JP7852863B2

JP7852863B2 - ルミノコッカッセ腸内菌投与による免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果の増強

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Publication number: JP7852863B2
Application number: JP2022554056A
Authority: JP
Inventors: 博嘉西川; 聖大福岡; 義己辨野; 佑布子重野
Original assignee: National Cancer Center Japan; RIKEN
Current assignee: National Cancer Center Japan; RIKEN
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2026-04-28
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: EP4223868A1; JPWO2022071423A1; WO2022071423A1; US20230364163A1; TW202227611A; EP4223868A4; CN116322721A; AU2021355240A1; CA3202362A1; AU2021355240B2; AU2021355240A9

Description

本発明は、対象における腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物に関する。

免疫抑制機構を標的とした治療で複数のがん腫において著しい臨床効果をもたらしているのが免疫チェックポイント阻害薬である。免疫チェックポイント阻害薬は、悪性黒色腫、肺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、胃がんといった複数のがん腫で承認されている。しかしながら、免疫チェックポイント阻害薬単剤では、いまだ十分な治療効果が得られているとは言えない。

異なる免疫抑制阻害療法薬の併用や既存承認薬との併用により、複数の免疫抑制メカニズムを同時に解除することで、抗腫瘍免疫をさらに賦活化し、有効性を増強させる試みが提唱されており（特許文献１）、いくつかの臨床試験も行われている。しかし、十分な効果が得られているとは言い難いのが現状である。

免疫チェックポイント分子及び制御性Ｔ細胞を中心とした免疫抑制ネットワークが、がん微小環境において構築され、免疫寛容を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。これらの免疫応答に、腸内常在菌が影響していることが相次いで報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。

特表２０１５－５１８８２６

Nature Reviews Cancer, 12, 252-264 (2012) Science, 359, 91-97 (2018) Science, 359, 97-103 (2018)

本発明は、対象における腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強することができる医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、免疫チェックポイント阻害薬の治療を受けた胃がん・肺がん患者の腸内細菌を解析したところ、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例がルミノコッカス科の未分類属細菌を多く有することを見出した。さらに、本発明者らは、特定の細菌が抗腫瘍免疫に与える影響について検討するために、奏功例の腸内容物より細菌の単離培養を行った。単離した細菌を、抗菌薬投与によって固有の腸内細菌を減少させたマウスへ投与し、免疫チェックポイント阻害薬との併用効果を検討したところ、配列番号１に示す塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）が免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果を増強させることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、限定されるわけではないが、以下に関する。
［１］
ルミノコッカッセ腸内菌の単離方法であって：
（ｉ）免疫チェックポイント阻害薬を投与された哺乳動物であって、投与後のＣＴ画像評価によってＰＲ（部分奏効）以上の評価が得られた、又は半年以上にわたってＳＤ（病勢安定）の評価が得られた該哺乳動物から得られた腸内容物を、嫌気性希釈液を用いて段階希釈して、腸内容物希釈液を生成する工程；
（ｉｉ）該腸内容物希釈液の一部を固形培地に接種して嫌気性条件下で培養し、腸内容物希釈液に含まれる微生物の単一クローンに由来するコロニー（複数可）を固形培地上に生成する工程；
（ｉｉｉ）該コロニーに含まれる細菌が、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するものであるかどうかを確認する工程；及び
（ｉｖ）配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有することが確認された細菌を取得する工程
を含む単離方法。
［２］
免疫チェックポイント阻害薬が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ－９、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、及びＢ７－Ｈ７からなる群より選択されるいずれかの免疫チェックポイント分子に対する阻害剤又はそれら阻害剤の２以上の組み合わせである、［１］に記載の単離方法。
［３］
免疫チェックポイント阻害薬が、前記免疫チェックポイント分子に対する抗体、抗体の抗原結合性断片、及びそれらの組み合わせから選択される、［２］に記載の単離方法。
［４］
免疫チェックポイント阻害薬が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブからなる群より選択される、［３］に記載の単離方法。
［５］
哺乳動物がヒトである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の単離方法。
［６］
医薬組成物の製造方法であって、［１］～［５］のいずれか一項に記載の単離方法によって単離されたルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を配合して医薬組成物とする工程を含む、製造方法。
［７］
医薬組成物が、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される医薬組成物である、［６］に記載の製造方法。
［８］
［６］又は［７］に記載の製造方法によって製造された、医薬組成物。
［９］
免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物。
［１０］
ルミノコッカッセ腸内菌の生菌体を含む、［９］に記載の医薬組成物。
［１１］
ルミノコッカッセ腸内菌が、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌である、［９］又は［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
免疫チェックポイント阻害薬が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ－９、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、及びＢ７－Ｈ７からなる群より選択されるいずれかの免疫チェックポイント分子に対する阻害剤又はそれら阻害剤の２以上の組み合わせである、［８］～［１１］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１３］
免疫チェックポイント阻害薬が、前記免疫チェックポイント分子に対する抗体、抗体の抗原結合性断片、及びそれらの組み合わせから選択される、［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］
免疫チェックポイント阻害薬が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブからなる群より選択される、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
経口投与、経管投与、又は注腸投与によって投与される、［８］～［１４］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１６］
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが同時に投与される、［８］～［１５］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１７］
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とを含む、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが別々に投与される、［８］～［１５］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１９］
免疫チェックポイント阻害薬の投与前に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
免疫チェックポイント阻害薬の投与後に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、［１８］に記載の医薬組成物。
［２１］
対象において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化するための、［８］～［２０］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［２２］
腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するための、［８］～［２１］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［２３］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんに対する免疫応答の増強効果が大きい、［２２］に記載の医薬組成物。
［２４］
対象における腫瘍又はがんを治療するための、［８］～［２３］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［２５］
前記治療が、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定化させることである、［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定させる効果が大きい、［２５］に記載の医薬組成物。
［２７］
対象における腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制するための、［８］～［２５］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［２８］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍もしくはがんの再発又は転移の抑制効果が大きい、［２７］に記載の医薬組成物。
［２９］
手術療法、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される１以上の療法とさらに組み合わせて投与される、［２２］～［２８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３０］
腫瘍又はがんが、悪性胸膜中皮腫、悪性腹膜中皮腫、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胸腺腫、消化管間質腫瘍、神経内分泌腫瘍、精巣腫瘍、軟部肉腫、腎芽腫、肝芽腫、胚細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、口腔咽頭がん、喉頭がん、舌がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、耳下腺がん、顎下腺がん、聴器がん、肺がん、乳がん、胸腺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、小腸がん、肝細胞がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、尿膜管がん、副腎がん、腹膜がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、膣がん、外陰がん、基底細胞がん、有棘細胞がん、神経内分泌がん、カポジ肉腫、及び原発不明がんからなる群より選択される、［２２］～［２９］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３１］
投与前と比較して哺乳動物の腸内常在菌の多様性を増加させるための、［８］～［２０］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３２］
腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強する方法。
［３３］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんに対する免疫応答の増強効果が大きい、［３２］に記載の方法。
［３４］
腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、腫瘍又はがんの治療方法。
［３５］
前記治療が、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定化させることである、［３４］に記載の方法。
［３６］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定させる効果が大きい、［３５］に記載の方法。
［３７］
腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、対象における腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制する方法。
［３８］
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍もしくはがんの再発又は転移の抑制効果が大きい、［３７］に記載の方法。
［３９］
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが同時に投与される、［３２］～［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが別々に投与される、［３２］～［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］
免疫チェックポイント阻害薬の投与前に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、［４０］に記載の方法。
［４２］
免疫チェックポイント阻害薬の投与後に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、［４０］に記載の医薬組成物。
［４３］
手術療法、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される１以上の療法とさらに組み合わせて実施される、［３２］～［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］
腫瘍又はがんが、悪性胸膜中皮腫、悪性腹膜中皮腫、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胸腺腫、消化管間質腫瘍、神経内分泌腫瘍、精巣腫瘍、軟部肉腫、腎芽腫、肝芽腫、胚細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、口腔咽頭がん、喉頭がん、舌がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、耳下腺がん、顎下腺がん、聴器がん、肺がん、乳がん、胸腺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、小腸がん、肝細胞がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、尿膜管がん、副腎がん、腹膜がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、膣がん、外陰がん、基底細胞がん、有棘細胞がん、神経内分泌がん、カポジ肉腫、及び原発不明がんからなる群より選択される、［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
哺乳動物に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物の腸内常在菌を投与前と比較して増加させる方法。
［４６］
樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物であって、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲの作動薬を含む医薬組成物。
［４７］
前記複数のＴＬＲが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９である、［４６］に記載の医薬組成物。
［４８］
前記複数のＴＬＲが、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９である、［４７］に記載の医薬組成物。
［４９］
前記作動薬が、フラジェリン、Ｒ８４８（レシキモド）、及びＣｐＧ－ＯＤＮの組み合わせである、［４８］に記載の医薬組成物。
［５０］
前記作動薬が、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物である、［４６］～［４８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［５１］
対象において、腫瘍又はがんを治療するための、［４６］～［５０］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［５２］
樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法であって、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲの作動薬を、樹状細胞前駆細胞と接触させることを含む、方法。
［５３］
ｉｎｖｉｔｒｏで行われる、［５２］に記載の方法。
［５４］
前記複数のＴＬＲが、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９である、［５２］又は［５３］に記載の方法。
［５５］
前記作動薬が、フラジェリン、Ｒ８４８（レシキモド）、及びＣｐＧ－ＯＤＮの組み合わせである、［５４］に記載の方法。
［５６］
前記作動薬が、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物である、［５２］～［５５］のいずれか一項に記載の方法。
［５７］
［５２］～［５６］のいずれか一項に記載の方法によって誘導された１型樹状細胞。
［５８］
対象において、腫瘍又はがんを治療するための、［５７］に記載の１型樹状細胞を含む医薬組成物。
［５９］
腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するための、［５７］に記載の１型樹状細胞を含む医薬組成物。

