JP7850965B2 - トリプシン又はｔｍｐｒｓｓ２の分解用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物に関する。より具体的には、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患用医薬部外品に関する。本願は、２０２１年１月１９日に米国に仮出願されたＵＳ６３／１３８，７９８号、及び、２０２１年８月４日に米国に仮出願されたＵＳ６３／２２９，０７７号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。

消化管は、無数の食物及び微生物由来の分子に恒常的にさらされているユニークな器官である。消化管は、外部からの内容物に加えて、消化酵素等の宿主由来の分子にも遭遇する。上部腸では、食事で摂取した多量の栄養素をより小さな成分に分解し、体内に吸収するために、消化酵素が重要な役割を果たしている。一方、大腸では主に水分を吸収しており、消化酵素は必要なく、むしろその活性の乱れが微生物叢の組成の変化、粘膜バリアーの崩壊、炎症の発生に関与しているとされている。

腸管組織は、恒常性とバリアー機能を維持するために、ムチンや酵素不活性化分子の産生等、様々な調節機構や保護機構を備えている。また、腸内微生物叢は、内腔の物質を減少させたり変化させたりすることで、安定した環境の維持に大きく貢献していることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。

J. L. Round and S. K. Mazmanian, The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease, Nature reviews immunology, 9, 313-323, 2009.

しかしながら、微生物による管腔内タンパク質の制御の詳細は、完全には解明されていない。特に、大腸内に残存する消化酵素の制御に関連する微生物の属性については、まだほとんど解明されていない。本発明は、大腸内に残存するプロテアーゼの制御に関連する微生物の機能を解明し、プロテアーゼの活性を制御する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［２］００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、及び、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［３］配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［４］配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［５］前記細菌がｔｙｐｅ ＩＸ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ９ＳＳ）を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［６］前記Ｔ９ＳＳが、ＰｏｒＶタンパク質、ＰｏｒＵタンパク質、ＰｏｒＮタンパク質、ＰｏｒＭタンパク質、ＰｏｒＬタンパク質、ＰｏｒＫタンパク質又はＰｏｒＰタンパク質を含む、請求項５に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［７］前記細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｉｌｉａ属又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ属に属する細菌である、［１］～［６］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［８］前記Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａであり、前記Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓからなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、［７］に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［９］前記細菌が、配列番号３の塩基配列若しくは配列番号４の塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌、又は、配列番号３の塩基配列若しくは配列番号４の塩基配列に対して９７％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である、［１］～［８］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１０］前記細菌が、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３０３、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３３５、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０２８８、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０４１０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０４３５及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、［１］～［６］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１１］前記細菌が生菌である、［１］～［１０］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１２］前記細菌が死菌である、［１］～［１０］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１３］００５０２タンパク質若しくは前記００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは前記００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１４］００５０２タンパク質若しくは前記００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、及び、００５０９タンパク質若しくは前記００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１５］トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療用である、［１］～［１４］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１６］前記トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患が、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、過敏性腸炎、感染症、急性膵炎又は慢性膵炎である、［１］～［１５］のいずれかに記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１７］前記感染症が、ウイルス感染症又は細菌感染症である、［１６］に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１８］前記炎症性腸疾患、過敏性腸炎又は感染症が、ＴＭＰＲＳＳ２又はＩｇＡが関わる疾患である、［１６］又は［１７］に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
［１９］００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を検出するための特異的結合物質を含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬。
［２０］配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬。
［２１］００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を有する細菌を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患用医薬部外品。
［２２］００５０２タンパク質若しくは前記００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは前記００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患用医薬部外品。

本発明によれば、プロテアーゼの活性を制御する技術を提供することができる。

図１は、実験例１におけるプロテオミクス解析の結果を示す図である。 図２は、実験例１における、特定病原体フリー（ＳＰＦ）マウス及び無菌（ＧＦ）マウスの糞便のトリプシン活性試験の結果を示すグラフである。 図３は、実験例１における、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの糞便のウエスタンブロット解析によりアニオン性トリプシンプロテアーゼ（ＰＲＳＳ２）を検出した結果を示す写真である。 図４は、実験例１における、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの大腸切片の免疫染色により、粘液（ＵＥＡ１）及びアニオン性トリプシンプロテアーゼ（ＰＲＳＳ２）を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図５は、実験例１において、ＧＦマウスとＳＰＦマウスの小腸と大腸の異なる場所におけるトリプシン活性を測定した結果を示すグラフである。 図６は、実験例２において、健常人ドナーから採取した糞便サンプルを投与した、ＧＦマウスにおける糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。 図７は、実験例２における、各群のマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。 図８は、実験例２において、トリプシンの分解を測定したウエスタンブロットの結果を示す写真である。 図９は、実験例２において、ヒトトリプシンの分解を測定したウエスタンブロットの結果を示す写真である。 図１０は、実験例２において、様々な細菌のトリプシン分解能を測定したウエスタンブロットの結果を示す写真である。 図１１は、実験例３において、組換えマウスＰＲＳＳ２（ｒｍＰＲＳＳ２）を、プロテアーゼ阻害剤で前処理した後にＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図１２は、実験例３において、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 図１３は、実験例３において、ツニカマイシンで前処理したＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図１４は、実験例３において、ツニカマイシン処理を行ったＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）又はツニカマイシン処理を行わなかったＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を、ｒｍＰＲＳＳ２とそれぞれインキュベートし、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 図１５は、実験例３において、Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）、Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＪＣＭ１４８６０）及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）のゲノム中のＩＸ型分泌機構（Ｔ９ＳＳ）の遺伝子構成のアライメントを示す模式図である。 図１６は、実験例３において、ＰｏｒＵの発現を欠失させる相同組換えを説明する模式図である。 図１７は、実験例３において、変異Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）をｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図１８は、実験例３において、野生型Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）又は一連の変異体Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）を介したｒｍＰＲＳＳ２分解のウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。 図１９は、実験例３において、Ｐ．ｃｌａｒａ（Δ００５０２）及びＰ．ｃｌａｒａ（Δ００５０９）を、ｒｍＰＲＳＳ２とそれぞれインキュベートし、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 図２０は、実験例３において、Ｐ．ｃｌａｒａ（Δ００５０２）及びＰ．ｃｌａｒａ（Δ００５０９）を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図２１は、実験例３で解析した、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株のゲノム配列を示す模式図である。 図２２は、実験例３において、００５０２～００５０９遺伝子のそれぞれを欠失させたＰ．ｃｌａｒａ変異株を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図２３は、実験例４において、ＦＩＴＣ標識したカゼインの切断によって、組換え００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質のプロテアーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。 図２４は、実験例４において、遊離型の組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質、又は、組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質をマイクロビーズに結合したものをｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図２５は、実験例４において、組換え００５０２タンパク質、組換え００５０９タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をマイクロビーズ結合させたものを、ｒｍＰＲＳＳ２と一緒にインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２とタンパク質結合ビーズの結合状態を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 図２６は、実験例４において、ＧＦマウスの盲腸内容物を、培地コントロール（－）又はマイクロビーズに結合させた組換え００５０２タンパク質とインキュベートし、トリプシンの分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図２７は、発明者らが提唱する、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌を介したトリプシン分解のモデルである。 図２８は、実験例５において、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便中のＰ．ｃｌａｒａ株のＤＮＡを定量した結果を示すグラフである。 図２９は、実験例５において、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。 図３０は、実験例５において、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２）を、３４－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。 図３１は、実験例５において、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便中の各タンパク質をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図３２は、実験例５において、ＧＦマウスの糞便、２－ｍｉｘと共に野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種したＧＦマウスの糞便、上記２者を混合した試料、上記２者を混合したものにトリプシン阻害剤（ＴＣＬＫ）を添加した試料中の各タンパク質をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図３３は、実験例６において、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の各群のマウスの体重変化を示すグラフである。 図３４上段は、実験例６における、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染から７日後の各マウスの大腸の画像である。図３４下段は、実験例６における、盲腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真である。 図３５は、実験例６における、ヘマトキシリン・エオジン染色に基づく盲腸組織の組織学的スコアを示すグラフである。 図３６は、実験例６において、糞便中の各タンパク質をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図３７は、実験例６において、生きたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍと糞便液のｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションによって、糞便ＩｇＡによる凝集効果を評価した結果を示す写真である。 図３８は、実験例７の実験スケジュールを示す模式図である。 図３９は、実験例７における、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のマウス体重の変化を示すグラフである。 図４０は、実験例７において、盲腸パッチにおけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵの測定値を示すグラフである。 図４１は、実験例７において、管腔内容物におけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵの測定値を示すグラフである。 図４２は、実験例７において、盲腸管腔内容物中の各タンパク質をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。 図４３は、実験例８における、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）感染実験の概要を説明する模式図である。 図４４は、実験例８における、ＭＨＶ感染後のマウスの生存曲線を示すグラフである。 図４５は、実験例８において、肝臓、脳、糞便中のＭＨＶのウイルスタイターを測定した結果を示すグラフである。 図４６は、実験例８における、各群のマウスの肝臓組織のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す代表的な画像である。 図４７は、実験例９において、計算機上で検索した、トリプシン分解に関連する遺伝子（００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子）のホモログ及びそれをコードする種を示す図である。 図４８は、実験例９において、各細菌種におけるトリプシン分解に関連する遺伝子の遺伝子座の構造及びＰ．ｃｌａｒａ株の遺伝子に対する配列同一性（％）を示す図である。 図４９は、実験例９における、日本人コホートの非ＩＢＤ対照群（健常人）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）群、クローン病（ＣＤ）群の患者の糞便中のトリプシン活性の測定結果を示すグラフである。 図５０は、実験例９において、ＰＲＩＳＭコホート及びＨＭＰ２コホートの、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）と診断された患者の集団における、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの保菌率を示すグラフである。 図５１は、実験例９において、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ株によるトリプシンの分解を測定した結果を示す写真である。 図５２は、実験例９において、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（ＭＳＰ ００８１）株によるトリプシン分解活性を測定した結果を示す写真である。 図５３は、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び／又は、００５０９タンパク質若しくはそのホモログと、抗体定常領域との融合タンパク質の一例を示す模式図である。

［トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物］
一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物を提供する。

実施例において後述するように、発明者らは、００５０２タンパク質を有する細菌又は００５０９タンパク質を有する細菌が、菌体の表面にトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を吸着し、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の自己消化によりトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解することを明らかにした。

したがって、００５０２タンパク質を有する細菌又は００５０９タンパク質を有する細菌を有効成分として含有する組成物を、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解の用途に使用することができる。したがって、本実施形態の組成物は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解剤であるということもできる。

トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解は、工業用の用途に使用することもできるし、後述するように医薬用の用途に使用することもできる。

後述する、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８５９」）の００５０２タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢのアクセッション番号は、Ｇ５ＳＮＣ９である。また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株の００５０２タンパク質はＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）にコードされる。ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＺ＿ＪＨ３７６５９１ ＲＥＧＩＯＮ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（８７３４０．．９１１３１）である。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＹＩＴ １１８４１）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８６０」）の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＹＩＴ １１８４１）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５１４１」）の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１３に示す。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５２４３」）の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ（ＰＭＵＲ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０３７２２」）の００５０２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６に示し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ（ＰＭＵＲ）株の００５０２タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。

後述する、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８５９」）の００５０９タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢのアクセッション番号は、Ｇ５ＳＮＣ１である。また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株００５０９タンパク質はＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）にコードされる。ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＺ＿ＪＨ３７６５９１ ＲＥＧＩＯＮ：７３８４８．．７６９３１である。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１８に示し、ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株の００５０９タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２０に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株の００５０９タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２２に示す。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＹＩＴ １１８４１）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８６０」）の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に示し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＹＩＴ １１８４１）株の００５０９タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２４に示す。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５１４１」）の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２５に示し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株の００５０９タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２６に示す。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５２４３」）の００５０９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に示し、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株の００５０９タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２８に示す。

実施例において後述するように、本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、又は、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌を有効成分とするものであってもよい。

００５０２タンパク質のホモログとしては、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質が挙げられる。００５０２タンパク質のホモログを有する細菌は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２結合能を有し、更にトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解する活性を有することが好ましい。

００５０９タンパク質のホモログとしては、配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質が挙げられる。００５０９タンパク質のホモログを有する細菌は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２結合能を有し、更にトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解する活性を有することが好ましい。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、「有効成分として含有する」とは、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌を、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解するのに十分な量を含むことを意味する。あるいは、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌を、主要な活性成分として含むことを意味する。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、００５０２タンパク質又は００５０２タンパク質のホモログを有する細菌とは、００５０２タンパク質又は００５０２タンパク質のホモログを発現する細菌を意味する。

００５０２タンパク質を発現する細菌は、００５０２タンパク質をコードするＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子（配列番号１）を有する細菌であってもよい。また、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌は、配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡをコードする遺伝子を有する細菌であってもよい。００５０２タンパク質は、細菌に内在する遺伝子由来であってもよく、外来遺伝子由来であってもよい。

同様に、００５０９タンパク質又は００５０９タンパク質のホモログを有する細菌とは、００５０９タンパク質又は００５０９タンパク質のホモログを発現する細菌を意味する。

００５０９タンパク質を発現する細菌は、００５０９タンパク質をコードするＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子（配列番号２）を有する細菌であってもよい。また、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌は、配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡをコードする遺伝子を有する細菌であってもよい。００５０９タンパク質は、細菌に内在する遺伝子由来であってもよく、外来遺伝子由来であってもよい。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解活性を有する限り、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌のみを含有していてもよいし、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌のみを含有していてもよいし、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、及び、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌の双方を含有していてもよい。あるいは、本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌を含有していてもよい。このような細菌は遺伝子改変等により作製することができる。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌は、ｔｙｐｅ ＩＸ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＸ型分泌機構、Ｔ９ＳＳ）を有することが好ましい。

また、Ｔ９ＳＳが、ＰｏｒＶタンパク質、ＰｏｒＵタンパク質、ＰｏｒＮタンパク質、ＰｏｒＭタンパク質、ＰｏｒＬタンパク質、ＰｏｒＫタンパク質又はＰｏｒＰタンパク質を含むことが好ましい。

