器に接続し、オープンフローシステムを形成させた。弾塑性チューブを使用して構成要素を接続し、粘着剤（Ｂｌｕ－ｔａｃｋ）を使用して密閉した。特注のソフトウェア（以下の「実験構成要素を制御するためのソフトウェア」を参照されたい）を使用して、システムを制御した。全体として、このシステムは、２０～３６ラウンドのハイブリダイゼーションを可能にした（特殊な緩衝剤のために保存された弁の数およびスポットの数に応じて）。ハイブリダイゼーションラウンドの数が流動システムの能力を超えた実験においては、緩衝剤を、以下の手順によって新しいものと交換した：弁システムからの出力を廃液収集容器に直接接続し、試料含有チャンバーをバイパスした。次いで、全ての弁を、３０％ホルムアミドおよび二重蒸留した水を使用して洗浄した。次に、新しいセットの緩衝剤を導入し、チャンバーを流動システムに再接続した。最後に、次のラウンドのハイブリダイゼーションのために実験を再開した。
実験構成要素を制御するためのソフトウェア。全てのシステム構成要素を、特注のソフトウェアを使用して制御した。このソフトウェアパッケージは、同時に動作するいくつかの以下のメインモジュールから構成されていた：全ての照射および顕微鏡構成要素を制御し、同期させるのに使用されるソフトウェアパッケージである「Ｈａｌ」。一部の場合、このパッケージに含まれない、構成要素のためのドライバーを書くことが必要であることがわかった。Ｈａｌはまた、照射強度、ステージの順序およびイメージング中（例えば、ｚスキャン中）の照射操作、曝露時間などのイメージングパラメータを定義するためにも使用される。モザイク画像（すなわち、多くの個々の視野を構成する複合画像）を取り、実験におけるイメージングのための領域を選択するために使用されるモジュールである「Ｓｔｅｖｅ」。流体成分を制御し、セット（例えば、新しいラウンドのハイブリダイゼーションを実施する場合に起こる操作のセット）として実施される予めプログラミングされた操作順序を定義するために使用されるソフトウェアである「Ｋｉｌｒｏｙ」。ＨａｌとＫｉｌｒｏｙとの両方に対してコマンドを発令することができ、完全なセットの流体システムおよび顕微鏡操作、それらを実施する順番およびタイムラグを前もって定義することによってデータ収集の実施を自動化するために使用される、「Ｄａｖｅ」。
実験の一般的な流れは、実験が始まる前に、ＨａｌおよびＫｉｌｒｏｙに、使用するパラメータおよび仕様をロードすることである。試料をロードし、チャンバーにイメージング緩衝剤を充填した後、ＤＡＰＩチャネルのモザイク画像を、Ｓｔｅｖｅを使用して取り、目的の領域を選択する。次いで、実験全体を通した操作の順序を特定するためのファイルを生成し、目的の選択領域の座標と共に、Ｄａｖｅにロードする。残りの実験は、手動の介入なしに自動的に実行される。実験におけるラウンド数が流動システムの能力を超える場合、自動シーケンスはシステムの能力次第で動作を特定する。次いで、緩衝剤を交換し（上記の「流体システム構成」の節を参照されたい）、新しいＤａｖｅファイルを創出し、全てのイメージングラウンドが完了するまでこれを繰り返す。
一次／符号化プローブ合成。一次／符号化プローブを、上記の鋳型ライブラリーから増幅した（上の「一次／符号化プローブデザイン」を参照されたい）。これを、以下の工程を含む以前に記載された増幅プロトコールを使用して行った：最初に、初期のオリゴプールを、限定サイクルのＰＣＲを使用して約２０サイクルにわたって拡大した。この工程において使用されたリバースプライマーはまた、プライマー伸長によってＴ７プロモーター配列を導入した。次いで、得られた生成物は、カラム精製によって精製され、高収率インビトロ転写反応によってさらに増幅およびＲＮＡへの変換を受けた。次に、ＲＮＡ生成物を、逆転写反応によって一本鎖ＤＮＡに変換し戻した。次いで、以前の工程の生成物を、アルカリ加水分解（残留ＲＮＡを除去するため）にかけ、カラム精製した（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄ４００３およびＤ４０３３）。最後に、必要に応じて、以前の工程の生成物を、減圧下で乾燥し、水中に再懸濁して、所望の濃度の一次プローブを達成した。全てのプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。
細胞培養物の調製および一次／符号化プローブのハイブリダイゼーション。細胞を、以前の試験と同様に調製した。ＩＭＲ－９０細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８６）から購入し、推奨されたプロトコールに従って増殖させた。クロマチン構造の潜在的な変更を回避するために、この試験における全ての細胞を、以下に特定される密度で培養開始の６週間以内に播種した。
ＤＮＡイメージングについて準備するために、細胞を、４０ｍｍの丸い＃１．５のカバースリップ（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０４２０－０３２３－２）上に、カバースリップあたり約５００，０００個の密度で播種した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で集密まで約２日間増殖させた。転写阻害実験において、細胞培地を、細胞固定の６時間前に、１００マイクログラム／ｍＬのアルファ－アマニチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２２６３）を含有する新鮮な培地と交換した。１，６－ヘキサンジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２４０１１７）を用いた実験のために、本発明者らは、細胞播種の前に１０マイクログラム／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１１４１）でカバースリップを被覆し、培地を、４５分にわたって２％ｗ／ｖの１，６－ヘキサンジオールを含有する新鮮な培地と交換した。次いで、培養物を、室温で１０分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定し、ＰＢＳ中で２～３回洗浄した。次いで、細胞を２つの工程で透過処理した：最初に、それらを室温で１０分間、ＰＢＳ中の０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ８７８７）で処理した。次いで、細胞を、室温で５分間、０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）で処理し、ＰＢＳ中で２～３回洗浄した。ＨＣｌ処理後、細胞を、３７℃で３０～４５分間、ＰＢＳ中に溶解した０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＥＮ０５３１）の溶液で処理して、ＲＮＡへのオフターゲット結合の潜在的な供給源を除去した。この処理の後、細胞を、２ｘ塩水－クエン酸ナトリウム緩衝剤（ＳＳＣ；Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９７６３）および５０％ホルムアミド（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９３４２）を使用したプレハイブリダイゼーション緩衝剤中で約１０分間インキュベートした。次に、細胞カバースリップを反転させ、６０ｍｍのペトリ皿中、５０マイクロリットルのハイブリダイゼーション緩衝剤（１０マイクログラムのヒトＣｏｔ－１ ＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５２７９０１１）を含む、または含まない約２５マイクロモルの合計濃度で一次／符号化プローブの混合物を含有する、２ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８９０６））の液滴上に置いた。皿を、約９０℃で３分間、水浴中に部分的に浸し、加湿チャンバー中、１６～３６時間にわたって４７℃でインキュベートした。一次／符号化プローブと共にインキュベートした後、試料を２ｘＳＳＣおよび４０％ホルムアミド中で３０分間洗浄し、室温で１０分間、２ｘＳＳＣ中の４％ＰＦＡで後固定した。次いで、試料を、２ｘＳＳＣ中の標準ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆ８８０５またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆ８７９２のいずれか）と共に２～３分間インキュベートし、５～１０分間、２ｘＳＳＣ中の１マイクロモルの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄ１３０６）で染色した後、イメージングまで２ｘＳＳＣ中で保存した。