本発明により、対象における腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強することができる。

図１は、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例及び非奏功例における腸内常在菌を比較したＬＥｆＳｅ解析の結果である。図２は、腸内常在菌において種々の細菌群の割合の中央値が高い患者群と低い患者群について、無増悪生存期間を比較した結果である。図３は、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例由来腸内容物または非奏功例由来腸内容物を移植したマウス腫瘍モデルにおける、免疫チェックポイント阻害薬の効果を検討した結果である。図４は、抗生剤処理したマウス腫瘍モデルに免疫チェックポイント阻害薬の奏功例由来腸内容物を移植したものにおいて、免疫チェックポイント阻害薬の効果を検討した結果である。図５は、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例由来腸内容物における細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の系統解析結果である。図６は、抗生剤処理したマウス腫瘍モデルに各種細菌を移植し、免疫チェックポイント阻害薬の効果を検討した結果である。図７は、抗生物質処理したマウス腫瘍モデルに、B. vulgatus又はルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を移植し、免疫チェックポイント阻害薬の効果を検討した結果である。図８は、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はビヒクルと共培養した樹状細胞において、樹状細胞成熟化マーカーを測定したフローサイトメトリーの結果である。図９は、細菌と共培養した後の樹状細胞をＯＴ－Ｉマウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養して、１ｎＭ又は１００ｎＭのＮ４ペプチドで刺激を与えた場合の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化マーカー（ＩＦＮ－γ）の測定結果である。図１０は、細菌と共培養した後の樹状細胞をＯＴ－Ｉマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養して、Ｎ４ペプチド又はＱ４Ｈ７ペプチドで刺激を与えた場合の、ＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０）及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ）の測定結果である。図１１は、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養した場合、及びB. vulgatusと共培養した樹状細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養した場合のそれぞれにおいて、ＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０（ｐＺＡＰ７０））及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ｓ６（ｐＳ６））に対する、異なる濃度のＮ４ペプチド刺激の効果（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）を調べた結果である。図１２は、抗生剤処理したマウス腫瘍モデルに免疫チェックポイント阻害薬の奏功例由来腸内容物又は非奏功例由来腸内容物を移植し、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）単菌又はB. vulgatus単菌を経口投与したものにおいて、免疫チェックポイント阻害薬の効果を検討した結果である。図１３は、腸内容物移植後と、単菌投与後のそれぞれにおいて回収したマウスの腸内容物について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づくメタ解析を行い、それぞれの腸内容物における細菌叢の多様性を比較した結果である。図１４は、マウス骨髄由来の樹状細胞と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）とを共培養したのちに、樹状細胞からRNAを抽出し、トランスクリプトーム解析を行った結果を示す。図１５は、MC38培養細胞株を皮下移植後、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatusを経口投与されたマウスから採取した各組織（腫瘍近傍リンパ節、粘膜固有層、腸管膜リンパ節）のFACS解析結果を示す。図１６は、MC38培養細胞株を皮下移植後、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatusを経口投与されたマウスから採取した腫瘍のFACS解析結果を示す。図１７は、骨髄由来樹状細胞前駆細胞と、FLT3Lと、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はPBSとを共培養した後、IRF8の発現についてFACS解析した結果を示す。図１８は、マウス骨髄由来樹状細胞と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はPBSとを共培養した後、p-S6Kおよびp-STAT3の発現についてFACS解析した結果を示す。図１９は、ＴＬＲ複合刺激による樹状細胞前駆細胞の１型樹状細胞への誘導を示す。Ａは、ルミノコッカッセYB328で刺激した樹状細胞と、B. vulgatusで刺激した樹状細胞における、各種TLRに着目したトランスクリプトーム解析結果を示す。Ｂは、MyD88ノックアウトマウスから採取した骨髄由来樹状細胞を、ルミノコッカッセYB328またはビヒクルで刺激して、CD103陽性CD11ｂ陰性樹状細胞の割合についてFACS解析した結果を示す。Ｃは、ＴＬＲ５、７、及び９のそれぞれの作動薬の種々の混合物によって、マウス骨髄由来樹状細胞を刺激して、CD103陽性CD11ｂ陰性樹状細胞の割合についてFACS解析した結果を示す。

本発明の一つの側面によれば、ルミノコッカッセ腸内菌の単離方法が提供される。

本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、
（ｉ）免疫チェックポイント阻害薬を投与された哺乳動物であって、投与後のＣＴ画像評価によってＰＲ（部分奏効）以上の評価が得られた、又は半年以上にわたってＳＤ（病勢安定）の評価が得られた該哺乳動物から得られた腸内容物を、嫌気性希釈液を用いて段階希釈して、腸内容物希釈液を生成する工程；
（ｉｉ）該腸内容物希釈液の一部を固形培地に接種して嫌気性条件下で培養し、腸内容物希釈液に含まれる微生物の単一クローンに由来するコロニー（複数可）を固形培地上に生成する工程；
（ｉｉｉ）該コロニーに含まれる細菌が、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するものであるかどうかを確認する工程；及び
（ｉｖ）配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有することが確認された細菌を取得する工程
を含む。