実施例において後述するように、発明者らは、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログが、Ｔ９ＳＳにより外膜を越えて細菌の表面に輸送され、細菌表面に結合することを明らかにした。

例えば、後述するＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ株において、ＰｏｒＶタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２２４４５．１であり、ＰｏｒＵタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２２４４３．１であり、ＰｏｒＮタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２３２１０．１であり、ＰｏｒＭタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２３２１１．１であり、ＰｏｒＬタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２３２１３．１であり、ＰｏｒＫタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２３２１５．１であり、ＰｏｒＰタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＷＰ＿００８６２３２１７．１である。また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ株以外の細菌においては、当該細菌におけるこれらのタンパク質のホモログがＴ９ＳＳを構成する。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｉｌｉａ属又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ属に属する細菌であってもよい。

実施例において後述するように、発明者らは、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｉｌｉａ属又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ属に属する細菌が、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解することを明らかにした。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌としては、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３０３、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３３５等が挙げられる。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌としては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ等が挙げられる。

Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する細菌は、配列番号３の塩基配列若しくは配列番号４の塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、又は、配列番号３の塩基配列若しくは配列番号４の塩基配列に対して９７％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列同一性が９７％以上であると、同じ種に属する細菌であると判断される。

配列番号３に記載の塩基配列は、後述するＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＹＩＴ １１８４０）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８５９」）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号２９に記載の塩基配列は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号４に記載の塩基配列は、後述するＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ （８２Ａ６）株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号３０に記載の塩基配列は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＹＩＴ １１８４１）株（カタログ番号「ＪＣＭ：１４８６０」）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３０３、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＳＰ ０３３５、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０２８８、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０４１０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｓｐ．ＭＳＰ ０４３５及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからなる群より選択される少なくとも１種の細菌であってもよい。

Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａとしては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（ＭＳＰ ００８１）株、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株が挙げられる。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍとしては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５２４３」）が挙げられる。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓとしては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ（ＰＭＵＲ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０３７２２」）が挙げられる。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓとしては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍａｓｓｉｌｉａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ（ＭＳＰ ０２２４）株が挙げられる。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとしては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）株が挙げられる。

実施例において後述するように、発明者らは、これらの細菌が、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解することを明らかにした。

配列番号３１に記載の塩基配列は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（１０９）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５１４１」）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号３２に記載の塩基配列は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（ＰＪ１Ａ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０５２４３」）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号３３に記載の塩基配列は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ（ＰＭＵＲ）株（カタログ番号「ＤＳＭ：１０３７２２」）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、上記の細菌は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解活性を有する限り、生菌であってもよいし、死菌であってもよい。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、例えば、溶液又は懸濁液等の水性形態若しくは半固体形態で埋め込まれている、粉末形態又は凍結乾燥形態等で上記の細菌を含有していてもよい。一態様において、組成物又は細菌は、凍結乾燥されている。一態様において、組成物中の細菌のサブセットは凍結乾燥されている。細菌を含む組成物を凍結乾燥する方法は、当該技術分野において周知である。例として、米国特許第３２６１７６１号明細書、米国特許第４２０５１３２号明細書、国際公開第２０１２／０９８３５８号を参照することができる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

細菌は、組み合わせとして凍結乾燥されてもよく、別々に凍結乾燥され、組み合わされてもよい。細菌は、他の細菌と組み合わされる前に薬学的に許容される担体と組み合わされてもよい。複数の凍結乾燥された細菌は、凍結乾燥された形態において組み合わされてもよい。一度組み合わせられた細菌の混合物は、続いて、薬学的に許容される担体と組み合わされてもよい。一態様において、細菌は、凍結乾燥された固形物である。一態様において、組成物は、凍結乾燥された固形物である。

一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質若しくは前記００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは前記００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物を提供する。

実施例において後述するように、発明者らは、００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質が、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解することを明らかにした。ここで、００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質は、固相表面に固定されていることが好ましい。

固相としては、特に限定されず、樹脂、ガラス、金属等を材料とする粒子、プレート、チューブ等の容器の表面、樹脂を材料とする膜等が挙げられる。粒子は磁気粒子であってもよい。

固相は、薬学的に許容される固相であってもよい。薬学的に許容される固相としては、リポソーム、タンパク質ナノ粒子、脂質ナノ粒子等の高分子ナノ粒子、鉄ナノ粒子、リピッドマイクロスフェア等のナノエマルジョン、ミセル、ワクチンアジュバント、ナノ結晶等が挙げられる。薬学的に許容される固相は、独立行政法人医薬品医療機器総合機構（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ａｇｅｎｃｙ、ＰＭＤＡ）、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ、ＥＭＡ）により承認されたものであることが好ましい。

００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質の固相への固定方法は、特に限定されず、化学リンカーによる結合、アビジン－ビオチンによる結合、物理的吸着等が挙げられる。

実施例において後述するように、本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質のホモログを有効成分とするものであってもよい。

００５０２タンパク質のホモログとしては、上述したものと同様であり、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質が挙げられる。００５０２タンパク質のホモログは、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２結合能を有することが好ましい。

００５０９タンパク質のホモログとしては、上述したものと同様であり、配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有し、且つトリプシン結合能を有するタンパク質が挙げられる。００５０９タンパク質のホモログは、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２結合能を有することが好ましい。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物において、「有効成分として含有する」とは、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解するのに十分な量を含むことを意味する。あるいは、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを、主要な活性成分として含むことを意味する。

００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログは、タンパク質精製のため、タンパク質検出のため、あるいは固相への結合のために、ペプチドタグを付加されていてもよい。ペプチドタグとしては特に限定されず、例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ等が挙げられる。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解活性を有する限り、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログのみを含有していてもよいし、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログのみを含有していてもよいし、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログの双方を含有していてもよい。

本実施形態に係るトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物が、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくはそのホモログの双方を含有する場合、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくはそのホモログは、結合していてもよい。

ここで、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくはそのホモログは、直鎖状に結合していてもよく、環状に結合していてもよい。また、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び、００５０９タンパク質若しくはそのホモログは、直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）が１～４回反復したアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられる。

００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び／又は、００５０９タンパク質若しくはそのホモログは、抗体定常領域との融合タンパク質の形態であってもよい。抗体定常領域は、ヒト抗体由来の定常領域であってよく、ヒトＩｇＧ型抗体由来の定常領域であってよい。

図５３は、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び／又は、００５０９タンパク質若しくはそのホモログと、抗体定常領域との融合タンパク質の一例を示す模式図である。図５３中、「Ｐｒｏｔｅｉｎ」は００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくはそのホモログを示し、「ＣＨ２」は抗体定常領域ＣＨ２ドメインを示し、「ＣＨ３」は抗体定常領域ＣＨ３ドメインを示す。

図５３に示すように、００５０２タンパク質若しくはそのホモログ、及び／又は、００５０９タンパク質若しくはそのホモログと、抗体定常領域は、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）が１～４回反復したアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられる。

［トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療用医薬組成物］
一実施形態において、上述したトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療用であってもよい。すなわち、一実施形態において、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療用医薬組成物を提供する。本実施形態の医薬組成物は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有効成分とする。

本実施形態の医薬組成物において、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログ、これらを有する細菌については上述したものと同様である。

本実施形態の医薬組成物において、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患としては、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、過敏性腸炎、急性膵炎、慢性膵炎等が挙げられる。

あるいは、本実施形態の医薬組成物において、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患としては、感染症が挙げられる。感染症としては、ウイルス感染症、細菌感染症が挙げられる。また、上記炎症性腸疾患、過敏性腸炎又は感染症としては、ＴＭＰＲＳＳ２又はＩｇＡが関わる疾患が挙げられる。ＴＭＰＲＳＳ２が感染に関わる感染症としては、コロナウイルス感染症等が挙げられる。ＩｇＡが関わる感染症としては、サルモネラ感染症等が挙げられる。

本実施形態の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化されていてもよい。薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。

本実施形態の医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油等の香味剤、ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤、リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤等が挙げられる。

本実施形態の医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

本実施形態の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、液剤、注腸剤、坐剤等が挙げられる。錠剤、散剤、カプセル剤、液剤は経口投与される。注腸剤、坐剤は腸内に投与される。医薬組成物は、有効成分（００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログを有する細菌、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のホモログ、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のホモログ）を腸に送達できる剤型であることが好ましい。

医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、有効成分が生菌である場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１回から数回投与することが考えられる。また、有効成分が死菌又はタンパク質である場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日あたり１回から数回投与することが考えられる。

本実施形態の医薬組成物は医薬部外品であってもよい。医薬部外品とは、特定の効能、効果が認められる製品であって、人体に対する作用が緩和なものをいう。本実施形態の医薬部外品としては、特に限定されないが、ドリンク剤、健胃薬、整腸薬等の形態が挙げられる。

［トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬］
一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、を検出するための特異的結合物質を含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬を提供する。

すなわち、本実施形態の診断薬は、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログを、タンパク質レベルで検出するための特異的結合物質を含む。

特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。

本実施形態の診断薬において、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログ、これらを有する細菌については上述したものと同様である。また、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患についても上述したものと同様である。

本実施形態の診断薬を用いて、対象由来の生体試料における、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログ、又はこれらを有する細菌の存在の有無を検出することができる。

本実施形態の診断薬による検出原理は特に限定されず、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラテラルフローイムノアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。

対象由来の生体試料としては、便試料等が挙げられる。本実施形態の診断薬を用いて、対象由来の生体試料中に、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログ、又はこれらを有する細菌の存在が検出された場合、対象は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患していないと判断することができる。

対象由来の生体試料中に、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログ、又はこれらを有する細菌の存在が検出されなかった場合、対象は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患している可能性があると判断することができる。この場合には、対象に上述した医薬組成物又は医薬部外品を投与することにより、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の症状を治療又は緩和することができる。

一実施形態において、本実施形態の診断薬は、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、００５０９タンパク質のホモログを、遺伝子レベルで検出するものであってもよい。

すなわち、一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質をコードするＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子若しくは前記ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は、００５０９タンパク質をコードするＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子若しくは前記ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断薬を提供する。いいかえると、本実施形態の診断薬は、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子、を検出するためのプライマーセット又はプローブを含む。

ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子、ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子については上述したものと同様である。

ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５８遺伝子の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子とは、上述した００５０２タンパク質のホモログをコードする遺伝子である。

また、ＨＭＰＲＥＦ９４４１＿００８５０遺伝子の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子とは、上述した００５０９タンパク質のホモログをコードする遺伝子である。

本実施形態の診断薬を用いて、対象由来の生体試料における、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌の存在の有無を検出することができる。

本実施形態の診断薬による検出原理は特に限定されず、例えば、ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、メタゲノム解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析等が挙げられる。

対象由来の生体試料としては、上述したものと同様であり、便試料等が挙げられる。本実施形態の診断薬を用いて、対象由来の生体試料中に、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌の存在が検出された場合、対象は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患していないと判断することができる。

対象由来の生体試料中に、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌の存在が検出されなかった場合、対象は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患している可能性があると判断することができる。

この場合には、対象に上述した医薬組成物又は医薬部外品を投与することにより、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の症状を治療又は緩和することができる。

［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、又は、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子若しくは配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象由来の生体試料における、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のホモログ、００５０９タンパク質、又は、００５０９タンパク質のホモログの存在の有無を検出する工程であって、前記タンパク質又はホモログの存在が検出されなかったことが、前記対象がトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患していることを示す工程と、前記タンパク質又はホモログの存在が検出されなかった場合に、前記対象に、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質の有効量を投与する工程とを含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断及び治療方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、対象由来の生体試料における、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のホモログを有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のホモログを有する細菌、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、又は、配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌の存在の有無を検出する工程であって、前記タンパク質若しくは前記ホモログ若しくは前記遺伝子を有する細菌の存在が検出されなかったことが、前記対象がトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患に罹患していることを示す工程と、前記タンパク質若しくは前記ホモログ若しくは前記遺伝子を有する細菌の存在が検出されなかった場合に、前記対象に、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、００５０２タンパク質若しくは００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、又は、００５０９タンパク質若しくは００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質の有効量を投与する工程とを含む、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の診断及び治療方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療のための組成物であって、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、又は、配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌を有効成分として含有する組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療のための医薬組成物であって、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、００５０９タンパク質、又は、００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療のための医薬組成物を製造するための、００５０２タンパク質を有する細菌、００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、配列番号１に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌、００５０９タンパク質を有する細菌、００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質を有する細菌、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子を有する細菌、又は、配列番号２に記載の塩基配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する細菌の使用を提供する。

一実施形態において、本発明は、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療のための医薬組成物を製造するための、００５０２タンパク質、００５０２タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質、００５０９タンパク質、又は、００５０９タンパク質のアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有するタンパク質の使用を提供する。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料及び方法］
（マウス）
特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件又は無菌（ＧＦ）条件で飼育されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、三共ラボラトリーズジャパン、ＳＬＣジャパン、チャールズリバージャパン又はＣＬＥＡジャパンから購入した。ＧＦマウスおよびノトバイオート（ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ）マウスは、理化学研究所生命医科学研究センターのｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ施設内で繁殖・維持された。すべての動物実験は、理研横浜研究所の動物実験委員会の承認を得た。

（細菌株）
Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＪＣＭ１４８６０）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ（ＪＣＭ１３４６４）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＪＣＭ１３４４９）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒｅａ（ＪＣＭ１３４６９）及びＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｕｌｏｒｕｍ（ＪＣＭ１４９６６）は、Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）から入手した。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（Ｐ２３７Ｅ３ｂ）及び（Ｐ３２２Ｂ５）は、Ｖｅｄａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから提供を受けた。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）は、発明者らが単離した。