ＲＮＡイメージングを含む実験のために、全ての緩衝剤は、ＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ Ｍ０３１４またはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎ２６１５のいずれか）の１：１０～１：１，０００希釈液を含有する細胞を固定した点から使用した。ＲＮＡ染色のための処理は、ＨＣｌを用いた処理まで上記のプロトコールと同一であった。この工程の後、細胞を、プレハイブリダイゼーション緩衝剤中で１０分間インキュベートした後、細胞カバースリップを反転させ、ＤＮＡ染色について記載されたように、約１マイクロモルの合計濃度でＲＮＡイントロンを標的とする一次／符号化プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝剤の液滴上に置いた。この場合、しかしながら、９０℃の熱変性を実施せず、細胞を、加湿チャンバー中、１６～３６時間にわたって４７℃ですぐにインキュベートした。一次／符号化プローブと共にインキュベートした後、試料を、ホルムアミド溶液中で洗浄し、上でＤＮＡについて記載されたようにＰＦＡで後固定した。次いで、それを標準ビーズと共にインキュベートし、１マイクロモルのＤＡＰＩで染色した後、イメージングまで２ｘＳＳＣ中で保存した。ＲＮＡイメージング後、試料を顕微鏡から取り出し、細胞をＲＮａｓｅ Ａで処理した後、ＲＮＡイメージングを用いずにＤＮＡイメージングについて上に記載されたのと同じ様式でＤＮＡハイブリダイゼーションを開始した。
逐次的またはコンビナトリアルＦＩＳＨイメージングのためのリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーション。プロトコールのこの部分における全ての液体交換を、ＦＣＳ２フローチャンバー（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０６０３１９－２）中にマウントされたカバースリップと共に、特注の流体システムの使用によって達成した。このシステムの設定は、「流体システム構成」の節で詳細に説明されている。略述すると、流体システムは、３～５個のコンピュータ制御された八方弁（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＶＰおよびＨＶＸＭ８－５）およびコンピュータ制御された蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ、ＭＩＮＩＰＬＵＳ３）を使用した。まとめると、これらの構成要素は、任意の所与の時間での流体流動の速度と、流体流動の種類との両方の制御を可能にした。それぞれのハイブリダイゼーションラウンドは、以下の一般的工程を使用した：最初に、ハイブリダイゼーション緩衝剤を、以下に記載されるように、それぞれのラウンドに特異的なオリゴヌクレオチドプローブのセットと共に流した。次いで、それを、室温で１０分間インキュベートした。次に、洗浄緩衝剤を流し、それを約２００秒間インキュベートし、最後に、イメージング緩衝剤を流した。
イメージング緩衝剤を以前に記載のように調製し、６０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０％ｗ／ｖのグルコース、１％のグルコースオキシダーゼ酸素スカベンジャー溶液（約１００ｍｇ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ２１３３）およびカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ３１５５）の１：３希釈液を含有する）、０．５ｍｇ／ｍＬの６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２３８８１３）および５０μＭのＴｒｏｌｏｘ Ｑｕｉｎｏｎｅ（Ｔｒｏｌｏｘ溶液のＵＶ照射によって生成される）を含むイメージング緩衝剤を使用した。Ｔｒｏｌｏｘを、メタノールに溶解した後、溶液に添加した。調製後、イメージング緩衝剤を、約０．５ｃｍの厚さの鉱物油層によって被覆して、酸素への曝露を防止した。
ハイブリダイゼーション緩衝剤および洗浄緩衝剤は、それぞれ、２ｘＳＳＣ中、３５％および３０％のホルムアミドから構成され、ハイブリダイゼーション緩衝剤はまた、０．０１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含有していた。ハイブリダイゼーション緩衝剤は、それぞれのハイブリダイゼーションラウンドのために別々に保持され、２セット（コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンイメージングのため）または３セット（逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのため、ならびにコンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンおよびＲＮＡイメージングのため）のリードアウトプローブを含有していた。蛍光シグナルを、以下のように導入した：逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために、ハイブリダイゼーション緩衝剤は、３０ｎＭの濃度で添加された３つの蛍光リードアウトプローブ（Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ６４７またはＣｙ５、およびＣｙ３）を含有していた。全ての実験は、図２４Ａに記載されるような、オリゴヌクレオチドアダプターと蛍光リードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーションを含んでいた。それぞれのハイブリダイゼーションラウンド中に、アダプタープローブのセット（それぞれ１００ｎＭ濃度）を最初に、３つの異なるカラーチャネル（Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ６４７またはＣｙ５、およびＣｙ３）における３つの標的ゲノム遺伝子座の検出のために流した。それぞれのアダプタープローブは、標的遺伝子座の１つに対してユニークなリードアウト配列と相補的なセグメントおよびカラーチャネルに特異的な共通のリードアウト配列を含有するセグメントを含んでいた。次に、それぞれ３つのカラーチャネルに特異的な共通のリードアウト配列の１つと相補的な、３つの異なる色素とコンジュゲートされたリードアウトプローブを、それぞれのプローブについて３０ｎＭの濃度で流した。この手順により、それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションの間に、それぞれ３つのカラーチャネルにおいて３つのゲノム遺伝子座をイメージングすることができる。蛍光リードアウトプローブは、以前に記載されたように、フルオロフォアをオリゴヌクレオチドに連結するジスルフィド結合を含有して、ラウンド間のシグナルの効率的な除去を可能にした。コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンイメージングのために、各ラウンドのハイブリダイゼーション緩衝剤は、一方はＣｙ５またはＡｌｅｘａ６４７で標識され、他方はＡｌｅｘａ７５０で標識された、２つの蛍光リードアウトプローブを含んでいた。蛍光リードアウトプローブは、１）１００ｎＭの濃度で添加された、所与のビットでイメージングされた全ての符号化プローブに共通のリードアウト配列と相補的な蛍光標識されたオリゴ、または２）上記のような、追加の共通リードアウト配列（それぞれのカラーチャネルにおいて全てのアダプターに共通する）に連結された、リードアウト配列と相補的な配列を有するアダプターオリゴと、この共通リードアウト配列と相補的な蛍光標識されたリードアウトプローブとの組合せのいずれかを使用した。一部の実験については、アダプターおよび共通リードアウトプローブを、１：１．５の比で予め混合し、約１００ｎＭの最終濃度で添加した。他の実験については、アダプターとリードアウトプローブとを、逐次的に試料にハイブリダイズさせた。ＲＮＡイメージングについては、それぞれのラウンドのハイブリダイゼーション緩衝剤は、上記のように、１つがそれぞれのカラーチャネルのための、３つのアダプタープローブを含有していた。それぞれのラウンドは、２つの個別のハイブリダイゼーション工程を含んでいた。最初に、アダプターを流し、ハイブリダイズさせ、過剰の材料を洗浄した。次いで、それぞれ、Ｃｙ３、Ｃｙ５（またはＡｌｅｘａ６４７）およびＡｌｅｘａ７５０で標識された、アダプター上の共通リードアウト配列と相補的な、３つの蛍光リードアウトプローブを、逐次的に流した。蛍光リードアウトをハイブリダイズさせた後、イメージング緩衝剤を流し、シグナルを収集した。