＜ルミノコッカッセ腸内菌の単離方法＞
本発明におけるルミノコッカッセ腸内菌は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することにより、対象における腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強することができる。本発明者らは、このようなルミノコッカッセ腸内菌を、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例であるヒトから単離することができることを驚くべきことに見出した。

＜腸内容物希釈液を生成する工程＞
本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、（ｉ）免疫チェックポイント阻害薬を投与された哺乳動物であって、投与後のＣＴ画像評価によってＰＲ（部分奏効）以上の評価が得られた、又は半年以上ＳＤ（病勢安定）が得られた該哺乳動物から得られた腸内容物を、嫌気性希釈液を用いて段階希釈して、腸内容物希釈液を生成する工程を含む。

ＣＲ（Complete Response、完全奏功）、ＰＲ（Partial Response、部分奏功）、ＳＤ（Stable Disease、病勢安定）、ＰＤ（Progressive Disease、進行）は、腫瘍もしくはがんの消失、縮小、又は安定化の指標として、当業界で一般的な評価基準である。ＣＲは腫瘍が完全に消失した状態、ＰＲは腫瘍のサイズの合計が３０％以上減少した状態、ＳＤは腫瘍のサイズが変化しない状態、ＰＤは腫瘍のサイズの合計が２０％以上増加し、かつ絶対値でも５ｍｍ以上増加した状態、あるいは新病変が出現した状態をいう。腫瘍のサイズは、ＣＴ画像評価によって評価することができる。ＣＴ画像評価としては、たとえばＲＥＣＩＳＴｖｅｒ１．１を用いることができる。

本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法では、免疫チェックポイント阻害薬を投与された哺乳動物であって、投与後のＣＴ画像評価によってＰＲ（部分奏効）以上の評価が得られた、又は半年以上ＳＤ（病勢安定）が得られた該哺乳動物から得られた腸内容物を用いる。ここでＰＲ（部分奏効）以上の評価とは、ＰＲ（部分奏功）またはＣＲ（完全奏功）を意味する。

本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、上記腸内容物を、嫌気性希釈液を用いて段階希釈して、腸内容物希釈液を生成する工程を含む。嫌気性希釈液としては、嫌気性細菌の生存に悪影響を及ぼさない希釈液であればいずれを用いてもよいが、たとえば、『腸内菌の世界』光岡知足（1990）、朝倉書店の記載に従い、同書の嫌気性希釈液（Ｂ）を用いることができる。希釈倍率は適宜調整すればよいが、固形培地上におけるコロニー生成のためには、たとえば１０^－６～１０^－１０の範囲で１０倍希釈系列を作り、もっともコロニー生成に適した希釈倍率を選択することができる。

＜コロニーを生成する工程＞
本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、上記腸内容物希釈液の一部を固形培地に接種して嫌気性条件下で培養し、腸内容物希釈液に含まれる微生物の単一クローンに由来するコロニー（複数可）を固形培地上に生成する工程を含む。

固形培地としては、たとえばＥＧ寒天培地を用いることができる。ＥＧ寒天培地の標準的な組成を以下に示す。

嫌気条件とは、酸素が存在せず、気相として窒素ガス、水素ガスおよび炭酸ガスで置換された環境をいう。実質的に酸素が存在しない環境は、ルミノコッカッセ腸内菌が増殖可能な程度に酸素分圧が低い雰囲気を維持することができる嫌気性チャンバー等の密閉環境で達成することができる。

＜細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を確認する工程＞
本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、上記生成されたコロニーに含まれる細菌が、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するものであるかどうかを確認する工程を含む。

本発明におけるルミノコッカッセ腸内菌は、フィルミクテス門クロストリジウム綱クロストリジウム目ルミノコッカス科に分類される偏性嫌気性細菌をいい、特に配列番号１に示す塩基配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌をいう。

２つの遺伝子塩基配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：３８７）。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。

上記生成されたコロニーに含まれる細菌が、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するものであるかどうかを確認する方法としては、たとえば、各コロニーを形成している細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定して、配列番号１の塩基配列と比較する方法が挙げられる。細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、公知のプライマーを用いたＰＣＲ等によって増幅し、標準的なシークエンシング方法によって配列決定することができる。

＜細菌を取得する工程＞
本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、（ｉｖ）配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有することが確認された細菌を取得する工程を含む。

上記方法によって、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有することが確認されたルミノコッカッセ腸内菌は、コロニーから液体培地に接種して、さらに大量に培養して利用することができる。液体培地としては、たとえば上記ＥＧ寒天培地組成の内、寒天を含まない液体培地（以後、単にＥＧ培地ということがある）を用いることができる。

＜腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強する効果を確認する工程＞
本発明のルミノコッカッセ腸内菌の単離方法は、必要に応じて、取得したルミノコッカッセ腸内菌について、腫瘍又はがんに対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強する効果を有することを確認する工程を含んでもよい。たとえば、得られたルミノコッカッセ腸内菌を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて、腫瘍又はがんを有するマウス、ラット、ヒト等の哺乳動物に投与して、免疫チェックポイント阻害薬単独投与の場合と比較して、免疫チェックポイント阻害薬の効果が増強されることを確認することができる。具体的には、たとえば、免疫チェックポイント阻害薬を単独投与した場合と比較して、得られたルミノコッカッセ腸内菌を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与した場合において、腫瘍もしくはがんが消失しているか、そのサイズが縮小しているか、又はそのサイズが変化せずに安定化していれば、免疫チェックポイント阻害薬の効果が増強されていると評価することができる。

＜医薬組成物のためのルミノコッカッセ腸内菌＞
本発明の一つの側面によれば、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物及びその製造方法が提供される。

本発明の医薬組成物に用いるルミノコッカッセ腸内菌としては、配列番号１に示す塩基配列と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するものであるものが好ましい。そのような細菌としては、上記単離方法によって単離された細菌を好適に用いることができる。

本発明の医薬組成物に用いるルミノコッカッセ腸内菌としては、本発明者らが単離したルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を例示することができる。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）は、配列番号１に示す塩基配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する。本出願人は、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を、国立研究開発法人理化学研究所内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を第三者に分譲することを保証する。

ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）は、たとえば、上記ＥＧ培地を用いて、嫌気性チャンバー内で、３７℃で好適に培養することができる。

本発明の医薬組成物は、複数種のルミノコッカッセ腸内菌を含むものであってもよいし、単一種のルミノコッカッセ腸内菌を含むものであってもよい。単一種で効果を発揮することができるルミノコッカッセ腸内菌としては、たとえばルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を挙げることができる。腸内容物そのもののようにきわめて多種多様な細菌を含む組成物を人体に移植すると、感染症やアレルギー反応等の副反応を生じるリスクがあるが、本発明の複数種のルミノコッカッセ腸内菌又は単一種のルミノコッカッセ腸内菌を用いることにより、このようなリスクを回避することが可能になる。

本発明は、上記ルミノコッカッセ腸内菌を配合する工程を含む、医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物の製造方法は、上記ルミノコッカッセ腸内菌の単離方法によって単離されたルミノコッカッセ腸内菌を配合する工程を含んでもよい。

＜ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物＞
本発明の医薬組成物は、上記ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む。菌体を用いる場合、生菌体が好ましい。生菌体は、ルミノコッカッセ腸内菌の培養用培地を含む培養物の形態であってもよく、菌体の凍結乾燥物の形態であってもよい。本発明に用いるルミノコッカッセ腸内菌の培養上清は、細菌の培養物から、遠心分離等の手法によって細菌を取り除いた後の液体部分をいう。本発明に用いるルミノコッカッセ腸内菌の代謝産物は、上記培養物や培養上清等から適宜精製することができる。本発明に用いるルミノコッカッセ腸内菌の菌体抽出物は、粉砕、超音波処理、アルカリ処理による溶解等の方法によって菌体を破壊し、所望により適宜分画及び／又は精製して得られた抽出物をいい、菌体内容物、細胞膜成分、それらの精製物、又はそれらの組み合わせ等を適宜用いることができる。