（盲腸内容物のプロテオーム解析）
プロテアーゼインヒビター入りのＴｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）でピペッティングと混合を行い、盲腸内容物中のタンパク質を抽出した。続いて、１５，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離して不溶物を除去した後、上清を新しいチューブに移し、２５％トリクロロ酢酸（最終濃度１２．５％ｖ／ｖ）を加え、４℃で１時間インキュベートした。続いて、１５，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離して上澄みを除去した後、沈殿物をアセトンで２回洗浄し、蓋を開けて乾燥させた。続いて、乾燥させた試料を、０．５％ドデカン酸ナトリウムと１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に水浴式ソニケーター（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ－２００，ＳｏｎｉｃＢｉｏ Ｃｏｒｐ）を用いて再溶解した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより再溶解したサンプルのタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度を１μｇ／μＬに調整した。ショットガンプロテオーム解析の前処理は、既報（Kawashima Y., et al., Optimization of Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry for Deep and Highly Sensitive Proteomic Analysis, Int J Mol Sci., 20 (23),5932, 2019.）に記載の通りに行った。

ペプチドは、２．７μｍのコアシェルＣ１８粒子（ＣＡＰＣＥＬＬ ＣＯＲＥ ＭＰ ２．７μｍ、１６０Å ｍａｔｅｒｉａｌ、大阪曹達株式会社）をインハウスで充填した７５μｍ×１５ｃｍのＰｉｃｏＦｒｉｔエミッタ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に直接注入し、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ ｅｋｓｐｅｒｔ ｎａｎｏＬＣ ４００ ＨＰＬＣシステム（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、３００ｎＬ／分の流速で１８０分間のグラジエントをかけて分離した。

カラムから溶出したペプチドは、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００＋質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、ショットガンＭＳ及びＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ）－ＭＳ分析を行った。ショットガンＭＳを用いた実験では、４００～１０００ｍ／ｚの範囲で２５０ミリ秒の間、ＭＳ１スペクトルを収集した。電荷状態が２＋から５＋で１５０カウント／秒を超える上位２５個のプリカーサーイオンを選択し、ローリングコリジョンエネルギーでフラグメンテーションを行い、１００～１５００ｍ／ｚの範囲で１００ミリ秒の間、ＭＳ２スペクトルを収集した。ダイナミックエクスクルージョン時間は２４秒に設定した。

ＳＷＡＴＨ－ＭＳを用いた実験では、質量分析計を、連続したデータに依存しない取り込みモードで動作させ、プレカーサー分離ウィンドウで１２ｍ／ｚずつ増加させた。分離幅１３ ｍ／ｚ（ウィンドウのオーバーラップは１ｍ／ｚ）を使用して、４００～１０００ｍ／ｚのプリカーサー質量範囲をカバーする５０個のウィンドウのセットを構築した。ＳＷＡＴＨ ＭＳ２スペクトルは、ＭＳ２実験ごとに６０ミリ秒の間、１００～１５００ｍ／ｚの範囲で行われた。各ＭＳ２実験では、ローリングコリジョンエネルギーを用いて前駆イオンをフラグメント化した。

すべてのショットガンＭＳファイルは、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウエアｖ．４．５とＰａｒａｇｏｎアルゴリズム（Ｓｃｉｅｘ）を用いて、マウスのＵｎｉＰｒｏｔリファレンスプロテオーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ ｉｄ ＵＰ００００００５８９、レビュー済み、ｃａｎｏｎｉｃａｌ）と照合し、タンパク質の同定を行った。

タンパク質の信頼性の閾値は、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔの未使用スコアが１．３で、少なくとも１つのペプチドが９５％の信頼性を持つものとした。今回の研究では、ペプチドとタンパク質の両方において、グローバルな偽発見率は１％未満であった。同定されたタンパク質は、ＰｅａｋＶｉｅｗ ｖ．２．２（Ｓｃｉｅｘ）を用いてＳＷＡＴＨ－ＭＳデータから定量された。

（Ｐ．ｃｌａｒａの培養上清のプロテオーム解析）
Ｐ．ｃｌａｒａの培養上清に２５％トリクロロ酢酸（最終濃度１２．５％ｖ／ｖ）を加え、４℃で１時間インキュベートした。続いて、１５，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離して上澄みを除去した後、沈殿物をアセトンで２回洗浄し、蓋を開けて乾燥させた。続いて、乾燥した試料を、水浴型ソニケーター（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ－２００）を用いて、０．５％ドデカン酸ナトリウムと１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に再溶解した。ＢＣＡアッセイにより再溶解したサンプルのタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度を１μｇ／μＬに調整した。ショットガンプロテオーム解析の前処理は、上述した通りに行った。

ペプチドは、２．７μｍのコアシェルＣ１８粒子をインハウスで充填した７５μｍ×２０ｃｍのＰｉｃｏＦｒｉｔエミッターに５０℃で直接注入した後、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ ＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、１００ｎＬ／分の流速で８０分間のグラジエントをかけて分離した。カラムから溶出したペプチドは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてオーバーラップウインドウＤＩＡ－ＭＳで分析した。ＭＳ１スペクトルは４９５～７８５ｍ／ｚの範囲で３０，０００の分解能で収集し、自動ゲインコントロールの目標値を３×ｅ^６、最大注入時間を５５に設定した。

ＭＳ２スペクトルは、自動ゲインコントロールの目標値を３×ｅ^６、最大注入時間を「ａｕｔｏ」、段階的な正規化衝突エネルギーを２２、２６、３０％に設定し、３０，０００の分解能で２００ｍ／ｚ以上の範囲で収集した。ＭＳ２のアイソレーション幅を４ｍ／ｚに設定し、５００～７８０ｍ／ｚのオーバーラップするウィンドウパターンを使用した。ウィンドウの配置はＳｋｙｌｉｎｅソフトウエアを用いて最適化した。

ＭＳファイルは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＤＩＡ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて，Ｐ．ｃｌａｒａのスペクトルライブラリーと照合した。スペクトルライブラリーは、Ｐ．ｃｌａｒａ（ＵｎｉＰｒｏｔ ｉｄ ＵＰ００００００５８９，ｒｅｖｉｅｗｅｄ，ｃａｎｏｎｉｃａｌ）のタンパク質配列データベースから、Ｐｒｏｓｉｔソフトウエアを用いて生成した。

Ｐ．ｃｌａｒａのタンパク質配列データベースは、メタゲノム解析により独自に作成した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＤＩＡの検索パラメータは以下の通りであった。実験データ検索酵素：トリプシン、最大ミス切断部位：１、前駆体質量の許容範囲：８ｐｐｍ、フラグメント質量の許容範囲：８ｐｐｍ、静的修飾：システインのカルバミドメチル化。

タンパク質同定の閾値は、ペプチド及びタンパク質の偽発見率が１％以下になるように設定した。ペプチドの定量は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ＤＩＡのＥｎｃｙｃｌｏｐｅＤＩＡアルゴリズムにより算出した。各ペプチドについて、最も品質の高い4つのフラグメントイオンを選択し、定量した。タンパク質の定量値は、ペプチドの定量値の合計から推定した。

（ペプチドーム解析）
盲腸内容物に、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル（ＡＣＮ）を加え、遠心エバポレーターで乾燥させた。乾燥したサンプルにアセトンを加え、水浴式ソニケーターで脂質に溶ける低分子化合物を抽出した後、４℃で１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離を行った。

上清を除去した後、沈殿物に７０％ＡＣＮ－ＨＣｌを加え、水浴型ソニケーターでペプチドを再溶解させた後、１５，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離した。続いて、上清を新しいチューブに移し、遠心エバポレーターで乾燥させた。続いて、乾燥したサンプルを、プロテアーゼ阻害剤を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに再溶解し、１０ｍＭジチオスレイトールで５０℃で３０分間処理した。その後、３０ｍＭのヨードアセトアミドで３０分間、室温で暗所にてアルキル化した後、０．５％トリフルオロ酢酸（終濃度）で酸性化した。酸性化したサンプルをＭｏｎｏｓｐｉｎ Ｃ１８（ＧＬサイエンス）で脱塩した。

ペプチドは、Ｃ１８コアシェル粒子（ＣＡＰＣＥＬＬ ＣＯＲＥ ＭＰ ２．７μｍ、１６０Å、大阪曹達）をインハウスで充填した７５μｍ×２５ｃｍのＰｉｃｏＦｒｉｔエミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に５０℃で直接注入した後、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ ＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて，１００ｎＬ／分の流速で９０分間のグラジエントをかけて分離した。

カラムから溶出したペプチドは，Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてＤＤＡ－ＭＳで分析した。ＭＳ１スペクトルは，自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）の目標値である３×１０^６を達成するために、１２万の分解能で３５０～１５００ｍ／ｚの範囲で収集した。

４．４×１０^３を超える電荷状態が２＋から５＋の最も強い３０個のイオンを、データに依存したモードで、規格化された衝突エネルギーが２６％の衝突誘起解離で断片化し、２００ｍ／ｚで３０，０００の質量分解能を持つＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でタンデムマススペクトルを取得した。ＡＧＣターゲットを１×１０^５に設定した。

ＭＳファイルは、マウスのＵｎｉＰｒｏｔリファレンスプロテオーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ ｉｄ ＵＰ００００００５８９， ｒｅｖｉｅｗ， ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＰＥＡＫＳ Ｓｔｕｄｉｏで検索した。

検索条件は、前駆体の質量許容範囲８ｐｐｍ、フラグメントイオンの質量許容範囲０．０１Ｄａ、酵素の有無、固定修飾のカルバミドメチル化、可変修飾の酸化（Ｍ）であった。ペプチドの偽発見率が１％以下になるようにフィルターをかけて同定した。

（ウエスタンブロット）
マウス糞便サンプルを懸濁し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５０倍に希釈した。続いて、懸濁したサンプルを４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清をウエスタンブロットに供した。マウス膵臓組織を液体窒素で急速凍結し、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でタンパク質を抽出し、最終タンパク質濃度を４μｇ／μＬに調整した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥとブロッティングには、Ｎｏｖｅｘ（Ｒ）ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とｉＢｌｏｔ^ＴＭ ２ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）をメーカーの指示にしたがって使用した。

いくつかの実験では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＰＶＤＦ膜（０．２μｍ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱ、メルクミリポア）の転写は、メーカー（ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＳＹＳＴＥＭ（ＤＲＣ））の説明書にしたがって行った。

染色にはｉＢｉｎｄ^ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。

使用した抗体は以下の通りであった。ウサギ抗マウスＰＲＳＳ２抗体（コスモバイオ）、ウサギ抗マウスＨＳＰ９０抗体（＃４８７７、セルシグナリングテクノロジー）、ウサギ抗ヒトＰＲＳＳ２抗体（ＬＳ－Ｂ１５７２６、ＬＳＢｉｏ）、ウサギ抗ヒトＰＲＳＳ１抗体（ＬＳ－３３１３８１、ＬＳＢｉｏ）、ウサギ抗マウスＴＭＰＲＳＳ２抗体（ＬＳ－Ｃ３７３０２２， ＬＳＢｉｏ， プロテアーゼドメインの配列に対するもの）、ウサギ抗６－Ｈｉｓ抗体（Ａ１９０－２１４Ａ， Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＡα鎖抗体（ＨＲＰ）（ａｂ９７２３５、アブカム）、ラット抗マウスκ鎖抗体（ＨＲＰ）（ａｂ９９６３２、アブカム）、ウサギ抗マウスＣＥＬＡ３ｂ抗体（ＯＡＣＤ０３２０５， Ａｖｉｖａｓｙｓｂｉｏ）、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＨＲＰ）（＃７０７４、セルシグナリングテクノロジー）、ウサギ抗マウスＲｅｇ３抗体（５１１５３－Ｒ００５， Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）。

化学発光アッセイにはＣｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ナカライテスク）を、イメージングにはＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ（Ｒ）ＣｈｅｍｉＤｏｃ^ＴＭ ＸＲＳ＋ ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド）又はｉＢｒｉｇｈｔ^ＴＭ ＦＬ１５００を使用した。

（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
マウス膵臓のＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で抽出した。抽出したＲＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡに変換した。

ＲＴ－ｑＰＣＲ解析は，Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）とＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ）を用いて行い，ΔΔＣｔ法で解析した。内因性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。使用したプライマーの塩基配列は次の通りであった。
GAPDH Forward primer：5'-GTCGTGGAGTCTACTGGTGTCTTC-3'（配列番号３５）
GAPDH Reverse primer：5'-GTCATATTTCTCGTGGTTCACACC-3'（配列番号３６）
PRSS2 Forward primer：5'-TGTGACCCTCAATGCCAGAG-3'（配列番号３７）
PRSS2 Reverse primer：5'-AGCACTGGGGCATCAACAC-3'（配列番号３８）

（免疫蛍光染色）
マウス大腸組織（糞便を含む）を採取し、コルノイ液（６０％メタノール、３０％クロロホルム、１０％氷酢酸）で４℃で一晩固定した。パラフィン包埋にはＴｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ライカマイクロシステムズ）を使用した。続いて、パラフィンブロックをミクロトームで薄切片（５．０μｍ）にした後、パラフィンを除去し、免疫染色を行った。

免疫蛍光法に使用した抗体は以下の通りであった。ウサギ抗ＰＲＳＳ２抗体（ＬＳＢｉｏ）、Ａｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、４’－６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（同仁化学研究所）、ローダミン標識ＵＥＡ１（Ｕｌｅｘ Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ １、ベクターラボラトリーズ）。免疫蛍光イメージングには、Ｌｅｉｃａ ＡＦ６００と共焦点のＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５を使用した。

（マウス及びヒト糞便サンプルでのトリプシン活性測定）
マウス腸管内容物又は糞便サンプルを０．９％ＮａＣｌ溶液で５００倍（ｗ／ｖ）に希釈した。ヒト糞便を０．９％ＮａＣｌ溶液で２００倍（ｗ／ｖ）に希釈した。希釈した溶液をミニシェーカーで２０分間、２，０００ｒｐｍでボルテックスし、ピペッティングでホモジナイズした後、４℃、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。続いて、上清を回収し、メーカーのプロトコルにしたがってＴｒｙｐｓｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ） １００ ｔｅｓｔ（ａｂ１０２５３１）でトリプシン活性を測定した。４０５ｎｍの吸光度をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを用いてキネティックモードで測定した。