次のラウンドのリードアウトプローブまたはアダプタープローブハイブリダイゼーションの前に、現在のラウンドにおけるリードアウトプローブからの蛍光シグナルを、以下の「ハイブリダイゼーションラウンド間のシグナル除去」の節に記載されるように除去した。
第１ラウンドのハイブリダイゼーションの前に、イメージングのラウンドを実施して、ＤＡＰＩシグナルを獲得し、核境界を同定した。逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために、約２２０ラウンドにわたってＣｈｒ２１上の６５１個のゲノム遺伝子座または約３２０ラウンドにわたってＣｈｒ２上の９３５個のゲノム遺伝子座を、全て３つのカラーチャネルにおいてイメージングした。コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンイメージングのために、１，０４１個のゲノム遺伝子座の全セットを、５０ラウンドのハイブリダイゼーションおよびラウンドあたり２つのカラーチャネルにおいてイメージングした。各ラウンドにおいて、ゲノム遺伝子座を、ｚ次元にステージをステップすることによって３Ｄでイメージングした。Ｃｈｒ２１上の８６個の遺伝子に関する新生ＲＮＡ転写物を、３色で３１ラウンドにわたって逐次的にイメージングし、１，１３７個の遺伝子のＲＮＡ転写物のゲノムスケールでのイメージングを、３色で１８ラウンドにおいて３Ｄでイメージングした。Ｃｈｒ２１の逐次的イメージングのために、具体的には、２９ラウンドにわたって８６個の遺伝子のＴＳＳを、３色でイメージングした。さらなるラウンドを使用して、ゲノム遺伝子座のセットを再標識し、色収差およびカラーチャネル間の裏抜け、ならびに試料およびイメージング機器の安定性を評価した。合計約１，０００～３，０００個の細胞を含有する約６０の視野のイメージングには、逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングの逐次的イメージングについては約１２～１８日間およびコンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのクロマチンイメージングについては３日間かかった。
３～５つの弁のシステムは、最大で２０～３６の異なるハイブリダイゼーション溶液のローディングを可能にした。結果として、全ての流体システムのチャネルを使い果たした後、試料チャンバーをバイパスし、ハイブリダイゼーションのために使用された全てのチャネルを、水中の３０％ホルムアミドで洗浄した。次に、チャンバーを再接続し、次のセットのハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドを進めた。
逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために、穏やかな後固定工程を、定期的に（約４日毎）、５分間にわたって２ｘＳＳＣ中の２％ＰＦＡを用いて実施して、試料の構造的完全性を維持した。
抗体の標識化およびイメージング。抗体イメージングを、ＲＮＡまたはＤＮＡイメージングの直後に実施した。上記のプロトコールによるイメージングの完了後、試料は以下の工程を受けた：試料を、ブロッキング溶液（０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ９４１６）および１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ００１－０００－１６２）を含むＰＢＳ）と共に、３０分間インキュベートした。試料を、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体と共に、１時間インキュベートした。試料を、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中で３回、それぞれ５分間洗浄した。蛍光タグ付き二次抗体のために、工程２および３を繰り返した。
全ての緩衝液交換を、以下の「流体システム設定」の節に記載されるマイクロ流体システムを使用して、顕微鏡上で行った。Ｃｙ５カラーチャネルをイメージングのために使用し、光退色を使用して逐次的抗体標識化間のシグナルを消滅させた。
以下のセットの一次および二次抗体を使用した：核スペックルをイメージングするために、ストックからの１：２００の希釈率の、核スペックルのマーカーとして一般的に使用されるスプライシング因子であるＳＣ３５に対する一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８２６）およびストック濃度から１：１，０００に希釈されたＣｙ５色素によって標識されたロバ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７１５－１７５－１５０）を使用した。核小体をイメージングするために、ストックからの１：２００の希釈率の抗フィブリラリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５８２１）、およびストック濃度から１：１，０００に希釈された、Ａｌｅｘａ６５７色素によって標識されたロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－６０５－１５２）を使用した。細胞周期状態の決定のために、ストックからの１：１００の希釈率の、抗ゲミニン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９５０４７）、およびストック濃度から１：１，０００に希釈されたＡｌｅｘａ６５７色素（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、７１１－６０５－１５２）によって標識されたロバ抗ウサギ二次抗体を使用して、ＲＮＡイメージングの直後に免疫蛍光染色を実施した。
画像獲得。それぞれの実験について、細胞がまばらである領域を避けて、イメージングのために約６０の視野（ＦＯＶ）を選択した（本発明者らは、典型的には、ＦＯＶあたり１０～５０個の細胞を同定した）。それぞれのカメラのＦＯＶは、イメージング面におけるそれぞれの次元において１５３ｎｍに対応するカメラピクセルを有する、１，０００ｘ１，０００ピクセル、またはイメージング面におけるそれぞれの次元において１０８ｎｍに対応するカメラピクセルを有する、２０４８ｘ２０４８ピクセルを使用した。
各ラウンドのハイブリダイゼーション後（上の「ＦＩＳＨイメージングのためのリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーション」を参照されたい）、それぞれのＦＯＶのｚスタック画像を、３または４色で獲得した：６４７ｎｍおよび７５０ｎｍの照射（または５６０ｎｍ、６４７ｎｍ、および７５０）を使用して、ＦＩＳＨ画像を獲得し、５６０ｎｍの照射（または４０５ｎｍの照射）を使用して、標準ビーズをイメージングした。第１ラウンドのイメージングのために、４０５ｎｍの照射を使用して、ＤＡＰＩシグナルをイメージングしたが、抗体イメージングのためには、６４７ｎｍの励起チャネルを、ＲＮＡまたはＤＮＡイメージング後に使用した。連続ｚ切片を、全てのイメージングされた細胞の全ての核体積を包含する、８５、１００、１５０または２００ｎｍにより分離した。それぞれのｚ位置で、画像を全てのチャネルで獲得した後、ステージを動かし、画像を約１０Ｈｚの速度で獲得した。
ハイブリダイゼーションラウンド間のシグナル除去。各ラウンドのイメージングの前に、前のラウンドからのシグナル（または第１ラウンドの場合、内因性バックグラウンド）を消滅させた。これは、必要に応じた光退色工程について以前に記載されたようにフルオロフォアをリードアウトプローブに接続するジスルフィド結合を切断することによって達成された。切断のために使用された緩衝剤は、フルオロフォアをリードアウトプローブに接続するジスルフィド結合を減少させるための５０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４７０６）、ならびに占有されていないリードアウト配列が次のハイブリダイゼーションラウンドを妨げるのを遮断するための３５％ホルムアミド中の１ｍＭの色素非含有共通リードアウトプローブを含有していた。光退色を実施する実験においては、３５％ホルムアミドを含む、または含まない２ｘＳＳＣに緩衝剤を変更し、それぞれの視野に、５６０、６４７および７５０の最大利用可能出力のレーザーを３～１０秒間照射することを伴っていた。逐次的トレーシング実験における光退色工程を、オリゴヌクレオチドアダプターを用いるハイブリダイゼーション工程の間に行って、総実験時間を最小化した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝剤中の高いホルムアミド濃度の結果として、ＤＡＰＩシグナルは消滅した。