＜免疫チェックポイント阻害薬＞
本発明の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することができる。本明細書において免疫チェックポイント阻害薬とは、免疫チェックポイント分子の機能を阻害して、Ｔ細胞応答の抑制を解除する機能を有する薬剤をいう。本発明に用いる免疫チェックポイント阻害薬としては、ヒトに対する免疫チェックポイント阻害薬であることが好ましく、たとえばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ－９、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、及びＢ７－Ｈ７からなる群より選択されるいずれかの免疫チェックポイント分子に対する阻害剤又はそれら阻害剤の２以上の組み合わせを好適に用いることができる。本発明に用いる免疫チェックポイント阻害薬は、好適には、前記免疫チェックポイント分子に対する抗体、抗体の抗原結合性断片、及びそれらの組み合わせであり、たとえばニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、及びデュルバルマブからなる群より選択される。

＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物の形態は、特に限定されないが、目的に応じて、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、腸溶カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤、ゲル剤等の形態を適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物をそのまま用いてもよいし、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物に加えて、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を使用して製剤化したものを用いてもよい。

本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されず、製剤形態、患者の年齢や性別、疾患の程度等を考慮して、適宜設定することができる。たとえば、経口投与、経管投与、注腸投与、等の投与方法を好適に用いることができる。

本発明の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することができる。具体的には、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物を、免疫チェックポイント阻害薬の投与と同時に、免疫チェックポイント阻害薬の投与とは別々に、免疫チェックポイント阻害薬の投与前に、又は免疫チェックポイント阻害薬の投与後に投与することができる。ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物と、免疫チェックポイント阻害薬とを１つの製剤中に配合した配合剤の形態としたものを、本発明の医薬組成物として用いてもよい。

本発明の医薬組成物の投与レジメンは、製剤形態、患者の年齢や性別、疾患の程度等を考慮して、適宜設定することができるが、通常、ルミノコッカッセ腸内菌を、１日あたり患者１人あたり約１×１０^８個～１×１０^１１個投与するのが好ましく、患者１人あたり約１×１０^９個～１×１０^１０個投与するのがさらに好ましい。

本発明の別の側面によれば、対象において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化するための、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物が提供される。

後述するように、本発明のルミノコッカッセ腸内菌は、B. vulgatus等の他の細菌又はＰＢＳや生理食塩水等のビヒクルを投与した場合と比較して、樹状細胞を成熟化させることを介してＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）を活性化させる効果を有する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は、たとえばＩＦＮ－γタンパク質又はこれをコードするポリヌクレオチドの発現量を測定することにより解析することができる。タンパク質またはポリヌクレオチドの発現量は、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット等の定量的タンパク質発現解析や、トランスクリプトーム解析、リアルタイム定量ＰＣＲ等の定量的遺伝子発現解析等の公知の方法を適宜用いて解析することができる。本発明の別の側面によれば、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物であって、腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するための医薬組成物が提供される。

＜腫瘍又はがん＞
本明細書において、腫瘍又はがんは、たとえば悪性胸膜中皮腫、悪性腹膜中皮腫、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胸腺腫、消化管間質腫瘍、神経内分泌腫瘍、精巣腫瘍、軟部肉腫、腎芽腫、肝芽腫、胚細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成症候群、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、口腔咽頭がん、喉頭がん、舌がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、耳下腺がん、顎下腺がん、聴器がん、肺がん、乳がん、胸腺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、小腸がん、肝細胞がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、腎細胞がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、尿膜管がん、副腎がん、腹膜がん、前立腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、膣がん、外陰がん、基底細胞がん、有棘細胞がん、神経内分泌がん、カポジ肉腫、及び原発不明がんをいうが、これらに限定されない。

＜免疫応答の増強効果＞
対象において免疫チェックポイント阻害薬を単独投与した場合と、本発明の医薬組成物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与した場合とを比較して、免疫応答が活性化していることを示す指標に基づいて、腫瘍又はがんに対する免疫応答が増強されていることを評価することができる。免疫応答が活性化していることを示す指標としては、たとえば、傷害性Ｔ細胞もしくはその前駆細胞であるＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４４^＋細胞の割合の増加、ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α^＋ＩＦＮ－γ^＋細胞の割合の増加、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞）数の減少、ＦｏｘＰ３^＋細胞数に対するＣＤ４^＋細胞数の比の上昇、樹状細胞の成熟化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ等）の発現上昇、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化マーカー（ＩＦＮ－γ等）の発現上昇、ＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０等）の発現上昇、及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ｓ６（ｐＳ６）等）の発現上昇等を採用することができるが、これらに限定されない。

本発明の別の側面によれば、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物であって、対象における腫瘍又はがんを治療するための医薬組成物が提供される。

＜腫瘍又はがんの治療効果＞
免疫チェックポイント阻害薬を単独投与した場合と比較して、本発明の医薬組成物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与した場合において、腫瘍もしくはがんが消失しているか、そのサイズが縮小しているか、又はそのサイズが変化せずに安定化していれば、本発明の医薬組成物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することによって、腫瘍又はがんの治療効果が示されたと評価することができる。

腫瘍もしくはがんの消失、縮小、又は安定化の指標としては、当業界で一般的な評価基準であるＣＲ（Complete Response）、ＰＲ（Partial Response）、ＳＤ（Stable Disease）、ＰＤ（Progressive Disease）を採用してもよい。ＣＲは腫瘍が完全に消失した状態、ＰＲは腫瘍のサイズの合計が３０％以上減少した状態、ＳＤは腫瘍のサイズが変化しない状態、ＰＤは腫瘍のサイズの合計が２０％以上増加し、かつ絶対値でも５ｍｍ以上増加した状態、あるいは新病変が出現した状態をいう。本明細書では、ＣＲ、ＰＲ、又はＳＤと評価された場合、腫瘍又はがんに対する治療効果があると判断する。

本発明の別の側面によれば、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与される、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物であって、対象における腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制するための医薬組成物が提供される。

＜腫瘍もしくはがんの再発又は転移の抑制効果＞
本明細書において、腫瘍又はがんの再発とは、腫瘍又はがんの治療後１か月以内、６か月以内、１年以内、３年以内、５年以内、又は１０年以内に、治療した腫瘍又はがんの近傍において、腫瘍又はがんが再び出現することをいう。また、本明細書において、腫瘍又はがんの転移とは、腫瘍又はがんの治療後１か月以内、６か月以内、１年以内、３年以内、５年以内、又は１０年以内に、治療した腫瘍又はがんから離れた場所に腫瘍又はがんが発生することをいう。

免疫チェックポイント阻害薬を単独投与した場合と比較して、本発明の医薬組成物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与した場合において、腫瘍又はがんの治療後１か月以内、６か月以内、１年以内、３年以内、５年以内、又は１０年以内に、腫瘍もしくはがんの再発又は転移がまったく発生しないか、発生するタイミングが遅延するか、あるいは発生数が減少していれば、本発明の医薬組成物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することによって、腫瘍もしくはがんの再発又は転移の抑制効果が示されたと評価することができる。

本発明の医薬組成物は、手術療法、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される１以上の療法とさらに組み合わせて投与されてもよい。