（ヒト微生物叢のＧＦマウスへの定着）
ヒトの糞便サンプルは、機関内審査委員会で承認された研究プロトコルにしたがって、理化学研究所及び慶應義塾大学で採取された。各被験者からインフォームドコンセントを得た。ヒト糞便サンプル（２０％（ｖ／ｖ）グリセロールで保存）を嫌気チャンバーに移し、解凍後、１００μｍのメッシュでふるい、ＧＦアイソレーターに移し、ＧＦマウスに２００μＬ／マウスを経口投与した。

抗生物質処理は、０．５ｇ／Ｌアンピシリン（ナカライテスク）、０．５ｇ／Ｌメトロニダゾール（ナカライテスク）、１．０ｇ／Ｌタイロシン（シグマ）の各溶液をオートクレーブ処理した水道水で作製した。ドナーＣ由来の糞便内容物を経口投与したマウスに、１２日間抗生物質溶液を与えた。抗生物質溶液は１週間に１回交換した。

（マウス糞便内容物からのコロニー形成種の分離と同定）
マウス腸管内容物をグリセロール含有（２０％）ＰＢＳと混合して嫌気チャンバーに入れ、－８０℃でストックした。ストックを、嫌気チャンバー内で等量のＴＳブロス（ＢＤ）と混合し、以下に示す、異なる寒天プレートにプレーティングした。ＥＧ、ＥＳ、Ｍ１０、ＮＢＧＴ、ＶＳ、ＴＳ（ＢＤ）、ＢＬ（栄研化学）、ＢＢＥ（極東製薬）、Ｏｘｏｉｄ ＣＭ０６１９（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＣＭ０６１９－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ＳＲ０１０７（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＣＭ０６１９－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ＳＲ０１０８（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ｍＧＡＭ（日水製薬）、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ（ＢＤ）。２日間の培養後、外観が異なるコロニーを新しいＥＧプレートに移した。その後、コロニーをＥＧＥＦ液体培地で一晩培養し、グリセロール（最終濃度２０％（ｖ／ｖ））と混合し、－８０℃でストックした。

ＥＧ（Ｅｇｇｅｒｔｈ Ｇａｇｎｏｎ）寒天培地の配合は以下の通りであった。プロテアーゼペプトンＮｏ．３（１０．０ｇ）、酵母エキス（５．０ｇ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（４．０ｇ）、グルコース（１．５ｇ）、可溶性デンプン（０．５ｇ）、Ｌ－システインＨＣｌ（０．５ｇ）、Ｌ－システイン（０．２ｇ）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．５ｇ）、寒天（４．８ｇ）、馬肉抽出液（５００ｍＬ）、１０００ｍＬまでの水＋脱線維した馬の血液（５０ｍＬ）。ＥＧＥＦ培地では、寒天を除き、脱線維した馬の血液（５０ｍＬ）をフィルデス液（４０ｍＬ）に置換した。

続いて、分離された菌株から、糞便からのＤＮＡ分離と同様のプロトコルで、細菌のＤＮＡゲノムを抽出した。１６Ｓ ｒＲＮＡは、ＫＯＤ ｐｌｕｓ Ｎｅｏキット（東洋紡）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがってＰＣＲで増幅した。サンガーシークエンスはＥｕｒｏｆｉｎｓ社に委託した。塩基配列はＮＣＢＩデータベースと照合した。サンガーシークエンスのためのプライマー配列は次の通りであった。
F27 primer：5'-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3'（配列番号３９）
R1492 primer：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'（配列番号４０）

（１６Ｓ ｒＲＮＡのシーケンス）
凍結したマウス糞便サンプルを解凍し、１００μＬの懸濁液を、ＲＮａｓｅ Ａ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）とリゾチーム（最終３．０ｍｇ／ｍＬ、シグマ）を含む９００μＬのＴＥ１０（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， １０ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液と混合した。懸濁液を穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。精製したアクロモペプチダーゼ（和光）を最終濃度２，０００ユニット／ｍＬになるように加え、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、ドデシル硫酸ナトリウム（最終１％）とプロテイナーゼＫ（最終１ｍｇ／ｍＬ、ナカライ）を懸濁液に加え、５５℃で１時間インキュベートした。

続いて、高分子ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、イソプロパノールで沈殿させた後、７０％エタノールで洗浄し、１００μＬのＴＥに再懸濁した。

ＰＣＲはＥｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ２領域を増幅するためのプライマー配列は次の通りであった。
27Fmod primer：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3'（配列番号４１、「xxxxxxxx」は、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）インデックス配列を表す。）
)338R primer：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'（配列番号４２、「xxxxxxxx」は、Ｍｉｓｅｑ（イルミナ）インデックス配列を表す。）

ＰＣＲ産物は、メーカーのプロトコルにしたがってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター）で精製した。１６Ｓ ｒＲＮＡライブラリは、Ｋａｐａ ｌｉｂｒａｒｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって作製した。１６Ｓ ｒＲＮＡのシーケンスは、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ ｖｅｒ３の標準プロトコルで行った。

（ノトバイオート実験）
Ｐｈａｓｏｌａｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ（３Ｇ４）を除き、分離した菌株は嫌気チャンバーで３７℃の温度で１～２日間培養した。Ｐｈａｓｏｌａｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍを８０ｍＭコハク酸ナトリウムを添加したＯｘｏｉｄ ＣＭ０６１９寒天プレートで２～３日間培養し、コロニーを回収してＥＧＥＦに再懸濁した。ＯＤ_６００値をもとに菌密度を調整し、培養株の混合物をＧＦマウスに経口投与した（１５０μＬ／マウス、総菌数約１～２×１０^８ＣＦＵ）。

糞便中のＰ．ｃｌａｒａ ＤＮＡを定量するために、マウスの糞便ＤＮＡを精製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）でＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いてＰ．ｃｌａｒａ株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な配列を増幅する定量的リアルタイムＰＣＲを行った。Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株のゲノムＤＮＡの連続希釈液から標準曲線を作成した。使用したプライマーの塩基配列は次の通りであった。
5'-CGTAGGAGTTTGGACCGTGT-3'（配列番号４３）
5'-GCATGGGAGCGACAAATAAA-3'（配列番号４４）

（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）感染）
ＧＦマウスに、２００μＬの２－ｍｉｘ（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＰ．ｍｅｒｄａｅ）＋Ｐ．ｃｌａｒａ（ＷＴ）、２－ｍｉｘ＋Ｐ．ｃｌａｒａ（Δ００５０２）、２－ｍｉｘのみのいずれかを経口接種した。１４日後、マウスに、一晩培養したＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（１５０μＬ／マウス）を経口投与して感染させ、７日目に安楽死させた。

組織学的分析のために、マウスの頸部を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックを切開し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。

大腸炎の程度は、炎症細胞の浸潤（スコア、０～４）、粘膜の肥厚（スコア、０～４）、杯細胞の枯渇（スコア、０～４）、陰窩膿瘍（スコア、０～４）、組織構造の破壊（スコア、０～４）の基準にしたがって、消化器専門医が評価した。最終的な組織学的スコアは、これらのパラメータのスコアの合計として定義した。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのために、盲腸パッチ（ｃｅｃａｌ ｐａｔｃｈｅｓ）又は盲腸管腔内容物を採取し、ＰＢＳでホモジナイズした後、段階希釈したホモジネートをＬＢ寒天プレートにプレーティングした。好気的条件下、３７℃で一晩培養した後、ＣＦＵをカウントした。

Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的ＩｇＡのｅｘ ｖｉｖｏ評価のために、盲腸内容物を５ｘ（ｗ／ｖ）ＬＢ培地に再懸濁し、遠心分離し、上清を孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜付きの滅菌フィルターユニットで濾過した後、等量のｉｎ ｖｉｔｒｏで一晩培養したＣ． ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ培養液と混合した。この混合物を室温で穏やかに振って１時間インキュベートし、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８）で凝集効果を調べた。あるいは、インキュベーション後、混合物を遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１％ＳＤＳ溶液（５ｍＭ ＥＤＴＡを添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で希釈）で菌体ペレットを溶解した。ライセートをヤギ抗マウスＩｇＡα鎖抗体（ＨＲＰ）（ａｂ９７２３５）でウエスタンブロットにより染色し、糞便内容物中のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ結合性（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異性）ＩｇＡの相対的な量を評価した。

ワクチン投与実験のために、ＧＦマウスをあらかじめ２００μＬの２－ｍｉｘ（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＰ．ｍｅｒｄａｅ）＋ Ｐ．ｃｌａｒａ（ＷＴ）又は２－ｍｉｘ＋Ｐ．ｃｌａｒａ（Δ００５０２）を投与した。４日後、マウスに過酢酸で不活性化したＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（１０^１０個／マウス）を週１回、３週間にわたって経口投与した。３週間の免疫後、マウスは経口投与により一晩培養したＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（１５０μＬ／マウス）に感染し、１４日目に安楽死させた。

過酢酸で不活性化されたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、次のようにして作製した。一晩培養したＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを遠心分離（１６，０００×ｇ、１０分）して回収し、滅菌したＰＢＳに１ｍＬあたり１０^１０個の密度で再懸濁した。過酢酸（２４０９９０、シグマ）を最終濃度０．４％になるように加え、室温で１時間インキュベートした。滅菌したＰＢＳで３回洗浄した後、最終ペレットをＰＢＳに１０^１１粒子／ｍＬの最終濃度で再懸濁し、４℃で保存した。ワクチンは使用前に、１００μＬの不活化ワクチンを２００ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養して完全に不活化されていることを確認した。

（マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）感染）
ＭＨＶ－２は氏家誠氏（日本獣医生命科学大学）より提供された。５週齢のＧＦ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスは、ＣＬＥＡジャパン又は三共ラボサービスから入手し、別々のステンレススチール製アイソレーターで飼育した。ＧＦマウスは２－ｍｉｘ（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＰ．ｍｅｒｄａｅ）＋Ｐ．ｃｌａｒａ（ＷＴ）又は２－ｍｉｘ＋Ｐ．ｃｌａｒａ（Δ００５０２）を２００μＬ経口投与した。接種から２週間後、マウスに４．５ｘ１０^６ ＰＦＵのＭＨＶ－２を経口感染させ、１０日間毎日生存率を観察した。

ウイルスの力価を測定するために、感染後４日目又は５日目に肝臓と脳を採取し、ＤＮＡ／ＲＮＡシールド（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）でホモジナイズした。ウイルスＲＮＡは、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｖｉｒａｌ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてメーカーの説明書にしたがって抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡）とランダムプライマー（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ）でＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行い、ｏｒｆ１ａ遺伝子を増幅した。ＭＨＶの相対量は、ＭＨＶゲノムｃＤＮＡの段階希釈液から作成した標準曲線から求めた。使用したプライマーの塩基配列は次の通りであった。
5'-AAGAGTGATTGGCGTCCGTAC-3'（配列番号４５）
5'-ATGGACACGTCACTGGCAGAG-3'（配列番号４６）

（ｉｎ ｖｉｔｒｏでのトリプシン分解）
一晩培養した細菌を、組換えマウストリプシン（最終濃度１μｇ／ｍＬ）と１時間、またはヒトトリプシン（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）と４時間インキュベートした。使用した組換えトリプシンアイソフォームは、組換えマウスＰＲＳＳ２（５０３８３－Ｍ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、組換えヒトＰＲＳＳ１（ＬＳ－Ｇ１３５６４０）、組換えヒトＰＲＳＳ２（ＬＳ－Ｇ２０１６７）、組換えヒトＰＲＳＳ３（Ｈｉｓ－ｔａｇ）（ＮＢＰ２－５２２２０）であった。

いくつかの実験では、組換えマウスＰＲＳＳ２を、Ｐ．ｃｌａｒａ培養液とのインキュベーションの前に、まず次のトリプシン阻害剤の１つで３０分間処理した。ＡＥＢＳＦ（シグマ、最終濃度２ｍＭ）、ロイペプチン（シグマ、最終濃度１００μＭ）、ＴＬＣＫ（アブカム、最終濃度１００μＭ）。

いくつかの実験では、組換えマウスＰＲＳＳ２とのインキュベーションの前に、ツニカマイシン（シグマ、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、２－フルオロ－Ｌ－フコース（ケイマンケミカル、最終濃度２５０μＭ）、又は対応するＤＭＳＯコントロールの存在下でＰ．ｃｌａｒａを一晩培養した。

Ｃａ^２＋の影響を評価する実験では、組換えマウスＰＲＳＳ２とのインキュベーションの前に、１ｍＭのＣａ^２＋を補充した又は補充しなかった低Ｃａ^２＋ ｍＧＡＭ培地でＰ．ｃｌａｒａを培養した。Ｐ．ｃｌａｒａ上清を用いた実験では、一晩培養したＰ．ｃｌａｒａを、孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜を用いた滅菌フィルターユニットでろ過した。

（共焦点顕微鏡）
組換えマウスＰＲＳＳ２をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ４８８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａ２０１８１， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ４８８で標識し、ＡＥＢＳＦ阻害剤で前処理した（１５０μｇ／ｍＬ ｒｍＰＲＳＳ２ ｗｉｔｈ ２０ｍＭ ＡＥＢＳＦ）。

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ４８８で標識したマウスＰＲＳＳ２を、最終濃度５μｇ／ｍＬで培養した細菌と、嫌気チャンバー内で２０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。共焦点画像の撮影には、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いた。

（ジスクシンイミジルスルホキシド（ＤＳＳＯ）クロスリンク）
ＤＳＳＯ（Ａ３３５４５）はサーモフィッシャーサイエンティフィックから購入した。一晩培養したＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株を、ＡＥＢＳＦで処理したマウスの組換えＰＲＳＳ２と２０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した後、１０ｍＭ ＤＳＳＯに再懸濁した。室温で１０分間インキュベートした後、トリス－塩酸緩衝液（最終濃度２０ｍＭ）を加えて反応を停止した。