逐次的ＤＮＡ－ＦＩＳＨイメージングにおけるゲノム領域の再標識化。染色体全体に関して逐次的ＤＮＡ－ＦＩＳＨイメージング実験を終了した後、領域のサブセットを再標識化し、再イメージングした。試料を、２ｘＳＳＣ中の５７％ホルムアミドで４分間処理し、この処理を３回繰り返して、リードアウトオリゴヌクレオチドプローブを剥ぎ取った（最初に、ＴＣＥＰを使用してオリゴヌクレオチドプローブから色素を切断した後、光退色によって第１ラウンドのイメージング後にその蛍光シグナルを除去した）。リードアウトプローブを剥ぎ取った後、１ｍＭの色素非含有共通リードアウトプローブを、３５％ホルムアミド２ｘＳＳＣ中に添加して、剥ぎ取られなかったアダプタープローブ上の占有されていないリードアウト配列を遮断した。次に、選択された領域の再標識化を、標準的なリードアウトプローブのハイブリダイゼーションプロトコールに従うことによって達成した（「逐次的またはコンビナトリアルＦＩＳＨイメージングのためのリードアウトプローブの逐次的ハイブリダイゼーション」の節に記載されている）。
画像分析：分析パイプラインの概説。この試験において使用された画像分析パイプラインは、Ｐｙｔｈｏｎ中に実装された。全体のパイプラインは以下の工程を使用した：全てのイメージングされた核を同定し、分割する、ＤＮＡまたはＲＮＡイメージングのため、ならびに標準ビーズのために使用されたイメージングチャネルにおいて全ての検出された蛍光スポットに３Ｄガウス分布を適合させる。同定された核と重複しないＤＮＡおよびＲＮＡスポットを拒絶した。標準ビーズを使用して試料ドリフトを補正し、異なるカラーチャネル間の色の効果を補正し、特注のアルゴリズムおよびソフトウェアを使用してＤＮＡ遺伝子座およびＲＮＡ分子に識別を割り当てる（これらのものは、両方とも染色体ワイドのイメージングおよびゲノムワイドのイメージングのための、ＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのために以下に別々に記載される）。
核のセグメント化。第１ラウンドのイメージングからのＤＡＰＩ画像を使用して、個々の核の体積を同定し、細胞セグメント化を可能にした。これを、畳み込みニューラルネットワークにより達成し、以前に公開された研究と同様に構築および訓練し、インプットとしてのｘｙ平面上へのＤＡＰＩ画像の最大投射を取った。
ＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのためのスポット適合化。以下の分析パイプラインを、それぞれのイメージングされたＦＯＶに適用して、目的の全ての遺伝子座の三次元（３Ｄ）位置を得た：基準を、全てのイメージングラウンドにおいて適合させ、画像の整列のために使用した（以下の「ドリフト補正」の節を参照されたい）。第１のイメージングラウンド（第１ラウンドのハイブリダイゼーションに先行する）において、個々の核の境界を同定するために、ならびにＲＮＡとＤＮＡイメージングとの間の画像登録のために、ＤＡＰＩシグナルを使用した。詳細については、「核のセグメント化」および「ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録」の節を参照されたい。それぞれの同定された核内の回折限定スポットを、３Ｄガウス関数に適合させて、局部バックグラウンドを超える質量および明るさのその中心を同定した。分析を、より管理可能にするために、復号化のために保持される画像あたりの適合スポットの数を、コンビナトリアルＦＩＳＨによるゲノムスケールでのイメージングにおいて１２５またはそれ以下に固定した（ノイズなしに予想された異なる遺伝子座の数よりも３倍多い）。逐次的ハイブリダイゼーションによる全染色体イメージングのために画像あたりの染色体あたりの適合スポット数を、６またはそれ以下に固定した。次いで、工程３からの適合スポットを、以下の対応する節中に記載されるように、ＤＮＡ遺伝子座および転写焦点を同定し、その位置を決定するために使用した。
ドリフト補正。標準ビーズスポット適合化を、上記と同じように実施した。次いで、標準ビーズ位置のセットを、ハイブリダイゼーションラウンド間で比較し、厳正な形質転換を適用して、ビーズの相対位置の平方差の和を最小化した。
色効果の補正。多色イメージングに関する裏抜けおよび色収差を、それぞれのイメージングチャネル中の同じセットのゲノム遺伝子座を独立に標識化し、それぞれ、異なるカラーチャネル中の同じ遺伝子座のシグナルを比較することによって実施した。
ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録。最初に、２Ｄ画像相関による２セットの画像（すなわち、クロマチンおよびＲＮＡ）にわたる大まかな画像登録のために、ＤＡＰＩシグナルを使用した（各セット内の全画像を、標準ビーズを使用してＤＡＰＩ画像と整列させた）。初回ラウンドのＲＮＡ復号化を実施した後（以下の「逐次的イメージングにおける適合ＲＮＡスポットからの転写焦点の同定」および「コンビナトリアルゲノムスケールイメージングにおける適合ＲＮＡスポットのための復号化アルゴリズム」を参照されたい）、新生ＲＮＡ局在とそれらが存在するＤＮＡ遺伝子座との間の変位が、視野における全てのイメージングされた遺伝子および細胞にわたって考慮した場合、平均でゼロであるはずであると仮定することによって、より細かいアラインメントを算出した。したがって、さらなる厳正な形質転換を算出して、イメージングされた新生ＲＮＡと、その対応するＤＮＡ遺伝子座との平均変位を最小化し、これを最終的なアラインメントとして使用した。
逐次的イメージングにおける適合ＤＮＡスポットからのクロマチン遺伝子座の同定。それぞれの遺伝子座の同定および３Ｄ局在特定を、以下の工程によって達成した：各画像中の全ての適合スポットのドリフトおよび収差補正された位置について一覧を生成した。スポット発見アルゴリズムにより、特異的ハイブリダイゼーションラウンドの特定のカラーチャネルに対応するそれぞれの逐次的画像においてそれぞれの染色体について最大６つの候補を発見することができたため（「ＤＮＡおよびＲＮＡイメージングのためのスポット適合化」を参照されたい）、以下の追加の工程を実施して、イメージングされたクロマチン遺伝子座から生じる可能性が最も高い候補スポットを同定した。それぞれのハイブリダイゼーションラウンドのそれぞれのカラーチャネルにおいてそれぞれの細胞中のそれぞれの染色体コピーに対応する最も明るいスポットを選択することによって、最初の暫定的なクロマチントレースを生成した。それぞれの適合スポットについて、それが最初の暫定的なクロマチントレースのために選択されたかどうかに関係なく、３つの品質測定基準：局部バックグラウンドを超えるスポットの明るさ、暫定的な染色体トレースに沿って５つの遺伝子座上流および５つ下流から算出された、局部質量中心までのスポットの距離、ならびに暫定的な染色体トレース全体の質量中心までの距離を算出した。それぞれのスポットについて、暫定的なクロマチントレースに含まれるスポットに関する品質測定基準値の分布（本発明者らは、「正当な分布」と呼ぶであろう）に対する全ての候補スポットに関して合わせたＦｉｓｈｅｒのｐ値を算出することによって、上記の３つの品質測定基準を、単一の尺度で組み合わせた。これは、それぞれのスポットの全体の品質スコアと考えられ、以下のようにスポットあたりで算出した：それぞれの測定基準について、より低い品質測定基準を有していた「正当な分布」における他のスポットの比率を算出し、これらの３つの比率を乗算した。次いで、期待値最大化手順を使用して、それぞれの標的クロマチン遺伝子座に対応する最も高い品質スコアを有するスポットを逐次選択し、「正当な分布」を、得られるクロマチントレースに基づいて再度アップデートした。この最適化手順を、収束まで繰り返した。収束後、それぞれクロマチン遺伝子座に対応する、最後のセットのスポットを使用して、標的遺伝子座の３Ｄ空間位置を決定した。最後に、工程４からのスポットをフィルタリングして、品質スコアが設定されたカットオフよりも下であった（およびかくして、低い信頼性のものであった）ものを除去した。合わせた品質スコアに関するカットオフ値を設定するために、再イメージング実験に含まれた遺伝子座の品質スコアを最初に計算して、変位エラーを決定した（以下の、「逐次的イメージングにおける再イメージングされた遺伝子座の同定」の節を参照されたい）。次いで、オリジナルの間で低い変位エラー（５００ｎｍ未満）を示すスポットの品質スコアの分布を算出し、高い変位エラー（５００ｎｍを超える）を示すスポットについて遺伝子座を再度イメージングした。最後に、高い変位エラーのカテゴリーにあると予想された、最後のクロマチントレース（閾値を適用した後）における遺伝子座の比率が５％未満となるように、品質スコア閾値を設定した。工程５後の残りのスポットを使用して、クロマチン遺伝子座の最終的な位置を決定し、クロマチン構造を追跡した。