＜手術療法、化学療法、及び放射線療法＞
本発明の医薬組成物と組み合わせることができる手術療法には、腫瘍又はがんの病巣の切除、腫瘍又はがんを有する臓器の切除、腫瘍又はがんの周辺にあるリンパ節の郭清等を目的とする直視下手術及び鏡視下手術等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物と組み合わせることができる化学療法とは、腫瘍又はがん細胞の増殖や成長を妨げるか、その死滅を促進する薬物による処置をいい、ホルモン療法及び分子標的療法を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物と組み合わせることができる放射線療法とは、腫瘍又はがんの細胞を死滅させること、腫瘍又はがんを縮小させること、腫瘍又はがんの再発や転移を予防すること、及び腫瘍又はがんの症状を緩和することを目的とした放射線照射処置をいい、外部照射及び内部照射を含むが、これらに限定されない。

＜免疫応答を増強する方法、腫瘍又はがんの治療方法、腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制する方法＞
本発明の別の側面によれば、腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強する方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、腫瘍又はがんの治療方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、腫瘍又はがんを有する対象に、免疫チェックポイント阻害薬の有効量と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量とを組み合わせて投与することを含む、対象における腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制する方法が提供される。

上記方法は、手術療法、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される１以上の療法とさらに組み合わせて実施されてもよい。

＜腸内常在菌の多様性を増加させるための医薬組成物又は方法＞
上記ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物は、哺乳動物に投与することにより、投与前と比較して、該哺乳動物の腸内常在菌の多様性を増加させることができる。したがって、ある側面からは、本発明は、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物であって、投与前と比較して哺乳動物の腸内常在菌の多様性を増加させるための医薬組成物に関する。別の側面からは、本発明は、哺乳動物に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、該哺乳動物の腸内常在菌を投与前と比較して増加させる方法にも関する。

腸内常在菌の多様性は、たとえばＳｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数（以後、シャノン指数と呼ぶことがある）を用いることができる。シャノン指数は、以下の式で表される。

ここでＳは種数、ｐ_ｉはｉ番目の種類の個体数（ｎ_ｉ）が総個体数Ｎに占める割合を示し、ｐ_ｉ＝ｎ_ｉ／Ｎである。

本発明のルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を含む医薬組成物は、哺乳動物に投与することにより、投与後の腸内常在菌におけるシャノン指数Ｈ’を、投与前の腸内常在菌におけるシャノン指数Ｈ’と比較して増加させることができ、好ましくは有意に増加させることができる。免疫チェックポイント阻害薬の非奏功例では、腸内常在菌の多様性が低いことがわかっている。本発明のルミノコッカッセ腸内菌は、他の細菌と比較して、腸内常在菌の多様性を増加させる高い効果を有する。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のルミノコッカッセ腸内菌が抗腫瘍免疫応答を惹起するメカニズムのひとつとして、腸内常在菌の多様性を増加させることが寄与している可能性がある。

哺乳動物の腸内常在菌の多様性を増加させるための本発明の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与してもよい。

＜樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物及び方法＞
後述するように、本発明者らは、ルミノコッカッセ腸内菌が、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導させることができることを見出した。さらに、樹状細胞前駆細胞から１型樹状細胞への誘導には、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲが同時に刺激されることが重要であることを見出した。

したがって、本発明は、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物であって、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲの作動薬を含む医薬組成物にも関する。

樹状細胞前駆細胞は、樹状細胞成熟化マーカーの発現が、成熟樹状細胞より低いものをいう。樹状細胞成熟化マーカーの例としてはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における樹状細胞前駆細胞は、骨髄由来樹状細胞残区細胞であることが好ましい。樹状細胞前駆細胞は、種々の刺激に応じて分化し、最終的には１型樹状細胞（標準型１型樹状細胞ともいう、ｃＤＣ１）、２型樹状細胞（標準型２型樹状細胞ともいう、ｃＤＣ２）、または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に分化する。本発明において１型樹状細胞とは、CD103陽性CD11b陰性樹状細胞をいう。

本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物は、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲの作動薬を含む。ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９からなる群から選択される複数のＴＬＲを挙げることができるが、これらに限定されない。ＴＬＲ１／ＴＬＲ２の作動薬の例としてはＰａｍ３ＣＳＫ４が挙げられ、ＴＬＲ２の作動薬の例としてはヒストンが挙げられ、ＴＬＲ２／ＴＬＲ６の作動薬の例としてはチモサン、ＭＡＬＰ－２が挙げられ、ＴＬＲ３の作動薬の例としてはＰｏｌｙ（Ｉ）／Ｐｏｌｙ（Ｃ）が挙げられ、ＴＬＲ４の作動薬の例としてはＬＰＳが挙げられ、ＴＬＲ５の例としてはフラジェリンが挙げられ、ＴＬＲ７の作動薬の例としては、Ｒ８３７（イミキモド）が挙げられ、ＴＬＲ７／８の作動薬の例としてはＲ８４８（レシキモド）が挙げられ、ＴＬＲ９の作動薬の例としては、ＯＤＮ１８２６等のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物を、本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物に含まれる作動薬として用いてもよい。

本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物は、対象において、腫瘍又はがんを治療するために使用することができる。また、本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導するための医薬組成物は、腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するために使用することができる。

本発明はまた、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法であって、ＴＬＲ４以外の複数のＴＬＲの作動薬を、樹状細胞前駆細胞と接触させることを含む、方法にも関する。

本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法は、ｉｎｖｉｖｏで行ってもよいし、ｉｎｖｉｔｒｏで行ってもよい。

本発明の樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法で用いる樹状細胞前駆細胞の由来は限定されないが、好ましくはヒト由来である。

本発明はさらに、上記樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法によって誘導された１型樹状細胞にも関する。

本発明の、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法によって誘導された１型樹状細胞は、対象において腫瘍又はがんを治療するために使用することができる。また、本発明の、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法によって誘導された１型樹状細胞は、腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するために使用することができる。

したがって、本発明は、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法によって誘導された１型樹状細胞を含む、対象において腫瘍又はがんを治療するための医薬組成物にも関する。また、本発明は、樹状細胞前駆細胞を１型樹状細胞へと誘導する方法によって誘導された１型樹状細胞を含む、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するための医薬組成物にも関する。

以下、実施例について説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本発明を種々変更、修飾して使用することが可能であり、これらも本発明の範囲に含まれる。

＜免疫チェックポイント阻害薬奏功例及び非奏功例における腸内常在菌のメタゲノム解析＞
免疫チェックポイント阻害薬であるニボルマブ又はペムブロリズマブを投与したヒト患者（胃癌４３例、肺癌１８例）の腸内容物サンプルを用いて、免疫チェックポイント阻害薬の奏功例及び非奏功例における腸内常在菌のメタゲノム解析を行った。ＣＴ画像評価によるＲＥＣＩＳＴｖｅｒ１．１による評価でＰＲ（部分奏功）以上の評価を得られたか、または半年以上ＳＤ（病勢安定）が得られた患者を奏功例と定義し、非奏功例はそれ以外の症例と定義した。

奏功例と非奏功例の腸内常在菌を比較したＬＥｆＳｅ解析の結果を図１に示す。これにより、奏功例に多い細菌群として、ルミノコッカッセ腸内菌群が同定され、さらにルミノコッカス科に属するルミノコッカス属細菌群及びルミノコッカス未分類属細菌群が同定された。