ＰＢＳで洗浄した後、ペレットを１％ＳＤＳ溶液（５ｍＭ ＥＤＴＡを添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で希釈）で溶解した。Ｐ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株のみ（ＰＲＳＳ２とのインキュベーションなし）を同様に処理し、ネガティブコントロールとした。上清をウサギ抗６－Ｈｉｓ抗体（Ａ１９０－２１４Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び抗ウサギＩｇＧ抗体（ＨＲＰ）（＃７０７４、セルシグナリングテクノロジー）で染色し、ウエスタンブロットで解析した。

（全細胞ライセート、上清、糖鎖含有タンパク質のタンパク質染色）
Ｐ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）株を、ツニカマイシン（シグマ、最終１０μｇ／ｍＬ）、２－ｆｌｕｒｏ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｅ（ケイマンケミカル、最終２５０μＭ）、又は対応するＤＭＳＯコントロールの存在下で一晩培養した。その後、培養した細菌をペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１％ＳＤＳ溶液（５ｍＭ ＥＤＴＡを添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で希釈したもの）で溶かした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＮｏｖｅｘ（Ｒ）ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて行った。糖鎖を含むタンパク質は、Ｐｒｏ－Ｑ^ＴＭ Ｅｍｅｒａｌｄ ３００ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ Ｂｌｏｔ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって染色した。全細胞ライセートのタンパク質をＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で染色した。上清のタンパク質をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（１０ｋＤ ＮＭＷＬ）で濃縮した後、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で染色した。

（変異体作製）
Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株の欠失変異体（Δ０３０４９～０３０５３、Δ０００５０２及びΔ０００５０９）は、次のようにして作製した。まず、コーディング領域を挟む約１ｋｂの配列をＰＣＲで増幅し、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を用いてメーカーのプロトコル通りに自殺用ベクターｐＬＧＢ３０に組み入れた。続いて、各反応液１μＬずつをエレクトロ－コンピテント大腸菌Ｓ１７－１ λｐｉｒに形質転換した。

続いて、形質転換体を以下のようにＰ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株と結合させた。ドナー株とレシピエント株をそれぞれＬＢ培地とＥＧＥＦ培地でＯＤ_６００が０．５になるように培養し、１：１の割合で混合した。この混合物をＥＧＥＦ寒天プレートに滴下し、３７℃で１６時間好気的に培養した。続いて、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＥＧＥＦ寒天培地プレートで接合完了体を選択した。接合完了体は、ラムノースで誘発されたｓｓ－ｂｆｅ１トキシンの発現に部分的に感受性であり、１０ｍＭのラムノースの存在下では成長が阻害された（一晩のＯＤ_６００が～０．３）。その後、２回目のクロスオーバーによるプラスミドのゲノムからの消失を選択するために、接合完了体を、１０ｍＭラムノースを添加したＥＧＥＦブロスで、接合完了体が復帰体に負けるまで、少なくとも３世代培養した（一晩のＯＤ_６００が～１．０に達した）。その後、細菌培養を行い、単一のコロニーを採取し、ＰＣＲで正常な欠失を確認した。

コード領域の約０．５～１ｋｂの相同配列を自殺ベクターｐＬＧＢ３０に組み入れ、エレクトロコンピテント大腸菌Ｓ１７－１株に形質転換し、同様の手順で挿入変異体を作製した。

形質転換体を同じプロトコルでＰ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株と共役させ、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＥＧＥＦ寒天プレートで接合完了体を選択し、ＰＣＲで確認した後、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＥＧＥＦブロスで維持した。変異体作成に用いた全てのプライマーの塩基配列を下記表１～５に示す。

（透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ））
野生型（ＷＴ）又はΔ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４５８９）株を、マウス組換えＰＲＳＳ２（５０３８３－Ｍ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、終濃度５μｇ／ｍＬ）と２０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド－１％グルタルアルデヒド溶液を用いて、室温で２時間固定した。０．０５Ｍ ＰＢＳで洗浄した後、ペレットを段階的にエタノール（５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％）で脱水した。脱水したペレットをＬＲＷ樹脂（１００％エタノールとＬＲＷの１：１で１時間、その後１００％エタノールとＬＲＷの１：２で一晩、さらに１００％ＬＲＷで５時間）で浸潤した。浸潤後、サンプルはゼラチンカプセルで硬化させた（５３℃、２４時間）。重合したＬＲＷブロックをＬｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｃｕｔ ＵＣＴで切開し、８０ｎｍの切片を得た。

免疫金染色のために、まず、切片を、１％ＢＳＡを添加した０．０５ＭのＰＢＳでブロックした後、ウサギ抗６－Ｈｉｓ抗体（Ａ１９０－２１４Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で６０分間染色した。０．０５ＭのＰＢＳで洗浄した後、切片を１２ｎｍのコロイド金標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体で６０分間染色した。０．０５ＭのＰＢＳで再度洗浄した後、切片を０．０５ＭのＰＢＳに溶解した１％のグルタルアルデヒドで固定し、水で洗浄した後、酢酸ウラニルで５分間染色した。すべての画像はＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡で撮影した。

（組換えタンパク質の発現と磁気マイクロビーズへの結合）
組換え００５０２タンパク質及び組換え００５０９タンパク質を作製するために、両タンパク質の遺伝子のコード領域（シグナルペプチドをコードするＮ末端配列を除く）を発現ベクターｐＥＴ－２８ｂ（＋）（＃６９８６５、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、サプライヤーのプロトコルにしたがってＣ末端にＨｉｓタグを導入した。

続いて、発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）コンピテントセル（＃７１１３６、Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。続いて、形質転換体を指数関数的に成長させ、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉ６７５８、シグマ）を添加することでタンパク質の発現を誘導した。２５℃で一晩培養した後、Ｂ－ＰＥＲ^ＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（＃７８２４３、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて細胞を溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｇａｒｏｓｅ Ｂｅａｄｓ（＃７８６０５、サーモフィッシャーサイエンティフィック）及びＰｉｅｒｃｅ^ＴＭ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（＃８９８４９、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質を調製した。

続いて、精製した組換え００５０２タンパク質、組換え００５０９タンパク質又はウシ血清アルブミン（＃２３２０９、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（１４３１１Ｄ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって、マイクロ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）に結合させた。ビーズ１ｍｇあたり１５μｇのタンパク質を添加した。

続いて、１ｍｇのタンパク質結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭを２００μＬのＥＧＥＦ培地に再懸濁し、組換えマウスＰＲＳＳ２（終濃度３μｇ／ｍＬ）、ＡＥＢＳＦで前処理したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ ４８８標識マウスＰＲＳＳ２（終濃度５μｇ／ｍＬ）、又は５０μＬのＧＦ盲腸内容物（ＰＢＳで５０倍希釈）と混合した。組換え体の作製に使用したすべてのプライマーの塩基配列を下記表６に示す。

（プロテアーゼ活性アッセイ）
Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃２３２６６、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて，メーカーのプロトコルにしたがって、Ｐ．ｃｌａｒａ培養液、Ｐ．ｃｌａｒａ培養液上清、組換え００５０２タンパク質及び組換え００５００９タンパク質のプロテアーゼ活性を測定した。

フルオレセインの励起フィルター及び発光フィルター（４８５／５３８ｎｍ）を備えたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒを使用し、ＦＩＴＣ－カゼイン基質が消化されて、より小さなフルオレセイン標識断片になったことによる蛍光総量の増加を検出した。プロテアーゼ活性は、相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）の変化として測定した。

（公開されたコホートのヒト便サンプルのメタゲノム解析）
ＰＲＩＳＭ、ＨＭＰ２、ＦＨＳ、５００ＦＧ、ＣＶＯＮ、Ｊｉｅの各コホートのヒト便サンプルから得られたメタゲノムは、ｄｅ ｎｏｖｏで、非冗長遺伝子カタログにアセンブルし、ＭＳＰｍｉｎｅｒを用いてメタゲノム種にまとめて相対的な存在量を定量化した。

００５０２タンパク質をコードする遺伝子と００５０９タンパク質をコードする遺伝子を含むトリプシン関連遺伝子座のＰ．ｃｌａｒａ株の遺伝子とＰ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の遺伝子のホモログ、及び、他の６つの近傍遺伝子を遺伝子カタログで検索するために、ＵＳＥＡＲＣＨ ｕｂｌａｓｔ（ａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ）を採用し、最小ｅ－ｖａｌｕｅが０．１のヒットを保持した。その結果、各種とも８つの遺伝子すべてが存在することを遺伝子カタログで確認した。

この遺伝子座をコードする追加の推定ホモログや種を同定するために、まずＰ．ｃｌａｒａ株とＰ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の対応するホモログ間の類似性を評価し、遺伝子座の各遺伝子に対するｕｂｌａｓｔヒットの最小同一性（Ｉｄ）とカバレッジ（Ｃｏｖ）の閾値を以下のように設定した。００５０２：Ｉｄ＝２５％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０３：Ｉｄ＝７０％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０４：Ｉｄ＝６０％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０５：Ｉｄ＝６０％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０６：Ｉｄ＝５０％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０７：Ｉｄ＝２５％、Ｃｏｖ＝９０％。００５０８：Ｉｄ＝４５％、Ｃｏｖ＝８０％。００５０９：Ｉｄ＝２０％、Ｃｏｖ＝３０％。

続いて、どの他のメタゲノム種（ＭＰＳ）が、Ｐ．ｃｌａｒａ株とＰ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の００５０２～００５０９遺伝子の相同体をコードするかを評価し、それぞれ８と７の相同体を持つＭＳＰ ０３５５とＭＳＰ ０３０５を同定した。ＭＳＰ ０３５５とＭＳＰ ０３０５は、以前、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門にのみアノテーションされていたが、今回、ｕｂｌａｓｔを用いて、これらのプロテオームを統合ヒト消化管ゲノム（ＵＨＧＧ）コレクションと比較した。その結果、ＭＳＰ ０３５５及びＭＳＰ ０３０５は、それぞれＧＵＴ＿ＧＥＮＯＭＥ １４００８２及びＧＵＴ＿ＧＥＮＯＭＥ ０１６８７５と注釈され、遺伝子の大部分（＞９０％）が、高い信頼性（アミノ酸同一性中央値＞９９％及びｅ値＜１×ｅ^－１８４）で、ＵＨＧＧを代表する単一種にマッピングされた。ＵＨＧＧでは、両方とも系統発生的にＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種として分類された。

（統計）
全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ）を用いて行った。多重比較にはＴｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを併用したＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いた。２群間の比較には，ウェルチの補正を加えたＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（ノンパラメトリック）またはｐａｉｒｅｄ ｔ検定（パラメトリック）を用いた。２つの変数間の相関を調べるために、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関を用いた。生存分析には，Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いた。

［実験例１］
（微生物叢による大腸内トリプシンの制御）
腸内微生物叢が大腸内のタンパク質分布に及ぼす影響を調べるため、無菌（ＧＦ）マウスと特定病原体フリー（ＳＰＦ）マウスの盲腸内容物を採取し、質量分析法によるプロテオミクス解析を行った。検出された７１３種類の宿主由来タンパク質のうち、３２４種類がＧＦマウスよりもＳＰＦマウスの方が高いことがわかった（＞２－ｆｏｌｄ，ｐ＜０．０５）。それらには、α－デフェンシン２１（Ｄｅｆａ２１）やペプチドグリカン認識タンパク質１（Ｐｇｌｙｒｐ１）等の免疫関連分子も含まれていた。一方、ＧＦマウスでは、ＳＰＦマウスと比較して４５種類のタンパク質がより多く存在していた（＞２－ｆｏｌｄ，ｐ＜０．０５）。

図１は、プロテオミクス解析の結果を示す図である。図１は、ＳＰＦマウスよりもＧＦマウスの盲腸で発現量が増加したタンパク質を示す。その中で、アニオン性トリプシンプロテアーゼ（Ｐｒｓｓ２遺伝子にコードされる）に着目した。アニオン性トリプシンプロテアーゼ（ＰＲＳＳ２）のレベルは、ＧＦマウスの盲腸内容物で著しく上昇していた。

図２は、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの糞便のトリプシン活性試験の結果を示すグラフである。図３は、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの糞便のウエスタンブロット解析によりアニオン性トリプシンプロテアーゼ（ＰＲＳＳ２）を検出した結果を示す写真である。図４は、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの大腸切片の免疫染色により、粘液（ＵＥＡ１）及びアニオン性トリプシンプロテアーゼ（ＰＲＳＳ２）を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、ＤＡＰＩで細胞核を染色した。

その結果、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの糞便のトリプシン活性試験、ＳＰＦマウス及びＧＦマウスの糞便のウエスタンブロット解析、大腸切片の免疫染色の結果も、プロテオミクス解析の結果と同様であり、ＧＦマウスでは、ＳＰＦマウスと比較して、盲腸内容物及び糞便中に、アニオン性トリプシンプロテアーゼがより多く存在することが明らかとなった。以下、アニオン性トリプシンプロテアーゼを単にトリプシンという場合がある。

トリプシンは膵臓で不活性の前駆体（トリプシノーゲン）として生成された後、十二指腸に分泌され、エンテロペプチダーゼによって活性化される。そこで、ＧＦマウスとＳＰＦマウスの膵臓におけるトリプシノーゲンの発現を調べた。その結果、ＧＦとＳＰＦでは、膵臓におけるＰＲＳＳ２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルが同等であることが明らかとなった。この結果から、大腸で観察されたトリプシンレベルの差が、膵臓での生産量の差によるものである可能性は否定された。

続いて、ＧＦマウスとＳＰＦマウスの小腸と大腸の異なる場所で、管腔内トリプシン活性を調べた。図５は、空腸、回腸、盲腸、大腸、糞便におけるトリプシン活性を測定した結果を示すグラフである。図５中、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。

その結果、小腸の遠位端までは、ＳＰＦマウスとＧＦマウスは同程度のトリプシン量であることが明らかとなった。一方、大腸では、ＳＰＦマウスはＧＦマウスに比べてトリプシン活性が有意に低下しており、大腸におけるトリプシンの制御に微生物叢が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