逐次的イメージングにおける適合ＲＮＡスポットからの転写焦点の同定。ＲＮＡイメージングラウンドからのシグナルを、以下の手順を使用して分析した：最初に、それぞれの細胞に関する適合ＲＮＡスポットの位置を、最初に粗いＤＡＰＩベースのアラインメントを使用して色収差およびドリフトについて補正し、対応するＤＮＡ遺伝子座まで１０００ｎｍの距離内にある最も明るいＲＮＡスポットを保持した。次いで、ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の登録を、上の「ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録」の節に記載されたように、初期の選択されたＲＮＡ局在（工程１からの）と、それらを有するＤＮＡ遺伝子座の位置との間の変位に基づいて精緻化した。最後に、工程２からの細かい登録後、全ての候補ＲＮＡスポットの位置を、遺伝子を有する５０ｋｂのＤＮＡ遺伝子座および対応する５ｋｂのＤＮＡ転写開始部位の位置と比較した。このステージで、５０ｋｂの遺伝子座または５ｋｂの転写開始部位からの５００ｎｍのよりストリンジェントな距離カットオフ、ならびに１のシグナルノイズ比閾値を適用した。新生ＲＮＡ局在が両方の閾値を通過した場合、それを検出された転写バーストと考えた。
逐次的イメージングにおける再イメージングされた遺伝子座の同定および変位エラーの推定。再イメージングされた遺伝子座を使用して、元のイメージングラウンドにおける遺伝子座の対応するサブセットを置き換えたことを除いて、再イメージングされた遺伝子座の同定を、「逐次的イメージングにおける適合ＤＮＡスポットからのクロマチン遺伝子座の同定」の節の記載と同様に実施した。
元のラウンドと再イメージングラウンドとの間の変位エラー（図２４Ｂ～図２４Ｄ）を計算するために、以下の観察に基づいて、明るさの閾値を通過した遺伝子座のみを考慮した。再イメージングラウンドにおける蛍光シグナルは、元のイメージングラウンドにおけるよりも実質的に不鮮明であることがわかった。これは、潜在的には、元のリードアウトプローブの不完全な除去に起因する、および／または元のイメージングラウンドにおいて結合した蛍光リードアウトプローブを剥ぎ取るためのホルムアミド処理の間にゲノムＤＮＡに結合した一次プローブの部分的除去に起因するものであった。より低い明るさは、再イメージングされた遺伝子座の局在特定精度を低下させ、初期のイメージングラウンドの局在特定エラーの人工的な過大評価を引き起こした。局在特定エラーの推定における、この効果を軽減するために、元のシグナルと比較して、明るさにおいて２０％を超えていた再イメージングされた遺伝子座のみを選択した。
さらなる注意として、両方の近隣の遺伝子座から１０００ｎｍを超える遺伝子座を検査する場合、これらの比率（約２０％）は、大きい再イメージング変位エラーを示し、より低い明るさを有する。かくして、それらのゲノム近隣の両方から遠くにある遺伝子座は、相対的に低い信頼性を有しうる。
コンビナトリアルゲノムスケールイメージングにおける適合ＤＮＡスポットのための復号化アルゴリズム。それぞれの遺伝子座の同定および３Ｄ局在特定を、以下の工程によって達成した：最初に、それぞれのビット画像（特定のイメージングラウンドにおける特定のカラーチャネルに対応する）における全ての同定されたスポットのドリフトおよび収差補正された位置に関する一覧を生成した。ビット画像毎のそれぞれの検出されたスポットについて、その位置から設定されたカットオフ距離（ｘ、ｙおよびｚにおいて約１５０ｎｍ）以内にある他のビット画像からの全てのスポットを見出した。スポット対によって産生されたバーコード（それらが出現するラウンドおよびカラーチャネルに基づく）が、正当なバーコード（すなわち、ゲノム遺伝子座に割り当てられたバーコード）に対応するかどうかに関係なく、全てのそのようなスポット対を、さらなる分析のために保持した。次いで、それぞれのスポット対について、３つの品質測定基準を算出した：２つのスポットの３Ｄ局在間の変位、２つのスポット間の明るさの差異、および２つのスポットの明るさの平均。それぞれのスポットの明るさを、対応するビット画像中の全スポットの明るさの中央値によって正規化した。次いで、スポット対を、それらが正当なバーコード（したがって、潜在的には、ゲノム遺伝子座）に対応するかどうかに基づいて、２つの群に分離した。各群内で、品質測定基準の分布を算出した。便宜上、無効なバーコードからのスポット対品質測定基準の分布を、「無効な分布」と称し、全ての正当なバーコードからのものを「正当な分布」と称する。それぞれのスポット対について、工程３における３つの品質測定基準を、「正当な分布」に対する全ての候補スポット対に関する合わせたＦｉｓｈｅｒのｐ値を算出することによって、単一の尺度に合わせた。これは、それぞれのスポット対の全体の品質スコアと考えられ、以下のように対あたりで算出した：３つの測定基準のそれぞれについて、より低い品質測定基準を有していた「正当な分布」における他のスポット対の比率を算出し、これらの３つの比率を乗算した。期待値最大化手順を使用して、それぞれの標的化されたクロマチン遺伝子座に対応する最も高い品質スコアを有する２つのスポット対を逐次的に選択し、「正当な分布」を再アップデートし、この最適化手順を収束まで繰り返した。収束後、それぞれクロマチン遺伝子座に対応する、最後のセットのスポット対を使用して、遺伝子座の３Ｄ空間位置を決定した。工程５の後、改変型Ｋ平均アルゴリズムを使用して、同じ染色体に属するクロマチン遺伝子座を２つのホモログに分離した。点を２つの群に分け、各群内の回転半径を最小化する標準的なＫ平均クラスタリングアルゴリズムとは反対に、点を、群間で進行的に切り替えて、最初にそれぞれのホモログ中の割り当てられた点の比率を最大化した後、それぞれのホモログの回転半径を最小化した。２つのホモログを分離した後、工程２からのそれぞれのスポット対のその質量中心および距離を、その親染色体の質量中心に対して算出した。染色体中心までの距離を、工程３において考慮した３つの測定基準に加えて別の品質測定基準として加え、工程３～６を繰り返した。最後に、工程７からのスポット対をフィルタリングして、品質スコアが「無効な分布」と依然として類似する対を除去した。工程８後の残りのスポット対を使用して、クロマチン遺伝子座の最終的な位置を決定し、クロマチン構造を追跡した。
コンビナトリアルゲノムスケールイメージングにおける適合ＲＮＡスポットのための復号化アルゴリズム。ＲＮＡイメージングラウンドからのシグナルを、以下の手順を使用して復号化した：最初に、各ラウンドのイメージングにおいて全ての同定されたスポットのドリフト補正および収差補正された位置について、一覧を生成した。全てのイメージングラウンドにおけるそれぞれの検出されたスポットについて、その位置からの設定されたカットオフ距離内にある他のラウンドからの全てのスポットが見出され、これらのスポット対を、それらが正当なバーコードを形成した場合、候補ＲＮＡバーストとして保持した。次いで、これらの候補ＲＮＡバーストのそれぞれの位置を、初期の画像登録（ＤＡＰＩ画像に基づく）ならびにドリフト補正および収差補正後に、関連遺伝子を有するＤＮＡ遺伝子座の位置と比較し、それらが設定された閾値距離内にある場合、保持した。次に、ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の登録を、上の「ＤＮＡイメージングとＲＮＡイメージングとの間の画像登録」の節に記載されたように、初期の復号化されたＲＮＡ局在（工程３からの）と、それらを有するＤＮＡ遺伝子座の位置との間の変位に基づいて精緻化した。最後に、全ての候補ＲＮＡバーストの位置を、今回、精緻化された画像登録を用いて、それらが復号化する遺伝子を有するＤＮＡ遺伝子座の位置と再度比較した。新生ＲＮＡ局在がこの段階でそれが存在するＤＮＡ遺伝子座からのカットオフ距離内にあった場合、それを、検出された転写バーストと考えた。