次に、腸内常在菌において各細菌群が占める割合の違いと、患者の無増悪生存期間（Progression Free Survival:PFS）との相関を調べた。具体的には、腸内常在菌におけるルミノコッカッセ腸内菌群の割合の中央値が高い患者群（高ルミノコッカッセ腸内菌群）と、腸内常在菌におけるルミノコッカッセ腸内菌群の割合の中央値が低い患者群（低ルミノコッカッセ腸内菌群）について、無増悪生存期間を比較した。ルミノコッカス未分類属細菌群、ルミノコッカス属細菌群、及びバクテロイデス細菌群についてもそれぞれ同様に、腸内常在菌における各細菌群の割合の中央値が高い患者群と低い患者群について、無増悪生存期間を比較した。結果を図２に示す。高ルミノコッカッセ腸内菌群、高ルミノコッカス未分類属細菌群、及び高ルミノコッカス属細菌群において、無増悪生存期間が長い傾向にあり、高バクテロイデス細菌群において、無増悪生存期間が短い傾向にあった。

＜免疫チェックポイント阻害薬奏功例腸内容物のマウスへの移植＞
上記奏功例及び非奏功例由来の腸内容物を等張液に懸濁した懸濁液を作成し、無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスに投与して、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体である、Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD279 (PD-1)(RMP1-14)。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より購入）の効果に対する影響を調べた。マウスは、奏功例の腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群及び非治療群、並びに非奏功例の腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群及び非治療群の４群にグループ分けした。腸内容物投与の１４日後にマウス皮下にＭＣ３８培養細胞を移植して、免疫応答性マウス腫瘍モデルを作成した。ＭＣ３８培養細胞移植の５日後、８日後、１１日後に、治療群には免疫チェックポイント阻害薬を投与し、非治療群にはＰＢＳを腹腔内投与した。その後、各マウスについて、腫瘍径及び生存期間を観察して比較を行った。腫瘍体積は、計測した腫瘍径に基づいて、以下の計算式により算出した。

結果を図３に示す。奏功例腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群（奏功例治療群）は、奏功例腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬非治療群（奏功例非治療群）、非奏功例腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群（非奏功例治療群）及び非奏功例腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬非治療群（非奏功例非治療群）のいずれと比べても、顕著な腫瘍体積減少効果及び生存期間延長効果を示した。つまり、奏功例腸内容物移植には、腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強する効果、すなわち腫瘍に対する免疫応答を増強する効果があることが示された。また、奏功例非治療群は、非奏功例非治療群と比較して、腫瘍体積減少効果及び生存期間延長効果を示した。従って、奏功例腸内容物移植は、単独でも抗腫瘍効果を有するが、免疫チェックポイント阻害薬治療と組み合わせた場合、相乗的な抗腫瘍効果を示した。

＜免疫チェックポイント阻害薬奏功例由来腸内容物の、抗生剤投与マウスへの移植＞
上記の腸内容物移植実験を、事前に抗生剤投与を行ったＳＰＦマウスを用いて行った。

上記奏功例及び非奏功例由来の腸内容物を等張液に懸濁した懸濁液を作成し、抗生剤（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）を６日間投与した無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスに投与して、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体である、Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD279 (PD-1)(RMP1-14)。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より購入）の効果に対する影響を調べた。マウスは、奏功例の腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群（奏功例腸内容物移植＋、抗ＰＤ－１抗体（Anti PD-1 mAb）＋）及び非治療群（奏功例腸内容物移植＋、アイソタイプコントロール＋）、並びに非奏功例の腸内容物移植群の免疫チェックポイント阻害薬治療群（非奏功例腸内容物移植＋、抗ＰＤ－１抗体＋）及び非治療群（非奏功例腸内容物移植＋、アイソタイプコントロール＋）の４群にグループ分けした。腸内容物投与の１４日後にマウス皮下にＭＣ３８培養細胞を移植して、免疫応答性マウス腫瘍モデルを作成した。ＭＣ３８培養細胞移植の５日後、８日後、１１日後に、治療群には免疫チェックポイント阻害薬を投与し、非治療群にはアイソタイプコントロール抗体（Ultra-LEAF Purified Rat IgG2a, κ isotype Ctrl(RTK2758)。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より購入）を腹腔内投与した。その１４日後にマウスを安楽死させた後、回収した腫瘍からリンパ球を単離して、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍浸潤Ｔ細胞の解析を行った。結果を図４に示す。奏功例治療群のＣＤ８^＋細胞におけるＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４４^＋細胞分画の割合は、奏功例非治療群、非奏功例治療群、及び非奏功例非治療群のいずれと比較しても、有意に大きいことが示された。さらに、奏功例治療群のＣＤ８^＋細胞におけるＴＮＦ－α^＋ＩＦＮ－γ^＋細胞分画の割合も、奏功例非治療群、非奏功例治療群、及び非奏功例非治療群のいずれと比較しても、有意に大きいことが示された。すなわち、奏功例治療群では、奏功例非治療群、非奏功例治療群、及び非奏功例非治療群と比較して、ＣＤ８^＋細胞におけるエフェクター細胞の割合が有意に大きく、ＣＤ８^＋細胞産生サイトカインが多いことが示された。このことは、奏功例腸内容物移植が、単独でも顕著な免疫応答増強効果を有すること、さらに免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせた場合に相乗的な免疫応答増強効果を有することを示している。

＜免疫チェックポイント阻害薬奏功例腸内容物からのルミノコッカッセ腸内菌の単離＞
上記奏功例由来の腸内容物を、『腸内菌の世界』光岡知足（1990）、朝倉書店の記載に従い、同書の嫌気性希釈液（Ｂ）に希釈して腸内容物希釈液を生成した。１０^－７～、１０^－８、及び１０^－９に希釈した腸内容物希釈液を、それぞれＥＧ寒天培地に接種し、嫌気性チャンバー内で３７℃で３日～４日培養することにより、コロニーを生成した。

生成した各コロニーの細菌について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を決定し、常法に従って系統解析を行った。結果を図５に示す。配列番号１に示す塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と名付けた。

＜免疫チェックポイント阻害薬投与腫瘍マウスへの、各種細菌の移植＞
抗生剤（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）を６日間投与した無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスにＭＣ３８培養細胞を皮下移植して、５日後、８日後、１１日後に免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体）を投与した。対照群にはアイソタイプコントロールを投与した。単菌移植群には、免疫チェックポイント阻害薬又はアイソタイプコントロールの投与と同時に、各細菌（Akkermansia muchiniphilliaｍ、Eggerhella lenta、Clostridum colicanis、Bacteroides vulgatus（B. vulgatus）、Ersipelatoctostridum ransam、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328））を経口投与した。その後、各マウスについて腫瘍径を測定し、それに基づいて算出した腫瘍体積をプロットしたものを図６に示す。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）を投与した群は、免疫チェックポイント阻害薬のみで処置した群と比較して、さらに他の細菌を移植した群と比較して、顕著な腫瘍体積の減少を示した。つまり、奏功例腸内容物由来ルミノコッカッセ腸内菌であるルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせた場合、相乗的な抗腫瘍効果を示すことが示された。

同様の実験を、B. vulgatus及びルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）について行い、ＭＣ３８培養細胞の皮下移植の１４日後にマウスを安楽死させ、回収した腫瘍からリンパ球を単離して、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍浸潤Ｔ細胞の解析を行った。結果を図７に示す。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）投与群のＣＤ８^＋細胞におけるＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ４４^＋細胞分画の割合は、B. vulgatus投与群及び免疫チェックポイント阻害薬単独処置群と比較して有意に大きいことが示された。さらに、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）投与群のＣＤ８^＋細胞におけるＴＮＦ－α^＋ＩＦＮ－γ^＋細胞分画の割合も、B. vulgatus投与群及び免疫チェックポイント阻害薬単独処置群と比較して有意に大きいことが示された。すなわち、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）投与群では、B. vulgatus投与群及び免疫チェックポイント阻害薬単独処置群と比較して、ＣＤ８^＋細胞におけるエフェクター細胞の割合が有意に大きく、ＣＤ８^＋細胞産生サイトカインが多いことが示された。このことは、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）が、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせた場合に相乗的な免疫応答増強効果を有することを示している。