［実験例２］
（トリプシン分解を促進できるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株の同定）
大腸の微生物叢が膵臓のプロテアーゼを不活性化することはこれまでに報告されていたが、この過程に関与する菌は未同定であった。そこで、ヒト微生物叢から、トリプシンを減少させる細菌の単離と同定を試みた。

まず、６名の健常人の日本人ドナー（ドナーＡ～Ｆ）から採取した糞便サンプルをＧＦマウスに投与した。続いて、ＧＦマウスの糞便におけるトリプシン活性を測定した。図６は、それぞれの健常人ドナー（Ａ～Ｆ）から採取した糞便サンプルを投与した、ＧＦマウスにおける糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。図６中、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。

その結果、検討したヒト糞便サンプルには、マウスの糞便トリプシン活性を低下させる能力にばらつきがあることが明らかとなった。具体的には、ドナーＢの微生物叢を投与されたマウスは糞便トリプシン活性が減少しなかった一方で、ドナーＣ、Ｄ、Ｅ及びＦの微生物叢を投与されたマウスは糞便トリプシン活性が大幅に減少した。

続いて、ドナーＣの微生物叢を投与されたマウス（マウスＣ＃５）を選択し、その盲腸内容物を採取した。さらに、その盲腸内容物を新たなＧＦマウス（ＧＦ＋Ｃ＃５マウス）に経口投与した。ここで、微生物叢を絞り込むために、ＧＦ＋Ｃ＃５マウスを４群に分け、それぞれの群に、飲水を介してアンピシリン（Ａｍｐ）、メトロニダゾール（ＭＮＺ）、タイロシン（Ｔｙｌ）又はコントロール（抗生剤なし、Ｎｏ Ａｂｘ）を投与し、各群の糞便中のトリプシン活性を経時的に計測した。

図７は、各群のマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。図７中、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。その結果、抗生剤を処置しなかったＧＦ＋Ｃ＃５マウスでは、数日のうちに糞便中トリプシン活性が減少した。注目すべきことに、Ａｍｐ処理群で糞便中トリプシン活性はより減少しており、一方、ＭＮＺ処理群又はＴｙｌ処理群での糞便中トリプシン活性減少がなくなっていた。これらの結果は、Ｃ＃５の微生物叢が、Ａｍｐ処理群で濃縮されており、ＭＮＺ又はＴｙｌ処理群で減少している、トリプシン活性を低下させる細菌を含有していることを示す。

Ａｍｐ処理マウスのうち１匹（マウスＣ５－Ａｍｐ＃５）を追跡調査し、その盲腸内容物を採取し、嫌気性条件下でさまざまな培地を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。続いて、４３２個の異なるコロニーを単離し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した結果、３５個のユニークな株に細分化された。この３５株は、Ｃ５－Ａｍｐ＃５マウスに定着している菌種を広くカバーしていた。３５株の単離菌（３５－ｍｉｘ）の混合物をＧＦマウス（ＧＦ＋３５－ｍｉｘ）に投与すると、糞便中トリプシン活性が顕著に減少し、その減少は元のドナーＣの微生物叢を定着させたマウスの減少と同等であった。

次に、エフェクターとなる細菌を絞り込むために、上述した抗生物質投与試験で得られた糞便サンプルの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を解析し、スピアマンの順位相関試験を行って、３５株それぞれの相対的な存在量とトリプシン活性の低下との関連性を評価した。その結果、３５株のうち、１４株はトリプシン活性と負の相関を示した（ρ≦－０．３）。

続いて、ノトバイオートマウスを作製することで、この１４菌と残りの２１菌の効果を比較した。その結果、ＧＦ＋１４－ｍｉｘマウスは、ＧＦ＋３５－ｍｉｘマウスと同程度に、糞便中のトリプシン活性の強力な減少を示した一方、ＧＦ＋２１－ｍｉｘマウスはその活性を減少させなかった。続いて、この１４－ｍｉｘから、トリプシン活性の減少と有意に関連する９株をさらに選択した（ρ≦－０．５，ｐ＜０．０５）。

ＧＦマウスへの９－ｍｉｘの定着は、１４－ｍｉｘが定着したマウスと同程度に、糞便中のトリプシン活性の強力な減少を示した。最終的に、９－ｍｉｘを、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ種からなる３－ｍｉｘと、非Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ種からなる６－ｍｉｘに分けた。

Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｌａｒａ（Ｐ．ｃｌａｒａ，ｓｔｒａｉｎ ＩＤ：１Ｃ４），Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ，ｓｔｒａｉｎ ＩＤ：３Ｈ３）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ，ｓｔｒａｉｎ ＩＤ：１Ｄ４）からなる３－ｍｉｘで、ｉｎ ｖｉｖｏにおける糞便トリプシン活性の減少に必要十分であり、６種の非－Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ ｍｉｘは糞便トリプシン活性の減少に全く効果がないことが明らかとなった。

トリプシンを分解する細菌を特定するために、９－ｍｉｘのそれぞれの株を、組換えマウストリプシン（ｒｍＰＲＳＳ２、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ－ｔａｇを付加）と混合してインキュベーションし、ウエスタンブロットにてトリプシンの分解を測定した。

図８は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。その結果、唯一、Ｐ．ｃｌａｒａ（ｓｔｒａｉｎ ＩＤ：１Ｃ４）が、トリプシンを減少させた。これと一致して、Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ ３Ｈ３及びＰ． ｍｅｒｄａｅ １Ｄ４の混合物（３－ｍｉｘからＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を除外したもの）又は３４－ｍｉｘは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて糞便トリプシン活性の減少能を示さなかった。

以上のことから、微生物叢のコニュニティーがトリプシン活性の低下に必要であるという当初の仮説とは異なり、単一のＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）がトリプシン活性の低下に必要であると結論した。

続いて、組換えヒトトリプシンアイソフォームＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ３（ｒｈＰＲＳＳ１－３）を、Ｐ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）と混合してインキュベートし、ヒトトリプシンの分解をウエスタンブロットで解析した。

図９は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図９中、「－」はＰ．ｃｌａｒａを添加しなかったことを示し、「＋」はＰ．ｃｌａｒａを添加したことを示す。その結果、Ｐ．ｃｌａｒａは、マウストリプシンに加えて、３つの既知のヒトトリプシン（ＰＲＳＳ１及びＰＲＳＳ２、また、より少ない程度にＰＲＳＳ３）の減少を促進できることが明らかとなった。

続いて、Ｐ．ｃｌａｒａによるトリプシン活性の減少の効果が株特異的であるかどうかを調べた。具体的には、組換えマウスＰＲＳＳ２（ｒｍＰＲＳＳ２）を、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌株又はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌株とｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した。Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌株としては、Ｐ．ｃｌａｒａ株（ＪＣＭ１４８５９、Ｐ２３７Ｅ３ｂ、Ｐ３２２Ｂ５）及びＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ株（ＪＣＭ１４８６０、８２Ａ６）を使用した。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属菌株としては、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒｅａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｕｌｏｒｕｍを使用した。図１０は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１０中、「＊」は、抗ＰＲＳＳ２抗体で検出されたＰＲＳＳ２の切断されたフラグメントの位置を示す。

Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａは、最近同定されたＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅの属で、Ｐ．ｃｌａｒａとＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａの２種のみを含む。そこで、ヒト健常人糞便サンプルから単離したＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＪＣＭ１４８６０）株及びＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株を調べた。

その結果、非日本人ドナーを含む健常人より採取した糞便サンプルから単離した３つの他のＰ．ｃｌａｒａ株（ＪＣＭ１４８５９、Ｐ２３７Ｅ３ｂ、Ｐ３２２Ｂ５）は、共通してトリプシンを減少させる効果があることが明らかとなった。また、Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＪＣＭ１４８６０）株及びＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（８２Ａ６）株の双方が、Ｐ．ｃｌａｒａ株に似た強力なトリプシン減少能を示すことが明らかとなった。

一方、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａと系統的に近い、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｔｅｒｃｏｒｅａ及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｕｌｏｒｕｍ）は、すべてトリプシン活性を低下させなかった。

これらの結果は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌が、トリプシン分解能を持つヒト微生物叢の代表的な構成要素であることを示す。

［実験例３］
（ＩＸ型分泌機構依存性ポリサッカライド（多糖）結合分子によるトリプシンの自己分解）
Ｐ．ｃｌａｒａの基質特異性について調べた。具体的には、各種タンパク質と共にトリプシンが大量に含まれているＧＦマウス盲腸内容物をｅｘ ｖｉｖｏでＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）と共にインキュベーションした。続いて、各タンパク質由来ペプチドの存在量をＬＣ－ＭＳによるペプチドーム解析により調べた。その結果、２７６タンパク質由来の７６１４ペプチドのうち、トリプシンが、Ｐ．ｃｌａｒａの存在下で時間経過に伴ってペプチド濃度が明確に増加するパターンを示した、ただ１つのタンパク質であった。

これらの結果は、Ｐ．ｃｌａｒａが狭い基質特異性を有しており、トリプシンに対する高い活性を有することを示している。また、Ｐ．ｃｌａｒａによるトリプシン分解の反応速度を調べたところ、反応は徐々に化学量論的に起きることが明らかとなった。

また、Ｐ．ｃｌａｒａにより媒介されるトリプシン分解は、十分量の２価カチオン（例えば、Ｃａ^２＋）の存在下でのみ起きていた。よって、この分解は酵素（プロテアーゼ）を介したものであることが明らかとなった。しかし、この分解は、トリプシンをＰ．ｃｌａｒａの培養上清とインキュベーションしたときには観察されなかった。さらに、Ｐ．ｃｌａｒａ生菌又はフィルターをかけたＰ．ｃｌａｒａの上清をプロテアーゼ基質（フルロセインラベルしたカゼイン）とともにインキュベーションしたところ、タンパク質分解活性は検出されなかった。

図１１は、組換えマウスＰＲＳＳ２（ｒｍＰＲＳＳ２）を、プロテアーゼ阻害剤で前処理した後にＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。その結果、セリンプロテアーゼ阻害剤であるＡＥＢＳＦ又はロイペプチン、更に、特異的なトリプシン阻害剤であるＴＬＣＫで前処理することにより、Ｐ．ｃｌａｒａのトリプシン分解能が消失することが明らかとなった。この結果は、Ｐ．ｃｌａｒａによるトリプシン分解が、トリプシン依存性の自己消化に媒介されることを示す。

続いて、Ｐ．ｃｌａｒａがトリプシンの自己消化を促進する機構を解明する目的で、トリプシンをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識し、トリプシンとＰ．ｃｌａｒａの相互作用を視覚化した。図１２は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したｒｍＰＲＳＳ２を、Ｐ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）、及び、２つのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種である、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐ．ｏｕｌｏｒｕｍとそれぞれインキュベートし、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図１２中、黒四角は、Ｐ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）の拡大画像を示す。

その結果、蛍光標識したトリプシンは、数分以内にＰ．ｃｌａｒａの表面に集積することが観察された。一方、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ及びＰ．ｏｕｌｏｒｕｍでは、トリプシンの集積は観察されなかった。このことから、トリプシン分解はトリプシン結合表面分子を介してＰ．ｃｌａｒａの表面で起こっており、トリプシン結合表面分子がトリプシンの集積と自己消化を促進していると考えられた。

続いて、Ｐ．ｃｌａｒａのトリプシン結合表面分子を同定するために、トリプシン（Ｈｉｓ－ｔａｇ ｒｍＰＲＳＳ２）とＰ．ｃｌａｒａ由来分子との複合体を捕捉する化学的架橋剤として、ジスクシンイミジルスルホキシド（ＤＳＳＯ）で処理した。続いて、ｒｍＰＲＳＳ２とＰ．ｃｌａｒａ由来分子がクロスリンクした複合体をウエスタンブロットで解析した。

その結果、ＤＳＳＯ処理によって、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体でブロットされた高分子量（～２５０ｋＤａ）の新たなバンドが出現した。このバンドは、トリプシンを含む高分子量複合体の存在を示す。

手持ちのマススペクトメトリーはこの複合体由来のクロスリンクしたペプチドを検出するのに十分な感度がなかったが、サイズ的にスメア状の２５０ｋＤａ付近のバンドはトリプシンが不均一な分子と相互作用していることを示していた。

Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａを含むＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓは、グリカン複合体が細胞表面に修飾されていることが知られている。このことから、Ｐ．ｃｌａｒａの表面に存在するグリカンを含む分子がトリプシンの結合と分解に関与していると考えられた。

この仮説を調べるため、Ｐ．ｃｌａｒａの糖鎖合成を標的とした阻害剤を使用した。まず、細菌のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のＯ－グリカン形成の最初のステップを仲介するＷｅｃＡ様トランスフェラーゼを標的とした阻害剤であるツニカマイシンで、Ｐ．ｃｌａｒａを処理した。

図１３は、ツニカマイシン（Ｔｕｎｉ．）又はビークルコントロールと前処理したＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。その結果、ツニカマイシンで処理したＰ．ｃｌａｒａでは、トリプシンの分解が見られないことが明らかとなった。

図１４は、ツニカマイシン処理を行ったＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）又はツニカマイシン処理を行わなかったＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したｒｍＰＲＳＳ２とそれぞれインキュベートし、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図１４中、「Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（＋）」はツニカマイシン処理を行った結果であることを示し、「Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（－）」はツニカマイシン処理を行わなかった結果であることを示す。その結果、ツニカマイシン処理したＰ．ｃｌａｒａでは、トリプシンのＰ．ｃｌａｒａの表面への集積が認められないことが明らかとなった。同様に、フコース含有糖鎖の合成を広く阻害するフコース転移酵素阻害剤である２－フルオロ－Ｌ－フコース（２Ｆ－Ｆｕｃ）でＰ．ｃｌａｒａを処理したところ、トリプシンのＰ．ｃｌａｒａ表面への結合とトリプシンの分解の双方が阻害された。

Ｔ９ＳＳ（ＩＸ型分泌機構）は、Ｓｅｃシステムと協調して、保存されたＣ末端ドメインを持つタンパク質を、外膜を越えて表面に輸送する細菌の機構である。Ｔ９ＳＳは、ソーターゼのようなプロテアーゼ活性でＣ末端ドメインを除去し、細胞外に輸送されたタンパク質を、表面の多糖類に結合させる役割を果たす。