コンビナトリアルゲノムスケールイメージングにおいて再イメージングされた遺伝子座の同定。コンビナトリアルゲノムスケールイメージング手法では、第６染色体上の標的ゲノム領域のサブセットに、それらがコンビナトリアルイメージング後に逐次的多色ＦＩＳＨを使用して個別に再イメージングすることができるようなプローブを割り当てた。コンビナトリアルイメージングにおけるこれらの遺伝子座の１つのそれぞれの復号化された例について、コンビナトリアルイメージングにおいて決定された局在と、逐次的再イメージングラウンドにおける最も近いスポットとの間の距離として、変位エラーを推定した。
免疫蛍光イメージングからの核内構造体の同定。核内構造体（核スペックルおよび核小体）の位置を、免疫蛍光シグナルの強度に対して閾値を適用し、高い免疫蛍光シグナルを同定するピクセル化されたマスクを得ることによって、免疫蛍光シグナルから抽出した。次いで、これを、核内構造体を「含有」するピクセル化されたセットの位置として処理した。
抗ゲミニンおよびＤＡＰＩ画像からの細胞周期段階の決定。最初に、分裂を受けている細胞を、目視検査によって取り除き、分析のために考慮しなかった。次に、ゲミニン免疫蛍光シグナルと、ＤＡＰＩを使用して測定された核シグナルとの組合せを使用して、細胞を、以前の試験と同様にＧ１（低いゲミニンシグナル、低いＤＡＰＩシグナル）またはＧ２／Ｓ（高いゲミニンシグナル）として分類した。
核ラミナの位置の推定。所与の細胞中の全ての復号化されたクロマチン遺伝子座の位置の周囲に最小の３Ｄ凸包表面を生成することによって（ＰｙｔｈｏｎのＳｃｉＰｙパッケージを使用する）、核ラミナの位置を推定した。
空間距離。任意の遺伝子座対間の空間距離を、物理的距離に対するカメラピクセルおよびｚステップに関する適切な比率を乗じた、その適合された３Ｄガウス中心間のユークリッド距離として単純に算出した。核内構造体までの距離の場合、全ての同定された核内構造体の「位置」までの最小ユークリッド距離または核ラミナを規定する凸包の表面までの最小距離を算出した。
イメージングからの接近頻度マトリックス。任意の所与の遺伝子対の間の接近頻度を算出するために、設定されたカットオフ距離よりも小さい、その遺伝子座対間の測定距離の数を最初に計数した（別途記載しない限り、この試験では５００ｎｍ）。次いで、この数を、その遺伝子座対について測定された距離の総数で除算した。Ｈｉ－Ｃ接触マトリックスと共に様々なカットオフ閾値から得られる接近頻度マトリックス間のＰｅａｒｓｏｎ相関、ならびにＣｈｒ２１に関するイメージングデータおよびＨｉ－Ｃデータに由来する、ＴＡＤおよびコンパートメントなどのアンサンブル構造特徴のアラインメントを評価することによって、カットオフ距離を決定した。
接近頻度マップと、Ｈｉ－Ｃマップとの間のＰｅａｒｓｏｎ相関係数は、２００ｎｍ～８００ｎｍのカットオフ距離について０．８２～０．８８の範囲で大まかに一定のままであり、約４００～５００ｎｍで最大に達することがわかった。さらに、５００ｎｍ以下のカットオフ閾値については、イメージングデータに由来するＴＡＤ境界は、同様に高い精度でＨｉ－Ｃデータに由来するＴＡＤ境界と整列したが、６００ｎｍよりも大きいカットオフ距離については、アラインメントは低下した。より大きい規模では、Ａ／Ｂコンパートメントコーリングは、４００～６００のカットオフ距離に関して最も高いレベルの一致を示した。したがって、４００～５００ｎｍの範囲のカットオフ距離は、ＴＡＤとＡ／Ｂコンパートメントとの両方の正確なコーリングにとって最適であると考えられ、全ての分析について５００ｎｍのカットオフ距離を選択した。
局部密度分析。それぞれの復号化された位置でのコンパートメントＡおよびコンパートメントＢ遺伝子座の局部密度を算出するために、それぞれの細胞に関するクロマチン遺伝子座のそれぞれの対の間の空間距離を算出した。それぞれの遺伝子座について、局部Ａ／Ｂ密度比を、以下のように計算した：最初に、１００ｎｍ（Ｃｈｒ２１のイメージングについて）、１２５ｎｍ（Ｃｈｒ２のイメージングについて）、または５００ｎｍ（ゲノムスケールでのイメージングについて）の標準偏差で、それぞれのＡまたはＢ遺伝子座を中心とするガウス確率密度関数を置いた。次いで、遺伝子座での合計Ａ密度を、全染色体イメージングにおいて自身を除く全てのＡ遺伝子座からのこのガウス確率密度関数値の和として計算した。ゲノムスケールでのイメージングのために、遺伝子座での合計ｔｒａｎｓ Ａ密度を、全てのｔｒａｎｓ染色体Ａ遺伝子座（すなわち、他の染色体に由来する全てのＡ遺伝子座）から合計した。合計Ｂ密度を、同様の方法で計算した。最後に、コンパートメントＡ遺伝子座の合計密度を、コンパートメントＢ遺伝子座の密度で除算して、その遺伝子座でのＡ／Ｂ密度比を見出した。ｔｒａｎｓ Ａ／Ｂ密度比を、同様に計算した。
イメージングデータからの絶縁スコア。絶縁スコアは、アンサンブルＨｉ－Ｃについて以前に定義されている。イメージング結果のために同様の定義を使用し、単一細胞中の個々の染色体における近隣または非近隣ドメインの絶縁スコアを計算するために適用した。
２つのドメイン間の絶縁スコアを算出するために、第１のドメイン内の遺伝子座のそれぞれの対の間の全ての距離および第２のドメイン内の遺伝子座のそれぞれの対の間の全ての距離を考慮することによって、ドメイン内距離分布を算出した。次いで、異なるドメイン中に存在する遺伝子座の対の間の全ての距離を考慮することによって、ドメイン間距離分布を算出した。次いで、ドメイン内距離の中央値によって除した、全てのドメイン間距離の中央値として絶縁スコアを定義した。２つの高度に混合したドメインは、１に近い絶縁スコアを有するが、ちょうど接触しているドメインは、約２の絶縁スコアを有するであろう。
ＴＡＤコーリングのための正規化された絶縁スコア。イメージングデータおよびＨｉ－ＣデータにおけるＴＡＤコーリングの比較を可能にするために、これらのデータに由来する絶縁スコアが同じ動的範囲に適合するように、上で定義された絶縁スコアをわずかに改変した。イメージングデータに由来するペアワイズ距離中央値マトリックスにおけるＴＡＤコーリングのために、それぞれのゲノム遺伝子座について、固定ウィンドウを有する上流および下流の遺伝子座（すなわち、選択される遺伝子座のそれぞれの側の固定数の遺伝子座）を選択した。選択された遺伝子座の上流および下流の、これらの２つのクロマチン領域を、２つのドメインとして処理し、上記のように、絶縁スコアを計算した。次いで、正規化された絶縁スコアを、領域間距離の中央値と、領域内距離の中央値との和によって正規化された、これらの２つの中央値間の差異と定義した。したがって、正規化された絶縁スコアは、常に０～１であろう。正規化された絶縁スコアのこの定義を用いて、染色体に沿ってスライディングウィンドウを適用して、ゲノム遺伝子座に対応する絶縁スコアのベクトルを算出し、Ｓｃｉｐｙからの標準ピークコーリングアルゴリズムによって極大値を見出し、これらの位置をＴＡＤ境界と考えた。イメージングまたはＨｉ－Ｃ接触マトリックスに由来する接近頻度マトリックスを使用するＴＡＤ境界コーリングを、同様に実施した。
染色体内のＡ／Ｂ分離スコア。Ａ／Ｂ分離スコアは、染色体内のＡ遺伝子座とＢ遺伝子座との間の空間分離のレベルを定量する。この量を算出するために、最初に、Ａ高密度体積を、それぞれの染色体内で、Ａの密度スコアが上位２／３の範囲にある全てのＡ遺伝子座を含有する３Ｄ空間として操作的に定義した。Ｂ高密度体積を、同様の様式で操作的に定義した。ＡおよびＢ高密度体積の純度測定基準を、これらの体積内の全ての遺伝子座が、それぞれ、ＡおよびＢ遺伝子座である比率と定義した。最後に、Ａ／Ｂ分離スコアを、Ａ高密度およびＢ高密度体積の純度値の平均と定義した。この分離スコアは、ＡおよびＢ遺伝子座が完全に分離している場合、１であり、ＡおよびＢ遺伝子座が完全に混合している染色体は、約０．５の分離スコアを有するであろう。
コンビナトリアルＦＩＳＨによるＲＮＡイメージングにおける検出効率の推定。転写バースト事象の検出効率の推定を、以下のように実施した：最初に、ＲＮＡイントロンがイメージングされた遺伝子を有する全ての標的ゲノム遺伝子座を考慮した。これらのゲノム遺伝子座のいずれかについて、その対応するＲＮＡシグナルは、遺伝子が転写される場合に２つの予め定義されたビットで出現するはずである。これらの２つのビットのそれぞれが検出されない率（ｐ）を知ることは、ＲＮＡの検出効率の誘導を可能にする。その対応する遺伝子の２つの予想されるビットのうちの少なくとも１つにＲＮＡシグナルと共に局在する（約１５０ｎｍ以内）ゲノム遺伝子座のセットを同定した。次いで、工程１で同定されたクロマチン遺伝子座の合計セットから、その遺伝子の対応するビット（両方のビットではない）の正確に１つから、ＲＮＡシグナルと共局在する遺伝子座の比率（ｆ）を決定した。