＜Ｔ細胞の活性化に対するルミノコッカッセ腸内菌の影響＞
マウス骨髄由来樹状細胞（樹状細胞前駆細胞と同義）と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はビヒクルとを共培養したのちに、フローサイトメトリーを用いて、樹状細胞成熟化マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ）の測定を行った。結果を図８に示す。測定したすべての樹状細胞成熟化マーカーについて、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した場合、B. vulgatus又はビヒクルと共培養した場合と比較して、有意な発現増強が確認された。すなわち、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）は、B. vulgatus又はビヒクルと比較して、有意に高い樹状細胞の成熟化効果を有することが示された。

次に、上記共培養後の樹状細胞を回収し、ＯＴ－Ｉマウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養して、ＴＣＲに対する親和性の異なる公知のＯＶＡ抗原ペプチドであるＮ４ペプチド（１ｎＭ、１０ｎＭ又は１００ｎＭ）又はＱ４Ｈ７ペプチド（１ｎＭ、１０ｎＭ又は１００ｎＭ）を用いて刺激した。なお、Ｎ４ペプチドよりもＱ４Ｈ７ペプチドの方が、ＴＣＲに対して低い親和性を有することがわかっている。その後、ＥＬＩＳＡを用いたＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化マーカー（ＩＦＮ－γ）の測定、及びフローサイトメトリーを用いたＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０（ｐＺＡＰ７０））及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ｓ６（ｐＳ６））の測定を行った。

１ｎＭ又は１００ｎＭのＮ４ペプチドで刺激を与えた場合の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化マーカー（ＩＦＮ－γ）の測定結果を図９に示す。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合、B. vulgatusと共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合と比較して、Ｎ４ペプチド刺激に応答して有意に高いＩＦＮ－γ産生を示した。つまり、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞は、B. vulgatusと共培養した樹状細胞と比較して、有意に高いＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化効果を有することが示された。驚くべきことに、この効果は、１ｎＭという低濃度のＮ４ペプチドによっても示された。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）には、高い免疫応答増強効果があることが示唆された。

Ｎ４ペプチド又はＱ４Ｈ７ペプチドで刺激を与えた場合の、ＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０）及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ）の測定結果を図１０に示す。ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合、B. vulgatusと共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合や通常の樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合と比較して、Ｎ４ペプチド刺激又はＱ４Ｈ７ペプチド刺激に応答して有意に高いＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０）及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ）産生を示した。つまり、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞は、B. vulgatusと共培養した樹状細胞と比較して、ＴＣＲシグナル及びＣＤ２８シグナルの両方に対して、有意に高い活性化効果を有することが示された。驚くべきことに、この効果は、通常はＴ細胞活性化への寄与が低いと思われるＴＣＲ親和性の低いＱ４Ｈ７ペプチドによっても示された。

さらに、ＴＣＲシグナル（ＺＡＰ７０（ｐＺＡＰ７０））及びＣＤ２８シグナル（Ｅｒｋ（ｐＥｒｋ）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ｓ６（ｐＳ６））に対する、異なる濃度のＮ４ペプチド刺激の効果（０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）を、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合、及びB. vulgatusと共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合のそれぞれについて調べた結果を図１１に示す。いずれのシグナルに関しても、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合、B. vulgatusと共培養した樹状細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞とを共培養した場合と比較して、調べたすべての濃度のＮ４ペプチド刺激に応答して、有意に高い産生が示された。つまり、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）と共培養した樹状細胞は、B. vulgatusと共培養した樹状細胞と比較して、ＴＣＲシグナル及びＣＤ２８シグナルの両方に対して、低濃度のＮ４ペプチド刺激によっても有意に高い活性化効果を有することが示された。

以上のことから、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）は、抗原提示細胞である樹状細胞を成熟化させることができ、それにより、低濃度の抗原刺激を用いた場合でも、親和性の低い抗原刺激を用いた場合でも、Ｔ細胞の活性化に必要な２つの経路（ＴＣＲ及びＣＤ２８）に対する高い活性化効果を有することが示された。このことは、生体内において、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）のようなルミノコッカッセ腸内菌が、高い免疫応答増強効果を有することを示唆している。

＜腸内容物移植腫瘍マウスにおける、ルミノコッカッセ腸内菌の効果＞
抗生剤（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）を６日間投与した無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスに、上記免疫チェックポイント阻害薬奏功例由来腸内容物の懸濁液及び非奏功例由来腸内容物の懸濁液を投与して、腸内常在菌移植を行った。その後、マウスにＭＣ３８培養細胞を皮下移植して、５日後、８日後、１１日後に免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体である、Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD279 (PD-1)(RMP1-14)。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より購入）を腹腔内投与し、さらにルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）単菌またはB. vulgatus単菌を経口投与した。その後、各マウスについて腫瘍径を測定し、それに基づいて算出した腫瘍体積をプロットしたものを図１２に示す。また、腸内容物移植後と、単菌投与後のそれぞれにおいて回収したマウスの腸内容物について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に基づくメタ解析を行い、それぞれの腸内容物における細菌叢の多様性を比較した結果を図１３に示す。

図１２において、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）単菌投与群では、奏功例由来腸内容物及び非奏功例由来腸内容物のいずれを移植したマウスにおいても、有意に腫瘍増殖が抑制された。一方、B. vulgatus単菌投与群では、奏功例由来腸内容物及び非奏功例由来腸内容物のいずれを移植したマウスにおいても、腫瘍増殖を抑制することはできなかった。

図１３において、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）単菌投与後の腸内容物において、細菌叢の多様性が、投与前と比較して有意に増加したことが示された。免疫チェックポイント阻害薬の非奏功例では、腸内常在菌の多様性が低いことがわかっている。この実験により、本発明のルミノコッカッセ腸内菌が、他の細菌と比較して、腸内常在菌の多様性を増加させる高い効果を有することが明らかになった。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のルミノコッカッセ腸内菌が抗腫瘍免疫応答を惹起するメカニズムのひとつとして、腸内常在菌の多様性を増加させることが寄与している可能性がある。

＜樹状細胞の分化に対するルミノコッカッセ腸内菌の効果（in vitro）＞
マウス骨髄由来樹状細胞と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）とを共培養したのちに、樹状細胞からRNAを抽出し、トランスクリプトーム解析を行った。その結果、ルミノコッカッセYB328によって刺激された樹状細胞は、B. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）によって刺激された樹状細胞と比較して、batf3、Irf8、FLT3といった1型樹状細胞（cDC1）に特徴的な遺伝子の発現が高いことがわかった（図１４）。

＜樹状細胞の分化に対するルミノコッカッセ腸内菌の効果（in vivo）その１＞
抗生剤（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）を6日間投与した無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスにＭＣ３８培養細胞を皮下移植して、5日後にルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatusを経口投与し、8日後に各組織（腫瘍近傍リンパ節、粘膜固有層、腸管膜リンパ節）を採取した。

FACS解析の結果、腫瘍近傍リンパ節でCD103陽性移動性樹状細胞、粘膜固有層でCD103陽性CD11b陰性樹状細胞の割合がルミノコッカッセYB328投与群で有意に高かった。また腸間膜リンパ節ではCCR7の発現がルミノコッカッセYB328投与群で高いことが判明した（図１５）。このことからYB328の投与により、生体内で、遊走能が高くcDC1の割合が高い樹状細胞が誘導されていることが示唆された。