発明者らは、Ｔ９ＳＳによって分泌される細胞表面タンパク質が、トリプシンのリクルートと分解の原因となっていると推定し、以下の検討を行った。まず、Ｐ．ｃｌａｒａとＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ種のゲノムにおいて、Ｔ９ＳＳに含まれると推定される遺伝子配列を同定した。

図１５は、Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）、Ｐ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ（ＪＣＭ１４８６０）及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）のゲノム中のＴ９ＳＳ遺伝子構成のアライメントを示す模式図である。

続いて、プラスミド配列を相同組換えにより、Ｔ９ＳＳの基本構成因子であるＰｏｒＵの発現が欠失した変異Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株を作製した。図１６は、ＰｏｒＵの発現を欠失させる相同組換えを説明する模式図である。

図１７は、変異Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）をｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。図１７中、「ＰｏｒＵ ｍｕｔａｎｔ」は、変異Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）の結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型のＰ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）の結果であることを示す。その結果、変異Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）では、トリプシン分解が完全に欠失しており、Ｔ９ＳＳ依存性表面タンパク質がトリプシン分解に関与していることが明らかとなった。

続いて、トリプシン分解への作用効果を有する細胞表面タンパク質を同定するため、ツニカカマイシンの存在又は非存在下で、Ｐ．ｃｌａｒａ培養上清のプロテオーム解析を実施した。その結果、ツニカカマイシン処理Ｐ．ｃｌａｒａ培養上清において、２０個のバクテリア由来タンパク質を見出した。

そこで、プラスミド配列を２０個の標的遺伝子座にそれぞれ導入すること、又は、遺伝子クラスターを除去すること（Δ０３０４８～０３０５３）により、ツニカマイシン感受性タンパク質の合成が阻害された一連の変異Ｐ．ｃｌａｒａ株を作製した。

図１８は、野生型（ＷＴ）Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）又は一連の変異体Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）を介したｒｍＰＲＳＳ２分解のウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。図１８中、「Δ０３０４８～０３０５３」は、遺伝子クラスターを除去した変異体Ｐ．ｃｌａｒａの結果であることを示し、「０００２９」、「００８９０」、「００８２２」、「００３４２」、「００１０４」、「０３１９１」、「００５０２」、「０２１９９」、「００４７２」、「０１０４１」、「００８２３」、「００７２９」、「００９３５」、「０１６８６」、「０３１６６」、「００５０９」、「００００２」、「ＰｏｒＵ」、「ＷｅｃＡ」はそれぞれ、記載された遺伝子を、プラスミドの挿入により欠失した変異体Ｐ．ｃｌａｒａの結果であることを示す。

その結果、００５０２タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｇ５ＳＮＣ９、Ｏｍｐ２８関連細胞膜外タンパク質）、又は、００５０９タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ：Ｇ５ＳＮＣ１、機能未知タンパク質）をコードする遺伝子を破壊することで、ＰｏｒＵ又はＷｅｃＡ（ツニカマイシンの標的因子）欠損変異株と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのトリプシン分解が消失することが明らかとなった。

続いて、挿入変異体に代えて、００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質が欠失したＰ．ｃｌａｒａ株（Δ００５０２及びΔ００５０９）を作製して同様の検討を行った。

図１９は、Δ００５０２及びΔ００５０９を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識したｒｍＰＲＳＳ２とそれぞれインキュベートし、細菌の表面へのｒｍＰＲＳＳ２の結合を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。その結果、Δ００５０２株及びΔ００５０９株の双方において、トリプシンのリクルートが欠失したことが明らかとなった。

また、図２０は、Δ００５０２株及びΔ００５０９株を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。図２０中、「ＷＴ」は野生型のＰ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）の結果であることを示す。その結果、Δ００５０２株及びΔ００５０９株の双方において、トリプシン分解が欠失したことが明らかとなった。

続いて、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株のゲノム配列を解析した。図２１は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株のゲノム配列を示す模式図である。その結果、トリプシン分解能を有するすべての株が、００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子を有していることが明らかとなった。これに対し、調べたどのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ種も００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子のホモログを有していなかった。

また、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ株間で、００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子の遺伝子座とは離れた部位に００５０３～００５０８遺伝子が保存されていた。図２２は、００５０２～００５０９遺伝子のそれぞれを欠失させたＰ．ｃｌａｒａ変異株を、ｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。その結果、００５０３～００５０８遺伝子が欠失したＰ．ｃｌａｒａ変異株はトリプシン分解活性を保有しており、これらのトリプシン分解過程への関与は否定された。

［実験例４］
（００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質の検討）
組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質を作製した。００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質の発現ベクターを組み込んだ大腸菌をイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で処理して組換えタンパク質の発現を誘導し、発現した組換え００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質を細胞溶解液から磁性アガロースビーズで精製した。

図２３は、ＦＩＴＣ標識したカゼインの切断によって、組換え００５０２タンパク質又は００５０９タンパク質のプロテアーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。トリプシン（１ｎｇ／μＬ）をポジティブコントロールとして使用した。図２３中、（－）は、タンパク質を添加していないことを示す。プロテアーゼ活性は、相対的な蛍光単位の変化として表した。その結果、組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質は、プロテアーゼ活性を有していないことが明らかとなった。

図２４は、遊離型の組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質、又は、組換え００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質をマイクロビーズに結合したものをｒｍＰＲＳＳ２とインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２の分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。

図２５は、組換え００５０２タンパク質、組換え００５０９タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をマイクロビーズ結合させたものを、ｒｍＰＲＳＳ２と一緒にインキュベートし、ｒｍＰＲＳＳ２とタンパク質結合ビーズの結合状態を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す写真である。スケールバーは５μｍである。ＢＳＡはネガティブコントロールとして使用した。

その結果、遊離型の００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質は、トリプシン分解活性を示さないことが明らかとなった。一方、マイクロビーズに結合させた組換え００５０２タンパク質は、トリプシンの効果的なリクルート及び分解を示した。

図２６は、ＧＦマウスの盲腸内容物を、培地コントロール（－）又はマイクロビーズに結合させた組換え００５０２タンパク質とインキュベートし、２４時間後又は４８時間後のトリプシンのｅｘ ｖｉｖｏでの分解をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。図２６中、「＊」は、抗ＰＲＳＳ２抗体で検出されたＰＲＳＳ２の切断されたフラグメントの位置を示す。その結果、マイクロビーズに結合させた組換え００５０２タンパク質により、顕著なトリプシン分解が検出された。

これらの結果は、００５０２タンパク質がトリプシン結合の足場として働き、トリプシンの自己分解を促進するという発明者らのモデルを支持するものである。また、マイクロビーズに結合させた組換え００５０９タンパク質に、トリプシンは効果的に結合したが、トリプシン分解は起きないことが明らかとなった。

これらの結果から、００５０２タンパク質はトリプシンのリクルートと自己消化の効果を発揮させる主要な構成因子であるが、００５０９タンパク質はトリプシンのリクルートを補助する働きを持つことが示唆された。

図２７に、発明者らが提唱する、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌を介したトリプシン分解のモデルを示す。図２７中、「Ｓｅｃ」は、細胞質膜を超えてタンパク質が排出されるＳｅｃシステムを示す。

図２７に示すように、００５０２タンパク質及び００５０９タンパク質は、ＩＸ型分泌機構（Ｔ９ＳＳ）を介してＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの細胞外膜を超えて輸送される。ＰｏｒＵは基本的なＴ９ＳＳ構成因子であり、Ｔ９ＳＳ依存性タンパク質のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を分解し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属細菌のＬＰＳ分子とそれらのタンパク質をつなぐ。ＷｅｃＡは、ＬＰＳ Ｏ－グリカン合成の初めのステップを仲介し、例えば、ツニカマイシン処理によるＷｅｃＡの機能の破壊により、Ｔ９ＳＳ依存性タンパク質の放出をもたらす。００５０２タンパク質は、トリプシンのリクルート及び自己消化のための主要なエフェクター構成因子として働く。一方、００５０９タンパク質は、トリプシンのリクルートを補助する。

００５０９タンパク質ではなく、００５０２タンパク質がトリプシンの自己消化を促進する正確なメカニズムはまだ不明であるが、トリプシンが００５０２タンパク質に結合することでトリプシンの構造が変化し、自己消化が起こりやすくなるのではないかと推測される。

［実験例５］
（Ｐ．ｃｌａｒａ株の定着はＩｇＡの維持に貢献する）
ｉｎ ｖｉｖｏでのトリプシン分解への００５０２及び００５０９タンパク質の貢献を確認するために、３つのＰ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）の一つを定着させたＧＦマウスを解析した。

Ｐ．ｃｌａｒａ株は単一株ではマウスに定着しなかったため、Ｐ．ｃｌａｒａ株を２つのトリプシン分解をしない株（２－ｍｉｘ：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ ３Ｈ３及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ １Ｄ４）を共に接種した。２－ｍｉｘと共に接種することにより、すべての３つのＰ．ｃｌａｒａ株は、効果的にマウスの腸に定着した。

図２８は、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便中のＰ．ｃｌａｒａ株のＤＮＡを定量した結果を示すグラフである。図２８中、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示す。その結果、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、００５０２遺伝子又は００５０９遺伝子の欠失は、Ｐ．ｃｌａｒａ株の存在量に影響を与えないことが明らかとなった。

図２９は、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。図２９中、「＊」、「＊＊＊」は、それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。その結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果と一致して、Δ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させたマウスは糞便中で高いトリプシン活性を保っており、一方、Δ００５０９ Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させたマウスは部分的にトリプシン活性の減少を示した。

続いて、００５０２の重要性を、より複雑な微生物叢コミュニティーが存在する条件下で検討した。図３０は、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２）を、上述した３４－ｍｉｘ（３５－ｍｉｘからＰ．ｃｌａｒａ（１Ｃ４）を除外したもの）と共に接種したＧＦマウスの糞便トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。図３０中、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。その結果、Δ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａを定着させたマウスは、野生型（ＷＴ）Ｐ．ｃｌａｒａを定着させたマウスよりも、糞便中トリプシン活性が高いことが明らかとなった。

以上の結果から、００５０２タンパク質の本質的な役割は、ｉｎ ｖｉｖｏでのトリプシン分解を促進することであると確認できた。

続いて、野生型（ＷＴ）及び変異型Ｐ．ｃｌａｒａによる腸内トリプシンレベルの調節が、ＩｇＡや抗菌ペプチド等の、重要な腸内防御因子に与える影響を検討した。

図３１は、Ｐ．ｃｌａｒａ株（野生型（ＷＴ）、Δ００５０２又はΔ００５０９）を２－ｍｉｘと共に接種したＧＦマウスの糞便中の、トリプシン（ＰＲＳＳ２）、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）、ＩｇＡ重鎖、κ軽鎖、グラム陰性菌に対する抗菌ペプチドであるＲｅｇ３β、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｌｉｋｅ Ｅｌａｓｔａｓｅ ３Ｂ（ＣＥＬＡ３Ｂ）をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。

その結果、野生型のＰ．ｃｌａｒａ株のマウスへの定着では、Δ００５０２又はΔ００５０９ Ｐ．ｃｌａｒａ株のマウスへの定着よりも多量の糞便中のＩｇＡ重鎖（α鎖）が検出された。これに対し、κ軽鎖はトリプシン耐性なので、各種Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させたマウス間での糞便中κ軽鎖レベルは同様であった。また、グラム陰性菌に対する抗菌ペプチドであるＲｅｇ３βは、κ軽鎖と同様にトリプシン分解耐性であった。

これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｐ．ｃｌａｒａ株の定着が、トリプシンによる分解からＩｇＡを保護することを示す。

図３２は、ＧＦマウスの糞便、２－ｍｉｘと共に野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種したＧＦマウスの糞便、上記２者を混合した試料、上記２者を混合した試料にトリプシン阻害剤（ＴＣＬＫ）を添加した試料を、３７℃で４８時間インキュベーションし、トリプシン（ＰＲＳＳ２）、ＩｇＡ重鎖、κ軽鎖、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｌｉｋｅ Ｅｌａｓｔａｓｅ ３Ｂ（ＣＥＬＡ３Ｂ）をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。

その結果、第１レーンの結果より、ＧＦマウスの糞便中にトリプシンが含まれており、ＩｇＡ重鎖が分解されたことが示された。また、第２レーンの結果より、２－ｍｉｘと共に野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種したＧＦマウスの糞便では、トリプシンが減少しておりＩｇＡ重鎖が残存していることが示された。また、第３レーンの結果より、ＧＦマウスの糞便中に残存していたトリプシンにより、２－ｍｉｘと共に野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種したＧＦマウスの糞便中に残存していたＩｇＡ重鎖が分解されたことが示された。また、第４レーンの結果より、トリプシン阻害剤の添加により、レーン３におけるＩｇＡ重鎖の分解が阻害されることが示された。また、第３、第４レーンの結果より、ＩｇＡ重鎖の方がκ軽鎖よりもトリプシンに分解されやすいことが示された。

［実験例６］
（Ｐ．ｃｌａｒａ株の定着が腸管病原菌の感染に与える影響の検討）
腸管病原菌が感染した条件下でも、Ｐ．ｃｌａｒａ株により媒介されるトリプシン分解がＩｇＡ量を維持できるかどうかを検討した。

ＧＦマウスに２－ｍｉｘ又は２－ｍｉｘに加えて野生型（ＷＴ）又はΔ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種し、１４日後に、主に大腸に感染するマウスの病原体である、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）を感染させた。

図３３は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の各群のマウスの体重変化を示すグラフである。図３３中、「＊＊」、「＊＊＊」は、それぞれ、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１で有意差があることを示す（２－ｍｉｘ＋Δ００５０２ ｖｓ． ２－ｍｉｘ）。また、「＃」はＰ＜０．０５で有意差があることを示す（２－ｍｉｘ＋ＷＴ ｖｓ． ２－ｍｉｘ）。