に等しいはずである、測定されたｆ（８．４％）から、ｐ（４．４％）が推定された。最後に、両方のビットにおける共局在シグナルを検出するための全体的な検出効率を、式：
を使用して算出したところ、約９２％であることがわかった。
Ｈｉ－Ｃデータ分析。ＩＭＲ－９０細胞に関するＨｉ－Ｃデータを、ｓｔｒａｗから調達し、それを使用してロードした。個々の染色体におけるＡ／Ｂコンパートメントの同定のために、確立され公開されたプロトコールに従った。ＴＡＤの同定のために、「ＴＡＤコーリングの正規化された絶縁スコア」の節に記載された方法を使用した。イメージングデータに由来する接近頻度と、Ｈｉ－Ｃの接触回数との比較のために、標的領域を中心とするビンを創出し、これらのビンに関するＨｉ－Ｃデータを、より高い分解能のＨｉ－Ｃデータにおけるリード数を合計することによって入手した。
ＣＴＣＦおよびＲａｄ２１のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ分析。ＣＴＣＦおよびＲａｄ２１のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、ＥＮＣＯＤＥデータセットからダウンロードし、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓによってウィッグ形式に変換した。標的ゲノムセグメントに関するリード計数を収集し、それに応じてインプットによって正規化した。染色体に沿ったインプットにわたるＣＴＣＦまたはＲａｄ２１ ＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルエンリッチメントの極大値を、Ｓｃｉｐｙからの標準ピークコーリングアルゴリズムによってコールした。
本明細書においては、本開示のいくつかの実施形態が、記載および例示されたが、当業者は、機能を実施し、かつ／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つもしくは複数を得るための、他の様々な手段および／または構造を、たやすく想定し、このような変動および／または改変の各々は、本開示の範囲内にあるものとみなされる。より全般的に、当業者は、本明細書において記載される、全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示的であることを意図するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、具体的な適用、または本開示の教示が使用される適用に依存することをたやすく理解するであろう。当業者は、規定を超えない実験を使用して、本明細書において記載される、本開示の特異的実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であろう。したがって、前出の実施形態は、例だけを目的として提示されるものであり、付属の特許請求、およびこれらの均等物の範囲内において、本開示は、具体的に記載され、特許請求されたのと別の形でも実施されうることを理解されたい。本開示は、本明細書において記載される、各個別の特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、２つまたはこれを超える、このような特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法の、任意の組合せも、このような特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法が、相互に矛盾しない限りにおいて、本開示の範囲内に含まれる。
本明細書、および参照により組み込まれる文献が、相反し、かつ／または矛盾する開示を含む場合、本明細書に従うものとする。参照により組み込まれる、２つまたはこれを超える文献が、互いに対して、相反し、かつ／または矛盾する開示を含む場合は、新しい刊行日を有する文献に従うものとする。
本明細書において規定され、使用される、全ての定義は、辞書による定義、参照により組み込まれる文献における定義、および／または規定された用語の通常の意味に優先されて理解されるものとする。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞である、「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、逆のことが指し示されない限りにおいて、「少なくとも１つの」を意味するように理解されるものとする。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「および／または」という語句は、このように接続された要素の「一方または両方」、すなわち、ある場合には、連言的に存在し、他の場合には、選言的に存在する要素を意味するように理解されるものとする。「および／または」を伴って列挙される複数の要素は、同じ形において、すなわち、このように接続された要素のうちの「１つまたは複数」であると理解されるものとする。「および／または」節により、具体的に同定された要素以外に、具体的に同定された要素と関連する場合であれ、関連しない場合であれ、他の要素が存在してもよい。したがって、非限定例として述べると、「～を含むこと」などのオープンエンドの表現と共に使用される場合の、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、一実施形態においては、Ａだけを指す場合もあり（Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態においては、Ｂだけを指す場合もあり（Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態においては、ＡおよびＢの両方を指す場合もある（他の要素を含んでもよい）などである。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「または」とは、上記において規定された「および／または」と同じ意味を有するように理解されるものとする。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、要素の数またはリストのうちの、少なくとも１つの包含であるが、また、１つを超える数またはリストも含み、列挙されていない、さらなる項目を含んでもよいと解釈されるものとする。「～のうちの１つだけ」もしくは「～のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される場合の、「～からなること」など、逆のことが明確に指し示された用語だけが、要素の数またはリストのうちの、正確に１つの要素を指すことになる。全般的に、本明細書において使用される「または」という用語は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つだけ」、または「～のうちの正確に１つ」など、排他性の用語により先立たれている場合に限り、排他的代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を指し示すと解釈されるものとする。
１つまたは複数の要素を有するリストに言及して、本明細書および特許請求の範囲において使用される、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちの、任意の１つまたは複数から選択されるが、要素のリスト内において、具体的に列挙される、各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを、必ずしも含まず、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外しない、少なくとも１つの要素を意味するように理解されるものとする。この定義はまた、要素が、具体的に同定される要素に関連する場合であれ、関連しない場合であれ、「少なくとも１つの」という語句が指す要素のリスト内において、具体的に同定される要素以外に存在してもよいことを可能とする。したがって、非限定例として述べると、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、これと同義に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、これと同義に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態において、１つを超えるＡを含んでもよいが、Ｂは存在しない、少なくとも１つのＡを指す場合もあり（かつ、Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態において、１つを超えるＢを含んでもよいが、Ａは存在しない、少なくとも１つのＢを指す場合もあり（かつ、Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態において、１つを超えるＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡ、および１つを超えるＢを含んでもよい、少なくとも１つのＢを指す場合もある（かつ、他の要素を含んでもよい）などである。