＜樹状細胞の分化に対するルミノコッカッセ腸内菌の効果（in vivo）その２＞
抗生剤（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール）を6日間投与した無菌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスにＭＣ３８培養細胞を皮下移植して、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体、RMP1-14, バイオレジェンド社、米国）またはアイソタイプコントロール抗体（RTK2758、バイオレジェンド社、米国）を、３日間隔で２回静脈注射により投与した。ＭＣ３８培養細胞の皮下移植から5、8、11日後にルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）を経口投与し、13日後に腫瘍を採取した。

FACS解析の結果、腫瘍内におけるCD103陽性樹状細胞の割合が、ルミノコッカッセTB328投与群で有意に高かった（図１６）。

＜ルミノコッカッセ腸内菌による樹状細胞分化誘導のメカニズム＞
マウス骨髄由来細胞から樹状細胞の前駆細胞（骨髄由来樹状細胞）を単離し、cDC1への分化に必要なFLT3リガンド（FLT3L）と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）と共培養した後、IRF8の発現についてFACS解析を行った。高濃度（100ng/ml）のFLT3Lを投与した場合にはいずれも高いIRF8の発現を認めたが、低濃度（1ng/ml）のFLT3Lを投与した場合にはルミノコッカッセYBS328投与群のみでIRF8の発現が維持された（図１７）。このことから、ルミノコッカッセYB328は、FLT3L非依存的にcDC1の分化を誘導する可能性が示唆された。

さらに、骨髄由来樹状細胞と、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）又はB. vulgatus又はLPS又はビヒクル（PBS）とを４時間共培養した後、p-S6キナーゼ（p-S6K）及びp-STAT3の発現についてFACS解析を行った。ルミノコッカッセYB328投与群のみで、p-S6K及びp-STAT3の量分子の発現が高いことが判明した（図１８）。

FLT3Lは、PI3K-mTOR経路を活性化させることを通じて樹状細胞の分化に関わると考えられている。上記の結果から、ルミノコッカッセYB328は、FLT3Lの代わりにPI3K-mTOR経路を活性化させることによりcDC1への分化の誘導に関与すると考えられる。

＜ＴＬＲ複合刺激による樹状細胞前駆細胞の１型樹状細胞への誘導＞
上記のとおり、ルミノコッカッセYB328が、樹状細胞の分化に関わる様々な分子発現に関わることが明らかになってきた。そこで、ルミノコッカッセYB328によるcDC1への分化誘導経路のさらに上流を解明するため、TLRに着目して、以下のとおり検討した。

まず、図１４で示したトランスクリプトーム解析の中で、TLRに着目した解析を行った結果、ルミノコッカッセYB328で刺激した樹状細胞前駆細胞は、B. vulugatusで刺激した樹状細胞前駆細胞と比較して、多様なTLRについて高い発現を示した（図１９，Ａ）。中でも、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９の発現が高かった。

さらに、MyD88ノックアウトマウス（MyD88^-/-）から採取した骨髄由来樹状細胞をルミノコッカッセYB328で刺激した後、FACS解析を行った。その結果、CD103陽性CD11ｂ陰性樹状細胞は誘導されず、これは、ビヒクルによって刺激した場合と同様の結果であった（図１９，Ｂ）。このことは、ルミノコッカッセYB328によって誘導されるCD103陽性樹状細胞の分化はMyD88-TLRシグナルに依存的であり、TLRシグナル伝達が重要な役割を果たしていることを示唆している。

上記トランスクリプトーム解析では、TLR5、7、9が、ルミノコッカッセYB328群において特に高い発現を示した。そこで、TLR5、7、9の作動薬（それぞれフラジェリン、R848（レキシモド）、ODN-1826）の種々の混合物によってマウス骨髄由来樹状細胞（細菌による刺激等をしていないインタクトな樹状細胞前駆細胞）を処理したところ、TLR5、7、9の作動薬をすべて用いて処理した樹状細胞において、LPSやコントロールで処理した場合と比較して、CD103陽性CD11b陰性樹状細胞、すなわち１型樹状細胞が顕著に誘導された（図１９，Ｃ）。また、この実験では、TLR5、7、及び9の作動薬の混合物に、TLR4の作動薬であるLPSを加えると、CD103陽性CD11b陰性樹状細胞、すなわち１型樹状細胞への誘導が有意に低下することもわかった（図１９，Ｃ）。このことは、TLR4以外の複数のTLRを同時に刺激することにより、樹状細胞前駆細胞から１型樹状細胞が誘導されることを示唆する。そして、ルミノコッカッセYB328は、これら１型樹状細胞への誘導に関与する複数のTLRを刺激することが示唆される。

Claims

ルミノコッカッセ腸内菌を含む医薬組成物であって、該ルミノコッカッセ腸内菌が配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、FLT3L非依存的にcDC1の分化を誘導する、前記医薬組成物。
配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するルミノコッカッセ腸内菌の菌体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、医薬組成物。
ルミノコッカッセ腸内菌の菌体が、生菌体である、請求項２に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ－９、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、及びＢ７－Ｈ７からなる群より選択されるいずれかの免疫チェックポイント分子に対する阻害剤又はそれら阻害剤の２以上の組み合わせである、請求項２または３に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬が、前記免疫チェックポイント分子に対する抗体、抗体の抗原結合性断片、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
経口投与、経管投与、又は注腸投与によって投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが同時に投与される、請求項２～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬と、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物とが別々に投与される、請求項２～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬の投与前に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害薬の投与後に、ルミノコッカッセ腸内菌の菌体、培養上清、代謝産物及び／又は菌体抽出物が投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
対象において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
腫瘍又はがんを有する対象において、腫瘍又はがんに対する免疫応答を増強するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんに対する免疫応答の増強効果が大きい、請求項１３に記載の医薬組成物。
対象における腫瘍又はがんを治療するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記治療が、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定化させることである、請求項１５に記載の医薬組成物。
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍又はがんを消失させるか、縮小させるか、又は安定させる効果が大きい、請求項１６に記載の医薬組成物。
対象における腫瘍もしくはがんの再発又は転移を抑制するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記免疫チェックポイント阻害薬の単独投与の場合と比べて、腫瘍もしくはがんの再発又は転移の抑制効果が大きい、請求項１８に記載の医薬組成物。
手術療法、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される１以上の療法とさらに組み合わせて投与される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
投与前と比較して哺乳動物の腸内常在菌の多様性を増加させるための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ルミノコッカッセ腸内菌は、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
ルミノコッカッセ腸内菌であって、該ルミノコッカッセ腸内菌が、配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、FLT3L非依存的にcDC1の分化を誘導する、前記ルミノコッカッセ腸内菌。
ルミノコッカッセ腸内菌であって、該ルミノコッカッセ腸内菌が、配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、FLT3L非依存的にcDC1の分化を誘導し、さらに以下の（１）～（３）の少なくとも一つの特徴を有する、前記ルミノコッカッセ腸内菌：
（１）ＥＧ培地を用いて、嫌気性チャンバー内で、３７℃で好適に培養することができる；
（２）樹状細胞を成熟化させることができる；および
（３）腸内常在菌の多様性を増加させる能力を有する。
ルミノコッカッセ腸内菌の菌体であって、該ルミノコッカッセ腸内菌が、配列番号１に示す塩基配列と９９％以上の配列同一性を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、FLT3L非依存的にcDC1の分化を誘導する、前記菌体。
前記ルミノコッカッセ腸内菌は、ルミノコッカッセYB328（Ruminococcaceae YB328）である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のルミノコッカッセ腸内菌または菌体。