図３４上段は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染から７日後の各マウスの大腸の画像である。２－ｍｉｘ群では盲腸の色が白っぽく、収縮していた。図３４下段は、盲腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色の代表的な画像を示す顕微鏡写真である。

図３５は、ヘマトキシリン・エオジン染色に基づく盲腸組織の組織学的スコアを示すグラフである。図３５中、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。

その結果、２－ｍｉｘ群は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの感染に続き、急速な体重の減少と重篤な盲腸の炎症を示した。一方、Ｐ．ｃｌａｒａ定着マウスでは、体重減少はより軽度であり、盲腸の炎症もより軽度であった。これは、意外なことに、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群と２－ｍｉｘ＋Δ００５０２群ともに同様であった。この結果は、Ｐ．ｃｌａｒａ株が、トリプシン分解とは独立の機構でＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染から防御することを示唆した。

図３６は、糞便中の全ＩｇＡ、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的ＩｇＡ、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｌｉｋｅ Ｅｌａｓｔａｓｅ ３Ｂ（ＣＥＬＡ３Ｂ）をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。

その結果、同程度の盲腸の炎症に関らず、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群のマウスは高い総ＩｇＡ量で維持されており、２－ｍｉｘ＋Δ００５０２群に比べて、早ければＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の７日後から、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的ＩｇＡがかなり存在することが明らかとなった。

図３７は、生きたＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍと糞便液のｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションによって、糞便ＩｇＡによる凝集効果を評価した結果を示す写真である。その結果、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群の糞便微生物叢とＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ生菌をインキュベーションすると顕著な細菌の凝集が認められた。この結果は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的なＩｇＡが存在することを示す。

以上のことから、Ｐ．ｃｌａｒａ株は、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対する未知の機構による防御効果に加えて、病原体特異的ＩｇＡを保護することで、病原体に対する適応免疫反応を強めることが示された。

［実験例７］
（Ｐ．ｃｌａｒａ株を介したトリプシン分解はＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対するワクチン効果を高める）
Ｐ．ｃｌａｒａ株を介したトリプシンの分解とその結果としての病原体特異的ＩｇＡの保護は、腸内病原体に対する経口ワクチンの効果を高める可能性があり、同じ病原体に再びさらされたときに、より大きな抵抗性をもたらす。

この仮説を確認するために、以下の検討を行った。図３８は、本実験例のスケジュールを示す模式図である。２－ｍｉｘに加えてＷＴ又はΔ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させたＧＦマウスに、過酢酸で不活化したＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを週１回、３週間にわたって経口ワクチン接種した。その後、経口でＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ生菌を感染させた。

図３９はＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後のマウス体重の変化を示すグラフである。図３９中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。その結果、あらかじめ野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を接種したマウスは、体重減少が軽減されたことが明らかとなった。

続いて、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染から１４日目のマウスから盲腸パッチと管腔内容物を回収し、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵを測定した。図４０は盲腸パッチにおけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵの測定値を示すグラフである。また、図４１は管腔内容物におけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍのＣＦＵの測定値を示すグラフである。

その結果、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群及び２－ｍｉｘ＋Δ００５０２群の双方において、盲腸中のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの存在量は同様であったにもかかわらず、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群では、盲腸組織へのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの浸潤が抑制されていた。

図４２は、盲腸管腔内容物中のトリプシン（ＰＲＳＳ２）、全ＩｇＡ、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的ＩｇＡ、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ Ｌｉｋｅ Ｅｌａｓｔａｓｅ ３Ｂ（ＣＥＬＡ３Ｂ）をウエスタンブロットで解析した結果を示す写真である。

その結果、野生型（ＷＴ）Ｐ．ｃｌａｒａ株定着マウスの盲腸において、顕著に高い全ＩｇＡ量及び顕著に高いＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ特異的ＩｇＡ量が検出された。この結果から、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群へのＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ侵入に対する優れた防御効果には、ワクチンの効果が大きかったことが考えられた。

以上の結果は、Ｐ．ｃｌａｒａ株を送達することで、宿主が以前に遭遇した腸内病原菌に対してより効果的な対応ができるようになる、という発明者らの見解を支持するものである。

［実験例８］
（Ｐ．ｃｌａｒａ株はコロナウイルスの感染からマウスを保護する）
トリプシンやＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）等のトリプシン様プロテアーゼは、コロナウイルスのスパイクタンパク質のタンパク質分解活性化や、ウイルスと宿主の細胞膜の融合に関与することが知られている。

ＴＭＰＲＳＳ２は、肺や腸の上皮細胞に膜貫通型のタンパク質として発現しているが、自己切断を受けてプロテアーゼドメインを放出することができる。興味深いことに、発明者らは、上述する実験例５において、野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株が生着したＧＦマウスでは、糞便中のＴＭＰＲＳＳ２量が減少していることを見出した。このことは、Ｐ．ｃｌａｒａ株がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴＭＰＲＳＳ２の活性型の放出と似た効果を持つことを示唆する。このことは、腸内において、遊離型のＴＭＰＲＳＳ２が、トリプシンと一緒に、コロナウイルス感染を促進している可能性があることを示す。

Ｐ．ｃｌａｒａ株がトリプシンとＴＭＰＲＳＳ２の分解を介してコロナウイルスの腸内感染を防御する可能性を検討した。具体的には、Ｐ．ｃｌａｒａ株の定着がマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）（マウストロピックコロナウイルス）の感染に与える影響を検討した。

図４３は、ＭＨＶ感染実験の概要を説明する模式図である。ＧＦマウスに、２－ｍｉｘと合わせて、ＷＴ又はΔ００５０２ Ｐ．ｃｌａｒａ（ＪＣＭ１４８５９）株を接種し、１４日後にＭＨＶの経口感染を行った。

図４４は、ＭＨＶ感染後のマウスの生存曲線を示すグラフである。その結果、野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させることにより、ＭＨＶの致死的な感染の後で、マウスの生存が延長したことが明らかとなった。

図４５は、肝臓、脳、糞便中のＭＨＶのウイルスタイターを測定した結果を示すグラフである。図４５中、「＊」、「＊＊」、「＊＊＊」は、それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。

その結果、野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させることにより、肝臓や脳でのウイルスの拡散が有意に防御されたことが明らかとなった。また、２－ｍｉｘ＋ＷＴ群のマウスは、２－ｍｉｘ＋Δ００５０２群のマウスに比べて、糞便中に排出されるウイルス粒子の数が有意に少なかった。

図４６は、各群のマウスの肝臓組織のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す代表的な画像である。組織学的解析により、野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株を定着させたマウスは、ＭＨＶによる壊死性肝病理から保護されたことが明らかになった。

以上の結果は、コロナウイルスの感染時に、Ｐ．ｃｌａｒａ株の保菌が宿主に保護効果をもたらすことを示す。

［実験例９］
（ヒト微生物叢におけるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属及び関連する遺伝子の検出）
地理的に異なる６つのコホートから収集した約６００万個の非冗長完全遺伝子からなる腸内細菌遺伝子カタログを新規に作成し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、トリプシン関連００５０２遺伝子、００５０９遺伝子の存在量と有病率を分析した。

５，９２９，５２８個の遺伝子を持つ非冗長な腸内細菌遺伝子カタログに対してＵＳＥＡＲＣＨ ｕｂｌａｓｔ（タンパク質レベル）で相同性検索を行った結果、最小ｅ－ｖａｌｕｅが０．１のヒットに集約された。

図４７は、計算機上で検索した、トリプシン分解に関連する遺伝子（００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子）のホモログ及びそれをコードする種を示す図である。

図４８は、各細菌種におけるトリプシン分解に関連する遺伝子の遺伝子座の構造及びＰ．ｃｌａｒａ株の遺伝子に対する配列同一性（％）を示す図である。

その結果、まず、Ｐ．ｃｌａｒａ株の００５０２遺伝子と、Ｐ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の００５０２遺伝子ホモログが、同一又はほぼ同一であることが確認された。同様に、Ｐ．ｃｌａｒａ株の００５０９遺伝子と、Ｐ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の００５０９遺伝子ホモログが、同一又はほぼ同一であることが確認された。さらに、００５０２遺伝子及び００５０９遺伝子の間に位置する、００５０３～００５０８遺伝子についても、Ｐ．ｃｌａｒａ株の遺伝子と、Ｐ．ｘｙｌａｎｐｈｉｌａ株の遺伝子ホモログが、同一又はほぼ同一であることが確認された。

また、００５０２～００５０９遺伝子ホモログを持つ２つのメタゲノム種（ＭＳＰ ０３０３及びＭＳＰ ０３３５）を同定し、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属に属する可能性があることを確認した。

Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属にアノテーションされた２つのメタゲノム種（ＭＳＰ ０３０３とＭＳＰ ０３３５）は、Ｐ．ｃｌａｒａ株の遺伝子００５０２～００５０９の全て又はほぼ全てのホモログをコードしていた。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓにアノテーションされた５つのＭＳＰ（ＭＳＰ ００８１、ＭＳＰ ０２２４、ＭＳＰ ０２８８、ＭＳＰ ０４１０、ＭＳＰ ０４３５）は、００５０２遺伝子と００５０９遺伝子のホモログをコードしていたが、００５０３～００５０８遺伝子のホモログを欠いていた。

また、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓは００５０９遺伝子のホモログを有していないと考えられた。

メタゲノム解析の中で、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属は平均して最大３％の相対存在比を示し、その存在率はコホートによって大きく異なり（サンプルの７～５０％）、Ｐ．ｃｌａｒａ株が最も多い種であり、次いでＰ．ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌｌａ株が多かった。

これらのデータは、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種がヒトのかなりの部分の微生物叢を構成していることを示唆しており、これが腸内病原体の感染に対する感受性の個人差に関連している可能性がある。

ヒトのトリプシン濃度は、マウスと同様に、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａのようなトリプシンを分解する細菌種によって調節されていると考えられる。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）やクローン病（ＣＤ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者では、糞便中のトリプシン濃度が上昇することが報告されている。そこで、日本人コホートの非ＩＢＤ対照群（健常人）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）群、クローン病（ＣＤ）群の患者の糞便中のトリプシン活性を測定した。

図４９は、トリプシン活性の測定結果を示すグラフである。図４９中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。その結果、非ＩＢＤ対照群と比較して、ＵＣ患者及びＣＤ患者は、糞便中のトリプシン活性が高いことが明らかとなった。

続いて、２つのＩＢＤコホート（ＰＲＩＳＭ及びＨＭＰ２）の非ＩＢＤ対照群、ＵＣ群、ＣＤ群のサブグループにおけるＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの保菌率を分析した。図５０は、ＰＲＩＳＭコホート及びＨＭＰ２コホートにおいて、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）と診断された患者の集団における、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの保菌率を示すグラフである。その結果、両方の研究で、ＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａはＵＣやＣＤ患者よりも非ＩＢＤ検体において、より存在していることが判明した。また、より大規模なＨＭＰ２コホートにおいて、この傾向は統計的に有意であった。

これらの結果は、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａの保菌が、腸内の健康状態と関連があることを示唆する。

図５１は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ株、ポジティブコントロールとしての野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株（Ｐ．ｃｌａｒａ（ＷＴ）、ネガティブコントロールとしての００５０２遺伝子をノックアウトしたＰ．ｃｌａｒａ株（Ｐ．ｃｌａｒａ（００５０２ＫＯ））の各株を、組換えマウストリプシン（ｒｍＰＲＳＳ２、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ－ｔａｇを付加）と混合してインキュベーションし、ウエスタンブロットにてトリプシンの分解を測定した結果を示す写真である。その結果、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ株、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓ株が、トリプシン分解活性を有することが明らかとなった。

図５２は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（ＭＳＰ ００８１）株、ポジティブコントロールとしての野生型Ｐ．ｃｌａｒａ株（Ｐ．ｃｌａｒａ（ＷＴ）、ネガティブコントロールとしての００５０２遺伝子をノックアウトしたＰ．ｃｌａｒａ株（Ｐ．ｃｌａｒａ（００５０２ＫＯ））の各株を、組換えマウストリプシン（ｒｍＰＲＳＳ２、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ－ｔａｇを付加）と混合してインキュベーションし、ウエスタンブロットにてトリプシンの分解を測定した結果を示す写真である。その結果、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ（ＭＳＰ ００８１）株が、トリプシン分解活性を有することが明らかとなった。

本発明によれば、プロテアーゼの活性を制御する技術を提供することができる。

Claims (13)

1. Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓからなる群より選択される少なくとも１種の細菌を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
2. 前記細菌が生菌である、請求項１に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
3. 前記細菌が死菌である、請求項１に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
4. 固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる単離された００５０２タンパク質、若しくは、固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有する単離されたタンパク質、
   を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
5. 固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる単離された００５０２タンパク質、若しくは、固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有する単離されたタンパク質、及び、
   固相表面に固定された、配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる単離された００５０９タンパク質、若しくは、固相表面に固定された、配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有する単離されたタンパク質、
   を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
6. トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患の治療用である、請求項１～５のいずれか一項に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
7. 前記トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患が、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、過敏性腸炎、感染症、急性膵炎又は慢性膵炎である、請求項６に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
8. 前記感染症が、ウイルス感染症又は細菌感染症である、請求項７に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
9. 前記炎症性腸疾患、過敏性腸炎又は感染症が、ＴＭＰＲＳＳ２又はＩｇＡが関わる疾患である、請求項７又は８に記載のトリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２の分解用組成物。
10. 配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる００５０２タンパク質を検出することにより、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解する活性を検出するための、前記００５０２タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
11. 配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子を検出することにより、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２を分解する活性を検出するための、プライマーセット又はプローブ。
12. Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒａｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｒｉｓからなる群より選択される少なくとも１種の細菌を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患用医薬部外品。
13. 固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる単離された００５０２タンパク質、若しくは、固相表面に固定された、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し且つトリプシン結合能を有する単離されたタンパク質、
    を有効成分として含有する、トリプシン又はＴＭＰＲＳＳ２に起因する疾患用医薬部外品。