数に言及して、本明細書において、「約」という語が使用される場合、本開示のさらに別の実施形態は、「約」という語により修飾されていない数も含むことを理解されたい。
また、逆のことが明確に指し示されない限り、本明細書において特許請求される、１つを超える工程または行為を含む、任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、列挙された方法の工程または行為の順序に、必ずしも限定されないことも理解されたい。
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書において、「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を保有すること」、「～を有すること」、「～を含有すること」、「～を伴うこと」、「～を保持すること」、「～から構成されること」など、全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、「～を含むがこれらに限定されないこと」を意味するように理解されるものとする。United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03において明示されている通り、「～からなること」および「～から本質的になる」という移行句だけが、それぞれ、クローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。

Claims (26)

  1. 単一の細胞内の少なくとも１００個の別個のゲノム遺伝子座をイメージングすることによって個々の細胞内のクロマチン構成を視覚化する方法であって、
    ａ）クロマチンを含む試料を複数の一次核酸プローブの集団と曝露することであって、ここで核酸プローブの各集団は、クロマチン内の空間的に隔てられた別個のゲノム遺伝子座にハイブリダイズし、各ゲノム遺伝子座は、エラーチェックおよび／またはエラー補正符号空間を形成する有効な符号語が割り当てられる、曝露すること；
    ｂ）各結合した一次核酸プローブ集団を、一次核酸プローブのリード配列にハイブリダイズする少なくとも２個の別個の蛍光リードアウトプローブと接触させることであって、ここで各リード配列は符号語の１個の位置に対応する、接触させること；
    ｃ）一次核酸プローブに結合したリードアウトプローブをイメージングすること；および、
    ｄ）ステップｂ）およびｃ）を１回または複数回の逐次的ハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドで反復すること
    を含む、方法。
  2. 接触させることおよびイメージングすることが、複数の核酸プローブのリード配列へのリードアウトプローブの結合に対応する符号語を創出する、請求項１に記載の方法。
  3. ゲノム遺伝子座が、創出された符号語および対応する有効な符号語に基づいて同定される、請求項２に記載の方法。
  4. クロマチンの三次元構成が、同定されたゲノム遺伝子座の空間的位置に基づいて視覚化される、請求項１に記載の方法。
  5. イメージングされたゲノム遺伝子座を活性クロマチンまたは不活性クロマチンとして分類することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  6. ゲノム遺伝子座に位置する遺伝子から転写される新生ＲＮＡをイメージングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 新生ＲＮＡをイメージングすることが複数の一次核酸プローブのプールを使用して行われ、ここで核酸プローブの各プールが別個の新生ＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、各転写物に少なくとも２であるハミング距離を有する有効な符号語が割り当てられる、請求項６に記載の方法。
  8. 核構造をイメージングすることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  9. 核構造が、核スペックルおよび核小体を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 少なくとも３０個のゲノム遺伝子座が、イメージングのために各染色体上で選択され、少なくとも１００個の別個のゲノム遺伝子座が単一の細胞においてイメージングされる、請求項１に記載の方法。
  11. １０００個を超えるゲノム遺伝子座が、個々の細胞においてイメージングされる、請求項１に記載の方法。
  12. ゲノム遺伝子座に位置する遺伝子から転写される１０００個を超える新生ＲＮＡをイメージングすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. クロマチン構成をその天然の構造的および機能的文脈に置く核構造をイメージングすることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  14. 一次核酸プローブが、ゲノム遺伝子座にハイブリダイズする標的配列およびリードアウトプローブに相補的なリードアウト配列を含み、ここで核酸プローブの各プールが同じリードアウト配列を含む、請求項１に記載の方法。
  15. アダプターオリゴヌクレオチドプローブの使用をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドが、５０回以上行われる、請求項１に記載の方法。
  17. ゲノム遺伝子座のサイズが、約３０ｋｂである、請求項１に記載の方法。
  18. クロマチンおよび各ゲノム遺伝子座に、２以上のハミング重みを有する１００ビットの二進コードが割り当てられる、請求項１に記載の方法。
  19. 各ハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドについて、１個、２個または３個のゲノム遺伝子座が標的とされる、請求項１８に記載の方法。
  20. ほぼ等しい数のゲノム遺伝子座が、イメージングラウンドのそれぞれでイメージングされる、請求項１８に記載の方法。
  21. 各ゲノム遺伝子座が、１色または２色の蛍光標識を使用してイメージングされる、請求項２０に記載の方法。
  22. 割り当てられた符号語が、同じ染色体上のゲノム遺伝子座間の距離を最大化するためのハミング距離を有するエラーチェックおよび／またはエラー訂正コード空間を有する、請求項１に記載の方法。
  23. コード空間内の有効な符号語は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６のハミング距離によって隔てられる、請求項２２に記載の方法。
  24. 有効な符号語は二進であり、すべての有効な符号語は同じ数の「１」ビットを有する、請求項２２に記載の方法。
  25. 異なるシグナル発生実体に関連する複数のリードアウトプローブの同時イメージングおよび同時決定を可能にするために、各ラウンドで多色イメージングが使用される、請求項１に記載の方法。
  26. ステップａ）の後、試料が、１ラウンドの１個または複数個のアダプターに曝露され、ここで各アダプターが、リードアウト配列のうちの１つに実質的に相補的な第１の部分と、１つの同定配列を含む第２の部分とを含み；
    方法が、１個または複数個の同定配列を決定するために、試料を１ラウンドの１個または複数個のリードアウトプローブに曝露することであって、各リードアウトプローブは、同定配列のうちの１つと実質的に相補的な配列を含む第１の部分と、シグナル伝達実体を含む第２の部分とを含む、曝露することを含む、
    請求項１に記載の方法。
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